KR100705774B1 - 김치 젓산균 동정용 프라이머 및 프라이머 셋 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 84 기재의 염기서열 또는 이들 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 김치 젓산균 동정용 프라이머 및 이들의 조합으로 구성되는 42개의 프라이머 셋을 개시한다.

김치, 젖산균, 프라이머

Description

김치 젓산균 동정용 프라이머 및 프라이머 셋{Primer for Classification of Lactic Acid Bacteria in Kimchi and The Primer Set}

도 1은 발명에서의 균주 동정을 위한 절차도

도 2는 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 결과 얻어진 전기영동사진들이다.

a)-A : 락토바실러스 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 플란타럼 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 프라이머 1-14(총 14개)

a), b)-B : 바이셀라 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 파르시미니스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 a) 프라이머 15, 16, b) 프라이머 17∼22(총 8개)

b)-C : 류코노스톡 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 파르시미니스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 프라이머 23∼31(총 9개)

b), c)-D : 페디오코커스 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 파르시미니스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형 태. 좌측부터 b) 프라이머 32, c) 프라이머 33∼42(총 11개)

c), d)-E : 바이셀라 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 퍼멘텀 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 c) 프라이머 15∼20, d) 프라이머 21∼22(총 14개)

d)-F : 류코노스톡 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 퍼멘텀 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 d) 프라이머 23-31(총 8개)

d). e)-G : 페디오코커스 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 퍼멘텀 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 d) primer 32∼36(총 11개)

e)-H : 바이셀라 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 샌프란시스센시스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 e) 프라이머 37∼42(총 14개)

e), f)-I : 류코노스톡 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 샌프란시스센시스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 e) 프라이머 23, 24, f) 프라이머 25∼31(총 8개)

f), g)-J : 페디오코커스 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 샌프란시스센시스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 f) 프라이머 32∼40, g) 프라이머 41, 42(총 11개)

g)-K : 바이셀라 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토 바실러스 힐가르디 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 g) 프라이머 15∼22(총 14개)

g), h)-L : 류코노스톡 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 힐가르디 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 g) 프라이머 23∼28, h) 프라이머 29∼31(총 8개)

h)-M : 페디오코커스 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 힐가르디 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 h) 프라이머 32∼42(총 11개)

h), i)-N : 류코노스톡 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 브레비스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 h) 프라이머 23, 24, i) 프라이머 25∼31(총 9개)

i)-O : 류코노스톡 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 락토바실러스 플란타럼 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 i) 프라이머 23∼31(총 9개)

j)-P : 바이셀라 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 바이셀라 김치 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 j) 프라이머 15∼22(총 8개)

j), k), l), m)-a1, b1, c1, d1 : 락토바실러스(a1), 바이셀라(b1), 류코노스톡(c1), 페디오코커스(d1) 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 엔테로코커스 플라베센스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌 측부터 프라이머 1∼42(총 42개)

m), n), o)-a2, b2, c2, d2 : 락토바실러스(a2), 바이셀라(b2), 류코노스톡(c2), 페디오코커스(d2) 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 엔테로코커스 솔리타리우스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 프라이머 1∼42(총 42개)

o), p), q), r)-a3, b3, c3, d3 : 락토바실러스(a3), 바이셀라(b3), 류코노스톡(c3), 페디오코커스(d3) 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 엔테로코커스 히래 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 프라이머 1∼42(총 42개)

r), s), t)-a4, b4, c4, d4 : 락토바실러스(a4), 바이셀라(b4), 류코노스톡(c4), 페디오코커스(d4) 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 엔테로코커스 말로도라터스 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 프라이머 1∼42(총 42개)

t), u), v), w)-a5, b5, c5, d5 : 락토바실러스(a5), 바이셀라(b5), 류코노스톡(c5), 페디오코커스(d5) 균주의 16S rRNA 상동 부분으로 만들어진 프라이머로 엔테로코커스 히래 균주의 DNA를 PCR로 증폭시킨 후에 전기영동한 형태. 좌측부터 프라이머 1∼42(총 42개)

본 발명은 특정한 단일 또는 복수의 김치젓산균과 종 특이적으로 반응하는 프라이머 및 그 조합에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 84 기재의 염기서열 또는 이들 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들의 조합으로 구성되는 42개의 프라이머 셋(set)에 관한 것이다.

1990년 이후부터 김치에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 대부분이 김치제조와 김치 숙성 조건 등에 관한 연구들에 그치고 있으며, 최근 들어서 신기능성 김치 제조와 김치 발효균들에 대한 기초연구가 수행되고 있지만 이러한 연구들은 특정 발효조건에 관하여 또는 특정 미생물 그룹에 관한 연구로써 여러 환경조건과 많은 미생물들의 상호작용에 의하여 숙성되는 김치 발효공정을 종합적으로 이해하고 김치의 규격화와 상품화로의 응용연구를 수행하기에는 부족함이 있다.

