JP2000509247A - 悪性メチルチオアデノシンホスホリラーゼ欠損細胞でアデニロコハク酸シンセターゼ活性を抑制する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ある種の癌の治療に有用な、インビボにおいてアデノシン５’一燐酸（ＡＭＰ）を哺乳類細胞から枯渇させる方法が提供される。本方法にしたがって、細胞集団をホストから得て、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）活性の消失が分析される。ＭＴＡｓｅは、細胞内ＡＭＰプールへアデニンを取り込む内在性回収のためにメチルチオアデノシンをアデニンに代謝する。ＭＴＡｓｅ活性の消失をアッセイする好ましい方法は、ＭＴＡｓｅタンパクをコードする遺伝子がホモ接合性欠失により細胞から欠失しているか否かを検出するハイブリダイゼーション技術である。さらに提供されるものはＭＴＡｓｅ欠損癌を治療する方法で、本方法は、イノシン５’一燐酸をＡＭＰに変換するアデニルコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）の活性を抑制する薬剤の治療的有効量をＭＴＡｓｅ欠損細胞と接触させて、当該腫瘍細胞からＡＭＰの新規産生のための基質を枯渇させることを含む。Ｌ−アラノシンが本発明の方法で使用する好ましいＡＳＳ抑制剤である。図はＭＴＡｓｅのゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）で、エクソンには下線が施されている。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性メチルチオアデノシンホスホリラーゼ欠損細胞で アデニロコハク酸シンセターゼ活性を抑制する方法 関連出願との関係 本出願は、係属中の米国特許出願（1993年12月29日出願）第08/176855号の部 分継続出願である。 発明の背景 本発明は、癌の化学療法において使用する医薬および方法に関する。より具体 的には、本発明は、アデニンヌクレオチドのサルベージ合成を目的とするメチル チオアデノシンのアデニンへの代謝ができない癌細胞の特定、およびそのような 癌細胞でのアデノシン５’一燐酸（ＡＭＰ）の新規合成を抑制するＬ−アラノシ ンの使用に関する。 発明の由来 メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）は、健常な哺乳類細胞ではメチルチオアデノ シンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）によってアデニンとメチルチオリボース−１ −Ｐに切断される。後者はメチオニンの代謝合成のための基質である。アデニン はアデノシン５’一燐酸（ＡＭＰ）の細胞プールに回収され、細胞は、ＡＭＰか ら代謝エネルギーに関わるアデノシン５’三燐酸（ＡＴＰ）を、さらにＤＮＡ合 成に関わる２’デオキシアデノシン５’三燐酸（ｄＡＴＰ）を誘導する。 初期のインビトロの研究を基に、細菌用抗生物質アラノシンのＬ型異性体(Str eptomyces alanosinicusから得られる；以下“Ｌ−アラノシン”）が、抗ウイル ス剤および抗癌剤としての使用で有望であるように思われた。特に、Ｌ−アラノ シンは、アデニロコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）の有するイノシン５’一燐酸 （ＩＭＰ）からＡＭＰへの変換作用を抑制し、したがって標的細胞からＡＭＰお よびＡＴＰを（アデニンの非存在下で）枯渇させると考えられる。しかしながら 、癌患者でのＬ−アラノシンの治療効果に関する臨床実験は期待通りの結果を生 まなかった（例えば以下の文献を参照されたい：(TyagiとCooneyで収集されたデ ー タ：Adv．Pharmacol．Chemotherapy，20:69-120(1984)〔その時以来今日までの 結果は、ヒトの癌に対するＬ−アラノシンの効果に関して殆ど希望を与えるもの ではなかった〕;Creaganら、Cancer，52:615-618(1993)〔フェイズII試験では全 体的な反応率はわずか４％であった〕:Creaganら、Am．J．Clin．Oncol.，7:543 -544(1984)〔メラノーマ患者でのフェイズII試験では治療反応は殆ど認められな かった〕;VonHoffら、Invest．New Drugs，9:87-88(1991)〔乳癌患者では目的の 反応は全く認められなかった〕）。最終的には癌の治療を目的としてＬ−アラノ シンを使用する臨床試験は全て断念された。 ＡＳＳ活性のまた別の抑制物質はハダシジンである。しかしながら、ハダシジ ンはヒトではＬ−アラノシンよりも毒性が高いと考えられる。さらに、プリンの 新規合成に関する他の抑制物質（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリ ン、６−チオグアニンおよびｄ−イデアザテトラヒドロフォレート、これらはＩ ＭＰ合成を阻害し、したがって理論的にはＡＭＰ産生の供給源としてのＩＭＰを 排除する）の活性は、ＩＭＰ産生の基質として使用されるヒポキサンチン（これ は血漿中に豊富である）の回収によって妨害されてしまった。したがって今日ま で、細胞内ＡＭＰ産生のためのアデニン代謝経路を阻害する薬剤のインビボにお ける能力は極めて低く期待にそむくものであった。 