JP2007000014A

JP2007000014A - ポリエステル中ｄｎａの定量方法

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Publication number: JP2007000014A
Application number: JP2005180231A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Maruyama; 裕之丸山
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2007-01-11

Abstract

【課題】微生物生産ポリエステル中に存在するＤＮＡを検出、定量する有効な方法を提供すること。
【解決手段】ポリエステルを可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で試料ＤＮＡを抽出する工程と、上記試料ＤＮＡを支持体に固定する工程と、ポリヒドロキシアルカン酸の生産微生物と相同性のあるプローブを標識し、上記試料ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程と、上記プローブと上記試料ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション複合体の形成量を測定する工程からなる、ポリエステル中ＤＮＡの定量方法を用いてポリエステル中のＤＮＡを定量すること。
【選択図】なし。

Description

本発明はポリエステル中に含まれるポリヒドロキシアルカン酸生産微生物由来のＤＮＡの抽出方法および該ＤＮＡの定量方法に関する。

ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーとして知られており、ＰＨＡ合成能を有する微生物に関して多くの報告がなされている（非特許文献１）。これらのポリマーは生分解性を有し、熱可塑性高分子であること、また、再生可能資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合型素材として多様な産業への応用が期待されている。

ＰＨＡの生産研究の例としては、特許文献１にアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、現ラルストニア・ユートロファ）の変異株をグルコースとプロピオン酸とを炭素源として培養することによる３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ））の製造方法が開示されている。また、アエロモナス・ハイドロフィラ(Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ)を用いた培養で３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨ）とからなる共重合ポリエステル（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ））が生産されている（非特許文献２）。

また、遺伝子組換え技術を応用した生産研究も行われている。例えば、特許文献２ではアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、旧アルカリゲネス・ユートロファス）に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産している。そのほか、アエロモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子を大腸菌に導入してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産した例（非特許文献３）や、シュードモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子をシュードモナス・プチダやラルストニア・ユートロファに導入してよりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸で構成される中鎖ＰＨＡを生産した例（非特許文献４）などがある。

このような微生物生産ポリエステルを工業製品として供給する場合、従来の石油原料由来のポリエステルとは異なり、ポリエステル製品中にその生産微生物由来のＤＮＡが混入する可能性が考えられ、品質管理上そのＤＮＡ量を把握する必要が生じてきている。従来、ＤＮＡ量を測定する方法としてはジフェニルアミン反応による方法（非特許文献５）やインドール反応による方法（非特許文献６）が知られている。しかしこれらの方法は、検出感度がいずれも数μｇ／ｍｌ程度と高感度な測定法とはいえず、被検体中の測定対象物質が微量の場合は定量できないという欠点があった。また、試料を電気泳動したのち、ゲルをエチジウムブロマイド染色してトランスイルミネーターにて検出する方法や、ビオチン、酵素、ラジオアイソトープなどで標識された標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブを用い、これと標的核酸とをハイブリダイゼーション反応させ、未反応物を洗浄除去等で分離した後、その標識体から信号を検出する方法、または、ＰＣＲを応用した方法（非特許文献７参照）などによってＤＮＡを定量することができる。しかしながらこれらの方法はいずれも水溶液中のＤＮＡを測定するもので、ポリエステル中に包含されたＤＮＡの測定にはそのままでは適用できなかった。
特開昭５７−１５０３９３号公報特開平１０−１０８６８２号公報「生分解性プラスチックハンドブック」，生分解性プラスチック研究会編，（株）エヌ・ティー・エス，Ｐ１７８−１９７Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７：２４０−２４４（２０００）Ｐａｒｋ等、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２：２４８−２５４（２００１）Ｍａｔｓｕｓａｋｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：６４５９−６４６７（１９９８）Ｄｉｓｃｈｅ、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍｉｅ，８：４（１９３０）Ｃｅｒｉｏｔｔｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８：２９７−３０３（１９５２）「バイオ実験イラストレイテッド３+ 新版本当にふえるＰＣＲ」，中山広樹著，秀潤社，Ｐ１４１−１５０（１９９８）

本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、微生物生産ポリエステル中に存在するＤＮＡを高感度に検出、定量する有効な方法を提供する。