김치 등의 천연 플로라(natural flora)를 갖는 생태계에서 발효를 조절하기 위해서는 유사한 형질을 가진 균주의 동적 상태를 조사하여야 한다. 가장 쉽게 할 수 있는 방법이 선택배지를 사용하여 균을 계수하는 방법이나 이러한 방법은 선택성이 한정되어 생리적 특성의 유추가 매우 부정확하다. 그래서, 젖산균의 생화학적 동정 방법을 병행하는 데, 이 경우에는 시간이 많이 소요되는 단점이 있고 또한 동정이 부정확하여 흔히 다른 균으로 동정될 수 있다. 따라서, 정밀한 균총을 조사할 때에는 16S rRNA 시퀀싱 분석 등의 유전학적 방법을 수행하여야 하고 이는 고가의 장비와 많은 시간이 소요된다.

본 발명은 상기 종래 기술이 지니는 문제에 대한 해결방안을 제시하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 종래 김치 및 절임류 등에서 많이 발견되는 젓산균의 동정에 있어서 생화학적 방법이 지니는 문제, 즉 균종 확인에 따르는 시간의 과다 소요, 및 동정의 부정확성을 극복할 수 있는 프라이머 및 프라이머 셋을 제공함에 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 제 1관점에서의 본 발명은 서열번호 1 내지 84 기재의 염기서열 또는 이들 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 김치 젓산균 동정용 프라이머를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 염기서열은 바람직하게는 상기 프라이머 서열의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 김치 젓산균 동정용 프라이머를 제공한다.

또한, 제 2관점에서의 본 발명은 서열번호 1과 2(제1프라이머셋), 3과 4(제2프라이머셋), 5과 6(제3프라이머셋), 7과 8(제4프라이머셋), 9과 10(제5프라이머셋), 11과 12(제6프라이머셋), 13과 14(제7프라이머셋), 15과 16(제8프라이머셋), 17과 18(제9프라이머셋), 19과 20(제10프라이머셋), 21과 22(제11프라이머셋), 23과 24(제12프라이머셋), 25과 26(제13프라이머셋), 27과 28(제14프라이머셋), 29과 30(제15프라이머셋), 31과 32(제16프라이머셋), 33과 34(제17프라이머셋), 35과 36(제18프라이머셋), 37과 38(제19프라이머셋), 39과 40(제20프라이머셋), 41과 42(제21프라이머셋), 43과 44(제22프라이머셋), 45과 46(제23프라이머셋), 47과 48(제24프라이머셋), 49과 50(제25프라이머셋), 51과 52(제26프라이머셋), 53과 54(제27프라이머셋), 55과 56(제28프라이머셋), 57과 58(제29프라이머셋), 59과 60(제30프라이머셋), 61과 62(제31프라이머셋), 63과 64(제32프라이머셋), 65과 66(제33프라이머셋), 67과 68(제34프라이머셋), 69과 70(제35프라이머셋), 71과 72(제36프라이머셋), 73과 74(제37프라이머셋), 75과 76(제38프라이머셋), 77과 78(제39프라이머셋), 79과 80(제40프라이머셋), 81과 82(제41프라이머셋), 또는 83과 84(제42프라이머셋)으로 구성되는 1쌍의 염기서열 또는 이들 각 염기서열과 상보적인 염기서열의 쌍을 포함하는 프라이머셋을 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 염기서열은 바람직하게는 프라이머셋을 구성하는 서열의 분자상에 결합하는 표식물 및/또는 고체상 담체에 결합가능한 부위가 도입된 서열임을 특징으로 하는 김치 젓산균 동정용 프라이머셋을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제 1 및 제 2의 관점에서 개시되어지는 염기서열들 중에서 선택된 염기서열 및 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 김치로부터 분리된 미지의 균의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 균을 동정하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 서열번호 1 내지 84로 기재된 염기서열은 김치로부터 분리한 특정한 젖산균에 대하여 단일 균주 또는 복수의 균주를 특이적으로 동정하는 것을 가능 하게 한다. 이들 균주는 PCR 반응에 2이상이 조합하여 사용되어질 수 있으며, 바람직하게는 상기한 바와 같이 제 1 내지 제 42의 프라이머셋의 조합으로 사용되어진다.

상기 서열번호 1 내지 84로 기재된 염기서열은 서열 중 일부가 변형되어 사용되어도 무방하다. 변형서열은 실질적으로 특정한 균주의 게놈과 혼성화(hybridization)능을 유지하는 범위 내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환되는 것을 의미한다. 또한 변형서열은 변형되기 이전의 염기서열이 특이적으로 반응하던 균주 이외의 다른 균주의 게놈과는 혼성화가 가능하지 않은 정도의 변형이어야 한다.

염기서열이 프라이머로 사용되는 경우 변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계(elongation step)에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만이 허용되어야 할 것이다.

상기 염기서열의 분자상에 결합하는 표식물(marker)은 방사선 물질 또는 비방사선 물질의 어느 것도 포함될 수 있다. 방사선 물질은 예를 들면, 인산에스테르 부분에 방사선 동위체를 포함하는 것일 수 있다. 비방사선 표식물의 예로는 로다민, 플로오로세인 및 이들 유도체 등의 형광물질 등일 수 있다. 또한 간접적인 표식물로서 비오틴, 햅텐 등이 도입될 수도 있다.

