MX2012010420A - Metodo de diagnostico y tratamiento de cancer en pacientes que tienen o desarrollan resistencia a una primera terapia de cancer. - Google Patents

Metodo de diagnostico y tratamiento de cancer en pacientes que tienen o desarrollan resistencia a una primera terapia de cancer.

Info

Publication number
MX2012010420A
MX2012010420A MX2012010420A MX2012010420A MX2012010420A MX 2012010420 A MX2012010420 A MX 2012010420A MX 2012010420 A MX2012010420 A MX 2012010420A MX 2012010420 A MX2012010420 A MX 2012010420A MX 2012010420 A MX2012010420 A MX 2012010420A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
inhibitor
raf
cancer
subject
kinase
Prior art date
Application number
MX2012010420A
Other languages
English (en)
Other versions
MX343368B (es
Inventor
Levi A Garraway
Corey M Johannessen
Original Assignee
Broad Inst Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Broad Inst Inc filed Critical Broad Inst Inc
Publication of MX2012010420A publication Critical patent/MX2012010420A/es
Publication of MX343368B publication Critical patent/MX343368B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11024—Mitogen-activated protein kinase (2.7.11.24), i.e. MAPK or MAPK2 or c-Jun N-terminal kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

Se describe un método para identificar un sujeto que tiene cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia combinada con un inhibidor de RAF y un segundo inhibidor. También se provee un método de tratamiento de cáncer en un sujeto en necesidad del mismo e incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de MEK, un inhibidor de CRF, un inhibidor de CrkL o un inhibidor de TPL2/COT. También se provee un método para identificar una cinasa objetivo que confiere resistencia a un primer inhibidor.

Description

MÉTODO DE DIAGNOSIS Y TRATAMIENTO DE CÁNCER EN PACIENTES QUE TIENEN O DESARROLLAN RESISTENCIA A UNA PRIMERA TERAPIA DE CÁNCER ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las mutaciones oncogénicas en la B-RAF de cinasa de serina/treonina (también conocida como BRAF) son encontradas en 50-70% de melanomas malignos. (Davies, H. et al., Nature4n , 949-954 (2002) . Estudios pre clínicos han demostrado que la mutación de B-RAF (V600E) predice una dependencia de la cascada de señalización de la cinasa de proteína mitogeno-activada (MPAK) en melanoma (Hoeflich, K. P. et al., Cáncer Res.69, 3042-3051 (2009); McDermott, U. et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA104, 19936-19941 (2007); Solit, D. B. et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Wature439, 358-362 (2006); Wan, P. T. et al., ¦ Cellll6, 855-867 (2004); Wellbrock, C. et al., Cáncer Res.64, 2338-2342 (2004)) una observación que ha sido validada por el éxito de los inhibidores de RAF o MEK en pruebas clínicas (Flaherty, K. T. et al., N. Engl . J. Med.363, 809-819 (2010); Infante, J. R. et al., J. Clin. Oncol.28 (suppl.), 2503 (2010); Sch artz, G. K. et al., J. Clin . Oncol .27 (suppl.), 3513 (2009).). Sin embargo, las respuestas clínicas a los terapéuticos anti cáncer apuntados son frecuentemente confundidas por la resistencia de novo o resistencia adquirida. (Engelman, J. A. et al., Science316, 1039-1043 (2007); Gorre, M. E. et al., Science293, 876-880 (2001); Heinrich, M. C. et al . , J. Clin. Oncol.24, 4764-4774 (2006); Daub, H., Specht, K. & Ullrich, A. Nature Rev. Drug Discov.3 , 1001-1010 (2004) .Asi, hay necesidad de nuevos métodos para identificación de mecanismos de resistencia de una manera que elucida objetivos "aptos de fármaco" para estrategias de tratamiento a largo plazo efectivas, por nuevos métodos para identificar pacientes que son probables de beneficiarse de las estrategias de tratamiento y por métodos de tratamiento de pacientes con las estrategias de tratamiento a largo plazo efectivas .
BREVE DESCRIPCIÓN DE IA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con el desarrollo de resistencia a agentes terapéuticos en el tratamiento de cáncer e identificación de objetivos que confieren resistencia al tratamiento de cáncer. La presente invención también es concerniente con la identificación de objetivos de fármaco paralelos para facilitar una estrategia de tratamiento a largo plazo efectiva y para identificar pacientes que se beneficiarían de tal tratamiento.
Así, en un aspecto, se provee un método para identificar un sujeto que tiene cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia de combinación con un inhibidor de RAF y un segundo inhibidor. El método incluye analizar un numero de copia genética, un mARN o un nivel de proteina o fosforilación de uno o mas objetivos de cinasa seleccionados del grupo que consiste de MAP3K8 (TPL2/C0T) , RAF1 (CRAF) , CRKL(CrkL) , FGR (Fgr) , PRKCE (Prkce) , PRKCH (Prkch) ,ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) en células de cáncer obtenidas del sujeto. El método incluye además comparar el numero de copia genética, el mARN o el nivel de proteina o la fosforilación con un numero de copia de gen, un mARN o nivel de proteina o la fosforilación con un numero de copia genética, un mARN o un nivel de proteina o fosforilación de la cinasa objetivo en células obtenidas de un sujeto sin el cáncer y correlacionar el numero de copia genética incrementado o una alteración en expresión en mARN o sobreexpresión de proteina o fosforilación de la cinasa objetivo en las células de cáncer en relación con las células del sujeto sin el cáncer con el sujeto que tiene el cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia de combinación.
En otro aspecto, se provee un método de tratamiento de cáncer en un sujeto en necesidad del mismo. El método incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de MEK o un inhibidor de TPL2/COT.
En otro aspecto, se provee un método para identificar un objetivo de cinasa que confiere resistencia a un primer inhibidor. El método incluye cultivar células que tienen sensibilidad al primer inhibidor y expresar una pluralidad de clones de ORF de cinasa en los cultivos celulares, cada cultivo celular expresa un clon de ORF de cinasa diferente. El método incluye además exponer cada cultivo celular al inhibidor e identificar cultivos celulares que tienen mayor viabilidad que un cultivo celular testigo después de exposición al inhibidor para identificar el clon de ORF de cinasa que confiere resistencia al primer inhibidor.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A-D ilustra una selección funcional a base de ORF que identifica cinasa de COT y C-RAF como impulsores de resistencia a inhibición de B-RAF. (a) Vista general esquemática de la colección de ORF de cinasa del Instituto CCSB/Broad. La clasificación de cinasa y numero de cinasas por clasificación son indicados; (b) Células A375 que expresan la colección de ORF de cinasa del Instituto CCSB/Broad fueron analizadas en cuanto a viabilidad relativa en PLX4720 ?µ? y normalizadas a MEK1 constitutivamente activas ( EK1DD) . Nueve ORF (circuios) puntuaron dos desviaciones estándar (linea discontinua 58.64%) de la media de todos los ORF (linea discontinua 44-26%) ; (c) las ORF indicadas fueron expresadas en cinco lineas celulares de B-RAFv6000E y tratadas con DMSO o PLX4720 ?µ?. La viabilidad (en relación con DMSO) fue cuantificada después de cuatro días. Las barras de error representan desviación estándar entre replicas (n = 6); (d) Selección secundaria en A375 y SKMEL28 prioriza las 9 ORF candidatas mas altas a través de una escala de concentración de PLX4720 de múltiples puntos.
La Figura 2A-F ilustra resistencia a la inhibición de B-RAF via activación de la ruta de MAPK. (a) Las ORF indicadas fueron expresadas en A375. Los niveles de MEK fosforilado y ERK fueron analizados enseguida del tratamiento de 18 horas con DMSO (-) o PLX4720 (concentración indicada) ; (b) Proliferación de ORF indicadas que expresan AR375. Las barras de error representan desviación estándar entre replicas (n = 6) . (c) C-RAF (S338) y fosforilación de ERK en Usados de ORF indicadas que expresan A375; (d) expresión de COT en Usados de melanocitos primarios inmortalizados que expresan BRAFV600E o vector vacio. El mARN de COT tiene un codón de inicio interno (30M) dando como resultado dos productos de proteina de longitudes diferentes; aminoácidos 1-467 o 30-467, indicados con flechas; (e) fosforilación de COT y ERK en Usados de las ORF indicadas que expresan A375 enseguida del agotamiento de B-RAF moderado por shARN (shBRAF) en relación con shARN testigo (shLuc) . (f ) Fosforilación de ERK en lisados de ORF indicadas que expresan A375 enseguida del agotamiento de C-RAF moderado por shARN (shCRAF) o shARN testigo (shLuc), enseguida del tratamiento de 18 horas con DMSO(-) o PLX4720 1 µ? (+).
La Figura 3A-K ilustra que la expresión de COT predice resistencia a inhibición de B- RAF en lineas de células de cáncer. (a) Numero de copia de MAP3K8/COT; barras rojas: amplificación de COT, barras azules: COT no amplificado; (b) expresión de COT en lineas celulares B-RAFv6000e y (c) Cultivos a corto plazo; (d) PLX4720 GI50 en líneas celulares B- RAFV6000E . Colores como (a) ; (e) fosforilación de MEK y ERK enseguida del tratamiento con DMSO o PLX4720 (concentración indicada) ; (f) fosforilación de ERK en lisados de 307 (AZD-R; AZD6244-resistente) tratados con DMSO o PLX4720 1 µ? (PLX) o Cl-1040 (Cl); (g) expresión de mARN de COT (QRT/PCR) en muestras de tejido de melanoma metastático tratado con PLX4032 paciente/lesión-coincidente. Los pacientes 1 y 3 tuvieron múltiples biopsias de la misma lesión. Las barras de error representan las SEM (n = 3) U; indeterminado/indetectable; (h) fosforilación de ERK y MEK en- RPMI-7951 enseguida del agotamiento de COT moderado por shARN (shCOT) versus testigo (shLuc) y tratamiento con DMSO (-) o PLS4720 1 µ? ( + ) . La fosforilación de ERK y MEK son cuantificadas ; (i) fosforilación de ERK y MEK en RPMI-7951 enseguida del tratamiento de una hora con un inhibidor de cinasa con COT de molécula pequeña. La fosforilación de ERK y MEK son cuantificadas . (j) curvas de sensibilidad de PLX4720 en un panel de lineas celulares de BRAFV6000E . OUMS-23 y M307 representan lineas celulares con expresión /amplificación de COT y todos los otros representan lineas celulares con COT indetectables/sin . alterar; (k) expresión selectiva de COT y activación de ruta de MAPK correspondiente en un melanoma maligno subcutáneo metastático con resistencia adquirida a PLX4032 (* denota µ?3 banda de fono, MET-MM (PLX-R) ; melanoma maligno metastático, PLX4032-resistente .
La Figura 4A-I ilustra lineas celulares de B-RAFV6000E que expresan COT que exhiben resistencia a inhibidores de MEK alostéricos. (a) CI-1040 G150 en un panel de lineas celulares de B-RAFV6000E; (b) fosforilación de MEK y ERK en Usados de lineas celulares indicadas tratadas con DMSO o CI-1040 (concentración indicada); (c) veces de cambio (en relación con MEK1) de GI50 de A375 que expresan ectópicamente las ORF indicadas para PLX4720, RAF265, CI-1040 y AZD6244; (d) fosforilación de ERK en ORF indicadas que expresan A375 enseguida del tratamiento con DSMO o una concentración 1 µ? de PLX4720, RAF265, CI-1040 or AZD6244; (e) viabilidad de A375 que expresan las ORF indicadas y tratadas con DMSO, PLX4720 (concentración indicada) y PLX4720 en combinación con CI-1040 o AZD6244 (todos una concentración de 1 µ?) . Las barras de error representan la desviación estándar (n=6) ; (f) fosforilación de ERK en A375 que expresan las ORF indicadas enseguida del tratamiento con DMSO, PLX4720 (1 µ?) o PLX4720 en combinación con CI-1040 or AZD6244 (todos a una concentración de 1 µ?) (g) lineas celulares con numero de copia/expresión de MAP3K8/COTaberrante son insensibles al inhibidor de MEK alostéricos CI-1040 o (h) AZD6244 ; (i) bosquejo esquemático de la formación de complejos de MAP3K en respuesta a la inhibición de B-RAF en lineas celulares mutantes de B-RAFV6000E. PLX4720 coloca C-RAF en un complejo señalización-competente (panel derecho superior) que es activado por eventos oncogenos corriente arriba de C-RAF (panel derecho inferior) , activando subsecuentemente la resistencia. En el contexto de expresión de COT, los complejos que contienen COT/RAF sonsuficientes para activar la ruta de MAPK y moderar la resistencia (panel izquierdo inferior) .
La Figura 5 ilustra un bosquejo esquemático de una selección funcional a base de ORF para cinasas que impulsan la resistencia a la inhibición de B-RAF. La linea celular de B-RAF 6000E A375 fue transducida lent iviralmente con las 597 cinasas en la condición de ORF de cinasa del Instituto CCSB/Broad. Las ORF que tienen un efecto positivo o negativo sobre la proliferación en A375 testigo-tratadas fueron identificadas y removidas del análisis final. Las ORF que promueven resistencia fueron identificadas al generar una proporción de viabilidad diferencial entre células B-RAF inhibidas ( PLX4720-tratadas ) y testigo-tratadas. La viabilidad diferencial fue normalizada a un alelo de MEK1 constitutivamente activo, MEKDD; un testigo positivo especifico del análisis.
La Figura 6A-C ilustra que la selección de ORF de cinasa del Instituto de CCSB/Broad es bien expresada vía alto titulo de lentitivirus . (a) esquema del vector de expresión lentiviral pLX-BLAST-V5 usado para todas las selecciones de ORF y validación .subsecuente. (b) ORF GFP-marcada que representan un intervalo de tamaño amplio fueron expresadas lent iviralmente en células Jurkat y el porcentaje de células/ORF que expresan GFP (por ejemplo, células infectadas) cuantificadas, demostrando alto titulo viral a través de un intervalo de tamaños de ORF. (c) expresión de 96 ORF aleatorias detectadas vía LiCor con anticuerpos contra el marcador de epitope V5, en relación con ADN celular. La expresión fue detectable en 83% de las cavidades.
La Figura 7 ilustra la expresión de ORF de resistencia candidatas. 293T fueron transíectadas transitoriamente con pLX-BLAST-V5-0RF (indicado) y la expresión detectada utilizando un anticuerpo anti-UV-HRP. El clon de AXL ex "cerrado" y tiene un codón de parada precedente a la etiqueta de V5. Véase Figura 12 para la verificación de expresión; (*) en la exposición oscura indica la expresión de tres ORF no visibles en la exposición mas clara.
La Figura 8 ilustra que una selección secundaria da prioridad a las nueve ORF de resistencia a inhibidor de B-RAF candidatas. Las nueve ORF más altas que puntúan en la selección primaria fueron expresadas en A375 o SKMEL28 y una GI5o de un intervalo de concentración de PLX4720 de ocho puntos.
La Figura 9A-B ilustra los efectos de la expresión de ORF sobre la proliferación en lineas celulares de B-RAFV6000E. La proliferación, en relación con MEK1, en (a) A375 o (b) SKMEL28 expresan las ORF indicadas después de 7 días de cultivo.
La Figura 10 ilustra que la expresión ectópica de MEK1 constitutivamente activa (MEK1DD) y COT conducen a pMEK/pERK incrementada en A375, mientras C-RAF reduce los niveles pMEK/pERK. Los Usados de A375 que expresan- ectópicamente GFP, EK1, MEKDD, COT o C-RAF fueron analizados vía inmunoabsorción en cuanto a niveles de pERK y p EK. GFP y MEK1 (carriles 1-3) fueron separados de COT/C-RAF (carriles 4-5) para impedir que la señal de V5-MEK1 residual abrume a aquella de COT y C-RAF que son expresadas a niveles más bajos.
La Figura 11A-B ilustra que la actividad de cinasa de COT y C-RAF es requerida para la fosforilación de ERK sostenida en el contexto de tratamiento de PLX4720. El análisis de inmunoabsorción de A375 que expresa (a)MEK ectópico, COT tipo silvestre o COT cinasa activo (COTK167R) o (b) MEK1, C-RAF tipo silvestre o C-RAF cinasa inactivo (C-RAFK375M) tratado con Plx4720 ?µ? por 18 horas.
