KR100454434B1

KR100454434B1 - 핵산단편 및 이것을 이용한 폴리하이드록시알카노에이트 합성능을 지닌 유전자의 검출방법

Info

Publication number: KR100454434B1
Application number: KR10-2001-0016696A
Authority: KR
Inventors: 야노테츠야; 이마무라타케시; 스다사카에; 혼마츠토무
Original assignee: 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2004-10-26
Also published as: US20020197607A1; DE60140229D1; KR20010095120A; EP1138785B1; ATE446379T1; EP1138785A2; EP1138785A3; US20030170716A1; EP1138785B8; JP2001275677A

Abstract

본 발명에 의하면, 신속, 간이하고, 특이적으로, 또한, 감도좋게 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)합성미생물의 존재 및 우선도를 검출하는 수단이 제공된다. 또, PHA합성효소유전자검출용의 프로브 혹은 프라이머로서, 서열번호: 1 내지 9에 표시된 염기서열 또는 그 상보적 염기서열에 의거해서, 적어도 그 부분서열을 포함하는 핵산단편을 이용함으로써, 목적으로 하는 PHA합성효소유전자를 지닌 PHA합성미생물을 검출하는 방법이 제공된다.

Description

핵산단편 및 이것을 이용한 폴리하이드록시알카노에이트합성능을 지닌 유전자의 검출방법{NUCLEIC ACID FRAGMENT AND METHOD OF DETECTING GENE HAVING POLYHYDROXYALKANOATE SYNTHESIZING ABILITY BY USING THE SAME}

본 발명은, 폴리하이드록시알카노에이트와 하이브리다이징(hybridizing)가능한 핵산단편, 미생물유래의 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)합성효소유전자 DNA, 이 핵산단편을 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)로서 이용해서, 미생물유래의 PHA합성효소유전자 DNA를 검출하는 방법, 혹은, PHA합성효소유전자 DNA의 염기서열을 결정하는 방법, 및 상기 미생물유래 PHA합성효소유전자 DNA의 검출에 의해 PHA합성능을 지닌 미생물의 검출 또는 스크리닝(선별)을 행하는 방법에 관한 것이다.

이제까지, 폴리-3-하이드록시부티르산(PHB) 또는 기타의 PHA를 생산하여, 균체내에 축적하는 PHA합성능을 지닌 미생물에 대해 많은 보고가 행해져 있다("생분해성 플라스틱핸드북", 생분해성 플라스틱연구회편, (주)엔·티·에스발행, p178-197). PHA와 같은 이들 미생물생산 폴리머는, 종래의 화학합성플라스틱과 마찬가지로, 용융가공 등에 의해 각종 제품의 생산에 이용할 수 있다. 또, PHA와 같은 이들 미생물생산 폴리머는, 생분해성이기 때문에, 자연계에서 미생물에 의해 완전분해된다고 하는 이점을 가지고 있다. 따라서, 종래의 많은 합성고분자화합물과 같이, 폐기시, 자연환경에 잔류해서 오염을 일으키는 일이 없다. 또, 대부분의 미생물생산 PHA는 생체적합성도 뛰어나고, 의료용 연질부재 등으로서의 응용도 기대되고 있다.

이와 같은 미생물생산 PHA는, 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건 등에 의해, 여러 가지의 조성이나 구조의 것으로 될 수 있는 것이 알려져 있고, 이제까지 주로, PHA의 물성의 개량을 목적으로 해서, 상기 기재한 수단을 이용해서 생산되는 PHA의 조성이나 구조의 제어에 관한 연구가 행해져 왔다.

예를 들면, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus) H16균주(ATCC No. 17699) 및 그 변이균주는, 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써, 3-하이드록시부티르산(3HB)과 3-하이드록시발레르산(3HV)과의 공중합체를 여러 가지의 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 특표평 6-15604호 공보, 동 특표평 7-14352호 공보, 특표평 8-19227호 공보 등).

또, 일본국 특허공보 제 2642937호에서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)균주(ATCC 29347)에, 탄소원으로서 비고리형상 지방족 탄화수소를 부여함으로써, 탄소수 6 내지 12까지의 3-하이드록시알카노에이트의 모노머유닛을 가진 PHA를 생산하는 것이 개시되어 있다.

일본국 공개특허 평 5-74492호 공보에는, 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.), 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) 및 슈도모나스속(Pseudomonassp.)의 미생물을, 탄소수3 내지 7의 제 1급 알콜에 접촉시킴으로써, 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.

일본국 공개특허 평 5-93049호 공보 및 일본국 공개특허 평 7-265065호 공보에는, 아에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)를, 올레산이나 올리브유를 탄소원으로 해서 배양함으로써, 3HB와 3-하이드록시헥산산(3HHx)의 2성분공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다.

또, 일본국 공개특허 평 9-191893호 공보에는, 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) IFO 13852균주가, 글루콘산 및 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 사용한 배양에 의해, 3HB와 4-하이드록시부티르산을 모노머유닛으로서 가진 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.

또한, 어떤 종류의 미생물에서는, 여러 가지의 치환기, 예를 들면, 불포화탄화수소, 에스테르기, 아릴기(방향족 고리기), 시아노기, 할로겐화 탄화수소, 에폭사이드 등이 도입된 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있고, 이와 같은 수법에 의해서 미생물생산 PHA의 물성개량을 목표로 하는 시도도 이루어지기 시작했다. 예를 들면, Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990); Macromolecules, 24, 5256-5260(1991); Chirality, 3, 492-494(1991) 등에서는, 슈도모나스 올레오보란스가 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3HPV)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있고, 3HPV가 함유되는 것에 기인한다고 생각되는, 폴리머물성의 변화가 확인되어 있다.

상기 설명한 바와 같이, 다수의 미생물이 폴리-3-하이드록시부티르산(PHB) 혹은 기타 PHA를 생산하고, 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있으나, 미생물이 생산하는 PHA의 특성은, PHA합성미생물의 다양성에 의존하는 바가 크다. 따라서, PHA합성능의 다양성을 나타내는 각종 PHA합성미생물을 검출하고, 또, 이들 검출된 PHA합성미생물의 수로부터, 목적으로 하는 PHA합성능을 나타내는 균주를 효율좋게 스크리닝하는 것이 필요하다.

이 때, PHA합성미생물의 검출 혹은 스크리닝을 행하는 수단으로서, 종래부터 몇가지의 방법이 이용되어 왔다. PHA합성능을 직접적으로 검증하는 수단으로서는, 각종 분리배양이 이용되고 있다. 일반적으로는, 특별한 배지, 예를 들면, 특정의 기질만을 첨가한 배지를 이용한 선택배양을 행하는 일이 많다. 이러한 선택배양방법은, 간편하기 때문에 널리 이용되지만, 항상 목적으로 하는 PHA합성능을 지닌 균주만이 선택되는 것은 아니다. 즉, 분리배양법에 있어서의 PHA합성의 유무를 조사하는 방법으로서는, 예를 들면, PHA를 수단블랙 B에 의해 염색하는 방법(Archives of Biotechnology, 71, 283, 1970), 위상차현미경에 의해 PHA의 축적을 조사하는 방법 등이 이용되고 있다. 그러나, PHA합성능을 나타내는 균이외에도, 수단블랙 B에 의해 염색되는 다른 균이 존재할 가능성도 있어, 엄밀하게는 이 염색만을 그 지표로 하는 것은 불가능하다.

따라서, 수단블랙 B염색법으로 선별한 균주 각각에 대해서, 또, 상세한 형태학적, 혹은 생화학적인 성상을 조사할 필요가 있다. 형태학적 혹은 생화학적인 성상에 의거해서, 목적으로 하는 균주를 검출 및 선별하는 데는, 숙련과 경험을 필요로 하고, 또한, 그 수법 자체도, 절차가 번잡하고, 또, 시간이 걸린다. 이와 같이, 수단블랙 B염색법을 기초로 하는 균의 선택은, 각종 실용면에서의 문제를 포함하는 것이다. 또, 마찬가지로, 위상차현미경에 의해 PHA의 축적을 조사하는 방법도, PHA축적의 판정에는 숙련과 경험을 필요로 하고, 그 정확도도 문제가 있으며, 게다가, 수법이 번잡하다는 것도, 실용상의 큰 과제이다.

이들 PHA합성 자체를 판정해서, PHA합성능의 유무를 검출하는 방법을 대신하는 수법으로서, PHA합성에 관한 PHA합성효소유전자의 유무를 검출하는 방법이 고려되고 있다. 즉, PHA합성효소유전자에 특이적인 핵산의 염기서열을, 그것에 상보적인 염기서열을 지닌 올리고뉴클레오티드 프라이머 혹은 프로브를 이용해서 검출하여, PHA합성효소유전자를 지닌 균주만을 선별하는 방법이 고려되고 있다.

PHA합성효소유전자에 대해서는, 이미 몇가지의 균주에 있어서, 그 염기서열이 해명되어, 보고되어 있다(Peoples, O.P. and Sinskey J., J. Biol. Chem., 264, 15293(1989); Huisman, G.W. et al., J. Biol. Chem., 266, 2191(1991); Pieper, U. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96. 73(1992); Timm, A. and Steinbuchel. A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992); Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459(1998)). 또, 이들 기지의 염기서열을 참조해서, 보존도가 높은 영역을 선택하여, 올리고뉴클레오티드를 설계한 예로서는, Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992)에 의해 보고된 서열을 들 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, PHA합성미생물을 효율좋게 검출하고, 또 목적으로 하는 PHA합성능을 지닌 균주를 스크리닝하기 위해서는, 그 미생물의 토양중에서의 존재 및 선점도나 생육상황을 알 필요가 있다. 이 때, 미생물을 특이적으로 검출, 계측할 수 있는 방법이 필요하나, 종래의 검출수단인 수단블랙 B염색을 이용하는 선택배지에 의한 배양이나, 위상차현미경을 이용하는 PHA합성의 판정은, 그 특이성, 감도, 간편성, 검출 및 스크리닝에 요하는 시간 등의 점에서 실용면에서 문제가 많다. 특히, 충분한 정확도로 판정을 하는 데는, 숙련과 경험을 요하므로, PHA합성미생물을 효율좋게 검출 및 스크리닝하는 수단으로서는, 반드시 적합한 것은 아니었다.

