JPH06279492A - オーエスキー病ウイルスｇＩＩＩ上のウイルス中和抗体を誘導し得るペプチド - Google Patents
オーエスキー病ウイルスｇＩＩＩ上のウイルス中和抗体を誘導し得るペプチドInfo
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- JPH06279492A JPH06279492A JP7141493A JP7141493A JPH06279492A JP H06279492 A JPH06279492 A JP H06279492A JP 7141493 A JP7141493 A JP 7141493A JP 7141493 A JP7141493 A JP 7141493A JP H06279492 A JPH06279492 A JP H06279492A
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- giii
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ等多くの産
業動物や愛玩動物に宿主域を持つオーエスキー病ウイル
スのｇIII 分子中のウイルス中和抗体を産性させる部位
を特定して、免疫効果に優れたサブユニットワクチンを
提供する。 【構成】 オーエスキー病のサブユニットワクチンとし
て、少なくともその一部に、Ala Pro Pro Pro Ser Val
Ser Arg Arg Lys のアミノ酸配列を有する。
業動物や愛玩動物に宿主域を持つオーエスキー病ウイル
スのｇIII 分子中のウイルス中和抗体を産性させる部位
を特定して、免疫効果に優れたサブユニットワクチンを
提供する。 【構成】 オーエスキー病のサブユニットワクチンとし
て、少なくともその一部に、Ala Pro Pro Pro Ser Val
Ser Arg Arg Lys のアミノ酸配列を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オーエスキー病ウイル
スのウイルス中和を誘導し得るペプチドに関し、詳しく
は、オーエスキー病ウイルスの感染防御に効果的な合成
ペプチドワクチンの設計あるいはリコンビナントワクチ
ンの設計に有効なペプチドに関する。
スのウイルス中和を誘導し得るペプチドに関し、詳しく
は、オーエスキー病ウイルスの感染防御に効果的な合成
ペプチドワクチンの設計あるいはリコンビナントワクチ
ンの設計に有効なペプチドに関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来の技術】オーエスキー病ウイルス
は、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ等多くの産業動物
および愛玩動物に宿主域を持つ。本ウイルスの感染が成
立した動物は致死的な経過をたどるが、ブタにおいては
発症は多くの場合一過性であり本病（オーエスキー病）
に耐過したブタは、ウイルスの運搬体（キャリアー）と
なり、生涯体内にウイルスを保有する。このようなブタ
では、輸送や分娩等のストレスを受けるとその体内でウ
イルスが急激に増殖し体外に排泄され他の動物への感染
源となる。このことが、本病の根絶を困難にしている大
きな要因となっている。産業的には、ブタにおけるオー
エスキー病の被害が最も大きく、その対策は重要な問題
となっている。
は、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ等多くの産業動物
および愛玩動物に宿主域を持つ。本ウイルスの感染が成
立した動物は致死的な経過をたどるが、ブタにおいては
発症は多くの場合一過性であり本病（オーエスキー病）
に耐過したブタは、ウイルスの運搬体（キャリアー）と
なり、生涯体内にウイルスを保有する。このようなブタ
では、輸送や分娩等のストレスを受けるとその体内でウ
イルスが急激に増殖し体外に排泄され他の動物への感染
源となる。このことが、本病の根絶を困難にしている大
きな要因となっている。産業的には、ブタにおけるオー
エスキー病の被害が最も大きく、その対策は重要な問題
となっている。
【０００３】ブタの本病に対する感受性は、年齢によっ
て異なる。本ウイルスに感染した哺乳豚および弱齢豚
は、死亡あるいは成長不良となるが、成豚においては多
くの場合不顕性感染となる。また、本ウイルスは妊娠豚
に流産を引き起こす。よって弱齢豚及び妊娠豚の本病か
らの保護が重要な課題である。
て異なる。本ウイルスに感染した哺乳豚および弱齢豚
は、死亡あるいは成長不良となるが、成豚においては多
くの場合不顕性感染となる。また、本ウイルスは妊娠豚
に流産を引き起こす。よって弱齢豚及び妊娠豚の本病か
らの保護が重要な課題である。
【０００４】ブタにおけるオーエスキー病の対策として
は従来感染豚を摘発して淘汰する方法がとられてきた。
しかしながら、本病の重度の汚染地帯では全ての感染豚
を淘汰することは困難であり、補助的手段としてワクチ
ンの接種が行われている。ワクチンとしては、生ワクチ
ン、不活化ワクチン、サブユニットワクチンが使用され
ている。これらのワクチンは、淘汰法との併用を可能と
するためにウイルスの構成タンパクあるいは非構成タン
パクのうちの一つあるいはそれ以上を取り除き、それら
をマーカーとしてワクチン接種によって生じた抗体（ワ
クチン抗体）と、ウイルスの野外感染によって上昇した
抗体（感染抗体）の区別ができるように工夫されてい
る。生ワクチンでは、ウイルスの増殖に必須でないタン
パクをコードする遺伝子を突然変異誘発剤の使用あるい
は遺伝子工学的手法によって欠損させ、それによってウ
イルスの弱毒化を図るとともに生ワクチンのマーカーと
している。マーカー遺伝子としては、ｇＩ、ｇIII 等が
広く用いられている。これらのワクチンの接種により本
病の発生は抑えられるかあるいは軽度に経過する。しか
しながら、ワクチンウイルス自体は体内に生涯残ること
になる。これらのウイルスはストレスによって再活性化
される可能性がある。もしも、異なったマーカーを持つ
