JP2001518800A - 過剰なプローブを破壊するハイブリダイゼーションアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 一本鎖標的核酸（２）を検出するための方法が開示され、この方法では、標的核酸と核酸プローブ（４）との間でハイブリッドを形成し（ここで該核酸プローブは酵素試薬（６）で標識されており、酵素試薬（６）は、一本鎖核酸を加水分解するが二本鎖核酸には実質的に作用しないものであり、該ハイブリッドは、該酵素試薬の活性範囲外のｐＨ条件下で形成される）、該ｐＨを該酵素試薬の活性範囲内の値に調整し、存在する任意の一本鎖核酸を該酵素試薬によって実質的に加水分解し、そして該ハイブリッドを検出する。

Description

【発明の詳細な説明】 過剰なプローブを破壊するハイブリダイゼーションアッセイ 技術分野 この発明は核酸を検出するための方法に関する。 背景技術 核酸のハイブリダイゼーションは、試料中の標的ポリヌクレオチド配列を同定 、検出および定量するために広く用いられている技術である。この技術は、二本 鎖核酸分子の片方同士の間で相補的塩基対合がうまくいくこと、すなわち、温度 、ｐＨおよびイオン強度の適当な条件下、一本鎖核酸同士を溶液中でインキュベ ートすると相補的塩基配列が対合して二本鎖の安定なハイブリッド分子を形成す ること、によるものである。一本鎖核酸分子がそれに相補的である核酸配列と水 素結合構造を形成することができるこの能力は、組換えＤＮＡの研究において分 析手段として長く使用されてきた。 多くの場合、試料は二本鎖核酸を含んでおり、ハイブリダイセーションアッセ イに先立って、試料を変成させ、一本鎖にすることが必要である。標的配列に対 して相補的である既知の配列を有する核酸は、自動化された態様で極めて簡単に 化学合成されたものか、あるいは適当な生物から分離され、変成によって一本鎖 にされたものである。そして、当該核酸は、相補的である標的配列について試料 を探索するためのプローブとして使用される。特定の標的核酸を検出することに より、ヒト、動物および植物において細菌性、真菌性およびウイルス性疾患状況 を正確に診断することが可能となる。さらに、特定のヌクレオチド配列を探索す る能力により、ヒトの遺伝病の診断が可能となる。ハイブリダイゼーションによ り安定なハイブリッドがもたらされ、これらを検出するため多くの異なる方策が 当該技術分野で知られている。 １つの方策は標識プローブの使用を伴うものである。容易に検出可能な化学基 でプローブ核酸を標識することにより、一本鎖の形態の試料核酸を含む試験媒体 において目的とするポリヌクレオチド配列を検出することが可能である。核酸は 放射性同位体、酵素および蛍光分子で標識されてきた。高分子分析において、標 識された核酸をプローブとして使用することは、臨床学的、獣医学的および環境 学的な診断の用途に重要である。 標的核酸を検出するための初期の方法は、ニトロセルロース紙、セルロース紙 、ジアゾ化紙またはナイロン膜などの固体支持体上に標的核酸を固定化すること を必要とした。たとえば、Falkowの米国特許第４，３５８，５３５号には、標的 核酸を一本鎖にし、次いで膜の上に固定化する方法が開示されている。標的核酸 に対して相補的である標識プローブを固体支持体と接触させ、標的核酸にハイブ リダイズさせる。固体支持体を注意深く調節された温度において何度か洗浄し、 特異的に結合したプローブを除去することなく未結合のプローブおよび非特異的 に結合したプローブを除去するようにし、得られたハイブリッド中の標識の存在 が測定される。この方法の欠点は、一本鎖標的核酸を固体支持体に付与すること が容易でもなく便利でもなく、プロセス全体において核酸をニトロセルロースシ ートとともにインキュベートするのに１２時間から１５時間かかり、その後焼き 付け工程のために２時間かかることである。このことは、アッセイを遅いものに し、日常的な使用にとって魅力に欠けるものにしている。また、膜および緩衝溶 液を含む封止袋においてハイブリダイゼーションおよび洗浄工程を行なうのは面 倒である。さらに、非常に低い濃度を検出する必要がある場合、非特異的結合プ ローブに対する特異的結合プローブの比が非常に低くなり、非常に厳密な条件下 で繰返し洗浄を行なうことがしばしば要求される。これらの条件下では、特異的 に結合したプローブがかなり損失するため、アッセイの感度がしばしば信頼の低 いものになる。 これまで多くの改善が行なわれてきており、それらの多くは２つのプローブ、 すなわちレポータープローブおよび捕獲プローブを用いるサンドイッチ法を採用 する。レポータープローブは、標的配列の少なくとも一部に対して相補的である 配列を有し、検出可能な基で標識された核酸である。捕獲プローブは、標的配列 の少なくとも一部に対して相補的である配列を有するが、レポータープローブの ものとは異なり、固定化可能な基で標識された核酸である。多くの応用例におい て、この目的で特異的結合メンバー（sbm）の対が使用されてきた。 たとえば、SnitmanおよびStronpeの米国特許第５，２７３，８８２号では、 標的核酸の一部に対して相補的である捕獲プローブは、抗原または抗体で標識さ れる。この捕獲プローブと標的との間でハイブリダイゼーションを行なった後、 支持体に結合された抗体または抗原に当該溶液が導入され、該抗体または抗原は 、捕獲プローブと標的との間に形成されたハイブリッドを固定化する。洗浄工程 の後、標的核酸の、異なる領域に対して相補的であるレポータープローブが２番 目に導入され、形成された三重サンドイッチが検出される。 類似した方策がHoltke et al.の米国特許第５，３４４，７５７号に記載され ており、この方法では、レポータープローブがジゴキシンまたはジゴキシゲニン で標識され、このハプテンに対する抗体を用いてハイブリッドが捕獲される。こ の場合、捕獲プローブは用いられず、当該方法は、固定化された標的の検出、あ るいは、プライマーのうち１つが固定化されるＰＣＲ生成物の検出にアッセイが 用いられる場合に限定される。米国特許第５，３５４，６５７号においてこの方 法はさらに発展され、標的核酸と、ジゴキシンまたはジゴキシゲニンで標識され たレポータープローブとの間での溶液ハイブリダイゼーションを伴っている。こ のハイブリッドは、ターゲットの、異なる領域に対して相補的である、固体に支 持された捕獲プローブによって捕獲される。その後、ハプテンに対する検出可能 に標識された抗体が添加され、形成されたハイブリッドが検出される。 抗原またはハプテンおよび抗体以外の特異的結合メンバーが用いられてきた。 Millerの米国特許第５，３７４，５２４号には、増幅された核酸の溶液サンドイ ッチハイブリダイゼーション、捕獲および検出のための方法が記載されている。 アンプリコンは、変成され、酵素標識されたレポータープローブおよびビオチニ ル化捕獲プローブで処理される。形成されたハイブリッドは、ストレプトアビジ ン被覆二酸化クロム粒子を用いて捕獲される。 これらの方策の欠点として、２つのプローブが用いられるためコストが増加し 複雑性が増すということが挙げられる。たとえば、アッセイの度ごとに２つのプ ローブ、すなわち、捕獲プローブとして使用するためのものと、レポータープロ ーブとして使用するためのものとを、合成して標識する必要がある。さらに、標 的、捕獲プローブおよびレポータープローブのサンドイッチを形成するためにハ イブリダイゼーション条件を注意深く選択する必要がある。 捕獲プローブの使用を避ける、より簡単な方策が記載されている。Atlasおよ びSteffan（Biotechniques（1990）8:316-318）は、環境試料中の遺伝子操作さ れた微生物を検出するための溶液ハイブリダイゼーション法を開示する。この検 出方法では、環境試料の微生物群からＤＮＡを回収し、放射性標識ＲＮＡ遺伝子 プローブによって溶液中でハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダイズし ないプローブＲＮＡをヌクレアーゼ消化した後、溶液ハイブリダイゼーションに おいて形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをカラムクロマトグラフィーによ って分離し、液体シンチレーションカウントによって検出する。KungおよびNaga inisの米国特許第４，９７８，６０８号にはより扱い易い方策が開示されており 、ここでＤＮＡは親和性の高い一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を用いて配列非特異 的な態様で検出される。この方策はKemp et al.の米国特許第５，５３６，６４ ８号において発展され、ここでは二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を用いる増幅ＤＮ Ａアッセイが開示されている。この方法は、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のため のリガンドであるヌクレオチド配列を有するＰＣＲプライマーを用いる。増幅の 後、増幅された標的は、固体表面上に固定化された二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質 によって捕獲される。この方法は、捕獲プローブを使用せず、二本鎖ＤＮＡ結合 タンパク質に対するリガンドである配列を含む任意の増幅生成物を検出する。