그 대신에, PHA합성효소유전자의 유무를 검출하는 방법은, 높은 정확도를 지닌 유력한 수단으로 여겨지고 있다. PHA합성효소유전자검출용의 프로브 또는 프라이머의 제안은 행해져 있으나, 목적으로 하는 PHA합성미생물의 검출 및 스크리닝수단으로서 이용하므로, PHA합성미생물에 선택적이고 또 PHA합성미생물에 폭넓게 공통인 프로브 또는 프라이머의 선택은, 현재에 있어서도 가장 곤란한 과제로서 존재하고 있다.

본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은, 신속하고, 간편하고, 또 특이적으로, 또한, 감도좋게 PHA합성미생물의 존재 및 선점도를 검출하는 수단, 즉, PHA합성효소유전자검출용의 프로브 또는 프라이머로서 이용가능하며, PHA합성미생물에 대해서 높은 선택성을 지니고, 또, PHA합성미생물사이에서는, 폭넓게 공통적으로 이용되는 것이 가능한 핵산단편의 제공, 그리고 상기 핵산단편을 프로브 또는 프라이머로서 이용하는 PHA합성효소유전자의 검출 및 스크리닝을 행하는 방법의 제공을 행하는 데 있다. 게다가, 본 발명은, 상기의 PHA합성효소유전자의 검출에 이어, 상기의 핵산단편을 프라이머로서 이용하는 PHA합성효소유전자의 염기서열을 결정하는 방법의 제공을, 그 목적에 포함하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 종래 제안되어 있던 염기서열과 비교해서, PHA합성효소유전자검출용의 프로브 또는 프라이머에 의해 적합한 염기서열의 선택을 진행하였다. 또, 본 발명자들은, 이 PHA합성효소유전자검출은, 토양속에서부터 PHA합성능을 지닌 신규의 미생물을 분리할 때, 보다 넓은 범위의 PHA합성미생물에 대해서, 그 PHA합성미생물유전자의 존재를 검출가능하게 되도록, 새롭게 프로브 또는 프라이머로서 이용할 수 있는 염기서열의 선택을 진행하였다. 그 결과, 수종의 염기서열을 선택하고, 이들 염기서열, 혹은 그 상보적인 염기서열로 이루어진 DNA단편은, PHA합성능을 나타내는 신규의 미생물에 대해서, 그 염색체의 DNA중에 존재하는 PHA합성미생물유전자와 높은 선택성으로 하이브리다이징될 수 있고, 각종의 하이브리다이제이션법에 이용되는 프로브 혹은 폴리머라제연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)에 의한 PCR증폭산물의 채취에 이용되는 프라이머로 되는 것을 발견하였다. 본 발명자들은, 이들 어느 수법을 이용해도, PHA합성미생물유전자의 존재를 극히 높은 정확도로 검출할 수 있고, 유효한 PHA합성미생물의 검출수단으로 되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하는 데 이르렀다.

즉, 본 발명의 핵산단편은, PHA합성능을 지닌 신규한 미생물, 그 미생물이 지닌 PHA합성미생물유전자를 검출하기 위해, 프로브 또는 프라이머로서 이용할 수 있는 염기서열을 지닌 인위적으로 제조되는 핵산단편이다. 특히, 본 발명의 핵산단편은, 서열번호: 1 내지 9로 표시된 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열, 혹은 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열의 어느 하나로부터 선택된 핵산단편이다. 또, 프로브 또는 프라이머로 사용할 때에는, 본 발명의 핵산단편은, 상기의 특정의 염기서열을 지닌 핵산단편 또는 그 염기서열중의 부분서열로 이루어진 핵산단편으로 이루어진 프라이머 혹은 프로브로서 이용가능한 핵산단편의 형태로 된다.

또한, 본 발명의 핵산단편은, 그 하이브리다이제이션특성을 유지하는 범위에서, 염기서열의 실질적인 상동성을 유지하면서, 약간의 변이를 지녀도 되고, 예를 들면, 그 비본질적인 변이로서, 서열번호: 1 내지 9로 표시된 염기서열, 또는 그 상보적인 염기서열에 의거해서 실시되는 변이가, 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 혹은 염기서열의 부가, 또는 염기서열중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기 혹은 염기서열에 의한 치환, 혹은 이들의 변이를 복합해서 실시한 변형서열을 지닌 핵산단편으로 하는 것이 가능하다.

본 발명의 프라이머는, 상기 염기서열로 이루어진 프라이머로서 이용가능한 핵산단편을 포함하는 프라이머에 있어서, 부가적인 변형으로서, 상기 핵산단편의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고상 담체(solid-phase carrier)에 결합가능한 부위가 도입되어 있어도 된다. 마찬가지로, 본 발명의 프로브는, 상기 염기서열로 이루어진 프로브로서 이용가능한 핵산단편을 포함하는 프로브에 있어서, 부가적인 변형으로서, 상기 핵산단편의 분자상에 결합되는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입되어 있어도 된다.

본 발명의 프라이머는, 예를 들면, PCR증폭에 있어서의 프라이머쌍으로서 이용될 수 있고, 그 경우에는, 염기서열에 실질적으로 차이가 있는 2종의 핵산단편의 조합으로 이루어진 프라이머에 있어서, 상기 2종의 핵산단편중 적어도 1종은 본 발명의 프라이머용의 핵산단편이며,

상기 2종의 핵산단편의 각 분자상에 표식물 및/또는 고상 담체가 도입되어 있어도 되는 프라이머이다.

본 발명의 프라이머는, 상기 PCR증폭에 있어서의 프라이머쌍으로서 뿐만 아니라, 예를 들면, mRNA에 대응하는 cDNA제조용의 프라이머에도 이용될 수 있으나, 어느 용도에 있어서도, 상기 변형된 염기서열을 지닌 프라이머용 핵산단편을 이용하는 것도 가능하다. 변형 염기서열을 지닌 프라이머용 핵산단편을 이용할 경우에는, 이용되는 상기 본 발명의 프라이머용 핵산단편의 염기서열은, 서열번호: 1 내지 9로 표시된 염기서열 혹은 그 상보적인 염기서열에 의거해서, 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기서열중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기 혹은 염기서열에 의한 치환, 또는 이들을 복합해서 실시한 변형염기서열인 것을 특징으로 하는 프라이머를 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는, 상기한 바와 같이 부가적인 변형을 실시하는 것이 가능하다. 따라서, 이 경우, 부가적인 변형이 실시된 핵산단편을 적어도 1종 함유하고, 상기 핵산단편의 1종에 있어서의 부가적인 변형은, 표식물 또는 고상 담체와 결합가능한 부위를 핵산단편의 5'-말단쪽으로 도입한 것임을 특징으로 하는 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것이 가능하다.

예를 들면, 이와 같은 부가적인 변형으로서, 분자상에 도입되는 표식물 또는 고상 담체에 결합가능한 부위가, 비오틴잔기, 2,4-디니트로페닐기 및 디곡시게닌잔기의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프라이머 또는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 PHA합성미생물의 검출방법은, 상기 설명한 본 발명의 염기서열을 지닌 핵산단편, 프라이머 또는 프로브로서 이용가능한 핵산단편의 형태, 또는, 서열의 변이가, 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 혹은 염기서열의 부가, 또는 염기서열중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기 혹은 염기서열에 의한 치환, 또는 이들을 복합해서 실시한 변형서열의 핵산단편중의 어느 하나인 본 발명에 의한 핵산단편의 적어도 1종을 프로브로서 이용하는 것을 특징으로 하는 PHA합성미생물의 검출방법이다. 혹은, 본 발명의 PHA합성미생물의 검출방법은, 상기 설명한 염기서열을 지닌 본 발명의 핵산단편, 프라이머 또는 프로브로서 이용가능한 핵산단편의 형태, 또는, 서열의 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 혹은 염기서열의 부가, 또는 염기서열중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기 혹은 염기서열에 의한 치환, 또는 이들을 복합해서 실시한 것인 변형서열의 핵산단편중의 어느 하나인 본 발명에 의한 핵산단편의 적어도 1종을 프라이머로서 이용하는 것을 특징으로 하는 PHA합성미생물의 검출방법으로 하는 것도 가능하다.

예를 들면, 본 발명의 PHA합성미생물의 검출방법은, 상기 본 발명의 프라이머를 사용하고, 하기 4개의 공정:

(1) PHA합성미생물의 유무를 검출하고자 하는 시료를 준비하는 공정;

(2) 필요에 따라, 상기 시료중의 균체의 파괴처리를 행하는 공정;

(3) 상기 시료중에 상기 프라이머를 부가하고, 프라이머의 신장반응을 행하는 공정; 및

(4) 상기 공정(3)에서 얻어진 신장반응물에 대해서 검출조작을 행하는 공정을 구비하거나, 혹은,

상기 공정(1), 공정(3) 및 공정(4)과, 필요에 따라 상기 공정(2)을 구비한 것을 특징으로 하는 PHA합성미생물의 검출방법으로 하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 기재한 2종의 핵산단편을 조합시켜 이루어진 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 PHA합성미생물의 검출방법으로서 실시하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 공정(3)의 프라이머의 신장반응이 폴리머라제연쇄반응에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 PHA합성미생물의 검출방법으로서 실시하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 핵산단편은, 서열번호: 1 내지 9로 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열, 또는 이들 서열에 의거해서 그의 부분염기서열을 포함하는 것으로, 그 특정의 염기서열을 지니는 핵산단편을 프라이머 또는 프로브로서 이용하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 프라이머 또는 프로브를 이용하는 PHA합성미생물의 검출방법은, 그 검출감도, 특이성, 수순의 간편성 및 신속성의 점에서 우수한 검출방법으로 된다. 이와 같이, PHA합성미생물의 검출효율이 높아지면, PHA합성미생물을 이용해서 생산되는 PHA의 개발, 예를 들면, 생분해성 플라스틱 등의 분야에 있어서의 연구·개발에 큰 공헌을 하는 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태예에 대해서 상세히 설명한다.