La Figura 12 ilustra los efectos de la expresión de ORF sobre la señalización de APK en el contexto del inhibidor de B-RAF PLX4720. La activación de la ruta de MAPK fue determinada mediante análisis de inmunoabsorción de pERK y pMEK en A375 que expresan las ORF indicadas en presencia de PLX4720 (18 horas) concentración indicada. (*) indica el uso de un anticuerpo dirigido contra la ORF expresada no contra el epitope de V5. AXL fue clonado sin la etiqueta de V5.
La Figura 13A-B ilustra que B-RAF se asocia con C-RAF inmunoprecipitado en A375 enseguida de un tratamiento de 18 horas con PLX4720 ?µ? ( + ) o DMSO (-); (a) WCE; testigos de extracto de célula entera. C-RAF expresado ectópicamente se asocia constitutivamente con B-RAF y es fosforilado en S338, consistente con la localización de activación de membrana. MEK, MEKDD y COT-expresan A375 no muestran evidencia de activación de C-RAF.
La Figura 14A-B ilustra que la expresión retroviral de un C-RAF tipo silvestre o un mutante de truncación de alta actividad de C-RAF (C-RAF (22W) ) vuelve a A375 resistente al B-inhibidor PLX4720 (a) y conduce a niveles de pERK sostenidos en el contexto del tratamiento con PLX4720 (1 µ?, 18 h) , (b) los niveles de expresión de C-RAF obtenidos con retrovirus son significativamente mas bajos que con los sistemas lentiviral-basados , dando como resultado una GI50 mas baja que aquella obtenida con C-RAF lentiviral.
La Figura 15A-B ilustra los efectos de B-RAFV600E sobre mARN de COT (a) RT/PCR cuantitativa de la expresión de mARN de COT en relación con la expresión de mARN de GAPDH en melanocitos primarios transformados que expresan B-RAF tipo silvestre (vector) o B-RAFV600E. La expresión de COT fue normalizada a aquella de melanocitos primarios que expresan vector. (**) Significativa, p 0.05 (de dos colas de Students, prueba apareada) . El mARN de COT endógeno es indetectable en A375 sensibles a PLX4720 y los niveles de mARN de COT expresados ectópicamente están sin afectar por el tratamiento de PLX4720 1 µ?. A375 que expresan GFP o COT fueron tratadas por 18 horas con PLX4720 1 µ?. El mARN inverso-transcrito fue analizado en cuanto a la expresión de COT de GAPDH-normalizada, en relación con la expresión de GFP, A375 tratadas con DMSO. (*) No significativo, p > 0.5 (prueba T apareado de Students de dos colas) . Las barras de error presentan la SE .
La Figura 16 ilustra que los niveles de proteínas B- y C-RAF no son requeridos para la fosforilación de ERK COT-moderada. A375 que expresan MEK1 ectópico (testigo) o COT fueron infectadas secuencialmente con lentivirus que expresan shARN que apuntan a B-RAF, C-RAF o shARN testigo (shLuc) y analizados en cuanto a expresión de las proteínas indicadas en presencia ( + ) o ausencia (-) PLX4720 1 µ?, 18 horas.
La Figura 17 ilustra el análisis de SNP de 752 lineas celulares revela alteraciones de numero de copia MPA3K8/COT. De las 752 lineas celulares que han sufrido análisis de número de copia, 534 también han sufrido perfilado de mutación. 38 (7.1%) de células mutación-perfiladas albergan la mutación de B-RAFV600E. Dos lineas celulares (OU S-23, RPMI-7951, indicadas) albergan la mutación de B-RAFV600E junto con la ganancia de número de copia en MAP3K8/COT .
La Figura 18A-C ilustra alteraciones de MAP3K8/COT en la linea de célula de cáncer OUMS-23. (a) señal de RMA de una sonda de MAP3K8/COT (indicada) del análisis de micro arreglo de mARN. OUMS-23 es una del 2% más porciento de mARN de COT que expresan (de 765 lineas celulares) , (b) expresión de mARN de COT en un panel de lineas de células mutantes B-RAFv600E. (c) Expresión de proteina de COT endógena en OUMS-23 en relación con COT expresado ectópicamente en lineas celulares A375 y SKMEL28 tal como se determina vía análisis de inmunoabsorción de las células indicadas.
La Figura 19A-B ilustra que el mARN de COT y proteina son expresados en lineas celulares resistentes al inhibidor de BARF y tejido, (a) análisis de RT/PCR de la expresión de mARN de COT GAPDH normalizado en un panel de lineas celulares, cultivos a corto plazo y tejido de melanoma maligno (MM-R) PLX4032-tratado de recaída. La expresión de proteína correspondiente para lineas celulares y cultivos a corto plazo son mostrados en las Figuras 3b y 3c, respectivamente, (b) Análisis de Western Blot de lisado de melanocitos primarios (l°Mel (B-RAF T) ) , melanoma de piel normal coincidente con pacientes (piel) y melanoma maligno metastático (MM-R; mARN de COT mostrado en panel a) , células A375 y melanocitos primarios que expresan B-RAF 600E (1° Mel(B-RAFV600E) ) .
La Figura 20A-B ilustra que el agotamiento de COT afecta la viabilidad en la línea celular COT amplificada RPMI-7951. (a) Cuantificación de viabilidad de RPMI-7951 enseguida del agotamiento de COT shARN-moderado lentiviral (shCOT) , en' relación con shARN testigo (shLuc) . Las barras de error representan desviación estándar entre replicas, (b) análisis de inmunoabsorción que muestran la expresión de proteína de COT relativa en RPMI-7951 que expresa shLuc y shCOT.
La Figura 21 ilustra efectos de la expresión de ORF sobre la GI50 de un panel de inhibidores de ruta de MAPK en SKMEL28. La concentración inhibidora del crecimiento máxima media (GI50) de células SKMEL28 que expresan ectópicamente MEK1 , MEK1DD 0 COT fue determinada para los inhibidores de RAD PLX4720 y ARF265 y los inhibidores de MEK1/2, CL-1040 y AZD6244. El cambio de GI50 para MEK1DD y COT (en relación con MEK1) fue determinado para cada compuesto.
La Figura 22A-B ilustra que COT puede activar ERK vía mecanismos independientes de MEK y dependientes de MEK. (a) análisis de inmunoabsorción de fosforilación de ERK en lisados de células A375 enseguida de la expresión de GFP o COT y subsecuente agotamiento de MEKl, MEK2 o MEKl y MEK2, shARN-moderado lentiviral en relación con shARN (shLuc) .Los paneles izquierdo y derecho representan dos pares diferentes de constructos de shARN de. MEKl y MEK2. (b) análisis de inmunoabsorción de fosforilación de ERK de recombinantes (Thr202/Tyr204 ) mediante COT recombinantes en un análisis de cinasa in vitro.
La Figura 23 ilustra que la inhibición de ruta de MAPK combinatorial suprime efectivamente la proliferación en SKMEL28. La viabilidad (en relación con DMSO) de SKMEL28 que expresan ectópicamente MEKl, MEK1DD o COT y tratadas con DMSO, PLX4720 (concentración indicada), PLX4720 (1 µ?) y CL-1040 (1 µ?) o PLX4729 (1 µ?) y AZD644 Q µ?) . Las barras de error representan la desviación estándar entre replicas.
La Figura 24 ilustra que la sobreexpresión de COT es suficiente para volver a las células de cáncer de melanoma con la mutación de B-RAFv600E resistente a la inhibición de B-RAF.
La Figura 25A-B ilustra las nueve ORF mas altas que puntúan en la selección primaria fueron expresadas en (a) células SKEL28 de (b) A375 y aG150 es mostrado para cuatro inhibidores de la ruta de MAPK (PLX4720, RAF265, CI-1040, AZD-6244) .
La Figura 26 ilustra que la expresión de CRKL modifica la sensibilidad al inhibidor de B-RAF selectivo PLX4720 en un panel de lineas celulares B-RAFv600E.
La Figura 27 ilustra la linea celular de cáncer MAP3K8/COT-amplificada/B-RAFv600E-mutante OUMS-23 muestra fosforilación constitutiva de ERK/MEK a través de un intervalo de dosis de PLX4720.
La Figura 28A-B ilustra la insensibilidad a la inhibición de la ruta de MAPK corresponde con ganancias de numero de copia de MAP3K8/COT en un subconjunto de lineas de célula de cáncer de piel. Un panel de 20 líneas de células B-RAFv600E-mutantes y su sensibilidad a (a) el inhibidor de B-RAF PLX4720 y (b) el inhibidor de MEK, AZD6244 es mostrado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con el desarrollo de resistencia a agentes terapéuticos en el tratamiento de cáncer e identificación de objetivos que confieren resistencia al tratamiento de cáncer. La presente invención también es concerniente con la identificación de objetivos de fármaco paralelos para facilitar una estrategia de tratamiento a largo plazo efectiva y para identificar pacientes que se beneficiarían de tal tratamiento. En algunas modalidades, la presente invención es concerniente con cinasas y en particular con componentes de la ruta de cinasa de MAP .
La práctica de la presente invención empleara, a no ser que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, inmunología, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están dentro de la habilidad del arte. Véase, por ejemplo Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (Current Edition) ; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (Current Edition)) ; the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) : PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (Current Edition) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)) . DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed. ) ; Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. , Current Edition); Nucleic Acid Hybridi zation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.) .
La cascada de cinasa de proteína mitogeno-act ivada (MAPK) es una ruta de señalización intracelular crítica que regula la transducción de señal en respuesta a diversos estímulos extracelulares , incluyendo factores de crecimiento, citoquinas y proto-oncogenes . La activación de esta ruta da como resultado activación del factor de transducción y alteraciones en la expresión genética, que finalmente conduce a cambios en funciones celulares .incluyendo proliferación celular, regulación del ciclo celular, supervivencia celular, angiogénesis y migración celular. La señalización de ???? clásica es iniciada por cinasa de tirosina receptoras en la superficie celular, sin embargo, muchas otras moléculas de superficie celular son aptas de activar la cascada de MAPK, incluyendo integrinas, proteínas G heterotrimericas y receptores de citoquina.
El enlace de ligando a un receptor de superficie celular, por ejemplo una cinasa de tirosina receptora, comúnmente da como resultado fosforilación del receptor. La proteína adaptadora Grb2 se asocia con el dominio intracelular fosforilado del receptor activado y esta asociación recluta factores de intercambio .de nucleótido de guanina incluyendo SOSl- y CDC25 a la membrana celular. Estos factores de intercambio de nucleótido de guanina interactúan con y activan la Ras de GTPasa. La isoformas de Ras comunes incluye K-Ras, N-Ras, H-Ras y otros. Enseguida de la activación de Ras, la cinasa de serina/treonina Ras (por ejemplo, A-Raf, B-Raf o Raf-1) es reclutada a la membrana celular por medio de interacción con Ras. Luego Raf es fosforilado. Raf activa directamente MEK1 y MEK2 mediante fosforilación de dos residuos de serina en posiciones 217 y 221. Enseguida de la activación, MEK1 y MEK2 fosforilan residuos de tirosina (Tyr-185) y treonina (Thr-183) en las cinasas de serina/treonina Erkq y Erk2, dando como resultado activación de Erk. Erk activada regula muchos objetivos en el citosol y también se transloca al núcleo, en donde fosforila un numero de factores de- transcripción que regulan la expresión genética. La cinasa de Erk tiene numerosos objetivos, incluyendo Elk-1, c-Etsl, c-Ets2, p90RSKl, NK1, MNK2, MSK1, MSK2 and TOB. En tanto que la ruta anterior es una representación clásica de señalización de MAPK, hay diafonia considerable entre la ruta de MAPK y otras cascadas de señalización.
Aberraciones en señalización de MAPK tienen un papel significativo en biología de cáncer. La expresión alterada de Ras es común en muchos canceres y mutaciones de activación en Ras también han sido identificadas. Tales mutaciones son encontradas en hasta 30% de todos los canceres y son especialmente comunes en carcinomas pancreáticos (90%) y colon (50%) . Además, mutaciones de Raf de activación han sido identificadas en melanoma y cáncer de ovario. La mutación más común, BRAFV600E, da como resultado activación constitutiva de la ruta de cinasa de MAP corriente abajo y es requerida para la proliferación de célula de melanoma, crecimiento de agar blando y formación de xenoinjerto de tumor. En base al papel definido de la sobre activación de MAPK en canceres humanos, el apuntamiento de componentes de la ruta de MAPK con inhibidores específicos es un procedimiento promisor a terapia de cáncer. Sin embargo, los pacientes pueden tener resistencia innata o resistencia adquirida a estas terapias promisorias. La identificación de cinasas objetivo, marcadores de diagnostico y/o prognóstico y terapias de tratamiento para estos pacientes con resistencia innata o adquirida son descritas a continuación.
Análisis de selección funcional de alto rendimiento En algunos aspectos, la presente invención es concerniente con métodos para identificar objetivos aptos de accionar resistencia a terapias clínicamente eficaces utilizando un análisis de selección de alto rendimiento. En algunas modalidades, el método puede incluir una selección funcional a base de cuadro de lectura abierto (ORF) para cinasas que accionan la resistencia a los agentes terapéuticos. El método puede incluir proveer una línea celular con una cinasa que se sabe que tiene una mutación oncogena. Una biblioteca de ORF de cinasa puede ser expresada individualmente en la línea celular, de tal manera que una pluralidad de clones que cada uno expresan un ORF diferente de la biblioteca puede ser evaluado adicionalmente . Cada clon puede ser (1) expuesto a un inhibidor de la cinasa* conocida en la línea celular y (2) monitoreado en cuanto a cambios de crecimiento en base a la expresión del ORF en la- línea celular sin el inhibidor. Cualesquier clones que tengan un efecto de crecimiento de la expresión de ORF sola, ya sea positivo o crecimiento negativo son eliminados. Los clones restantes que expresan cada uno una cinasa diferente son luego comparados en cuanto a viabilidad entre un testigo y un clon tratado y normalizados con un testigo positivo. La viabilidad celular incrementada después de tratamiento con el inhibidor identifica ORF que confieren resistencia y por consiguiente identifica objetivos de cinasa para tratamiento con un inhibidor adicional. En algunas modalidades, los clones que tienen puntuaciones por encima de dos desviaciones estándar de la media normalizada pueden ser cinasas objetivo indicando tratamiento con un inhibidor adicional es benéfico al sujeto.
Como un ejemplo no limitante, se muestra un esquema de un análisis de selección funcional de alto rendimiento para cinasas que accionan resistencia a la inhibición B-RAF en la Figura 5. Una colección de -600 ORF clonados y validados en secuencia fueron ensamblados, contando por ~75% de todas las cinasas anotadas (Centro para Biología de Sistemas de Cáncer (CCSB) /Broad Colección de ORF de cinasa de instituto amplio, Figuras la, Ib, Tabla 3) . Esta conexión disponible públicamente puede ser transferida rápidamente a una variedad de vectores de expresión para varias aplicaciones finales. Cualquier tipo de vector de expresión conocido para el experimentado en el arte puede ser usado para expresar la colección de ORF de cinasa. A manera de ejemplo no limitante, un vector de expresión lentiviral seleccionable, epitope-marcado apto de producir virus de alto titulo y expresión de ORF robusta en células mamiferas puede ser creado para expresar la colección de cinasas, (pLX-BLAST-V5-, Figura 6a) .