しかしながら、ある種のヒトの癌細胞においてＭＴＡｓｅをコードする遺伝子 のホモ接合性欠損を特定する十分に鋭敏なアッセイの開発にともない（合わせて 譲渡された親特許の米国特許出願第08/176855号を参照されたい）、Ｌ−アラノ シンの臨床試験で処置された腫瘍はＭＴＡｓｅを産生し、したがって十分なアデ ニンを産生し、ＩＭＰからＡＭＰ産生を抑制したにもかかわらずＡＭＰプールを 維持できたらしいことが分かった。したがって本発明は、ＭＴＡｓｅを欠く細胞 を特定し、さらにそのような細胞からＡＭＰを枯渇させて治療する方法を提供す る。 発明の要旨 ＭＴＡｓｅタンパクをコードする遺伝子を欠き、したがってＭＴＡをアデニン に代謝できない細胞（ＭＴＡｓｅ欠損細胞）は、ＡＭＰ新規合成抑制物質（例え ばＬ−アラノシン）の治療的有効量と接触したときにインビボで選択的に殺され ることが分かった。したがって、Ｌ−アラノシンは全ての癌細胞に対して有効で あるというわけではないが、ＭＴＡｓｅ欠損細胞に対しては治療的に有効である 。 本発明の特徴の１つでは、細胞がＭＴＡｓｅタンパクを欠くか否かを決定する アッセイを提供することによって特定の癌細胞がＭＴＡｓｅ欠損であるか否かを 決定する方法が提供される。これに関して使用される好ましいアッセイは、ＭＴ Ａｓｅタンパクをコードする遺伝子のホモ接合性欠損を細胞で検出するアッセイ である。 別の特徴では、本発明は、ＡＳＳ活性を抑制するプリンの新規合成抑制物質( 好ましくはＬ−アラノシン)の治療的有効量とＭＴＡｓｅ欠損細胞を接触させる ことによってＭＴＡｓｅ欠損癌を治療する方法を提供する。本発明のＡＳＳ抑制 剤は臨床的に許容できるいずれの手段によって投与してもよいが、好ましくは、 所望の抑制活性を長引かせ、さらにホスト組織への毒性を最少にするために最高 許容量未満の濃度で持続輸液によって投与される。 さらに、本発明の方法で使用するキットが提供されるが、当該キットは、ＡＳ Ｓ抑制物質の医薬組成物（好ましくはＬ−アラノシン）および／またはその活性 な代謝物、Ｌ−アラノシニルＡＩＣＯＲと同様に本発明のＭＴＡｓｅ欠損アッセ イの実施で使用される試薬を含む。 図面の簡単な説明 図１は、ＭＴＡｓｅゲノムヌクレオチド配列（配列番号１）で、エクソンには 下線が施されている。 図２は、ＭＴＡｓｅ能を有するヒト非小型細胞肺癌（non-small cell lung ca ncer）およびＭＴＡｓｅ欠損ヒト非小型細胞肺癌のヌードマウスへの定着異種移 植腫瘍に対する持続輸液後のＬ−アラノシンのインビボにおける効果を示すグラ フである。 図３は、ＭＴＡｓｅ欠損急性リンパ芽球性白血病のヌードマウスへの定着異種 移植腫瘍に対する持続輸液後のＬ−アラノシンのインビボにおける効果を示すグ ラフである。 図４および５（Ａ、Ｂ）は、ＭＴＡｓｅ能を有するか又はＭＴＡｓｅ欠損細胞 株にＬ−アラノシン処理後に種々の外因性ＭＴＡｓｅ基質を投与した場合の効果 を示すグラフである。 図６は、ＡＭＰ産生の細胞内代謝経路の模式図である。 図７は、Ｌ−アラノシンを毎日注射した後のＭＴＡｓｅ欠損ヒト非小型細胞肺 癌のヌードマウスへの定着異種移植腫瘍に対するインビボの効果を示すグラフで ある。 好ましい実施態様の説明 Ｉ．ＡＭＰ細胞内産生のための代謝経路 本発明の理解を助けるために、ＡＭＰが産生される細胞内代謝経路を示す図を 図６に提供する。要約すれば、細胞内ＡＭＰ産生のために３つの主要な基質供給 源がある。第一は、ＭＴＡｓｅによるメチルチオアデノシンからアデニンへの異 化作用である。この経路はＭＴＡｓｅ欠損細胞では阻害されている。 第二は、ＡＳＳまたはアデニルコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）の活性によるＩＭ ＰからＡＭＰへの変換である。現在のところＡＳＬ活性の抑制物質は知られてい ない。しかしながら、ＡＳＳ活性が失われるとともに、ＩＭＰ・ＡＭＰ変換は実 質的に排除される。 第三は、ＡＭＰのためのヒポキサンチン回収である。しかしながら、ＩＭＰ・ ＡＭＰ変換はヒポキサンチン回収より遠位部で生じるので、ＩＭＰ・ＡＭＰのＡ ＳＳ異化作用の抑制はヒポキサンチン回収経路を阻害する。 II．哺乳類ホストから得られたアッセイ可能なサンプル中の腫瘍細胞がＭＴＡ ｓｅ欠損であるか否かを決定する方法 Ａ．ＭＴＡｓｅ欠損細胞を特定する際に使用されるポリヌクレオチド試薬 特定の細胞集団がＭＴＡｓｅ欠損であるか否かを決定する好ましい方法は、Ｍ ＴＡｓｅをコードする遺伝子がホモ接合性で細胞から欠失していることを検出す ることができるハイブリダイゼーションアッセイによって実施される。核酸ハイ ブリダイゼーションに依拠するスクリーニング方法は、適切なプローブが利用可 能であるということを条件に全ての生物における一切のポリヌクレオチド配列の 検出を可能にする（さらに、そのようなポリヌクレオチド配列によってコードさ れる一切のタンパクの検出も可能にする）。 本発明での使用に適したハイブリダイゼーション技術の完全な内容は、ＭＴＡ ｓｅをコードする遺伝子の記述と同様に、合わせて譲渡されたともに継続中の米 国特許出願第08/176855号（1993年12月29日出願）に記載されている（当該出願 の内容は、それについて為された一切の補正とともに参照により本明細書に含ま れる）。参照の便宜のために、ＭＴＡｓｅをコードする遺伝子のポリヌクレオチ ド配列を本明細書に添付した配列表の配列番号１および図１（ここでは当該遺伝 子のコード領域は下線を施して特定されている）に記載する。 