JPH04503302A - ターゲット核酸増幅／検出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ターゲット核酸増幅／検出システム 国際特許出願公開第８７１０６２７０号および国際特許出願第ＵＳ８９１０１９ ６６号明細書（１９８９年１１月公開）を参照し、その記載全体をここに参考と して引用する。

発明の分野 本発明は一般に分子生物学および組み換えＤＮＡ技術の前進に関するものである 。

より詳細には、本発明は生物学的試料中のターゲットＲＮＡ種、および推論によ りそれらのＲＮＡ種がコードする対応ポリペプチドの存在を、インビトロまたは エクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）セツティングにおいて検出するための方法および 手段を目的とし、これにはアッセイ法、ならびに必要な試薬および手段を含む試 験キットが含まれる。

本発明は、生物学的試料中のターゲットＲＮＡの検出のための核酸プローブハイ ブリダイゼーションシステムに用いるために、ターゲット増幅の利点と、ＲＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼにより検出可能なリポータ−分子を酵素的に産生じて ＲＮＡターゲットのコピー（ターゲット配列を含み、このポリメラーゼにより自 触媒的に複製しうる）を生成することの利点を、新規な様式で組み合わせること を特色とする。

本発明が利用される用途には、要求されるターゲットＲＮＡを含有する体液およ び組織のインビトロまたはエクスビボ核酸プローブハイプリダイゼーシａンアッ セイにより、疾病または病的状態に特徴的なＲＮＡ配列を分析することが含まれ る。

発明の背景 核酸プローブ技術における目標は、生物学的試料中に存在するＲＮＡ、ＤＮＡま たは両者を含めた多種多様な他の核酸種と比較して、通常は核酸配列、いわゆる ターゲット核酸が少量存在する試料中において、それら種々の核酸を検出するこ とである。従って、疾病または病的状態に付随する可能性のあるポリペプチドを コードするＲＮＡ、たとえばヒト免疫不全ウィルスのゲノムのＲＮＡを検出しう ることが望ましい。これらのウィルスに付随するＲＮＡを検出するほか、たとえ ば疾病または病的状態に特徴的な他のＲＮＡ、たとえば血友病または鎌状赤血球 貧血の場合のように欠損遺伝子から転写されたものを検出することも望ましい。

特徴的に、これらの疾病または状態に付随するＲＮＡは、たとえ存在したとして も特定の生物学的試料、たとえば被験個体の血液試料または体液もしくは組織試 料中の総核酸と比較して、極めて少量存在する。

これらのＲＮＡ種の検出には、そのＲＮＡが存在する場合、試料中でそれに付随 する多種多様な他の核酸種のうちから検出および測定しうることが要求される。

これら非ターゲット核酸種は、少なくとも分離されたセグメント中ではターゲッ トＲＮＡと密接な相同性をもつ可能性がある。さらに上記のように、これらのタ ーゲットＲＮＡ種は試験される生物学的試料中に極めて少量見出されるにすぎな い場合がしばしばある。それにもかかわらず、内在する疾病状態の適切な診断の ためにはこのように少量のターゲットＲＮＡですら、存在する場合には検出可能 であることが必要である。

生物学的試料において極めて少量で、総核酸の副次画分として存在するにすぎな いターゲット核酸の信頼性のある検出を行うために、幾つかの方法が提示された 。１方法においては、試料中の核酸の量は変化させない。その代わりに、リポー タ−システムを採用し、これにより試料中のターゲット核酸分子それぞれにつき 多数の容易に検出しうる分子が産生され、この検出可能な分子の存在または量が 測定される。このようなリポータ−システムはターゲット核酸に付随するシグナ ル発生システムであり、試料中のターゲット核酸分子数を表す検出可能なシグナ ルを発生する。

基本的に異なる他の方法の場合、ターゲット核酸の一部であるがアッセイすべき 生物学的試料中の他の核酸の一部ではないターゲット核酸セグメント、またはそ のターゲットセグメントの相補体（すなわちターゲットセグメントと同一サイズ であるが、配列が相補的であるセグメント）、またはターゲットセグメントおよ びその相補体の双方のコピー数を選択的に増加させる。すなわち試料中において 、ターゲット核酸セグメントもしくはその相補体のコピー数、またはターゲット セグメントおよびその相補体の双方のコピー数が、他のいずれの核酸セグメント のコピー数より大幅に増加する。このコピー数の選択的増加は、当技術分野でセ グメントの′増幅′と呼ばれる。ターゲットセグメント（ここでは、また当技術 分野で、′ターゲット配列′とも呼ばれる）またはターゲットセグメントの相補 体が十分な程度に増幅されると、これは核酸プローブ技術の分野で核酸セグメン トの検出のために開発された多数の方法のいずれかによって信頼性をもって検出 しつる。これには、ターゲット核酸分子それぞれにつき多数の容易に検出しつる 分子の産生を伴う上記の第１法による方法も含まれる。

ターゲットセグメントの増幅のために開発された１方法は、いわゆる１ポリメラ 一ゼ連鎮反応’　（’　ＰＣＲ’　）法である。この方法はサイキ（Ｓａｉｋｉ ）ら。

５ｃｉｅｎｃｅ２３０．１３５０　（１９８５）　、ならびにムリスら、欧州特 許出願公開第２００３６２および２０１１８４号明細書（米国特許第４６８３１ ９５および４６８３２０２号明細書も参照されたい）に報告され、特に下記の反 復サイクルを伴う＝　（１）ターゲット核酸配列の３′−末端に第１プライマー を、ターゲット配列に相補的な配列の３′−末端に第２プライマーをハイブリダ イズし、（２）これらのプライマーをポリメラーゼにより延長し、そして（３） この連鎖延長反応により得られた二本鎖を一本鎖となす。このＰＣＲ法によりタ ーゲット配列およびその相補体がサイクル数に伴って指数的に増幅される（たと えば連鎖反応の場合のように）。