こ の方策の欠点は、その特異性のための増幅工程の精度に依存することである。 Dattaguptaの米国特許第４，９６８，６０２号には別の方法が開示されている 。反応性部位を化学的に導入するよう試験試料が修飾される。この混合物がレポ ータープローブと接触させられる。溶液相ハイブリダイゼーション工程の後、ハ イブリッドは、固定化された反応パートナーを有する表面と接触させられ、反応 パートナーは、ハイブリッドの反応性部位と反応する。そして、ハイブリダイズ されていない材料は洗い流される。この方策の欠点は、最初の反応工程が、次の ハイブリッド形成を妨げ得ることである。 ハイブリッド自体がハプテンであり、このため１つのプローブしか必要とされ ないさらなる方策が、Carricoによって開示されている。米国特許第４，７４３ ，５３５号には、レポータープローブを伴う核酸ハイブリダイゼーションアッセ イが開示されており、それによれば、抗体試薬に対するエピトープを有するハイ ブ リッドが形成される。抗体試薬は一本鎖核酸に対してＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮ Ａ−ＲＮＡハイブリッドを選択する。Carricoの米国特許第５，２００，３１３ 号にはさらに、測定すべき特定のポリヌクレオチド配列とＤＮＡ−ＲＮＡまたは ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成するよう選択された、固定化されたまたは固 定化可能なポリヌクレオチドプローブを採用する核酸ハイブリダイゼーションア ッセイが開示されている。得られるハイブリッドは抗体試薬の結合によって検出 される。抗体試薬は、好ましくは、検出可能な化学基で標識され、一本鎖試料お よびプローブ核酸の存在下でのハイブリッドの結合に関し選択的なものである。 Carrico発明の有利な特徴は、試料核酸の固定化または標識を必要とせず、ハイ ブリダイゼーションを完全に溶液中で行なうことが可能な点である。さらなる利 点は、標的が何であっても一般的な検出試薬が用いられ得ることである。 Carrico発明の鍵となる特徴は、一本鎖核酸に対し親和性がほとんどない二本 鎖ハイブリッドに特異的な抗体を使用することである。二本鎖核酸には結合する が一本鎖核酸には結合しない特異的なポリクローナル抗体の生成は、一本鎖核酸 と交差反応する抗体をポロクローナル抗血清が含み得ることにより複雑になる。 ポリクローナル抗血清はさらに、一本鎖核酸に対して自然に生じる抗体、または 免疫感作の結果として生じる、一本鎖核酸に対する抗体を含み得る。モノクロー ナル抗体法は、部分的にこれらの問題を克服し得る所望の親和性および特異性を 有する抗体を選択するための手段を提供し得る。二本鎖ＤＮＡ（米国特許第４， ６２３，６２７号）またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（Carricoの米国特許第 ４，８３３，０８４号）と選択的に結合するそのようなモノクローナル抗体は、 調製されている。しかしながら、モノクローナル抗体の生成には費用がかかり、 その親和性はポリクローナル抗体の場合よりも一般的に低い。 Carrico（米国特許第４，８３３，０８４号）によって開示されているモノク ローナル抗体は、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖、特にＤＮＡ−ＲＮＡヘテロポリマー二 本鎖に特異的であり、競合イムノアッセイによって測定される、一本鎖または二 本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に関する交差反応性は、約１：１０００未満、 好ましくは１：１０，０００未満であり、１０⁹Ｌ／モルを超えるＤＮＡ−ＲＮ Ａヘテロポリマー二本鎖への親和性を有することを特徴とする。 Chevrier他（Molecular and Cellular Probes（1993）7:137-197）は、２００ ｆｍｏｌまでの捕獲プローブがCovalink NHミクロウェル（Nunc）に付与され得 ることを報告している。したがって、Carricoによって開示されている抗体はお よそ２００ｆｍｏｌの１／１０，０００、あるいは２０ａｍｏｌの検出下限を有 するはずである。また、標識抗体と、プローブが固定化される表面との間の非特 異的結合は、バックグラウンドシグナルにも影響を及ぼす。このためcarrlcoの 方法は、シグナル増幅検出システムまたは化学発光などの感度の高い検出システ ムの範囲内にある、非常に低い濃度の標的核酸の検出には適用できない。Carric oの方策は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるもののような 、標的の増幅生成物の検出に有用性を見出している。たとえば、SorinのGEN-ETI -K（商標）といった市販のアッセイは、ストレプトアビジン−ビオチン結合およ びペルオキシダーゼで標識された二本鎖ＤＮＡに対する抗体によって、ミクロタ イタープレートに固定化されたプローブを利用する。その主な用途は、核酸の増 幅生成物のアッセイである。 交差反応性の問題を克服する１つの方策は、Hyldig-NielsonおよびPluzekの米 国特許第５，６１２，４５８号に開示されている。ここでは、ペプチド核酸（Ｐ ＮＡ）と核酸との間の複合体に対する抗体、特に核酸プローブＤＮＡまたは核酸 プローブＲＮＡハイブリッドに対する抗体を用いている。 別の方策では、使用される抗体の親和性または選択性を改善することを試みて いる。Fliss他(Applied and Environnental Microbiology(1993)59:2698-2705) は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに特異的なネズミモノクローナル抗体を開示し ており、この抗体は、ビオチニル化された遺伝子プローブとリステリア（Lyster ia）から抽出されたｒＲＮＡとから溶液中に形成されるリステリアＤＮＡ−ＲＮ Ａハイブリッドを検出するために用いられる。これはまた、AtlasおよびStefen （上記）によって用いられるエンドヌクレアーゼ消化法では、ハイブリダイズさ れていない分子から、ハイブリダイズされた分子が効率よく分離されていないこ とを教示している。注目すべきことは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに特異的な ネズミモノクローナル抗体による捕獲の前に一本鎖核酸を排除するようヌクレア ーゼによって処理すれば、アッセイの改善がもたらされるであろうこ とを彼らが教示していないことである。 要約すると、Carricoは、二本鎖核酸に特異的な抗体を利用ずる、標的核酸と 核酸プローブとの間で溶液中に形成されたハイブリッドを捕獲するための簡単な 方法を開示している。この方策の欠点は、抗体と、存在し得る任意の一本鎖核酸 との間にクロストークが生じることである。これによりアッセイの感度が制限さ れる。AtlasおよびStefenは、別の溶液相ハイブリダイゼーションアッセイを開 示しており、ここではエンドヌクレアーゼ消化工程の後にカラムクロマトグラフ ィによってハイブリッドが分離される。ヌクレアーゼ保護アッセイには類似した 方策が利用されている。これはＲＮＡの検出、定量および特徴付けに関する感度 の高い技術である。ハイブリダイゼーション反応は溶液中で起こり、標的ｍＲＮ Ａへのプローブのハイブリダイゼーションを完了させる。ハイブリダイゼーショ ンの後、残りの一本鎖プローブＲＮＡおよびハイブリダイズされていない試料Ｒ ＮＡがリボヌクレアーゼＡおよびＴ１の混合物またはＳ１ヌクレアーゼによる消 化によって除去される。その後、単一の工程において、ヌクレアーゼが不活性化 され、残りのハイブリッドは沈澱させられる。ヌクレアーゼ保護アッセイはＤＮ Ａの検出には用いられない。これらの２つの方法の欠点は、煩雑であり、存在す る標的核酸の量が正確に定量されないことである。 Carricoの発明の有利な特徴に、クロストークが少なく、バックグラウンドが 低く、感度が改善されたものを合せる必要が依然としてある。 米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号では、ＤＮＡ またはＲＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。これらの 特許の全体をここに引用によって援用する。この方法は、二本鎖標的核酸におけ る各々相補的な鎖の５’末端にオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイゼ ーションすることを伴う。プライマーは、標的核酸の各鎖に対して相補的である 核酸配列に遊離ヌクレオチドを組込むＤＮＡポリメラーゼによって、３’末端か ら５’→３’の方向に伸長される。伸長物を標的核酸鎖から解離させた後、伸長 物は次のサイクルの標的配列になる。満足のいく量の増幅ＤＮＡを得るためには サイクルを繰返し行なう必要があり、これらのサイクルの間、相補的ＤＮＡ鎖は 高温のもとで変成させなければならない。 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と呼ばれる、核酸混合物中に低いコピー数で存在 する特異的な核酸配列を検出するための方法も開示されている。