고상 담체(solis-phase carrier)와 결합가능한 부위는 예를 들면, 샌드위치혼성화 반응 등 핵산의 특이 단편을 고상 담체에 특이적으로 결합할 경우에 이용된 다. 고상 담체는 중합효소 연쇄반응 생성물의 선택적인 검출을 더욱 효과적으로 수행할 수 있도록 하는 한 특별히 한정되지는 아니한다. 이들 고상 담체의 예로는 예로는 아가로스비드, 폴리아크릴비드, 라텍스, 마이크로타이터, 폴리스티렌볼 등의 고상담체에 프라이머 중에 도입된 결합부위를 포착가능하도록 프트렙토아비딘, 항체 등을 도입한 것 등이 있다. 상기 포식물 또는 고상담체와 결합가능한 부위는 중합연쇄반응시 신장에 방해를 주지 않기 위해 바람직하게는 5'말단부위에 도입된다.

본 발명의 프라이머의 서열과는 상이하지만 상기와 같이 염기서열에서 변형서열, 표식물, 고체상 담체 등을 사용하는 보다 구체적인 예가 특허공개 2001-0095120호에 개시되어 있다.

본 발명은 상기 개시된 염기서열 또는 이들의 조합을 프라이머로 하고, 상기 프라이머를 김치로부터 분리되어진 미지의 균주의 게놈에 부가하여 중합효소연쇄반응에 의해 얻어진 산물로부터 특정한 균주를 동정하는 방법을 포함한다.

프라이머 신장반응은 예를 들면 유전자의 PCR증폭반응에 이용되는 효소, 반응조건 등에 대해서는 각종 수법들이 개시되어 있다. 본 발명에 기본이 되는 서열번호 1 내지 84로 표시되는 염기서열은 각종 PCR법의 어느 것에 의하더라도 프라이머로서 충분한 길이 및 염기서열을 지니고 있다. 따라서, 각종 PCR의 어느 것을 적용하더라도 상기 설명한 바와 같은 부가적인 변형, 염기길이의 조정, 변이의 도입 등을 필요에 따라 실시하여 균주를 동정할 수 있다.

본 발명에 사용되는 제 1 내지 42의 프라이머는 진뱅크(Gene bank)에 있는 젖산균 16S rRNA 데이터를 이용하여 락토바실러스(Lactobacillus) 속 6종으로부터 14개 셋(set), 바이셀라(Weissella) 속 2종으로부터 8개 셋, 류코노스톡(Leuconostoc) 속 3종으로부터 9개 셋, 페디오코커스(Pediococcus) 속 2종으로부터 11개 셋 등 총 13종의 젓산균으로부터 42개의 프라이머 셋으로 확인된 것이다. 이들 각 프라이머 셋에 대한 상세한 설명은 다음과 같다.

1번 프라이머 셋

서열번호 1: 5'-aagcctgcgaaggcaag-3'

서열번호 2: 5'-aggccaccggctttg-3'

페디오코커스 펜토사세우스의 유전자 1000 bp DNA 만을 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 다른 종과 상기 균을 구별할 수 있다.

2번 프라이머 셋

서열번호 3: 5'-gcgtattagctagttggtgaggtaa-3'

서열번호 4: 5'-cttcaaacttaataaaccgcctaca-3'

락토바실러스 속 6종(330∼390 bp)과 페디오코커스 펜토사세우스(200, 890 bp), 엔테로코커스 속 솔리타리우스(410 bp)와 히래(410, 1700 bp)의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서 증폭시키지 못한 바이셀라와 류코노스톡 속과 구별할 수 있으며, 페디오코커스와 엔테로코커스 속 종의 일부와 상기 균을 구별할 수 있다.

3번 프라이머 셋

서열번호 5: 5'-ctaataccgcataacaactactttcacat-3'

서열번호 6: 5'-aacttaataaaccgcctacattctctttac-3'

락토바실러스 파르시미니스(450 bp)를 증폭시키고, 페디오코커스 액시디락티시(90 bp)와 페디오코커스 펜토사세우스(320 bp)를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 다른 종과 상기 균을 구별할 수 있다.

4번 프라이머 셋

서열번호 7: 5'-gcgtattagctagttggtgaggtaa-3'

서열번호 8: 5'-gcagttactctcatccttgttcttc-3'

락토바실러스 속 6종(120∼1200 bp), 바이셀라 속 3종(90∼150 bp)과 엔테로코커스 속 5종(180∼1400 bp), 및 페티오코커스 액시디락티시(600∼1500 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속과 페디오코커스 속 종의 일부와 상기 균을 구별할 수 있다.

5번 프라이머 셋

서열번호 9: 5'-gtcccgcggcgtatt-3'

서열번호 10: 5'-tccccaggcggaatg-3'

락토바실러스 속 6종(350∼1000 bp), 바이셀라 속 3종(600∼1100 bp)과 엔테로코커스 사카로리티커스를 제외한 엔테로코커스 속 4종(600∼1500 bp), 및 페디오코커스 액시디락티시(600∼1500 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서 증폭시키지 못한 류코노스톡 속과, 페디오코커스 속 종의 일부와 상기 균을 구별할 수 있다.