特定のＲＮＡは特定のポリメラーゼ、たとえば細菌ファージＲＮＡ依存性ＲＮＡ ポリメラーゼ、たとえばＱβレブリカーゼによる自触媒複製を受けやすいことが 知られている。これらのＲＮＡをこの場合′鋳型配列′をもつと言う。これはそ れらがポリメラーゼによる複製の鋳型となる配列を含むことを意味する。この方 法で鋳型ＲＮＡ　（すなわち′鋳型配列′を含むＲＮＡ）からレプリカーゼによ り触媒された反応において生成したＲＮＡも、複製可能なＲＮＡである（すなわ ち同様に′鋳型配列″を含む）。こうして自触媒複製においては、複製可能なＲ ＮＡの量は指数的に増加する。ミーμ（Ｍｉｅｌｅ）ら、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙエヱ１．２８１　（１９８３）を参照されたい。

最近まで、生物学的試料を特定の核酸配列の存在につき分析するための簡便な、 利用範囲の広い高感度リポータ−システムを得るために自触媒複製を利用しうろ ことは認識されていなかった。ターゲット配列に対するプローブがＱβレプリカ ーゼにより複製されるＲＮＡに結合したシステムは国際特許出願公開第８７１０ ６２７０号明細書およびチュ（Ｃｈｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ１４．５５９１　（１９８６）に記載されている。たとえばこの国 際特許出願公開明細書に記載された発明は、ＲＮＡ複製技術とオリゴヌクレオチ ドハイブリダイゼーションプローブ技術とを、ターゲットセグメントに会合する （プローブを通して）複製可能なＲＮＡの複製増幅によりターゲット核酸を検出 することによって結びつけたものである。

選ばれた形態としての本発明の目的は、ターゲットＲＮＡ配列の検出を容易にす るために増幅のための基本的ＲＮＡ複製法をさらに利用し、これにより必ずしも 温度サイクルを必要とすることなく指数的なコピー産生を達成することである。

ターゲットは試料中に存在する場合、増幅されたのちに初めて検出されるのであ るから、本発明の他の目的は、増幅された生成物中にターゲット配列が保持され るのを保証するために、偽陽性の存在を避けるかまたは少なくとも実質的に減少 させる方法を用いたＲＮＡ検出法を利用することである。本発明の他の目的は、 対応するターゲットＲＮＡを検出および測定するための手段として、複製法およ び延長生成物法の利点を組み合わせることである。

本発明の基本的目的は、プローブ配列、およびＲＮＡ鋳型指令によるプライマー 開始−ＲＮＡ鎖合成（ならびに自触媒複製の開始）に関してＲＮＡ依存性ＲＮＡ ポリメラーゼ（レプリカーゼ）により操作的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）認識 されるものである配列を保有する第１ヌクレオチド配列を、第２プローブ配列、 および同様にＲＮＡ鋳型指令によるプライマー開始−ＲＮＡ鎖合成（ならびに自 触媒複製の開始）に関してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより操作的に認識 されるものである配列を保有する第２の会合ヌクレオチド配列と組み合わせて使 用し、これにより第１配列の延長生成物が第２配列の延長生成物の産生のための 鋳型として用いられ、後者の延長生成物はそのままで、または鎖が脱会台した形 で、上記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの適宜な影響に際して複製されうるも のである。従って本発明は、ＲＮＡターゲット配列が被験試料中に存在した場合 にのみ報告し、その増幅成分が温度サイクルの必要なしに指数的に作動する増幅 ／検出システムに関する。従って本発明の好ましい目的は、意図する現存ターゲ ットＲＮＡ配列への最初のハイブリダイゼーションの実施により、存在するター ゲット核酸配列に対応する特定の延長生成物が産生され、これが後続生成物を誘 導し、これは複製により増幅されて複数のＲＮＡセグメントを生じやすく、これ らをたとえば真性ターゲット配列とのハイブリダイゼーションにより、および／ または所望によりそれらの検出、測定に寄与しつるシグナルグループ（すなわち それ自体検出可能な、または適切な化学反応により検出可能な分子になりつるり ポーターグループ）との会合により検出および測定することである。

従って本発明の全体的な目的は、当技術分野で枚挙されている目標に対処し、先 行技術者の試みが遭遇する欠点および問題に対処する選択的手段を提供すること である。本発明は、複製による増幅ののち、必要なターゲット核酸配列が被験試 料中に存在する場合にのみ存在するリポータ−分子を用いる。本発明は、核酸配 列を用い、これはハイブリダイゼーションポテンシャル、レプリカーゼにより触 媒される連鎖延長、最終的には自触媒複製による増幅に対して感受性である配列 のみを含み、それ以上は含まないことが必要である。従って本発明は、ターゲッ トＲＮＡ配列自体の存在にのみ応答するターゲット核酸配列検出法を提供する。

本発明はさらに、受容しつる程度の短期間で再現性をもって用いることかでき、 既知試薬の簡便さを利用し、かつ−貫した科学的結果に到達するのに必要な精度 を備えた直接的手法：再現性のあるアッセイセツティングに用いることができ、 実験室／臨床分析キット用に調整しうる手法を提供する。従って本発明の目的は 、インビトロまたはエクスビポシステムにおけるターゲット配列の存在に付随す る配列を増幅させることにより特定のＲＮＡ配列（ターゲットセグメント）の検 出性を高めることであり、その好ましい形態はレプリカーゼによる天然の連鎖延 長および複製プロセスを利用し、ターゲット核酸配列が存在した場合にのみ測定 可能であるという独自の特色をそなえている。