ワクチン株が同一個体内で増殖した場合、リコンビネー
ションによって強毒株が出現する危険のあることは指摘
されるところである（Ｋａｔｚ Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．
Ｖａｃｃｉｎｅ ８：２８６−２８８，１９９０）。不
活化ワクチンは、マーカーのついた生ワクチン株を不活
化することにより得られる。これらのワクチンも発症防
御効果がありまた上記リコンビナント強毒株の出現する
可能性もないが生産コストが高くつくという欠点があ
る。サブユニットワクチンも生ワクチン株から特定のウ
イルスタンパクを精製することによって造られている。
これらのワクチンにもコストが高くつくという欠点があ
る。
は従来感染豚を摘発して淘汰する方法がとられてきた。
しかしながら、本病の重度の汚染地帯では全ての感染豚
を淘汰することは困難であり、補助的手段としてワクチ
ンの接種が行われている。ワクチンとしては、生ワクチ
ン、不活化ワクチン、サブユニットワクチンが使用され
ている。これらのワクチンは、淘汰法との併用を可能と
するためにウイルスの構成タンパクあるいは非構成タン
パクのうちの一つあるいはそれ以上を取り除き、それら
をマーカーとしてワクチン接種によって生じた抗体（ワ
クチン抗体）と、ウイルスの野外感染によって上昇した
抗体（感染抗体）の区別ができるように工夫されてい
る。生ワクチンでは、ウイルスの増殖に必須でないタン
パクをコードする遺伝子を突然変異誘発剤の使用あるい
は遺伝子工学的手法によって欠損させ、それによってウ
イルスの弱毒化を図るとともに生ワクチンのマーカーと
している。マーカー遺伝子としては、ｇＩ、ｇIII 等が
広く用いられている。これらのワクチンの接種により本
病の発生は抑えられるかあるいは軽度に経過する。しか
しながら、ワクチンウイルス自体は体内に生涯残ること
になる。これらのウイルスはストレスによって再活性化
される可能性がある。もしも、異なったマーカーを持つ
ワクチン株が同一個体内で増殖した場合、リコンビネー
ションによって強毒株が出現する危険のあることは指摘
されるところである（Ｋａｔｚ Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．
Ｖａｃｃｉｎｅ ８：２８６−２８８，１９９０）。不
活化ワクチンは、マーカーのついた生ワクチン株を不活
化することにより得られる。これらのワクチンも発症防
御効果がありまた上記リコンビナント強毒株の出現する
可能性もないが生産コストが高くつくという欠点があ
る。サブユニットワクチンも生ワクチン株から特定のウ
イルスタンパクを精製することによって造られている。
これらのワクチンにもコストが高くつくという欠点があ
る。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】サブユニットワクチ
ンのコストを落とす良い方法として特定のウイルスタン
パクの遺伝子を発現ベクターに挿入して発現させる方法
がある。発現させるウイルスタンパクの候補としてｇII
I が挙げられる。ｇIII は、ウイルスの主要な膜糖タン
パクであり、ウイルスの宿主細胞への吸着に重要な役割
を果たしていることが知られている（Ｓｃｈｒｅｕｒｓ
ａｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２２５１−２２
５７，１９８８）。また、ウイルスの感染時にブタの体
内で造られるウイルス中和抗体のうちでｇIII に対する
ものが最も重要であることも報告されている（Ｂｅｎ−
Ｐｏｒａｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．１５４：３２５
−３３４，１９８６）。ｇIII を効果的に発現させるた
めには、ｇIII を適当なタンパク、例えば免疫増強効果
のあるタンパクあるいは他のウイルスタンパクと結合さ
せて発現させることが考えられる。そのためには、ｇII
I の全長を使用することは不適当でありｇIII 分子中の
感染防御に重要な部位のみを抽出することが必要とな
る。本発明では、ｇIII 分子中の動物にウイルス中和抗
体を産性させる部位を特定することを目指した。
ンのコストを落とす良い方法として特定のウイルスタン
パクの遺伝子を発現ベクターに挿入して発現させる方法
がある。発現させるウイルスタンパクの候補としてｇII
I が挙げられる。ｇIII は、ウイルスの主要な膜糖タン
パクであり、ウイルスの宿主細胞への吸着に重要な役割
を果たしていることが知られている（Ｓｃｈｒｅｕｒｓ
ａｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２２５１−２２
５７，１９８８）。また、ウイルスの感染時にブタの体
内で造られるウイルス中和抗体のうちでｇIII に対する
ものが最も重要であることも報告されている（Ｂｅｎ−
Ｐｏｒａｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．１５４：３２５
−３３４，１９８６）。ｇIII を効果的に発現させるた
めには、ｇIII を適当なタンパク、例えば免疫増強効果
のあるタンパクあるいは他のウイルスタンパクと結合さ
せて発現させることが考えられる。そのためには、ｇII
I の全長を使用することは不適当でありｇIII 分子中の
感染防御に重要な部位のみを抽出することが必要とな
る。本発明では、ｇIII 分子中の動物にウイルス中和抗
体を産性させる部位を特定することを目指した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明者等は、オーエスキー病ウイルスインディアナ
Ｓ株よりｇIII 遺伝子をクローニングし、その全長およ
び断片を大腸菌で発現させた。これらの発現タンパクを
ウサギおよびマウスに免疫し血清中のウイルス中和抗体
価を測定した。さらに、これらの血清を発現させたｇII
I 断片で吸収することにより、ｇIII タンパク中でウサ
ギおよびマウスにウイルス中和抗体を誘導した部位を確