6번 프라이머 셋

서열번호 11: 5'-gagcgcaggcggttt-3'

서열번호 12: 5'-tgacgggcggtgtgt-3'

락토바실러스 속 6종(700∼1550 bp), 바이셀라 속 3종(400∼1300 bp), 페디오코커스 속 2종(310∼1500 bp), 엔테로코커스 속 5종(800∼1500 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속과 상기 균을 구별할 수 있다.

7번 프라이머 셋

서열번호 13: 5''-ggcggcgtgcctaat-3'

서열번호 14: 5'-tgacgggcggtgtgt-3'

락토바실러스 속 6종(450∼1500 bp), 바이셀라속 3종(210∼990 bp), 페디오코커스 속 2종(1000 bp), 엔테로코커스 속 5종(350∼1500 bp), 류코노스톡 락티스(1400 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

8번 프라이머 셋

서열번호 15: 5'-agcgttgtccggatttattg-3'

서열번호 16: 5'-taaggttcttcgcgttgctt-3'

락토바실러스 속 6종(400∼580 bp), 바이셀라속 3종(300∼320 bp), 페디오코커스 속 2종(510∼1250 bp), 엔테로코커스 속 5종(320∼1100 bp), 류코노스톡 락티스(390 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

9번 프라이머 셋

서열번호 17: 5'-tgatgcatagccgagttgag-3'

서열번호 18: 5'-cgagtttgcgactcgttgta-3'

락토바실러스 속 6종(670∼1220 bp), 바이셀라속 3종(800∼1000 bp), 페디오코커스 속 2종(410, 540 bp), 엔테로코커스 속 5종(900∼1000 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속과 상기 균을 구별할 수 있다.

10번 프라이머 셋

서열번호 19: 5'-gtaaagctctgttgttggagaagaa-3'

서열번호 20: 5'-ggactaccagggtatctaatcctgt-3'

락토바실러스 속 6종(350∼1050 bp), 바이셀라속 3종(200∼1200 bp), 페디오코커스 속 2종(990∼1250 bp), 엔테로코커스 속 5종(300∼420 bp), 류코노스톡 락티스(340 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

11번 프라이머 셋

서열번호 21: 5'-gcattagctagttggtaaggtaacg-3'

서열번호 22: 5'-ggactaccagggtatctaatcctgt-3'

락토바실러스 속 6종(500∼1250 bp), 바이셀라속 3종(350∼1200 bp), 페디오코커스 속 2종(420∼1150 bp), 엔테로코커스 속 5종(500∼620 bp), 류코노스톡 락티스(680 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

12번 프라이머 셋

서열번호 23: 5'-cgccgcgtgagtgaa-3'

서열번호 24: 5'-tccccaggcggaatg-3'

Lac. 샌프란시스센시스를 제외한 락토바실러스 속 5종(310∼600 bp), 바이셀라속 3종(300∼1100 bp), P. 액시디락티시(1600 bp)과 E. 히래를 제외한 엔테로코커스 속 4종(440∼1550 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속과, 락토바실러스, 페디오코커스, 엔테로코커스 속 종의 일부와 상기 균을 구별할 수 있다.

13번 프라이머 셋

서열번호 25: 5'-ggcggcgtgcctaat-3'

서열번호 26: 5'-tgacgggcggtgtgt-3'

락토바실러스 속 6종(960∼1500 bp), 바이셀라속 3종(320∼980 bp), 페디오코커스 속 2종(1050∼1100 bp), 엔테로코커스 속 5종(300∼1450 bp), 류코노스톡 락티스(1480 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

14번 프라이머 셋

서열번호 27: 5'-gcatgggtagcaaacaggat-3'

서열번호 28: 5'-cagactgcaatccgaactga-3'

락토바실러스 속 6종(450∼1650 bp), 바이셀라속 3종(450∼980 bp), 페디오코커스 속 2종(1200∼1400 bp), 엔테로코커스 속 5종(590∼1000 bp), 류코노스톡 락티스(630 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

15번 프라이머 셋

서열번호 29: 5'-tggcgaacgggtgagt-3'

서열번호 30: 5'-ccgcgggaccatctc-3'

락토바실러스 속 5종(70∼1500 bp), 바이셀라속 3종(60∼240 bp), 페디오코커스 속 2종(380∼1500 bp), 엔테로코커스 속 5종(170∼950 bp), 류코노스톡 락티스(170 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Lac. 샌프란시스센시스, Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

16번 프라이머 셋

서열번호 31: 5'-tggcgaacgggtgagt-3'

서열번호 32: 5'-cgagccgaaaccctta-3'

락토바실러스 속 5종(310∼1500 bp), 바이셀라속 3종(310∼790 bp), 페디오코커스 속 2종(270∼910 bp), 엔테로코커스 속 5종(210∼800 bp), 류코노스톡 락티스(210 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

17번 프라이머 셋

서열번호 33: 5'-gcaggggataacatttggaa-3'

서열번호 34: 5'-gccgttcctttctggtaaga-3'

락토바실러스 속 5종(350∼1700 bp), 바이셀라속 3종(400∼620 bp), 페디오코커스 속 2종(220, 1500 bp), 엔테로코커스 속 5종(310∼1700 bp) DNA를 증폭시켜 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속 및 Lac. 샌프란시스센시스와 상기 균을 구별할 수 있다.

