KR19990087627A - 메틸티오아데노신 포스포릴라제 결핍 세포내 아데닐로숙시네이트 합성효소 활성의 억제 방법 - Google Patents

메틸티오아데노신 포스포릴라제 결핍 세포내 아데닐로숙시네이트 합성효소 활성의 억제 방법 Download PDF

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카를로스 제이. 카레라
데니스 에이. 카슨
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쓰또무 노보리
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Abstract

본 발명은 특정 암의 치료에 유용한 포유류 세포로부터 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP) 를 고갈시키는 생체내 방법을 제공한다. 이 방법에 따라, 세포군이 숙주로부터 수득되며 메틸티오아데노신 포스포릴라제 (MTAse) 활성의 상실이 검정되어진다. MTAse 는 메틸티오아데노신을 아데닌으로 이화시켜 세포내 AMP 풀로 내생적 재이용되도록 한다. MTAse 활성의 상실을 검정하는 바람직한 방법은, 이노신 5'-모노포스페이트를 AMP 로 전환시키는 아데닐숙시네이트 합성효소의 활성을 억제함으로써 종양 세포내 신규 AMP 생성에 사용되는 기질을 고갈시키는 제제의 치료 유효량으로 코딩하는 유전자의 동형접합성 결실을 검출하는 혼성화 기법이다. L-알라노신은 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 ASS 억제제이다.

Description

메틸티오아데노신 포스포릴라제 결핍 세포내 아데닐로숙시네이트 합성효소 활성의 억제 방법
관련된 출원에 대한 전후 참조
본 발명은 현재 계류중인 1993 년 12 월 29 일자 출원된 미국 특허 일부 계속 출원 일련 번호 제 08/176,855 호이다.
발명의 배경
본 발명은 약제학적 제제 및 암의 화학요법 치료에 있어서의 이의 사용법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 메틸티오아데노신 포스포릴라제를, 아데닌 뉴클레오티드의 재이용 합성에 사용되는, 아데닌으로 대사시키지 못하는 암세포의 확인 및 상기 암 세포내 신규 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP) 합성을 저해하는데 있어서의 L-알라노신의 용도에 관한 것이다.
발명의 역사
메틸티오아데노신 (MTA) 은 건강한 포유류 세포내에서 메틸티오아데노신 포스포릴라제 (MTAse) 에 의해 아데닌 및 메틸티오리보스-1-P 로 분해되는데, 이중 메틸티오리보스-1-P 는 메티오닌의 대사 합성에 있어서 기질로 사용된다. 아데닌은 아데노신 5'-모노포스페이트 (AMP) 의 세포 풀 내로 재이용되는데, 여기에서 세포는 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP) 를 유도하여 대사 에너지로 사용하고 2' - 데옥시아데노신-5'-트리포스페이트 (dATP) 는 DNA 합성에 사용한다.
종래의 시험관 내 연구 결과를 근거로, 박테리아성 항생 알라노신의 L 이성질체 (스트렙토마이세스 알라노시니쿠스로부터 수득됨; 이하, "L-알라노신") 는 항바이러스제 및 항종양제로 사용될 가능성이 있는 것으로 보인다. 특히, L-알라노신은 이노신 5'-모노포스페이트 (IMP) 를 AMP 로 전환시키는 아데닐로숙시네이트 합성효소 (ASS) 를 억제함으로써 AMP 및 ATP 의 표적 세포를 (아데닌의 부재하에) 고갈시키는 것으로 여겨진다. 그러나, 인간 암 환자를 대상으로 L-알라노신의 치료 효능을 알아본 임상 연구 결과는 기대에 어긋났다 (하기 문헌에서 수집된 데이타 참고: Tyagi and Cooney, Adv. Pharmacol. Chemotherapy, 20:69-120, 1984 [인간 암의 치료에 있어서의 L-알라노신의 효능에 관해 현재까지의 결과는 "약간 고무적"임]; Creagan, et al., Cancer, 52:615-618, 1993 [II 상 연구 결과는 불과 4 % 의 전체 반응율을 보임]; Creagan, et al., Am. J. Clin. Oncol., 7:543-544, 1984 [흑색종 환자의 II 상 연구 결과, 약간의 치료 반응이 관찰됨]; VonHoff, et al., Invest. New Drugs, 9:87-88, 1991 [유방암 환자에게서 아무런 목적 반응도 관찰되지 않음]). 결국, 암 치료에 사용하기 위한 L-알라노신의 모든 임상 실험 결과가 무시되었다.
공지된 또다른 ASS 활성 억제제는 하다시딘 (hadacidin) 이다. 그러나, 하다시딘은 L-알라노신 보다 인체에 더 유독한 것으로 여겨진다. 더욱이, IMP 합성을 방해하는 (따라서 AMP 생산에 있어서 공급원으로서의 IMP 를 이론적으로 배제하는) 기타 신규 퓨린 합성 억제제 (예컨데 메토트레크세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌 및 d-이데아자테트라히드로폴레이트) 의 활성은, 생체내에서 IMP 생산에 기질로서 사용되는 혈장에 풍부한 히포크산틴의 재이용으로 인해 배제된다. 따라서, 현재까지 세포내 AMP 를 생산하는 아데닌 대사 경로를 차단하는 제제의 생체내 효능은 매우 미약하다.
그러나, 특정 인간 암 세포내 MTAse 를 코딩하는 유전자의 동형접합성 결실을 확인하기에 충분한 감도를 갖는 검정법의 개발 (통상 부여된 모 미국 특허 출원 일련 번호 제 08/176,855 호 참고) 로, 현재 임상 실험에서 L-알라노신으로 처리된 종양이 MTAse 를 생산하며, 따라서, IMP 로부터의 AMP 생산의 억제에도 불구하고 AMP 풀을 유지하기에 충분한 아데닌을 제공할 수 있었는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명은 MTAse 가 결핍된 세포를 확인하고 상기 세포내 AMP 를 고갈시킴으로써 상기 세포를 치료하는 방법을 제공한다.