定することができた。この部位のＤＮＡ配列を決定する
ことにより配列番号１に示した４６個のアミノ酸中にウ
イルス中和エピトープの存在することが明かとなった。
さらに、エピトープの存在する領域を限定するために、
同領域に１８〜２０ｍｅｒのペプチド８種類および１０
ｍｅｒのペプチド４種類を合成しこれらをウサギに免疫
してその抗原性を調べると共にｍＡｂとの反応性を調べ
た。その結果、配列番号２に示した１０個のアミノ酸領
域に高い中和抗体を誘導するＢ細胞エピトープの存在す
る事が明かとなった。
に本発明者等は、オーエスキー病ウイルスインディアナ
Ｓ株よりｇIII 遺伝子をクローニングし、その全長およ
び断片を大腸菌で発現させた。これらの発現タンパクを
ウサギおよびマウスに免疫し血清中のウイルス中和抗体
価を測定した。さらに、これらの血清を発現させたｇII
I 断片で吸収することにより、ｇIII タンパク中でウサ
ギおよびマウスにウイルス中和抗体を誘導した部位を確
定することができた。この部位のＤＮＡ配列を決定する
ことにより配列番号１に示した４６個のアミノ酸中にウ
イルス中和エピトープの存在することが明かとなった。
さらに、エピトープの存在する領域を限定するために、
同領域に１８〜２０ｍｅｒのペプチド８種類および１０
ｍｅｒのペプチド４種類を合成しこれらをウサギに免疫
してその抗原性を調べると共にｍＡｂとの反応性を調べ
た。その結果、配列番号２に示した１０個のアミノ酸領
域に高い中和抗体を誘導するＢ細胞エピトープの存在す
る事が明かとなった。
【０００７】
【実施例】以下本発明を実施例に基づいてさらに詳細に
説明する。
説明する。
【０００８】１）ｇIII 遺伝子のクローニング オーエスキー病ウイルスインディアナＳ株よりＳｐｅａ
ｒ等の方法（Ｓｐｅａｒ Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．９：１４７−１５９，１９７２）に従ってウ
イルスを精製した。プロテインアーゼＫでウイルスを処
理した後、フェノールクロロフォルム処理をしてウイル
スＤＮＡを得た。オーエスキー病ウイルスベッカー株の
ｇIII 遺伝子の塩基配列（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ａ．Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：３３９−３４７，１
９８６）にしたがって、ｇIII 遺伝子の両末端に２つの
プライマー、Ｐ１ＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴ
ＣＧＣＧＣＧ、Ｐ２ＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣ
ＧＴＧＡＣＧを合成した。長いＤＮＡ断片の増幅法とし
て、ｓｅｑｕｅｎａｓｅを用いたＫｅｏｈａｖｏｎｇ等
の方法に従ってＰＣＲを実施した（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ
Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，７１：２２１−２１６，
１９８８）。増幅後のサンプルを、アガロースの電気泳
動にかけｇIII 遺伝子の長さに相当するバンドを切り出
した。常法に従ってＤＮＡを抽出、精製した後同ｇIII
ＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１８ベクターのＢａｍＨＩ
部位に挿入した（ｐＵＣｇIII ）。ｇIII 遺伝子が挿入
されていることは、両末端の塩基配列を決めることによ
って確認した。
ｒ等の方法（Ｓｐｅａｒ Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．９：１４７−１５９，１９７２）に従ってウ
イルスを精製した。プロテインアーゼＫでウイルスを処
理した後、フェノールクロロフォルム処理をしてウイル
スＤＮＡを得た。オーエスキー病ウイルスベッカー株の
ｇIII 遺伝子の塩基配列（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ａ．Ｋ．ｅ
ｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：３３９−３４７，１
９８６）にしたがって、ｇIII 遺伝子の両末端に２つの
プライマー、Ｐ１ＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴ
ＣＧＣＧＣＧ、Ｐ２ＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣ
ＧＴＧＡＣＧを合成した。長いＤＮＡ断片の増幅法とし
て、ｓｅｑｕｅｎａｓｅを用いたＫｅｏｈａｖｏｎｇ等
の方法に従ってＰＣＲを実施した（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ
Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，７１：２２１−２１６，
１９８８）。増幅後のサンプルを、アガロースの電気泳
動にかけｇIII 遺伝子の長さに相当するバンドを切り出
した。常法に従ってＤＮＡを抽出、精製した後同ｇIII
ＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１８ベクターのＢａｍＨＩ
部位に挿入した（ｐＵＣｇIII ）。ｇIII 遺伝子が挿入
されていることは、両末端の塩基配列を決めることによ
って確認した。
【０００９】２）ｇIII 遺伝子の大腸菌での発現 ｇIII タンパク上のウイルス中和抗体を誘導し得る領域
を決めるためにｇIIIタンパクの全長あるいはその断片
を大腸菌内で発現させた。発現ベクターは、プロメガ社
製のｐＧＥＭＥＸを用いた。本ベクターは、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターの支配下にラムダファージ