ＷＯ ８９／０ ９８３５にはこの方法が記載されており、その全体がここに引用によって援用さ れる。試料中の標的核酸は、隣接配列を含むプローブとアニールされる。ハイブ リダイゼーションと同時に、プローブは連結されて、元の標的核酸に対して相補 的である検出可能な融合プローブを形成する。融合プローブは核酸から解離され 、さらなるハイブリダイゼーションおよびプローブの融合のためのテンプレート （鋳型）としての役割を果たし、検出すべき核酸は幾何級数的に増幅される。こ の方法ではＤＮＡポリメラーゼは使用されない。 他の公知の核酸増幅法は、転写に基づいた増幅システムを含む。(Kwoh et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.)（1989）86:1173;Gingeras et al.，WO 88/ 10315;Davey et al.，EP 329,822;Miller et al.，WO 89/06700），RACE（Frohm an，In:PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Academic Press ，NY(1990)）and one-sided PCR（Ohara，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．(U. S.A.)（1989）86:5673-5677）。特に適当な増幅法の中には、核酸配列に基づい た増幅、鎖置換増幅およびサイクリングプローブ増幅がある。 得られたジオリゴヌクレオチドの配列を有する核酸の存在下で、２つ（または それ以上の）オリゴヌクレオチドを連結させ、ジオリゴヌクレオチドを増幅する 方法も知られている（Wu et al.，Genomics(1989)4:560）。 等温増幅法が開示されており、この方法では制限エンドヌクレアーゼおよびリ ガーゼが、制限部位の１つの鎖にヌクレオチド５’−［ａ−チオ］トリホスフェ ートを含む標的分子の増幅を行なうために用いられる（Walker et，al.，Proc． Natl．Acad．Sci.(U.S.A.)(1992)89:392-396）。 重要なことは、標識として採用された酵素が、容易に検出可能な生成物を有す る反応を触媒し、感度の高い検出を可能にする大きな代謝回転数を有することで ある。酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ が最も一般的である。セイヨウワサビペルオキシダーゼに関する、感度の高い化 学発光法によるアッセイは、少量の酵素の検出を可能にするものとして記載され ているが、その使用に伴う問題として、酵素の不足、基質の安定性および試料中 の内生的なペルオキシダーゼの存在がある。 アルカリホスファターゼについて、酵素増幅サイクルが開示されており、これ は検出され得る酵素の量をさらに低減し、検出の限界を広げる。１つの方法にお いて、増幅システムは、付帯的サブユニットとの相互作用によりホロ酵素に変換 可能なアポ酵素と、検出すべき酵素の作用により、活性なマスクされていない形 に変換可能な、マスクされた形のサブユニットとを含む。たとえばRabin他の来 国特許第５，４４５，９４２号には、加水分解されたときにＦＡＤをもたらすよ うに置換された、ＦＡＤの合成誘導体を加水分解することができるヒドロラーゼ 酵素を検出するための方法が開示されており、その全体がここに引用によって援 用される。ここで、サブユニットはＦＡＤであり、マスクされた形は３’ＦＡＤ Ｐであり、アポ酵素はアポグルコースオキシダーゼまたはアポ−Ｄ−アミノ酸オ キシダーゼである。 生成したＦＡＤは、対応するアポ酵素から活性ホロ酵素を形成させる。この方 策により短時間で少量のアルカリホスファターゼが検出できるようになる。たと えば、アポ酵素がアポ−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼであるような増幅システムを 使用することにより、３０分以内で０．１ａｍｏｌのアルカリホスファターゼの 検出が可能となる（Harbron et al.，Anal．Biocnem．(1992)206:119-124）。Ｇ Ｂ９６２２５２４．８において、この方策はヌクレアーゼＰ₁に対する増幅アッ セイにさらに拡張され、その全体がここに引用によって援用される。 発明の開示 広く、この発明は、上記技術の有利な局面を合せて、一本鎖標的核酸を検出す るための改善された新規な方法を開示する。この発明による方法は、 （ａ） 該標的核酸と核酸プローブとの間でハイブリッドを形成する工程、（ 該核酸プローブは、一本鎖核酸を加水分解するが、二本鎖核酸には実質的に作用 を及ぼさない酵素試薬で標識され、該ハイブリッドは、該酵素試薬の活性範囲外 であるｐＨの条件下で形成される） （ｂ） 該ｐＨの値を該酵素試薬の活性範囲内に調節する工程、 （ｃ） 存在する任意の一本鎖核酸を、該酵素試薬によって実質的に加水分解 させる工程、および （ｄ） 該ハイブリッドを検出する工程 を含む。 さらなる局面において、この発明は、二本鎖核酸に特異的な抗体またはＤＮＡ 結合タンパク質などのハイブリッド結合試薬によって、あるいは、１対もしくは 複数対のｓｂｍによって、ハイブリッドを検出するためのさまざまな手段を提供 する。これらは、抗原もしくはハプテン、およびそれに対応する抗体、ビオチン およびアビジン、ストレプトアビジンもしくはニュートラビジン（neutravidin ）であるか、または核酸プローブに存在する配列に特異的な核酸結合タンパク質 であり得る。これら試薬の任意のものは、酵素、蛍光成分、化学発光成分、電気 化学発光成分または着色成分とすることができる、検出可能な標識で標識しても よい。 さらなる局面において、この発明は、標的核酸と、標的核酸の一部に対して相 補的である配列を有する核酸プローブとの間の、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、 ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＰＮＡハイブ リッドを検出するための方法を開示する。 さらに別の局面において、この発明は、核酸の増幅生成物と、増幅された核酸 の一部に対して相補的である配列を有する核酸プローブとの間のハイブリッドを 検出するための方法を開示する。 さらなる局面において、この発明は、臨床上の標本、獣医学的標本、食物の標 本または環境上の試料から抽出された標的核酸と、標的核酸の一部に対して相捕 的である配列を有する核酸プローブとの間のハイブリッドを検出するための方法 を開示する。 さらに別の局面において、この発明は、試料中の複数の核酸標的を検出するた めの方法を開示する。 さらなる局面において、この発明は、上記方法を行なうためのキットを提供す る。 この発明の好ましい具体例により、下記の目的および利点のうち１つまたはそ れ以上を達成することが可能となる。 （ａ） 特異的結合メンバーによって、標的核酸と、標的核酸の一部に対して 相補的である配列を有する核酸プローブとの間のハイブリッドを検出するための 方法を提供する。この方法では、任意の一本鎖核酸は、上記プローブに付与され 、かつ一本鎖核酸に特異的な酵素試薬での処理によって、除去される。この発明 の利点は、１つのプローブしか必要ではないこと、化学発光または酵素増幅カス ケードなどの感度の高い検出システムがハイブリッドの検出に用いられ得ること 、ならびに、ＰＣＲまたはＬＣＲなどの標的増幅技術を用いることなく標的核酸 の、感度の高い検出を行なうことができることである。 （ｂ） 複数または多数の核酸標的を検出するための方法を提供する。この発 明の利点は、相当数の標的を１つの試料でスクリーニングすることができ、それ により、アッセイの速度を増加させ、必要な試料の数を低減できることである。 （ｃ） 標的核酸を検出するための汎用的な方法を提供する。この発明の利点 は、既存の核酸プローブおよびそれに対応する検出システムを使ってこの発明を 行えることである。 （ｄ） 使用されるハイブリッド結合試薬および酵素試薬を適当に選択するこ とにより、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＰＮＡ およびＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド間のハイブリッドを検出するための方法を提 供する。 図面の簡単な説明 図１は、一本鎖核酸を検出するための、この発明の３つの好ましい具体例を概 略的に示す図である。 図２は、ヌクレアーゼＰ₁（黒三角）およびヌクレアーゼＳ₁（黒四角）の、３ ’ＦＡＤＰに基づく酵素増幅アッセイの標準曲線を示す図である。横軸は存在す る各酵素の量をａｍｏｌ（アトモル）（１０^-18モル）で表わし、縦軸は、ブラ ンクの読取りを控除した後の、２５℃で１５分間インキュベートして得られる吸 光度を表わす。スケールはいずれも対数である。点線は検出限界を表わす。 図面に使用される参照番号 ２−一本鎖標的核酸 ４−核酸プローブ ６−酵素試薬 ８−特異的結合対の第１のメンバー １０−特異的結合メンバー １２−固体表面 １４−特異的結合対の第２のメンバー １６−生成物 発明を実施するための最良の形態 この発明は、酵素試薬で試料を処理して一本鎖核酸を除去し、ハイブリッドを 検出することにより、標的核酸と標的核酸の一部に対して相補的である配列を有 する核酸プローブとの間のハイブリッドを検出するための方法を提供する。 