Para identificar cinasas aptas de circunvenir la inhibición de RAF, la colección de ORF de cinasa arreglada puede ser expresada establemente en células A375, una linea celular de melanoma maligno B-RAFV600E que es sensible al inhibidor de cinasa RAF PLX4720 (Figuras la, Ib y 6c, Tabla 3) . Clones de células que expresan ORF tratadas con PLX4720 1 µ? son seleccionados en cuanto a viabilidad en relación con células sin tratar y normalizados a un testigo positivo análisis-especifico MEK1S218/222D (MEK1DD) (Tabla 4) . Los ORF que afectaron la viabilidad de referencia o proliferación son removidos del análisis. Los clones que tienen puntuación por enzima de dos desviaciones estándar de la media normalizada pueden ser evaluados adicionalmente para identificar una cinasa objetivo que contiene resistencia por un segundo inhibidor. En algunas modalidades, el gen que codifica la cinasa objetivo puede ser MAP3K8 (TPL2/C0T) , RAF1 (CRAF) , CRKL (CrkL) , FGR (Fgr) , PRKCE (Prkce) , PRKCH (Prkch) , ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) . En algunas modalidades, el gen que codifica la cinasa objetivo puede ser un activador de ruta de MAPK. En algunas modalidades, el gen que codifica la cinasa objetivo puede ser una cinasa de MAP3 que fosforila directamente y activa MEK. En algunas modalidades, el gen que codifica la cinasa objetivo puede codificar una proteina adaptadora que es amplificada y fosforilada en melanoma.
En otras modalidades, la colección de ORF puede ser expresada establemente en una linea celular que tiene una mutación diferente en B-RAF, por ejemplo otra mutación en la posición de aminoácido de alrededor de 600 tal como V600K, V600D y V600R. Mutaciones de B-RAF adicionales incluyen las mutaciones descritas en Davies et al. Nature, 417, 949-954, 2002, Tabla 1. Las lineas celulares pueden ser usadas que son sensibles a otros inhibidores de cinasa de ARF incluyendo pero no limitados a PLX4032; GDC-0879; RAF265; sorafenib; SB590855 y/o ZM 336372. En algunas modalidades, la colección de ORF puede ser expresada establemente en una linea celular que · tiene sensibilidad a un inhibidor de MEK. Ejemplos no limitantes de inhibidores de MEK incluyen AZD6244; CI-1040; PD184352; PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-Metoxi-7- ( 3-morfolin-4-il-propoxi ) -4- (4-fenoxi-fenilamino) -quinolin-3-• carbonitrilo y 4- [3-Cloro-4- ( l-metil-lH-imidazol-2- ilsulfanil) -fenilamino] -6-metoxi-7- ( 3-morfolin-4-il-propoxi ) - quinolin-3-carbonitrilo . Inhibidores de RAF y MEK adicionales son descritos a continuación. A manera de ejemplo no limitante, inhibidores de RAF ejemplares son mostrados e la Tabla 1 e inhibidores de MEK ejemplares son mostrados en la Tabla 2.
Tabla 1 : Inhibidores de RAF ejemplares Tabla 2 : Inhibidores de MEK ejemplares Marcadores de diagnostico/prognóstico para resistencia innata y adquirida a terapias apuntadas En algunos aspectos, la presente invención es concerniente con métodos para detectar la presencia de uno o mas marcadores de diagnostico o prognóstico en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica de un paciente con cáncer) . Una variedad de métodos de selección conocidos para el experimentado en el arte pueden ser usados para detectar la presencia del marcador en la muestra incluyendo ADN, ARN y detección de proteina. Las técnicas descritas a continuación pueden ser usadas para determinar la presencia o ausencia de un objetivo de cinasa en una muestra obtenida de un paciente. En algunas modalidades, el paciente puede tener resistencia innata o adquirida a terapias apuntadas de cinasa, incluyendo inhibidores de B-RAF o inhibidores de MEK. Por ejemplo, el paciente puede tener una resistencia innata o adquirida a inhibidores de B-RAF PLX4720 y/o PLX4032. En algunas modalidades, el paciente puede tener resistencia innata o adquirida al inhibidor de MEK AZD6244. LA identificación de uno o mas marcadores objetivos de cinasa en el paciente ayuda al medico a determinar un protocolo del tratamiento para el paciente. Por ejemplo, en un paciente que tiene uno o mas marcadores objetivos de cinasa, el medico puede tratar al paciente con una terapia combinada o terapia de combinación como se describe en mas detalle posteriormente en la presente .
En algunas modalidades, el objetivo de cinasa puede incluir pero no esta limitado a ???3?8 (TPL2/COT) , RAF1 (CPvAF) , CRKL (CrkL) , FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH ( Prkch) ,ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) . El marcador puede ser un incremento en el numero de copia genética, un incremento en expresión de proteina, fosforilación de uno o mas miembros de ruta de cinasa de MAP, un cambio en expresión de mARN y los semejantes, para el objetivo de cinasa.
A manera de ejemplo no limitante, en un paciente que tiene una mutación oncogénica en B-RAF, la identificación de una cinasa objetivo activada puede ser útil para caracterizar un protocolo de tratamiento para el paciente. Por ejemplo, en un paciente que tiene una mutación de B-RAFV600E, el tratamiento con un inhibidor de RAF solo puede indicar que el paciente esta en riesgo relativamente alto de adquirir resistencia al tratamiento después de un periodo de tiempo. En un paciente que tiene una mutación oncogénica, la identificación de un objetivo de cinasa activada en aquel paciente puede indicar la inclusión de un segundo inhibidor en el protocolo de tratamiento.
La identificación de un objetivo de cinasa activada puede incluir un análisis del número de copia genética e identificación de un incremento en el número de copia de una cinasa objetivo. Por ejemplo, una ganancia de número de copia en AP3K8 es indicadora de un paciente que tiene resistencia innata o desarrolla resistencia adquirida, en particular si el paciente también tiene una mutación de B-RAFV600E.
En algunas modalidades, la identificación de una cinasa objetivo activada puede incluir un análisis de fosforilación de una cinasa objetivo y/o un miembro de la ruta de cinasa de MAP. Por ejemplo, la fosforilación de C-RAF en S338 es indicadora de un paciente que tiene resistencia innata o que desarrolla resistencia adquirida, en particular si el paciente también tiene una mutación de B-RAF . En algunas modalidades, la identificación de un incremento en fosforilación de MEK/ERK puede ser indicadora de un paciente gue tiene resistencia innata o desarrolla resistencia adquirida. La identificación incrementada de proteínas COT en pacientes que tienen una mutación de B-RAFV600E puede predecir resistencia a inhibición de RAF e inhibición de MEK.
La identificación de una cinasa activada objetivo puede incluir un análisis de expresión de mARN de una cinasa objetivo. Por ejemplo, un incremento en expresión de mARN de COT enseguida del tratamiento inicial con un primer inhibidor de cinasa es indicador de un paciente que tiene o que desarrolla resistencia. En algunas modalidades, el primer inhibidor de cinasa puede ser un inhibidor de RAF o inhibidor de MEK.
Métodos de tratamiento En varias modalidades, la invención provee métodos para tratamiento de un paciente que tiene cáncer. Los métodos comprenden en general la administración de un primer inhibidor y un segundo inhibidor. Un inhibidor puede ser un inhibidor de RAF. El inhibidor de RAF puede ser un inhibidor de pan-RAF o un inhibidor de RAF selectivo. Inhibidores de pan-RAF incluyen pero no están limitados a RAF265, sorafenib o SB590885. En algunas modalidades, el inhibidor de RAF es un inhibidor de B-RAF. En algunas modalidades, el inhibidor de RAF selectivo es PLX4720, PLX4032 o GDC-0879-A. Un inhibidor puede ser un inhibidor de ME (véase Tabla 2 que ilustra inhibidores de MEK ejemplares) . Un inhibidor puede ser un inhibidor de COT. A manera de ejemplo no limitante, el inhibidor de COT puede ser un inhibidor de shARN como se describe a continuación o un inhibidor de COT de molécula pequeña, 4- ( 3-cloro-4-fluorofenilamino) -6- (piridin-3-il-metilamino ) -3-ciano-[l , 7]-naftiridina (EMD; inhibidor I de TPL2; numero de catalogo 616373, PubChem ID: 9549300) . Los inhibidoresd de la presente invención inhiben una o mas de las cinasas objetivo incluyendo MAP3K8 (TPL2/COT) , RAF1 (CRAF) , CRKL (CrkL) , FGR (Fgr) , PRKCE (Prkce) , PRKCH (Prkch) , ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) u otros objetivos de rutas de cinasa de MAP.
En algunas modalidades, se provee una terapia de combinación para cáncer, que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/C0T) . También se provee una terapia combinada para cáncer, que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un inhibidor de MEK. Otras terapias combinadas incluyen una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un segundo inhibidor que apunta al gen, mARN o proteina purificada por uno o mas de los siguientes: MAP3K8 (TPL2/C0T) , RAF1 (CRAF) , CR L (CrkL) , FGR (Fgr) , PRKCE (Prkce) , PRKCH (Prkch) , ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) . La terapia combinada es apropiada para tratamiento de un paciente en donde el cáncer contiene células mutantes de B-RAF y en particular células mutantes B-RAFV600E. La presente invención provee además una terapia combinada para cáncer, que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un inhibidor de MEK, en donde el sujeto con el cáncer contiene células con expresión de MAP3K8 (TPL2/COT) alterada o numero de copia genética alterado. En algunas modalidades, el inhibidor de MEK es CI-1040/PD 184352 o AZD6244.
Como un ejemplo no limitante, el inhibidor de MEK provisto en la presente puede ser CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-Metoxi-7- ( 3-morfolin-4-il-propoxi ) -4- ( 4-fenoxi-fenilamino) -quinolin-3-carbonitrilo o- 4-[ 3-Cloro-4- ( l-metil-lH-imidazol-2-ilsulfañil ) -fenilamino] -6-metoxi-7- ( 3-morfolin-4-il-propoxi) -quinolin-3-carbonitrilo, Roche compuesto RG7420,o combinaciones de los mismos. Inhibidores de MEK adicionales conocidos en el arte pueden también ser usados.
En modalidades ejemplares de los aspectos anteriores, el inhibidor de RAF provisto en la presente es PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), ZM 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 o CJS352 (NVP-AAL881-NX (denominado posteriormente en la presente como AAL881) y NVP-LBT613-AG-8 (LBT613) son compuestos de isoquinilina (Novartis, Cambridge, MA) . Inhibidores de RAF ejemplares adicionales útiles para terapia combinada incluyen inhibidores de pan-RAF, inhibidores de B-RAF, inhibidores de A-RAF e inhibidores de RAF-1- En inhibidores de RAF modalidades ejemplares útiles para terapia combinada incluyen PLX4720, PLX4032, BAY 43-9006 (Sorafenib), Z 336372, RAF 265, AAL-881, LBT-613 y CJS352. Inhibidores de RAF ejemplares incluyen además los compuestos resumidos en la publicación de PCT No. WO/2008/028141, todo el contenido de la cual es incorporado en la presente por referencia. Inhibidores de RAF ejemplares incluyen adicionalmente los derivados de quinazolinona descritos de la publicación de PCT No. WO/2006/024836 y los derivados de piridinilquinazolinamina descritos en la publicación de PCT No. O/2008/020203, todo el contenido de las cuales es incorporado en la presente por referencia.
La administración de la combinación incluye la administración de la combinación en una sola formulación o forma de dosificación unitaria, administración de los agentes individuales de la combinación concurrente pero separadamente o administración de los agentes individuales de la combinación secuencialmente mediante cualquier ruta apropiada. La dosificación de los agentes individuales de la combinación puede requerir administración mas frecuente de uno de los agentes en comparación con el otro agente en la combinación. Por consiguiente, para permitir la dosificación apropiada, los productos farmacéuticos empacados pueden contener una o mas formas de dosificación que contienen la combinación de agentes y una o mas formas de dosificación que contienen una de las combinaciones de agente, pero no el (los) otro (s) agente (s) de la combinación.
Los agentes pueden contener uno o mas elementos asimétricos tales como centros estereogénicos o ejes estereogénicos, por ejemplo átomos de carbono asimétricos, de tal manera que los compuestos pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas . Estos compuestos pueden ser por ejemplo racematos o formas ópticamente activas. Para compuestos con dos o mas elementos asimétricos, estos compuestos pueden adicionalmente ser mezclas de diastereómeros . Para compuestos que tienen centros asimétricos, se debe entender que todos los isómeros ópticos y mezclas de los mismos son abarcados. Además, compuestos con dobles enlaces carbono-carbono se pueden presentar en forma Z y E; todas las formas isoméricas de los compuestos están incluidas en la presente invención. En estas situaciones, los enantiómeros individuales (formas ópticamente activas) pueden ser obtenidos mediante síntesis asimétrica, síntesis a partir de precursores ópticamente puros o mediante resolución de los racematos. Las resolución de los racematos también ser puede llevar a cabo por ejemplo, mediante métodos convencionales tal como cristalización en presencia de un agente . de resolución o cromatografía, utilizando por ejemplo una columna de HPLC quiral.
A no ser que se especifique de otra manera o se indique claramente en el texto, la referencia a compuestos útiles en la terapia combinada de la invención incluye tanto la base libre de los compuestos como las sales aceptables farmacéuticamente de los compuestos. Una modalidad preferida es la sal de clorhidrato.
El término "sales aceptables farmacéuticamente" incluye derivados de los compuestos revelados, en donde el compuesto padre es modificado al hacer sales de adición de acido o base no tóxicas del mismo y se refiere además a solvatos aceptables farmacéuticamente, incluyendo hidratos de tales compuestos y tales sales. Ejemplos de sales aceptables farmacéuticamente incluyen pero no están limitados a sales de adición de acido mineral u orgánico de residuos básicos tales como aminas; sales de adición de álcali u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos y los semejantes y combinaciones que comprenden una o mas de las sales anteriores. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen sales no tóxicas y las sales de amonio cuaternario del compuesto padre formadas por ejemplo a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, sales de acido no tóxicas incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tales como acido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfamico, fosfórico y nítrico; otras sales inorgánicas aceptables incluyen sales de metal, sales como sal de sodio, sal de potasio y sal de cesio y sales de metal alcalinotérreo, tales como sal de calcio y sal de magnesio y combinaciones que comprenden una o mas de las sales anteriores .
Sales orgánicas aceptables farmacéuticamente incluyen sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acido acético, trifluoroacetico, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicilico, mesí lico,'esilico, besilico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluensulfónico, metansulfónico, etandisulfónico, oxálico, isetiónico, HOOC(CH2) nCOOH en donde n es0-4; salesde amina orgánicas talescomo sal de trietilamina, sal de piridina, . sal de picolina, sal de etanolamina, sal de trietanolamina, sal de diciclohexilamina, sal de N, ' -dibenciletilendiamina ysales de aminoácidos talescomo arginato, asparginato, y glutamatoycombinaciones que comprenden unaomás de las salesanteriores .
Una "cantidad efectiva" de una combinación de agentes (por ejemplo, inhibidores de MEK y RAF o inhibidores de RAF y COT o RAF y un inhibidor que apunta a MAP3K8 (TPL2/C0T) , RAF1 (CRAF) , CRKL (CrkL) , FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH ( Prkch ) ,ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3)) ) es una cantidad suficiente para proveer una mejora observable con respecto a los signos y síntomas observables clínicamente de referencia de la alteración tratada con la combinación.
Los productos farmacéuticos pueden ser administrados mediante formas orales u otras formas, por ejemplo rectalmente o mediante inyección parenteral. "Forma de dosificación oral" pretende incluir una forma de dosificación unitaria prescrita o designada para administración oral. Una forma de dosificación oral puede o no puede comprender una pluralidad de subunidades tales como por ejemplo micro cápsulas o micro tabletas, empacadas para administración en una sola dosis.
Los productos farmacéuticos pueden ser liberados en varias formas. "Forma liberable" pretende incluir formas de liberación instantánea, liberación inmediata, liberación controlada y liberación sostenida.
"Liberación instantánea" pretende incluir una forma de dosificación diseñada para asegurar distribución rápida del agente activo al modificar la forma cristalina normal del agente activo para obtener una disolución mas rápida.
"Liberación inmediata" pretende incluir una forma de liberación convencional o no modificada en la cual mayor o . igual a alrededor del 50% o mas preferiblemente alrededor del 75% de los agentes activos es liberada en el transcurso de 2 horas de administración, preferiblemente en una hora de administración .