発明の要約 本発明は、下記よりなる第１ヌクレオチド配列を新規な様式で使用することに基 づ＜：（ｉ＞ターゲットＲＮＡ配列のセグメントとのハイブリダイゼーシヨンに 適したプローブ配列、および（ｉ　ｉ）該プローブ配列の５′−末端から５′一 方向に伸びた、レブリカーゼにより自触媒複製プロセスを開始しうる、かつこれ によりＲＮＡ鋳型指令−ＲＮＡプライマー開始一連鎖延長反応をも開始しつる配 列である第１配列。この第１配列はここでは第２ヌクレオチド配列との組み合わ せにおいて作動し、この第２ヌクレオチド配列は下記よりなる：　（ｉ）第１ヌ クレオチド配列のストランド分離した（ｓｔｒａｎｄ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ）延 長生成物に第１ヌクレオチド配列からの延長生成物の′反対側末端′　（より厳 密には、これはこの延長生成物のセグメントにおいて、第１ヌクレオチド配列の ３′−末端から３′−側を意味し、これは延長生成物の５′−末端にある）にお いてハイブリダイズするのに適した第２プローブ配列、および（ｉ　ｉ）第２プ ローブ配列の５′−末端から５′一方向に伸びた、同様にレプリカーゼにより自 触媒複製プロセスを開始しつる、かつこれによりＲＮＡ鋳型指令−ＲＮＡプライ マー開始一連鎖延長反応をも開始しうる配列である第２配列。ターゲット配列に つきアッセイすべき試料中にターゲット配列が存在した場合、第１配列がこれに ハイブリダイズしたのち、第１配列はレプリカーゼにより触媒された連鎖延長反 応において延長される。次いで延長生成物はターゲット配列を含むターゲット核 酸から分離され、このストランド分離された延長生成物に第２配列がハイブリダ イズし、レプリカーゼによる第２の連鎖延長反応において延長される。次いで第 ２延長の生成物は（そのまま、または必要に応じてストランド分離された形で） 本発明の増幅プロセスにおいてレブリカーゼの存在下に自触媒複製される。次い でこの増幅された複製物が、それ自体当業者に知られている多数の方法のいずれ かによって検出および測定される（たとえば国際特許出願公開第８７１０６２７ ０号明細書、参照）。

本発明のターゲット配列認識／増幅プロセス観点の実施に関する代表例について 、本明細書の第１図を参照されたい。

１形態においては、本発明は新規な共同機能性（ｃｏｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ） ヌクレオチド配列、それらの調製および使用、すなわち上記に述べた、がっ下記 に述べる第１および第２ヌクレオチド配列を目的とする。

他の形態においては、本発明は第１ヌクレオチド配列とターゲットまたは第２ヌ クレオチド配列延長生成物とのハイブリダイゼーションののち、このターゲット または第２ヌクレオチド配列延長生成物を鋳型として形成された第１ヌクレオチ ド配列延長生成物、および第２ヌクレオチド配列とストランド分離された第１延 長生成物の１本のストランド（第２ヌクレオチド配列がこれに第２プローブ配列 によってハイブリダイズしつる）とのハイブリダイゼーションののち形成された 第２ヌクレオチド配列延長生成物を目的とする。

ここで言う延長生成物は、適宜なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより触媒さ れ、ＮＴＰの存在下に行われる連鎖延長反応において形成される。好ましい形態 においては、これらの延長反応および自触媒復製プロセスは同一レプリカーゼ、 すなわちＱ−ベータレプリカーゼにより行われ、その場合この酵素により認識さ れる配列は第１ヌクレオチド配列の延長生成物にハイブリダイズした（たとえば ターゲット配列にハイブリダイズした）第２ヌクレオチド配列の延長生成物の一 部である。

レプリカーゼ認識配列を含む自触媒複製物はそれ自体既知の方法で、たとえば自 触媒複製の過程で取り込まれた、または検出可能な状態に標識された少な（とも ターゲット配列のサブ配列もしくはそのサブ配列の相補体を含むオリゴヌクレオ チドプローブとのハイブリダイゼーションにより取り込まれた、発色団部分また は放射性部分によって検出および測定される。

あらゆる観点において本発明は、相補的ＲＮＡ配列のハイブリダイゼーション、 レプリカーゼにより触媒されたＲＮＡ鋳型上におけるＲＮＡプライマーの連鎖延 長（たとえばブルナキス（Ｖｏｕｒｎａｋｉｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、７０．７７４　（１９７６）、参照）、組み換 えＲＮＡを含めた多数のＲＮＡの、レプリカーゼによる自触媒複製（たとえばミ ーレら、前掲、；米国特許第４．７８６，６００号明細書、参照）という自然の 原理を、核酸混合物を含有する生物学的試料中に存在する可能性のあるターゲッ トＲＮＡ配列またはターゲットＲＮＡを増幅して検出および測定可能なものにす るために新規に利用することを目的とする。

さらに本発明は、これらの原理に基づくアッセイシステムのための方法および手 段、ならびにターゲットＲＮＡ配列を検出または測定するためのアッセイ法に必 要な成分を含む、実験室用および臨床用セツティングを含めたキットを目的とす る。