のｇｅｎｅ１０タンパクと融合タンパクの形で外来遺伝
子が発現されるように設計されている。ｇIII 遺伝子と
読み枠を合わせるためにベクターに以下の操作を施し
た。制限酵素ＸｈｏＩで消化しＤＮＡ合成酵素ｋｌｅｎ
ｏｗで両末端をうめた後ＤＮＡリガーゼで再環状化し
た。同ＤＮＡによって大腸菌を形質転換し、そのクロー
ンを増殖させてそこからプラスミドＤＮＡを抽出した。
そのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化後、その両末端をＢａｐ
を用いて脱リン酸化し、さらにｋｌｅｎｏｗで末端をう
めたものを以下のクローニングに用いた。
を決めるためにｇIIIタンパクの全長あるいはその断片
を大腸菌内で発現させた。発現ベクターは、プロメガ社
製のｐＧＥＭＥＸを用いた。本ベクターは、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターの支配下にラムダファージ
のｇｅｎｅ１０タンパクと融合タンパクの形で外来遺伝
子が発現されるように設計されている。ｇIII 遺伝子と
読み枠を合わせるためにベクターに以下の操作を施し
た。制限酵素ＸｈｏＩで消化しＤＮＡ合成酵素ｋｌｅｎ
ｏｗで両末端をうめた後ＤＮＡリガーゼで再環状化し
た。同ＤＮＡによって大腸菌を形質転換し、そのクロー
ンを増殖させてそこからプラスミドＤＮＡを抽出した。
そのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化後、その両末端をＢａｐ
を用いて脱リン酸化し、さらにｋｌｅｎｏｗで末端をう
めたものを以下のクローニングに用いた。
【００１０】ｇIII 遺伝子の全長は、ｐＵＣｇIII より
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切り出した。このＤＮＡ断
片の末端をｋｌｅｎｏｗ処理し、ｐＧＥＭＥＸベクター
に組み込んだ（ｐＰｇIII ＥＨ）（図１）。以下に示す
反応では、すべて末端のｋｌｅｎｏｗ処理とライゲーシ
ョン反応、大腸菌の形質転換反応を行っている。ｐＰｇ
III ＥＨを、ＨｉｎｄIII とＰｖｕIIあるいはＨｉｎｄ
III とＰｍａＣＩで消化しそれぞれｐＰｇIII ＥＰｖお
よびｐＰｇIII ＥＰｍを得た。同様に、ｐＰｇIII ＥＨ
をＨｉｎｄIII とＴｔｈ111 Ｉで消化してｐＰｇIII Ｅ
Ｔを得た。ｐＵＣｇIII をＥｃｏＲＩとＳｃａＩあるい
はＰｍａＣＩとＨｉｎｄIII で消化した断片をｐＧＥＭ
ＥＸベクターに組み込んでｐＰｇIII ＥＳｃあるいはｐ
ＰｇIIIＰｍＨを得た。ｐＵＣｇIII をＳｍａＩで消化
した断片をｐＧＥＭＥＸベクターに組み込んでｐＰｇII
I ＥＳｍを得た。ｐＰｇIII ＥＰｍをＥｃｏＲＩとＴｔ
ｈ111 Ｉで消化してｐＰｇIII ＴＰｍを得た。これらの
プラスミドＤＮＡを染色体上にｌａｃプロモーターの支
配下にＴ７ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつ大腸菌ＪＭ
１０９（ＤＥ３）株に導入した。
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII で切り出した。このＤＮＡ断
片の末端をｋｌｅｎｏｗ処理し、ｐＧＥＭＥＸベクター
に組み込んだ（ｐＰｇIII ＥＨ）（図１）。以下に示す
反応では、すべて末端のｋｌｅｎｏｗ処理とライゲーシ
ョン反応、大腸菌の形質転換反応を行っている。ｐＰｇ
III ＥＨを、ＨｉｎｄIII とＰｖｕIIあるいはＨｉｎｄ
III とＰｍａＣＩで消化しそれぞれｐＰｇIII ＥＰｖお
よびｐＰｇIII ＥＰｍを得た。同様に、ｐＰｇIII ＥＨ
をＨｉｎｄIII とＴｔｈ111 Ｉで消化してｐＰｇIII Ｅ
Ｔを得た。ｐＵＣｇIII をＥｃｏＲＩとＳｃａＩあるい
はＰｍａＣＩとＨｉｎｄIII で消化した断片をｐＧＥＭ
ＥＸベクターに組み込んでｐＰｇIII ＥＳｃあるいはｐ
ＰｇIIIＰｍＨを得た。ｐＵＣｇIII をＳｍａＩで消化
した断片をｐＧＥＭＥＸベクターに組み込んでｐＰｇII
I ＥＳｍを得た。ｐＰｇIII ＥＰｍをＥｃｏＲＩとＴｔ
ｈ111 Ｉで消化してｐＰｇIII ＴＰｍを得た。これらの
プラスミドＤＮＡを染色体上にｌａｃプロモーターの支
配下にＴ７ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつ大腸菌ＪＭ
１０９（ＤＥ３）株に導入した。
【００１１】これらのクローンについてプロメガ社のプ
ロトコールに従いｇIII とｇｅｎｅ１０の融合タンパク
を発現させた。これらのタンパクについてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥをしたところそれぞれ期待される分子量のバンドが
観察された（図２）。さらに、これらのタンパクは、ウ
エスタンブロッティング法により抗ｇIII モノクローン
抗体（図３、４）およびオーエスキー病ウイルス感染耐
過豚血清（図５）と反応することからｇIII 由来のタン
パクであることが確認された。
ロトコールに従いｇIII とｇｅｎｅ１０の融合タンパク
を発現させた。これらのタンパクについてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥをしたところそれぞれ期待される分子量のバンドが
観察された（図２）。さらに、これらのタンパクは、ウ
エスタンブロッティング法により抗ｇIII モノクローン
抗体（図３、４）およびオーエスキー病ウイルス感染耐
過豚血清（図５）と反応することからｇIII 由来のタン
パクであることが確認された。
【００１２】３）発現ｇIII タンパクによるウサギおよ
びマウスの免疫 発現されたタンパクをウサギおよびマウスに免疫してこ
れらの動物に中和抗体を誘導し得る部位を調べた。抗原
には、表１に示す７種類を以下に示すごとく菌体をリゾ
チーム処理して遠心し可溶性のタンパクを取り除いたも