발명의 요약
MTAse 단백질을 코딩하는 유전자가 결실되어 MTA 를 아데닌으로 대사시킬 수 없는 세포 ("MTAse 결핍 세포") 는 L-알라노신과 같은 신규 AMP 합성 억제제의 치료 유효량과 접촉시 생체내에서 선택적으로 죽는다는 것이 발견되어졌다. 따라서, L-알라노신이 모든 암 세포에 대해 치료 효능을 나타내지는 않지만, MTAse 결핍 세포에 대해서는 치료 효능을 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명은 세포의 MTAse 단백질 결핍 여부를 측정하는 검정법을 제공함으로써 특정 암 세포가 MTAse 결핍 세포인지를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 목적으로 사용하기에 바람직한 검정법은 세포로부터 MTAse 단백질을 코딩하는 유전자의 동형접합성 결실을 검출하는 방법이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 ASS 의 활성을 억제하는 치료 유효량의 신규 퓨린 합성 억제제, 바람직하게는 L-알라노신과 MTAse 결핍 세포를 접촉시킴으로써 MTAse 결핍성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 ASS 억제성 제제는 임의의 임상적으로 허용가능한 방법을 통해 투여될 수 있으나, 최대 내성 투여량 미만의 농도로 연속 주입하여 투여함으로써 목적하는 억제 활성을 연장시키고 숙주 조직에 대한 독성을 최소화하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 방법에 사용되는 키트도 제공하는데 이 키트는 본 발명의 MTAse 결핍 검정을 수행하는데 사용되는 시약 뿐만 아니라 ASS 억제제, 바람직하게는 L-알라노신 및/또는 그의 활성 대사 물질인 L-알라노시닐 AICOR 의 약제학적 조성물도 포함한다.
도 1 은 게놈성 MTAse 에 대한 뉴클레오티드 서열로서 (서열 번호 1) 엑손은 밑줄 그어져 있다.
도 2 는 누드 마우스내 정착된 인간 MTAse 풍부 및 MTAse 결핍 비소 세포 폐암 이종이식 종양에 L-알라노신을 연속 주입한 후의 생체내 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3 은 누드 마우스내 정착된 인간 MTAse 결핍 급성 림프아구성 백혈병 이종이식 종양에 L-알라노신을 연속 주입한 후의 생체내 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4 및 5 (A - B) 는 L-알라노신으로 처리한 후 MTAse 풍부 또는 MTAse 결핍 세포계에 각종 외인성 MTAse 기질을 투여한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6 은 AMP 를 생산하는 세포내 대사 경로를 나타내는 도식도이다.
도 7 은 누드 마우스내 정착된 인간 MTAse 결핍 비소 세포 폐암 이종이식 종양에 L-알라노신을 매일 주사한 후의 생체내 효과를 나타내는 그래프이다.
바람직한 구현예의 설명
I. 세포내 AMP 생산의 대사 경로
본 발명의 이해를 돕고자, AMP 를 생산하는 세포내 대사 경로를 나타내는 차트가 도 6 에 제공되었다. 요약하자면, 세포내 AMP 생산에 사용되는 기질의 주요 공급원은 세가지가 있다. 그 첫번째는 MTAse 에 의한 메틸티오아데노신의 아데닌으로의 이화작용인데, 이 경로는 MTAse 결핍 세포에서는 차단된다.
두번째는 ASS 또는 아데닐숙시네이트 리아제 (ASL) 의 활성에 의한 IMP 의 AMP 로의 전환이다. 현재까지 알려진 ASL 활성 억제제는 없다. 그러나, ASS 활성의 상실과 함께, IMP-AMP 전환은 실질적으로 소실된다.
세번째는 AMP 로의 히포크산틴의 재이용이다. 그러나, IMP-AMP 전환이 히포크산틴 재이용의 말단에서 일어나므로, IMP-AMP 의 ASS 이화작용의 억제는 히포크산틴 재이용 경로를 차단한다.
II. 포유류 숙주로부터 수득된 검정가능한 시료내 종양 세포가 MTAse 결핍 세포인지를 확인하는 방법.
A. MTAse 결핍 세포를 확인하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 시약
특정 세포군이 MTAse 결핍성인지를 측정하는 바람직한 방법은 세포로부터 MTAse 를 코딩하는 유전자의 동형접합성 결실을 검출하는 혼성화 검정법에 의한 것이다. 핵산 혼성화에 의존하는 스크리닝 방법은, 적합한 탐침만 제공된다면, 어떠한 유기체내 어떠한 폴리뉴클레오티드 서열 (및, 추론상, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 어떠한 단백질) 도 검출가능하게 한다.
본 발명에 사용하기 적합한 혼성화 기법 및 MTAse 를 코딩하는 유전자에 대한 자세한 설명이 동시 계류중인, 통상 부여된 미국 특허 출원 일련 번호 제 08/176,855 호 (출원일: 1993 년 12 월 29 일) 에 기재되어 있으며, 이의 내용은 임의의 보정사항과 함께 상기 참조에 의해 본문에 인용되었다. 참고를 용이하게 하기 위해, MTAse 를 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이 첨부된 서열 목록의 서열 번호 1 및 도 1 에 기재되어 있으며, 유전자의 코딩 영역은 밑줄로 표시되어 있다.