ＭＴＡｓｅゲノムポリヌクレオチドは、第９染色体の領域ｐ２１に位置する。 興味深いことには、腫瘍サプレサーｐ１６をコードする遺伝子のホモ接合性欠損 をもつ細胞は、非常に高い率でＭＴＡｓｅをコードする遺伝子のホモ接合性欠損 を有する。したがって、後者の遺伝子（ＭＴＡｓｅをコードする）のホモ接合性 欠損を検出する代替手段は、前者の遺伝子（ｐ１６をコードする）のホモ接合性 欠損を検出することによって実施される。この点に関する更なる参考のためには 、合わせて譲渡された共に継続中の米国特許出願第08/227800号(この文献は参照 により本明細書に含まれる)を参照されたい。 完全な長さのラットＭＴＡｓｅのゲノムＤＮＡを含む大腸菌株は、アメリカ基 準株収集所（American Type Culture Collection，ロックビル、メリーランド） に１９９３年１２月２９日以前に郵送によって寄託され、まとめて指定番号５５ ５３６号、５５５３７号、５５５３８号、５５５３９号および５５５４０号を与 えられた。本発明を実施する権限のために本寄託が必要であるということが承認 されたわけではない。しかしながら、本寄託は、その期間がどのようなものであ れ生命活性を有する形態で維持されるか、または本開示に適用される特許法によ って必要とされるかもしれない。 ＭＴＡｓｅ遺伝子が問題の細胞からホモ接合性で欠失しているか否かを決定す るために、ホストからアッセイ可能な細胞性サンプルを入手する。これらサンプ ルには、例えば、ホストの組織または腫瘍に由来する、体液または細胞が含まれ る。そのようなサンプルは当臨床分野で既知の方法を用いて入手できるが、例え ば腫瘍細胞は生検または外科的切除によって入手できるであろう。好ましくは、 これら細胞は、“夾雑物”（すなわちアッセイの結果を偽る可能性がある細胞、 タンパク質および類似の成分）を本質的に含まない。例えば、固形腫瘍がアッセ イ可能な細胞サンプルの供給源である場合には、正常な非悪性細胞および当該生 物学的サンプルを得るために操作実施中に正常細胞から遊離されるＭＴＡｓｅは 夾雑物と考えられるであろう。そのような夾雑物は、通常の精製技術（例えば抗 ＭＴＡｓｅ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー）によって除去でき る。 本発明は、ＭＴＡｓｅ陰性と思われる細胞性サンプル中の本遺伝子の有無を検 出することを目的としているので、検出方法の感度を高めるためにサンプル中の 核酸は好ましくは増幅される。好ましくはこの増幅はポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）を用いたものであるが、ポリメライゼーション工程における連鎖反応の使 用は必須というわけではない。 サンプル中の増幅されるべき核酸は、もしサンプル中に存在するとしたら、そ れは通常ＭＴＡｓｅをコードすると考えられるゲノムＤＮＡまたは野性型ＤＮＡ から成るであろう（配列番号１参照）。ＭＴＡｓｅコードＤＮＡ（以下“標的Ｄ ＮＡ”）は、ヒト細胞を含む全ての正常哺乳類細胞に存在すると考えられる。 コントロールとして、またはオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの 供給源として使用するために、ＭＴＡｓｅをコードするゲノムＤＮＡを当技術分 野で既知の方法、例えばマニアーティスらの記載した方法（Maniatisら、「分子 クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」C old Spring Harbor Laboratory Press刊(1982)）にしたがって分離できる。ヒト ＭＴＡｓｅ遺伝子のゲノムクローンの分離を説明する実用的な実施例を本明細書 で提供するが、この例では、ＭＴＡｓｅのｃＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ を用いてコスミド遺伝子ライブラリーがスクリーニングされる（実施例III参照 ）。しかしながら、ＭＴＡｓｅコードＤＮＡを得る他の適切な手段も用いること ができることは当業者には理解されよう。 例えば、問題のポリヌクレオチドを含むと考えられるｃＤＮＡライブラリーは 、ｃＤＮＡ由来の種々のｍＲＮＡを卵母細胞に注射し、当該ｃＤＮＡ遺伝子産物 が生じるために十分な時間を置き、さらに、例えば問題のポリヌクレオチドによ ってコードされるペプチドに特異的な抗体を用いることによって、または問題の ポリヌクレオチドによってコードされるペプチドの反復モチーフのためのプロー ブを用い、さらに当該ペプチドに特徴的な組織発現パターンによって、所望のｃ Ｄ ＮＡ発現サンプルの存在についてテストすることによりスクリーニングされる。 また別には、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも１つのエピトープをもつ目的 のペプチド（例えばＭＴＡｓｅタンパク）の発現について当該ペプチドに特異的 な抗体を用いて間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体の由 来はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、それらは問題のｃＤＮＡの存 在を示唆する発現生成物を検出するために用いることができる。