標的核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、目的とする任意の媒体、たとえば、 医学的、獣医学的、環境的または産業的に重要な液体試料、から得られるもので ある。標的核酸はまた、ＰＣＲまたはＬＣＲなどの核酸増幅アッセイの生成物で あってもよい。標的核酸が主に二本鎖である場合、それはハイブリッドの形成前 に変成処理される。核酸の変成は、好ましくは沸騰水中で加熱するか、またはア ルカリ処理（たとえば０．１Ｎ水酸化ナトリウム）によって行なわれ、これは、 必要に応じて細胞を溶解させるために同時に用いられ得る。また、細胞またはウ イルスの源から核酸を放出させることは、たとえば、機械的な破壊（凍結／解凍 、摩砕、超音波処理）、物理的／化学的な破壊（Triton（商標）、Tweenまたは ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、アルカリ処理、浸透圧衝撃または加 熱）、または酵素溶解（リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ペプシン）によって行 なうことができる。得られる試験媒体は一本鎖の形の標的核酸を含む。 核酸プローブは、ＤＮＡプローブでも、ＲＮＡプローブでも、あるいはＰＮＡ プローブでもよい。核酸プローブは、標的核酸配列の少なくとも一部に対して実 質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖塩基配列を含む。しかしながら、そ のような塩基配列は、連続した一本のポリヌクレオチドセグメントでなくてもよ く、非相補的な配列が間に入った２つまたはそれ以上の個々のセグメントからな るものでもよい。これらのハイブリダイゼーションされない配列は線状である。 さらに、核酸プローブの相補的である領域には、相補的な配列が増幅のために挿 入されたベクターのＤＮＡまたはＲＮＡからなるもののように、その３’および ５’末端にハイブリダイゼーションされない配列が配置されていてもよい。いず れの場合でも、分析試薬として与えられる核酸プローブは、目的とする標的核酸 に対し、１つまたはそれ以上の点において、検出可能なハイブリダイゼーション を示す。核酸プローブ配列は、好都合なまたは必要な任意の長さを有することが でき、１２塩基程度の小さなものから１０，０００塩基程度の大きなものにまで 及び、約５０未満の塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む。核酸プローブは核 酸合成機によって固相化学に従い生成されたオリゴヌクレオチドであってもよい 。ＲＮＡまたはＤＮＡプローブは、その他のさまざまな通常の方法において得る ことができる。ここで用いられるＲＮＡプローブおよびＤＮＡプローブという表 現は、プローブ中に含まれるすべてのヌクレオチドがリボヌクレオチドまたは２ ’−デオキシリボヌクレオチドでなければならないことを意味するわけではない ことを理解されたい。したがって、プローブ中に含まれるヌクレオチド上の２’ 位の１つまたはそれ以上は、当該アッセイの性能に必要な抗体結合特性が十分な 程度維持される限り、化学修飾されてもよい。同様に、このように制限された２ ’−デオキシ修飾に加えて、またはそれに代えて、核酸プローブは、その個々の 一本鎖と比較して二本鎖ハイブリダイゼーション生成物に対する抗体の特異性が 実質的に損なわれないならば、そのリボースホスフェート骨格に沿って他の任意 の修飾を一般に有してもよい。好ましい具体例において、酵素標識に加え、核酸 ブローブは検出可能な成分または固定化可能な成分のいずれかで標識される。た とえば、核酸プローブは核酸合成機を用いて固相化学反応によって調製され、ト リチル−ヘキシルチオール誘導５’末端を有する。この部位に対する標識の共有 結合は、広い範囲のヘテロ二官能性試薬を用いて多くの周知の方法によって行な うことができる。たとえばCarlsson他（Biochem J（1978）173:723−737）の方 法を用いることができ、標識は、２−ピリジルジスルフィド活性化標識をもたら すよう３−［（２）−ピリジルジチオ］プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミドエステル（ＳＰＤＰ）と反応させられる。これにより、上記の誘導化された トリチル−ヘキシルチオールでのジスルフィド交換によって標識核酸プローブが 得られるようになる。核酸プローブを標識するための他の方策は、当該技術分野 における当業者には明らかである。さらに、広い範囲の標識核酸が市販品として 入手可能である。好ましい標識は、酵素類、アルカリホスファターゼ、ペルオキ シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ヌクレアーゼＰ₁およびヌクレアーゼＳ₁、ハ プテン類、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、フルオレセインイソ チオシアネート、およびビオチンまたはビオチン類似体を含む。 この発明の好ましい具体例で、酵素試薬としてヌクレアーゼを使用ずる。一本 鎖核酸に特異的な多くのヌクレアーゼが知られている。たとえば、リボヌクレア ーゼＡおよびリボヌクレアーゼＴ₁を、一本鎖ＲＮＡを加水分解するために組合 せて用いてもよい。他の好ましいヌクレアーゼは、エキソデオキシリボヌクレア ーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．１、類似酵素：哺乳類のＤＮアーゼＩＩＩ、エ キソヌクレアーゼＩＶ、Ｔ２−およびＴ４−誘導エキソデオキシリボヌクレアー ゼ）、エキソデオキシリボヌクレアーゼ（ファージｓｐ３−誘導）（Ｅ．Ｃ．３ ．１．１１．４、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１． ５、類似酵素：ヘモフィラス・インフルエンザのＡＴＰ−依存性ＤＮアーゼ）、 エキソデオキシリボヌクレアーゼＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．６、類似酵素 ：ミクロコッカス・ルテウスのエキソヌクレアーゼ）、エキソリボヌクレアーゼ ＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１３．１、類似酵素：ＲＮアーゼＱ、ＲＮアーゼＢＮ、 ＲＮアーゼＰＩＩＩ、ＲＮアーゼＹ）、ヘビ毒（毒液）エキソヌクレアーゼ（Ｅ ．Ｃ．３．１．１５．１、類似酵素：ブタ腎臓のホスホジエステラーゼ、ラクト バシラスのエキソヌクレアーゼ）、脾臓エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１． １６．１、類似酵素：ラクトバシラス・アシドフィラスのヌクレアーゼ、バシラ ス・サブチリスのヌクレアーゼ、サケ精巣ヌクレアーゼ）、デオキシリボヌクレ アーゼＩＶ（ファージＴ４−誘導）（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．２、類似酵素：Ｄ ＮアーゼＶ（哺乳類、アスペルギルス・ソヤのＤＮアーゼ、バシラス・サブチリ スのエンドヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エンドヌクレア ーゼＩ、アスペルギルスのＤＮアーゼＫ２、ワクシニアウイルスのＤＮアーゼＶ Ｉ、酵母 ＤＮアーゼ、クロレラＤＮアーゼ）、アスペルギルスのデオキシリボヌクレアー ゼＫ１（Ｅ．Ｃ．３．１．２２．２、アスペルギルスヌクレアーゼＳ１（Ｅ．Ｃ ．３．１．３０．１、類似酵素：ニューロスポラ・クラッサ（Ｎ ｃｒａｓｓａ ）ヌクレアーゼ、マングビーン（緑豆）ヌクレアーゼ、ペニシリウム・シトリナ ムのヌクレアーゼＰ₁）を含み得る。特に好ましいヌクレアーゼはヌクレアーゼ Ｐ₁およびヌクレアーゼＳ₁であり、これらは一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡに対して 比較的広い特異性を有する。 ハイブリッド結合試薬が抗体である場合には、これは、通常の抗血清およびモ ノクローナル法といった、利用できるいかなる態様で得られてもよい。抗血清は 、適当な免疫原を有するマウス、ウサギ、モルモットまたはヤギなどの動物の免 疫感作を伴う周知の確立された技術によって得ることができる。免疫グロブリン もまた、体細胞ハイブリダイゼーション法によって得ることができ、これもまた 適当な免疫原の使用を伴う。抗体試薬はさらに、組換え抗体、キメラ抗体または 一本鎖抗体であってもよい。抗体は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−Ｄ ＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに特異的であり得る。抗Ｄ ＮＡ−ＲＮＡモノクローナル抗体の生産例は、Fliss他（Applied and Environme ntal Microbiology（1993）59：2698-2705）に記載されている。二本鎖核酸に特 異的な抗体もまた市販品として入手可能である。