게놈성 MTAse 폴리뉴클레오티드는 p21 영역의 염색체 9 상에 위치한다. 흥미롭게도, 종양 억제자 p16 을 코딩하는 유전자가 동형접합성 결실된 세포 중 매우 높은 퍼센티지의 세포에서 MTAse 를 코딩하는 유전자 또한 동형접합성 결실되어 있다. 따라서, 후자 (MTAse 코딩 유전자) 의 동형접합성 결실을 검출하는 또다른 방법은 전자 (p16 코딩 유전자) 의 동형접합성 결실을 검출함으로써 이루어진다. 이와 관련해, 현재 동시-계류중인 미국 특허 출원 일련 번호 제 08/227,800 호를 추가로 참고할 수 있으며, 그 내용은 상기 참조에 의해 본문에 인용되었다.
쥐 MTAse 에 대한 온전한 길이의 게놈성 DNA 를 함유하는 E. coli 균주가 ATCC [American Type Culture Collection, Rockville, MD.] 에 기탁되어 있는데, 1993 년 12 월 29 일 이전에 우송되었으며, 기탁 번호 55536, 55537, 55538, 55539 및 55540 을 공동 부여받았다. 상기 기탁이 본 발명을 수행하는데 필요한 것은 아니다. 그러나, 상기 기탁은 본 발명의 개시에 적용되는 특허법이 요구하는 기간동안 생육 형태로 유지될 것이다.
MTAse 유전자가 목적 세포로부터 동형접합성 결실되었는지를 확인하기 위해, 숙주로부터 검정가능한 세포 시료를 수득한다. 예컨데, 시료는 숙주 조직 또는 종양에서 유래한 체액 또는 세포로 이루어질 수 있다. 상기 시료는 임상 분야에 공지된 방법을 사용해 수득될 수 있는데, 예컨데, 종양 세포는 생체검사법 또는 외과 절제술에 의해 수득될 수 있다. 세포는 본질적으로 "오염물질", 즉, 검정 결과를 왜곡할 수 있는 세포, 단백질 및 유사한 성분들로부터 유리된 것이 바람직하다. 예컨데, 검정가능한 세포 시료의 공급원이 고형 종양인 경우, 정상적인 비-악성 세포 및 생물학적 시료를 수득하는 과정에서 정상 세포로부터 방출될 수 있는 MTAse 는 오염물질로 간주된다. 상기 오염물질은 통상적인 정제 기법; 예컨데, 항-MTAse 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다.
본 발명은 MTAse 음성이라 의심되어지는 세포 시료내 상기 유전자의 존재 또는 부재를 확인하는데 방향이 맞춰져 있기 때문에, 시료내 핵산은 바람직하게는 검출법의 감도를 높이기 위해 증폭되어질 수 있다. 상기 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 사용해 수행되는 것이 바람직하지만, 중합 단계에서 연쇄 반응의 사용이 반드시 필요한 것은 아니다.
시료내 증폭되어질 핵산은, 시료내 존재할 경우, 통상적으로 MTAse 를 코딩하는 것으로 예상되는 게놈성 또는 야생형 DNA 로 이루어질 것이다 (서열 번호 1 참고). DNA (이하 "표적 DNA") 를 코딩하는 MTAse 는 인간 세포를 비롯한 모든 정상 포유류 세포에 존재하는 것으로 여겨진다.
대조군으로서 또는 올리고뉴클레오티드 탐침 및 프라이머의 공급원으로서 사용되기 위해, 게놈성 MTAse-코딩 DNA 는 당 분야에 공지된 방법, 예컨데 Maniatis 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) 에 의해 기재된 방법에 따라 분리될 수 있다. 인간 MTAse 유전자의 게놈성 클론의 분리를 보여주는 실용예가 본문에 제시되어 있는데, 이 실용예에서는 MTAse cDNA 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용해 코스미드 유전자 라이브러리가 스크린된다 (실시예 III 참고). 그러나, 당 분야의 숙련자는 MTAse 코딩 DNA 를 수득하는 기타 적합한 방법도 사용될 수 있음을 알게 될 것이다.
예컨데, 목적하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것으로 여겨지는 cDNA 라이브러리는 cDNA 로부터 유래한 각종 mRNA 를 난모세포내로 주입시켜, cDNA 유전자 생성물의 발현이 일어나기에 충분한 시간동안 방치하고, 예컨데, 목적하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 펩티드에 특이적인 항체를 사용하거나 또는 반복 모티프용 탐침 및 목적하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 펩티드의 특징적인 조직 발현 패턴용 탐침을 사용함으로써 목적 cDNA 발현 생성물의 존재를 시험함으로써 스크린될 수 있다. 이와는 달리, cDNA 라이브러리를 대상으로 목적하는 펩티드에 특이적인 항체를 사용하여 하나 이상의 에피토프를 갖는 목적 펩티드 (예컨데, MTAse 단백질) 의 발현을 간접적으로 스크린할 수 있다. 상기 항체는 폴리클론적 또는 모노클론적으로 유도될 수 있으며 목적 cDNA 의 존재를 나타내는 발현 생성물을 검출하는데 사용될 수 있다 [Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982) 참고].
본 발명에서 대조군, 탐침 또는 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 당 분야에 널리 공지되어 있는 기법 및 핵산 합성 장치를 이용해 합성될 수도 있다. 이와 관련해, 문헌 [Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Chs. 2 and 4 (Wiley Interscience, 1989)]을 참고할 수 있다.
B. 게놈성 DNA를 코딩하는 MTAse 의 증폭 및 이를 위한 혼성화 검정
본 발명의 혼성화 검정의 감도를 높이기 위해, 검정될 세포 시료는 표적 핵산의 선별 증폭을 조장하는 조건하에 놓는 것이 바람직하다. 바람직하게, 표적 핵산은 MTAse를 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 부분 (즉, "표적 폴리뉴클레오티드") 일 것이다. 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 바람직한 방법은 PCR 에 의한 방법이다.