18번 프라이머 셋

서열번호 35: 5'-gcggcgttgctccat-3'

서열번호 36: 5'-gtcccgcggtgcatt-3'

락토바실러스 속 6종(90∼1700 bp), 바이셀라속 3종(80∼200 bp), 페디오코커스 속 2종(190∼1600 bp), 엔테로코커스 속 5종(150∼1700 bp), 류코노스톡 락티스(80 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

19번 프라이머 셋

서열번호 37: 5'-gttgagctgagggctttcac-3'

서열번호 38: 5'-tgatgcatagccgagttgag-3'

락토바실러스 속 6종(110∼1500 bp), 바이셀라속 3종(310∼390 bp), 페디오코커스 속 2종(360∼1500 bp), 엔테로코커스 속 5종(210∼1100 bp), 류코노스톡 락티스(500 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

20번 프라이머 셋

서열번호 39: 5'-gttgagctgagggctttcac-3'

서열번호 40: 5'-aagtcgaacgctttgtggtt-3'

락토바실러스 속 6종(510∼1500 bp), 바이셀라속 3종(550∼600 bp), 페디오코커스 속 (210∼1500 bp), 엔테로코커스 속 4종(580∼1600 bp), 류코노스톡 락티스(200∼980 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

21번 프라이머 셋

서열번호 41: 5'-acttcagacttaaataaccgtctgc-3'

서열번호 42: 5'-ttgctacttaaaagatggttctgct-3'

락토바실러스 속 5종(490∼1500 bp), 바이셀라속 3종(380∼450 bp), 페디오코커스 속 2종(420, 770 bp), 엔테로코커스 속 3종(400∼1550 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속, E. 플라베센스 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

22번 프라이머 셋

서열번호 43: 5'-ctttcacttcagacttaaataaccgtct-3'

서열번호 44: 5'-gaaacagatgctaataccgtataacaatag-3'

락토바실러스 속 5종(290∼1500 bp), 바이셀라속 3종(410∼510 bp), 페디오코커스 속 2종(490, 910 bp), 엔테로코커스 속 3종(420∼450 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 류코노스톡 속, E. 플라베센스 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

23번 프라이머 셋

서열번호 45: 5'-gctacaatggcgtatacaacgag-3'

서열번호 46: 5'-attactagcgattccgacttcgt-3'

락토바실러스 퍼멘텀(950 bp), 페디오코커스 속 2종(1100 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서 증폭시키지 못한 바이셀라속, 류코노스톡 속 및 엔테로코커스 속과 상기 균을 구별할 수 있다.

24번 프라이머 셋

서열번호 47: 5'-cgcaacgagcgcaac-3'

서열번호 48: 5'-aggccaccggctttg-3'

락토바실러스 퍼멘텀(1050 bp)과 류코노스톡 겔리덤(800 bp)의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 다른 종과 상기 균을 구별할 수 있다.

25번 프라이머 셋

서열번호 49: 5'-gtgagtaacacgtggataacctacc-3'

서열번호 50: 5'-attacaaactcccatggtgtgac-3'

락토바실러스 퍼멘텀(800 bp)과 류코노스톡 속 3종 (100∼1200 bp) 및 페디오코커스 속 2종(500, 1150 bp)의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 바이셀라 속, 엔테로코커스 속, 일부가 증폭되었던 락토바실러스 속의 다른 종과 상기 균을 구별할 수 있다.

26번 프라이머 셋

서열번호 51: 5'-atcctttgaagcttttagagatagaagtgt-3'

서열번호 52: 5'-acgtactttaagagattagctcaccttcac-3'

락토바실러스 퍼멘텀(570 bp), 바이셀라 시바리아(100, 1100 bp)과 류코노스톡 속 3종 (200∼910 bp)의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 페디오코커스, 엔테로코커스 속 및 일부가 증폭되었던 락토바실러스, 바이셀라 속의 다른종과 상기 균을 구별할 수 있다.

27번 프라이머 셋

서열번호 53: 5'-aacagctagagtagggaatgactttagttt-3'

서열번호 54: 5'-aagagaacacttctatctctaaaagcttca-3'

락토바실러스 퍼멘텀(810 bp)과 류코노스톡 속 3종 (500∼890 bp)의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 바이셀라, 페디오코커스, 엔테로코커스 속 및 일부가 증폭되었던 락토바실러스 속의 다른 종과 상기 균을 구별할 수 있다.

28번 프라이머 셋

서열번호 55: 5'-agctagagtagggaatgactttagtttgac-3'

서열번호 56: 5'-actgagacgtactttaagagattagctcac-3'

락토바실러스 속 4종(310∼1650 bp), 류코노스톡 속 3종 (410∼890 bp), 페디오코커스 속 2종(630, 580 bp), 엔테로코커스 속 4종(300∼1550 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 바이셀라 속 및 락토바실러스 속의 L. 브 레비스, L. 플란타럼, 그리고 엔테로코커스 속의 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

29번 프라이머 셋

서열번호 57: 5'-aacagctagagtagggaatgactttagttt-3'

서열번호 58: 5'-actgagacgtactttaagagattagctcac-3'

락토바실러스 속 3종(500∼1600 bp), 류코노스톡 속 3종 (230∼900 bp), 페디오코커스 속 2종(900, 1250 bp), 엔테로코커스 속 5종(630∼1700 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 바이셀라 속 및 락토바실러스 속의 L. 브레비스, L. 퍼멘텀, L. 플란타럼과 상기 균을 구별할 수 있다.