のを使用した。発現したタンパクはすべてＤＯＣ、Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００等のデタージェントに不溶性だっ
た。各プラスミドを導入した大腸菌クローンを波長６０
０ｎｍの吸光度が０．４−０．５になるまで増殖させＩ
ＰＴＧを最終濃度０．５μＭとなるように加えた。さら
に４−６時間培養後軽遠心をかけて菌体を回収した。ペ
レットをリゾチームを１００μｇ／ｍｌに含むバッファ
ー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に再浮遊し３０℃で
１時間反応させた。反応物にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を
最終濃度１％となるように加え卓上遠心機で１５０００
ｒｐｍ，１０分間遠心して沈殿を回収した。沈殿をＰＢ
Ｓ（−）でさらに２回洗浄した標品を免疫原として使用
した。
びマウスの免疫 発現されたタンパクをウサギおよびマウスに免疫してこ
れらの動物に中和抗体を誘導し得る部位を調べた。抗原
には、表１に示す７種類を以下に示すごとく菌体をリゾ
チーム処理して遠心し可溶性のタンパクを取り除いたも
のを使用した。発現したタンパクはすべてＤＯＣ、Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００等のデタージェントに不溶性だっ
た。各プラスミドを導入した大腸菌クローンを波長６０
０ｎｍの吸光度が０．４−０．５になるまで増殖させＩ
ＰＴＧを最終濃度０．５μＭとなるように加えた。さら
に４−６時間培養後軽遠心をかけて菌体を回収した。ペ
レットをリゾチームを１００μｇ／ｍｌに含むバッファ
ー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に再浮遊し３０℃で
１時間反応させた。反応物にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を
最終濃度１％となるように加え卓上遠心機で１５０００
ｒｐｍ，１０分間遠心して沈殿を回収した。沈殿をＰＢ
Ｓ（−）でさらに２回洗浄した標品を免疫原として使用
した。
【００１３】免疫スケジュールは、１００μｇを等量の
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とエマルジョン
化しウサギでは皮下に、マウスでは腹腔内に２週間間隔
で３回免疫し最終免疫の１週間後に全採血した。血清中
のＥＬＩＳＡ抗体価および中和抗体価を表１に示す。中
和反応は補体を添加して行い、中和抗体価はプラック減
少法によりプラック数がコントロールの２０％以下とな
る最大希釈倍数の逆数とした。また、ＥＬＩＳＡ抗原に
は精製ウイルスを使用した。表からわかるようにアミノ
末端１１３個のアミノ酸を含むタンパクで免疫をした群
でのみ中和抗体の上昇が認められ、この領域に少なくと
も１つのウイルス中和エピトープの存在することが確認
された。また、１１４−２１２番目のアミノ酸を含むク
ローン（ｐＰｇIII ＴＰｍ）および２１３−４７９番目
のアミノ酸を含むクローンでＥＬＩＳＡ抗体が上昇して
いるにもかかわらず中和抗体の上昇が認められないこと
から、１−１１３番目のアミノ酸領域に含まれるウイル
ス中和エピトープはメジャーなものであることが推測さ
れた。
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とエマルジョン
化しウサギでは皮下に、マウスでは腹腔内に２週間間隔
で３回免疫し最終免疫の１週間後に全採血した。血清中
のＥＬＩＳＡ抗体価および中和抗体価を表１に示す。中
和反応は補体を添加して行い、中和抗体価はプラック減
少法によりプラック数がコントロールの２０％以下とな
る最大希釈倍数の逆数とした。また、ＥＬＩＳＡ抗原に
は精製ウイルスを使用した。表からわかるようにアミノ
末端１１３個のアミノ酸を含むタンパクで免疫をした群
でのみ中和抗体の上昇が認められ、この領域に少なくと
も１つのウイルス中和エピトープの存在することが確認
された。また、１１４−２１２番目のアミノ酸を含むク
ローン（ｐＰｇIII ＴＰｍ）および２１３−４７９番目
のアミノ酸を含むクローンでＥＬＩＳＡ抗体が上昇して
いるにもかかわらず中和抗体の上昇が認められないこと
から、１−１１３番目のアミノ酸領域に含まれるウイル
ス中和エピトープはメジャーなものであることが推測さ
れた。
【００１４】
【表１】
【００１５】 ４）発現ｇIII タンパクによる血清の吸収試験 上記ウイルス中和エピトープの存在領域を再確認すると
共にその領域を狭めるために血清の吸収試験を実施し
た。大腸菌の１０ｍｌ培養液に相当する発現タンパクを
９０μｌのＰＢＳ（−）に浮遊し、１０μｌの血清と混
合して室温で２時間反応させ、１５０００ｒｐｍ１０分
間遠心した上清を吸収後の血清として使用した。結果を
表２に示す。表２に示すように吸収後、吸収に使用した
抗原と同じ抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価が検出されな
くなることから、吸収は充分に行われたことが確認され
た。全長のｐＰｇIII ＥＨで免疫したマウス血清を、ｐ
ＰｇIII ＥＴで吸収すると中和抗体価は検出されなくな
る。これに対し、ｐＰｇIIIＥＳｍで吸収を試みても中
和抗体価は全く変わらない。言い替えると、全長で免疫
して上昇した中和抗体のほとんど全ては、１−１１３ア
ミノ酸の領域と反応性を持ち、しかも１−６７アミノ酸
の領域とは反応性が無い。このことよりｇIIIのメジャ
ーなウイルス中和エピトープは６８−１１３アミノ酸の
領域にあることがわかった。
共にその領域を狭めるために血清の吸収試験を実施し
た。大腸菌の１０ｍｌ培養液に相当する発現タンパクを
９０μｌのＰＢＳ（−）に浮遊し、１０μｌの血清と混
合して室温で２時間反応させ、１５０００ｒｐｍ１０分
間遠心した上清を吸収後の血清として使用した。結果を
表２に示す。表２に示すように吸収後、吸収に使用した
抗原と同じ抗原に対するＥＬＩＳＡ抗体価が検出されな