本発明者は、上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリエステルを可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で抽出することにより、ポリエステル生産微生物由来のＤＮＡを効率的に抽出することができ、該ＤＮＡを定量できることを見い出した。

即ち本発明は以下の通りである。
［１］ポリヒドロキシアルカン酸を含有する試料を可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で試料ＤＮＡを抽出する工程と、上記試料ＤＮＡを支持体に固定する工程と、当該ポリヒドロキシアルカン酸の生産微生物の有するＤＮＡと相同性のあるＤＮＡを標識してプローブを作製し上記試料ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程と、上記プローブと上記試料ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション複合体の形成量を測定する工程からなることを特徴とするポリエステル中ＤＮＡの定量方法、
［２］可溶性有機溶剤がクロロホルム、ジクロロメタンおよび１，２−ジクロロエタンのいずれかであることを特徴とする上記記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法、
［３］試料ＤＮＡを抽出する工程で、水または緩衝液にキャリアＤＮＡを添加することを特徴とする、上記記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法、
［４］ハイブリダイゼーション複合体の形成の有無を測定する方法が、ドット−ブロット法またはサザンブロット法のいずれかである、上記記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法、
［５］ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸とからなる共重合体であることを特徴とする、上記記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法、
に関する。

微生物生産ポリエステル中に存在するＤＮＡを高感度に検出、定量する有効な方法が提供できる。

本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸を含有する試料は、微生物によって生産されたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を含有するポリエステル樹脂であればどのような形態のものでもよく、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物から回収されたＰＨＡ粉末、およびそれを溶融してペレット化したものなどの原体、あるいは原体を種々の副原料と混練してシート状、フィルム状、繊維状、ビーズ状およびそれを発泡させたものなどの半加工品、或いはそれらの半加工品に成形加工などを施した最終加工品が挙げられる。

＜ＤＮＡ抽出工程＞
ポリエステルからＤＮＡを抽出する手順は、試料ポリエステルに可溶性有機溶剤を添加して溶解させた後に、水または緩衝液を添加して混合してもよいが、試料ポリエステルを溶解させる時に、水又は緩衝液を添加しておいてもよい。試料ポリエステルを溶解後、混合物全体を遠心分離にかけ、水相と有機溶剤相に分ける。水相を取り出すことによって抽出されたＤＮＡ試料が得られる。

本発明によれば、１回の分析に使用するポリエステル試料の量は０．０１ｇ〜１ｇ程度でよい。ポリエステル試料は小片化してある方が有機溶剤への溶解が容易である。

ポリエステル試料を溶解するための可溶性有機溶剤としては、ポリエステル試料を溶解し、かつ水又は緩衝液と混ざらないものであればどのような溶剤でも利用できるが、ポリエステルの溶解性が高く、水層との分離が容易である点から、クロロホルム、ジクロロメタン又は１，２−ジクロロエタンを用いることが好ましく、それらの内少なくとも１種用いることができる。。可溶性有機溶剤の添加量は、ポリエステル試料が溶解できればよく、通常はポリエステル試料の２０〜２００倍量（重量比）が好適である。

ＤＮＡを抽出するための緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液等を用いることができ、例えばＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）が好ましく用いることができる。水又は緩衝液には抽出されたＤＮＡが試験管の器壁などに吸着して失われるのを防ぐ目的でキャリアＤＮＡを添加しておくことができる。キャリアＤＮＡとしては、例えばニシンやサケの精子ＤＮＡを超音波処理したものが好適に使用できる。濃度は１〜１００μｇ／ｍｌが好ましく、より好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌである。水又は緩衝液の添加量は前記有機溶剤の添加量に対して重量換算で０．２〜５倍が好ましく、より好ましくは０．５〜１倍が適当である。

上記のようにして水相に抽出されたＤＮＡ試料を用いてポリエステル生産微生物由来のＤＮＡを定量するには、ＰＣＲ法（非特許文献７：「バイオ実験イラストレイテッド３⁺ 新版本当にふえるＰＣＲ」，中山広樹著，秀潤社，Ｐ１４１−１５０（１９９８）参照）、ハイブリダイゼーション法を用いることができるが、ＰＣＲ法は特殊な装置が必要であるのに対し、ハイブリダイゼーション法は汎用装置が使用でき、しかも簡易で安価に測定できるため好適に使用できる。