PCR은 표적 핵산내 특정 핵산 서열에 혼성화되어 목적 영역의 측면에 위치하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 특정 DNA 또는 RNA 서열을 효소적으로 합성하는 시험관내 방법이다. 주형 변성, 프라이머 어니일링 및 어니일링된 프라이머의 효소를 이용한 연장의 반복되는 일련의 사이클을 통해 프라이머의 5' 말단에 의해 말단이 결정되는 특정 핵산 단편이 기하급수적으로 축적된다. 한 사이클에서 합성된 생성물 (PCR 생성물)은 다음 사이클에 주형으로 사용된다; 결과적으로, 표적 핵산 카피의 수는 한 사이클당 약 두배로 늘어난다.
기본적인 PCR 기법은 Mullis 등에게 주어진 미국 특허 제 4,683,195 호 및 제 4,683,202 호에 기재되어 있으며, 이는 통상적인 PCR 수행 기법의 예로써 본문에 인용되었다. 그러나, 본 발명은 Mullis 등에게 주어진 '202 특허에 기재된 PCR 기법의 사용에 국한되지는 않는다. Mullis 등의 기법의 개발 이래, 이 기법의 변형을 이용한, PCR 에 바탕을 둔 다수의 검정법이 개발되었다. 상기 변형은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 따라서, 본문에 자세히 기재되지 않을 것이다. 그러나, 당 분야의 기술의 범위를 예시할 목적으로, 상기 변형중 다수가 하기에 기재되어 있다.
서열 및 크기 면에서 표적 핵산과 상이한 경쟁 주형을 사용한 내부 증폭 기준을 제공하는 PCR 기법은 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:2725-2729 (Gilliland, et al., authors)]에 기재되어 있다. 서열 면에서는 상이하지만 크기는 동일한 주형을 이용한 "경쟁적" PCR을 수행하는 또다른 기법은 문헌 [Nuc. Acids. Res., 21:3469-3472, (1993), (Kohsaka, et al., authors)] 에 기재되어 있다. 상기 기법은 증폭된 핵산을 분석하는데 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하다는 점에서 특히 바람직한 기법이다. 부위-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용해 유전자내 변이 또는 다형성을 검출하고 또한 본 발명의 방법에도 적용될 수 있는 비경쟁적 PCR 기법은 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:6230-6234 (Saiki, et al., authors)]에 기재되어 있다. 상기 각각의 기법은 PCR 도중 일어날 수 있는 임의의 비특이적 증폭으로 인한 거짓 양성 반응을 배제하는데 도움을 주는 혼성화 탐침을 사용한다는 장점이 있다.
추가적인 배경에 관해서, 당 분야의 숙련자는 문헌 [Innis, et al., "Optimization of PCR's", PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Acad. Press, 1990)]을 참고할 수 있다. 상기 문헌은 목적하는 PCR 생성물의 특이성, 충실성 및 수율에 영향을 주는 기법을 요약하고 있다.
MTAse 표적 폴리뉴클레오티드 (즉, "플랭킹 서열") 의 양쪽 끝 (즉, 5' 및 3')상의 작은 범위의 염기쌍에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (하나이상의 프라이머쌍) 가 선택된다. 당 분야의 숙련자는 과다한 실험을 하지 않고도 본문에 첨부된 서열 목록의 서열 번호 1 및 도 1 에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열 정보를 근거로 적합한 프라이머를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
프라이머 설계에 있어서, 프라이머가 상보적 염기를 함유하지 않는 것이 중요한데 이는 그들간에 혼성화가 일어날 수 있기 때문이다. 시료내 존재할 수 있는 임의의 오염물질의 증폭을 배제하기 위해, 엑손 (MTAse 유전자의 경우, 도 1 에 밑줄 그어져 있다) 이 포함되도록 프라이머를 설계하는 것이 바람직하다.
상기 기재된 바와 같이, 시료내 핵산을 충분히 증폭시키기 위해 상기 중합 단계에서 연쇄 반응을 이용할 필요가 없을 수도 있다. 예컨데, 상기 Kohsaka등에 의해 기재된 기법을 이용해 고체상 지지체에서 중합 단계를 수행한 후 표적 폴리뉴클레오티드 특이적 탐침으로 혼성화시키는 경우, 검정 감도는 표적 폴리뉴클레오티드의 단일한 중합으로도 충분할 수 있을 것이다.
증폭 단계가 완료되면, PCR 생성물을 검정하여 MTAse 코딩 유전자가 시료내에 존재하는지를 확인할 수 있다. 바람직하게는, 이중가닥 PCR 생성물을 고체상에 결합시킨 다음 변성에 의해 가닥은 분리시킴으로써 서열-특이적 탐침으로 하여금 결합된 PCR 생성물의 안티센스 가닥에 혼성화되게 하여 상기 Kohsaka 등에 의해 기재된 바와 같이 실직적으로 유전자를 검출할 수 있게 된다. 이와는 달리, 탐침을 혼성화시키기 위해 이중가닥 PCR 생성물에 첨가하기 전에 PCR 생성물을 반응 환경으로부터 제거하고 증폭 혼합물로부터 분리할 수도 있다. 후자의 경우, PCR 생성물은 당 분야에 공지된 특정 검정 방법; 예컨데, 겔 익스클루젼, 전기영동 또는 친화성 크로마토그래피에 따라 증폭 혼합물로부터 분리될 수 있다.