くなることから、吸収は充分に行われたことが確認され
た。全長のｐＰｇIII ＥＨで免疫したマウス血清を、ｐ
ＰｇIII ＥＴで吸収すると中和抗体価は検出されなくな
る。これに対し、ｐＰｇIIIＥＳｍで吸収を試みても中
和抗体価は全く変わらない。言い替えると、全長で免疫
して上昇した中和抗体のほとんど全ては、１−１１３ア
ミノ酸の領域と反応性を持ち、しかも１−６７アミノ酸
の領域とは反応性が無い。このことよりｇIIIのメジャ
ーなウイルス中和エピトープは６８−１１３アミノ酸の
領域にあることがわかった。
【００１６】
【表２】
【００１７】５）中和エピトープ領域をコードするＤＮ
Ａ配列の決定上記領域のインディアナＳ株におけるアミ
ノ酸配列を決めるため、同領域の塩基配列を決めた。Ｍ
１３ベクターにこの領域のＤＮＡを再クローニングしダ
イデオキシ法によりシークエンシングを実施した。その
結果、配列番号３のＤＮＡ配列が決まり、この配列より
配列番号１のアミノ酸配列が決まった。これらの配列は
以前に報告のあるベッカー株のそれとアミノ酸で１残
基、核酸で１塩基異なっていた。
Ａ配列の決定上記領域のインディアナＳ株におけるアミ
ノ酸配列を決めるため、同領域の塩基配列を決めた。Ｍ
１３ベクターにこの領域のＤＮＡを再クローニングしダ
イデオキシ法によりシークエンシングを実施した。その
結果、配列番号３のＤＮＡ配列が決まり、この配列より
配列番号１のアミノ酸配列が決まった。これらの配列は
以前に報告のあるベッカー株のそれとアミノ酸で１残
基、核酸で１塩基異なっていた。
【００１８】６）ペプチド合成 配列番号１のアミノ酸配列を含む領域に、表１に示す８
種類の１８〜２０ｍｅｒのペプチドをアプライドバイオ
システム社製のアミノ酸自動合成機４３０を用いて合成
した。さらに４種類の１０ｍｅｒのペプチドをカイロン
社製のミモトープ エピトープ スキャンニング キッ
トを用いて合成した。
種類の１８〜２０ｍｅｒのペプチドをアプライドバイオ
システム社製のアミノ酸自動合成機４３０を用いて合成
した。さらに４種類の１０ｍｅｒのペプチドをカイロン
社製のミモトープ エピトープ スキャンニング キッ
トを用いて合成した。
【００１９】７）合成ペプチドのウサギ免疫 ２０ｍｅｒのペプチド８種類に、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ
社製のキットを用いてキャリアータンパク（ＫＬＨ ｋ
ｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉ
ｎ）を結合させ、その５００ｕｇを等量のＦＣＡとエマ
ルジョン化しウサギの背部に皮下注射し、さらに２５０
ｕｇをフロイント不完全アジュバントとエマルジョン化
して１４，２８及び４８日後に追加免疫した。最終免疫
の１０日後に血液を採取し血清を分離した。これらの血
清のＥＬＩＳＡ及び中和抗体価を表４に示した。すべて
のウサギで、免疫原としたペプチドに対する抗体価は十
分に上昇していたにもかかわらず、中和抗体はＰ１とＰ
２を免疫したウサギ血清でのみ検出され、しかもその抗
体価はＰ１免疫ウサギで８倍高く、Ｐ１部分に中和抗体
を誘導する主要なエピトープの存在が明かとなった。
社製のキットを用いてキャリアータンパク（ＫＬＨ ｋ
ｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉ
ｎ）を結合させ、その５００ｕｇを等量のＦＣＡとエマ
ルジョン化しウサギの背部に皮下注射し、さらに２５０
ｕｇをフロイント不完全アジュバントとエマルジョン化
して１４，２８及び４８日後に追加免疫した。最終免疫
の１０日後に血液を採取し血清を分離した。これらの血
清のＥＬＩＳＡ及び中和抗体価を表４に示した。すべて
のウサギで、免疫原としたペプチドに対する抗体価は十
分に上昇していたにもかかわらず、中和抗体はＰ１とＰ
２を免疫したウサギ血清でのみ検出され、しかもその抗
体価はＰ１免疫ウサギで８倍高く、Ｐ１部分に中和抗体
を誘導する主要なエピトープの存在が明かとなった。
【００２０】
【表３】
【００２１】 ８）中和活性のあるｍＡｂと合成ペプチドの反応 図３に使用したｇIII の６８ー１１３ａａ（配列番号１
に示したアミノ酸領域）に反応性のある中和活性を有す
るｍＡｂ４１８との反応性を、各ペプチドを０．０５Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０ｕｇ／ｍｌに希釈して
固相化したプレートを用いてＥＬＩＳＡ法により検討し
た。図６に示す如くｍＡｂ４１８は、中和抗体を誘導し
たペプチドＰ１とのみ強く反応した。このことより、ｍ
Ａｂ４１８が認識するエピトープと中和抗体を誘導した
エピトープが一致することが示唆された。
に示したアミノ酸領域）に反応性のある中和活性を有す
るｍＡｂ４１８との反応性を、各ペプチドを０．０５Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０ｕｇ／ｍｌに希釈して
固相化したプレートを用いてＥＬＩＳＡ法により検討し
た。図６に示す如くｍＡｂ４１８は、中和抗体を誘導し
たペプチドＰ１とのみ強く反応した。このことより、ｍ
Ａｂ４１８が認識するエピトープと中和抗体を誘導した
エピトープが一致することが示唆された。
【００２２】そこで、Ｐ１ペプチド領域に１０ｍｅｒの
ペプチドを３アミノ酸ずつずらして４種類合成し（表
３）、これらのペプチドとｍＡｂ４１８の反応性をカイ
ロン社のマニュアルに準じてＥＬＩＳＡ法で調べた。ｍ
Ａｂ４１８は、ペプチドＰ１ａと強く反応した。このこ
とより、配列番号２に示したアミノ酸領域に中和抗体を
誘導するエピトープの存在する事が明かとなった。
ペプチドを３アミノ酸ずつずらして４種類合成し（表
３）、これらのペプチドとｍＡｂ４１８の反応性をカイ
ロン社のマニュアルに準じてＥＬＩＳＡ法で調べた。ｍ
Ａｂ４１８は、ペプチドＰ１ａと強く反応した。このこ
とより、配列番号２に示したアミノ酸領域に中和抗体を
誘導するエピトープの存在する事が明かとなった。
【００２３】