"Liberación sostenida" o "liberación prolongada" incluye la liberación de agentes activos a tal velocidad que los niveles en la sangre (por ejemplo, plasma) son mantenidos dentro de un intervalo terapéutico pero por debajo de los niveles tóxicos por al menos alrededor de 8 horas, preferiblemente por lo menos alrededor de 12 horas, mas preferiblemente alrededor de 24 horas después de administración a estado estable. El término, "estado estable" significa que un nivel en el plasma para un agente activo o combinación de agente dada ha sido obtenido y que es mantenido con dosis subsecuentes del (los) agente (s) activos a un nivel que esta en o por encima del nivel terapéutico efectivo mínimo y esta por debajo del nivel de plasma toxico mínimo para un (os) agente (s) activo (s) dado (s) .
El término "tratar", "tratado", "que trata" o "t atamiento" es usado en la presente para dar a entender aliviar, reducir o aliviar por lo menos un síntoma de una enfermedad en un sujeto. Por ejemplo, el tratamiento puede ser de disminución de los síntomas de una alteración o erradicación completa de una alteración tal como cáncer. Dentro del significado de la presente invención, el término "tratar" también denota detener, retardar el inicio (por ejemplo, el periodo antes de la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad. El término "protegeré" es usado en la presente para dar a entender impedir el retardo o tratar o todo, como sea apropiado, el desarrollo o continuación o agravación de una enfermedad en un sujeto. En el significado de la presente invención, la enfermedad esta asociada con un cáncer .
El término "sujeto" o "paciente" pretende incluir animales que son aptos de sufrir de o son afligidos por un cáncer o cualquier alteración que involucra, directa o indirectamente un cáncer. Ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo humanos, perros, vacas, caballos, puercos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos . En ciertas modalidades, el sujeto es un humano, por ejemplo un humano que sufre de o esta en riesgo en sufrir de o es potencialmente apto de sufrir de canceres.
El término "alrededor" o "aproximadamente" o usualmente significa dentro de 20%, más preferiblemente dentro de 10% y más preferiblemente todavía dentro de 5% dentro de un valor o intervalo dado. Alternativamente, especialmente en sistemas biológicos, el término "alrededor" significa dentro de alrededor de un logaritmo (esto es, un orden de magnitud) preferiblemente dentro de un factor de dos de un valor dado.
El uso de los términos "un" y "uno" y "el" y referencias similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de la siguientes reivindicaciones) será interpretado para cubrir tanto el singular como el plural, a no ser que sea indicado de otra manera o contradicho claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" serán interpretados como términos de extremos abiertos (esto es, que significa "que incluye, pero no esta limitado a") a no ser que se indique de otra manera. La cita de intervalos de valores en la presente pretende solamente servir como método corto para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo, a no ser que sea indicado de otra manera en la presente y cada valor separado es incorporado a la especificación como si fuera citado individualmente en la presente.
Como se especifica anteriormente en la presente, en un aspecto, la presente invención provee una combinación de fármacos útil para tratar, impedir, detener, retardar el inicio de y/o reducir el riesgo de desarrollar o invertir por lo menos un síntoma de cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una terapia combinada que comprende una cantidad- efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un inhibidor de MAP3K8 (TPL/COT) o una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de inhibidor de MEK o una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un segundo inhibidor que apunta a MAP3K8 (TPL2/COT) , RAF1 (CRAF) , CK2L (CrkL) , FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch) , ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3). Preferiblemente, estos inhibidores son administrados a dosificaciones terapéuticamente efectivas que cuando son combinadas proveen un efecto benéfico. La administración puede ser simultánea o secuencial.
El término "cáncer" es usado en la presente para dar a entender un amplio espectro de tumores, incluyendo todos los tumores sólidos y malignidades hematológicas . Ejemplos de tales tumores incluyen pero no están limitados a leucemia, linfomas, carcinomas, carcinoma metastáticos , sarcoma, adenomas, canceres de sistema nervioso y canceres genitourinarios. En modalidades ejemplares, los métodos anteriores son útiles en el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda adulta y pediátrica, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical , cánceres SIDA -relacionados, cáncer anal, cáncer del apéndice, astrocitoma, carcinoma de célula basal, cáncer de conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, osteosarcoma, histiocitoma fibroso, cáncer de cerebro, glioma del tallo celular, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma , tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales , glioma hipotalámico, cáncer de pecho, cáncer de pecho masculino, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma de origen desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebelar, glioma maligno, cáncer cervical, cáncer de la niñez, leucemia linfocitica crónica , leucemia mielógeno crónica, alteraciones mieloproliferativos crónicos, cáncer colorectal, linfoma de célula T, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esófagar, tumores de familia de Ewing, tumor de célula de germen extracraneal, tumor de células germinal extragonadal , el cáncer de conducto biliar extrahepático, el melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal, tumor de células germinal extracraneal, tumor de célula germinal extragonadal, tumor de célula germinal de ovario, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células vellosa, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular , linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin , cáncer hipofaringeo, glioma hipotalámico y de la ruta visual, melanoma intraocular, tumores de células de los isleta, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de célula renal, cáncer laríngeo, cáncer del labio y la cavidad oral, cáncer de pulmón de célula no pequeñas de cáncer de pulmón de célula pequeña, linfoma del sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno, cáncer de cuello escamoso, síndrome de neoplasia endocrino múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos, alteraciones mieloproliferativas, alteraciones mieloproliferativas crónicas, cáncer de cavidad nasal y seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oro faríngeo, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de paratiroide, cáncer penil, cáncer de faríngeo, feocromocitoma , pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales , cáncer de pituitárua, neoplasias de células de plasma, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma de tejidos blando, sarcoma uterino, síndrome de Sézary, cáncer de piel sin melanoma , cáncer de intestino delgado, carcinoma de célula escamosa, cáncer de cuello escamoso, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transiciónal, tumores trofoblásticos, cáncer uretral, cáncer de uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, y tumor de Wilms.
En particular, el cáncer puede estar asociado con una mutación en el gen de B-RAF. Estos canceres incluyen melanoma, cáncer de pecho,, canceres colorectales, glioma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, sarcoma y cáncer de tiroides .
En una modalidad particular, la combinación terapéutica provista en la presente es efectiva para el tratamiento de cáncer moderado a severo en un sujeto.
Dosificaciones La dosis óptima de la combinación de agentes para tratamiento de cáncer puede ser determinada empíricamente para cada sujeto utilizando métodos conocidos y dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad de los agentes, la edad, peso corporal, salud general, genero y dieta del sujeto; la hora y ruta de administración y otras medicaciones que el sujeto esta tomando. Las dosificaciones óptimas pueden ser establecidas utilizando pruebas y procedimientos de rutina que son bien conocidos en el arte.
La cantidad de combinación de agentes que pueden ser combinados con los materiales portadores para producir una forma de dosificación variara dependiendo del individuo tratado y el modo de administración particular. En algunas modalidades, las formas de dosificación unitaria que contienen la combinación de agentes como se describe en la presente contendrán las cantidades de cada agentes de la combinación que son administrados típicamente cuando los agentes son administrados solos.
El medico o veterinario que tiene habilidad ordinaria en el arte puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el medico o veterinario podría iniciar dosis de los compuestos de la invención empleadas en la composición farmacéutica a niveles mas bajos que aquellos requeridos con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosificación hasta que se obtiene el efecto deseado.
En general, una dosis diaria apropiada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que es la dosis mas baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva dependerá en general de los factores descritos anteriormente y es determinada fácilmente por aquellos de habilidad ordinara en el arte.
En general, dosis terapéuticamente efectivas de los compuestos de esta invención para un paciente, cuando son usadas para los efectos analgésicos indicados, variaran de alrededor de 0.0001 a alrededor de 1000 mg por kilogramo de peso corporal por día, mas preferiblemente de alrededor de 0.01 a alrededor de 50 mg por kilogramo por día.
Si se desea, la dosis diaria efectiva del compuesto activo puede ser administrada como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas separadamente a intervalos apropiados en todo el día, opcionalmente en formas de dosificación unitarias.
Formulaciones farmacéuticas y rutas de administración Se proveen en la presente formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación de agentes para tratamiento de cáncer, por ejemplo melanoma. Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un portador o excipiente-, estabilizador, agente saborizante y/o agente colorante.
Se provee en la presente formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación de agentes que pueden ser por ejemplo una combinación de dos tipos de agentes: (1) un inhibidor de RAF y/o metabolitos farmacológicamente activos, sales, solvatos y racematos de inhibidor y (2) un inhibidor de MAP3K8 (TPL/COT) y/o metabolitos farmacológicamente activos, sales, solvatos y racematos de inhibidor de COT. En otra modalidad, la combinación de agentes puede ser provista para un sujeto que comprende células mutantes de BRAF o que comprende células que sobreexpresan MAP3K8 (TPL/COT) e incluyen: (1) un inhibidor de RAF y/o metabolitos farmacológicamente activos, sales, solvatos y racematos de inhibidor y (2) un inhibidor de MEK y/o metabolitos farmacológicamente activos, sales, solvatos y racematos del inhibidor de MEK.
La combinación de agentes puede ser administrada utilizando una variedad de rutas de administración conocidas para aquellos experimentados en el arte. La combinación de agentes puede ser administrada a humanos y otros animales oral, parenteral, sublingualmente, mediante aerosol o inhalación de atomización, rectal, intracisternamente , intravaginalmente, intraperitonealmente, bucal o tópicamente en formulaciones unitarias de dosificación que contienen portadores aceptables farmacéuticamente no tóxicos convencionales, adyuvantes y vehículos como se desee. La administración tópica puede también involucrar el uso de administración transdérmica tales como parches transdérmicos o dispositivos de ionoforesis. El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal o técnicas de infusión .
Los métodos de formulación son bien conocidos en el arte y son revelados, por ejemplo en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa . , 19th Edition (1995). Composiciones farmacéuticas para uso en la presente invención pueden estar en forma de soluciones liquidas no pirogénicas, estériles o suspensiones, cápsulas recubiertas, supositorios, polvos liofilizados, parches transdérmicos u otras formas conocidas en el arte.
Preparaciones inyectable, por ejemplo suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles pueden ser formuladas de acuerdo con el arte conocido utilizando agentes dispersantes o de humectación y agentes de suspensión apropiados. La preparación inyectable estéril puede también ser una solución inyectable estéril, suspensión o emulsión en un diluyente o solvente aceptable parenteralmente no toxico, por ejemplo como una solución en 1,3 propandiol o 1,3 butandiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden ser empleados están agua, solución de Ringer, U.S.P. y soluciones de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos estériles son empleados convencionalmente como solvente o medio de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite fijo blando puede ser empleado incluyendo mono-o di-glicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como acido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.. Las formulaciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo mediante filtración a través de un filtro de retención bacteriana o al incorporar agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas estériles que pueden ser disueltas o dispersadas en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.
Con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es frecuentemente frenar la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de una suspensión liquida del material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que a su vez, puede depender del tamaño cristalino y forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada parenteralmente se puede llevar a cabo mediante disolución o suspensión del fármaco en un vehículo de aceite. Formas de depósito inyectable son elaboradas al formar matrices micro encapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como poliglicolato de polilactudo. Dependiendo de la proporción de fármacos a polímeros y la naturaleza del polímero particular empleado, la velocidad de liberación de fármaco puede ser controlada. Ejemplos de polímeros biodegradables incluyen poli (orto esteres) y poli (anhídridos) . Formulaciones inyectables de depósito pueden también ser preparadas al atrapar el fármaco en liposomas o micro emulsiones que son compatibles con los tejidos corporales .
Composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden ser preparados al mezclar los compuesto de invención con excipientes o portadores no irritantes apropiados, tales como manteca de caco, poli etilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por consiguiente se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
Las formas de dosificación solidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, pildoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación oral, el compuesto activo es mezclado con por lo menos un excipiente o portador aceptable armacéuticamente inerte tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o (a) rellenos o agentes extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y acido silícico (b) aglutinantes tales como por ejemplo carboximetilcelulosa, arginato, gelatina, polivinilpirrilidinona, sacarosa y acacia, (c) humectantes tales como glicerol, (d) agentes desintegrantes tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, acido alginico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, (e) agentes retardantes de solución tales como parafina, (f) aceleradores de absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes tales como por ejemplo alcohol cetílico y mono estearato de glicerol, (h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita y (i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, poli etilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, la forma de dosificación puede también comprender agentes reguladores del pH.
Composiciones sólidas de tipo similar pueden también ser empleadas como rellenos en cápsulas de gelatina de relleno blandas y duras utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche también como polietilenglicoles de alto peso molecular y los semejantes.
Las formas de dosificación sólidas de tabletas, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos pueden ser preparadas con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser también de una composición que libera el (los) ingrediente (s) activo (s) solamente o de preferencia en una cierta parte del sistema intestinal, opcionalmente de manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que pueden ser usadas incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Los compuestos activos pueden también estar en forma micro encapsulada con uno o más excipientes como se indica anteriormente. Las formas de dosificación sólidas de tabletas, grageas, cápsulas, pildoras y gránulos pueden ser preparadas con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos que controlan la liberación y otro recubrimientos bien conocidos en el arte de formulación farmacéuticos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede ser mezclado con por lo menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación pueden también comprender, como es la práctica normal, sustancias adicionales diferentes de los diluyentes inertes, por ejemplo lubricantes de formación de tabletas, y otros auxiliares de formación de tabletas tales como estearato de magnesio y celulosa micro cristalina. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes reguladores del pH . Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes que pueden también ser de una composición que libera el (los) ingrediente (s) activo solamente o de preferencia, en una cierta parte del sistema intestinal, opcionalmente de manera retardada. Ejemplos de composiciones de inhibición que pueden ser usadas incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación liquida para administración oral incluyen emulsiones, micro emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires aceptables farmacéuticamente. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación liquida puede contener diluyentes inertes usados comúnmente en el arte tales como por ejemplo agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsificantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropilico, carbonato de etilo, EtOAc, alcohol bencílico, benzoato de benzilo, propilenglicol , 1,3 butilenglicol , dimetilformamida, aceites (en particular aceites de semilla de algodón, nuez molida, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo) , glicerol, alcohol tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y esteres de acido graso de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales pueden también incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de suspensión, agentes endulzantes, saborizantes y perfumes.
Las formas de dosificación oral para administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, atomizaciones, inhalantes o parches. El componente activo es mezclado bajo condiciones estériles con un portador aceptable farmacéuticamente y cualesquier conservadores necesarios o soluciones reguladoras como pueda ser requerido. Formulaciones oftálmicas, gotas para los oídos y los semejantes son también contemplados por estar dentro del alcance dentro de esta invención.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además del compuesto activo de esta invención, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácidos silícico, talco y oxido de zinc o mezclas de los mismos.
Las composiciones de la invención pueden también ser formuladas para administración como un aerosol líquido o polvo seco inhalable. Las formulaciones en aerosol liquidas pueden ser nebulizadas predominantemente a tamaños de partículas que pueden ser administrados a los bronquiolos terminales y respiratorios.
Las formulaciones en aerosol de la .invención pueden ser administradas utilizando un dispositivo de formación de aerosol, tal como un chorro, placa poros vibratoria o nebulizador ultrasónico, preferiblemente seleccionado para permitir la formación de partículas de aerosol que tienen un diámetro por medio en masa predominantemente de entre 1 a 5 µ?. Además, la formulación tiene preferiblemente fuerza iónica de osmolaridad equilibrada y concentración de cloruro de sodio equilibrada y el volumen que se puede convertir en aerosol mas pequeño apto para administrar dosis efectivas de los compuestos de la invención al sitio de la infección. Adicionalmente , la formulación en aerosol preferiblemente no deteriora negativamente la funcionalidad de las vías aéreas y no provoca efectos secundarios indeseables.