본 발명의 핵산단편은, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열을 실질적으로 유지하고, PHA합성능을 나타내는 각종 미생물에 대해서, 그 염색체 DNA중에 존재하는 PHA합성효소유전자와 높은 선택성으로 하이브리다이징될 수 있는 특성을 지닌 것이다. 서열번호: 1 내지 9로서 표시되는 염기서열은, 어느 것도, 그 서열길이는 약 25개의 염기, 즉, 23 내지 27개의 염기로 이루어진 것이다. 본 발명의 핵산단편은, 이 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열을 실질적으로 유지하는 1본쇄의 DNA분자로서, PHA합성효소유전자의 이중쇄DNA의 어느 것의 사슬에 선택적으로 하이브리다이징한다.

이하, 본 발명의 핵산단편, 그 프로브 혹은 프라이머로서의 이용형태, 및 프로브 혹은 프라이머에 이용된 PHA합성미생물의 검출방법에 대해서, 보다 상세히 설명한다.

<핵산단편>

본 발명의 핵산단편은, 상기 설명한 바와 같이, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열을 지니는 핵산, 혹은 이들의 염기서열에 의거해서 변이가 실시된 변형서열의 어느 것으로부터 선택된 염기서열을 실질적으로 지니는 핵산단편이다. 즉, 본 발명의 핵산단편은, 프라이머 또는 프로브로서 이용할 때, 그 용도에 따라, 그 서열의 길이를 10 내지 50개의 염기의 길이로서 설정한 1본쇄의 핵산단편이다.

따라서, 프라이머로서 이용할 때에는, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열은, 어느 것도, 그 서열길이는, 약 25개의 염기, 즉, 23 내지 27개의 염기로이루어진 것이 있으나, 예를 들면, 그 부분염기서열을 선택하고, 최소의 전체길이에 10개의 염기의 핵산단편, 또는, 그 상보적인 염기서열을 지니는 최소의 전체길이에 10개의 염기의 핵산단편으로 설정하는 것도 가능하다. 한편, 프로브로서 이용할 때에는, 예를 들면, 약 25개의 염기로 이루어진 염기서열에 부가적인 염기서열을 연결해서, 최대 전체길이에 50개의 염기의 핵산단편, 또는, 상보적인 약 25개의 염기로 이루어진 염기서열에 부가적인 염기서열을 연결해서, 최대 전체길이가 50개의 염기인 핵산단편으로 설정하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 핵산단편에 있어서, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거해서, 그 부분염기서열만을 이용할 경우에는, 그 부분염기서열만이라도, PHA합성미생물에 특이적이고, 다른 세균에 상동성이 적은 부분을 선택하는 것이 바람직하다.

또는, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거해서, 실질적으로 PHA합성효소유전자에 대한 하이브리다이제이션능을 유지하는 범위에서, 일부 염기서열을 치환, 부가, 삽입 및 결실을 지녀도 된다. 예를 들면, 본 발명의 핵산단편을, PCR반응에 이용하는 프라이머로 이용할 때, 프라이머상호가 하이브리다이제이션을 일으키지 않도록, PHA합성효소유전자에 대한 하이브리다이제이션능을 유지하는 범위내에서, 염기의 치환, 말단서열의 제거 등의 변이조작을 실시한 것으로 하는 것도 가능하다. 또, PCR반응 등에 의해 2중쇄 DNA를 형성한 때, 본 발명의 핵산단편에 유래하는 부분에, 제한효소에 의한 절단서열을 포함하도록, 염기서열에 부가, 삽입 등의 조작을 실시하는 것도 가능하다. 혹은, 일반적으로, 믹스트(mixed)프라이머로서 사용될 때에는, 염기서열중에 코딩된 아미노산서열이 일치하는 범위에서, 코돈축퇴의 범위에 따라 염기의 치환을 행하여, 서로 유사한 염기서열을 지니는 복수종의 혼합물로 제작하는 것도 가능하다.

여기서, 상기의 변형 또는 부가/삽입은, 그 변형에 따라, 목적으로 하는 PHA합성효소유전자이외의 유전자와의 높은 하이브리다이제이션능을 유발하지 않도록 선택하면 된다. 예를 들면, PHA합성효소유전자를 유지하는 미생물에 있어서, 알칸산의 대사반응에 관여하는 그 밖의 효소단백질의 유전자와의 높은 하이브리다이제이션능을 유발하는 염기서열을 도입하는 등, 선택성을 손상할 염려가 있는 변형으로 되지 않도록 선택하면 된다. 또, PHA합성효유전자 자체는 유지되지 않지만, 알칸산의 대사능을 지니는 미생물에 있어서, 알칸산의 대사반응에 관여하는 그 밖의 효소단백질의 유전자와 높은 하이브리다이제이션능을 유발하는 염기서열을 도입하는 등, 선택성을 손상할 염려가 있는 염기서열의 변이로 되지 않도록 선택하면 된다.

본 발명에 있어서의 핵산단편은, 상기 설명한 바와 같이, 예를 들면, 일부의 염기 혹은 염기서열의 결실, 치환, 부가 등이 실시된 염기서열이며, 프로브 또는 프라이머로서의 사용형태 및 목적에 따라서, 10 내지 50개의 염기의 길이를 지닌 핵산단편으로 하는 것이 가능하다. 특히 핵산단편을 프라이머로서 이용할 경우에는, PHA합성효소유전자를 주형으로 해서 프라이머의 신장반응을 행하지만, 통상, 그 신장반응에 큰 영향을 주는 것으로 여겨지는 3'-말단부근의 변이로 되지 않도록 하거나 혹은 3'-말단부근의 변이가 있어도, 그 변이를 실시하는 염기수를 최소한으로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 보다 바람직하게는, 부가적인 염기서열 등의, 본래의 하이브리다이제이션능을 보완·증진하는 작용을 지니지 않은 변이를 도입할 때에는, 5'-말단부근에서 그 변이가 있도록 한다.

또, 본 발명의 핵산단편을 이용한 프라이머 또는 프로브에 있어서는, 상기한 10 내지 50개의 염기의 길이의 핵산단편으로 이루어져, 그 DNA분자상에 표식물 및/또는 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어, 변형이 행해진 핵산단편이어도 된다. 하기에 설명하는 바와 같이, 이 표식물 및/또는 고상 담체와 결합가능한 부위는, 2본쇄의 DNA단편 또는 하이브리다이제이션된 DNA복합체를, 관련된 표식물 및/또는 고상 담체와 결합가능한 부위를 이용해서, 검출 또는 고정화하는 역할을 지닌다. 이 부가적인 변형은, 본 발명의 핵산단편을 이용한 프라이머 또는 프로브의 PHA합성효소유전자에 대한 하이브리다이제이션능을 손상하지 않는 한, 그 도입부위에 특히 제한은 없다.

이와 같이 필요에 따라, 표식물 또는 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입된 프라이머는, 예를 들면, 이들 프라이머를 이용해서, PHA합성효소유전자를 주형으로 한 3'-말단의 신장반응을 행해서, PHA합성미생물의 검출을 행한다. 즉, 표식물 또는 고상 담체와 결합가능한 부위를 도입가능한 위치는, 프라이머의 신장반응을 방해하지 않는 위치라면 어디라도 되나, 가능하면, 5'-말단에 도입하는 것이 바람직하다. 또, 프로브를 이용한 검출을 행할 경우, 일반적으로, 프로브의 3'-말단에의 신장반응은 이용하지 않는다. 따라서, 프로브의 표식물 또는 고상 담체와 결합가능한 부위를 도입가능한 위치는, 3'-말단이나 5'-말단의 수산기부분, 또한 염기부분이나 인산디에스테르부분 등을 이용하는 것도 가능하다. 또한, 프로브의 염기서열 자체나 그 길이 등을 고려해서, 하이브리다이제이션을 방해하지 않는 위치에 도입하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 프로브의 염기서열의 전체중, 하이브리다이제이션에 주로 관여하는 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열에 의거한 부분을 제외하고, 부가적인 염기서열부분을 그 도입위치로 이용하는 것도 바람직하다.

본 발명의 핵산단편은, 본래 프라이머 또는 프로브로서 이용되므로, 그 사용시에는, 1본쇄 DNA로 설정하나, 제조시에는, 서로 상보적인 염기서열을 지니는 1본쇄가 결합된 2본쇄의 DNA의 형태로 해도 된다. 이들 본 발명의 핵산단편, 혹은 그 부분염기서열은, 적합한 형태로, 임의의 방법에 의해 제조하는 것이 가능하다. 핵산단편의 염기서열에 따라서, 예를 들면, 후술하는 실시예에 기재한 방법에 따라서, 염기서열전부 또는 일부를 화학합성해도 된다. 혹은, 화학합성한 프라이머를 이용해서, PCR법으로 증폭해서, 증폭단편을 그대로, 혹은 증폭단편으로부터 절단한 부분단편을, 프로브로서 이용하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 핵산단편에 의해 일단 검출된 PHA합성미생물의 유전자로부터, 소정의 영역을 제한효소 등을 이용해서 직접 잘라내어, 제조하는 것도 가능하다. 또, 이들 유전자를 이콜라이(E.coli) 등의 플라스미드에 클로닝해서, 균을 증식한 후에 플라스미드를 회수하여, 소정의 영역을 잘라내서 이용하는 것도 가능하다.