30번 프라이머 셋

서열번호 59: 5'-ggatccgcggtgcat-3'

서열번호 60: 5'-tgcgcccattgtgga-3'

락토바실러스 속 5종(290∼1500 bp), 바이셀라 속 3종 (90∼1100 bp), 류코노스톡 속 3종 (180∼380 bp), 엔테로코커스 속 5종(700∼1500 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 페디오코커스 속 및 락토바실러스 속의 L. 퍼멘텀과 상기 균을 구별할 수 있다.

31번 프라이머 셋

서열번호 61: 5'-gataacatttggaaacagatgctaatac-3'

서열번호 62: 5'-gtatggtaccgtcaaactaaaatcattc-3'

락토바실러스 속 4종(190∼1500 bp), 류코노스톡 속 3종 (390∼490 bp), 엔테로코커스 속 5종(900∼1150 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 바이셀라 속, 페디오코커스 속 및 락토바실러스 속의 L. 브레비스, L. 퍼멘텀과 상기 균을 구별할 수 있다.

32번 프라이머 셋

서열번호 63: 5'-ggcggcgtgcctaat-3'

서열번호 64: 5'-tgacgggcggtgtgt-3'

락토바실러스 속 6종(300∼1700 bp), 바이셀라속 3종(210∼950 bp), 페디오코커스 속 2종(1250∼1450 bp), 엔테로코커스 속 5종(1050∼1250 bp), 류코노스톡 락티스(1000 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 Leu. 시트레움 및 Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

33번 프라이머 셋

서열번호 65: 5'-ccatgtgtagcggtgaaatg-3'

서열번호 66: 5'-aaggttactccaccggcttt-3'

락토바실러스 속 5종(650∼1500 bp), 바이셀라속 3종(700∼780 bp), 페디오코커스 속 2종(760∼780 bp), 엔테로코커스 속 4종(700∼1500 bp), 류코노스톡 락 티스(750 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

34번 프라이머 셋

서열번호 67: 5'-agccgacctgagagggtaat-3'

서열번호 68: 5'-aaggttactccaccggcttt-3'

락토바실러스 속 5종(135∼1200 bp), 바이셀라속 3종(920∼1100 bp), 페디오코커스 속 2종(1000∼1080 bp), 엔테로코커스 속 4종(990∼1500 bp), 류코노스톡 락티스(1050 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

35번 프라이머 셋

서열번호 69: 5'-aacacctggaaacagatgctaatac-3'

서열번호 70: 5'-taggttagcagaagatgtcaagacc-3'

락토바실러스 속 5종(700∼1500 bp), 바이셀라속 3종(800∼850 bp), 페디오코커스 속 2종(800∼1500 bp), 엔테로코커스 속 5종(850∼930 bp), 류코노스톡 락티스(780 bp) DNA를 증폭시킬 수 잇다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

36번 프라이머 셋

서열번호 71: 5'-aacacctggaaacagatgctaatac-3'

서열번호 72: 5'-ttaatgctggcaactaataataggg-3'

락토바실러스 속 5종(180∼1600 bp), 바이셀라속 3종(920∼960 bp), 페디오코커스 속 2종(960∼980 bp), 엔테로코커스 속 5종(1000∼1200 bp), 류코노스톡 락티스(950 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

37번 프라이머 셋

서열번호 73: 5'-tattagctagttggtgagataaaggctca-3'

서열번호 74: 5'-taatctcttaggttagcagaagatgtcaag-3'

락토바실러스 속 5종(620∼800 bp), 바이셀라속 3종(300∼950 bp), 페디오코커스 속 2종(790∼800 bp), 엔테로코커스 속 4종(810∼910 bp), 류코노스톡 락티스(700 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

38번 프라이머 셋

서열번호 75: 5'-gagcgcaggcggtct-3'

서열번호 76: 5'-agggttgcgctcgttg-3'

락토바실러스 속 5종(300∼1450 bp), 바이셀라속 3종(320∼1500 bp), 페디오 코커스 속 2종(550∼600 bp), 엔테로코커스 속 4종(520∼1500 bp), 류코노스톡 락티스(540 bp) DNA를 증폭시켜 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

39번 프라이머 셋

서열번호 77: 5'-gcggtcttttaagtctaatgtgaaa-3'

서열번호 78: 5'-gtgttacaaactctcatggtgtgac-3'

락토바실러스 속 5종(700∼900 bp), 바이셀라속 3종(800∼890 bp), 페디오코커스 속 2종(550∼600 bp), 엔테로코커스 속 4종(630∼760 bp), 류코노스톡 락티스(900 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 히래와 상기 균을 구별할 수 있다.