【表４】
【００２４】
【発明の効果】本発明によりｇIII 上のウイルス中和エ
ピトープの存在部位が明かとなった。従来ｇIII を単独
に発現させたのでは、それをワクチンとして使用しよう
とした場合その免疫効果が不十分であったが、本発明に
よりさらに効果的な発現方法の設計が可能となった。さ
らに、合成ペプチドワクチンへの応用も可能である。
ピトープの存在部位が明かとなった。従来ｇIII を単独
に発現させたのでは、それをワクチンとして使用しよう
とした場合その免疫効果が不十分であったが、本発明に
よりさらに効果的な発現方法の設計が可能となった。さ
らに、合成ペプチドワクチンへの応用も可能である。
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド フラグメントの型：中間部フラグメント 配列 Ala Pro Pro Pro Ser Val Ser Arg Arg Lys Pro Pro Arg Asn Asn 5 10 15 Asn Arg Thr Arg Val His Gly Asp Lys Ala Thr Ala His Gly Arg 20 25 30 Lys Arg Ile Val Cys Arg Glu Arg Leu Phe Ser Ala Arg Val Gly 35 40 45 Asp 配列番号：２ 配列の長さ： 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド フラグメントの型：中間部フラグメント 配列番号：３ 配列の長さ：１３８ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：オーエスキー病ウイルス（仮性狂犬病ウイル
ス） 株名：インディアナ株 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置： ＜１・・＞１３８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCC CCG CCG CCC TCG GTC TCG CGC AGG AAG CCC CCG CGG AAC AAC AAC 48 CGG ACG CGC GTC CAC GGC GAC AAG GCC ACC GCG CAC GGG CGC AAG CGC 96 ATC GTG TGC CGG GAG CGG CTG TTC TCG GCG CGG GTG GGG GAC 138 配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 起源 生物名：オーエスキー病ウイルス（仮性狂犬病ウイル
ス） 株名：インディアナ株 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置： ＜１・・＞３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCC CCG CCG CCC TCG GTC TCG CGC AGG AAG ３０
ス） 株名：インディアナ株 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置： ＜１・・＞１３８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCC CCG CCG CCC TCG GTC TCG CGC AGG AAG CCC CCG CGG AAC AAC AAC 48 CGG ACG CGC GTC CAC GGC GAC AAG GCC ACC GCG CAC GGG CGC AAG CGC 96 ATC GTG TGC CGG GAG CGG CTG TTC TCG GCG CGG GTG GGG GAC 138 配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 起源 生物名：オーエスキー病ウイルス（仮性狂犬病ウイル
ス） 株名：インディアナ株 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置： ＜１・・＞３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCC CCG CCG CCC TCG GTC TCG CGC AGG AAG ３０
【図１】発現させたｇＩＩＩ タンパクの部位とクロー
ン名を示した。上段はｇIII 遺伝子中の使用した制限酵
素地図である。図中の記号は以下の通りである。 Ｅ：ＥｃｏＲＩ Ｓｍ：ＳｍａＩ Ｔ：Ｔｔｈ111
Ｉ Ｓｃ：ＳａｃＩ Ｐｍ：ＰｍａＣＩ Ｐｖ：ＰｖｕII Ｈ：ＨｉｎｄIII
ン名を示した。上段はｇIII 遺伝子中の使用した制限酵
素地図である。図中の記号は以下の通りである。 Ｅ：ＥｃｏＲＩ Ｓｍ：ＳｍａＩ Ｔ：Ｔｔｈ111
Ｉ Ｓｃ：ＳａｃＩ Ｐｍ：ＰｍａＣＩ Ｐｖ：ＰｖｕII Ｈ：ＨｉｎｄIII
【図２】発現ｇIII タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示
した。矢頭は、発現したタンパクのバンドを示す。
した。矢頭は、発現したタンパクのバンドを示す。
【図３】発現ｇIII タンパクのウエスタンブロティング
像を示した。抗体は、６８−１１３アミノ酸領域に特異
性を持つモノクローン抗体を用いた。
像を示した。抗体は、６８−１１３アミノ酸領域に特異
性を持つモノクローン抗体を用いた。
【図４】発現ｇIII タンパクのウエスタンブロティング
像を示した。抗体は、１１４−１４７アミノ酸領域に特
異性を持つモノクローン抗体を用いた。
像を示した。抗体は、１１４−１４７アミノ酸領域に特
異性を持つモノクローン抗体を用いた。
【図５】発現ｇIII タンパクのウエスタンブロティング
像を示した。抗体は、ブタの感染耐過血清を用いた。
像を示した。抗体は、ブタの感染耐過血清を用いた。
【図６】８種類の合成ペプチドとｍＡｂ４１８のＥＬＩ
ＳＡ法での反応性を示した。