<표식물 및 고상 담체와 결합가능한 부위>

상기 핵산단편을 프로브 또는 프라이머로서 이용할 경우, 상기 표식물로서,방사성 물질, 비방사성 물질의 어느 쪽을 이용해도 된다. 방사성 물질을 이용할 때에는, 예를 들면, 인산에스테르부분에, 방사성 동위체를 포함하는 것으로 해도 된다. 비방사성 표식물로서는, 플루오레세인유도체, 로다민 및 그 유도체 등의 형광물질, 화학발광물질, 지연형광물질 등을 들 수 있다. 또, 표식물과 특이적으로 결합하는 물질을 이용해서, 간접적으로 표식물을 검출하는 것도 가능하다. 이렇게 간접적으로 검출가능한 표식물로서는, 비오틴, 합텐 등을 들 수 있다. 예를 들면, 비오틴의 경우에는, 아비딘 혹은 스트렙토아미딘을 이용하고, 합텐의 경우에는, 이것에 특이적으로 결합하는 항체를 검출에 이용한다. 표식에 이용하는 합텐으로서는, 2,4-디니트로페닐기를 지닌 화합물이나 디곡시게닌 등을 사용하는 것이 가능하다. 이들 표식물은, 어느 것이라도 단독 혹은 필요에 따라서 복수종을 조합해서 프로브 또는 프라이머에 도입하는 것도 가능하다.

고상 담체와 결합가능한 부위는, 예를 들면, 샌드위치하이브리다이제이션 등 핵산의 특이단편을 고상 담체에 특이적으로 결합할 경우에 이용한다. 이 때, 해당 고상 담체와 선택적으로 결합가능한 것이면 어느 것이라도 된다. 예를 들면, 비오틴 혹은 플루오레세인, 2,4-디니트로페닐기를 지닌 화합물이나 디곡시게닌 등의 합텐을 들 수 있다. 이들은, 고상 담체의 종류에 따라서, 어느 것이라도 단독으로 혹은 필요에 따라서 복수종 조합해서, 프로브 또는 프라이머에 도입해도 된다. 또, 본 발명의 핵산단편, 프라이머 또는 프로브에 실시되는 표식물 및/또는 고상 담체와 결합가능한 부위의 도입에 의한 부가적인 변형은, 위에서 설명한 예시로 한정되지 않는다.

본 발명의 PHA합성미생물의 검출방법은, 상기 본 발명의 핵산단편으로 이루어진 프라이머 또는 프로브를 이용하는 방법이다.

<프로브를 이용한 검출법>

프로브를 이용한 본 발명의 PHA합성미생물의 검출법은, 상기 염기서열을 지니는 핵산단편에 있어서, 표식물 및/또는 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있어도 되는 핵산단편으로 이루어진 본 발명의 프로브의 적어도 1종을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법이다. 일반적으로, 프로브를 이용한 검출법으로서는, 도트하이브리다이제이션, 서던(southern)하이브리다이제이션 및 인사이투(in situ)하이브리다이제이션의 형태가 있고, 상기 표식을 실시한 핵산단편을 사용해서, 상법에 따라 하이브리다이제이션을 행하는 것이 가능하다. 또, 인사이투하이브리다이제이션에 있어서도, 본 발명의 핵산단편을 검출하는 데 제공하는 것이 가능하다.

또, 하이브리다이제이션조작의 간이화를 위해 샌드위치하이브리다이제이션을 기본으로 하는 수법이 개발되어 있으며, 이 수법을 이용해서, 본 발명의 핵산단편을 고정프로브 등에 이용해서 PHA합성미생물의 검출을 행하는 것이 가능하다.

많은 경우, PHA합성효소유전자와의 하이브리다이제이션에 의해, 검출을 행하나, PHA합성효소유전자로부터 전사된 mRNA, 혹은 그 cDNA와의 하이브리다이제이션에 의해 검출을 행해도 된다.

<프라이머를 이용한 검출법>

프라이머를 이용한 본 발명에 의한 PHA합성미생물의 검출법은, 상기 염기서열을 지닌 핵산단편에 있어서, 표식물 및/또는 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있어도 되는 핵산단편으로 이루어진 본 발명의 프로브의 적어도 1종을 지니는 것을 특징으로 하는 방법이다. 보다 바람직한 예로서는, 후술하는 바와 같은 2종의 다른 프라이머를 이용해서, 유전자증폭반응에 의해 시료중의 미량의 핵산단편을 증폭하는 PCR법을 이용하는 검출법이다. 여기서, 2종의 프라이머를 이용할 때, 프라이머의 형태로서는, 예를 들면, 2종의 프라이머 모두 변형되어 있지 않은 것, 2종의 프라이머의 적어도 한 쪽에 검출가능한 표식물 또는 고상 담체와 결합가능한 부분이 도입된 것, 2종의 프라이머중, 한쪽에는 표식물이 도입되고, 다른 쪽에는 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있는 것, 2종의 프라이머 모두 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입된 것 등을 들 수 있다.

본 발명에 의한 PHA합성미생물의 검출방법은, 상기한 바와 같은 본 발명에 의한 프라이머를 적어도 1종, 바람직하게는, 2종의 프라이머를 조합시켜 이루어진 프라이머쌍을 이용해서, 이하와 같이 실시하는 것도 가능하다:

(1) 폴리하이드록시알카노에이트합성미생물의 유무를 검출하고자 하는 시료를 준비하는 공정;

(4) 상기 공정(3)에서 얻어진 신장반응물에 대해서 검출조작을 행하는 공정에 의해 실시하거나, 혹은,

상기 공정(1), 공정(3) 및 공정(4)과, 필요에 따라 상기 공정(2)를 포함하는일련의 공정에 의해 실시한다.

즉, 시료중에 함유되는 많은 종류의 핵산단편, DNA유전자 등으로부터, 본 발명의 프라이머와 상보적인 염기서열을 지닌 것의 유무를, 그것을 주형으로 해서, 프라이머의 신장반응에 의한 반응물의 생성을 검출함으로써 행하는 방법이다. 이 때, 프라이머의 신장반응에, PCR법을 응용하면, 반응생성물의 선택적인 증폭이 행해지므로, 보다 높은 검출감도가 달성된다. 이에 더해서, 증폭산물의 분자량(염기길이)도 소정량으로 되어, 검출이 보다 용이해진다.

공정(4)에 있어서의, 프라이머의 신장반응에 의해 증폭된 핵산단편의 검출은, 전기영동 혹은 하이브리다이제이션 등의 통상 사용되는 방법을 이용해도 된다. 또, 유전자의 증폭반응에 있어서, 각각의 프라이머에 별개의 표식을 도입해 놓고, 증폭반응후, 반응생성물을 고상 담체에 흡착시켜, 반응생성물을 선택적으로 검출하는 방법 등을 이용하는 것도 가능하다.

상기 고상 담체로서는, 폴리스티렌볼, 아가로스비드, 폴리아크릴비드, 라텍스, 마이크로타이터 웰등의 고상 담체에, 프라이머중에 도입된 결합부위를 포착가능하도록, 스트렙토아비딘, 항체 등을 도입한 것을 들 수 있다. 예를 들면, 비오틴이 도입된 프라이머로부터의 PCR산물을 포착하기 위해서는, 스트렙토아비딘을 고상 담체에 결합한 담체를, 플루오레세인 등이 도입된 프라이머로부터의 신장반응물을 포착하기 위해서는, 플루오레세인 등에 대한 항체를 고상에 결합한 담체를, 각각 이용해도 된다. 또, 고상 담체를 미립자로 함으로써, 목적으로 하는 반응생성물의 핵산단편을 응집 혹은 침전형성의 유무에 의해 간편하게 판정하는 것도 가능하다.

2종의 프라이머로서, 한쪽의 프라이머에 고상 담체와 결합가능한 부위를, 다른 쪽의 프라이머에 표식물을 도입한 것을 이용해서, 신장반응을 행한 후, 그 신장반응생성물을 고상 담체와 접촉시킨 후에, 고상 담체와 결합하지 않은 불순물을 적당한 용매로 세정해서 제거하는 수법이 제안되어 있다. 이 수법을 이용하면, 고상 담체와 결합가능한 부위를 지닌 목적으로 하는 핵산단편은, 또 표식물을 지닌 형태로 해당 고상 담체에 고정되어, 한층 특이적으로 검출된다. 이들 고상 담체에 고정된 핵산단편에 대해서, 그 표식물질의 실제의 검출은, 사용하는 표식물질에 따라서 일반적인 수법을 이용하면 된다. 예를 들면, 표식물질이 방사성 동위체이면, 그대로 방사활성을 측정하면 된다. 또, 예를 들면, 비오틴 또는 합텐이면, 아비딘-효소결합체 혹은 항체-효소결합체를 사용해서, 상기 결합체의 효소에 대해서 AMPPD 등의 기질과 반응시켜, 그 효소량(효소활성)을 색적 수단 혹은 형광적 수단에 의해 검출하면 된다.

또, 프라이머신장반응, 예를 들면, 유전자의 PCR증폭반응에 이용되는 효소, 반응조건 등에 대해서는, 각종 수법이 고안되어 있다. 본 발명의 핵산단편은, 그 기본이 되는 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열에 표시된 염기서열은, 그들 각종의 PCR법의 어느 것에 대해서도, 프라이머에 이용하는 데 충분한 길이 및 염기서열을 지니고 있다. 따라서, 각종 PCR의 어느 것을 적용할 경우에도, 상기 설명한 바와 같은 부가적인 변형, 염기길이의 조정, 변이의 도입 등을 필요에 따라 실시해서, 본 발명의 핵산단편을 프라이머에 이용함으로써, PHA합성미생물의 검출을행하는 것이 가능하다.