증폭된 생성물의 검출은 검출가능한 표지와 안정적으로 결합되어 있는 혼성화 탐침을 사용하여 수행될 수 있다. 표지는 핵산 탐침에 공유 결합되거나 또는 단단하게 결합되어 탐침을 검출하는 능력을 가진 물질이다. 예컨데, 표지는 방사성 동위 원소, 효소 기질 또는 억제제, 효소, 방사선 불투과성 물질 (예컨데 콜로이드성 금속), 형광제, 화학발광성 분자, 임의의 상기 표지를 함유하는 리포솜, 또는 특정 결합 쌍일 수 있다. 적합한 표지는 증폭도중 검출능과 관련된 성질을 잃지 않는다.
분석학 분야의 숙련자는 시험관내 검출 검정에 사용하기 적합한 검출가능한 표지를 잘 알고 있을 것이다. 예컨데, 시험관내 사용에 적합한 방사성 동위 원소로는3H,125I,131I,32P,14C,35S 가 있다. 방사성 동위 원소에 의해 표지된 증폭 단편들은 감마 카운터 또는 방사선 사진의 농도계, 농도계와 결합한 증폭 단편 사우던 블로팅에 의한 방법을 통해 직접 검출될 수 있다. 적합한 화학 발광성 분자의 예로는 아크리딘 또는 루미놀이 있다. 아크리듐 에스테르로 유도된 탐침으로 혼성화된 표적 서열은 삽입 (intercalation) 에 의해 가수분해로부터 보호된다. 적합한 형광제의 예로는 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 단실 또는 로다민이 있다.
적합한 효소 기질 또는 억제제의 예로는 양고추냉이 과산화물, 글루코스 산화효소, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, β-갈락토시다제, 피루베이트 키나제 또는 알칼린 포스파타아제 아세틸콜린에스테라제에 특이적으로 결합하는 화합물이 있다. 방사선 불투과성 물질의 예로는 콜로이드성 금 또는 자성입자가 있다.
특정 결합 쌍은 두개의 상이한 분자로 이루어져 있는데, 이중 하나는 표면 또는 공동에 또다른 분자의 특정 공간적 또는 극성 조직체에 특이적으로 결합하는 영역을 갖는다. 특정 결합 쌍의 일원은 통상적으로 리간드 및 수용체 또는 리간드 및 안티-리간드로 지칭된다. 예컨데, 수용체가 항체일 경우 리간드는 이에 상응하는 항원이다. 기타 특정 결합 쌍으로는 호르몬-수용체 쌍, 효소 기질 쌍, 비오틴-아비딘 쌍 및 당단백질-수용체 쌍이 포함된다. 결합 특이성을 유지하는 특정 결합 쌍의 단편 및 일부도 여기에 포함되는데, Fab 단편 등을 비롯한 면역글로불린의 단편이 여기에 해당한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 특정 결합 쌍의 일원이 표지로써 사용되는 경우, 친화성 크로마토그래피에 의한 분리 방법이 바람직하다.
상기 기재된 검정법으로 증폭 생성물이 검출되지 않을 경우, 이는 시료내 존재하는 세포가 MTAse 결핍성임을 나타낸다. 정상 (즉, 비-악성) 세포는 MTAse 코딩 유전자를 검출가능한 양으로 함유할 것 (대립 유전자의 상실시에도) 이라 예상되므로, 세포내 MTAse 코딩 유전자가 결핍되어 있다는 것 (즉, 유전자의 동형접합성 결실을 갖는다는 것) 은 검정된 세포내에 촉매 활성 및 촉매 비활성 MTAse 가모두 결핍되어 있음을 나타낸다.
그러나, 필요에 따라, 문헌 [Seidenfeld, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 95:1861-1866 (1980); 및 본문 실시예 I 참고] 에 기재되어 있는 방법을 이용해 시료내 MTAse 촉매 활성을 미리 스크린해볼 수 있다. 이어서, 발명상의 검정법을 이용해 시료내 세포에 MTAse 코딩 유전자가 존재하는지를 확인할 수 있다. 시료는 또한 검정용 시료내 세포 오염물질: 즉, 비-악성 세포를 선별하기 위해 촉매 활성 또는 비활성 단백질의 존재에 대해 테스트될 수 있다. 이와 관련해 대안책 (즉, 혼성화 검정법 대신) 으로 사용되기에 적합한 면역검정법은 문헌 [Nobori, et al., Cancer Res. 53:1098-1101 (1991)] 및 본문에 인용된 동시 계류중인, 통상 부여 미국 특허 출원 일련 번호 제 08/177,855 호 (출원일: 1993 년 12 월 29 일) 에 기재되어 있다.
C. MTAse 결핍 세포
상기 기재된 검정 기법을 이용해, 하기의 인간 1 차 종양이 MTAse 결핍성인 것으로 나타났다. 이 목록은 본문에 기재된 검정법을 이용해 MTAse 결핍성이라 판명될 수 있는 암 형태를 총망라한 것이 아닌 대표격인 것으로 이해하게 될 것이다.
- 급성 림프아구성 백혈병 (약 80 % 빈도)
- 신경교종 (약 67 % 빈도)
- 비소 세포 폐암 (약 18 % 빈도)
- 유로텔리아성 종양 (예컨데, 방광암; 빈도는 종양 형태에 따라 다름)
상기 데이타를 근거로, 상기 질환을 앓고 있는 환자에게는 MTAse 가 결핍되어 있는 것으로 의심되어진다. 따라서, 상기 환자의 세포 시료의 MTAse 결핍성을 정기적으로 검정해 환자가 본 발명의 치료요법으로부터 혜택을 받을 수 있는지를 결정해야 한다.