40번 프라이머 셋

서열번호 79: 5'-tgttaaagaagaacgtgggtaagag-3'

서열번호 80: 5'-gtgttacaaactctcatggtgtgac-3'

락토바실러스 속 5종(850∼1250 bp), 바이셀라속 3종(100∼1200 bp), 페디오코커스 속 2종(710∼850 bp), 엔테로코커스 속 5종(1000∼1200 bp), 류코노스톡 락티스(1000 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤과 상기 균을 구별할 수 있다.

41번 프라이머 셋

서열번호 81: 5'-cgaacttccgttaattgattatgac-3'

서열번호 82: 5'-gtgttacaaactctcatggtgtgac-3'

락토바실러스 속 6종(500∼1500 bp), 바이셀라속 3종(980∼1200 bp), 페디오코커스 속 2종(990∼1200 bp), 엔테로코커스 속 3종(1500∼1600 bp), 류코노스톡 락티스(1480 bp) DNA를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 플라베센스, E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

42번 프라이머 셋

서열번호 83: 5'-taattgattatgacgtacttgtactgattg-3'

서열번호 84: 5'-aactgagaatggttttaagagattagctt-3'

락토바실러스 속 6종(110∼1500 bp), 바이셀라속 3종(110∼720 bp), 페디오코커스 속 2종(1150∼1300 bp), 엔테로코커스 속 3종(1500 bp), 류코노스톡 락티스(1480 bp) DNA를 증폭시켜 증폭시키지 못한 L. 파르시미니스, Leu. 시트레움, Leu. 겔리덤 및 E. 히래, E. 사카로리티커스와 상기 균을 구별할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예> 프라이머의 제작 및 김치로부터 분리된 젓산균의 동정실험

본 실시예의 실험과정은 도 1에 나타낸 바와 같이 프라이머를 준비하고, 준비된 프라이머를 이용하여 젖산균주의 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행하며, PCR 수행의 결과를 전기영동하여 패턴을 분석하고 이로부터 균주를 동정하는 과정을 포함한다. 이하, 상기 과정에 대하여 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

프라이머 제작

본 실시예에서는 김치에서 많이 발견되는 류코노스톡, 락토바실러스, 바이셀라, 페디오코커스 등을 위주로 진뱅크 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 16S rRNA 시퀀스를 조사하여 유전자 상동성에 따른 유연관계로부터 균주별로 특이적인 프라이머 셋트를 표 1과 같이 디자인하고 제작하였다. 젖산균 각각의 종의 16S rRNA에만 특이적으로 PCR 반응이 일어날 수 있는 프라이머 셋은 한국 바이오니아사에 주문제작한 것을 사용하였다.

<표 1> 프라이머 셋

번호r	16S rRNA 시퀀스의 상동성 비교에 이용된 젖산균 종	프라이머 셋
1	Lactobacillus acidophilus	5'-aagcctgcgaaggcaag-3' 5'-aggccaccggctttg-3'
2	Lactobacillus farciminis	5'-gcgtattagctagttggtgaggtaa-3' 5'-cttcaaacttaataaaccgcctaca-3'
3		5'-ctaataccgcataacaactactttcacat-3' 5'-aacttaataaaccgcctacattctctttac-3'
4	Lactobacillus maltaromicus	5'-gcgtattagctagttggtgaggtaa-3' 5'-gcagttactctcatccttgttcttc-3'
5	Lactobacillus plantarum	5'-gtcccgcggcgtatt-3' 5'-tccccaggcggaatg-3'
6		5'-gagcgcaggcggttt-3' 5'-tgacgggcggtgtgt-3'
7		5''-ggcggcgtgcctaat-3' 5'-tgacgggcggtgtgt-3'
8		5'-agcgttgtccggatttattg-3' 5'-taaggttcttcgcgttgctt-3'
9	Lactobacillus reuteri	5'-tgatgcatagccgagttgag-3' 5'-cgagtttgcgactcgttgta-3'
10		5'-gtaaagctctgttgttggagaagaa-3' 5'-ggactaccagggtatctaatcctgt-3'
11		5'-gcattagctagttggtaaggtaacg-3' 5'-ggactaccagggtatctaatcctgt-3'
12	Lactobacillus sanfranciscensis	5'-cgccgcgtgagtgaa-3' 5'-tccccaggcggaatg-3'
13		5'-ggcggcgtgcctaat-3' 5'-tgacgggcggtgtgt-3'
14		5'-gcatgggtagcaaacaggat-3' 5'-cagactgcaatccgaactga-3'
15	Weissella cibaria	5'-tggcgaacgggtgagt-3' 5'-ccgcgggaccatctc-3'
16		5'-tggcgaacgggtgagt-3' 5'-cgagccgaaaccctta-3'
17		5'-gcaggggataacatttggaa-3' 5'-gccgttcctttctggtaaga-3'
18	Weissella kimchii	5'-gcggcgttgctccat-3' 5'-gtcccgcggtgcatt-3'
19		5'-gttgagctgagggctttcac-3' 5'-tgatgcatagccgagttgag-3'
20		5'-gttgagctgagggctttcac-3' 5'-aagtcgaacgctttgtggtt-3'
21		5'-acttcagacttaaataaccgtctgc-3' 5'-ttgctacttaaaagatggttctgct-3'
22		5'-ctttcacttcagacttaaataaccgtct-3' 5'-gaaacagatgctaataccgtataacaatag-3'
23	Leuconostoc lactis	5'-gctacaatggcgtatacaacgag-3' 5'-attactagcgattccgacttcgt-3'