従つて本発明は、核酸を含有する試料中の少なくとも１種類の特異的ＲＮＡター ゲットを検出するための方法を提供するものであって、該ＲＮＡターゲットはタ ーゲット配列を含み、本方法は複製可能な延長生成物（またはその相補体）を検 出することよりなり、該生成物はターゲットＲＮＡからストランド分離された第 １ＲＮＡ延長生成物とハイブリダイズした第２リボヌクレオチド（すなわちＲＮ Ａ）配列からの延長生成物であり、これはターゲット配列の３′−末端とハイブ リダイズした第１リボヌクレオチド配列からの第１延長生成物の合成のための鋳 型となる。本方法において第１リボヌクレオチド配列は下記よりなる：ターゲッ ト配列の３′−末端のサブ配列に相補的な第１プローブ配列、およびプローブ配 列の５′−末端リボヌクレオチドから５′側にあり、これと連続した（すなわち １個のホスフェートを通して結合している）第１複製開始配列であって（ａ）タ ーゲットＲＮＡ配列を鋳型として用いてプローブ配列の３′−末端からＲＮＡ合 成（すなわち連鎖延長）するプロセスの開始のためにレプリカーゼにより認識さ れ、かつ（ｂ）レブリカーゼにより自触媒複製されうるＲＮＡの５′−末端を含 む部分であるもの。さらに第２リボヌクレオチド配列は下記よりなる：　（１） ターゲット配列の５′−末端におけるサブ配列（この５′−サブ配列は、第１プ ローブ配列がその相補体である３′−サブ配列とオーバーラツプしない）と同一 の配列であり、従ってターゲットＲＮＡにハイブリダイズした第１リボヌクレオ チド配列からの延長生成物のサブ配列のものに対する相補体である配列であって 、このサブ配列の５′−末端は該延長生成物中の第１ヌクレオチド配列の３′− 末端から３′側にある；および（２）第２プローブ配列から５′側にあり、これ と連続した第２複製開始配列であって（ａ）ターゲットＲＮＡ配列の相補体を鋳 型として用いて第２プローブ配列の３′−末端からＲＮＡ合成（すなわち連鎖延 長）するプロセスの開始のためにレブリカーゼにより認識され、カリ（ｂ）レプ リカーゼにより自触媒複製されうるＲＮＡの５′−末端を含む部分であり、ただ しその３′−末端において１個のホスフェートを通して第１複製開始配列の相補 体の５′−末端に結合している第２複製開始配列からなるＲＮＡはレプリカーゼ により自触媒複製可能であり、さらにこの自触媒複製可能なＲＮＡがら、第２複 製開始配列の３′−末端と第１複製開始配列の相補体の５′−末端との間にＲＮ Ａセグメントを挿入することにより形成されたＲＮＡもレプリカーゼにより自触 媒複製可能である。第２ヌクレオチドの複製可能な延長生成物は、レプリカーゼ により触媒された自触媒複製によって、ターゲット配列を増幅する機能をもつ。

第２ヌクレオチド配列の複製可能な延長生成物および該延長生成物の相補体は、 自触媒複製可能であることにより、ターゲット配列および付随するターゲットＲ ＮＡに対するリポータ−分子としても作用する。

本発明は複製（すなわち自触媒複製）の使用を有利に組み合わせたものであり、 従ってＰＣＲなどの方法に必要な温度サイクル無しで、複製核酸を選択的かつ指 数的に成長させることができ、この複製可能な生成物中にターゲットＲＮＡ配列 が含まれ、これによりターゲット分子それぞれに対するリポータ−分子数のみで なく、ターゲット配列も増幅される。また本発明は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ ラーゼ、たとえばＱ−ベータレプリカーゼが、ＲＮＡを鋳型として用いてプライ マーからＲＮＡを合成しかっＲＮＡを自触媒複製する両方の機能をもっことを有 利に利用し、これにより単一の酵素を用いてターゲットの増幅およびリポータ− 分子の生成を行うものである。

本発明の形態はさらに、自触媒複製による生成物を検出し、その量を測定し、こ れにより分析される試料中に存在するターゲットＲＮＡの量をも判定するための 手段である。

１観点において本発明は、核酸を含有する試料中の少なくとも１種類の特異的Ｒ ＮＡターゲット配列を検出するために有用な、下記を含む方法を目的とする：該 ターゲットＲＮＡ配列と、プローブ配列（配列が該ターゲット配列のセグメント に対応する）および機能的長さの配列（これは適宜なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ ラーゼと会合した際に複製されうるものの相補体である）からなるヌクレオチド 配列とを、適切な条件下でハイブリダイズし、このハイブリダイズしたヌクレオ チド配列を連鎖延長し、延長生成物をストランド分離し、 前工程で分離された複製可能なものの相補体である配列を含むストランドと、第 ２ヌクレオチド配列（上記の分離されたストランドとターゲット配列の相補体で ある配列の反対側末端においてハイブリダイズしうる配列、および適宜なＲＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼと会合した際に複製されつるものの相補体である機能 的長さの配列からなる）とをハイブリダイズし、このハイブリダイズした第２ヌ クレオチド配列を連鎖延長し、前工程の第２延長生成物を、所望によりストラン ド分離後に、適宜なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとの接触により操作的に複 製させ、そして複製物を検出する。

本発明の使用形態は、上記の複製物をたとえばそれ自体既知の放射性もしくは発 色団標識またはハイブリダイゼーション技術により検出することである。

本発明は、ターゲット配列が遺伝性または病原性の疾病または状態の特性を伴う ものである試料、特にターゲットＲＮＡ配列がヒトウィルスＲＮＡのセグメント または欠損遺伝子の転写体もしくは正常な遺伝子の欠損転写体であるものにおけ るＲＮＡターゲット配列の検出を包含する。

遺伝子欠損の直接的結果であるか、または特定の対立遺伝子の存在と相関するヒ トの疾病は多数ある。たとえば本明細書に記載する方法は、ごく少量の核酸試料 中に特定のターゲットが存在するか否かを判定するために用いることができる。