（更なる参考と してマニアーティスらの諭文を参照されたい:Maniatisら、「分子クローニング： 実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」Cold Spring Harb or Laboratory Press刊(1982)）。 コントロール、プローブまたはプライマーとして本発明で使用するポリヌクレ オチドはまた、当技術分野で周知の技術と核酸合成装置を用いて合成できる。こ の点に関する参考としてオースベルらの論文を参照されたい(Ausubelら、「分子 生物学の最新プロトコル(Current Protocois in Molecular Biology)」、第２お よび４章、Wiley Interscience刊(1989))。 Ｂ．ＭＴＡｓｅをコードするゲノムＤＮＡの増幅とそのためのハイブリダイゼ ーションアッセイ 本発明のハイブリダイゼーションアッセイの感度を高めるために、好ましくは 、アッセイするべき細胞サンプルは標的核酸の選択的増幅に有利な条件を与えら れる。好ましくは、標的核酸はＭＴＡｓｅをコードする遺伝子のポリヌクレオチ ド部分であろう（すなわち一標的ポリヌクレオチド）。当該標的ポリヌクレオチ ドを増幅する好ましい手段はＰＣＲによる。 ＰＣＲは、特定の核酸配列とハイブリダイズし、さらに標的核酸内の問題の領 域に接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ 配列を酵素によってインビトロ合成する方法である。鋳型の変性、プライマーの アニーリングおよびアニーリングしたプライマーの酵素による伸長というサイク ルの反復繰り返しによって、その末端がプライマーの５’末端によって規定され る固有の核酸フラグメントが指数関数的に蓄積される。１回のサイクルで合成さ れる生成物（ＰＣＲ生成物）は次のサイクルのための鋳型として機能し、結果と して標的核酸コピーの数は各サイクルでほぼ２倍になる。 基本的なＰＣＲ技術はムリス（Mullis）らの米国特許第4683195号および46832 02号に記載され、これらの内容はＰＣＲ実施のための通常の技術の例として本明 細書に取り込まれている。しかしながら、本発明は、ムリスらの4863202号特許 で開示されたＰＣＲ技術の使用に限定されることを意図しない。ムリスらの技術 の開発以来、当該技術を改変した多くのＰＣＲを基にしたアッセイが開発されて きた。当技術分野でこれらの改変は周知であり、従って本明細書では詳細に述べ ない。しかしながら、当技術分野の範囲を説明する目的でこれら改変の幾つかを 下記で説明する。 標的核酸と配列およびサイズが異なる競合鋳型を用いる内部増幅基準物を提供 するＰＣＲ技術は報告されている(Gillilandら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 87:2725-2729(1990))。配列は異なるがサイズは異ならない鋳型を用いる“競合 ”ＰＣＲを実施するまた別の技術も報告されている(Kohsakaら、Nuc．Acids Res .，21:3469-3472(1993))。この技術は、増幅核酸を分析するために酵素連結免疫 吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する場合に特に好ましい技術である。遺伝子 の変異または多形性を検出するために位置特異的オリゴヌクレオチドを用いる非 競合ＰＣＲ技術(これはまた本発明の方法に利用できる)は文献に記載されている (Saikiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6230-6234(1989))。これらの技術 は各々、ＰＣＲ中に発生する可能性がある一切の非特異的増幅に由来する偽陽性 結果の排除の助けになるという、ハイブリダイゼーションプローブを用いる場合 における利点を有する。 更なる背景を知るために、当業者はイニスらの論文を参照することができる： 「ＰＣＲの最適化、ＰＣＲプロトコル：方法と応用の手引（”Optimization of PCR's”，PCR Protocols:A Guide to Methods and APPlications)」、Academic Press刊(1990)）。この文献は、所望のＰＣＲ生成物の特異性、正確さおよび収 量に影響を与える技術の要約である。 ＭＴＡｓｅ標的ポリヌクレオチドのいずれかの側（すなわち５’および３’） の短い塩基対ストレッチ（すなわち“隣接（flanking）配列”）と特異的にハイ ブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー(少なくとも１つのプライマー対) が選択される。当業者は、本明細書に添付した配列リストに配列番号１としてさ らに図１で示すポリヌクレオチド配列の情報を基に煩雑な実験を行うことなく適 切なプライマーを容易に選択できるであろう。 プライマーの作製のためには、当該プライマーが自分自身とハイブリダイズす るような相補性塩基を含まないことが大切である。サンプル中に存在する可能性 がある一切の夾雑物質の増幅を排除するために、好ましくはプライマーはエクソ ン（ＭＴＡｓｅ遺伝子の場合これは図１の下線部である）を含むように作製され る。 上記に特記したように、サンプル中の核酸を適切に増幅させるためにこの重合 工程で連鎖反応を利用する必要は必ずしもない。例えば、コーサカら(Kohsakaら 、上掲書)が記載した技術を用いる場合は、重合工程は固相支持体手段で実施さ れ、その後で標的ポリヌクレオチド特異的プローブでハイブリダイズされる。