好ましい具体例において、抗体 は検出可能な成分または固定化可能な成分のいずれかで標識される。標識の共有 結合は、広い範囲のヘテロ二官能性試薬を用いる多くの周知の方法によって行な われ得る。たとえば、Carlsson他（Biochem J（1978）173：732-737）の方法が 用いられてもよく、この場合、標識は２−ピリジルジスルフィド活性化標識をも たらすよう３−［（２）−ピリジルジチオ］プロピン酸Ｎヒドロキシスクシンイ ミドエステル（ＳＰＤＰ）と反応させられる。これはＩｇＧ抗体と混合され、ジ スルフィド交換反応により標識された抗体抱合体がもたらされる。抗体を標識す るための他の方策は当業者には明らかである。好ましい標識は、酵素類、アルカ リホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ヌクレアーゼＰ₁ 、ハプテン類、ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、ならびにビオチンまたはビ オチン類似体を含む。特に好ましい具体例において、抗体はミクロ タイタープレート上に直接固定化される。これは当業者には周知である多くの手 段によって行なうことができる。たとえば、６０ｍＭの炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６ 中に溶解した抗体とともにインキュベートすることにより、Immulon IIミクロタ イタープレートを抗体で被覆することができる。当業者には他の方策も明らかで ある。 この発明の操作を示す、特に好都合な応用例が以下に説明される。 図１を参照して、ここには、この発明の特に好ましい３つの具体例が示され、 第１行目には標的核酸（２）が示され、これは、必要に応じて一本鎖になるよう 変成され、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プローブ（４）と接触させられ る。この核酸プローブ（４）は、標的核酸の少なくとも一部に対して相補的であ る配列を有し、好ましくはヌクレアーゼＰ₁である酵素試薬（６）でその５’末 端において標識されている。第２行目および第３行目に示される２つの具体例で は、核酸プローブ（４）は、好ましくはビオチンである特異的結合対（８）の第 １のメンバーにより、その３’末端においてさらに標識される。 図１の第２行では、混合物のｐＨは、酵素試薬（６）によって一本鎖核酸を除 去できるよう調節される。これらの一本鎖核酸は、ハイブリダイズされていない プローブおよびハイブリダイズされていない標的を含む。 図１の最後の行では、固体表面（１２）に固定化されたｓｂｍ（１０）が、形 成されたハイブリッドを認識し、かつそれに結合する。ｓｂｍ（１０）は、好ま しくは、図１の第１列および第２列に示されるような二本鎖核酸に特異的な抗体 であるか、または第３列に示されるストレプトアビジンである。第２列に示され る１つの具体例では、検出酵素（１４）好ましくはビオチニル化されたアルカリ ホスファターゼで標識された特異的結合対の第２のメンバーがさらに導入される 。未結合の材料が洗い出され、好ましくは、第１列および第３列に示されるよう にプローブに結合されたヌクレアーゼＰ₁に対し、あるいは、第２列に示される ように、プローブに結合されたアルカリホスファターゼに対し、増幅アッセイを 用いて、酵素標識（６または１４）により生じる生成物（１６）の量を測定する ことによって、結合プローブ核酸−標的核酸−抗体複合体の量が、測定される。 図１において、ヌクレアーゼＰ₁は核酸プローブに直接結合した形で示される 。 プローブがフルオレセインイソチオシアネートなどの成分で標識され、ヌクレア ーゼＰ₁が、ヌクレアーゼＰ₁で標識された抗ＦＩＴＣ抗体によってそれに結合さ れる具体例が意図される。 上述の原理を採用するこの発明の他の具体例が当業者には明らかである。かく して、この方法は溶液中でのハイブリダイゼーションおよび検出に適用され得る 。必要に応じて一本鎖になるよう変成された標的核酸は、標的核酸の少なくとも 一部に対して相補的である配列を有しかつ酵素試薬で標識された核酸プローブと 、ハイブリダイゼーション条件下で接触させられる。混合物のｐＨは、酵素試薬 が一本鎖核酸を除去するように調節され、形成されたハイブリッドは、該ハイブ リッドまたは核酸プローブ上に存在する部位に特異的なｓｂｍに結合する。これ らの反応により、たとえば濁度測定アッセイによって検出され得る大きな複合体 がもたらされる。 さらなる別の応用例において、この方法は、固相上のｓｂｍ−核酸複合体の検 出に適用される。核酸プローブと標的核酸との間に形成された複合体で、該核酸 プローブまたは該標的核酸のいずれかが固相上に固定化されたものは、この発明 の方法によって検出され得る。混合物のｐＨは、酵素試薬が、固定化された複合 体から一本鎖核酸を除去するように調節され、検出は、酵素に結合されたｓｂｍ 、蛍光マーカーまたは別のシグナル発生システムを用いて直接的に行なうことが でき、あるいは、それらの標的に結合されるｓｂｍを検出するために通常用いら れる検出システムのいずれかを用いて間接的に行なうことができる。固体は、ナ イロンまたはニトロセルロース膜（サザンまたはノーザンブロット）、組織切片 （in situハイブリダイゼーション）、またはプラスチック表面（ＥＬＩＳＡ形 式）を含む。この方策は、一本鎖核酸プローブが酵素試薬によって加水分解され るため、これらのアッセイに通常用いられる長い洗浄工程を最小限に低減できる という利点を有する。 さらなる応用例において、この方法はバイオセンサシステムに適用され得る。 バイオセンサ表面を用いる動的反応の検出の一例は、BIAcore（商標）バイオセ ンサシステム（Pharmacia）によって採用されているような、表面プラスモン共 鳴（ＳＰＲ）検出システムである。生体分子とセンサチップ上に固定化されたリ ガンドとの相互作用は、エバネセント光を用いて表面で測定される。システムは 、リガンドが親水性デキストランマトリクスに固定化され得るセンサチップ、分 析物および試薬をセンサ表面に移送するための微細化されたフルーイディックス カートリッジ、ＳＰＲ検出器、オートサンブラー、ならびにシステム制御および 評価ソフトウェアを含む。特定のリガンドは、アミン、チオールまたはアルデヒ ド化学反応によって、あるいはたとえばビオチン−アビジン相互作用によって生 物特異的に、センサチップに共有結合により固定化される。ハイブリッドまたは 核酸プローブの部位に特異的なｓｂｍが、BIAcore（商標）バイオセンサシステ ム（または他のタイプのバイオセンサシステム）に用いられるセンサチップのデ キストラン層に結合される。必要に応じて一本鎖になるよう変成された標的核酸 を含む試料は、酵素で標識された核酸プローブと、ハイブリダイゼーション条件 下で接触させられ、これにより複合体が形成される。混合物のｐＨは、一本鎖核 酸を酵素試薬が加水分解するように調節される。試料はBIAcore（商標）のフロ ーシステムを通過し、デキストラン表面に結合したｓｂｍは、存在するのであれ ば核酸プローブ−標的核酸複合体と結合する。BIAcore（商標）によって採用さ れているＳＰＲ検出に基づき、この結合により、表面に結合されるようになる試 料中の標的材料の量に応じてシグナルが生じる。 さらなる応用例において、この方法は細胞中の結合核酸プローブの検出に適用 され得る。適当な条件下で、核酸プローブオリゴマーは、細胞株、造血細胞およ び動物／ヒトの組織等の、生きた細胞または固定化された細胞の細胞壁を貫通し 得る。ハプテンまたは他のレポーター分子で核酸プローブを標識することにより 、細胞への貫通が阻止され得る。酵素により一本鎖核酸が除去されるように混合 物のｐＨを調節した後、核酸プローブと標的核酸との間に形成されたハイブリッ ドを、免疫組織化学（凍結または固定化された組織バイオプシー）によるか、あ るいはフローサイトメトリ（たとえば界面活性剤、アセトンまたはアルコールで 処理された細胞について）によるか、あるいは、細胞培養に添加されるが生きた 動物に投与される核酸プローブの結合および／または組織分配を検出するような インビボの装備において、検出する。 別の応用例において、この方法は、１つの試料溶液における複数または多数の 標的のハイブリダイゼーションおよび検出に適用される。必要に応じて一本鎖に なるよう変成された標的核酸は、それぞれの標的核酸の少なくとも一部に対して 相補的である配列を有し、かつ酵素試薬で標識された、対応する標識核酸プロー ブと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させられる。混合物のｐＨは、酵素 試薬が一本鎖核酸を除去するように調節され、形成されたハイブリッドは、ハイ ブリッドまたは核酸プローブに存在する部位に特異的な固定化されたｓｂｍと結 合する。未結合の材料は洗浄により除去される。捕獲されたハイブリッドは、い くつかの方法で検出され得る。１つの方策では、各組のプローブが、種々の異な る蛍光成分または吸収（吸光）成分で標識される。これらは種々の異なる波長で 照合することができ、元の試料中に存在する各標的の量がこれにより測定される 。別の方策では、使用される各組のプローブが種々の異なる酵素で標識される。 酵素試薬による処理の後、溶液のアリコートが、ハイブリッドまたは核酸プロー ブ上に存在する部位に特異的なｓｂｍで被覆されたミクロタイタープレートの異 なるウェルにそれぞれ分配される。