다른 암환자로부터의 세포 시료를 대상으로 임상적으로 지시된대로 MTAse 결핍 여부를 검정해야 한다. 참고적으로, 하기 질환을 앓고 있는 환자의 1 차 종양 시료는 MTAse 결핍성이 아닌 것 (즉, "MTAse 풍부" 암) 으로 판명되었다:
- 유방암
- 결장암
- 뇌암 및 후두암
- 흑색종
- 신장암
- 성인 비림프아구성 백혈병
- 특정 급성 백혈병 (성인 및 소아)
상기 MTAse 풍부 암을 치료하기 위한 임상 실험이 L-알라노신을 이용해 수행되었으나, 뚜렷한 성과는 없었다.
III. MTAse 결핍 세포의 치료 방법
A. L-알라노신에 대한 약리학 및 독성 매개변수
영장류에서, L-알라노신의 약 75 % 는 약 24 시간내에, 주로 L-알라노시닐-IMP 및 L-알라노시닐-AICOR 의 뉴클레오시드 형태로, 소변을 통해 분비된다. 인간의 경우, 정맥내 투여 후 혈장으로부터의 제거는 이중 형태로 일어나는데, 이때 t1/2α= 14 분 및 t1/2β= 99 분이다 ("t1/2" 는 반감기이며 시간 (t) 는 근사값이다).
종래의 임상 실험에서, 독성은 투여량-제한적이었는데, 신장 독성, 구내염, 식도염 및, 보다 적은 빈도로, 골수억제, 두통, 메스꺼움 및 저혈압 또는 고혈압이 여기에 포함된다. 신장 독성은 4 g/m2체중을 초과한 단일 볼루스 (bolus) 복용시 나타났다. 더욱이, 별도로 하루에 약 350 mg/m2체중을 초과해 투여된 두명의 소아 환자는 간 기능장애를 앓았다. 구내염 및 식도염은 다중 볼루스 투여 후 일어났다. 기타 관찰된 반응은 환자 특이적이었다.
한 II 상 실험은 급성 비림프아구성 백혈병 성인 환자에게 5 일간 약 125 mg/m2체중의 투여량을 연속 주입시킴으로써 이루어졌다. 투여량 제한적인 독성은 점액성이었다.
B. 숙주에 ASS 억제제의 투여
본 발명의 MTAse 결핍성 검정에 따라 MTAse 결핍성이라고 판명된 암을 앓고 있는 포유류 숙주 (예컨데, 인간) 를 L-알라노신, L-알라노시닐-AICOR 또는 하다시딘, 바람직하게는 L-알라노신과 같은 ASS 억제제의 치료 유효량으로 처리한다. 이와 관련해, "치료 유효량" 이란 평가가능한 환자에게서 목적하는 종양 반응을 형성하는 투여량을 의미하는데, 이때 종양 반응이란 성장의 중지 또는 퇴행을 의미하며 임상학적으로 허용가능한 기준 (예컨데, Eagan, et al., Cancer, 44:1125-1128, 1979 [상기 참조에 의해 본문에 인용됨] 참고) 및 IND#14,247 (식품 의약품국) 하에 수행된 임상 실험에서 적용된 매개변수에 관한 시중 유통되는 보고서 (Eagan 등) 에 대하여 측정되었다. 상기 기준을 참고로, 세포내 AMP 를 고갈시키기 위해 본 발명에 사용될 ASS 억제제의 치료 유효량은 종양학 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 독성을 일으키는 것으로 알려진 것보다 낮은 투여량으로 ASS 억제제를 매일 투여하거나 또는 연속 주입하는 것이 약제의 항-대사물질 활성을 강화시키는 치료적 프로토콜로서 바람직하다. 상기 처리 방법에 대한 MTAse 결핍 세포의 특유의 민감성으로 인해, MTAse 풍부 세포의 처리에 있어서의 L-알라노신의 임상 실험에서 시험된 것보다 낮은 투여량이 요구됨으로써, 비증식성 세포에 대한 독성의 감소가 예상될 수 있다.
비-악성, MTAse 풍부 세포 또한 MTA 또는 아데닌 합성에 사용되기에 적합한 기질 유사체의 투여를 통해 ASS 억제제에 노출됨으로 인한 영향으로부터 보호될 수 있다. 이와 관련해 사용하기에 적합한 화합물로는 MTA, 2'-5' 디데옥시아데노신, 5'-데옥시아데노신, 2'-데옥시-5-데옥시-5'메틸티오아데노신 (예컨데, 실시예 II 참고) 이 있다. 그러나, MTAse 풍부 세포는 AMP 세포 풀을 보충하기 위해 메틸티오아데노신의 대사작용으로부터 아데닌을 생산할 수 있으며 따라서 MTAse 결핍 세포와 동일한 수준으로 AMP 가 고갈되지는 않을 것이라 예상된다.
본 발명이 충분히 기재되었으며, 이의 실행은 하기 실시예에 의해 예시되어 있다. 그러나, 실시예가 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다. 표준 약어가 실시예 전반에 걸쳐 사용되었는데, 예컨데 "ml" 은 밀리리터를, "h" 는 시간을, "mg" 는 밀리그람을 나타낸다.
실시예 I
연속 주입 후 MTAse 결핍 및 MTAse 풍부 인간 종양 이종이식편에 대한 L-알라노신의 생체내 효과
연속 주입 후 공지된 인간 MTAse 결핍 종양에 대한 L-알라노신의 생체내 효과를 평가하고, 상기 효과를 공지된 인간 MTAse 풍부 종양에 대한약제의 효과와 비교하기 위해, 2 x 106MTAse 결핍성 H292 NSCLC 세포 및 MTAse 풍부 Calu-6 종양 세포 (0.3 ml 50 % MATRIGELTM담체 중) 를, 각각, 8 Balb/C 흉선-제거 누드 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리에 주사한다. MATRIGELTM은 초기에 생체내 고체 매트릭스를 형성하는데 주입 첫째날에 각각의 마우스내에서 이를 대조용 종양 크기로서 측정한다 (14 일동안 다시 흡수됨). 추가 비교를 위해, 50 % MATRIGELTM담체 중의 107CEM T-ALL (MTAse 결핍 급성 림프아구성 백혈병) 세포를 8 마리의 다른 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 주사한다. 다수의 세포는, 각각, ATCC 기탁번호 CRL-1848 및 HTB-56 하에 시판되고 있는 세포계로부터 수득될 수 있다.