Dispositivos de aerosol apropiados para administración de formulaciones en aerosol de la invención incluyen por ejemplo, chorro, placa porosa vibratoria, nebulizadores ultrasónicos e inhaladores de polvo seco energizados que son aptos de nebulizar la formulación de la invención aun tamaño de partícula de aerosol predominantemente en el intervalo de tamaño de 1-5µ?. Predominantemente, en esta solicitud significa que por lo menos 70%, pero preferiblemente mas de 90% de todas las partículas en aerosol generadas están dentro del intervalo de 1-5 µ?. Un nebulizador a chorro trabaja mediante presión de aire para romper una solución liquida en gotas de aerosol. Los nebulizadores de placa porosa vibratoria trabajan al usar un vacio sónico producido por una placa porosa que vibra rápidamente para extrudir una gota de solvente a través de una placa porosa. Un nebulizador ultrasónico trabaja mediante, un cristal piezoeléctrico que corta un liquido en gotas de aerosol pequeñas. Una variedad de dispositivos apropiados están disponibles incluyendo por ejemplo nebulizadores de placa porosa vibratoria AERONEB o AERODOSE y AERODOSE (AeroGen, Inc., Sunnyvale, California), nebulizadores SIDESTREAM (Medie Aid Ltd., West Sussex, Inglaterra) , nebulizadores de chorro PARI LC y PARI LC STAR ¦ (Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Virginia) y AEROSONIC (DeVilbiss Medizinische Produkte ( Deutschland) GmbH, Heiden, Alemania) y nebulizadores ultrasónicos ULTRAAIRE (Omron Healthcare, Inc., Vernon Hills, Illinois) .
Los compuestos de la invención pueden también ser formulados para uso como polvos tópicos y atomizaciones, que contienen, además de los compuestos de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, acido silícico, hidróxido de aluminio, silicato de calcio y polvo de poliamida o mezclas de estas sustancias. Las atomizaciones pueden contener adicionalmente los propelentes acostumbrados como clorofluorohidrocarburos .
Los parches transdérmicos tienen la ventaja agregada de proveer administración controlada de un compuesto al cuerpo.
Tales formas de dosificación pueden ser elaboradas al disolver o dispersar el compuesto en el medio apropiado. Mejoradores de absorción pueden también ser usados para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede ser controlada ya sea al proveer una membrana que controla la velocidad o al dispersar el compuesto en una matriz o gel polimérico. Los compuestos de la presente invención pueden también ser administrados en forma de liposomas. Como es conocido en el arte, los liposomas son en general derivados de fosfolipidos u otras sustancias de lipidos. Los liposomas son formados mediante cristales líquidos hidratados de mono capilares que son dispersados en un medio acuoso. Cualquier lípido no toxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable apto de formar liposomas puede ser usado. Las presentes composiciones en forma de liposoma pueden contener, además del compuesto de la presente invención, estabilizadores, conservadores, excipientes y los semejantes. Los lipidos preferidos son los fosfolipidos y fosfatidil colina (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Métodos para formar liposomas son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo Prescott (ed. ) , "Methods in Cell Biology, " Volume XIV, Academic Press, New York, 1976, p. 33 et seq.
Ejemplos Ejemplo 1 : Selección funcional a base de ORF identifica cinasas especificas como impulsores de resistencia a inhibición de B-RAF Para identificar cinasas aptas de circunvenir la inhibición ARF, 597 clones de ORF de cinasa secuencia-validados que representan el -75% de la cinasas indicadas (Center for Cáncer SystemsBiology (CCSB)/Broad Institute Kinase ORF Collection) fueron ensamblados y expresados establemente en A375, una línea de célula de melanoma maligno de B-RAFV600E que es sensible al inhibidor de cinasa ARF PLX4720 (Tsai, J. et al.Proc. Nati Acad. Sci. USA105, 3041-3046 (2008)) (Figura la, Ib, Tabla 3, Figura 6c) . Las células que expresan ORF tratadas con PLX4720 1 µ? fueron seleccionadas en cuanto a viabilidad en relación con células sin tratar y normalizadas a un testigo positivo análisis-especifico, MEK1S218 222D (MEK1DD) (Emery, C. M. et al.Proc. Nati Acad. Sci. USA106, 20411-20416 (2009) ) (Tabla 4 y resumido en la Figura 5) . Nueve ORF confirieron resistencia a niveles que exceden dos desviaciones estándar de la media (Figura Ib y Tabla 4) y fueron seleccionadas para análisis de seguimiento (Figura 7) . Tres de nueve ORF candidatas fueron cinasas de tirosina receptoras, suprimiendo el potencial de esta clase de cinasas para involucrarse en rutas de resistencia. Los efectos de resistencia fueron validados y priorizados a través de una escala de concentración de fármaco de PLX4720 de multipuntos en las líneas celulares de B-RAFv600E 7A375 y SKMEL28. Las cinasas de cinasas de MAP Ser/Thr (MAP3Ks) ???3?8 (C0T/Tpl2) y RAF1 (C-RAF) surgieron como los mas altos candidatos de ambas líneas celulares; estos ORF desplazaron la GI50 de PLX4720 por 10-600 veces sin afectar la viabilidad (Tabla 5, Figuras 8 y 9) . CRKL, una ORF que desplazo la GI50 de PLX4720 a una extensión menor (9.7 veces en células SKMEL28; Figura 8), codifica una proteína de adaptador fosforilada mediante cinasa de tirosina tales como BCR-ABL (Birge, R.B. et al., Cell Commun Signal 7, 13 (2009)), pero carece de actividad de cinasa intrínseca. COT y C-RAF redujeron la sensibilidad a PLX4720 en múltiples líneas celulares de B-RAFV600E (Figura le) confirmando la habilidad de estas cinasas para moderar la resistencia a inhibición de RAF. Una selección secundaria en A375 y SK EL28 da prioridad a los nueve ORF candidatos mas altos a través de una escala de concentración de PLX4720 en múltiples puntos (Figura Id) .
Interesantemente, las dos cinasas validadas mas altas son ambas cinasas de cinasa de cinasa Ser/Thr (MAP3K) que se sabe que activan la señalización de MEK/ERK en varios contextos. Como B-RAF, C-RAF es una MAP3K en la cascada de MAPK canónica (McKay, . . y Morrison, D.K. Oncogene 26, 3113-3121 (2007)) que fue previamente implicada en resistencia asociada con la selección gradual in vitro utilizando un inhibidor de pan-RAF (Montagut, C. et al. Cáncer Res 68, 4853-4861 (2008)) . COT (la proteina producto del gen de MAP3K8 humano) es mejor caracterizada como la MAP3K (Salmerón, A. et al. EMBO J 15, 817-826 (1996)) corriente debajo de la señalización de NFKB en células inflamatorias (Banerjee, A.et al.,Proc Nati Acad Sci U.S. A. 103, 3274-3279 (2006) ) ; sin embargo, su importancia funcional en cáncer de humano no ha sido elucidada previamente.
Ejemplo 2 : Resistencia a inhibición de B-RAF vía activación de la ruta de MAPK También se probó si la sobreexpresion de estos genes era suficiente para activar la ruta de MAPK. En la referencia, la expresión de COT incremento la fosforilación de ERK de manera comparable a MEK1DD, consistente con la activación de la ruta de cinasa de MAP (Figuras 2a y 10) . La sobreexpresion de COT o C-RAF tipo silvestre dio como resultado la fosforilación constitutiva de ERK y MEK en presencia de PLX4720, mientras gue los derivados cinasa-muertos no tuvieron ningún efecto (Figuras 2a y 11) . Asi, COT y C-RAF impulsan la resistencia a la inhibición de RAF predominantemente por medio de la reactivación de la señalización de MAPK. Notablemente, ninguno de los nueve ORF candidatos de la selección inicial, un subconjunto (3) no mostró fosforilación de ERK/MEK persistente enseguida de la inhibición de RAF, sugiriendo la alteración independiente de la ruta de MAPK de la sensibilidad al fármaco (Figura 12).
Ejemplo 3 : Activación de C-RAF y heterodimerización con B-RAF La activación de C-RAF y heterodimerización con B-RAF constituyen componentes críticos de la respuesta celular a la inhibición de B-RAF. En células A375, los heterodimeros de C-RAF: B-RAF endógenos fueron mensurables e inducibles enseguida del tratamiento con PLX4720 (Figura 13) . Sin embargo, la fosforilación de C-RAF endógeno en S338-un evento requerido para la activación de C-RAF-permaneció baja (Figura 13). En contraste, C-RAF expresado ectópicamente fue fosforilado en S338 (Figura 13.) y su genotipo de resistencia a PLX4720 fue asociado con la activación de MEK/ERK sostenida (Figura 2a y 13) . Además la expresión ectópica de un mutante de truncación de C-RAF de alta actividad (C-RAF ( 22) fue mas efectiva que C-RAF tipo silvestre en moderar la resistencia a PLX4720 y activación de ERK (Figura 14), indicando además que la actividad de C-RAF elevada dirige la resistencia a este agente. Consistente con este modelo, alelos oncogénicos de NRAS y KRAS confirieron resistente a PLX4720 en células A375 (Figura 2b) y produjeron fosforilación de C-RAF (S338) y ERK sostenida en el contexto de tratamiento de fármaco (Figura 2c) . Así, aunque las alteraciones genéticas que engendran la activación de C-RAF (por ejemplo, mutaciones de RAF oncogénicas) tienden a mostrar exclusividad mutua con la mutación de B-RAFV600E, tales eventos que co-ocurren son favorecidos en el contexto de resistencia adquirida a inhibición de B-RAF.
Ejemplo 4 : Investigación de expresión de COT en melanoma En tanto que C-RAF ha sido enlazado previamente a melanoma y dependencia de ruta de MAPK (Montagut, C. et al. 2008; Karreth, F.A. , DeNicola, G.M. et al., 2009; Dumaz, N. et al. Cáncer Res 66, 9483-9491 (2006); Hatzivassiliou, G. et al. Nature (2010); Heidorn, S.J. et al., Cell 140, 209-221 (2010); Poulikakos, P.I. et al., Nature (2010)), COT no ha sido descrito como una cinasa melanoma-asociada .
El papel de COT en melanoma fue investigado y su expresión en melanocitos humanos fue examinada. Melanocitos inmortalizados primarios (B-RAF tipo silvestre) expresaron COT (Figura 2d) , aunque la expresión de B-RAFV600E ectópica redujo los niveles de mARN de COT (Figura 15) y volvió a la proteina de COT indetectable (Figura 2d) . Inversamente, mientras que COT expresado ectópicamente fue solo débilmente detectable en células A375 (Figura 2a, 3e) el agotamiento shARN-moderado de B-RAFV600E endógeno provoco un incremento en niveles de proteina de COT que se correlacionaron con la extensión del knockdown de B-RAF (Figura 2e) . Además, el tratamiento de células A375 que expresan COT con PLX4720 condujo a un incremento dependiente de dosis en proteina de COT (Figura 2a) sin afectar los niveles de mARN de COT ectópicos (Figura 15). B-RAF oncogénico antagoniza la expresión de COT extensamente por medio de la estabilidad de proteina alterada (Figura 2a, d, e y 15) y la inhibición de B-RAF potencia el crecimiento de células que expresan COT durante el curso del tratamiento. Notablemente, ni C-RAF ni B-RAF solos o en combinación fueron requeridos para la fosforilación de ERK en el contexto de la expresión de COT, aun en presencia de PLX4720 (Figura 2e, 2f y Figura 16). Como se muestra, la expresión de COT es suficiente para inducir la activación de la ruta de la cinasa de MAP derivada de manera independiente de RAF.
Ejemplo 5: La expresión de COT predice resistencia a inhibición de B-RAF en lineas de célula de cáncer .
Se probo que las lineas celulares que expresan COT elevado en un fondo de B-RAFV600E exhibe resistencia de novo al tratamiento con PLX4720. Para identificar tales instancias, un panel de lineas celulares fue seleccionado en cuanto a evidencia de ganancias de número de copia de MAP3K8/COT coincidente con la mutación de B-RAFV600E. De 534 lineas celulares que habían sufrido análisis de numero de copia y perfilado de mutación, 38 líneas celulares (7.1%) convenían la mutación de B-RAFV600E. Dentro de este subgrupo dos lineas celulares-OU S-23 (cáncer de colon) y RPMI-7951 (melanoma ) -también mostraron evidencia de ganancias de copia cromosomal que abarca el sitio de MAP3K8/COT (Figuras 3a y 17) y expresión de proteina de COT robusta (Figura 3b y 18). Un panel de cultivos a corto plazo de melanoma fue también seleccionado en cuanto a expresión de proteina de COT. Una de estas lineas expresaron COT: M307, un cultivo de corto plazo derivado de un tumor de B-RAFV600E que desarrollo resistencia a la inhibición de MEK alostérica enseguida de la estabilización de la enfermedad inicial (Figura 3c) . Todas las tres lineas celulares fueron refractarias al tratamiento de PLX4720 exhibiendo valores GI50 en el intervalo de 8-10 µ? (Figura 3d) y que muestran fosforilación de ERK sostenida en el contexto de inhibición de B-RAF (Figuras 3e y Ef) . OUMS-23 y RPMI-7951 son lineas de células naive inhibidores de ruta de MAPK; asi, estos resultados demuestran que COT confiere resistencia del novo a la inhibición de RAF (un fenómeno observado en -10% de melanomas de B-RAFV600E) - Ejemplo 6: Expresión de COT en pacientes tratados con inhibidor de COT La expresión de COT en el contexto de resistencia al inhibidor de RAF clínico PLX4032 fue examinada al obtener material de biopsia de tres pacientes con melanoma de B-RAFV600E metastático. Cada caso consistía ' de material de biopsia, lesión-coincidente-congelado o tenido antes de y durante el tratamiento ( "pre-t ratamiento" y "en tratamiento"; Figura 3g, Tabla 6) ; adicionalmente, una muestra contenia dos especímenes de biopsia independientes del mismo sitio de tumor de recaída ("post-recaída"; Figura 3g) . Consistente con los modelos experimentales presentados anteriormente, el análisis de RT-PCR en tiempo real cuantitativo (qRT/PCR) revelo expresión de mARN de COT incrementada concurrente con el tratamiento de PLX4032 en dos de tres casos. Los niveles de mARN de COT fueron incrementados adicionalmente en un espécimen de recaída en relación con sus contrapartes de pre-tratamiento y en tratamiento (Figura 3G, paciente numero 1) . Una biopsia de melanoma maligno de recaída sin coincidir adicional mostró expresión de mARN de COT elevada comparable con niveles observados en líneas celulares COT-amplificadas resistentes al inhibidor de RAF (Figura 19) . Este espécimen también exhibió activación de ruta de MAPK robusta y expresión elevada de B-RAF, C-RAF y COT en relación con la piel normal coincidente o líneas celulares de B-RAFV600E (Figuras 19) . Estudios de secuenciación de este tumor no revelaron mutaciones adicionales en BRAF, NRAS o KRAS (datos no mostrados) . Estos analitos proporcionaron evidencia clínica de que los mecanismos COT-dependientes son operantes en melanomas malignos PLX4032-resistentes .
Ejemplo 7 : Regulación de COT de fosforilación de MEK/ERK Si COT regula activamente la fosforilación de MEK/ERK en células de B-RAFV600E que albergan la expresión de COT naturalmente elevada fue probado al introducir constructos de shARN que apuntan a COT en células RPMI-7951. El agotamiento de COT suprimió la viabilidad de RPMI-7951 (Figura 20) y disminuyo la fosforilación de ERK (Figura 3h) ; así, apuntan que la actividad de cinasa de COT suprime la fosforilación de MEK/ERK en células de cáncer con sobreexpresión de COT o amplificación de COT. Adicionalmente, el apuntamiento de la actividad de cinasa de COT en presencia de un inhibidor de B-RAF (PLX4720) suprime la fosforilación de MEK/ERK (Figura 3h) . El tratamiento de células RMI-7951 con un inhibidor de cinasa de COT de molécula pequeña (Wyeth, Abbot compound ID 9549300) (George, D. et al.,Bioorg. Med. Chem. Lett.18, 4952-4955 (2008); Hirata, K. et al., Biol. Pharm. Bull.33, 133-137 (2010); Lee, K. M. et al., Cáncer Res.69, 8043-8049 (2009)) dio como resultado la supresión dosis-dependiente de la fosforilación de MEK y ERK, proporcionando evidencia adicional de que COT contribuye a la activación de MEK/ERK en estas células (Figura 3i).