＜ＤＮＡを支持体に固定する工程＞
ハイブリダイゼーション法としては、ドット−ブロット法及びサザン−ブロット法が挙げられ、本発明ではその何れも使用ができる。何れの方法においてもＤＮＡ試料の支持体への固定は、常法に従えばよく、ドット−ブロット法ではＤＮＡ試料を支持体上に直接乗せて固定化し、サザン−ブロット法ではＤＮＡ試料をアガロースゲル中などで電気泳動し、その大きさで分離した後に支持体上に転写して固定化する。ここで支持体としてはＤＮＡのブロッティングに汎用で用いられるニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ等のフィルターが挙げられる。

＜ハイブリダイズ工程＞
まず、ポリヒドロキシアルカン酸の生産微生物の有するＤＮＡと相同性のあるＤＮＡを標識したプローブの作製について説明する。検出に用いるプローブＤＮＡは、ポリエステル生産微生物由来のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＤＮＡであればどのようなものでもよく、対象微生物の染色体ＤＮＡや対象微生物が保持するプラスミドＤＮＡに相同性のあるＤＮＡが使用できる。一例としては、対象微生物に由来するポリエステル合成酵素遺伝子に相同性のあるＤＮＡが挙げられる。プローブＤＮＡの長さは１２〜数千塩基まで任意に設定できるが、プローブＤＮＡが検出すべきＤＮＡ（標的ＤＮＡ）に完全に相補的である必要はなく、標的ＤＮＡと特異的に結合するのに有効な長さであれば、ＤＮＡ分子の一部だけが相補的であってもよい。

プローブＤＮＡの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質や、より好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることができる。

上記で作製したプローブを、前記で作製したＤＮＡ試料を固定化した支持体に適切な条件下で作用させ、ハイブリダイゼーションを行う。特異的なハイブリダイズの現象は上記したプローブの標識物質に起因する信号を従来公知の適切な手法によってモニタリングすることができる（「基礎生化学実験法第４巻核酸・遺伝子実験ＩＩ．応用編」，日本生化学会編，東京化学同人，Ｐ２６−３０（２００１）参照）。

＜ハイブリダイゼーション複合体の形成量を測定する工程＞
本発明によれば、ハイブリダイゼーションによって得られた結果に基づいてポリエステル中のＤＮＡ量を定量することができる。既知量の標的ＤＮＡを添加して得た抽出液を順次希釈した系列を作製し、ハイブリダイゼーション法による信号の強度を測定して、被験試料の信号強度と比べればよい。例えば、１ｎｇの標的ＤＮＡを添加して得た抽出液を１００倍希釈して得られた信号強度が、被験液の信号強度と同等であったとすれば、被験サンプルのポリエステル中に１０ｐｇの標的ＤＮＡが含まれていたことになる。

以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。

（実施例１）キャリアＤＮＡ濃度の検討
ポリエステルに既知量の標的ＤＮＡを添加して抽出処理を行い、ドットハイブリダイゼーション法による標的ＤＮＡの検出を行った。被験試料としては、細菌ラルストニア・ユートロファにプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３を導入して形質転換した株（Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４８２１−４８３０（１９９７）参照）を培養し、菌体から抽出、精製したＰＨＡ粉体を用いた。ガラス試験管６本に被験試料のＰＨＡ粉体を各５０ｍｇ入れ、実験Ｎｏ．１〜６とした。そのうち実験Ｎｏ．２、４、６の試験管に標的ＤＮＡとしてプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３のＴＥ溶液（１０μｇ／ｍｌ）を５μｌ添加した。実験Ｎｏ．１と２はサケ精子ＤＮＡをＴＥに溶解して超音波処理を行ったキャリアＤＮＡを１μｇ／ｍｌの濃度で含むＴＥ緩衝液を１ｍｌ添加した。実験Ｎｏ．３と４は１０μｇ／ｍｌの、実験Ｎｏ．５と６は５０μｇ／ｍｌのキャリアＤＮＡを含むＴＥ溶液をそれぞれ１ｍｌ添加した。次に、実験Ｎｏ．１〜６にそれぞれ２ｍｌのクロロホルムを加え、室温で３０分撹拌した。これらの試験管を遠心し、２層に分離した上層を分取し、抽出液を得た。