다음 날, 4 마리의 마우스에 좌우 상칭의 NSCLC 이식편을, 4 마리에 T-ALL 이식편을 종양 세포 접종 부위로 부터 일정 거리 떨어진 등부분에 ALZETTM1007D 삼투압성 주입 펌프를 이용하여 피하 이식시킨다. 펌프는 연속 주입을 통해 하루 60 mg/kg 을 전달토록 산정된 농도의 L-알라노신으로 채워진다. 60 mg/kg 투여량으로는 7 일 후 아무런 독성이 나타나지 않았으므로 상기 펌프를 제거하고, 추가로 7 일동안 하루 90 mg/kg 의 L-알라노신을 전달하는 펌프로 교체한다.
도 2 및 도 3 에 나와있는 것과 같이, 투여된 L-알라노신은 면역결핍성 쥐 숙주내 정착된 MTAse 결핍성 NSCLC ("H292 L-alan Tx"; 도 2) 및 T-ALL ("처리된 마우스"; 도 3) 이종이식편의 수축을 일으키고, 처리된 MTAse 풍부 NSCLC 세포 및 비처리된 MTAse-결핍 세포와 비교해 볼 때 면역결핍성 쥐 숙주내 새로운 MTAse-결핍 NSCLC 또는 T-All 이종이식편의 성장을 예방한다. 특히, 정착된 MTAse 풍부 종양은, 비처리된 MTAP-결핍성 NSCLC 또는 T-ALL 이종이식편과 마찬가지로, L-알라노신에도 불구하고 빠르게 성장한다.
실시예 II
MTAse 기질에 의한 MTAse 풍부성 건강한 세포의 보호
각각의 배양액에 MTAse 기질인 배양액에 메틸티오아데노신 (MTA) 를 투여함에도 불구하고 L-알라노신 (40 μM) 의 존재하에는 증식하지 못하는 MTAse 결핍성 NSCLC 세포의 선별적인 무능력은 두개의 세포계, MTAse 풍부 Calu-6 및 MTAse 결핍성 H292 의 비교를 통해 확인되었다 (도 4). 아데닌 (tAde) 을 함유하는 대조용 배양액은 L-알라노신과 관계없이 증식하였는데, 이는 선별적 독성이 MTAse-결핍 세포가 MTA 를 아데닌으로 대사시키지 못함으로 인한 것으로 확인되었다.
추가적인 비교에 있어서, MTA 또는 MTA 기질 유사체 5'-데옥시아데노신의 첨가는 MTAse 풍부 A427 세포 및 MOLT-4 세포에서만 성장 회복을 일으킨 반면, MTAse 결핍성 A549 및 CEM 세포의 성장은 계속 억제되었다 (도 5A 및 B). MTA 는 스퍼민 합성 효소의 피드백 억제제이므로, MOLT-4 와 같은 몇몇 세포계는 높은 농도에 의해 억제된다. 이는 MTA 농도의 증가에 따른 이중 형태의 성장 회복 곡선을 나타낸다 (도 5A).
실시예 III
MTAse 게놈성 클론의 클로닝 및 부분 특성 분석
인간 MTAse 의 게놈성 클론을 하기와 같이 분리한다. 인간 태반 DNA (Clontech) 로부터 구축된 코스미드 유전자 라이브러리를 MTAse cDNA 유전자 탐침, 서브클론 MTAP-7 유래의 Not I/EcoRi 단편을 사용해 스크린한다. 라이브러리로부터 형질전환된 E. coli 세포를 앰피실린 (50 mg/l) 함유 LB 플레이트상에 도포하는데, 이때 콜로니 밀도는 1-2 x 104/135 x 15 mm 플레이트가 되게 한다.
하기 절차를 수행한다. 50 만개의 콜로니로부터, MTAP-10 이라 명명된 단일 양성 콜로니를 분리하고 PCR 분석 및 직접 서열분석을 통해 부분 특성분석한다. 두개의 프라이머, 정지 코돈으로부터 120 bp 상류에 위치한 센스 올리고뉴클레오티드 및 정지 코돈으로부터 20 bp 하류에 위치한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하여 PCR 분석에 사용한다. PCR 을 25 회 수행하는데, 이때 각 회전은 변성 (92℃, 1 분), 어니일링 (55℃, 2 분) 및 연장 (72℃, 5 분) 으로 이루어진다. PCR 생성물을 0.8 % 아가로스 겔상에서 분리시킨다.
상기 기재된 기법을 이용해 현재까지 확인된 MTAse 유전자내 엑손의 위치는 도 1 에 밑줄 그어져있다.
실시예 IV
악성 세포계에 MTAse 서열-특이적 올리고뉴클레오티드의 적용을 통한 상기 세포내 MTAse 의 존재 또는 부재의 확인
실시예 IV 에 기재된 바에 따라 확인된 MTAse 게놈성 클론으로부터 개발된 올리고뉴클레오티드 탐침 (서열 번호 1) 의 유용성을 시험하기 위해, MTAse 풍부 세포 (Calu-6; ATCC 수탁번호 HTB-56) 및 MTAse 결핍 세포 (A549; ATCC 수탁번호 CCL-185) 를 함유하는 것으로 알려진 다수의 인간 폐암 세포계를 대상으로 PCR 을 수행한다. 게놈성 DNA 를 실시예 III 에 기재된 바에 따라 분리하고 이 중 1 μg 을 PCR 에 사용한다.
