KR102593642B1

KR102593642B1 - 폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물 스크리닝용 프라이머 및 이를 이용한 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102593642B1
Application number: KR1020210102204A
Authority: KR
Inventors: 박경문; 박시형; 공유정
Original assignee: 홍익대학교세종캠퍼스산학협력단
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2023-10-25
Also published as: KR20230020624A

Abstract

본 발명의 프라이머 쌍은 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 미생물의 스크리닝용 프라이머 쌍으로서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제1프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제2프라이머를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물 스크리닝 방법은 상기 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함한다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물 스크리닝용 프라이머 및 이를 이용한 스크리닝 방법{Primer for screening of polyhydroxyalkanoate producing microorganism and screening method using the same}

본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물 스크리닝용 프라이머 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 중합효소 연쇄반응을 통해 시료로부터 폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물을 매우 효율적으로 스크리닝할 수 있으며, 특히 호염성 특징을 갖는 폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물을 스크리닝할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트 생산 미생물 스크리닝 방법에 관한 것이다.

대표적인 생분해성 바이오플라스틱인 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate, PHA)는 미생물이 탄소와 에너지를 저장하기 위해 세포 내에 과립 형태로 생성하는 하이드록시알칸산(hydroxyalkanoic acid)의 폴리에스터(polyester)이며, 석유에서 유래한 합성고분자와 물리적 특성이 유사하고 생체 적합성을 가지고 있기 때문에, 산업상 유용한 물질로서 많은 관심을 받고 있다.

3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate, 3HB), 폴리(3-하이드록시-부티레이트)[poly(3-hydroxy-butyrate), PHB] 동종중합체(homopolymer)와 같은, PHA에 대한 많은 연구가 이루어져 왔으나, 높은 생산 단가로 인해 상업화에는 성공하지 못하고 있다. 이에 보다 효율적인 PHA 생산 방법이 필요하며, 이를 위해 새로운 PHA 생산 미생물을 발굴하는 것이 필요하다.

호염성 균주는 염분이 고농도로 함유된 조건에서 성장할 수 있기 때문에, 이러한 호염성 균주를 사용하는 공정은 오염 위험을 낮출 수 있다는 장점이 있다. 따라서 PHA를 생산할 수 있는 호염성 균주를 발굴한다면, PHA 생산에 있어서 대규모 멸균에 소요되는 에너지 비용을 줄일 수 있으며, 증류수를 사용하는 방법과 같은 간단한 추출법 적용할 수 있어 결과적으로 상당한 생산 단가 저감이 가능할 것이다.

한편, 나고야 의정서의 발표에 따라 국내 기업들이 해외의 생물자원을 연구 및/또는 활용하기 위해서는 해당 국가의 허가와 협의를 통한 이익공유가 필요하게 되었다. 이에 국내 생물자원의 확보 및 활용 연구가 시급하며, PHA 생산 미생물의 발굴 및 연구 또한 시급한 실정이다.

특정 물질을 생산하는 유기체를 발굴하는 방법 중 하나로, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 방법이 있다. 이는 시료 내 유기체의 핵산에서 대상 물질과 관련된 표적 핵산을 증폭함으로써 원하는 유기체를 스크리닝하는 방법으로, 잘 사용한다면 매우 신속하고 간편하며 또한 정확한 스크리닝이 가능하다. 이에 이러한 PCR을 이용하여 효율적인 PHA 생산 미생물의 스크리닝을 가능하게 할 수 있는 방법, 특히 이를 위해 중요한 프라이머의 개발을 시도할 필요가 있다.

Riddhi Mahansaria, Jayanta Debabrata Choudhury & Joydeep Mukherjee (2015). Polymerase chain reaction-based screening method applicable universally to environmental haloarchaea and halobacteria for identifying polyhydroxyalkanoate producers among them. Extremophiles 19, 1041-1054. Dan Kucera, Iva Pernicova, Adriana Kovalcik, Martin Koller, Lucie Mullerova, Petr Sedlacek, Filip Mravec, Jana Nebesarova, Michal Kalina, Ivana Marova, Vladislav Krzyzanek, Stanislav Obruca (2018). Characterization of the promising poly(3-hydroxybutyrate) producing halophilic bacterium Halomonas halophila. Bioresource Technology, Volume 256, 552-556.

본 발명의 주된 목적은 PCR을 통해 새로운 PHA(폴리하이드록시알카노에이트) 생산 미생물을 효율적으로 스크리닝할 수 있는 프라이머를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 특히 호염성 특징을 갖는 PHA 생산 미생물을 효율적으로 스크리닝할 수 있는 프라이머를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 프라이머를 사용하여 PHA 생산 미생물을 효율적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 PHA(폴리하이드록시알카노에이트)를 생산하는 미생물의 스크리닝용 프라이머 쌍으로서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제1프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제2프라이머를 포함하는, 프라이머 쌍을 제공한다.