(계속)

번호	균종	프라이머 셋
24	Leuconostoc gelidum	5'-cgcaacgagcgcaac-3' 5'-aggccaccggctttg-3'
25		5'-gtgagtaacacgtggataacctacc-3' 5'-attacaaactcccatggtgtgac-3'
26		5'-atcctttgaagcttttagagatagaagtgt-3' 5'-acgtactttaagagattagctcaccttcac-3'
27		5'-aacagctagagtagggaatgactttagttt-3' 5'-aagagaacacttctatctctaaaagcttca-3'
28		5'-agctagagtagggaatgactttagtttgac-3' 5'-actgagacgtactttaagagattagctcac-3'
29		5'-aacagctagagtagggaatgactttagttt-3' 5'-actgagacgtactttaagagattagctcac-3'
30	Leuconostoc citreum	5'-ggatccgcggtgcat-3' 5'-tgcgcccattgtgga-3'
31		5'-gataacatttggaaacagatgctaatac-3' 5'-gtatggtaccgtcaaactaaaatcattc-3'
32	Pediococcus damnosus	5'-ggcggcgtgcctaat-3' 5'-tgacgggcggtgtgt-3'
33		5'-ccatgtgtagcggtgaaatg-3' 5'-aaggttactccaccggcttt-3'
34		5'-agccgacctgagagggtaat-3' 5'-aaggttactccaccggcttt-3'
35		5'-aacacctggaaacagatgctaatac-3' 5'-taggttagcagaagatgtcaagacc-3'
36		5'-aacacctggaaacagatgctaatac-3' 5'-ttaatgctggcaactaataataggg-3'
37		5'-tattagctagttggtgagataaaggctca-3' 5'-taatctcttaggttagcagaagatgtcaag-3'
38	Pediococcus pentosaceus	5'-gagcgcaggcggtct-3' 5'-agggttgcgctcgttg-3'
39		5'-gcggtcttttaagtctaatgtgaaa-3' 5'-gtgttacaaactctcatggtgtgac-3'
40		5'-tgttaaagaagaacgtgggtaagag-3' 5'-gtgttacaaactctcatggtgtgac-3'
41		5'-cgaacttccgttaattgattatgac-3' 5'-gtgttacaaactctcatggtgtgac-3'
42		5'-taattgattatgacgtacttgtactgattg-3' 5'-aactgagaatggttttaagagattagctt-3'

젖산균 세포벽 분해 및 유전자 추출

젖산균 게놈 DNA는 게놈 DNA 정제 키트(프로메가)를 사용하여 추출한 후 버퍼에 녹여 -20℃에서 보관하며 사용하였다. 라이소자임 처리시간을 10분, 20분, … , 60분으로 나누어 추출 여부를 조사하였다. 그 결과 60분 동안 처리하였을 경우 락토바실러스의 O.D 값은 0.304, 엔테로코커스는 0.307, 바이셀라는 0.226, 페디오코커스는 0.186, 류코노스톡은 0.329로 60분 처리시에 가장 효과적으로 게놈 DNA를 추출할 수 있었다.

선정된 프라이머를 이용한 젖산균주 유전자의 PCR분석

제작한 프라이머 셋의 정확성을 분석하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 PCR을 수행하여 증폭하였다. 주형 DNA는 위에서 추출한 젖산균 표준균주의 게놈 DNA를 이용하였다.

PCR 반응은 전체 반응액을 20㎕로 하여 PCR 프리믹스(열안정 DNA 폴리머라제 1U, dNTP 200μM, MgCl₂ 1.5mM) 10㎕, 주형 DNA, 1μM의 각각의 프라이머를 혼합하여 10㎕가 되게 하여 수행하였다.

PCR 반응조건은 94℃에서 1분간 초기 열처리(preheating)한 후, 94℃에서 2분간 변성(denaturation)시키고 어닐링(annealing) 온도는 50℃로 각각 설정하여 1분간 반응시키고, 신장을 위하여 72℃에서 7분간 반응시켰다.

PCR 증폭산물(product)은 염색용액(dye solution)과 섞은 후 0.5× TAE 버퍼용액에 3％ 되도록 아가로즈를 녹여 만든 겔에 8㎕씩 로딩하여 100V로 40분간 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(Et-Br) 용액으로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)로 확인하였으며, 분자량은 분자량 래더 마크(ladder marker)로 비교하였다. 그 결과는 표 2와 도1∼23에 나타낸 바와 같다.

<표 2> 프라이머 셋에 의해 각 젓산균 종에 따라 증폭된 DNA의 분자량

(계속)

* 빈 칸은 프라이머에 따른 DNA가 증폭이 안된 경우

본 발명에 의한 프라이머 및 프라이머 셋은 종래 김치 및 절임류 등에서 많이 발견되는 젖산균의 동정에 있어서 생화학적 방법이 안고 있는 문제, 즉, 시간이 많이 소요되고 부정확한 단점을 극복하여 신속하고도 정확한 균종의 동정을 가능하게 한다.

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