Ejemplo 8: Lineas celulares de B-RAFV600E que expresan COT exhiben resistencia a inhibidores de MEK alostéricos Se analizo si las células de cáncer que expresan COT siguen siendo sensibles a la inhibición de la ruta de MAPK en un objetivo corriente debajo de COT o RAF. Las lineas celulares OU S-23 y RPMI-7951 fueron interrogadas en cuanto a sensibilidad al inhibidor de EK1/2 y CI-1040. Ambas lineas celulares fueron refractarias a la inhibición de MEK (Figura 4a) y mostraron fosforilación de ERK sostenida a una CI-1040 1 µ? (Figura 4b) . La expresión de COT ectópica en células A375 y SKMEL28 también confirió sensibilidad disminuida a los inhibidores de MEK CI-1040 y AZD6244, sugiriendo que la expresión de COT solo fue suficiente para inducir este fenotipo (Figuras 4c, 4d y 21) . Similar a los resultados observados con inhibidores de MEK farmacológicos, el knockdown de MEK1/2 solo suprimió moderadamente la fosforilación de ERK COT-moderada en células A375 (Figura 22). Estos datos demuestran que COT activa ERK por medio de mecanismos MEK-independiente y MEK-dependientes . Además, un análisis de cinasa in vitro utilizando COT y ERK1 recombinantes fue efectuado y se demostró que COT recombinante induce la fosforilación de pThr202/Tyr204 de ERK1 in vitro (Figura 22). Asi, la expresión de COT potencia la activación de ERK de manera independiente de MEK.
Ejemplo 9: Inhibición de ruta de MAPK combinatorial para suprimir la proliferación celular El uso de inhibidores de RAF y MEK en combinación puede cancelar la resistencia a agentes individuales como se muestra en la Figura 23. Se probo si la inhibición de RAF/MEK combinada podría circunvenir la resistencia COT-impulsada . En el ageste de expresión de COT ectópica, la exposición a AZD6244 o CI-1040 en combinación con PLX4720 (1 µ? a cada uno) redujo el crecimiento celular y la expresión de pERK mas efectivamente que en PLX4720 de un solo agente, aun en concentraciones de 10 µ? (Figuras 4e, 4f y 23). Estos datos subrayan la importancia de esta ruta en células de tumor de B-RAF 600E y demuestran que la inhibición de B-RAF/MEK ayuda a circunvenir la resistencia a los inhibidores de RAF.
Métodos Centro para biología de sistemas de cáncer (CCSB) /Colección de cuadro de lectura abierta de cinasa del Instituto amplio Una biblioteca de 597 ORF de cinasa en vectores de entrada de pDONR-223 (Invitrogen) fueron ensamblados. Los clones individuales fueron secuenciados por el extremo utilizando cebadores vector-específicos en ambas direcciones. Los clones con desviaciones sustanciales de secuencias reportadas fueron descartados. Los clones de entrada y secuencias están disponibles vía Addgene (http: //www . addgene . org/human kinases) . Los ORF de cinasa fueron ensamblados de múltiples fuentes; 337 cinasas fueron aisladas como clones individuales de la colección ORFeome 5.1 (http : //horfd . dfci . harvard . edu) , 183 cinasas fueron clonadas de ARN de tejido humano normal (Ambion) mediante transfección inversa y subsecuente amplificación de PCR para agregar secuencias de Gateway ( Invitrogen) , 64 cinasas fueron clonadas de plantillas provistas por el Instituto Harvard de proteomics (HIP) y 13 cinasas fueron clonadas a sistemas Gateway de plantillas obtenidas de laboratorios colaborantes. El vector lentiviral Gateway-compatible pLX-Blast-V5 fue creado de la cadena fundamental de pLKO-1. Reacciones de recombinación enzimáticas de LR clonasa fueron efectuadas para introducir las 597 cinasas a pLX-Blast-V5 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen).
Selección de ORF de alto rendimiento Células de melanoma A375 fueron depositadas en placas de mitro titulo de 384 cavidades (500 células por cavidad) . El día siguiente, las células fueron spin-infectadas con la biblioteca de ORF de cinasa lentiviralmente-empacada en presencia de 8 µg/ml de polibreno. 48 horas post-infección, el medio fue reemplazo con medio de cultivo estándar (dos replicas) , medio que contiene 1 µ PLX4720 (2 replicas, puntos en el tiempo) o medios que contienen 10 µ?/ml de blasticidina (2 replicas). Después de 4 días y 6 días, el cultivo celular fue analizado utilizando Cell Titer-Glo(Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Todo el experimento fue efectuado dos veces.
Identi icación de ORF de resistencia candidatos Los valores de luminiscencia sin procesar fueron importados a Excel de Microsoft. La eficiencia de infección fue determinada por el porcentaje de luminiscencia sin procesar duplicado-promediada en células seleccionadas de blasticidina en relación con células no seleccionadas. Los ORF con una eficiencia de infección de menos de 0.70 fueron excluidos del análisis adicional junto con cualquier ORF que tiene una desviación estándar de > 15,000 unidades de luminiscencia sin procesar entre duplicados. Para identificar ORF cuya expresión afectan la proliferación, se comparo la luminiscencia sin procesar duplicado-promediado de ORF individuales contra el promedio y desviación estándar de todas las células testigo-tratadas vía la puntuación z o puntuación estándar a continuación, Z = en donde x = luminiscencia sin procesar promedio de un ORF dado, µ = luminiscencia sin procesar media de todos los ORF s = la desviación estándar de la luminiscencia sin procesar de todas las cavidades. Cualquier ORF individual con una puntuación z > + 2 o <-2 fue anotada que afectan la proliferación y fue removida del análisis final. La proliferación diferencial fue determinada por el porcentaje de valores de luminiscencia sin procesar publicado-promediados en células con PLX4720 (1 µ?) en relación con células sin tratar. Subsecuentemente, la proliferación diferencial fue normalizada al testigo positivo en cuanto a resistencia a PLX4720 EK1S218 222D (MEK1DD) , con proliferación diferencial de MEK1DD = a 1.0. La proliferación diferencial normalizada de MEK1DD para cada ORF individual fue promediada a través de dos experimentos duplicados, con dos puntos en el tiempo para cada experimento (día 4 y dia 6) . Luego una puntuación z fue generada, como se describe anteriormente para la proliferación diferencial normalizada de MEKIDD promedio. Los ORF con una puntuación z > 2 fueron considerados a ciertos seguidos en la selección secundaria. ORF y expresión de shARN Los ORF fueron expresados de pLX-Blast-V5 (lentiviral) o plásmidos de expresión de pWZL-Blast, pBABE-Puro o pBABE-zeocin (retroviral ) . Para la transducción lentiviral, células 293T fueron transíectadas con un 1 µ? de pLX-Blast-V5-ORF o pLKO.1-shRNA, 900 ng ?8.9 (gag, pol) y 100 ng VSV-G utilizando 6 µ? de Fugene (Roche) . El supernatante viral fue cosechado 72 horas post-transfección . Células mamiferas fueron infectadas a una dilución 1:10-1:20 de virus en placas de 6 cavidades en presencia de 5 µ?/ml de polibreno y centrifugadas a 2250 RPM por 1 hora a 37°C. Veinticuatro horas después de la infección con blasticidina (pLX-Blast-V5, 10 pg/ml) o puro (pLKO.l, 0.75 µ?/???) fue agregado y las células fueron seleccionadas por 48 horas. Para producción de retrovirus, células 293T fueron transfectadas con 1 µ? de plásmido-ORF retroviral, 1 µ? de pCL-AMPHO y 100 ng de VSV-G, como se describe anteriormente. Las células fueron infectadas con supernatante que contiene retrovirus a una dilución de 1:2 en 5µ/p?1 de polibreno de la noche a la mañana, seguido por el cambio de medio a medio de cultivo. La infección fue repetida una vez mas (dos veces en total), seguido por selección, como antes.
Selección secundaria Células A375 (1.5 x 103) y SKMEL28 (3 x 103) fueron sembradas en placas de 96 cavidades por 18 horas. Lentivirus que expresa ORF fue agregado a una dilución de 1:10 en presencia de 8 µg/ml de polibreno y centrifugado a 2250 RPM y 37 °C por 1 horas. Enseguida de la centrifugación, el medio que contiene virus a medio de cultivo normal y se le permite que incube por 18 horas. Veinticuatro horas después de la infección, se agrego DMSO (1:1000) o lOx PLX4720 (en DMSO) a una concentración final de 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 o 0.00001 µ?. La viabilidad celular fue analizada utilizando WST-1 (Roche) , según la recomendación del fabricante, 4 días después de la adición de PLX4720.
Lineas celulares y reactivas A375, SK EL28, SKMEL30, COLO-679, M4511u, SKMEL5, Malme 3M, S MEL30, WM3627, WM1976, WM3163, WM3130, WM3629, M3453, WM3682 y WM3702 fueron cultivadas en RPMI (Cellgro) , FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%. M307 fue cultivada en RPMI (Cellgro) , FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% complementada con piruvato de sodio 1 mM. Células 293T y OUMS-23 fueron cultivadas en DMEM (Cellgro) , FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Célula RPMI-7951 (ATCC) fueron cultivadas en MEM (Cellgro), FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% .Melanocitos primarios tipo silvestre fueron cultivados en HAM FIO (Cellgro) , FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Melanocitos primarios que expresan B-RAFV600E fueron cultivados en medio de TIVA (Cellgro), FBS al 7%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina 2 mM (Cellgro) , IBMX 100 µp?, 50 ng/ml de TPA, lmMdbcAMP lmM (Sigma) y vanadato de sodio 1 µ?] . CI-1040 (PubChem ID: 6918454) fue comprado de Shanghai Lechen International Trading Co . , AZD6244 (PubChem ID: 10127622) de Selleck Chemicals y PLX4720 (PubChem ID: 24180719) de Symansis. RAF265 (PubChem ID: 11656518) fue una donación generosa de Novartis Pharma AG. A no ser que se indique de otra manera, todos los tratamientos de fármaco fueron por 1*6 horas. Alelos activados de NRAS y KRAS han sido descritos previamente. (Boehm, J. S. et al.Cell 129, 1065-1079 (2007); Lundberg, A. S. et al. Oncogene 21, 4577-4586 (2002)).
Análisis de inhibición de crecimiento farmacológico Células cultivadas fueron sembradas en placas de 96 cavidades (3,000 células por cavidad) para todas las lineas de células de melanoma; 1,500 células fueron sembradas para 375. 24 horas después de la siembra diluciones seriales de compuestos relevantes fueron preparadas en DMSO agregada alas células, produciendo concentraciones de fármaco finales que varían de 100 µ? a 1 x 105µ?, el volumen final de DMSO no excede del 1%. Las células fueron incubadas por 96 horas enseguida de la adición del fármaco. La viabilidad celular fue medida utilizando el análisis de viabilidad de WST1 (Roche) la viabilidad fue calculada como porcentaje de testigo (células sin tratar) después de la resta del fondo. Un minimo de 6 replicas fueron efectuadas para cada línea celular en combinación de fármaco. Los datos de análisis de inhibición de crecimiento fueron modelados utilizando un ajuste de curva de regresión no lineal con una dosis-respuesta sigmoide'. Estas curvas fueron desplegadas y GI50 generado utilizando Graph Pad Prism 5 para Windows (GraphPad) . Las curvas sigmoide-respuesta que cruzaron el punto de inhibición del 50% en o por encima de 10 µ? tienen valore s de IG50 anotados como > 10 µ?. Para estudios de una sola dosis, se siguió el protocolo idéntico utilizando una sola dosis del fármaco indicado (1 µ? a no ser que se indique de otra manera) .
Inmunoabsorciones e inmunoprecipitaciones Las células fueron lavadas dos veces con PBS helado y sometidas a lisis con solución reguladora del pH con NP-40 al 1% [150 mM NaCl, 50 mM TrispH 7.5, 2 mM EDTA pH 8, 25 mM NaF y 1% NP-40] que contiene inhibidores de proteasa 2x (Roche) y cocteles I y II de Inhibidor de fosfatasa lx (CalBioChem) . Los lisados fueron cuantificados (Análisis de Bradford) , normalizados, reducidos, desnaturalizados (95%) y resueltos mediante electroforesis de gel de SDS sobre geles de Tris/Glicina al 10% ( Invitrogen) . La proteina fue transferida a membranas de PVDF y sondeadas con anticuerpos primarios que reconocen pERKl/2 (T202/Y204 ) , p EKl/2 (S217/221) , MEK1/2, EK1, MEK2, C-RAF (rabbit host), pC-RAF (pS338) (Cell Signaling Technology; 1:1,000), V5-HRP (Invitrogen; (1:5,000), COT (1:500), B-RAF (1:2,000), Actina (1:1,000), Actina-HRP (1 : 1, 000; Santa Cruz)), C-RAF (huésped ratón; 1:1,000; BD Transduction Labs), Vinculina (Sigma; 1:20,000), AXL (1:500; R&D Systems). Después de incubación con el anticuerpo secundario apropiado (anti-conejo, IgG anti-ratón, HRP-enlazado; dilución 1:1000, Tecnología de señalización celular o IgG anti-cabra, HRP-enlazado; dilución de 1:1000, Santa cruz) , las proteínas fueron detectadas utilizando guimioluminiscencia (Pierce) . Las inmunoprecipitaciones fueron efectuadas de la noche a la mañana a 4°C de solución reguladora del pH de lisis NP-40 al 1%, como se describe anteriormente, a una concentración de 1 µ?/ml total de proteína utilizando un anticuerpo que reconoce C-RAF (1:50; Cell Signaling Technology) . Los complejos de anticuerpo: antígeno fueron enlazados a agarosa de proteína A (25 L, suspensión al 50% ; Pierce) por 2 horas a 4 °C. Las perlas fueron centrifugadas y lavadas tres veces en solución reguladora del pH de lisis y eluidas y desnaturalizadas (95°C) en solución reguladora del pH de muestra reducida 2x ( Invitrogen) . Las inmunoabsorciones fueron efectuadas como antes. La cuantificación de fosfo-proteina fue efectuada utilizando NIH Image J.
Los lisados de tumor de piel normal coincidente fueron generados mediante homogenización mecánica del tejido RIPA [50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, lmM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% NaDOC, 1.0% Tritón X-100, 25 mM NaF, lmM NA3V04], que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa, como antes. La normalización subsecuente e inmunoabsorciones fueron efectuadas como antes.
Material de tumor de melanoma sometido a biopsia El material de tumor sometido a biopsia consistía de tejido descartado y des-identificado que fue obtenido con consentimiento por escrito y caracterizado bajo el protocolo 02-017 (muestras apareadas, Hospital General de Massachusetts) y 07-087 (muestra sin aparear, Dana-Farber Cáncer Insitute) . Para especímenes apareados, las muestras "en tratamiento" fueron recolectadas 10-14 días después del inicio del tratamiento con PXL4032 (Tabla 6) .
Inhibición de actividad de cinasa de COT Células RPMI-7951 adherentes fueron lavadas dos veces con PBS lx incubadas de la noche a la mañana en medio de cultivo libre de suero. Subsecuentemente, 4- ( 3-Cloro-4-fluorofenilamino) -6- (piridin-3-il-metilamino) -3-ciano- [1,7]-naftiridina ( EMD TPL2 inhibidor I; Cat#: 616373, PubChem ID: 9549300), suspendido en DMSO a la concentración indicada, fue agregado a las células por una hora, después de lo cual los extractos de proteína fueron ' elaborados como se describe anteriormente.
RT-PCR cuantitativa EL mARN fue extraído de líneas celulares y tumores recién congelados utilizando el kit de RNeasy (Qiagen) . El mARN total fue usado para la transcripción inversa subsecuente utilizando la Super mezcla de síntesis de primera hebra super script III (Invitrogen) para líneas celulares y muestras de tumor sin aparear y el kit de Síntesis de cADN super script VILO (Invitrogen) para muestras de tumor congeladas apareadas. Se usaron 5 µ? de la reacción de T para PCR cuantitativa utilizando la mezcla madre de PCR SYBR Green y cebadores gen-específicos por triplicado, utilizando un sistema de PCR en tiempo real ABI 7300. Los cebadores usados para detección son como sigue: Análisis de cinasa in vitro Análisis de cinasa in vitro fueron efectuados como se describe previamente utilizando 1 µg de cada COT (aminoácidos 30-397, R & D Systems) y ERK1 inactivo (Millipore) .