본 발명의 프라이머 쌍에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 3'-말단에 포함하며, 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열을 3'-말단에 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 프라이머 쌍에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR(중합효소 연쇄반응)을 수행하는 단계;를 포함하는 PHA 생산 미생물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 PHA 생산 미생물 스크리닝 방법에 있어서, 상기 PCR의 어닐링 온도는 60 내지 65℃인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, PCR을 통해 시료로부터 PHA 생산 미생물을 매우 효율적으로 스크리닝할 수 있으며, 특히 호염성 특징을 갖는 PHA 생산 미생물을 스크리닝할 수 있다.

도 1은 본 발명 프라이머의 PHA 생산 균주 스크리닝 가능성을 실험한 결과를 나타낸다. 호염성 PHA 생산 균주인 Halomonas halophila의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. phaC3, 본 발명의 프라이머를 사용한 PCR 결과; phaC1 및 phaC2, 비교예의 프라이머를 사용한 PCR 결과.
도 2 및 3은 본 발명의 프라이머를 사용한 스크리닝에서 최적 PCR 조건을 확인하기 위한 실험 결과를 나타낸다. 5종의 호염성 PHA 생산 균주의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 도 2의 AT, 어닐링 온도; 도 3의 AT, 어닐링 시간.
도 4는 다양한 환경에서 수집한 시료로부터 호염성 미생물을 배양한 결과를 나타낸다. 빨간색 원으로 표시한 콜로니를 실시예의 스크리닝 시료로 사용하였다.
도 5는 도 4의 빨간색 원으로 표시한 콜로니 시료를 대상으로 본 발명의 스크리닝을 적용한 결과를 나타낸다.

본 발명의 프라이머 쌍은 서열번호 1(5'-CCN CCN TGG ATC AAY AAG TAY TAC-3')의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제1프라이머 및 서열번호 2(5'-CCA RTG NGG CCA CCA GGA RCC YTC-3')의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제2프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 서열번호 1 및 2에서 'N'은 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C) 및 티민(thymine, T) 중 임의의 염기이고, 'Y'는 티민 또는 시토신이고, 'R'은 구아닌 또는 아데닌이다.

따라서 상기 제1프라이머는 5'-CCA CCA TGG ATC AAT AAG TAT TAC-3'의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드('N'이 아데닌이고, 'Y'가 티민인 경우), 5'-CCG CCG TGG ATC AAC AAG TAC TAC-3'의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드('N'이 구아닌이고, 'Y'가 시토신인 경우) 등 'N' 및 'Y'에 따라 도출될 수 있는 모든 형태 중 한 형태의 올리고뉴클레오타이드이거나, 도출될 수 있는 모든 형태 중 일부의 형태가 혼합된 것이거나, 도출될 수 있는 모든 형태가 혼합된 것일 수 있다. 바람직하게는 도출될 수 있는 모든 형태가 혼합된 것으로, 이에 따르면 'N' 및 'Y' 부분에 대응하는 부위가 다른 다양한 표적 핵산을 증폭할 수 있으므로, 보다 다양한 PHA 생산 미생물을 스크리닝할 수 있다.