こ のアッセイの感度は、標的ポリヌクレオチドのただ１回のポリメライゼーション 反応が必要とされる全てである場合の感度であろう。 増幅工程が完了するや、ＰＣＲ生成物をアッセイし、それによってＭＴＡｓｅ をコードするべき遺伝子がサンプル中に存在するか否かを決定する。好ましくは ＰＣＲ生成物を固相に結合させ、その結果当該鎖が変性によって分離し、それに よって配列特異的プローブをＰＣＲ生成物の結合アンチセンス鎖とハイブリダイ ズさせ、上掲書でコーサカらが述べたように当該遺伝子を検出できる。また別に は、ＰＣＲ生成物を反応環境から取り出して、二重鎖ＰＣＲ生成物とのハイブリ ダイゼーションのためのプローブを添加する前に当該増幅混合物から分離する。 この後者のアプローチでは、ＰＣＲ生成物は、検出のために選択される個々の方 法について当技術分野で既知の方法（例えばゲル分離、電気泳動またはアフィニ ティークロマトグラフィー）にしたがって増幅混合物から分離される。 増幅生成物の検出は、検出可能な標識と安定的に結合させたハイブリダイゼー ションプローブを用いて達成できる。標識は、核酸プローブと共有結合によって 結合しているかまたは堅固に結合している物質で、プローブを検出する能力をも たらす。例えば標識は、放射性同位元素、酵素基質もしくは抑制物質、酵素、放 射線不透過性物質（コロイド金属を含む）、蛍光物質、化学発光分子、上記の標 識のいずれかを含むリポゾーム、または特異的結合対構成物質であろう。適切な 標識は、検出能力に必須の品質を増幅時に失わないであろう。 診断分野で習熟した者は、インビトロでの検出アッセイで使用できる適切な検 出可能標識について知識を有するであろう。例えば、インビトロで使用できる適 切な放射性同位元素には³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓが含まれる。放 射性同位元素手段によって標識される増幅フラグメントは、ガンマカウンターに より、またはオートラジオグラフィーの濃度測定により、または濃度測定と組み 合わせた増幅フラグメントのサザンブロッティングにより直接検出できる。適切 な化学発光分子の例はアクリジンまたはルミノールである。アクリジウムエステ ルから誘導したプローブとハイブリダイズした標的配列は、挿入による加水分解 から保護される。適切な蛍光物質の例は、フルオレセイン、フィコビリタンパク 、希土類キレート、ダンシルまたはローダミンである。 適切な酵素基質または阻害物質の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グ ルコースオキシダーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、β−ガラクト シダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、またはアルカリフォスファターゼアセチルコリ ンエステラーゼと特異的に結合する化合物である。放射線不透過物質の例はコロ イド金または磁性粒子である。 特異的結合対は２つの異なる分子を含み、この場合、当該分子の一方は、別の 分子の固有の空間構造および極性構造と特異的に結合する領域をその表面または 空洞内に有する。特異的結合対の構成分子は、しばしばリガンドとレセプターま たはリガンドと抗リガンドと呼ばれる。例えば、レセプターが抗体である場合は 、リガンドは対応する抗原である。他の特異的結合対にはホルモン−レセプター 対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対および糖タンパク−レセプター対が含 まれる。結合特異性を保持している特異的結合対のフラグメントおよび部分、例 えば免疫グロブリンのフラグメント（Ｆａｂフラグメントなどを含む）も含まれ る。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかである。特 異的結合対の構成物質が標識として用いられる場合は、好ましい分離方法はアフ ィニティークロマトグラフィーを含む。 上記のアッセイで増幅生成物が検出できない場合は、サンプル中に存在する細 胞のＭＴＡｓｅ欠損を示唆する。正常（すなわち非悪性）細胞は、（たとえ一方 の対立遺伝子座が欠失していたとしても）常に検出可能量のＭＴＡｓｅコード遺 伝子を有すると期待されるので、細胞がＭＴＡｓｅコード遺伝子を欠く（すなわ ち当該遺伝子のホモ接合性欠損を有する）という所見は、アッセイされた細胞が 触媒的に活性なＭＴＡｓｅおよび触媒的に活性をもたないＭＴＡｓｅの両方を欠 いているということを示す。 しかしながら、所望の場合には文献に記載された方法（Seidenfeldら、Bioche m．Biophys．Res．Commun.，95:1861-1866(1980);さらに以下の実施例Ｉもまた 参照のこと）を用いてＭＴＡｓｅ触媒活性についてサンプルを予備スクリーニン グすることができる。続いて本発明のアッセイを用いて、ＭＴＡｓｅをコードす る遺伝子がサンプルの細胞に存在するか否かを決定できるであろう。サンプルは また、アッセイされるべきサンプル中の細胞性夾雑物（すなわち非悪性細胞）を 排除する目的で触媒的に活性または不活性なタンパクの存在についてテストする ことができる。