본 발명의 핵산단편은, 그 기본이 되는 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열중에 1개소 또는 복수 위치에, 복수종의 염기를 선택종으로 하는 개소를 지니고 있다. 따라서, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열은, 상기 선택종의 조합에 의해, 각각 서로 상동성을 지닌 1군의 염기서열을 구성한다. 본 발명의 핵산단편은, 상기 서로 상동성을 지닌 1군의 염기서열로부터 선택되는 염기서열을 지닌 것이다. 프라이머 혹은 프로브에 사용될 때에는, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열로 표시되는, 어느 것의 상동성을 지닌 1군으로부터 선택되는 염기서열을 지닌 1종류의 핵산단편을 이용하는 것도 가능하다. 혹은, 개개의 상동성을 지닌 1군으로부터 선택되는, 서로 상동성을 지닌 복수종의 핵산단편을 혼합해서 이용해도 된다. 또한, 소위 믹스프라이머로 불리는 혼합물, 즉, 상동성을 지닌 1군을 구성하는 염기서열의 것을 모두 포함하는 것을 이용해도 된다. 즉, 본 발명에 있어서는, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열을 지니는 핵산단편이란, 상기한 바와 같이, 단일종의 것, 서로 상동성을 지닌 복수종의 혼합물, 또한 선택가지의 조합에 의해 구성되는 상동성을 지닌 염기서열을 지닌 1군 전체, 이들 형태 모두를 포함한다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이하에 설명하는 실시예는 본 발명의 최량의 실시형태의 일례이나, 본 발명의 기술적 범위는, 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 프라이머특이성의 평가-1

본 발명의 프라이머는, PHA합성미생물의 검출이 가능한 특이성을 나타내는 것을 검증하였다. 그 일례로서, 본 발명의 프라이머를 이용해서, PCR법에 의해, PHA합성미생물의 유전자 DNA를 주형으로 해서, 목적으로 하는 PHA합성효소유전자의 부분염기서열을 검출한 예를 이하에 표시한다.

PHA합성능을 지니지 않은 기지의 2균주, 즉, 이콜라이(E coli) JM109 및 J1(FERM BP-5352); PHA합성능을 지니는 4균주, 즉, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373) 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376)의 총 6종의 세균을 대상으로 해서, PHA합성미생물의 검출에 있어서의 특이성을 검증하였다. 즉, 이 6종의 세균 각각에 대해서, 상법에 의해 각종 세균으로부터 DNA를 제조한 것을 시료로 하고, PCR법에 의해 프라이머의 특이성을 평가하였다.

본 실시예에 있어서, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열에 의거해서 제작된, 서열번호: 1 내지 4 및 6 내지 8로서 표시된 염기서열을 지닌 믹스프라이머 7종과 서열번호 5 및 6에 상보적인 염기서열을 지닌 믹스프라이머 2종을 이용해서, PCR증폭산물을 얻었다. 구체적으로는, 합성위탁한, 하기 포워드(forward)-프라이머 7종(아머샴-파르마시아-바이오텍사(Amersham-Pharmacia-Biotec Co., Ltd) 제품);

(서열번호: 1):

5'-GCCTCKGAAAACACCYTGGGSCT-3'

(서열번호: 2):

5'-TGACCGARGCCWTSGCSCCGACC-3'

(서열번호: 3):

5'-AGCCTGGCGCGSTTCTGCCTGCGC-3'

(서열번호: 4):

5'-GGCGARAASAAGGTCAAYGCCYTSACC-3'

(서열번호: 6):

5'-TGCAGGCCTAYCTGRSCTGGCAGAA-3'

(서열번호: 7):

5'-CCAGTACRYSCTSAARAAYGGCCTGC-3'

(서열번호: 8):

5'-CTGGACTTCTTCAAGCWCAACCCG-3'

및 하기의 리버스(reverse)-프라이머 2종(아머샴-파르마시아-바이오텍사 제품):

(서열번호: 5의 상보쇄)

5'-CAGCCACCAGGARTCGGYRTGCTTG-3'

(서열번호: 9의 상보쇄)

5'-ATGCTCTGSAYRTGVCCGCTGTTGG-3'

(단, K=G 또는 T, Y=C 또는 T, S=G 또는 C, R=A 또는 G, W=A 또는 T, B=T, G 또는 C, V=A, G 또는 C를 의미함)을 이용하였다.

PCR용 프라이머의 조합으로서는, 상기 서열번호: 1 내지 4의 염기서열을 지닌 포워드-프라이머 4종에 서열번호: 5의 상보쇄염기서열을 지닌 리버스-프라이머를 조합시킨 4종의 프라이머의 조합, 및 상기 서열번호: 6 내지 8의 염기서열을 지닌 포워드-프라이머 3종에 서열번호: 9의 상보쇄염기서열을 지닌 리버스-프라이머를 조합시킨 3종의 프라이머조합의 합계 7종류의 조합으로 하였다.

PCR은, 시판의 효소계, 암플리탁(AmpliTag) DNA 폴리머라제(타카라슈조사 제품)의 키트를 이용해서, 이하의 반응용액조성 및 조건에서 행하였다.

50pmol/㎕ 농도의 상기 2종의 프라이머를 각각 1㎕씩, 효소에 첨부한 반응완충액을 5㎕, 효소에 첨부한 dNTP혼합용액을 5㎕, 시료 DNA를 10ng 첨가하고, 또, 물을 첨가해서 반응용액 전체량을 50㎕로 하였다. 이것에, 암플리탁 DNA 폴리머라제(타가라슈조사 제품)를 1유닛 가하였다.

반응조건은, 반응용액을 95℃로 가열해서 5분간 유지한 후, 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 60초를 1사이클로 해서, 이 조건에서 15사이클의 반응을 행하고, 또, 95℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 60초를 1사이클로 해서, 이 조건에서 20사이클의 반응을 행하고, 그 후, 72℃에서 5분간 유지하였다. 반응종료후, 반응용액 50㎕로부터 2㎕씩 개별적으로 취해서, 아가로즈겔전기영동 및 에티디움브로마이드염색을 행하여, 증폭산물의 핵산쇄의 검출을 행하였다.

그 결과, PHA합성능을 지니지 않은 기지의 2균주, 즉, 이콜라이 JM109 및J1(FERM BP-5352)에서는, 어떠한 증폭산물도 검출되지 않았다. 한편, PHA합성미생물에 있어서는, 상기 PCR용 프라이머를 조합한 7종류의 PHA합성미생물의 어느 것에 있어서도 각각 증폭산물로서, 명료한 1본의 밴드가 확인되었다. 또, 상기 PHA합성미생물 4종 모두, PCR용 프라이머의 조합 7종류 각각에 대해서, 얻어진 PCR증폭산물의 단편길이는, 상호 일치하고 있고, 하기 표 1에 표시한 단편길이였다. 즉, 이 합계 7종의 프라이머조합은, 각각 4종의 PHA합성미생물에 유래하는 PHA합성효소유전자로부터, 상호 대응하는 부분염기서열을 증폭하고 있기 때문에, PCR증폭산물은, 거의 마찬가지 염기쌍을 지니는 것이었다. 이상의 결과로부터, 본 실시예에 이용된 9종의 프라이머는 어느 것도, PHA합성미생물의 검출에 적용가능한 특이성을 나타내는 것이 확인되었다.

포워드-프라이머의 염기서열	리버스-프라이머의 염기서열	PCR증폭단편길이
서열번호: 1	서열번호: 5의 상보쇄	약 1.5kpb
서열번호: 2	서열번호: 5의 상보쇄	약 1.2kpb
서열번호: 3	서열번호: 5의 상보쇄	약 0.85kpb
서열번호: 4	서열번호: 5의 상보쇄	약 0.6kpb
서열번호: 6	서열번호: 9의 상보쇄	약 1.2kpb
서열번호: 7	서열번호: 9의 상보쇄	약 0.75kpb
서열번호: 8	서열번호: 9의 상보쇄	약 0.2kpb

(실시예 2) 프라이머의 제조

본 발명의 핵산단편의 일례로서, 표식물 혹은 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있는 프라이머 및 표식물 혹은 고상담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있지 않은 프라이머에 대해서, 각각의 화학합성법에 의해 제조하였다.

먼저, 표식물 혹은 고상 담체와 결합가능한 부위가 어느 곳도 도입되어 있지 않은 핵산단편은, 1본쇄 DNA로서, DNA자동합성기 모델 381A(퍼킨엘머사 제품)를 이용해서, 포스포아미다이트법에 의해 0.2μmol스케일로 합성을 행하였다. 목적의 핵산단편은, 원료 등의 혼입물을 제거하기 위해, OPC카트리지(퍼킨엘머사 제품)에 의해 정제하였다.

또, 표식물 혹은 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있는 프라이머의 일례로서, 그 염기서열의 5'-말단에 표식물 혹은 고상 담체와 결합가능한 부위가 부가된 프라이머를 조정하였다. 미리 중간원료로서, 그 5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 그 후에 적당한 시약을 이용해서 표식물 혹은 고상 담체와 결합가능한 부위를 5'-말단의 아미노기를 이용해서 도입하였다. 이하에, 그 일례로서, 비오틴화한 예와 2,4-디니트로페닐기를 부가한 예를 설명한다.

5'-말단에 비오틴화한 프라이머의 합성

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 10):

5'-GCCTCGGAAAACACCTTGGGGCT-3'

의 합성은, 상기 포스포아미다이트법에 의한 합성반응에 의해, 5'-말단에 최후의 염기(이 경우는 C)를 부가한 후, 아미노링크II(퍼킨엘머사 제품)를 또 부가함으로써, 5'-말단에 아미노기를 부가한 G를 부가하였다. 합성종료후, 중간원료의 5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드는 마찬가지로 해서, OPC카트리지에 의해 정제하였다.