상기 제2프라이머 또한 'R', 'N' 및 'Y'에 따라 도출될 수 있는 모든 형태 중 한 형태의 올리고뉴클레오타이드이거나, 도출될 수 있는 모든 형태 중 일부의 형태가 혼합된 것이거나, 도출될 수 있는 모든 형태가 혼합된 것일 수 있다. 바람직하게는 도출될 수 있는 모든 형태가 혼합된 것으로, 이에 따르면 'R', 'N' 및 'Y' 부분에 대응하는 부위가 다른 다양한 표적 핵산을 증폭할 수 있으므로, 보다 다양한 PHA 생산 미생물을 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 제1프라이머는 상기 서열번호 1의 염기서열을 3'-말단에 포함하며, 상기 제2프라이머는 상기 서열번호 2의 염기서열을 3'-말단에 포함한다. 예를 들어, 제1프라이머가 24개 초과의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 30개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 5'-말단의 6개 뉴클레오타이드를 제외한 3'-말단의 24개 뉴클레오타이드의 서열이 서열번호 1의 염기서열로 이루어진다. 마찬가지로, 제2프라이머가 24개 초과의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 30개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 5'-말단의 6개 뉴클레오타이드를 제외한 3'-말단의 24개 뉴클레오타이드의 서열이 서열번호 2의 염기서열로 이루어진다. 이에 따르면 증폭 과정에서 미스매치(mismatch)로 인한 오류를 줄일 수 있어, 보다 정확하게 PHA 생산 미생물을 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 제1프라이머 및 제2프라이머의 뉴클레오타이드 길이는 각각 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이, 24 내지 29개 뉴클레오타이드 길이, 24 내지 28개 뉴클레오타이드 길이, 24 내지 27개 뉴클레오타이드 길이, 24 내지 26개 뉴클레오타이드 길이, 24 내지 25개 뉴클레오타이드 길이 또는 24개 뉴클레오타이드 길이이다. 상기 제1프라이머의 뉴클레오타이드 길이와 상기 제2프라이머의 뉴클레오타이드 길이는 서로 같거나 다를 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진다. 즉, 상기 제1프라이머는 추가되는 염기서열 없이 그 염기서열이 서열번호 1의 염기서열 만으로 이루어지는 24개 뉴클레오타이드 길이의 형태이고, 상기 제2프라이머는 추가되는 염기서열 없이 그 염기서열이 서열번호 2의 염기서열 만으로 이루어지는 24개 뉴클레오타이드 길이의 형태이다. 이러한 형태인 경우, 증폭 과정에서 미스매치로 인한 오류를 줄이고 표적 핵산에 대한 특이성을 높일 수 있어, 보다 정확하게 PHA 생산 미생물을 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 표지물질로 표시된 것일 수 있다. 예를 들어, 검출의 용이성을 위해 검출용 표지물질로 표시된 것일 수 있다.

본 발명의 PHA 생산 미생물 스크리닝 방법은 상기와 같은 프라이머 쌍을 사용하여 PCR(중합효소 연쇄반응)을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때의 PCR 주형은 임의의 시료로부터의 핵산이다.

상기 PCR을 수행하는 단계는 PCR에 통상적으로 사용되는 시약(예를 들어 본 발명의 프라이머를 포함하여, 중합효소(polymerase), dNTP, 완충제 등) 및 장치(thermal cycler 등)를 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 PCR은 94 내지 96℃, 60 내지 90초의 변성(denaturation) 단계; 50 내지 65℃, 20 내지 120초의 어닐링(annealing) 단계; 70 내지 74℃, 90초 내지 180초의 연장(extension) 단계;로 수행한다.

바람직하게는, 상기 PCR의 어닐링 온도를 60 내지 65℃로 수행한다. 이에 따르면 표적 핵산에 대한 보다 정확하고 효율적인 증폭이 가능하므로, 결과적으로 스크리닝 효율을 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 PCR의 어닐링 시간을 90 내지 120초로 수행한다. 이러한 조건 또한 표적 핵산에 대한 보다 정확하고 효율적인 증폭을 가능하게 하므로, 결과적으로 스크리닝 효율을 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 단계를 30 내지 35사이클로 수행한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 PHA 생산 미생물 스크리닝 방법은, 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;를 더 포함한다. 핵산의 추출은 시료로부터 핵산을 추출하는데 통상적으로 사용되는 시약, 장치 및 방법에 따라 수행할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

1. 프라이머의 PHA 생산 균주 스크리닝 가능성 확인

PHA 생산 균주(호염성)로 알려진 Halomonas halophila의 게놈 DNA를 주형으로 하고 아래 표 1의 3종의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, 각 프라이머의 사용에 따른 PHA 생산 균주 스크리닝 가능성을 비교하였다.

프라이머 명칭	서열	비고
phaC1(비교예1)	(Forward) 5‘-TGG ATC AAY AAG-3'
phaC1(비교예1)	(Reverse) 5‘-CCA CCA GGA RCC-3'
phaC2(비교예2)	(Forward) 5'-TGG ATC AAY AAG TAY TAC-3'
phaC2(비교예2)	(Reverse) 5'-CCA RTG NGG CCA CCA GGA-3'
phaC3(실시예)	(Forward) 5'-CCN CCN TGG ATC AAY AAG TAY TAC-3'	서열번호 1
phaC3(실시예)	(Reverse) 5'-CCA RTG NGG CCA CCA GGA RCC YTC-3'	서열번호 2

상기 각 프라이머의 예상 증폭산물의 크기는 900 ~ 920bp이다.

이때 표 2와 같이 어닐링(annealing) 온도 및 시간을 각각 50 ~ 65℃, 20 ~ 90초로 설정하여 PCR을 수행하였다.