상기 기재된 바와 같이 증폭을 40 회전 실시하는데, 이때 각 회전은 변성 (92℃, 1 분), 어니일링 (55℃, 1 분), 및 연장 (72℃, 1/2 분) 으로 이루어진다. PCR 생성물을 1.5 % 아가로스 겔 상에서 분석한다. MTAse 결핍성이라 알려진 세포계에서는 MTAse 가 검출되지 않았으나, MTAse 풍부 세포계에서는 MTAse 가 검출되었다.
실시예 V
정착된 종양 이종이식편을 갖는 누드 마우스에 L-알라노신을 매일 주사한 후의 MTAP-결핍 종양의 억제
6 주된 Balb/c 흉선 제거 누드 마우스에 107A549 또는 A427 NSCLC 세포를 피하내 주사한다. 종양의 직경이 약 0.4 cm 에 이르면, 12 시간마다 L-알라노신 또는 식염수를 복막내 주사하여 처리를 시작한다.
7 일간은 마우스에 1 회 15 mg/kg 을 주사하고 이후 5 일간은 22.5 mg/kg 을 주사한다. 종양 크기는 수직 직경의 곱으로 측정한다. 처리된 (각 세포 형태에 대해 n = 6 [시료 크기]) 마우스 대 대조군 (각 세포 형태에 대해 n = 4 [시료 크기]) 마우스의 결과가 도 7 에 나와 있다.
테스트된 투여량 모두에서 독성은 발견되지 않았다 (시험내내 마우스의 체중은 일정하게 유지되었다). 1 일 2 회 볼루스 주사로 L-알라노신이 투여된 경우, 정착된 MTAP-결핍 종양의 크기는 감소하였으나, MTAP-양성 세포의 성장에는 아무런 영향을 주지 않았다.
서열의 요약
서열 번호 1 은 메틸티오아데노신 포스포릴라제 (MTAse) 에 대한 게놈성 클론이다.
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
(ii) 발명의 명칭: 악성 메틸티오아데노신 포스포릴라제 결핍 세포내 아데닐로숙시네이트 합성효소 활성의 억제 방법
(iii) 서열의 수: 1
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 로빈스, 벨라이너 및 카슨
(B) 거리: 엔. 피구에로아 스트리트 201, 5 층
(C) 시: 로스안젤레스
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국: 미국
(F) ZIP: 90012-2628
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 타입: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현재 출원 데이타:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 이름: 벨라이너, 로버트
(B) 등록번호: 20,121
(C) 참조/일람 번호: 5555-423
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (213)977-1001
(B) 팩스: (213)977-1003
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 2763 염기쌍
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(vii) 기원:
(B) 클론: 메틸아데노신 포스파타아제
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타내는 기호: CDS
(B) 존재 위치: 1..2763
(xi) 서열 기재: 서열 번호 1:

Claims (13)

  1. 하기로 이루어지는 메틸티오아데노신 포스포릴라아제 (MTAse) 결핍 세포내 아데닐 숙시네이트 합성효소 (ASS) 의 활성을 억제하는 방법:
    (a) 포유류 숙주로부터 수득된 세포군이 MTAse 결핍성임을 확인하고;
    (b) 숙주에 치료 유효량의 ASS 억제제를 투여하므로써 상기 접촉으로 인해 MTAse 결핍 숙주 세포로부터 아데노신 5'-모노포스페이트를 고갈시키는 효과를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (a) 가 하기 과정에 의해 수행되는 방법:
    (a) MTAse 결핍성이라 의심되어지는 검정가능한 세포 시료를 수득하고;
    (b) 탐침이 시료내 임의의 핵산에 검출가능한 수준으로 혼성화되도록 하는 조건하에서 시료내 존재하는 임의의 MTAse 코딩 핵산에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 탐침을 시료에 첨가하고;
    (c) 시료내 MTAse 코딩 핵산이 존재하는지 검출한다 (이때, 상기 핵산의 존재는 세포 시료내 MTAse 단백질의 존재를 나타낸다).
  3. 제 1 항에 있어서, ASS 억제제가 L-알라노신인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, MTAse 결핍 숙주 세포가 비소 세포 폐암 세포, 급성 림프아구성 백혈병 세포, 신경교종 세포 및 유로텔리알 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 차 종양 세포인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, ASS 억제제가 매일 또는 지속적으로 숙주에 투여되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, AMP 의 세포내 생산에 사용되는 기질이 단계 (b) 에 따른 숙주의 처리 후에 숙주에 투여되는 방법.
  8. 메틸티오아데노신 포스포릴라제 (MTAse) 결핍성이라 알려진 세포인, 포유류 숙주의 세포내 아데닐숙시네이트 합성효소 (ASS) 의 활성을 억제하는 방법으로서, 치료 유효량의 ASS 억제제를 숙주에 투여하는 것으로 이루어지며, 이로인해 MTAse 결핍 숙주 세포로부터 아데노신 5'-모노포스페이트가 고갈되는 효과를 나타내는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, ASS 억제제가 L-알라노신인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, MTAse 결핍 숙주 세포가 비소 세포 폐암 세포, 급성 림프아구성 백혈병 세포 및 신경교종 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 차 종양 세포인 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, ASS 억제제가 매일 또는 지속적으로 숙주에 투여되는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, AMP 의 세포내 생산에 사용되는 기질이 ASS 억제제를 숙주에 투여한 후 숙주에 투여되는 방법.
KR1019980707079A 1996-03-08 1997-01-27 메틸티오아데노신 포스포릴라제 결핍 세포내 아데닐로숙시네이트 합성효소 활성의 억제 방법 KR19990087627A (ko)

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