これらの抽出液および標準試料をドットブロッティング装置（アトー製）を用いてナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス製）にブロッティングした。なお、ブロッティングに用いるすべての溶液は沸騰水中で５分間熱変性させ、氷水上で急冷してからブロッティングした。標準試料としてはプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３を用い、１０ｎｇ／ｍｌＴＥ溶液から２倍段階希釈した液を各１０μｌブロッティングした。抽出液はＮｏ．１、３、５については１００μｌ、Ｎｏ．２、４、６についてはＴＥで１０倍希釈した液を１０μｌブロッティングした。その後メンブレンを８０℃で２時間加熱し、ＤＮＡを固定化した。

その後のプローブとのハイブリダイゼーション、シグナルの検出はＧｅｎｅＩｍａｇｅＲａｎｄｏｍ−ＰｒｉｍｅＬａｂｅｌｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス製）を用い、その手順書に従って行った。プローブはプラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得た、約２．４ｋｂのＥＥ３２ｄ１３断片（配列番号１）を用いた。２００ｎｇのＥＥ３２ｄ１３断片を上記のシステムを用いて５０μｌの反応液量で標識化した。５０ｎｇ分の標識化プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。シグナルの検出はＸ線フィルムに約１時間露光して行った。結果を表１に示す。表中、シグナル強度は試料のシグナルの黒化度と同等の黒化度を示す標準試料の濃度で示した。標的ＤＮＡの回収量は次式によって計算した。
（標的ＤＮＡ回収率（％））＝（シグナル強度（ｐｇ／ｄｏｔ））／（標的ＤＮＡ添加濃度（ｐｇ／ｄｏｔ））×１００
１０μｇ／ｍｌ以上のキャリアＤＮＡを用いることで、標的ＤＮＡがほぼ１００％回収されて検出できることが確認された。

（実施例２）各種ポリエステルサンプルのＤＮＡ含量の定量
ラルストニア・ユートロファを宿主とし、アエロモナス・キャビエ由来のポリエステル合成酵素遺伝子が導入された菌株によって生産された、菌株や精製ロットの異なるポリエステル１５種（Ａ〜Ｏ）を試料としてＤＮＡ含量を測定した。５０ｍｇのポリエステル試料に１０μｇ／ｍｌのキャリアＤＮＡを含むＴＥ緩衝液１ｍｌと、クロロホルム２ｍｌを加え室温で１時間撹拌した。遠心により水層を回収して抽出サンプルとした。

標準ＤＮＡはｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３を用い、５００ｐｇ分を上記と同様に抽出処理し、１０μｇ／ｍｌのキャリアＤＮＡを含むＴＥ緩衝液で段階希釈した。標準ＤＮＡ溶液およびサンプルは沸騰水中で５分間熱変性させ、氷水上で急冷した後、ドットブロッティング装置を用いてナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋上に１００μｌずつブロッティングした。メンブレンへのＤＮＡの固定は８０℃、２時間の処理で行った。

その後のプローブとのハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出は実施例１と同様にして行った。その結果、サンプルＣのみでシグナルが検出され、標準ＤＮＡ溶液との比較により、そのＤＮＡ濃度は０．６ｎｇ／ｇポリマーと見積もられた。

プラスミドｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３の構成を示した概略図。

Claims

ポリヒドロキシアルカン酸を含有する試料を可溶性有機溶剤に溶解し、水または緩衝液で試料ＤＮＡを抽出する工程と、上記試料ＤＮＡを支持体に固定する工程と、当該ポリヒドロキシアルカン酸の生産微生物の有するＤＮＡと相同性のあるＤＮＡを標識してプローブを作製し上記試料ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程と、上記プローブと上記試料ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション複合体の形成量を測定する工程からなることを特徴とするポリエステル中ＤＮＡの定量方法。
可溶性有機溶剤がクロロホルム、ジクロロメタンおよび１，２−ジクロロエタンからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法。
試料ＤＮＡを抽出する工程で、水または緩衝液にキャリアＤＮＡを添加することを特徴とする、請求項１または２に記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法。
ハイブリダイゼーション複合体の形成の有無を測定する方法が、ドット−ブロット法またはサザン−ブロット法のいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法。
ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸とからなる共重合体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のポリエステル中ＤＮＡの定量方法。