Análisis de viabilidad celular Células RPMI-7951 adherentes fueron infectadas con virus que expresa shARN contra COT o Luciferasa como se describe anteriormente. Enseguida de la selección, las células fueron depositadas (1.5 x 105 células/cavidad) sobre una placa de 24 cavidades por cuadriplicado.. Las células viables fueron contadas via exclusión de azul de trifano utilizando un analizador de viabilidad celular VI-CELL, según las especificaciones del fabricante. Los conteos celulares por cuadruplicado fueron promediados y normalizados en relación con aquel del shARN testigo.
Enciclopedia de linea celular de cáncer (CCLE) El proyecto de enciclopedia de linea celular de cáncer (CCLE) es una colaboración entre el Instituto Broad los Institutos de Novartis para investigación biomédica (NIBR) y el Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación de Novartis (GNF) para llevar a cabo una caracterización genética y farmacológica detallada de un panel grande de modelos de cáncer humano, para desarrollar análisis computacionales integrados que enlazan distintas vulnerabilidades farmacológicas a patrones genómicos y para traducir genómicas integrativas de linea celular a la estratificación del paciente con cáncer. Los datos del numero de copia cromosomal y expresión genética usados para este estudio están disponibles en linea en http : / /www . broadinstitute . org/cgi-bin/cáncer/datasets . cgi .
Perfilado de expresión de lineas de células de cáncer El análisis de microarreglo de oligonucleótídos se llevo a cabo utilizando el arreglo de expresión GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix (Affymetrix) . Las muestras fueron convertidas a cARN marcado, fragmentado, siguiendo el protocolo de Affymetrix para uso en el microarreglo de expresión.
Constructos de shARN usados (plKO.l) Las secuencias de ADN para preparar los constructos de shARN usados fueron como sigue: Las definiciones y revelaciones provistas en la presente determinan y reemplazan a todas las otras incorporadas por referencia. Aunque la invención en la presente ha sido descrita en relación con modalidades preferidas de la misma, se apreciara por aquellos experimentados en el arte que adiciones, modificaciones, sustituciones y cancelaciones no descritas específicamente se pueden hacer sin desviarse el espíritu y alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, se pretende que la descripción detallada anterior sea considerada como ilustrativa en lugar de limitante y que se entenderá que son las reivindicaciones siguientes, incluyendo todos los equivalentes, que pretenden definir el curso y alcance de esta invención.
Tabla 3 : Descripción de biblioteca de ORF de cinasa del CCSB/lnsti uto de Broad y clasificación de ORF Abreviaturas: RS/TK (Serina de receptor/Cinasa de treonina); RTK (Cinasa de tirosina de receptor) ; NRS/TK (Serina sin receptor/cinasa de treonina) ; NRTK (cinasa de tirosina sin receptor) Tabla 4: Clasificación de proliferación diferencial (PLX4720 1 µ?/testigo) para 597 ORF cinasa-relacionados, en relación con MEK DD A375 SKMEL28 Tabla 5 : Resultados de una cuantificación de selección secundaria del cambio en GI50 de PLX4720 inducida por las 9 ORF de resistencia candidatas más altas Tabla 6 : Características del paciente Tiempo de Tiempo diagnosis de de Estatuse diagnosis enfermedad Estatus de BRAF (en- Estatus Estat PaEdad Ubicación primaria metastática BRAF (pre- tratamiento/ Estatus Estatus de de de ciente Tejido (años) Genero de Biopsia (años) (años) Respuesta tratamiento) post-recaída) de NRAS RAS pMEK pER Biopsia de Respuesta Pt 1 49 Espalda V600E N/A N/A N/A N/A N/ tejido parcial Biopsia de Respuesta Pt 2 67 M Espalda V600E ?/? N/A N/A N/A N/ tejido parcial Biopsia de Respuesta Pt 3 68 M Pierna V600E N/A N/A N/A N/A N/ tejido parcial Biopsia de Respuesta M-R 38 M Axila V600E V600E WT WT tejido parcial Nodo Cultivo a Enfermedad Ref.
M307 59 M linfático V600E V600E N/A N/A corto plazo estable ( 14) axilar * Vase Figura 20 **Véase Figura 3f

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un sujeto que tiene cáncer que es probable de beneficiarse de un tratamiento con una terapia combinada con un inhibidor de RAF y un inhibidor secundario, caracterizado porque comprende: (a) analizar un numero de copia genética, nivel de mARN o nivel de proteina o fosforilación de uno o mas objetivos de cinasa seleccionados del grupo que consiste de MAP3K8 (TPL2/C0T) r RAF1 (CRAF) , CRKL(CrkL) , FGR (Fgr), PRKCE (Prkce), PRKCH (Prkch) , ERBB2 (ErbB2), AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) en células de cáncer obtenidas del sujeto y comparar el numero de copia genética, el mARN o el nivel de proteina o la fosforilación con un numero de copia genética, mARN o nivel de proteina o fosforilación de la cinasa objetivo en células obtenidas de un sujeto sin el cáncer y (b) correlacionar el numero de copia genética incrementado o una alteración en expresión de mARN o sobreexpresión de proteina o fosforilación de la cinasa objetivo en la células de cáncer en relación con las células del sujeto sin el cáncer con el sujeto que tiene el cáncer que es probable de beneficiarse de tratamiento con la terapia combinada .
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además (c) analizar una muestra de acido nucleico obtenida de las células de cáncer en cuanto a la presencia de una mutación en una molécula de acido nucleico que codifica un polipéptido de B-RAF con una mutación en alrededor de la posición de aminoácidos 6000 y (d) correlacionar la presencia de la mutación en la molécula de 5 acido nucleico que codifica el polipéptido de B-RAF con el sujeto que es probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia combinada.
3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende correlacionar la presencia de una mutación 0 de Valina a acido Glutámico en alrededor de la posición de aminoácidos 600 (V600E) en una molécula de acido nucleico que codifica B-RAF con un sujeto que es probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia combinada.
4. El método de la reivindicación 1, caracterizado 5 porque comprende analizar el número de copia genética, el mARN o el nivel de proteina de MAP3K8 (TPL/COT) .
5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende analizar la fosforilación de C-RAF en el aminoácido S338.
Q 6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo inhibidor es un inhibidor de MEK, un inhibidor de CRAF, un inhibidor de CrkL o un inhibidor de TPL2/COT .
7. El método de la reivindicación 1, caracterizado 5 porque el inhibidor de RAF es un inhibidor de B-RAF o un inhibidor de pan-RAF.
8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de RAF es seleccionado del grupo que consiste de RAF265, sorafenib, SB590885, PLX 4720, PLX4032, GDC-0879 y Z 336372.
9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto tiene resistencia innata al inhibidor de RAF o es probable de desarrollar resistencia al inhibidor de RAF.
10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de melanoma, cáncer de pecho, canceres coloréeteles , glioma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, sarcoma y cáncer de tiroides.
11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el cáncer es melanoma.
12. Un método para tratar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un segundo inhibidor, en donde el segundo inhibidor es un inhibidor de EK o un inhibidor de ???3?8 (TPL2/COT) .
13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el sujeto tiene células de cáncer que comprenden una mutación en B-RAF.
14. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el sujeto tiene células de cáncer que comprenden una mutación de B-RAFV600E.
15. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque comprende además analizar un numero de copia genética, un mARN o un nivel de proteina o fosforilación de una o mas cinasas objetivo seleccionadas del grupo que consiste de MAP3K8 (TPL2/C0T) , RAF1 (CRAF) , CRKL(CrkL) , FGR (Fgr) , PRKCE (Prkce) , PRKCH ( Prkch) ,ERBB2 (ErbB2) , AXL (Axl) o PAK3 (Pak3) en células de cáncer obtenidas del sujeto y comparar el numero de copia genética, el mARN o el nivel de proteina o la fosforilación con un numero de copia genética, un mARN o nivel de proteina o fos-forilación de la cinasa objetivo en células obtenidas de un sujeto sin el cáncer y administrar al sujeto la cantidad efectiva de un inhibidor de RAF y una cantidad efectiva de un segundo inhibidor en sujetos que tienen un número de copia genética incrementada o una alteración en expresión de mARN o sobreexpresión de proteina o fosforilación de la cinasa objetivo en las células de cáncer.
16. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el inhibidor de RAF es seleccionado del grupo que consiste de RAF265, sorafenib, SB590885, PLX 4720, PLX4032, GDC-0879 y ZM 336372.
17. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el inhibidor de EK es seleccionado del grupo que consiste de CI-1040/PD184352, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, 6-Metoxi-7- ( 3-raorfolin-4-il-propoxi ) -4 - ( -fenoxi-fenilamino) -quinolm-3-carbonitrilo y 4- [3-Cloro-4- ( 1-metil-lH-imidazol-2-ilsulfañil ) -fenilamino] -6-metoxi-7- (3-morfolin-4-il-propoxi ) -quinolin-3-carbonitrilo .
18. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el sujeto tiene resistencia innata al inhibidor de RAF o es probable de desarrollar resistencia al inhibidor de RAF.
19. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de melanoma, cáncer de pecho, canceres coloréeteles , glioma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, sarcoma y cáncer de tiroides .
20. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el cáncer es melanoma.
21. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el sujeto tiene resistencia innata al inhibidor de MEK o es probable de desarrollar resistencia al inhibidor de MEK
22. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el segundo inhibidor es un inhibidor de MAP3K8 (TPL2/C0T) .
23. Un método para identificar una cinasa objetivo que confiere resistencia a un primer inhibidor, el método esta caracterizado porque comprende: cultivar células que tienen sensibilidad al primer inhibidor; expresar una pluralidad de clones de ORF de cinasa en los cultivos celulares, cada cultivo celular expresa un clon de ORF de cinasa diferente; exponer cada cultivo celular al inhibidor; identificar cultivos celulares que tienen mayor viabilidad que un cultivo celular testigo después de la exposición al inhibidor para identificar uno o mas clones de ORF de cinasa que confieren resistencia al primer inhibidor.
24. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque las células cultivadas tienen sensibilidad al inhibidor de RAF.
25. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque las células cultivadas tienen sensibilidad al inhibidor de MEK.
26. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque las células cultivadas comprenden una mutación de B-RAF.
27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque las células cultivadas comprenden una mutación de B-RAFV600E.
28. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque las células cultivadas comprenden una linea celular de melanoma .
29. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque comprende proveer la pluralidad de clones de ORF cinasa en un vector lentiviral o un vector retroviral.
MX2012010420A 2010-03-09 2011-03-09 Metodo de diagnostico y tratamiento de cancer en pacientes que tienen o desarrollan resistencia a una primera terapia de cancer. MX343368B (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31219310P 2010-03-09 2010-03-09
US31251910P 2010-03-10 2010-03-10
US32602110P 2010-04-20 2010-04-20
US41556910P 2010-11-19 2010-11-19
PCT/US2011/027689 WO2011112678A1 (en) 2010-03-09 2011-03-09 Methods of diagnosing and treating cancer in patients having or developing resistance to a first cancer therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2012010420A true MX2012010420A (es) 2012-11-30
MX343368B MX343368B (es) 2016-11-01

Family

ID=43837946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012010420A MX343368B (es) 2010-03-09 2011-03-09 Metodo de diagnostico y tratamiento de cancer en pacientes que tienen o desarrollan resistencia a una primera terapia de cancer.

Country Status (12)

Country Link
US (3) US20130059851A1 (es)
EP (1) EP2545187B1 (es)
JP (1) JP5985401B2 (es)
KR (1) KR20120139767A (es)
CN (1) CN103038364A (es)
AU (1) AU2011224410B2 (es)
BR (1) BR112012022801B8 (es)
CA (1) CA2791247C (es)
EA (1) EA030276B1 (es)
ES (1) ES2714875T3 (es)
MX (1) MX343368B (es)
WO (1) WO2011112678A1 (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
AU2009296246B2 (en) 2008-09-26 2015-07-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
CN102971337B (zh) 2010-04-01 2016-09-21 昂考梅德药品有限公司 卷曲蛋白结合药剂及其应用
US20140296248A1 (en) * 2011-04-04 2014-10-02 Stichting het Nederlands Kanker Instiuut-Antoni van Leeuwenhoek ziekenhuis Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
EP2773777B1 (en) 2011-10-31 2020-05-13 University of Utah Research Foundation Genetic alterations in glioblastoma
EP2788378A4 (en) * 2011-12-09 2015-09-09 Oncomed Pharm Inc ASSOCIATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER
EA028135B1 (ru) 2012-03-28 2017-10-31 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Мутанты c-raf, придающие резистентность к ингибиторам raf
KR20150038068A (ko) 2012-08-17 2015-04-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 코비메티닙 및 베무라피닙을 투여함을 포함하는 흑색종의 조합 치료법
CA2887711A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2014150671A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Methods of identifying responses to map kinase inhibition therapy
WO2014204261A1 (ko) * 2013-06-21 2014-12-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 Tpl2의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 신세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20170242015A1 (en) * 2014-09-17 2017-08-24 Institut Curie Map3k8 as a marker for selecting a patient affected with an ovarian cancer for a treatment with a mek inhibitor
KR20160129609A (ko) 2015-04-30 2016-11-09 삼성전자주식회사 Ｂｒａｆ 저해제를 포함하는 세포 또는 개체의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도
EP3896064A1 (en) 2015-07-06 2021-10-20 Gilead Sciences, Inc. 4,6-diamino-quinoline-3-carbonitrile derivatives as cancer osaka thyroid (cot) modulators for treating crohn's disease and ulcerative colitis
EP3319955B1 (en) 2015-07-06 2020-11-25 Gilead Sciences, Inc. 6-amino-quinoline-3-carbonitrils as cot modulators
GB201520178D0 (en) * 2015-11-16 2015-12-30 Univ London Queen Mary Method
CN105695616A (zh) * 2016-04-22 2016-06-22 王冬国 诊断甲状腺癌的分析标志物及其应用
WO2018005435A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Gilead Sciences, Inc. 4,6-diaminoquinazolines as cot modulators and methods of use thereof
WO2018027223A1 (en) * 2016-08-05 2018-02-08 Duke University Camkk2 inhibitor compositions and methods of using the same
US20200087732A1 (en) * 2016-12-20 2020-03-19 Eth Zurich Identification of drugs targeting non-genetic drug tolerance programs in cancer
US10793901B2 (en) * 2016-12-28 2020-10-06 Roche Molecular Systems, Inc. Reversibly protected nucleotide reagents with high thermal stability
MX2019008458A (es) 2017-01-17 2019-12-02 Heparegenix Gmbh Inhibidores de proteina cinasa para promover la regeneracion hepatica o reducir o prevenir la muerte de hepatocitos.
CN111601615A (zh) * 2017-11-02 2020-08-28 乔治亚大学研究基金公司 与轮状病毒产量增加有关的方法和组合物
CN108872438B (zh) * 2018-08-06 2021-01-15 杭州迪相实业有限公司 一种外泌体中肺癌标志物gk5快速检测试剂盒
EP3876930A4 (en) * 2018-11-07 2022-07-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. BENZIMIDAZOLE DERIVATIVES AND AZA-BENZIMIDAZOLE DERIVATIVES AS JANUS KINASE 2 INHIBITORS AND THEIR USES
US20220313700A1 (en) * 2019-02-26 2022-10-06 Cell Response, Inc. Methods for treating map3k8 positive cancers
TWI770527B (zh) 2019-06-14 2022-07-11 美商基利科學股份有限公司 Cot 調節劑及其使用方法
CN110862968A (zh) * 2019-10-30 2020-03-06 中国农业科学院兰州兽医研究所 Map3k8基因敲除pk-15细胞系的构建方法及其应用
CA3175541A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of (s)-6-(((1-(bicyclo[1.1.1]pentan-1-yl)-1h-1,2,3-triazol-4-yl)2-methyl-1-oxo-1,2- dihydroisoquinolin-5-yl)methyl)))amino)8-chloro-(neopentylamino)quinoline-3-carb onitrile a cot inhibitor compound
AU2021245924B2 (en) 2020-04-02 2024-02-29 Gilead Sciences, Inc. Process for preparing a Cot inhibitor compound
WO2021226261A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1982001011A1 (en) 1980-09-24 1982-04-01 Corp Cetus Diagnostic method and probe
EP0084796B1 (en) 1982-01-22 1990-05-02 Cetus Corporation Hla typing method and cdna probes used therein
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
CA1338457C (en) 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
EP0266032A1 (en) 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
AT404556B (de) 1995-11-23 1998-12-28 Pharma Consult Gmbh Einrichtung zum dichten verschliessen eines glas- oder kunststoffbehälters zur aufnahme flüssiger pharmazeutischer produkte
GB2323845A (en) 1997-03-31 1998-10-07 Merck & Co Inc MEK inhibiting lactones
US6821963B2 (en) 1997-07-01 2004-11-23 Warner-Lambert Company 4-Bromo or 4-iodo phenylamino benzhydroxamic acid derivatives and their use as MEK inhibitors
ES2274572T3 (es) 1997-07-01 2007-05-16 Warner-Lambert Company Llc Derivados de acido 2-(4-bromo- o 4-yodo-fenilamino) benzoico y su uso como inhibidor de mek.