これは、対応するｍＲＮＡの検出により遺伝的障害を診断する際、またはウィル ス感染、たとえばＨＩＶ−１の存在を検査する際に有用であろう。

本発明は、連鎖延長および複製の両方を行いうる適宜なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼ（レプリカーゼ）酵素の使用を包含する。好ましい形態においては、Ｑ −ベータポリメーゼ酵素を用いて好都合な、いわゆるシングルポット反応におい て両機能を達成する。

本発明は、核酸を含有する試料中の少なくとも１種類の特異的ＲＮＡターゲット 配列を本発明に従うターゲットＲＮＡ配列増幅ののち検出するのに有用なアッセ イシステム、およびそれを実施するキットをも目的とする。キットはレプリカー ゼ、前記に従って増幅を行うための第１ヌクレオチド配列、前記に従って増幅を 行うための第２ヌクレオチド配列、および増幅された生成物を検出するために、 またはそれに検出性を付与するために必要な組成物を含む。

第１図は本発明の１観点、すなわちそれの一本鎮または二本鎖ＲＮＡを増幅用鋳 型として用いたターゲット増幅における工程を模式的に表す。延長および増幅は 、たとえばＱ−ベータポリメラーゼ（レプリカーゼ）を用いて行われる。Ｔ（タ ーゲット）はセグメント状でＴＬＴＭＴ−再表示される。配列ＱＬＴＬおよびＴ 、′Ｑ択′は分子クローニングおよび後続のインビトロ転写により得られる。自 触媒複製による増幅に必要な鋳型は図示されるようにハイブリダイゼーション、 延長、再ハイブリダイゼーションおよび再延長により得られる。Ｑ−配列が連鎖 延長および複製の開始のためのＱ−ベータ配列である場合、Ｑ−ベータポリメー ゼが連鎖延長し、次いで複製する。

２、−膜性および定義 本発明の基本技術、たとえば下記を実施するための定義および方法ならびに手段 を含む標準的な分子生物学のテキストブックが参照される：ＲＮＡプローブまた はプライマーの調製、これは発現ベクターにおけるコーディングＤＮＡの転写、 およびそのままで、もしくは他のＲＮＡに結合した状態で本発明におけるプロー ブ用として適切なものにそれらを適合させること（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）を含む ： ハイブリダイゼーションに用いるための異なる機能性配列を含むヌクレオチドの 調製； ハイブリダイゼーションの方法、これはターゲットＲＮＡ配列に対するプライマ ーの相同性の程度に応じてハイブリダイゼーションの確実性を増減させるために ストリンジエンシー条件を変化させることを含む：連鎖延長反応を行うことがで き、かつ前記の複製可能な配列を認識しうるＲＮＡポリメラーゼの同定、分離ま たは調製；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＮＴＰの使用を含めた、延長 反応の開始および維持を助成する条件： 自触媒（ここでは時に′誘導された′と称する）複製の機構および方法；その他 。

たとえばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ ｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、＝＋−ルド・スプリング＋＋ハ ーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク（１９８２）、およびコロウィック（Ｃｏ １文献を参照されたい。

上記刊行物はすべてこの参照によりここに正確に引用される。

本明細書において′プローブ′という語は、ターゲット配列と十分な相同性をも ち、従って適切なハイブリダイゼーション条件下でターゲット配列とハイブリダ イズしうる、すなわち結合しうるＲＮＡ配列を意味する。一般的なプローブは少 なくとも約１０ヌクレオチドの長さであり、極めて好ましくは２５ヌクレオチド 塩基以上の長さであり、その極めて好ましい形態においてはそれはターゲット配 列との同一性または極めて高い相同性を有する。たとえば欧州特許出願公開第１ ２８０４２号明細書（１９８４年１２月１２日公開）を参照されたい。

検出シグナル、たとえば放射性標識または色原感受性酵素を用いた色原性手段に よるものを形成する方法も、当技術分野で周知であり、立証されている。

本発明のアッセイ法を実施する試料は、生物学的材料の原検体、たとえば血清そ の他の体液、組織培養用培地または食品材料であってもよい。より一般的には本 方法は、たとえばアフィニティー分子の非特異的結合を生じることによりターゲ ットの検出を妨害すると思われる物質を除去するための各種処理によって原検体 から誘導された処理検体である試料について実施される。本発明のアッセイ法に いっそう適した試料を得るために尿試料を処理する方法は、当技術分野において 周知である。

ここでバクテリオファージＱβという表現は、その特定の変異体もしくは突然変 異体または集団に限定されない。この表現は特に限定しない限り、バクテリオフ ァージＱβ感染に対し感受性の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）がそれに感染した際に、 ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはレプリカーゼとして作用するいずれか のポリメラーゼ、およびそれに付随する核酸基質を産生させうる、いずれかの変 異体もしくは突然変異体または集団に対するものである。

その感染に対し感受性の細菌がそれに感染した際に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ ラーゼ、およびそれに付随する、インビトロで自触媒複製されうる複製可能なＲ ＮＡを産生ずる他のファージであって、本発明に使用しうるものについては、た とえばミャケ（Ｍｉｙａｋｅ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（Ｕ、Ｓ、、Ａ、）　６８．２０２２　（１９７１）を参照されたい。

複製プロセスから得られたＲＮＡを、複製可能なＲＮＡの３′−末端が蛍光性と なるように修飾されたヌクレオチドを付加するＴ４　ＲＮＡリガーゼ触媒反応に より、蛍光性となすことができる。クロスティック（Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ）ら。

することができる。

複製ＲＮＡを検出するために採用しうるさらに他の方法には、複製が行われる系 に、または複製ＲＮＡがその上に分離している媒体（たとえば正に帯電した支持 体、たとえばエクテオーラ（ＥＣＴＥＯＬＡ）紙）に、核酸と特異的に結合する リポータ−物質を添加し１、このリポータ−物質からのシグナルを測定する方法 が含まれる。これらの物質には下記のものが含まれる：色原性色素、たとえば′ ステインズオール′　（ダールバーグ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ ｇｍａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７，６５９　（１９６ｇ）、および 銀エチジウム（シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２． ３０５５　（１９７３）；ベイシー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ。