これに関して代替できる(すなわちハイブリダイゼーションアッ セイに代わる)適切な免疫アッセイは、ノボリらの論文(Noboriら、Cancer Res. ，53:1098-1101(1991))および合わせて譲渡された同時継続中の米国特許出願第0 8/177855号（1993年12月29日出願）（この内容は参照により本明細書に含まれる ）に記載されている。 Ｃ．ＭＴＡｓｅ欠損細胞 上記のアッセイ技術を用いて、以下のヒト原発腫瘍がＭＴＡｓｅ欠損であるか 否かを決定した。このリストは、記載したアッセイ方法を用いてＭＴＡｓｅ欠損 であるか否かを決定できる癌の種類の典型例であって、網羅したものではないこ とは理解されよう。 ・急性リンパ芽球性白血病（約８０％で出現） ・神経膠腫（約６７％で出現） ・非小型細胞肺癌（約１８％で出現） ・尿皮細胞腫瘍（例えば膀胱癌；出現率は腫瘍の種類によって変動） これらのデータに基づいて、これらの症状をもつ患者についてＭＴＡｓｅ欠損 が強く疑われるはずである。したがって、そのような患者の細胞サンプルを日常 的にＭＴＡｓｅ欠損についてアッセイし、患者が本発明の治療方法によって利益 を受けそうであるか否かを決定するべきである。 臨床的に徴候を示す他の癌患者の細胞サンプルもアッセイするべきである。参 考のために、以下の症状をもつ患者の原発腫瘍細胞はＭＴＡｓｅ欠損であるとは 認められなかった（すなわち当該癌は“ＭＴＡｓｅ能有り”である）。 ・乳癌 ・大腸癌 ・頭部および頸部癌 ・メラノーマ ・腎癌 ・成人非リンパ芽球性白血病 ・ある種の急性白血病（成人および小児） 上記のＭＴＡｓｅ能をもつ癌の治療にＬ−アラノシンを用いる臨床試験が実施 されたが評価できる成果は得られなかった。 ＩＩ．ＭＴＡｓｅ欠損細胞の治療方法 Ａ．Ｌ−アラノシンの薬理学的指標および毒性指標 霊長類では、Ｌ−アラノシンの約７５％が、主にＬ−アラノシニル−ＩＭＰお よびＬ−アラノシニル−ＡＩＣＯＲのヌクレオシドの形として約２４時間で尿中 に排出される。ヒトの静脈内投与後の血漿からのクリアランスは二相性で、ｔ_{1/ 2} α＝１４分およびｔ_1/2β＝９９分である(ここで“ｔ_1/2”は半減期で時間（ｔ ）は概数である)。 以前の臨床試験では、毒性は用量限定性で、腎毒性、胃炎、食道炎、および発 生頻度は低いが骨髄系抑制、頭痛、悪心および低もしくは高血圧を含む。４ｇ／ ｍ²体重を越える用量での１回の大量投与で腎毒性が生じる。さらに、分散投与 で日量約３５０ｍｇ／ｍ²体重の大量投与を受けた２人の小児患者は肝不全を起 こした。胃炎および食道炎は複数回の大量投与後に生じた。その他の観察された 反応は患者固有のものであった。 フェイズII臨床試験では、非リンパ芽球性白血病の成人に約１２５ｍｇ／ｍ² 体重の投与量で5日間持続輸液が用いられた。用量を限定する毒性症状は粘膜炎 であった。 Ｂ．ホストへのＡＳＳ抑制物質の投与 本発明のＭＴＡｓｅ欠損アッセイにしたがってＭＴＡｓｅ欠損であると決定さ れた癌をもつ哺乳類ホスト（例えばヒト）を、ＡＳＳ抑制物質(例えばＬ−アラ ノシン、Ｌ−アラノシニル−ＡＩＣＯＲまたはハダシジン(好ましくは前者))の 治療的有効量で処置した。ここで、“治療的有効量”とは、評価可能患者におい て目的の腫瘍反応を生じる量である。ここで腫瘍反応とは、臨床的に認知された 基準(例えばEaganら、Cancer，44:1125-1128(1979)（この文献は参照により本明 細書に含まれる）および、ＩＮＤ#4247（米国食品医薬局）の下で実施された臨 床試験で用いられた（本質的にイーガン(eagan)らのもので用いられた）パラメ ーターに関する刊行物として入手可能な報告書を参照のこと）に対して決定され る増殖停止または退行である。これらの基準を参考にして、腫瘍学の分野に習熟 した者は、細胞内ＡＭＰの枯渇のために本発明で用いられるべきＡＳＳ抑制物質 の治療的有効量の決定を容易に為しえるであろう。 一般に、本薬剤の抗代謝活性を高めるために、毒性を生じることが分かってい る量より少ない投与量のＡＳＳ抑制物質を毎日投与するか、または持続的に輸液 することが好ましい治療プロトコルであろう。本治療方法に対するＭＴＡｓｅ欠 損細胞特有の感受性のために、ＭＴＡｓｅ能を有する細胞の治療においてＬ−ア ラノシンの臨床試験でテストされた量より少ない量が必要とされ、したがって、 非増殖細胞への毒性を減少させうることが期待されよう。 ＭＴＡｓｅ能を有する非悪性細胞はまた、ＭＴＡまたはアデニン合成で使用さ れる適切な基質類似体の投与によってＡＳＳ抑制物質への曝露によるいずれの影 響からも保護される。これに関して使用される適切な化合物にはＭＴＡ、２’− ５’ジデオキシアデノシン、５’−デオキシアデノシン、２’−デオキシ−５− デオキシ−５’メチルチオアデノシンが含まれる（例えば実施例IIを参照）。し かしながら、ＭＴＡｓｅ能を有する細胞は、ＡＭＰの細胞プールの補充のために メチルチオアデノシン代謝からアデニンを産生でき、したがってＭＴＡｓｅ欠損 細胞と同じ程度にＡＭＰが枯渇することはないと予想されることは理解できよう 。 本発明を既に十分に説明したが、下記で説明する実施例によって本発明の実施 について例証する。しかしながら、これら実施例は本発明の範囲を限定するもの ではなく、当該範囲は添付の請求の範囲によって限定されることは理解されると ころである。本実施例を通して標準的な略語が用いられる。例えばミリリットル については“ｍｌ”、時間については“ｈ”、およびミリグラムについては“ｍ ｇ”が用いられる。 