ＳＡ法での反応性を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 上田 進 埼玉県所沢市中新井３−12−19 (72)発明者 高橋 英司 東京都練馬区光が丘３−９−２−1309
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号２に示すアミノ酸配列によって
構成されることを特徴とするペプチド。 - 【請求項２】 オーエスキー病ウイルスｇIII タンパク
中の配列番号２に示すアミノ酸配列によって構成される
中和抗体を誘導し得るペプチド。 - 【請求項３】 請求項１又は２のペプチドの上流及び／
又は下流に異種タンパクが連結されていることを特徴と
するペプチド。 - 【請求項４】 請求項１のペプチドをコードし得る配列
番号４に示すＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 請求項４みおいて、ＤＮＡ配列の上流に
発現制御配列および翻訳開始シグナルを連結させ、ＤＮ
Ａ配列の下流に終止コドンを連結させたことを特徴とす
る組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項４又は５において、ＤＮＡ配列の
上流あるいは下流に異種タンパクの遺伝子あるいはその
１部分を読み枠を合わせて連結させたことを特徴とする
組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項５又は６の組換えＤＮＡにより形
質転換させた宿主細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7141493A JPH06279492A (ja) | 1993-03-30 | 1993-03-30 | オーエスキー病ウイルスｇＩＩＩ上のウイルス中和抗体を誘導し得るペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7141493A JPH06279492A (ja) | 1993-03-30 | 1993-03-30 | オーエスキー病ウイルスｇＩＩＩ上のウイルス中和抗体を誘導し得るペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06279492A true JPH06279492A (ja) | 1994-10-04 |
Family
ID=13459838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7141493A Pending JPH06279492A (ja) | 1993-03-30 | 1993-03-30 | オーエスキー病ウイルスｇＩＩＩ上のウイルス中和抗体を誘導し得るペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06279492A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE1009826A3 (fr) * | 1995-12-21 | 1997-09-02 | Solvay | Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique. |
| EP1138785A2 (en) * | 2000-03-30 | 2001-10-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Nucleic acid fragment primer or probe, and method of detecting polyhydroxyalkanoate synthesizing microorganism by using the same |
| GR1007699B (el) * | 2011-02-11 | 2012-09-19 | Ιφιγενεια Δημητριου Σιγαλα-Χαραλαμπιδου | Μεθοδος παρασκευης και συνθεση κρεμας για παναδες |
-
1993
- 1993-03-30 JP JP7141493A patent/JPH06279492A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE1009826A3 (fr) * | 1995-12-21 | 1997-09-02 | Solvay | Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique. |
| EP1138785A2 (en) * | 2000-03-30 | 2001-10-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Nucleic acid fragment primer or probe, and method of detecting polyhydroxyalkanoate synthesizing microorganism by using the same |
| EP1138785A3 (en) * | 2000-03-30 | 2004-03-10 | Canon Kabushiki Kaisha | Nucleic acid fragment primer or probe, and method of detecting polyhydroxyalkanoate synthesizing microorganism by using the same |
| GR1007699B (el) * | 2011-02-11 | 2012-09-19 | Ιφιγενεια Δημητριου Σιγαλα-Χαραλαμπιδου | Μεθοδος παρασκευης και συνθεση κρεμας για παναδες |
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