未結合の成分を除去するための洗浄の後、種 々の異なる検出試薬がウェルの各々に添加され、これにより、元の試料に存在す る各標的の量が測定される。 この発明による上述の方法を行なうためキットは、ハイブリッドまたは核酸プ ローブに存在する部位に特異的な、標識または未標識の形態のｓｂｍ、検出すべ き標的核酸に対して相補的であり、かつ一本鎖核酸に特異的な酵素試薬で標識さ れた核酸プローブ、および、検出システムを含む。 好ましい具体例において、キットは、ハイブリッドまたは核酸プローブに存在 する部位に特異的な、ミクロタイタープレートのウェルに固定化されたｓｂｍ、 検出すべき標的核酸に対して相補的であり、かつ一本鎖核酸に特異的な酵素試薬 で標識された核酸プローブ、および、検出システムを含む。 以下の例では、この発明の操作のさらなるさまざまな局面が示される。これら の例はいかなる意味でもこの発明を制限するよう意図されるものではない。 例１ ヌクレアーゼＰ₁の標準化 ヌクレアーゼＰ₁（１ｍｇ；Sigma Chemical Companyから入手、バッチ番号： １０７Ｆ０７９９）を、２２．７μＭの濃度をもたらすよう１ｍｌの水中に溶解 し、４℃で貯蔵した。この溶液の活性を以下の混合物中で検定した。混合物：５ ０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中、０．１６ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍ ＭのＰＥＰ、１ｍＭのＭｇＳＯ₄、２０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのアデノシン ３’，５’−ビスフォスフェート、１Ｕピルベートキナーゼ、１Ｕラクテートデ ヒドロゲナーゼおよび１Ｕミオキナーゼ、ｐＨ７．２、全容積１ｍｌ。ＮＡＤＨ の場合モル吸光率が６２２０であると想定して、３４０ｎｍにおける吸光度の変 化から、溶液中のヌクレアーゼＰ₁の活性は３２０Ｕ／ｍｌであることがわかっ た。 例２ ヌクレアーゼＰ₁およびヌクレアーゼＳ１の増幅アッセイ 例１に従って標準化したヌクレアーゼＰ₁の溶液を、ＮａＯＨによってｐＨ６ ．５に調節した５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で順次希釈した。アッセイ混合物は ２０ｍＭの３’ＦＡＤＰ、０．１ｍＭの４−アミノアンチピリン、２ｍＭのＤＨ ＳＡ、１μｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ、０．１Ｍのグルコースおよび０． １μＭのアポグルコースオキシダーゼを含み、全容積は０．１ｍｌであった。吸 光度の変化を、２５℃に設定したサーモスタット制御プレートホルダに嵌められ たDynatech MR7000プレートリーダで、５２０ｎｍにおいてモニターした。図２ はヌクレアーゼＰ₁アッセイの性能を示す。１５分間のアッセイ期間の後、検出 の下限（バックグラウンド読取りの標準偏差の３倍であると規定）は０．２ａｍ ｏｌであった。ヌクレアーゼＳ１を同様に測定し、その検出下限は４ａｍｏｌで あった（図２）。 例３ オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドを、Expedite（商標）化学試薬を用いてCyclone（商標） ＤＮＡ合成機で合成した。 ヌクレアーゼＰ₁で標識すべきＤＮＡは、Ｋ６６Ｅ突然変異体を含むリボヌク レアーゼ遺伝子の中間の領域に対して相補的であッた。このプローブについて、 ヌクレアーゼＰ₁への結合を容易にするよう、その５’末端をトリチル−ヘキシ ルチオール基で誘導化した。その配列は下記のとおりであった。 ５’−ＧＧＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＡＡＡＣＧＧＧＣＡＧＧ−３’ ストレプトコッカス・ニューモニアのゲノムＤＮＡの反復領域（米国特許第５ ，６５６，４３２号のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ６）に特異的な別のオリゴヌクレオチ ドであって、配列 ５’−ＴＡＴＹＹＡＣＡＲＹＳＴＣＡＡＡＡＹＡＧＴＧ−３’ を有し、かつビオチニル化された５’末端およびＦＩＴＣで標識された３’末端 を有するものを、Cruachem社から得た。 オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、必要となるまで４℃で貯蔵した。 例４ ヌクレアーゼＰ₁の誘導化 ヌクレアーゼＰ₁（５ｍｇ）を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５ｍｌの ０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ７．５中に溶解し、同じ緩衝液で平衡にした Sephadex G25（NAP-5カラム，Pharmacia）上でゲル濾過によって脱塩した。この 酵素溶液を、５０倍モル過剰の３−［（２）−ピリジルジチオ］−プロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）とともに室温で３０分間イ ンキュベートした。重炭酸塩緩衝液で平衡にしたSephadex G25（NAP10カラム，P harmacia）上でゲル濾過により、未反応のＳＰＤＰを除去した。２−ピリジルジ スルフィド活性化ヌクレアーゼＰ₁は４℃で貯蔵した。 例５ ヌクレアーゼＰ₁のオリゴヌクレオチドへの結合 ヌクレアーゼＰ₁を例４で説明したように２−ピリジルジスルフィドに結合し 、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム液中に ４℃で貯蔵した。例３のＫ６６Ｅオリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ塩化ナトリウ ムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液０．５ｍｌ中に溶解し、 最終的な濃度を０．３６μＭにした。これを、例４に従って調製した活性化ヌク レアーゼＰ₁とともに、１：２のモル比において、室温で４５分間、インキュベ ートし、その後４℃で１６時間インキュベートした。 その抱合体を、Sephadex G25上のクロマトグラフィーによって、１ｍＭのＣ ＨＡＰＳを含むｐＨ７．５の２０ｍＭビス−トリスプロパン緩衝液に移し、Phar macia Mono Qカラム上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。同じ 緩衝液中の塩化ナトリウム勾配をカラムに適用し、０．２５Ｍのモル濃度で抱合 体を溶出させた。 例６ 抗体で被覆したプレート上におけるプラスミドＤＮＡのハイブリダイゼーショ ンおよび検出 ９５μｌの滅菌水中に溶解された、非相補的結合を制御する役割を果たす、５ ０ｐｇのλＤＮＡを、さらに、ミクロタイタープレートウェルにおいて、ヒトの ＲＮアーゼ突然変異体および１０μｌのＩＭ水酸化ナトリウムを含む既知量のプ ラスミド５μｌと混合する。この混合物を１０分間室温でインキュベートし、プ ラスミドを変成させた後、２．２１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％のTween２ ０を含むｐＨ３．０の０．５Ｍクエン酸塩緩衝液８μｌで中和する。例５に従っ て調製し、７ｍＭ硫酸亜鉛、１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ、０．１％Ｎ−ラウロイルサ ルコシンおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．５の０．１Ｍトリス −ＨＣｌ緩衝液中に溶解した、５０μｌ（３４ｆｍｏｌ）のヌクレアーゼＰ₁抱 合レポータープローブを、各ウェルに添加する。４０℃１時間のハイブリダイゼ ーション後、ｐＨをクエン酸塩緩衝液の添加により約６．０に調整し、温度を４ ５℃で１０分間維持し、この後、ハイブリダイズされていないレボータープロー ブの９５％以上を加水分解する。 その後、混合物を抗二本鎖ＤＮＡ抗体で被覆した市販のミクロタイタープレー トに加える。３７℃でインキュベートした後、プレートを、７ｍＭ硫酸亜鉛、１ ％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび１５０ｍＭ塩化 ナトリウムを含むｐＨ７．５の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で６回洗浄する。 ミクロタイタープレート上に捕獲されたハイブリッドの量を、例２で説明した 増幅アッセイを用いて定量する。 例７ ストレプトコッカス・ニューモニアのゲノムＤＮＡの検出 ストレプトコッカス・ニューモニアからのゲノムＤＮＡを抽出し、ＰｓｔＩで 処理してＤＮＡをフラグメントに切断した。９５μｌの処理済ＤＮＡを、１０μ ｌの１Ｍ水酸化ナトリウムと混合し、室温で１０分間インキュベートしてＤＮＡ を変成させた後、２．２１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％Tween２０を含むｐ Ｈ３．０の０．