PCR 조건
95℃	5분
95℃	1분	30~35사이클
50~65℃	20~90초
72℃	2분
70℃	5분

이의 결과, phaC1 및 phaC2를 사용한 PCR에서는 예상 증폭산물이 나타나지 않은 반면, phaC3를 사용한 PCR에서는 약 900bp의 예상 증폭산물이 나타났다(도 1).

2. PCR 조건 최적화

PHA 생산 균주(호염성)로 알려진 H. halophila 및 H. elongata, 및 PHA 생산 관련 유전자를 보유하는 것으로 알려진 호염성 균주인 H. alimentaria 및 H. salicampi의 게놈 DNA와, 또한 PHA 생산 여부 또는 관련 유전자 보유 여부가 알려져 있지 않으나 PHA 생산 가능성이 있다고 판단되는 H. sediminicola의 게놈 DNA를 주형으로 하고 phaC3 프라이머를 사용한 다양한 조건에서의 PCR을 수행하여, phaC3 프라이머를 사용한 스크리닝의 최적 PCR 조건을 확인하였다.

먼저, 어닐링 온도를 50 ~ 65℃로 서로 다르게 설정하고 어닐링 시간을 60초로 설정하여 PCR을 수행한 결과, 어닐링 온도가 60 ~ 65℃인 경우에 보다 효과적인 스크리닝이 가능한 것으로 나타났다(도 2).

다음으로, 어닐링 시간을 20 ~ 90초로 서로 다르게 설정하고 어닐링 온도를 65℃로 설정하여 PCR을 수행한 결과, 어닐링 시간이 90초인 경우에 보다 효과적인 스크리닝이 가능한 것으로 나타났다(도 3).

3. 프라이머를 사용한 PHA 생산 균주 스크리닝

대한민국 세종특별자치시 조치원 전통시장에서 국내산 새우젓과 황석어젓을 구입하고 광안리 해변과 해운대 해변에서 토양 및 바닷물을 확보하여, PHA 생산 균주(호염성) 스크리닝을 위한 시료로 사용하였다.

먼저, 각 시료를 Marine agar plate(add NaCl to 80g/L)에 첨가하고 37℃에서 배양하여 콜로니(colony)를 확보한 후(도 4), 각 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

추출된 각 콜로니의 게놈 DNA를 주형으로 하고 phaC3 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 PHA 생산 균주를 스크리닝하였다.

이때, 상기 표 2와 같은 PCR 조건을 사용하되, 어닐링 온도를 65℃, 어닐링 시간을 90초로 설정하였다.

이의 결과, 예상 증폭산물을 생성하는 5개의 균주가 선별되었다(도 5).

이후, 선별된 균주를 배양하고 아래의 PHA 추출, 정제 및 분석 방법을 사용하여 선별된 균주가 PHA를 생산하는지를 확인하였다.

- PHA 추출 및 정제

세포 건조물 약 40㎎에 클로로포름 2㎖, 메탄올, 황산 및 벤조산을 혼합한 용액 1㎖을 첨가하여 95℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 증류수 1㎖을 첨가하여 클로로포름 층과 메탄올 층으로 분리하고, 클로로포름 층만을 GC 분석에 사용하였다.

- PHA 분석

DB-WAX column(30m. 0.25μm, 0.25mm)을 사용하여 gas chromatography를 수행하였다. Injector 및 Detector 온도는 250℃로 유지하고, oven 온도는 8℃/min의 속도로 100℃에서 220℃까지 증가하도록 설정하였다. Poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvaleric acid), PHV content 8 mol%(Sigma Aldrich)를 표준물질로 사용하였다.

이의 결과, 표 3과 같이 선별된 5개의 균주 모두 PHA를 생산하는 것으로 나타났다.

<110> Sejong Industry-Academia Cooperation Foundation Hongik University <120> Primer for screening of polyhydroxyalkanoate producing microorganism and screening method using the same <130> ALP21016 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ccnccntgga tcaayaagta ytac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 ccartgnggc caccaggarc cytc 24

Claims

폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 Halomonas 속 미생물의 스크리닝용 프라이머 쌍으로서,
서열번호 1의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제1프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 24 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 제2프라이머를 포함하는, 프라이머 쌍.
제1항에 있어서,
상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열을 3'-말단에 포함하며, 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열을 3'-말단에 포함하는, 프라이머 쌍.
제1항에 있어서,
상기 제1프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 상기 제2프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 프라이머 쌍.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트 생산 Halomonas 속 미생물 스크리닝 방법.
제4항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄반응의 어닐링 온도는 60 내지 65℃인, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 Halomonas 속 미생물 스크리닝 방법.