実施例Ｉ ＭＴＡｓｅ欠損およびＭＴＡｓｅ能を有するヒト腫瘍の異種移植片に対する Ｌ−アラノシン持続輸液後のインビボ効果 既知のヒトＭＴＡｓｅ欠損腫瘍に対する持続輸液後のインビボにおけるＬ−ア ラノシンの効果を評価し、さらに当該効果をＭＴＡｓｅ能を有する既知のヒト腫 瘍に対する当該薬剤の効果と比較するために、２×１０⁶個のＭＴＡｓｅ欠損Ｈ ２９２ＮＳＣＬＣ細胞およびＭＴＡｓｅ能を有するＣａｌｕ−６腫瘍細胞(５０ ％MATRIGEL（登録商標）担体中で０．３ｍｌとする)を８匹のＢａｌｂ／ｃ無胸 腺ヌードマウスの右および左脇腹にそれぞれ注射した。最初MATRIGEL（登録商標 ）はインビボで固形マトリックスを形成し、これをコントロール腫瘍サイズとし て輸液の第一日目に各マウスで測定した（これは１４日間で再吸収される）。更 なる比較のために、５０％MATRIGEL（登録商標）担体中のＣＥＭ Ｔ−ＡＬＬ(Ｍ ＴＡｓｅ欠損急性リンパ芽球性白血病)細胞１０⁷個を他の８匹のヌードマウスの 右の脇腹に注射した。細胞の多くは、それぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲ Ｌ−１８４８およびＨＴＢ−５６として販売されているＡＴＣＣの市販細胞株か ら得られた。 その次の日に、二側面にＮＳＣＬＣおよびＴ−ＡＬＬ接種物をもつ４匹のマウ スの背中に腫瘍細胞接種部位から多少離れてＡＬＺＥＴ（登録商標）１００７Ｄ 浸透輸液ポンプを埋め込んだ。このポンプは、持続輸液により日量で６０ｍｇ／ ｋｇを配送するように計算された濃度のＬ−アラノシンを送り込んだ。６０ｍｇ ／ｋｇの投与量では７日後に毒性は認められなかったので、このポンプを取り出 し、さらに７日間９０ｍｇ／ｋｇ／日を配送するためのＬ−アラノシンを含むポ ンプに置き換えた。 図２および図３に示すように、投与したＬ−アラノシンは、ＭＴＡｓｅ能を有 する処置ＮＳＣＬＣ細胞および未処置ＭＴＡｓｅ欠損細胞と比較したとき、免疫 不全マウスで定着ＭＴＡｓｅ欠損ＮＳＣＬＣ（図２で“Ｈ２９２Ｌ−ａｌａｎＴ ｘ”）およびＴ−ＡＬＬ（図３で“処置マウス”）異種移植接種物の退縮をもた らし、さらに新しく移植されたＭＴＡｓｅ欠損ＮＳＣＬＣまたはＴ−ＡＬＬ異種 移植接種物の増殖を防止した。特に、ＭＴＡｓｅ能を有する定着腫瘍は、Ｌ−ア ラノシンにもかかわらず未処置のＭＴＡＰ欠損ＮＳＣＬＣまたはＴ−ＡＬＬ異種 移植片のように急速に増殖した。 実施例II ＭＴＡｓｅ能を有する健常細胞のＭＴＡｓｅの基質による保護 Ｌ−アラノシンの存在下（４０μＭ）でＭＴＡｓｅ欠損ＮＳＣＬＣ細胞は、Ｍ ＴＡｓｅの基質メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）の各培養への添加にもかかわら ず選択的に増殖できないことが、２つの細胞株（ＭＴＡｓｅ能を有するＣａｌｕ −６およびＭＴＡｓｅ欠損Ｈ２９２）の比較によって確認された（図４）。アデ ニンを含むコントロール培養（ｔＡｄｅ）はＬ−アラノシンにもかかわらず増殖 し、この選択毒性は、ＭＴＡｓｅ欠損細胞はＭＴＡをアデニンに代謝することが できないためであることが確認された。 更なる比較のためにＭＴＡまたはＭＴＡ基質類似体、５’デオキシアデノシン を添加したとき、ＭＴＡｓｅ能を有するＡ４２７細胞およびＭＯＬＴ−４細胞の みで増殖の回復が生じ、一方、ＭＴＡｓｅ欠損Ａ５４９およびＣＥＭ細胞では増 殖は抑制されたままであった（図５ＡおよびＢ）。ＭＴＡはスペルミンシンセタ ーゼのフィードバック抑制物質であるので、いくつかの細胞株（例えばＭＯＬＴ −４）は高濃度で抑制される。これは、ＭＴＡ濃度の増加によって二相性の増殖 回復曲線をもたらす（図５Ａ）。 実施例III ＭＴＡｓｅゲノムクローンのクローニングと部分的性状決定 ヒトＭＴＡｓｅのゲノムクローンを以下のように分離した。ヒト胎盤ＤＮＡ(C lontech)から構築したコスミド遺伝子ライブラリーをＭＴＡｓｅのｃＤＮＡ遺伝 子プローブ（ＭＴＡＰ−７サブクローンのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント） を用いてスクリーニングした。このライブラリーを用いた形質転換大陽菌細胞を 、１−２×１０⁴個／１３５×１５ｍｍ平板のコロニー密度で、アンピシリンを ５０ ｍｇ／ｌで含有するＬＢ平板に平板培養した。 以下の工程を実施した。百万個のコロニー群の半数から１個の陽性コロニー( ＭＴＡＰ−１０と称する)を分離し、ＰＣＲ分析および直接配列決定によって部 分的に性状を決定した。２種のプライマー（終止コドンの１２０ｂｐ上流に位置 するセンスオリゴヌクレオチドおよび終止コドンの２０ｂｐ下流に位置するアン チセンスオリゴヌクレオチド）を合成し、ＰＣＲ分析に用いた。ＰＣＲでは、各 サイクルが変性（９２℃、１分）、アニーリング（５５℃、２分）および伸長（ ７２℃、５分）から成る工程サイクルを２５サイクル実施した。ＰＣＲ生成物は ０．８％アガロースゲルで分離した。 上記の技術を用いて今日までに特定したエクソンの位置は、図１で下線を施し て表示されている。 実施例IV 悪性細胞株中のＭＴＡｓｅの有無の検出を目的とする 当該細胞株へのＭＴＡｓｅ配列特異的オリゴヌクレオチドの適用 実施例IVで述べたように特定したＭＴＡｓｅゲノムクローン（配列番号１）か ら作製したオリゴヌクレオチドプローブの有用性を調べるために、ＭＴＡｓｅ能 を有する細胞(Calu-6;ATCC番号HTB-56)、または欠損細胞(A549;ATCC番号CCL-185 )であることが分かっているいくつかのヒト肺癌細胞株にＰＣＲを用いた。