５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液８μｌで中和した。７ｍＭ硫酸亜 鉛、１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび１５０ｍ Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中に溶解し た、例３で説明したようなストレプトコッカス・ニューモニアのプローブ５０μ ｌ（３４fmol）を、５０μｌの１μｇ／ｍｌヌクレアーゼＰ₁標識抗ＦＩＴＣ抗 体とともに添加した。この抗体は、２−メルカプトエチルアミン（遊離スルフィ ドリル基をもたらす）で処理された抗ＦＩＴＣ抗体を、例５で説明した方法と同 様に例４のＳＰＤＰ活性化ヌクレアーゼＰ₁と結合させることにより調製した。 ４０℃で１時間のハイブリダイゼーション後、クエン酸塩緩衝液を添加すること によりｐＨを約６．０に調節し、温度を４０℃で１０分間維持し、この後、ハイ ブリダイズされていないレポータープローブの９５％以上を加水分解する。 その後混合物を、抗二本鎖ＤＮＡ抗体またはストレプトアビジンのいずれかで 被覆した市販のミクロタイタープレートに加える。３７℃で３０分間のインキュ ベーション後、プレートを、７ｍＭ硫酸亜鉛、１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．５の ２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で６回洗浄する。 ミクロタイタープレートの上に捕獲されたハイブリッドの量を、例２で説明し た増幅アッセイを用いて定量する。 産業上の利用可能性 かくして、この発明の方法が、標的核酸と、一本鎖核酸を除去する酵素試薬で 標識された核酸プローブとの間に形成されたハイブリッドの検出に使用できるこ とがわかる。この方策により、存在する一本鎖核酸にｓｂｍが結合することに起 因するクロストークの可能性が排除される。これは、酵素増幅または化学発光な どの感度の高い方策を用いて、ハイブリッドとｓｂｍとの間に形成された複合体 を検出できることを意味する。さらに、核酸プローブの各端部をヌクレアーゼＰ₁ で標識できるため、検出反応の全体的な感度が高まる。 上述の方法に加えて、当業者には、ｓｂｍとハイブリッドとの間に形成された 複合体を検出するための他の多くの技術が明らかになる。たとえば、形成される 複合体が捕獲されてもよい。捕獲を行なうための多くの方策が知られている。た とえば、複合体は、ｓｂｍに特異的でありかつ固相上に固定化された抗体によっ て捕獲され得る。これに代えて、ｓｂｍが標識されてもよく、複合体は、固相上 に固定化され当該標識に特異的な抗体によって捕獲される。別の方策は、固体支 持体上に固定化されたハプテンまたは抗原に特異的な抗体でｓｂｍを標識するこ とである。さらなる方策は、１対のｓｂｍのうち１つのパートナーでｓｂｍを標 識し、固体表面上に固定化された第２のパートナーによって複合体を捕獲するこ とである。さらなる方策は、核酸プローブを標識し、当該標識に特異的な固相上 に固定化された抗体によって複合体を捕獲することである。別の方策は、固体支 持体上に固定化されたハプテンまたは抗原に特異的な抗体で核酸プローブを標識 することである。さらなる方策は、１対のｓｂｍのうち１つのパートナーで核酸 プローブを標識し、固体表面上に固定化された第２のパートナーによって複合体 を捕獲することである。複合体の捕獲に関するその他の方策は当業者に明らかな ところである。未結合の材料は洗い出され、結合プローブ核酸−標的核酸−抗体 複合体の量が測定される。 このような複合体を検出するため多くの方策が知られている。たとえば、ｓｂ ｍまたは核酸プローブは検出可能な標識でラベルされてもよい。これに代えて、 ｓｂｍ上の標識または核酸プローブ上の標識が抗体検出システムを用いて検出さ れてもよい。複合体の検出に関するその他の方策は当業者に明らかなところであ る。 この方法には、単一のプローブを利用し、コストが節減され、アッセイプロト コルの設計が簡単になるというさらなる利点がある。 この方法はさらに、試料中の複数または多数の標的を検出できるようにし、各 標的を１つ１つ検出する場合と比較して経済的に有利である。 以上の記述には多くの具体例が含まれるが、これらは発明の範囲を制限するも のと解されるべきではなく、この発明の現在の好ましい具体例のうちのいくつか を例示的に示すものである。たとえば、核酸プローブは、ペプチド核酸プローブ 、あるいは、修飾塩基もしくは変更された骨格を有する他の核酸類似体であって もよい。核酸プローブがペプチド核酸プローブである場合、酵素試薬は一本鎖ペ プチド核酸に特異的なプロテアーゼであってもよい。 したがって、この発明の範囲は、記載される例によってではなく添付の請求の 範囲およびそれらの法律上の均等物によって決定されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一本鎖標的核酸を検出するための方法であって、 ａ） 核酸プローブを与え、（ここで前記プローブは、 ｉ） 前記標的の少なくとも一部に対して相補的であるヌクレオチド配列、 および ii） 前記配列に結合された酵素試薬とを含むものであり、 前記酵素試薬は、前記一本鎖核酸を加水分解できるが、実質的に二本鎖核酸 を加水分解できないものである） ｂ） 前記酵素の活性範囲外であるｐＨの条件下で、前記プローブを前記標的 と接触させてハイブリッドを形成するようにし、 ｃ） 塩基、酸または緩衝剤によって、前記ｐＨを前記酵素試薬の活性範囲内 の値に調整し、 ｄ） 前記酵素試薬によって、存在する一本鎖核酸のすべてまたは一部を加水 分解し、 ｅ） 前記ハイブリッドを検出する、諸工程を備える、方法。 ２．前記酵素試薬が検出可能であり、それにより前記ハイブリッドが検出される 、請求項１に記載の方法。 ３．前記酵素試薬がヌクレアーゼである、請求項１または２に記載の方法。 ４．前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＡおよびリボヌクレアーゼＴ１の組 合せ、エキソデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．１）、哺乳 類のＤＮアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、Ｔ２およびＴ４誘導エキソデ オキシリボヌクレアーゼ、エキソデオキシリボヌクレアーゼ（ファージｓｐ３誘 導）（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．４）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ（Ｅ． Ｃ．３．１．１１．５）、ヘモフィラス・インフルエンザのＡＴＰ−依存性ＤＮ アーゼ、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．６） 、ミクロコッカス・ルテウスのエキソヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ Ｉ（Ｅ．Ｃ．３．１．１３．１）、ＲＮアーゼＱ、ＲＮアーゼＢＮ、ＲＮアーゼ ＰＩＩＩ、ＲＮアーゼＹ、ヘビ毒エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１５． １）、ブタ腎臓ホスホジエステラーゼ、ラクトバシラスのエキソヌクレアーゼ、 脾臓エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１６．１）、ラクトバシラス・アシ ドフィラスのヌクレアーゼ、バシラス・スブチリスのヌクレアーゼ、デオキシリ ボヌクレアーゼＩＶ（ファージＴ４誘導）（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．２）、ＤＮ アーゼＶ（哺乳類）、アスペルギルス・ソヤのＤＮアーゼ、バシラス・スブチリ スのエンドヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エンドヌクレア ーゼＩ、アスペルギルスＤＮアーゼＫ２、ワクシニアウイルスＤＮアーゼＶＩ、 酵母ＤＮアーゼ、クロレラＤＮアーゼ、アスペルギルスのデオキシリボヌクレア ーゼＫ１（Ｅ．Ｃ．３．１．２２．２）、アスペルギルスのヌクレアーゼＳ１（ Ｅ．Ｃ．３．１．３０．１）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎ ｃｒａｓｓａ） ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ならびにペニシリウム・シトリナム ヌクレアーゼＰ₁からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。 ５．前記酵素試薬がヌクレアーゼＰ１またはヌクレアーゼＳ１である、請求項２ に記載の方法。 ６．前記ハイブリッドをハイブリッド結合試薬に接触させる工程をさらに含む、 請求項１から５のいずれかに記載の方法。 ７．前記ハイブリッド結合試薬が、二本鎖核酸に特異的な抗体であるか、または 二本鎖核酸に特異的なＤＮＡ結合タンパク質である、請求項６に記載の方法。 ８．