또한, 상기 수순에 준해서, 후술하는 6종류의 5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드를 중간원료로서 제작하고, 합계 7종류의 5'-말단에 아미노기를도입한 올리고뉴클레오티드중간원료를 얻었다.

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 11):

5'-TGACCGAAGCCATGGCGCCGACC-3'

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 12):

5'-AGCCTGGCGCGGTTCTGCCTGCGC-3'

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 13):

5'-GGCGAAAACAAGGTCAACGCCCTGACC-3'

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 14):

5'-TGCAGGCCTACCTGAGCTGGCAGAA-3'

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 15):

5'-CCAGTACGCGCTGAAGAACGGCCTGC-3'

5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 16):

5'-CTGGACTTCTTCAAGCACAACCCG-3'

이어서, 5'-말단에의 비오틴화는, 이하와 같이 해서 행하였다. 10.D.의 아미노화 올리고뉴클레오티드수용액 10㎕에, 1M NaHCO₃수용액 10㎕, 물 30㎕ 및 비오틴화시약으로서, 20μg/㎕의 비오티닐-N-하이드록시숙신이미도에스테르(BRL)의 DMF용액을 50㎕ 가하여, 혼합후 실온에서 방치하였다. 4시간후, 세파덱스 G-50을 담체로 한 겔여과를 행하여, 50mM TEAB(중탄산 트리에틸암모늄)완충액(pH 7.5)으로 용출해서, 최초의 피크를 모았다. 이 용출물을 건조해서 고형화한 후, TE완충액(pH 8.0)에 용해시켰다. 하기 6종류를, 중간원료의 5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드를 비오틴화해서 제조하였다.

5'-말단에 디니트로페닐기(DNP)를 도입한 프라이머의 합성

5'-말단에의 디니트로페닐기(DNP)의 도입도, 비오틴표식과 마찬가지로, 5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드를 중간원료로 해서 행하였다. 5'-말단에 아미노기를 도입한 올리고뉴클레오티드 2종류, 즉 (염기서열: 17의 상보쇄):

5'-CAGCCACCAGGAGTCGGCGTGCTTG-3'

및 (서열번호: 18의 상보쇄):

5'-ATGCTCTGGACATGCCCGCTGTTGG-3'

를 각각 상기 비오틴표식과 마찬가지로 합성하고, 정제를 행하였다. 정제한 2 O.D.의 아미노화 올리고뉴클레오티드수용액 180㎕에, 1M NaHCO₃수용액 20㎕를 첨가하고, 이것에 시약의 5%(v/v) 디니트로플루오로벤젠의 에탄올용액 100㎕를 첨가하여, 37℃에서 2시간 승온하고, 반응을 행하였다. 비오틴화 올리고뉴클레오티드와 마찬가지로, 반응후의 정제는, 여과에 의해 행하여, 건조·고화시킨 후, TE완충액(pH 8.0)에 용해시켰다.

(실시예 3) 프로브의 제조

본 발명의 핵산단편의 일례로서, 표식물 혹은 고상 담체와 결합가능한 부위가 도입되어 있는 프로브를 화학합성법에 의해 제조하였다.

3'-말단에 비오틴표식을 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 13):

5'-GGCGAAAACAAGGTCAACGCCCTGACC-비오틴-3'

를 이하와 같이 제조하였다. 미리, 3'-말단이 비오틴표식되어 있는, 0.5μmol스케일의 3'-비오틴-ONCPG컬럼(CLONTECH)을 이용해서, 포스포아미다이트법에 의해 소정의 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 컬럼으로부터 분리하였다. 이 3'-말단에 비오틴표식을 지닌 올리고뉴클레오티드도, 상법에 의해 OPC카트리지를 이용해서 정제, 건조·고형화시킨 후, TE완충액(pH 8.0)에 용해시켰다. 이 핵산단편은, 3'-말단에 비오틴표식을 도입하고 있어, 프라이머가 아니라, 프로브에 적합한 것이었다.

(실시예 4) 프라이머특성의 평가-2

본 발명의 프라이머는, PHA합성미생물의 검출이 가능한 특이성을 나타내는 지의 여부를 검증하였다. 그 일례로서, 본 발명의 프라이머를 이용해서, PCR법에 의해, PHA합성미생물의 유전자 DNA를 주형으로 해서, 목적으로 하는 PHA합성효소유전자의 부분염기서열을 검출한 예를 이하에 표시한다.

본 실시예에 있어서, 프라이머는 실시예 2에서 제조한 9종의 프라이머, 구체적으로는, 하기의 5'-말단을 비오틴화한 포워드-프라이머 7종:

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 10):

5'-비오틴-GCCTCGGAAAACACCTTGGGGCT-3'

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 11):

5'-비오틴-TGACCGAAGCCATGGCGCCGACC-3'

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 12):

5'-비오틴-AGCCTGGCGCGGTTCTGCCTGCGC-3'

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 13):

5'-비오틴-GGCGAAAACAAGGTCAACGCCCTGACC-3'

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 14):

5'-비오틴-TGCAGGCCTACCTGAGCTGGCAGAA-3'

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 15):

5'-비오틴-CCAGTACGCGCTGAAGAACGGCCTGC-3'

5'-말단을 비오틴화한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 16):

5'-비오틴-CTGGACTTCTTCAAGCACAACCCG-3'

및 하기 5'-말단에 디니트로페닐기(DNP)를 도입한 리버스-프라이머 2종:

5'-말단에 DNP를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 17의 상보쇄):

5'-DNP-CAGCCACCAGGAGTCGGCGTGCTTG-3'

및 5'-말단에 DNP를 도입한 올리고뉴클레오티드(서열번호: 18의 상보쇄):

5'-DNP-ATGCTCTGGACATGCCCGCTGTTGG-3'

를 사용하였다.

PCR용 프라이머의 조합으로서는, 상기 서열번호: 10 내지 13의 염기서열을 지닌 포워드-프라이머 4종에 서열번호: 17의 상보쇄염기서열을 지닌 리버스-프라이머 4종류에 서열번호: 17의 상보쇄염기서열을 지닌 리버스-프라이머를 조합시킨 4종의 프라이머의 조합 및 상기 서열번호: 14 내지 16의 염기서열을 지닌 포워드-프라이머 3종에 서열번호: 18의 상보쇄염기서열을 지닌 리버스-프라이머를 조합시킨 3종의 프라이머의 조합의 합계 7종류의 조합으로 하였다.

PCR은, 시판의 효소계, 암플리탁 DNA 폴리머라제(타카라슈조사 제품)의 키트를 이용해서, 이하의 반응용액조성 및 조건에서 행하였다.

반응조건은, 반응용액을 95℃로 가열해서 5분간 유지한 후, 95℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 60초를 1사이클로 해서, 이 조건에서 30사이클의 반응을 행하고, 그 후, 72℃에서 5분간 유지하였다. 반응종료후, 반응용액 50㎕로부터 2㎕씩 개별적으로 취해서, 아가로즈겔전기영동 및 에티디움브로마이드염색을 행하여, 증폭산물의 핵산쇄의 검출을 행하였다.

그 결과, PHA합성능을 지니지 않은 기지의 2균주, 즉, 이콜라이(E. coli) JM109 및 J1(FERM BP-5352)에서는, 어떠한 증폭산물도 검출되지 않았다. 한편, PHA합성미생물에 있어서는, 상기 PCR용 프라이머가 조합된 PHA합성미생물 7종류의 어느 것에 있어서도 각각 증폭산물로서, 명료한 1본의 밴드가 확인되었다. 여기서, 상기 PHA합성미생물 4종 모두, PCR용 프라이머의 조합 7종류 각각에 대해서, 얻어진 PCR증폭산물의 단편길이는, 상호 일치하고 있고, 하기 표 2에 표시한 단편길이였다. 즉, 이 합계 7종의 프라이머조합은, 각각 4종의 PHA합성미생물에서 유래하는 PHA합성효소유전자로부터, 상호 대응하는 부분염기서열을 증폭하고 있기 때문에, PCR증폭산물은, 거의 마찬가지 증폭단편길이를 지니는 것이었다. 이상의 결과로부터, 본 실시예에 이용된 9종의 프라이머는 어느 것도, PHA합성미생물의 검출에 적용가능한 특이성을 나타내는 것이 확인되었다.

포워드-프라이머의 염기서열	리버스-프라이머의 염기서열	PCR증폭단편길이
서열번호: 10	서열번호: 17의 상보쇄	약 1.5kpb
서열번호: 11	서열번호: 17의 상보쇄	약 1.2kpb
서열번호: 12	서열번호: 17의 상보쇄	약 0.85kpb
서열번호: 13	서열번호: 17의 상보쇄	약 0.6kpb
서열번호: 14	서열번호: 18의 상보쇄	약 1.2kpb
서열번호: 15	서열번호: 18의 상보쇄	약 0.75kpb
서열번호: 16	서열번호: 18의 상보쇄	약 0.2kpb

(실시예 5) PHA합성미생물의 프라이머를 이용한 검출(1)

실시예 4에 표시한 바와 같이, 본 발명의 프라이머를 이용해서 PCR법에 의해, PHA합성미생물의 염색체유전자로부터, 목적으로 하는 PHA합성효소유전자의 부분염기서열을 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로, PHA합성미생물의 검출이 가능한 것을 나타내었다. 본 실시예에서는, PHA합성미생물의 검출시, 본 발명의 부가적인 변형을 실시한 프라이머를 이용함으로써, 그 표식물 및 고상 담체와 결합가능한 부위를 이용해서, 목적의 PCR증폭산물만을 선택함으로써, 높은 검출감도를 달성한 일례를 이하에 표시한다.