７０．７５　（１９７６）；Ｑβレプリカーゼによる複製のための鋳型であるＲ ＮＡに特異的に結合する蛍光原化合物−一たとえばＱβレプリカーゼのウィルス 系サブユニットに結合したフィコビリプロティン（オイ（Ｏｌ）ら、Ｊ、Ｃｅ１ ｌＢｉｏ１．９３．９８１　（１９８２）；ストライエルら、米国特許第４．　 ５２０゜１１０号明細書）。

レプリカーゼの濃度が鋳型ＲＮＡの濃度より高い状態に維持され、リボヌクレオ シド−５′−トリホスフェート濃度が制限とならない限り、鋳型ＲＮＡの濃度は レプリカーゼ触媒によるＲＮＡ複製に際して時間と共に指数的に上昇するであろ う。鋳型ＲＮＡ濃度がレプリカーゼ濃度と等しくなるか、またはそれを越えたの ちは、リボヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が制限とならない限り、 鋳型ＲＮＡの濃度は時間と共に直線的に上昇するであろう。たとえばクレイマー ら（（１９７４）、前掲）を参照されたい。

レプリカーゼ触媒による複製の条件下で、そこに例示されたＭＤＶ−１は鋳型濃 度が酵素濃度を越えるまで３６秒毎に２倍濃度となることが見出された。　。

レプリカーゼ触媒による複製反応系において一定の反応時間後の鋳型ＲＮＡの濃 度は、鋳型ＲＮＡの初期濃度に関係があるであろう。複製反応に際して常にレプ リカーゼの濃度が鋳型濃度を越える（かつリボヌクレオシド−５′−トリホスフ ェート濃度が制限とならない）場合、反応終結時の鋳型ＲＮＡの濃度のｌｏｇは 鋳型の初期濃度（反応開始時）のｌｏｇに正比例するであろう。レプリカーゼ濃 度が鋳型濃度を下回ったのちは、リボヌクレオシド−５′−トリホスフエート濃 度が制限とならない限り、反応終結時の鋳型の濃度は鋳型の初期濃度のｌｏｇに 正比例する。さらに、鋳型濃度がレプリカーゼ濃度と等しくなる時点に反応が達 するのに必要な時間は、鋳型の初期濃度のマイナスｌｏｇに正比例する。

複製反応を長時間進行させるほど、より高い感度が達成される。

本発明によるアッセイに際しては、ターゲットにつき検査される試料および対照 試料の両試料について、可能な限り同じ条件下で同時にアッセイを行う。当技術 分野で理解されているように、対照試料は被験試料と同様であるが、ターゲット を含有しないかまたは既知量のターゲットを含有することが知られている。ター ゲットを含有しない対照は′バックグラウンド′を確立し、これより下ではター ゲットを含有する試料を含有しない試料と区別することは不可能である。被験試 料のアッセイに際して産生される複製された複製可能なＲＮＡの量または濃度を 、同時にアッセイされた対照試料につき産生された量または濃度と比較すること により、被験試料中のバックグラウンドを越える水準のターゲットの存在を判定 することができる。既知濃度範囲のターゲットを含有する対照試料を用いる場合 、被験試料中のターゲットの濃度を推定することができる。

同様に、本発明のＲＮＡ生成物の複製の（自触媒）誘導のために″レプリカーゼ ′を用いることは当技術分野で知られている。本発明に有用なこれらのレプリカ ーゼの適切な例には、特定のＲＮＡ転写体の３′−末端における特定の核酸配列 部位を認識する、いわゆるＱβウィルス系レしリカーゼが含まれる。これらのレ プリカーゼはＲＮＡ転写体および相補体を複製しくｒｅｐｌｉｃａｔｅ、ｒｅｐ ｒｏｄｕｃｅＬこれによりそれらのコピーを増加させる作用をもつ。これらの酵 素が転写過程で反応座に存在すると、転写中に産生された多数の転写体自身が複 製され、従ってＲＮＡ転写体生成物の量が指数的に増加することが予測される。

以下の実施例は本発明のモデルシステムを説明するものである：４、実施例 例示したのは、Ｑ−ベータポリメラーゼ、およびこのポリメラーゼにより複製可 能なＲＮＡ基質をこのＲＮＡ基質に含まれるターゲットＲＮＡ配列の増幅のため に使用することである。Ｑ−ベータレプリカーゼは、ＲＮＡ基質の３′−末端の 特徴的構造要素を認識し、次いでこの基質の相補的コピーを産生するＲＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼである。相補的コピーもその３′−末端に必要な構造要素 を含む場合、Ｑ〜ベータレプリカーゼにより認識およびコピーされ、基質配列を 指数的に増幅する自触媒反応サイクルを生じる。

Ｑ−ベータレプリカーゼはその正常な開始特異性を避けて、適切なオリゴヌクレ オチドブライマーの３′−末端から相補的合成を延長しうる（フエリックス（Ｆ ｅｌｉｘ、Ｇ、）およびヘイク（Ｈｅｋｅ、Ｈ，）、Ｂ４ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、６５．５０３−５０９．１９７５）ｏこの反応によ り主として部分長さのｃＲＮＡ、およびかなりの量の非特異的ＲＮＡが生成しく ブルナキス（Ｖｏｕｒｎａｋｉｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ ｓ。

Ｃｏｍｍ、７０．７７４−７８２．１９７６Ｌ従って複製に不適当である。しか しこれは約２０−１００ヌクレオチドの短いターゲット領域を通してＲＮＡプラ イマーを延長するためには使用しつる。