前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメ ラ抗体および一本鎖抗体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。 ９．前記ハイブリッド結合試薬が標識される、請求項６に記載の方法。 １０．前記ハイブリッド結合試薬が固定化される、請求項６に記載の方法。 １１．前記核酸プローブが、特異的結合対の第１のメンバーをさらに含む、請求 項１から１０のいずれかに記載の方法。 １２．前記第１のメンバーが、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、 フルオレセインイソチオシアネートおよびビオチンからなる群から選択される、 請求項１１に記載の方法。 １３．前記ハイブリッドを特異的結合対の第２のメンバーと接触させる工程をさ らに含む、請求項１１に記載の方法。 １４．前記第２のメンバーが、抗ジゴキシン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、抗フ ルオレセイン抗体、抗フルオレセインイソチオシアネート抗体、アビジン、スト レプトアビジンおよびニュートラビジンからなる群から選択される、請求項１３ に記載の方法。 １５．前記第２のメンバーが標識を有する、請求項１３に記載の方法。 １６．前記第２のメンバーが固定化される、請求項１３に記載の方法。 １７．前記標識が、固定化可能な標識である、請求項９または１５に記載の方法 。 １８．前記標識が、検出可能な標識である、請求項９または１５に記載の方法。 １９．前記検出可能な標識が、酵素、蛍光成分、化学発光成分および電気化学的 発光成分からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記酵素が、β−ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダー ゼである、請求項１９に記載の方法。 ２１．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ヌクレアーゼＰ₁およびヌクレア ーゼＳ１からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。 ２２．前記ハイブリッドは増幅系によって検出される、請求項５または２１に記 載の方法。 ２３．前記増幅系は、付帯的サブユニットとの相互作用によってホロ酵素に変換 可能であるアポ酵素と、前記酵素の作用によって、活性なマスクされていない形 に変換可能である、マスクされた形の前記サブユニットとを含む、請求項２２に 記載の方法。 ２４．前記サブユニットがＦＡＤであり、前記マスクされた形は３’ＦＡＤＰで ある、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記アポ酵素がアポグルコースオキシダーゼまたはアポ−Ｄ−アミノ酸オ キシダーゼである、請求項２３または２４に記載の方法。 ２６．前記核酸プローブは固体表面に固定化される、請求項１に記載の方法。 ２７．前記標的核酸は試験試料がら分離されている、請求項１から２６のいずれ かに記載の方法。 ２８．前記標的核酸は、標的増幅手段によって生成されるものである、請求項１ から２７のいずれかに記載の方法。 ２９．前記標的増幅手段が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、核酸配 列に基づく増幅、サイクリングプローブ増幅および鎖置換増幅からなる群から選 択される、請求項３０に記載の方法。 ３０．前記標的核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡからなる群から選択される 、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。 ３１．前記プローブ核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡからなる群から選択さ れる、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。 ３２．検出すべき標的核酸に対して相補的であり、かつ一本鎖核酸を実質的に加 水分解するが二本鎖核酸は実質的に加水分解しない酵素で標識された核酸プロー ブを含む、一本鎖標的核酸を検出するためのアッセイキット。 ３３．前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＡおよびリボヌクレアーゼＴ１の 組合せ、エキソデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．１）、哺 乳類ＤＮアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、Ｔ２およびＴ４誘導エキソデ オキシリボヌクレアーゼ、エキソデオキシリボヌクレアーゼ（ファージｓｐ３誘 導）（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．４）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ（Ｅ． Ｃ．３．１．１１．５）、ヘモフィラス・インフルエンザのＡＴＰ−依存性ＤＮ アーゼ、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．６） 、ミクロコッカス・ルテウスのエキソヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ Ｉ（Ｅ．Ｃ．３．１．１３．１）、ＲＮアーゼＱ、ＲＮアーゼＢＮ、ＲＮアーゼ ＰＩＩＩ、ＲＮアーゼＹ、ヘビ毒エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１５． １）、ブタ腎臓のホスホジエステラーゼ、ラクトバシラスのエキソヌクレアーゼ 、脾臓エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１６．１）、ラクトバシラス・ア シドフィラスのヌクレアーゼ、バシラス・スブチリスのヌクレアーゼ、デオキシ リボヌクレアーゼＩＶ（ファージＴ４誘導）（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．２）、Ｄ ＮアーゼＶ（哺乳類）、アスペルギルス・ソヤのＤＮアーゼ、バシラス・スブチ リスのエンドヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エンドヌクレ アーゼＩ、アスペルギルスＤＮアーゼＫ２、ワクシニアウイルスＤＮアーゼＶＩ 、酵母ＤＮアーゼ、クロレラＤＮアーゼ、アスペルギルスのデオキシリボヌクレ アーゼＫ１（Ｅ．Ｃ．３．１．２２．２）、アスペルギルスのヌクレアーゼＳ１ （Ｅ．Ｃ．３．１．３０．１）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎ ｃｒａｓｓ ａ）ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ならびにペニシリウム・シトリ ナムヌクレアーゼＰ₁からなる群から選択される、請求項３２に記載のアッセイ キット。 ３４．前記酵素試薬がヌクレアーゼＰ１またはヌクレアーゼＳ１である、請求項 ３２に記載のアッセイキット。 ３５．前記一本鎖標的核酸と前記核酸プローブとの間に形成されたハイブリッド または前記核酸プローブに存在する部位のいずれかに対して特異的な特異的結合 メンバーをさらに含む、請求項３２から３４のいずれかに記載のアッセイキット 。 ３６．前記特異的結合メンバーが、二本鎖核酸に特異的な抗体、または二本鎖核 酸に特異的なＤＮＡ結合タンパク質である、請求項３５に記載のアッセイキット 。 ３７．前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キ メラ抗体および一本鎖抗体からなる群から選択される、請求項３６に記載のアッ セイキット。 ３８．前記部位が、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、フルオレセ インイソチオシアネートおよびビオチンからなる群から選択される、請求項３５ に記載のアッセイキット。 ３９．前記特異的結合メンバーは、抗ジゴキシン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、 抗フルオレセイン抗体、抗フルオレセインイソチオシアネート抗体、アビジン、 ストレプトアビジンおよびニュートラビジンからなる群から選択される、請求項 ３５に記載のアッセイキット。 ４０．検出系をさらに含む、請求項３５から３９のいずれかに記載のアッセイキ ット。 ４１．前記検出系が増幅系である、請求項４０に記載のアッセイキット。 ４２．前記増幅系は、付帯的サブユニットとの相互作用によってホロ酵素に変換 可能なアポ酵素と、前記酵素の作用によって、マスクされていない活性な形に変 換することができる、マスクされた形の前記サブユニットとを含む、請求項４１ に記載のアッセイキット。 ４３．前記サブユニットがＦＡＤであり、前記マスクされた形は３’ＦＡＤＰで ある、請求項４２に記載のアッセイキット。 ４４．前記アポ酵素がアポグルコースオキシダーゼまたはアポ−Ｄ−アミノ酸オ キシダーゼである、請求項４２または４３に記載のアッセイキット。