실시예 4와 마찬가지로 해서, 6종류의 각종 세균으로부터 DNA를 제조하였다. 이 시료 DNA를, 시판의 효소계인 암플리탁 DNA 폴리머라제(타카라슈조사 제품)를 이용해서, 이하의 반응용액조성 및 조건에서 PCR에 제공하였다.

실시예 2에서 제조한 2종의 프라이머:

(서열번호: 10)의 비오틴화한 포워드-프라이머

5'-비오틴-GCCTCGGAAAACACCTTGGGGCT-3'

및 (서열번호: 17의 상보쇄)의 DNP변형된 리버스-프라이머:

5'-DNP-CAGCCACCAGGAGTCGGCGTGCTTG-3'

의 20pmol/㎕ 농도의 상기 2종의 프라이머를 각각 1㎕씩, 효소에 첨부한 반응완충액을 5㎕, 효소에 첨부한 dNTP혼합용액을 2㎕, 시료 DNA로서, YN2, H45, P91 및 P161균주에 대해서는 10pg를, 다른 2종의 세균에 대해서는 10ng 첨가하고, 또, 물을 첨가해서 반응용액 전체량을 50㎕로 하였다. 이들 반응용액에, 암플리탁 DNA 폴리머라제(타가라슈조사 제품)를 1유닛 가하였다.

상기 반응용액을, 95℃로 가열해서 5분간 유지한 후, 95℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 60초를 1사이클로 해서, 이 조건에서 35사이클의 반응을 행하고, 그 후, 72℃에서 5분간 유지하였다. 반응종료후, 이 반응혼합액을 스핀컬럼에 걸어, 미반응의 프라이머를 제거하였다.

스트렙토아비딘고정화 마이크로플레이트에, 0.15M NaCl 및 0.05% Tween을 함유하는 트리스-Cl완충액(pH 7.5)을 미리 100㎕ 첨가해 두고, 이것에 미반응의 프라이머를 제거한 상기 혼합액을 10㎕ 첨가하였다. 그대로, 실온에서 30분간 방치한 후, 마이크로플레이트를 상기 트리스-Cl완충액 500㎕로 3회 세정하였다. 이 조작에 의해, 마이크로플레이트표면에 고정화되어 있는 스트렙토아비딘과 프라이머에서 유래하는 비오틴에 의해, 마이크로플레이트상에 PCR증폭산물의 고정화가 행해진다.

세정후의 마이크로플레이트에, 알칼리성 포스파타제표식 항DNP항체를 상기한 트리스-Cl완충액으로 2000배로 희석한 것을 100㎕ 첨가하였다. 그대로, 실온에서 30분간 방치한 후, 상기 마이크로플레이트를 상기 트리스-Cl완충액 500㎕로 3회 세정하였다. 이 조작에 의해, 마이크로플레이트표면에 고정화되어 있는 PCR증폭산물의 프라이머에서 유래하는 디니트로페닐기(DNP)에 대해, 알칼리성 포스파타제표식 항DNP항체가 반응(결합)한다.

다음에, 이 마이크로플레이트상에, 4㎎/㎖의 농도로 1M 디에탄올아민완충액에 용해된 p-니트로페닐인산용액을 100㎕ 첨가하고, 표식효소의 알칼리성 포스파타제를 상기 기질의 p-니트로페닐인산에 작용시키기 위해, 실온에서 30분간 방치한 후, 마이크로플레이트리더를 이용해서, 효소반응생성물량을 405nm의 흡광도로 측정해서 평가하였다.

그 결과, YN2, H45, P91 및 P161의 4균주의 시료 DNA를 이용한 경우에만, 백그라운드에 비해서 중요한 흡수를 확인할 수 있었다. 즉, 프라이머에 유래하는비오틴과 프라이머에 유래하는 디니트로페닐기(DNP)를 모두 지닌 목적의 PCR증폭산물이, 마이크로플레이트상에 고착되어 있는 것을, 표식효소의 알칼리성 포스파타제에 기인하는 효소활성에 의해 검출할 수 있었다.

한편, PHA합성능을 나타내지 않는, 다른 2종의 균주에 있어서는, 백그라운드정도의 흡수를 표시하는 데 머물렀다. 따라서, 실시예 4에 있어서도 확인된 바와 같이, 목적의 PCR증폭산물은 얻어지고 있지 않았다.

본 실시예의 결과로부터, 실시예 4와 비교해서, 프라이머농도를 20pmol/㎕로 감소시키고, 또한, 시료 DNA의 양도 10ng로부터 10pg로 대폭 저감한 조건에 있어서도, 반응사이클을 증가시킴으로써, 충분히 검출가능한 PCR증폭산물이 얻어지고 있는 것으로 판명되었다. 또, 부가적인 변형을 실시한 프라이머를 이용해서, 그 표식물 및 고상 담체와 결합가능한 부위를 이용함으로써, 보다 선택성을 높게 한 결과, 충분히 높은 검출감도가 달성되고 있는 것으로 확인되었다.

(실시예 6) PHA합성미생물의 프라이머를 이용한 검출(2)

실시예 5에 표시한 바와 같이, PHA합성미생물의 검출시, 부가적인 변형을 실시한 본 발명의 프라이머를 이용함으로써, 그 표식물 및 고상 담체와 결합가능한 부위를 이용해서, 목적의 PCR증폭산물만을 선택함으로써, 높은 검출감도를 달성할 수 있다. 본 실시예에서는, 그 높은 검출감도의 결과, 본 발명의 PHA합성미생물의 검출방법은, 극히 미량의 시료에 대해서도, 높은 정확도로 검출이 가능한 것을 검증한 예를 이하에 표시한다.

실시예 4와 마찬가지로 해서, PHA합성미생물인 YN2, H45, P91 및 P161균쥬로부터 DNA를 제조하였다. 이 시료 DNA를, 시판의 효소계인 암플리탁 DNA 폴리머라제(타카라슈조사 제품)를 이용해서, 이하의 반응용액조성 및 조건에서 PCR에 제공하였다.

실시예 2에서 제조한 2종의 프라이머:

(서열번호: 10)의 비오틴화한 포워드-프라이머

5'-비오틴-GCCTCGGAAAACACCTTGGGGCT-3'

및 (서열번호: 17의 상보쇄)의 DNP변형된 리버스-프라이머:

5'-DNP-CAGCCACCAGGAGTCGGCGTGCTTG-3'

의 20pmol/㎕ 농도의 상기 2종의 프라이머를 각각 1㎕씩, 효소에 첨부한 반응완충액을 5㎕, 효소에 첨부한 dNTP혼합용액을 2㎕, 시료 DNA로서, YN2, H45, P91 및 P161균주를 각각 10pg, 1pg, 100fg 및 10fg 첨가하고, 또, 물을 첨가해서 반응용액전량을 50㎕로 하였다. 이 각 균주에 대해서, 시료 DNA의 양을 상기 4수준으로 선택한 각 4종의 반응용액에, 암플리탁 DNA 폴리머라제(타가라슈조사 제품)를 1유닛 가하였다.

반응조건은, 상기 반응용액을, 95℃로 가열해서 5분간 유지한 후, 95℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 60초를 1사이클로 해서, 이 조건에서 40사이클의 반응을 행하고, 그 후, 72℃에서 5분간 유지하였다. 반응종료후, 이 반응혼합액을 스핀컬럼에 걸어, 미반응의 프라이머를 제거하였다.

스트렙토아비딘고정화 마이크로플레이트에, 0.15M NaCl 및 0.05% Tween을 함유하는 트리스-Cl완충액(pH 7.5)을 미리 100㎕ 첨가해 두고, 이것에 상기 미반응의프라이머를 제거한 상기 혼합액을 10㎕ 첨가하였다. 그대로, 실온에서 30분간 방치한 후, 마이크로플레이트를 상기 트리스-Cl완충액 500㎕로 3회 세정하였다. 이 조작에 의해, 마이크로플레이트표면에 PCR증폭산물의 고정화가 행해진다.

세정후의 마이크로플레이트에, 알칼리성 포스파타제표식 항DNP항체를 상기한 트리스-Cl완충액으로 2000배로 희석한 것을 100㎕ 첨가하였다. 그대로, 실온에서 30분간 방치한 후, 상기 마이크로플레이트를 상기 트리스-Cl완충액 500㎕로 3회 세정하였다. 이 조작에 의해, 마이크로플레이트상에 고정화되어 있는 PCR증폭산물에 대해서, 알칼리성 포스파타제표식 항DNP항체가 반응(결합)한다.

그 결과, 시료 DNA량이 10pg, 1pg 및 100fg인 3수준에서는, 백그라운드와 비교해서 중효한 흡수를 확인할 수 있었다. 한편, 시료 DNA량이 10fg인 것에 대해서는, 그 흡수는, 백그라운드의 흡수와 비교해서, 중요하다고는 판단되지 않는 정도에 머물렀다. 또, 상기 결과는 PHA합성미생물인 YN2, H45, P91 및 P161 균주의 어느 것에 있어서도, 마찬가지였다.

본 실시예에도 표시한 바와 같이, 본 발명의 PHA합성미생물의 검출방법은, 극히 시료량이 적은 경우에 있어서도, 높은 정확도로 PHA합성미생물의 검출이 행해지는 것으로 검증되었다.

(실시예 7) PHA합성미생물의 프로브를 이용한 검출(1)

본 발명의 프로브는, PHA합성미생물의 검출에 적용가능한 특이성을 나타내는 것으로 검증되었다. 그 일례로서, 본 발명의 프로브를 이용해서, 도트플롯법에 의해, PHA합성미생물의 유전자 DNA중에 포함되는 목적으로 하는 PHA합성효소유전자의 존재를 검출한 예를 이하에 표시한다.