プライマーの調製 ２種類のＲＮＡプライマーは、適切に構成された組み換えＤＮＡのインビトロ転 写により調製される。第１プライマーはＱ−ベータＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡのマイナ ス鎮の最初の１５７ヌクレオチド（５′−末端に）、続いて目的部位（すなわち ターゲット配列）の３′−末端から５′−側に（すなわちその″すぐ下流に′） 伸びる領域にわたって、ターゲットＲＮＡに相補的な１０−５０ヌクレオチドを ヌクレオチド（５′　−末端に）、続いて目的部位（すなわちターゲット配列） の５′−末端から３′−側に（すなわちその′すぐ下流に′）伸びる領域にわた ってターゲットＲＮＡに等しい１０−５０ヌクレオチドを含む。

ハイブリダイゼーションおよびプライマーの延長検出のためのターゲットとなり うる適切なＲＮＡ転写体を調製するために、対照鋳型ＤＮＡ、たとえば９丁７− ０（ニー・ニス・バイオケミカル）を使用する。

ｌｆｇ、１０ｆｇ、１１００ｆ、ｌｐｇ、１０ｐｇまたはｉｏｏｐｇのＲＮ、Ａ 転写体（ＩＦ’ｆｍｏｌ−１０−３μｍｏ＋）を５０μ＋容量に希釈して、１０ ０ｍＭトリスＨＣ］　（ｐＨ７，５）、２２ｍＭ　ＭｇＣＬ、２ｍＭ　ＮａｘＥ ＤＴ、Ａ。

４種類のＮＴＰ　（それぞれ）１ｍＭを含有する最終溶液を得る。この溶液に２ 種類のＲＮＡプライマーそれぞれ２ｎｇ　（約１ｒ＋Ｍ）を含有する２５μｌ容 量を添加する。混合物を７０℃に１分間加熱し、次いで氷で急冷する。Ｑ−ベー タレブリカーゼ２μｇを含有する２５μｍ容量を添加し、混合物を３７℃で１０ 分間インキュベートする。混合物を再び７０℃に１分間加熱し、次いで水で急冷 する。

Ｑ−ベータレブリカーゼ２μｇを含有する第２の２５μｍ容量を添加し、混合物 を再び３７℃で１０分間インキュベートする。

ターゲットＲＮＡの増幅 第２プライマー−延長生成物を所望により７０℃に１分間加熱し、次いで氷で急 冷することにより鋳型から解放する。この工程を含める場合、５ＱｍＭ）リスＨ ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１１ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、４種 類のＮＴＰ　（それぞれ）０．５ｍＭを含有する溶液中にＱ−ベータレプリカー ゼ２μｇを含有する第３の２５μｍ容量を添加しなければならない。いずれの場 合も、次いで３７℃で２０分間インキュベートすることによりターゲットの増幅 が自触媒的に進行する。次いで得られた混合物を、目的のターゲット配列の対応 する挿入配列を含むＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡの産生につきアッセイすることができる 。

複製されたＲＮＡの検出 ＲＮＡの量はその固有ＵＶ吸収により測定される（たとえばクタテラズ（Ｋｕｔ ａｔｅｌａｄｚｅ）　ら、Ａｎａｌ、Ｂｊｏｃｈｅｍ、ユ」と０．　１２９　（ １９７９）の接触フォトプリンティング法による）。あるいはＲＮＡをエテオラ 紙上で視覚化する。アリコート（等容量）の複製反応物を１３．４８または９６ −フィンガーアリコツター（ａｌｉｑｕｏｔｔｅｒ）によりジエチルアミノエチ ルセルロース紙のシートに移す。次いでこれらのシートを室温で２００ｍＭ　Ｎ ａＣ＋、３００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６の溶液中において洗浄し、ＲＮＡ に取り込まれなかったりポヌクレオシドトリホスフェートを除去する。次いでシ ートを０゜３μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色する（シャープ（Ｓｈａｒｐ） ら、旦土旦Ｃｂｅｍｉｓｔｒｙ　１２．３０５５　（１９７３））：ベイリー（ Ｂａｉｌｅｙ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７０．７５　（１９７６）。

最後に個々のプロットからの蛍光を数種の既知方法のいずれかにより測定する。

対照プロットを上回る染色プロットからの蛍光強度はターゲットの存在を指示す る。臭化エチジウムの代わりに他の染色用物質を用いることもできる。これらに はメチレンブルー（ディングマンおよびピーコック（Ｄｉｎｇｍａｎ、Ｐｅａｃ ｏｃｋ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ヱ、６５９　（１９６８）　、銀染色（ サモンズ（Ｓａｍｍｏｎｓ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２，１３５ 　（１９８１）フィコビリプロティン−Ｑβレプリカーゼーコンジュゲート（オ イ（Ｏｌ）ら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９３，９８１　（１９８２）が含まれ る。

以上の記載は本発明を実施するために用いられる方法をより詳細に説明するもの であり、考慮される最良の形態を示す。本文において詳述したが、これは本発明 の全体的範囲を限定するものではなく：むしろ本発明の範囲は適切な請求の範囲 の記載のみによって支配されると解すべきである。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　３年　６月　を日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．共同機能性ヌクレオチド配列である、下記よりなる第１ヌクレオチド配列： （１）ターゲットＲＮＡ配列を含有する試料中の該配列にハイブリダイズしうる 第１プローブ配列、および （２）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる配列の相補体である 配列； 下記よりなる第２ヌクレオチド配列： （１）第１ヌクレオチド配列のストランド分離した延長生成物に、第１ヌクレオ チド配列の反対側末端においてハイブリダイズしうる第２プローブ配列、および （２）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる配列の相補体である 配列。 ２．ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＱ−ベータレプリカーゼである、請求の 範囲第１項に記載のヌクレオチド配列。 ３．ターゲット配列がヒト免疫不全ウイルスに対応するＲＮＡセグメントである 、請求の範囲第１項または第２項に記載のヌクレオチド配列。 ４．ターゲット配列が欠損遺伝子の転写体または正常遺伝子の欠損転写体である 、請求の範囲第１項または第２項に記載のヌクレオチド配列。 ５．ターゲット配列とハイブリダイズしたのちの、請求の範囲第１項に記載の第 １ヌクレオチド配列の延長生成物。 ６．第１延長生成物の分離したストランド（第１ヌクレオチド配列に対応する配 列を保有する）とハイブリダイズしたのちの、請求の範囲第１項に記載の第２ヌ クレオチド配列の延長生成物。 ７．核酸を含有する試料中の少なくとも１種類の特異的ＲＮＡターゲット配列を 検出するために有用な方法において、複製可能な延長生成物を検出することを含 み、該生成物は第１延長生成物から分離したストランド（これはターゲットＲＮ Ａ配列とハイブリダイズしうる第１ヌクレオチド配列の配列を含む）とハイブリ ダイズした第２ヌクレオチド配列からの延長生成物であり、この複製可能な延長 生成物は該ターゲットに対するリポーター分子として機能し、上記の第１ヌクレ オチド配列は、該ターゲット配列に相補的なプローブ配列、および複製プロセス を開始しうる配列の相補体である配列からなり、上記の第２ヌクレオチド配列は 、第１延長生成物から分離したストランド（第１ヌクレオチド配列の配列を保有 する）の反対側末端に相補的なプローブ配列を含み、従って第２ヌクレオチド配 列の延長生成物は複製に際して鋳型として作用するものである方法。 ８．複製可能な生成物の検出に際して、該生成物を多数複製させることによる工 程をさらに含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．複製が、複製可能な生成物をレプリカーゼ酸素と接触させることにより行わ れる、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．レプリカーゼ酸素がＱ−ベータレプリカーゼである、請求の範囲第９項に 記載の方法。 １１．核酸を含有する試料中の少なくとも１種類の特異的ＲＮＡターゲット配列 を検出するために有用な、下記を含む方法：該ターゲットＲＮＡ配列と、プロー ブ配列（配列が該ターゲット配列のセグメントに対応する）および機能的長さの 配列（これは適宜なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと会合した際に複製されう るものの相補体である）からなるヌクレオチド配列とを、適切な条件下でハイブ リダイズし、このハイブリダイズしたヌクレオチド配列を連鎖延長し、延長生成 物をストランド分離し、 前工程で分離された、複製可能なものの相補体である配列を含むストランドと、 第２ヌクレオチド配列（上記の分離されたストランドとターゲット配列の相補体 である配列の反対側末端においてハイブリダイズしうる配列、および適宜なＲＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼと会合した際に複製されうるものの相補体である機 能的長さの配列からなる）とをハイブリダイズし、このハイブリダイズした第２ ヌクレオチド配列を連鎖延長し、前工程の第２延長生成物を、所望によりストラ ンド分離後に、適宜なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとの接触により操作的に 複製させ、そして複製物を検出する。 １２．レプリカーゼ酸素がＱ−ベータレプリカーゼである、請求の範囲第１１項 に記載の方法。 １３．検出された生成物が、核酸試料中に含有されるターゲット配列の量を測定 するために標準化された様式で測定される、請求の範囲第１１項または第１２項 に記載の方法。 １４．ターゲット配列が、遺伝性または病原性の疾病または状態の特性に付随す る核酸配列内に位置する、請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項に記載 の方法。 １５．核酸配列がヒト免疫不全ウイルスに対応するＲＮＡセグメントである、請 求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．核酸配列が欠損遺伝子の転写体または正常遺伝子の欠損転写体である、請 求の範囲第１４項に記載の方法。 １７．検出される生成物が検出前に標識される、請求の範囲第１１項または第１ ２項に記載の方法。 １８．生成物が放射性標識される、請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９．生成物が発色団標識される、請求の範囲第１７項に記載の方法。 ２０．複製物と、ターゲット配列の真正な、所望により標識された配列とのハイ ブリダイゼーションにより検出が行われる、請求の範囲第１１項ないし第１６項 のいずれかに記載の方法。 ２１．核酸を含有する試料中の少なくとも１種類の特異的ＲＮＡターゲット配列 を検出するために有用なキットにおいて、複製可能な延長生成物を検出すること を含み、該生成物は第１延長生成物から分離したストランド（これはターゲット ＲＮＡ配列とハイブリダイズしうる第１ヌクレオチド配列の配列を含む）とハイ ブリダイズした第２ヌクレオチド配列からの延長生成物であり、この複製可能な 延長生成物は該ターゲットに対するリポーター分子として機能し、上記の第１ヌ クレオチド配列は、該ターゲット配列に相補的なプローブ配列、および複製プロ セスを開始しうる配列の相補体である配列からなり、上記の第２ヌクレオチド配 列は、第１延長生成物から分離したストランド（第１ヌクレオチド配列の配列を 保有する）の反対側末端に相補的なプローブ配列を含み、従って第２ヌクレオチ ド配列の延長生成物は複製に際して鋳型として作用するものであり、かつ上記ヌ クレオチド配列をハイブリダイズする手段、ならびにこれらのハイブリダイズし たヌクレオチド配列を連鎖延長する手段、ならびにこれらの延長生成物を複製に より増幅する手段、ならびにこれによる複製物および推論により該ターゲット配 列を検出し、所望により測定する手段を含むキット。