ゲノ ムＤＮＡは実施例IIIで述べたように分離し、その１マイクログラムをＰＣＲに 用いた。 増幅は、各サイクルが変性（９２℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分） および伸長（７２℃、１／２分）から成る工程サイクルを上記のように４０回実 施した。ＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲルで分析した。ＭＴＡｓｅ欠損で あることが知られている細胞株ではＭＴＡｓｅは検出されず、一方、ＭＴＡｓｅ 能を有する細胞株ではＭＴＡｓｅが検出された。 実施例Ｖ 定着異種移植腫瘍をもつヌードマウスに毎日注射した後の ＭＴＡＰ欠損腫瘍のＬ−アラノシンによる抑制 ６週齢のＢａｌｂ／ｃ無胸腺ヌードマウスの皮下に１０⁷／個のＡ５４９細胞 ま たはＡ４２７細胞を注射した。腫瘍の直径が約０．４ｃｍに達したとき、Ｌ−ア ラノシンまたは食塩水を１２時問毎に腹腔内に注射して処置を開始した。マウス には１回の注射につき１５ｍｇ／ｋｇを７日間、続いて２２．５ｍｇ／ｋｇを５ 日間与えた。腫瘍サイズは垂直の差し渡しで表して測定した。処置マウス（各細 胞型についてｎ＝６〔サンプルサイズ〕）対コントロールマウス（各細胞型につ いてｎ＝４〔サンプルサイズ〕）で表した結果を図７に示す。 毒性はテストしたいずれの投与レベルでも明らかではなかった（マウスは検査 中安定した体重を維持した）。毎日２回の瞬時大量注射によってＬ−アラノシン を投与したとき、良好に定着していたＭＴＡＰ欠損腫瘍のサイズは減少したが、 ＭＴＡＰ陽性細胞に対しては影響はなかった。 配列の要約 配列番号１はメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）のゲノムク ローンである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カーソン、デニス エイ. アメリカ合衆国 92014 カリフォルニア 州 デル マール ヴィスタ デル オセ アノ 14824 (72)発明者 コッタム、ハワード ビー. アメリカ合衆国 92028 カリフォルニア 州 フォールブルック ホワイト ホース レーン 208 (72)発明者 ノボリ、ツトム アメリカ合衆国 92126 カリフォルニア 州 サン ディエゴ ブルックホロー コ ート 10666 【要約の続き】 ている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を有することを特徴とする、メチルチ オアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ）欠損細胞においてアデニルコハク酸 シンセターゼ（ＡＳＳ）の活性を抑制する方法： （ａ）哺乳類のホストから得た細胞集団がＭＴＡｓｅ欠損であるか否かを決定す る；および （ｂ）治療的に有効量のＡＳＳ抑制剤を当該ホストに投与するが、この場合、当 該細胞と当該抑制剤の接触はＭＴＡｓｅ欠損ホスト細胞からアデノシン５’一燐 酸を枯渇させる効果を有する。 ２． 前記工程（ａ）が以下の（ａ）〜（ｃ）によって実施される、請求項１ に記載の方法： （ａ）ＭＴＡｓｅ欠損と思われるアッセイ可能な細胞サンプルを得る； （ｂ）サンプル中に存在する一切のＭＴＡｓｅコード核酸に特異的にハイブリダ イズするオリゴヌクレオチドプローブを、当該サンプルに、サンプル中に存在す る一切のそのような核酸と当該プローブが検出可能なようにハイブリダイズする ことを可能にする条件下で添加する；および （ｃ）ＭＴＡｓｅコード核酸がサンプル中に存在するか否かを検出するが、この 場合、当該核酸の存在は当該細胞サンプル中のＭＴＡｓｅタンパクの存在を示唆 する。 ３． 当該ＡＳＳ抑制剤がＬ−アラノシンである請求項１に記載の方法。 ４． 当該ホストがヒトである請求項１に記載の方法。 ５． 当該ＭＴＡｓｅ欠損ホスト細胞が、非小型細胞肺癌細胞、急性リンパ芽 球性白血病細胞、神経膠腫細胞および尿皮腫瘍細胞から成る群から選ばれる原発 性腫瘍細胞である請求項１に記載の方法。 ６． 当該ＡＳＳ抑制剤がホストに毎日または持続的に投与される請求項１に 記載の方法。 ７． 工程（ｂ）にしたがってホストを処置した後で、ＡＭＰの細胞内産生の ための基質が当該ホストに投与される、請求項１に記載の方法。 ８． 治療的に有効量のアデニルコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）抑制剤を哺 乳類ホストに投与することを含む、哺乳類ホストの細胞でＡＳＳの活性を抑制す る方法であって、当該細胞がメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡｓｅ ）欠損細胞であることが知られており、当該細胞と当該抑制剤の接触がＭＴＡｓ ｅ欠損ホスト細胞からアデノシン５’一燐酸を枯渇させる効果を有する方法。 ９． 当該ＡＳＳ抑制剤がＬ−アラノシンである請求項８に記載の方法。 １０． 当該ホストがヒトである請求項８に記載の方法。 １１． 当該ＭＴＡｓｅ欠損ホスト細胞が、非小型細胞肺癌細胞、急性リンパ 芽球性白血病細胞および神経膠腫細胞から成る群から選ばれる原発性腫瘍細胞で ある請求項８に記載の方法。 １２． 当該ＡＳＳ抑制剤がホストに毎日または持続的に投与される請求項８ に記載の方法。 １３． 当該ＡＳＳ抑制剤をホストに投与した後で、ＡＭＰの細胞内産生のた めの基質がホストに投与される請求項８に記載の方法。