실시예 4와 마찬가지로 해서, PHA합성능을 지니지 않은 기지의 2균주, 즉, 이콜라이(E coli) JM109 및 J1(FERM BP-5352); PHA합성능을 지니는 4균주, 즉, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373) 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376)의 총 6종의 세균으로부터 DNA를 제조하였다. 각각의 시료 DNA를 알칼리변성한 후, 도트블롯장치(BRL)를 이용해서 1μg씩 나일론막(Tropilon-45, 트로픽사 제품)에 블롯하였다. 80℃에서 2시간 건조한 후, 나일론막을 비닐백에 놓고, 프리하이브리다이제이션용액(6×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 100μg/㎖ 변성 연어정자 DNA)을 3㎖ 첨가하고, 60℃에서 프리하이브리다이제이션을 1시간 행하였다.

이 나일론막에 대해서, 하이브리다이제이션용액으로서, 상기 프리하이브리다이제이션용액 3㎖당 실시예 3에서 제조한 비오틴표식 올리고뉴클레오티드프로브:

5'-GGCGAAAACAAGGTCAACGCCCTGACC-비오틴-3'

를 열변성후에 100ng 가한 액 3㎖를 이용해서, 60℃에서 2시간 하이브리다이제이션을 행하였다. 그 후, 니일론막을 비닐백으로부터 꺼내, 6×SSC 및 0.5% SDS용액을 이용해서, 60℃에서 5분간씩 3회 세정하였다.

상기 비오틴표식프로브의 하이브리다이제이션한 DNA의 검출은, 서던라이트(트로픽사 제품)를 이용해서, 첨부한 프로토콜에 따라, 프로브의 비오틴과 결합시킨 알칼리성 포스파타제표식 스트렙토비오틴을 표식효소알칼리성 포스파포타제와 AMPPD에 의한 화학발광법을 이용해서 행하였다.

그 결과, PHA합성미생물인 YN2, H45, P91 및 P161 균주에서 유래된 DNA를 블롯한 것에 대해서는, 극히 강한 양성의 반응을 확인할 수 있었다. 한편, PHA합성능을 지니지 않는 다른 2종의 균주에 있어서는, 양성의 반응을 검출하는 것은 불가능하였다. 따라서, 본 발명에 이용된 본 발명의 프로브는, PHA합성미생물의 검출에 적용가능한 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다.

(실시예 8) PHA합성미생물의 프로브를 이용한 검출(2)

실시예 7에 표시한 바와 같이, 본 발명의 프로브는, YN2, H45, P91 및 P161균주와 같은 PHA합성미생물의 검출에 적용가능한 특이성을 나타내는 것으로, 본 실시예는, 각종 하이브리다이제이션법에 적용할 수 있었던 것을 검증한 일례를 표시한다.

PHA합성능을 지니지 않은 기지의 2균주, 즉, 이콜라이(E coli) JM109 및 J1(FERM BP-5352); PHA합성능을 지니는 4균주, 즉, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373) 및 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376)의 총 6종의 세균을, 각각 상법에 의해 배양하였다. 배양한 균을 집균해서, 0.1M 인산나트륨완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 상기 완충액을 이용해서, 각각의 균수가 2×10⁷cells/㎖가 되도록 균현탁액을 제조하였다.

제조한 균현탁액 50㎕에, 6%의 포름알데하이드용액을 50㎕ 첨가해서, 균체를 고정하였다. 이어서, 0.1% 젤라틴 및 0.01% 크롬명반으로 피복한 슬라이드글라스에, 고정균체의 현탁액 30㎕를 적하하고, 바람건조시켰다. 이 균체시료를 고정한 슬라이드글라스를, 90%메탄올 및 3%포름알데하이드용액에 10분간 침지해서 균체의 재고정을 행한 후, 순수로 세정하였다.

상기 처리를 행한 고정균체시료를 고정한 슬라이드글라스를, 50mM NaBH₄를 함유하는 10mM 트리스-Cl완충액(pH 8.0)에 실온에서 30분간, 차광상태에서 침지하였다. 그 후, 순수로 세정하고, 바람건조시켰다.

프로브에는, 실시예 3에서 제조한 비오틴표식 올리고뉴클레오티드프로브:

5'-GGCGAAAACAAGGTCAACGCCCTGACC-비오틴-3'

에 대해서, FITC(Flouorescein isothiocyanate)표식된 스트렙토아비딘을 상기 비오틴에 대해서 미리 결합시킨 것을 이용하였다. 이 FITC표식프로브를 하이브리다이제이션용액(트리스-Cl완충액(pH 8.0), 0.75M NaCl, 5mM EDTA, 10% 황산덱스트란, 0.2% BSA 및 0.01% 폴리아데닐산)에 농도 5ng/㎕ 첨가한 액 30㎕를, 슬라이드글라스상에 적하하였다. 슬라이드글라스를 기밀성의 용기에 넣고, 45℃, 1시간의 반응을 차광상태에서 행하였다.

반응후, SET완충액(트리스-Cl완충액(pH 8.0), 0.2mM EDTA 및 30mM NaCl)으로 슬라이드글라스를 세정하고, 차광상태에서 바람건조시켰다. FITC표식 프로브의 하이브리다이제이션한 균을 검출하기 위해, 올림푸스의 낙사형 형광현미경으로 관찰을 행하여 형광의 유무를 조사하였다. 여기광원은 수은등을 사용하고, B여기에 의해 관찰을 행하였다. 현미경관찰 결과, PHA합성미생물인 YN2, H45, P91 및 P161 균주에 대해서는, 어느 균체도 형광이 관찰되었다. 한편, PHA합성능을 지니지 않은 다른 2종의 세균에서는, 형광을 관찰할 수 없었다.

본 실시예에 표시한 바와 같이, 본 발명의 프로브는, 미생물로부터 제조한 DNA시료를 이용할 경우는 물론, 그 외, 고정균체를 시료로 하는 수법에 있어서도, 충분히 목적으로 하는 PHA합성미생물의 검출에 적용가능한 특이성을 지니는 것으로 확인외었다.

이상, 본 발명의 핵산단편은, 서열번호: 1 내지 9로서 표시된 염기서열 또는 그 상보적인 염기서열, 혹은, 이들에 의거해서, 그 부분염기서열을 포함하는 것으로, 그 특정의 염기서열을 지니는 핵산단편을 프라이머 또는 프로브로서 이용하면, PHA합성미생물의 검출을 특이적으로 행하는 것이 가능하다. 따라서, 상기한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 또는 프로브를 이용하는 PHA합성미생물의 검출방법은,그 검출감도, 특이성, 또, 수순의 간편성, 신속성의 점에서 우수한 검출방법으로 된다. 이와 같이, PHA합성미생물의 검출이 효율화되면, PHA합성미생물을 이용해서 생산되는 PHA의 개발, 예를 들면, 생분해성 플라스틱 등의 분야에 있어서의 연구·개발에 큰 공헌을 하는 것이다.

<110> CANON KABUSHIKI KAISHA <120> Nucleic Acid Fragment Primer or Probe, and Method of Detecting Polyhydroxyalkanoate Synthesizing Microorganism by Using the Same <150> JP2000-095008 <151> 2000-03-30 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 1 gcctckgaaa acaccytggg sct 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 2 tgaccgargc cwtsgcsccg acc 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 3 agcctggcgc gsttctgcct gcgc 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 4 ggcgaraasa aggtcaaygc cytsacc 27 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 5 caagcayrcc gaytcctggt ggctg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 6 tgcargccta yctgrsctgg cagaa 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 7 ccagtacrys ctsaaraayg gcctgc 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 8 ctggacttct tcaagcwcaa cccg 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 9 ccaacagcgg bcayrtscag agcat 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 10 gcctcggaaa acaccttggg gct 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 11 tgaccgaagc catggcgccg acc 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 12 agcctggcgc ggttctgcct gcgc 24 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 13 ggcgaaaaca aggtcaacgc cctgacc 27 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 14 tgcaggccta cctgagctgg cagaa 25 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 15 ccagtacgcg ctgaagaacg gcctgc 26 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 16 ctggacttct tcaagcacaa cccg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 17 caagcacgcc gactcctggt ggctg 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 18 ccaacagcgg gcatgtccag agcat 25

Claims

서열번호: 1 내지 9로 표시되는 염기서열 및 상기 서열번호: 1 내지 9로 표시되는 염기서열과 상보적인 염기서열의 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산단편.
제 1항에 있어서, 상기 핵산단편의 5'말단에, 해당 핵산단편을 검출하기 위한 표식물 또는 고상담체와 결합가능한 부위로서, 비오틴잔기, 2,4-디니트로페닐기 또는 디곡시게닌잔기를 지니는 것을 특징으로 하는 핵산단편.
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폴리하이드록시알카노에이트(PHA)합성능을 지닌 유전자를 검출하는 방법에 있어서,

상기 유전자의 유무를 검출하기 위한 시료를 준비하는 공정;

상기 시료중에 청구항 제 1항 또는 제 2항에 기재된 핵산단편을 프로브로서 부가하고, 상기 유전자와의 하이브리다이제이션을 행하는 공정; 및

상기 하이브리다이제이션공정에 의해 하이브리다이즈된 핵산단편을 검출하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성능을 지닌 유전자의 검출방법.
폴리하이드록시알카노에이트(PHA)합성능을 지닌 유전자를 검출하는 방법에 있어서,

상기 유전자의 유무를 검출하기 위한 시료를 준비하는 공정;

상기 시료중에 청구항 제 1항 또는 제 2항에 기재된 핵산단편을 프라이머로서 부가하고, 상기 프라이머의 신장반응을 행하는 공정; 및

상기 신장반응에 의해 얻어진 반응물을 검출하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성능을 지닌 유전자의 검출방법.
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