US6506798B1 (en) 1997-07-01 2003-01-14 Warner-Lambert Company 4-Arylamino, 4-aryloxy, and 4-arylthio diarylamines and derivatives thereof as selective MEK inhibitors
US6310060B1 (en) 1998-06-24 2001-10-30 Warner-Lambert Company 2-(4-bromo or 4-iodo phenylamino) benzoic acid derivatives and their use as MEK inhibitors
WO1999001426A1 (en) 1997-07-01 1999-01-14 Warner-Lambert Company 4-bromo or 4-iodo phenylamino benzhydroxamic acid derivatives and their use as mek inhibitors
GEP20043172B (en) 1998-12-22 2004-02-25 Warner Lambert Co Combination Chemotherapy
US20040171632A1 (en) 1998-12-22 2004-09-02 Gowan Richard Carleton Combination chemotherapy
CA2349832A1 (en) 1999-01-13 2000-07-20 Warner-Lambert Company Benzenesulfonamide derivatives and their use as mek inhibitors
JP2000204079A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Warner Lambert Co ジアリ―ルアミン
AU2482800A (en) 1999-01-13 2000-08-01 Warner-Lambert Company Sulphohydroxamic acids and sulphohydroxamates and their use as mek inhibitors
ATE302193T1 (de) 1999-01-13 2005-09-15 Warner Lambert Co Benzoheterozyklen und ihre verwendung als mek inhibitoren
CA2348236A1 (en) 1999-01-13 2000-07-20 Stephen Douglas Barrett 4-arylamino, 4-aryloxy, and 4-arylthio diarylamines and derivatives thereof as selective mek inhibitors
JP2000204075A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Warner Lambert Co ジアリ―ルアミン
JP2000212157A (ja) 1999-01-13 2000-08-02 Warner Lambert Co ジアリ―ルアミン
JP2000204077A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Warner Lambert Co ジアリ―ルアミン
CZ20012528A3 (cs) 1999-01-13 2002-06-12 Warner-Lambert Company 1-Heterocyklicky substituované diarylaminy, farmaceutické kompozice na jejich bázi a způsoby léčení
AU2001273498B2 (en) 2000-07-19 2006-08-24 Warner-Lambert Company Oxygenated esters of 4-iodo phenylamino benzhydroxamic acids
WO2003035626A2 (en) 2001-10-23 2003-05-01 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Azole derivatives and pharmaceutical compositions containing them
JP2005526008A (ja) 2001-12-04 2005-09-02 オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 癌を処置するためのｒａｆ−ｍｅｋ−ｅｒｋ経路インヒビター
WO2003047583A1 (en) 2001-12-05 2003-06-12 Astrazeneca Ab Pharmaceutical compositions comprising benzofuranyl substituted 3-cyanoquinoline derivatives and their use for the treatment of solid tumours
AU2002347360A1 (en) 2001-12-05 2003-06-17 Astrazeneca Ab Pharmaceutical compositions comprising benzofuranyl substituted 3-cyanoquinoline derivatives and their use for the treatment of solid tumours
DOP2003000556A (es) 2002-01-23 2003-10-31 Warner Lambert Co Esteres hidroxamato de acido n-(4-fenil-sustituido)-antranilico.
MXPA04005527A (es) 2002-01-23 2005-03-23 Warner Lambert Co ESTERES HIDROXIMATO DEL áCIDO N-(4-FENIL SUSTITUIDO)-ANTRANILICO.
UA76837C2 (uk) 2002-03-13 2006-09-15 Еррей Байофарма Інк. N3 алкіловані похідні бензімідазолу як інгібітори мек
US6989451B2 (en) 2002-06-04 2006-01-24 Valeant Research & Development Heterocyclic compounds and uses thereof
AU2003238871B2 (en) * 2002-06-05 2009-04-23 Cedars-Sinai Medical Center Method of treating cancer using kinase inhibitors
US7232826B2 (en) 2002-09-30 2007-06-19 Bristol-Myers Squibb Company Tyrosine kinase inhibitors
WO2004041185A2 (en) 2002-10-31 2004-05-21 University Of Rochester Hyfroxyflutamide induced pathways related to androgen receptor negative prostate cancer cells
GB0225579D0 (en) 2002-11-02 2002-12-11 Astrazeneca Ab Chemical compounds
AU2003291268A1 (en) 2002-11-12 2004-06-03 Mercury Therapeutics, Inc. Xanthene compounds for cancer chemotherapy
US20050004186A1 (en) 2002-12-20 2005-01-06 Pfizer Inc MEK inhibiting compounds
WO2004080464A1 (en) * 2003-03-11 2004-09-23 Novartis Ag Use of isoquinoline derivatives for treating cancer and map kinase related diseases
WO2005000818A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Warner-Lambert Company Llc 5-substituted-4-`(substituted phenyl)!amino!-2-pyridone deviatives for use as mek inhibitors
WO2005007616A1 (en) 2003-07-23 2005-01-27 Warner-Lambert Company Llc Diphenylamino ketone derivatives as mek inhibitors
US20050049276A1 (en) 2003-07-23 2005-03-03 Warner-Lambert Company, Llc Imidazopyridines and triazolopyridines
CA2532067C (en) 2003-07-24 2010-12-21 Stephen Douglas Barrett N-methyle-substituted benzamidazoles
US7538120B2 (en) 2003-09-03 2009-05-26 Array Biopharma Inc. Method of treating inflammatory diseases
US7144907B2 (en) 2003-09-03 2006-12-05 Array Biopharma Inc. Heterocyclic inhibitors of MEK and methods of use thereof
WO2005028426A1 (ja) 2003-09-19 2005-03-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 新規４−フェニルアミノ−ベンズアルドオキシム誘導体並びにそのmek阻害剤としての使用
EP1682126B1 (en) 2003-10-16 2009-07-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Substituted benzazoles and use thereof as inhibitors of raf kinase
US7732616B2 (en) 2003-11-19 2010-06-08 Array Biopharma Inc. Dihydropyridine and dihydropyridazine derivatives as inhibitors of MEK and methods of use thereof
US7517994B2 (en) 2003-11-19 2009-04-14 Array Biopharma Inc. Heterocyclic inhibitors of MEK and methods of use thereof
AU2004293019B2 (en) 2003-11-19 2010-10-28 Array Biopharma Inc. Bicyclic inhibitors of MEK and methods of use thereof
TW200529846A (en) 2004-02-20 2005-09-16 Wyeth Corp 3-quinolinecarbonitrile protein kinase inhibitors
BRPI0511967B8 (pt) 2004-06-11 2021-05-25 Japan Tobacco Inc derivados de 5-amino-2,4,7-trioxo-3,4,7,8-tetrahidro-2h-pirido[2,3-d] pirimidina, seu uso e composição farmacêutica que os compreende
US7378423B2 (en) 2004-06-11 2008-05-27 Japan Tobacco Inc. Pyrimidine compound and medical use thereof
MY144232A (en) 2004-07-26 2011-08-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 5-substituted-2-phenylamino benzamides as mek inhibitors
CN101006085A (zh) 2004-08-17 2007-07-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 取代的乙内酰脲类
MX2007001846A (es) 2004-08-17 2007-03-28 Hoffmann La Roche Hidantoinas sustituidas.
JP5275628B2 (ja) 2004-08-25 2013-08-28 ターゲジェン インコーポレーティッド 複素環式化合物および使用方法
CN101044125A (zh) 2004-08-25 2007-09-26 塔尔基公司 杂环化合物和应用方法
BRPI0514679A (pt) 2004-09-01 2008-06-17 Astrazeneca Ab composto, processo para preparar o mesmo, composição farmacêutica, uso de um composto, e, métodos para produzir um efeito inibitório de b-raf e um efeito anticáncer em um animal de sangue quente, e para tratar uma doença ou condição
JP2006083133A (ja) 2004-09-17 2006-03-30 Sankyo Co Ltd スルファミド誘導体医薬組成物
TW200621766A (en) 2004-09-17 2006-07-01 Hoffmann La Roche Substituted hydantoins
US7956191B2 (en) 2004-10-20 2011-06-07 Merck Serono Sa 3-arylamino pyridine derivatives
CA2587178A1 (en) 2004-11-24 2006-06-01 Laboratoires Serono S.A. Novel 4-arylamino pyridone derivatives as mek inhibitors for the treatment of hyperproliferative disorders
ATE443063T1 (de) 2004-12-01 2009-10-15 Merck Serono Sa Ä1,2,4ütriazoloä4,3-aüpyridin-derivative zur behandlung hyperproliferativer erkrankungen
US7429667B2 (en) 2005-01-20 2008-09-30 Ardea Biosciences, Inc. Phenylamino isothiazole carboxamidines as MEK inhibitors
TWI441637B (zh) 2005-05-18 2014-06-21 Array Biopharma Inc Ｍｅｋ雜環抑制劑及其使用方法
WO2006133417A1 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Valeant Pharmaceuticals International Phenylamino isothiazole carboxamidines as mek inhibitors
US8648116B2 (en) * 2005-07-21 2014-02-11 Ardea Biosciences, Inc. Derivatives of N-(arylamino) sulfonamides including polymorphs as inhibitors of MEK as well as compositions, methods of use and methods for preparing the same
US8101799B2 (en) 2005-07-21 2012-01-24 Ardea Biosciences Derivatives of N-(arylamino) sulfonamides as inhibitors of MEK
AU2006272837B2 (en) 2005-07-21 2012-08-23 Ardea Biosciences, Inc. N-(arylamino)-sulfonamide inhibitors of MEK
US20070049591A1 (en) 2005-08-25 2007-03-01 Kalypsys, Inc. Inhibitors of MAPK/Erk Kinase
EA019983B1 (ru) 2005-10-07 2014-07-30 Экселиксис, Инк. Ингибиторы mek и способы их применения
EP1966155A1 (en) 2005-12-21 2008-09-10 AstraZeneca AB Tosylate salt of 6- (4-br0m0-2-chl0r0phenylamin0) -7-fluoro-n- (2-hydroxyethoxy) -3-methyl-3h-benzimi dazole- 5 - carboxamide , mek inhibitor useful in the treatment of cancer
US7612212B2 (en) 2006-02-22 2009-11-03 Hoffmann-La Roche Inc. Substituted hydantoins
US20090163525A1 (en) 2006-04-05 2009-06-25 Astrazeneca Ab Substituted quinazolines with anti-cancer activity
WO2007121269A2 (en) 2006-04-11 2007-10-25 Ardea Biosciences, Inc. N-aryl-n'alkyl sulfamides as mek inhibitors
JP5269762B2 (ja) 2006-04-18 2013-08-21 アーディア・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド Ｍｅｋ阻害剤としてのピリドンスルホンアミドおよびピリドンスルファミド
US7772233B2 (en) 2006-04-19 2010-08-10 Merck Serono, S.A. Arylamino N-heteroaryl compounds as MEK inhibitors
EP2013180A1 (en) 2006-04-19 2009-01-14 Laboratoires Serono SA Novel heteroaryl-substituted arylaminopyridine derivatives as mek inhibitors
WO2008021389A2 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Exelixis, Inc. Using pi3k and mek modulators in treatments of cancer
WO2008020203A1 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Astrazeneca Ab Pyridinylquinaz0linamine derivatives and their use as b-raf inhibitors
US20080085886A1 (en) 2006-08-21 2008-04-10 Genentech, Inc. Aza-benzofuranyl compounds and methods of use
ES2528797T3 (es) 2006-08-21 2015-02-12 Genentech, Inc. Compuestos de aza-benzotiofenilo y métodos de uso
WO2008028141A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Array Biopharma Inc. Raf inhibitor compounds and methods of use thereof
US7943659B2 (en) 2006-10-31 2011-05-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited MAPK/ERK kinase inhibitors
JP5211063B2 (ja) 2006-11-30 2013-06-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド アザ−インドリル化合物及び使用方法
CA2671982C (en) 2006-12-14 2016-01-26 Exelixis, Inc. Methods of using mek inhibitors
WO2008120004A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Astrazeneca Ab Combination of a mek- inhibitor and a b-raf inhibitor for the treatment of cancer
WO2009002607A1 (en) * 2007-05-01 2008-12-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for identifying transforming and tumor suppressor genes
EP2370568B1 (en) * 2008-12-10 2017-07-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mek mutations conferring resistance to mek inhibitors
PL2488033T3 (pl) * 2009-10-16 2019-12-31 Novartis Ag Kombinacja zawierająca inhibitor MEK i inhibitor B-raf

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012022801A2 (pt) 2017-01-10
CA2791247C (en) 2019-05-14
JP5985401B2 (ja) 2016-09-06
EA201290883A1 (ru) 2013-04-30
KR20120139767A (ko) 2012-12-27
WO2011112678A1 (en) 2011-09-15
CA2791247A1 (en) 2011-09-15
JP2013526843A (ja) 2013-06-27
BR112012022801B8 (pt) 2019-10-29
EP2545187B1 (en) 2018-09-05
CN103038364A (zh) 2013-04-10
US20210404014A1 (en) 2021-12-30
BR112012022801B1 (pt) 2019-10-15
US20170268069A1 (en) 2017-09-21
US11078540B2 (en) 2021-08-03
EA030276B1 (ru) 2018-07-31
EP2545187A1 (en) 2013-01-16
AU2011224410B2 (en) 2015-05-28
AU2011224410A1 (en) 2012-09-20
US20130059851A1 (en) 2013-03-07
MX343368B (es) 2016-11-01
ES2714875T3 (es) 2019-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2012010420A (es) Metodo de diagnostico y tratamiento de cancer en pacientes que tienen o desarrollan resistencia a una primera terapia de cancer.
US20150141470A1 (en) Diagnostic and treatment methods in patients having or at risk of developing resistance to cancer therapy
Antony et al. C-RAF mutations confer resistance to RAF inhibitors
Francica et al. Functional radiogenetic profiling implicates ERCC6L2 in non-homologous end joining
US11788151B2 (en) C-RAF mutants that confer resistance to RAF inhibitors
Lin et al. EGF upregulates RFPL3 and hTERT via the MEK signaling pathway in non‑small cell lung cancer cells
US20230042367A1 (en) Methods and compositions for treating cancers having f-box and wd-repeat protein 7 (fbxw7) alterations and/or cyclin l1 (ccnl1) gain or amplification
Rammohan A Study on the Role of DYRK1A in Acute Lymphoblastic Leukemia
Weil et al. DDDR-27. CLASS I HDAC INHIBITOR AGAINST TM-MEDIATED NETWORK CONNECTIVITY IN GLIOBLASTOMA
Perez Understanding the Acquisition and Treatment of p53-Mutated Cancer Cells
Singh Novel role of the JAK-STAT pathway in mediating the effects of atypical antipsychotics on 5-HT2A receptor signaling
Song et al. CHIR-124
Perini Uptake/efflux molecular mechanisms responsible for bosutinib multidrug resistance
Black High Throughput Screening For Drug Discovery In Head And Neck Squamous Cell Carcinoma
강찬우 Anti-tumor activity and acquired resistance mechanism of dovitinib (TKI258) in RET rearranged lung adenocarcinoma
Dixit Interferon-γ modulates intestinal P-glycoprotein: Molecular mechanism and clinical implications

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration