CN1490357A - 含聚羟基链烷酸酯的结构体及其生产方法 - Google Patents

Abstract

一种制造含聚羟基链烷酸酯结构体的方法，其中至少该结构体的基材表面的一部分涂有聚羟基链烷酸酯，该方法包括以下步骤：将聚羟基链烷酸酯合酶固定在所述基材的表面上，在所述基材表面上使用3－羟基酰基辅酶A，使其成为所述合酶的底物来合成聚羟基链烷酸酯，并在所述基材的至少一部分上涂布合成的聚羟基链烷酸酯，其中所述合酶含有能键合到所述基材上的氨基酸序列。一种含聚羟基链烷酸酯的结构体，该结构体至少一部分基材表面涂有聚羟基链烷酸酯，其包括：基材，固定在基材表面的聚羟基链烷酸酯合酶，和涂布在至少一部分基材表面上的聚羟基链烷酸酯，其中所述合酶含有能键合到所述基材上的氨基酸序列。

Description

含聚羟基链烷酸酯的结构体及其生产方法

发明领域

本发明涉及一种生产含聚羟基链烷酸酯结构体的方法，其包括在基材上固定参与聚羟基链烷酸酯生物合成反应的聚羟基链烷酸酯合酶的步骤，以及通过用该酶来聚合3-羟基酰基辅酶A以合成聚羟基链烷酸酯的方式，在至少一部分基材上涂覆聚羟基链烷酸酯。更具体而言，本发明涉及一种通过将聚羟基链烷酸酯合成酶固定在基材上的方式来生产含聚羟基链烷酸酯结构体的方法，其中聚羟基链烷酸酯酶含有能与基材结合的氨基酸序列。

本发明涉及一种具有聚羟基链烷酸酯的结构体，基材和固定在基材上的聚羟基链烷酸酯酶，且聚羟基链烷酸酯涂布在至少一部分基材上。本发明结构体包括一种粒状结构体(下文称作“囊状结构体”)，其中聚羟基链烷酸酯涂覆在一种粒状基材上，还包含一种平板状或膜状结构体(下文称作“层叠结构体”)，其中板状或膜状的基材至少一部分上涂覆有聚羟基链烷酸酯。

本发明结构体作为功能性结构体可找到广泛的应用。例如，囊状结构体可在多种功能性结构体方面具有大量应用，例如作为具有卓越分散稳定性的颜料分散剂，和用于静电照相的具有卓越静电特性的调色剂，层叠结构体可用作多种功能性结构体，包括OHP膜和电子设备。

相关背景技术

聚合物材料对于现代工业和我们的生活是非常重要的。那些便宜的，质量轻和具有良好的可模制性的材料被广泛用于包装材料和缓冲材料，或纤维材料，例如用于家用电子器件的盒子。另一方面，各种功能性材料，例如液晶材料和涂料也可通过利用这些聚合材料的稳定性能，通过在聚合物分子链上放置显示各种功能的取代基而得到。这些功能性材料的附加值比用于构造材料的聚合物的要高，因此可预期其具有大的市场需要，即使是小量。迄今为止，这些功能性聚合材料已通过有机合成化学方法在聚合物合成工艺中制备得到，或者通过用取代基对已合成的聚合物改性得到。在多数情况下，用于功能性聚合物材料的聚合物基本骨架是通过有机合成的化学方法从基于石油的原料得到的。这些聚合物的典型例子包括聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚酯，聚苯乙烯，聚氯乙烯和聚丙烯酰胺。

此外，本发明的发明者还集中精力研究了一种多层结构体，该结构体的基材涂布了一种聚合物，这种多层结构体作为一种基本元件给高分子化合物赋予了很大的附加值。具有非常有用的功能性的组合结构体可通过用聚合物涂布一种特殊的基材得到。

尽管用于涂布基材的高分子化合物是通过传统方式合成的，通过有机合成工艺制备，使其成为结构体，然后在其上加上各种官能团，最近通过生物工程方法制备高分子化合物的制备方法已被积极研究，且其一部分己具有实用性。已知的实施例包括从聚羟基链烷酸酯微生物(下文有时简写为PHAs)，例如聚-3-羟基-正丁酸(下文有时简写为PHB)、聚-3-羟基-正丁酸和3-羟基-正戊酸(下文有时简写为PHB/V)的共聚物，多糖，例如细菌纤维素和茁霉多糖，和聚氨基酸，例如聚-γ-谷氨酸和聚赖氨酸得到的多种高分子化合物。尤其是PHAs可通过熔融工艺或类似方式用于各种产品，例如传统的塑料，而且其显示出优异的生物适应性，因此期待其在包括用于医疗的柔性材料方面找到应用。

最近，已经开始努力在实验室中通过上述从微生物提取出的PHB合酶或PHA合酶来体外合成PHAs。

例如已成功地通过使从Alcaligenes eutrophus得到的PHB合酶作用于3-羟基丁酰CoA合成由3-羟基-正丁酸单元组成的PHB(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，6279-6283，1995)。此外，还成功地通过使从Alcaligenes eutrophus作用于3-羟基丁酰CoA或3-羟基戊酰CoA得到的PHB合酶合成由3-羟基-正丁酸单元或3-羟基-正戊酸单元组成的PHA(Int.J.Biol.Macromol.，25，55-60，1999)。而且，在该研究中报道由于酶的立体选择性，从外消旋3-羟基丁酰CoA合成出了仅由R形的3-羟基正丁酸单元组成的PHB。还已经报道通过使用从Alcaligenes eutrophus得到的一种PHB合酶体外合成一种PHB(Macromol.Rapid Commun.，21，77-84，2000)。

此外，还成功地通过使从Chromatium vinosum得到的PHB合酶作用于3-羟基丁酰CoA合成由3-羟基-正丁酸单元组成的一种PHB(FEMSMicrobiol.Lett，168，319-324，1998)。

已经通过使Pseudomonas aeruginosa(绿脓杆菌)的PHA合酶作用于3-羟基癸酸CoA来合成由3-羟基癸酸单元组成的一种PHA(Appl. Microbiol.Biotechnol.，54，37-43，2000)。

如上所述，将生物工程方法应用于高分子化合物可以合成与用传统有机合成方法难以实现的新的高分子化合物，并提供新的功能和结构体。此外，传统的有机合成化学方法需要多步骤的制备步骤，而生物工程方法在许多情况下仅需要单级步骤，因此预期简化生产步骤，节约成本并缩短周转时间。而且，该方法使得降低有机溶剂，酸，碱。表面活性剂等的用量，设定温和的反应条件，从非基于石油的原料和低纯度的原料并合成出目的材料成为可能，因此能够实现较低环境压力和资源再循环类型的合成工艺。此外，为了更详细描述低纯度原料的合成，生物工程合成工艺一般由于具有作为催化剂的酶的高的底物特异性，由此即使使用低纯度材料，也允许目标反应有选择地进行，因此有望利用废物和再循环原料。

另一方面，如前所述，本发明的发明者已经集中注意研究了通过用高分子化合物涂布一种基材而制成的一种结构体，作为关键技术使得高分子化合物具有较大的附加值。象这样，用高分子化合物涂布一种特定的基材可提供一种组合结构体，其具有非常有用的功能性。尤其是如果这种结构体可通过如前所述的生物工程方法制得，则利用一种用传统有机合成方法难以制得的新型高分子化合物或者新增加的功能和结构体成为可能，由此可以低成本实现低环境压力和资源再循环类型的制造工艺。例如，利用在活的有机体的催化反应中特定的精确的分子识别能力和立体选择性，可通过较低环境压力的、简单容易的工艺制备一种新型的高分子化合物，而该化合物的性能用传统的有机合成化学方法难以制得，或者制得一种用非常高的手性的高分子化合物涂布的囊状结构体或层叠状结构体。

因此本发明的一个目的是用生物工程方法提供一种具有高性能的高分子化合物结构体，及其制造方法，更具体的是用从微生物中提取的PHB合酶或PHA合酶来体外合成PHA以制得一种结构体，即用PHA涂布的基材时，更有效的利用酶的方法。此外，本发明的另一目的是提供一种这样的结构体，即用高分子化合物涂布的基材，该结构体能广泛地用作功能性组合结构体，及其有效的制造方法。

发明内容

本发明者已经进行的研究包括：从肽文库中筛选出能结合到基材上的肽的氨基酸序列，用基因工程方法将该氨基酸序列的肽与PHA合酶融合，并显示该肽，使得PHA合酶有效地固定在基材的表面上，通过将3-羟基酰基辅酶A加到所得材料上进行合成反应，使得找到一种有效地用所需PHA涂布基材表面的方法，由此完成本发明。换言之，本发明涉及一种用于制造含聚羟基链烷酸酯的结构体，至少该结构体的基材的一部分被涂布了聚羟基链烷酸酯，还涉及用于制备该结构体的方法，其包括在基材上固定含一种能结合到基材上的氨基酸序列的聚羟基链烷酸酯合酶，和加上酶的底物3-羟基酰基辅酶A。

本发明可有效地将PHA合酶固定在基材的表面上，因此当加入3-羟基酰基辅酶A进行合成反应时，不会产生游离的PHA颗粒，因此能够有效地用PHA涂布基材表面。

本发明所涉及的结构体具有这样一种结构，其中至少部分基材表面涂布了PHA，且当整个基材涂布了PHA层之后，可以得到囊状结构体，该结构体的基材成为核心。

附图简要说明

图1A和1B显示了对实施例4中用铜酞菁得到的PHA囊状结构体的外壳进行GC-MS分析的结果；

图2A和2B显示了对实施例8中用炭黑得到的PHA囊状结构体的外壳进行GC-MS分析的结果；

图3A和3B显示了对实施例12中用硅板得到的PHA层叠状结构体的层叠体进行GC-MS分析的结果；

图4显示了具有调色剂再利用机构的成像装置的简图；

图5显示了用于单组分显影剂的显影装置的主要部分的局部视图；

图6显示了定影装置的主要部分的分解透视图；

图7显示了当定影装置不运转时膜情况的主要部分的扩增局部视图。

发明具体实施方式

在本发明中，对于将涂布PHA的基材，只要它能够固定PHA合酶，就可以按需选择和使用一般的高分子化合物或无机固体材料，例如树脂，玻璃或金属。根据固定PHA合酶的方法，所制得结构体的应用形式等，可按需选择和使用基材的种类或结构体。

粒状基材(芯部)的例子包括使可聚合单体聚合得到的树脂颗粒，这些单体选自以下组，该组由基于苯乙烯的可聚合单体，如苯乙烯，α-甲基苯乙烯，β-甲基苯乙烯，邻甲基苯乙烯，间甲基苯乙烯，对甲基苯乙烯，2，4-二甲基苯乙烯，对正丁基苯乙烯，对叔丁基苯乙烯，对正己基苯乙烯，对正辛基苯乙烯，对正壬基苯乙烯，对正癸基苯乙烯，对正十二烷基苯乙烯，对甲氧基苯乙烯，和对苯基苯乙烯等；丙烯酸可聚合单体，例如丙烯酸甲酯，丙烯酸乙酯，丙烯酸正丙酯，丙烯酸异丙酯，丙烯酸正丁酯，丙烯酸异丁酯，丙烯酸叔丁酯，丙烯酸正戊酯，丙烯酸正己酯，丙烯酸2-乙基己酯，丙烯酸正辛酯，丙烯酸正壬酯，丙烯酸环己酯，丙烯酸苄酯，丙烯酸二甲基磷酸乙酯，丙烯酸二乙基磷酸乙酯，丙烯酸二丁基磷酸乙酯和丙烯酸2-苯甲酰氧基乙酯；甲基丙烯酸可聚合单体，例如甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸正丙酯，甲基丙烯酸异丙酯，甲基丙烯酸正丁酯，甲基丙烯酸异丁酯，甲基丙烯酸叔丁酯，甲基丙烯酸正戊酯，甲基丙烯酸正己酯，甲基丙烯酸-2-乙基己酯，甲基丙烯酸正辛酯，甲基丙烯酸正壬酯，甲基丙烯酸二乙基磷酸乙酯，甲基丙烯酸酸二丁基磷酸乙酯；基于乙烯基的可聚合单体，包括甲撑脂肪族单羧酸酯，乙烯酯，例如醋酸乙烯酯，丙酸乙烯酯，苯甲酸乙烯酯，丁酸乙烯酯，苯甲酸乙烯酯和甲酸乙烯酯；乙烯醚，例如乙烯基甲醚，乙烯基乙醚，和乙烯基异丁醚；乙烯酮，例如乙烯基甲基酮，乙烯基己基酮和乙烯基异丙基酮组成；或者通过向上述单体加入各种添加剂，例如带极性基团的聚合物和着色剂，制得的树脂颗粒；含有石蜡，聚烯烃蜡，Fischer Tropshch蜡，酰胺蜡，高级脂肪酸，酯蜡，及其衍生物；其接枝化合物，或其嵌段聚合物的微粒；粘土矿物，例如高岭土，膨润土，滑石和云母；金属氧化物，例如氧化铝和二氧化钛；不溶的无机盐，例如硅胶，羟基磷灰石和磷酸钙凝胶；黑色颜料，例如炭黑，氧化铜，二氧化锰，苯胺黑，活性炭，非磁性铁氧体和磁铁；黄色颜料，例如铬黄(黄铅)，锌黄，黄氧化铁、镉黄、矿物坚牢黄、镍钛黄，Neburs黄，萘酚黄S，汉萨黄G，汉萨(耐晒)黄10G，联苯胺黄G，联苯胺黄GR，喹啉黄色淀，永久黄NCG和酒石黄色淀；橙色颜料，例如铬橙，钼橙，永久橙GTR，吡咯啉酮橙，乌尔康橙，联苯胺橙G，阴丹士林亮橙RK和阴丹士林亮橙GK；红色颜料，例如氧化铁红，镉红铅，硫化汞，镉，永久红4R，立索红，吡咯啉酮红，沃丘格红钙盐，色淀红C，色淀红D，亮胭脂红6B，亮胭脂红3B，曙红色淀，若丹明色淀B，或茜素色淀；蓝色颜料，例如米洛丽蓝，钴蓝，碱性蓝色色淀，维多利亚蓝色色淀，酞菁蓝，非金属酞菁蓝，部分氯化的酞菁蓝，坚牢天蓝和阴丹士林蓝BC；紫色颜料，例如锰紫，坚牢紫B或甲基紫色淀；绿色颜料，例如氧化铬，铬绿，颜料绿B，孔雀石绿色色淀和终黄绿G；白色颜料，例如锌白，钛白，锑白，硫化锌；和体质颜料，例如氧化钡粉末，碳酸钡，粘土，二氧化硅，白炭黑，滑石和氧化铝白组成。当然，颗粒状基材不限于这些物质。如果需要可以将两种或多种上述物质组合使用。如果需要，基于其应用可以选择基材的形状，例如使用粒径为0.1微米到1.0毫米的颗粒较好。

此外，其它形式的基材，包括由塑料例如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)，二醋酸酯，三醋酸酯，赛璐玢，赛璐珞，聚碳酸酯，聚酰亚胺，聚氯乙烯，聚(偏二氯乙烯)，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯和聚酯制成的薄膜；多孔的聚合物薄膜，例如聚氯乙烯，聚乙烯醇，乙酰纤维素，聚碳酸酯，尼龙，聚丙烯，聚乙烯和聚四氯乙烯；木制板，玻璃板，硅板，织物，例如棉花，人造纤维，丙烯酸，丝和聚酯；纸，如高质量纸，中质量纸，铜版纸，证券纸，再生纸，氧化钡纸，浇铸涂布的纸，波纹纸板，和涂布了树脂的纸制得的膜。当然，基材不限于这些材料。而且，即使前述基材的表面是平整或不平整的，或者即使其是透明的，半透明的或不透明的，这些材料也是可以接受的。而且将前述基材中的两种或多种互相结合在一起制得的材料也是可接受的。

为了获得与本发明基材具有结合亲和力的肽的氨基酸序列，可提供如下所述的噬菌体显示肽文库的一个实施例。为形成一种噬菌体无序肽文库，一种无序合成基因，例如，连接至M13底物噬菌体的表面蛋白质(例如基因III蛋白质)的N端侧基因上。这种方法已经由Scott，JK.和Smith GP.，(Science，Vol.249，386，1990)，Cwirla，SE等人(Proc. Natl.Acad.Sci.USA Vol.87，6378，1990)以及其他人所报导。只要该肽被稳定表达，则要插入的基因的尺寸没有特别限定，由此可覆盖已形成肽文库的所有无序序列；但是，为了具有结合能力，相应于氨基酸数目的大小为6到40(相当于约600到4000的分子量)是合适的，其中优选相当于7到18个氨基酸的尺寸。为了选择一种结合到目标基材上的噬菌体，基材，例如被固定到柱子上或者板上，将以上所述的文库与基材接触，则结合的噬菌体保留，而未结合的噬菌体被冲走。用酸等将冲洗后留下的噬菌体洗脱，用缓冲剂中和该洗脱液，然后将噬菌体感染大肠杆菌以扩增。多次重复该选择方法，浓缩出大量能结合到目标基材上的克隆。此时为了得到单个克隆，该噬菌体再次感染大肠杆菌，以在培养板上制作出一个菌落。在液体培养基中培养各单独菌落之后，将存在于培养基上清液中的噬菌体用聚乙二醇或类似物使之沉降下来，纯化。通过对其碱基序列进行分析来确定肽的结构。

为形成一种具有无序氨基酸序列的肽文库，除了上述使用噬菌体的方法之外，还可以使用化学合成得到的肽。该方法包括，例如使用微珠的方法(Lam，KS等，Nature，354，82，1991)，一种液相聚焦方法(Houghton，RA等，Nature，354，84，1991)，和微板方法(Fodor，SPA等，Science，251，767，1991)，这些方法均可用于本发明。

可以这样利用通过上述方法获得的与基材有结合亲和力的多肽的氨基酸序列，用通常的基因工程方法将该序列融合到聚羟基链烷酸酯合酶中。能结合到基材上的肽可通过与聚羟基链烷酸酯合酶的N端或C端相连来表达。此外，也可以插入一合适的间隔序列来表达该肽。

间隔序列优选具有约3到400个氨基酸，且该序列可含任何氨基酸，更优选的是，间隔序列是一种不会妨碍PHA合酶功能，或者是不干扰PHA合酶结合到基材上的的一种序列。

<PHA>

能用于本发明的PHA没有特别的限定，只要能够用涉及在PHA生物合成反应中的PHA合成酶合成该PHA即可。

在本文中，PHA的生物合成方法是通过使用作为底物的(R)-3-羟基酰基CoA的酶促聚合反应实现的，该酰基CoA是从作为底物的链烷酸在生物体中用各种代谢途径制得的(例如β-氧化体系，和脂肪酸合成途径)。是PHA合成酶(也称作PHA聚合酶，PHA合酶)来催化该聚合反应的。术语“CoA”是辅酶A的缩写，其化学结构体如下：

以下显示了用聚合反应从链烷制得PHA的反应，其中使用了β-氧化体系和PHA合成酶。

另一方面，如果反应是通过脂肪酸合成通路来实施的话，则可认为PHA是类似地用(R)-3-羟基酰基CoA作为底物的PHA合酶来合成的，其中该底物是由(R)-3-羟基酰基-ACP(ACP是指一种酰基载体蛋白)转变而来。

此外，已知可以从细胞中提取出上述PHB合成酶和PHA合成酶，以在无细胞系统(体外)中合成PHA，以下将描述特定的例子。

例如，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，6279-6283(1995)中，报道了通过使3-羟基丁酰CoA作用于从Alcaligenes eutrophus中得到的PHB合成酶，成功地合成出包含3-羟基正丁酸单元的PHB。此外，在Int.J.Biol.Macromol.，调整25，55-60(1999)中报道了通过使3-羟基丁酰CoA和3-羟基戊酰CoA作用于从Alcaligenes eutrophus中得到的PHB合成酶，成功地合成出包含3-羟基正丁酸单元或3-羟基正戊酸单元的PHA。此外，根据该报告，当使外消旋的3-羟基丁酰CoA被该酶作用时，用于酶的立体选择性，合成出仅包含R-构型的3-羟基丁酸单元的PHB。在Macromol.Rapid Communn，21，77-84(2000)中还报道了在细胞之外用从碱基因肥土植物得到的PHB合成酶合成PHB。此外，在FEMS Microbiol.Lett，168，319-324(1998)中报道了通过使3-羟基丁酰CoA被从Chronatium vinosum得到的PHB合成酶作用，成功地合成出包含3-羟基正丁酸单元的PHB。在Appl.Microbiol.Biotechnol.，54，37-43(2000)中报道了通过使3-羟基癸酰CoA被从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)得到的PHA合成酶作用，成功地合成出包含3-羟基癸酸单元的PHA。

通过这种方式，PHA合成酶是在生物体中催化PHA合成反应体系中最后阶段的一种酶，且已知的任何能在生物体中合成的PHA都是在该酶的催化下合成的。因此在本发明中，通过使相应于所需PHA的3-羟基酰基CoA被固定在培养基上的酶作用上，可制备出具有任何能在生物体中合成的PHA类型的涂布了颜料的囊状结构体。

作为一个用于本发明的PHA的实施例，可特别地示出至少含以下所示的通式[1]到[10]表示的单体单元的PHA。

(其中该单体单元至少从以下组选择一个，该组由具有任何以下R1和a组合的单体单元组成：)

R1表示氢原子(H)，a表示0到10的整数的单体单元；

R1表示卤原子，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示发色团，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示羧基或其盐，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示

a表示1到7的整数的单体单元。)

(其中b表示0到7的整数，R2表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中c表示1到8的整数，R3表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中d表示0到7的整数，R4表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中e表示1到8的整数，R5表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅，-C₃F₇，-CH₃，-C₂H₅和-C₃H₇组成。)

(其中f表示0到7的整数)

(其中g表示1到8的整数)

(其中h表示1到7的整数，R6表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-COOR’，-SO₂R”，-CH₃，-C₂H₅，-C₃H₇，-CH(CH₃)₂，-C(CH₃)₃组成，其中R’表示氢原子(H)，Na，K，-CH₃和-C₂H₅，R”表示-OH，-ONa，-OK，卤原子，-OCH₃和-OC₂H₅。)

(其中i表示1到7的整数，R7表示选自以下组的任何一个基团，该组由10氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-COOR’，-SO₂R”组成，其中R’表示氢原子(H)，Na，K，-CH₃和-C₂H₅，R”表示-OH，-ONa，-OK，卤原子，-OCH₃和-OC₂H₅。)

(其中j表示1到9的整数。)

此外，上述卤原子的例子包括氟。氯和溴。

用于合成上述PHA的作为底物的3-羟基酰基CoA的具体例子可以是用如下化学式[12]到[21]表示的3-羟基酰基CoA：

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R1和a的定义与在以上通式[1]表示的单体单元中的R1和a的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R2和b的定义与在以上化学式[2]表示的单体单元中的R2和b的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R3和c的定义分别与在以上所述的化学式[3]表示的单体单元中的R3和c的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R4和d的定义分别与在以上所述的化学式[4]表示的单体单元中的R4和d的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R5和e的定义分别与在以上所述的化学式[5]表示的单体单元中的R5和e的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且f的定义与在以上所述的化学式[6]表示的单体单元中的f一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且g的定义与在以上所述的化学式[7]表示的单体单元中的g一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且h和R6的定义分别与在以上所述的化学式[8]表示的单体单元中的h和R6一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且i和R7的定义分别与在以上所述的化学式[9]表示的单体单元中的i和R7一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且j的定义与在以上所述的化学式[10]表示的单体单元中的j一样。)

此外，当基材的表面在含PHA的结构体中是亲水的时，具有亲水功能基团的PHA作为构成含PHA结构体的PHA。亲水功能基团可以是任何亲水功能基团，但可以使用阴离子官能团，且该阴离子官能团可以是任何阴离子官能团，但具体可以使用羧基。具有羧基的PHA的例子可以是含有至少一个选自以下组的基团的PHA，该组由以下通式[11]表示的单体单元组成。

(其中K表示1到10的任一整数。)

此外，上述PHA的具体例子可以是含以下通式[23]表示的3-羟基庚二酸的PHA。

此外，用作合成以上通式[11]所示的PHA的底物的3-羟基酰基CoA的例子可以是以下通式[22]表示的3-羟基酰基CoA。

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且k的定义与在以上所述的化学式[11]表示的单体单元中的k一样。)

此外，用作合成以上通式[23]所示的含3-羟基庚二酸的底物的3-羟基酰基CoA的例子可以是以下通式[24]表示的3-羟基庚二酰CoA。

而且，上述卤原子的具体例子可包括氟，氯和溴。此外，上述发色团没有特别的限制，只要其3-羟基酰基CoA本体能受到PHA合成酶的催化作用的影响，但如果考虑在合成聚合物的过程中可能发生的空间位阻，更理想的是在3-羟基酰基CoA中，存在于与CoA键合的羧基和发色团之间的甲撑链具有1到5个碳原子。此外，如果该发色团的光吸附波长在可见光范围，可以得到带颜色的含PHA的结构体。这种发色团的例子可包括亚硝基，硝基，偶氮基，二芳基甲烷，三芳基甲烷，呫吨，吖啶，喹啉，次甲基，噻唑，吲达胺，吲哚酚，内酯，氨基酮，羟基酮，茋，吖嗪，噁嗪，噻嗪，蒽醌，酞菁和靛类染料。

对于用于本发明的PHA，还可以使用包含上述多个单体单元的各无规共聚物和嵌段共聚物，因此利用各种单体单元和所含的功能基团的特性可以控制PHA的性能，并提供多种功能，从而利用官能团之间的相互作用实现新功能等。此外，通过选择合适的量和顺序，还可以在基材表面上合成具有任意顺序和组成的嵌段共聚物，其中3-羟基酰基CoA作为底物加入。此外，如果需要，在合成PHA之后或者之时，还可进行化学修饰等。

还可以在含聚羟基链烷酸酯结构体的层叠方向改变PHA单体单元的组合物到其外侧，例如通过随时间改变作为底物的3-羟基酰基CoA的组成和浓度。因此，例如，如果需要形成带有对基材具有低亲和力的PHA的涂布结构体，首先用对基材具有高亲和力的PHA覆盖基材，且对基材具有高亲和力的PHA的单体单元的组合物在层叠方向变为所需单体单元的组合物，以形成例如多层结构体或者梯度结构体，由此可以形成一键合得到增强的基材上的PHA覆盖层。

此外，PHA的化学修饰可使含聚羟基链烷酸酯的结构体具有各种改进的特性。例如，将接枝链段掺入到PHA中，可以使至少部分基材已被涂布PHA的含聚羟基链烷酸酯的结构体具有归因于接枝链段的各种特性。而且，通过使PHA交联，可以使至少部分基材已被涂布PHA的含聚羟基链烷酸酯的结构体具有期望的物理化学特性(例如，机械强度，抗化学品性能和耐热性)。本发明使用的术语“化学修饰”是指聚合物分子结构体可通过聚合物分子内或分子间的化学反应，或者聚合物和另外一种化学物质之间的化学反应而改变。术语“交联”是指聚合物被化学或者物理化学方式分子内或分子间键合，以形成一种网状结构体。而且，交联试剂是指与前述聚合物具有一定反应性的物质，加入该物质以实施上述交联反应。

而且，在本发明结构体中使用的用PHA合成酶合成的PHA，一般是一种仅由R-构型构成的等规立构聚合物。

为了使用，可从体外酶合成方法，使用例如微生物和植物的生物体的体内合成方法，化学合成方法等的合成方法中选取一种合适方法合成作为PHA合成底物的3-羟基酰基CoA。具体而言，酶合成方法是一种用于合成底物的方法，已知的酶合成方法包括利用市售可得的酰基CoA合酶、使用以下反应的方法(酰基CoA连接酶，E.C.6.2.1.3)(Eur.J.Biochem.，250，432-439(1997)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54，37-43(2000)等)：

               酰基CoA合酶

3-羟基链烷酸+CoA→3-羟基酰基CoA

对于利用酶和生物体的合成方法，可使用间歇式(batch type)合成方法，或者利用固定化酶和固定化细胞连续生产。

<PHA合成酶以及用于生产酶的微生物>

对于用于本发明的PHA合成酶，可以使用从能够生产酶的微生物中选取的合适微生物，或者其PHA合成酶基因引入到底物中的转化体。

对于用于制备PHA合成酶的微生物，可以使用产生PHB或PHB/V的微生物，作为这些微生物，除了使用Aeromonas sp.，Alcaligenes sp.，Chromatiumsp.，Comamonas sp.，Methylobaterium sp.，Paracoccus sp.，Pseudomonas sp.等之外，还可以使用本发明者已经分离出来的Burkholderia cepacia KK01，Ralstonia eutropha TB64，Alcaligenes sp.TL2。此外，在经济产业省生命工学工业技术研究所专利微生物保藏中心中，KK01，TB64和TL2的保藏号分别为FERMBP-4235，FERMBP-6933，FERMBP-6913。

而且，作为用于生产PHA合成酶的微生物，可以使用产生mc1-PHA和非常规-PHA的微生物，作为这些微生物除了Pseudomonas oleoborans，Pseudomonas resinoborans，Pseudomonas sp.61-3，Pseudomonas putidaKT2442，Pseudomonas aeruginosa以及类似物，还可以使用Pseudomonas属微生物，例如已被本发明者分离出来的Pseudomonas putida P91，Pseudomonascichorii H45，Pseudomonas cichorii YN2，Pseudomonas jessenii P161等的微生物，在待审公开号为2001-78753的日本专利申请中描述的Burkholderia属微生物，以及在待审公开号为2001-69968的日本专利申请中描述的Burkholderiasp.OK4(FERM P-17371)微生物。而且，除了这些微生物之外，还可使用属于Aeromonas sp.，Comamonas sp.和类似物，和产生mc1-PHA和非常规-PHA的微生物。

此外，在就专利程序而言国际公认的微生物保藏布达佩斯条约下，在经济产业省生命工学工业技术研究所专利微生物保藏中心中，P91，H45，YN2和P161的国际保藏号分别为FERM BP-7373，FERM BP-7374，FERM BP-7375和BP-7376。

至于在生产本发明PHA合成酶中使用的微生物的通常培养方法，可合适地选择使用例如制备菌株原料，为保证生产PHA合成酶所需的细胞数目和其活性状态的繁殖方法，和含为使所用微生物生长所需组分的培养基。例如可以使用任何类型的培养基如通常的天然培养基(肉汁，酵母提取物等)和带有加入的营养源的合成培养基，除非这些培养基对微生物的生长和存活有不利的影响。

至于培养方法，可以使用任何的液体培养和固体培养方法，只要可以增殖微生物即可。此外，可使用任何类型的培养方法，包括批量培养，加料批量培养，半连续培养和连续培养。至于液体批量培养形式，利用了如下方法，一种方法中的氧气是通过摇瓶振动来提供的，一种方法中的氧气是用带有搅拌充气系统的发酵罐来提供的，以及其它类似方法。此外，可以使用一种多级方法，其中这些步骤与多个阶段相连。

当用以上所述的生产PHA的微生物生产PHA合成酶时，可以使用例如这样的一种方法，其中微生物在含例如辛酸和壬酸的链烷酸的无机培养基中生长，用离心方法或类似方法收集对数生长期到平台期早期中的微生物细胞，以提取所需的酶等等。此外，如果用如上所述的情况培养微生物，则在微生物的一个细胞中从所加的链烷酸得到mc1-PHA，但是在这种情况下，一般说来PHA合成酶以这样的方式存在，所得PHA在细胞中结合成小颗粒。但是发明者指出该研究的结果是这样的，已发现即使从任一上述方法培养的细胞碎片进行液体离心作用后，在上清液中存在着几乎相等的酶活性。设想这是由于在培养相对早的阶段中以游离状态存在着相当量的PHA合成酶，该阶段是以上所述的从对数生长阶段到固定阶段早期，和由于酶在细胞中连续不断地活泼地产出。

对于用在上述培养方法中的无机培养基，可使用任何含能使微生物生长的组分的培养基，例如磷源(例如磷酸)和氮源(例如铵盐，硝酸盐等)，且无机培养基可包括例如MSB培养基，E培养基(J.Biol.Chem.，218，97-106(1956))和M9培养基。此外，用于本发明实施例的M9培养基如下：

Na₂HPO₄：6.2g

KH₂PO₄：3.0g

NaCl：  0.5g

NH₄Cl： 1.0g

(每升培养基，pH为7.0)

此外，在上述无机培养基中，优选加入含如下所示的微量组分的约0.3％(V/V)溶液，以保证微生物能满意地生长，并生产出PHA合成酶：

(含微量成分的溶液)

次氮基三醋酸：1.5g

MgSO₄： 3.0g

MnSO₄： 0.5g

NaCl：  1.0g

FeSO₄： 0.1g

CaCl₂： 0.1g

CoCl₂： 0.1g

ZnSO₄： 0.1g

CuSO₄： 0.1g

AlK(SO₄)₂：0.1g

H₂BO₃：0.1g

Na₂MoO₄：0.1g

NiCl₂： 0.1g(每升)

培养温度可以是任何温度，且在温度下上述微生物可满意地生长，例如14到40℃，优选20到35℃。

而且还可以用具有上述PHA生产用微生物的PHA合成酶基因的转化体来生产所需的PHA合成酶。依据已构建的方法可以实现对PHA合成酶的克隆，表达媒介体的制备和转化体的制备。在例如以大肠杆菌作为宿主的微生物得到的转化体中，在培养时使用的培养基是天然培养基或合成培养基，例如LB培养基，M9培养基或类似物。培养温度的范围是25到37℃。此外，需氧培养要实施8到27小时，以使微生物生长。此后，可收集细胞，以收集在细胞中积聚起来的PHA合成酶。如果需要可在培养基中加入抗菌素，例如卡那霉素，氨苄青霉素，四环素，氯霉素和链霉素。而且，当在表达媒介体中使用诱导启动子时，当培养转化体时，可将相应于启动子的诱导剂加入培养基中，以促进表达。这种诱导剂包括，例如异丙基-1-硫基-β-D-半乳糖苷(IPTG)，四环素和吲哚丙烯酸(IAA)。

对于PHA合成酶，可以使用从微生物细胞的碎片得到的液体，或者用硫酸铵沉淀盐析收集的蛋白质组分的粗酶等，或者可以使用各种方法纯化的酶。如果需要可以加入稳定剂如金属盐，甘油，二硫苏糖醇，EDTA和牛血清白蛋白，以及活化剂。

为了分离和提纯PHA合成酶，可以使用任何可保留PHA合成酶活性的方法。例如用压榨机，超声波破碎机，溶菌酶，各种表面活性剂等将所得的微生物细胞粉碎，此后，通过离心作用得到粗制的酶溶液或者由此制得的的硫酸铵盐析物，可单独使用或组合使用例如亲和色谱法，阳离子或阴离子交换色谱法，和凝胶渗透法，由此可得到纯化的酶。具体来说，可通过用带有“标记”的结合的蛋白质来表达蛋白质，更方便地纯化基因重组蛋白质，该“标记”例如键合到N端和C端的组氨酸残基，并通过这些标记使蛋白质键合到一亲和树脂上。为了从结合的蛋白质分离出所需蛋白质，可使用利用蛋白酶，例如凝血酶和凝血因子Xa使键裂解的方法，降低pH，加入高浓度的咪唑以作为一竞争性的结合剂等。此外，当使用pTYB1(由New England Biolab Co.，Ltd.生产)作为表达载体时，如果标记物包括intein，则用二硫苏糖醇或类似物获得还原条件，以使键裂解。至于能用亲和色谱纯化的结合蛋白质，除了组氨酸标记之外，公知的还有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，壳多糖键合区域(CBD)，麦芽糖键合蛋白质(MBP)和硫代还原酶(TBX)。GST结合蛋白质可用GTS亲和树脂进行纯化。

可用各种报道方法测量PHA合成酶的活性，例如，通过以下方法可以测量其活性，其测量原理是在测量时，在PHA合成酶的催化作用下3-羟基酰基CoA聚合形成PHA的过程中CoA被释放，用5，5’-二硫基-二(2-硝基苯甲酸)将CoA着色。试剂1：将牛血清白蛋白(由Sigma Co.，Ltd制造)溶解在0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲剂(pH为8.0)中，其浓度为3.0mg/ml；试剂2：将3-羟基辛酰CoA溶解在0.1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲剂(pH为8.0)中，其浓度为3.0mM；试剂3：将三氯醋酸溶解在0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲剂(pH为8.0)中，浓度为10mg/ml；以及试剂4：将5，5’-二硫基二(2-硝基苯甲酸)溶解在0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲剂(pH为8.0)中，其浓度为2.0mM。第一反应(PHA合成反应)：将100微升的试剂1加入到100微升的样品(酶)溶液中，并混合在一起，在30℃下预温孵1分钟。将100微升的试剂2加到其中，并混合在一起，在30℃下温孵1到30分钟，此后向其中加入试剂3，以终止反应。第二反应(对游离的CoA着色的反应)：对反应已经终止的第一反应溶液进行离心作用(15000×g，10分钟)，在500微升该溶液的上清液中加入500微升的试剂4，在30℃下预培养10分钟，随后在412nm处测量其吸附值。计算酶的活性：每分钟解离1微摩尔CoA的酶的用量定义为一个单位(U)。

<制备结构体>

用于产生含本发明聚羟基链烷酸酯的结构体的一方法实施例至少包括如下步骤：(1)在基材上固定PHA合成成酶，该酶含能键合到基材上的氨基酸序列，(2)加入底物3-羟基酰基CoA，(3)进行PHA合成反应，以及(4)依据应用，如果需要加工含聚羟基链烷酸酯的结构体，该结构体已被涂布上该聚羟基链烷酸酯。

能键合到本发明基材上的氨基酸序列是这样一种氨基酸序列，通过对无序肽文库进行筛选来确定，或者利用基材的化学特性来合理地设计氨基酸序列来确定。

本发明无序肽文库包括一种无序合成肽文库，其中用化学方法合成一种可溶形式的无序肽；包括一种固相固定肽文库，其中肽是在树脂珠上合成的；包括一种肽文库，其中是采用化学方法合成的无序DNA在无细胞体系中在核糖体中通过生物方式合成的；包括一噬菌体显示肽文库，其中例如将无序合成基因与M13系噬菌体表面蛋白质(例如gene III蛋白质)N端侧基因相连而制得包括一种无序肽文库，其中用上述类似方法，使细菌的膜蛋白OmpA(Francisco等，1993，PNAS，90，10444-10448，或者Pistor和Hoborn，1989，Klin.Wochenschr.，66，110-116)，PAL(Fchs等，1991，Bio/Technology，9，1369-1372)，Lamb(Charbit等，1988，Gene，70，181-189和Bradbury等，1993，Bio/Technology，1565-1568)，微丝结合蛋白(Hedegaard和Klemm，1989，Gene，85，115-124，和Hofnung，1991，Methods Cell Biol.，34，77-105)和IgA蛋白酶β区(Klauser等，1990，EMBO J.，9，1991-1999)融合，并使之表现。

通过这些无序肽文库筛选能键合到基材上的氨基酸序列的方法，当使用化学合成肽文库时，其包括使肽文库与一种基材接触，除去不能键合到基材上的肽，此后通过使用Edman降解方法等回收键合到基材上的肽，以确定该氨基酸序列。

另一方面，当使用噬菌体显示肽文库时，如果基材是颗粒状的话，基材被固定在柱子或板上，或者如果基材是板状的话，前述肽文库直接加在基材表面上，以使二者接触，然后保留键联的噬菌体，将非键联的噬菌体冲走。冲洗后留下的噬菌体用酸等进行洗脱。用一种缓冲液中和之后，将该噬菌体感染大肠杆菌，以将其扩增。多次重复该选择方法，则浓缩多个能键合到目标基材上的克隆。此时，为获得单个克隆，再一次将噬菌体感染大肠杆菌，以在培养板上制备一菌落。在液体培养基中培养各单独菌落之后，培养基上清液中存在的噬菌体被用聚乙二醇或类似物沉降，纯化。通过对其碱基序列进行分析来确定该肽的结构。

通过噬菌体显示肽文库来筛选能键合到基材上的肽可适用于本发明，因为其中包括了对更强烈地键合到基材的噬菌体进行浓缩的操作，又称作淘洗选法，因此可以选择更可靠的肽候选物。构建噬菌体无序肽文库的方法包括，例如将一无序合成基因连接到M13系噬菌体表面蛋白质(例如gene III蛋白质)的N端侧的基因上。该方法已被Scott，JK.和SmithGP.，(Science Vol. 249，389，1990)，Cwirla，SE等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.87，6378，1990)等所报导。不要该肽被稳定表达，对将要插入的基因的尺寸没有特别的限定；但是，为了覆盖所形成肽文库的所有无序序列，而且使这些序列具有键合能力，相应于6到40个氨基酸数目的长度(相当于分子量为约600到4000)是合适的，优选其中相应于7到18个氨基酸的长度。

当通过筛选噬菌体显示肽文库，得到两种或更多种能键合到基材上的肽时，将从这些肽组成的组中选取的至少一种肽的所有或部分氨基酸序列以一种合适的组合方式串联组合在一起，以作为一种能键合到所用基材的肽也是可以的。此时，理想的是在两种氨基酸序列之间设立一种合适的间隔序列。该间隔序列优选具有约3到400个氨基酸，且该序列可含任何氨基酸。最优选的是，该间隔序列是一种不会阻止PHA合酶功能或不影响PHA合酶键合到基材的序列。

能键合到本发明基材上的氨基酸序列是一种通过筛选无序肽文库确定的氨基酸序列，或者也可以是由基材的化学特性合理设计的一种氨基酸序列。

通过将能键合到基材并已经与PHA合酶融合和已显示的氨基酸序列，将PHA合酶相对于基材固定。包括PHA合酶等的酶蛋白质是多个氨基酸键合多肽，其通过例如赖氨酸，组氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸具有游离离子基团的氨基酸显示出离子吸附剂的特性，由具有疏水基团的氨基酸，例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和脯氨酸，也由于是有机高分子，其还显示出疏水吸附剂的特性。相应的，虽然固定程度有不同，可将酶蛋白固定在具有离子性，疏水性或既有离子特性又有疏水特性的基材上。

当使用其表面主要存在离子型官能团的基材时，例如含粘土矿物或金属氧化物等作为主要成分的无机颜料时，可通过选择含具有游离离子基团的氨基酸，例如赖氨酸，组氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸多的氨基酸序列，作为能键合到基材上的氨基酸序列，将其融合到合酶上并使其显示，通过离子吸附方法PHA合酶固定。

此外，当所用的表面主要是非极性的基材，例如具有多个芳环或稠合多环酞菁类颜料或蒽醌类颜料等有机颜料，或者是炭黑等含碳晶体的无机颜料，可通过选择含疏水基的氨基酸序列，例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和脯氨酸多的氨基酸序列，作为能键合到基材上的氨基酸序列，将其融合到合酶上并使其显示，通过疏水吸附方法将PHA合酶固定。

用通常的基因工程方法，将用上述方法得到的能键合到基材上的氨基酸序列融合到聚羟基链烷酸酯合酶中。可通过连接聚羟基链烷酸酯的N端或C端表达能键合到基材上的肽，而且，还可通过插入一种合适的间隔序列来表达该肽。

优选的间隔序列具有约3到400个氨基酸，且该序列可含任何氨基酸。更优选的是该间隔序列是一种不会阻止PHA合酶功能或不影响PHA合酶键合到基材的序列。

当用上述操作方法筛选噬菌体显示肽文库，确定两种或更多种能键合到基材上的肽时，可在本发明中使用分别将这些肽融合到PHA合酶中制得的多种PHA合酶的混合物。

对于分离和纯化如上所述含有能键合到基材的氨基酸序列的PHA合酶的方法，只要能维持PHA合酶的酶活性的，则可以使用任何方法。

通过在一种水性培养基中，使含有能键合到基材的氨基酸序列的PHA合酶与基材接触可以将PHA合酶固定在基材上。

用于合成PHA的水性培养基的组分可以是不影响实施PHA合成反应步骤的任何组分，但是可将该组合物调整成使PHA合成酶活性充分发挥的组合物，以简化随后的步骤。作为使PHA合成酶活性充分发挥的组合物，可使用例如一种缓冲液。对于该缓冲液，可合适地使用用于生化反应的通常缓冲液，例如醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，磷酸钾缓冲液，3-(N-吗啉代)丙烷磺酸酯(MOPS)缓冲液，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸酯(TAPS)缓冲液，Tris-盐酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，和2-(环己基氨基)乙烷磺酸酯(CHES)缓冲液。能使PHA合成酶活性充分发挥的缓冲液的浓度可以是一种通常的浓度，即为5mM到1.0M，优选范围是10到200mM。而且还要调整pH值，使其为5.5到9.0，优选为7.0到8.5，但是不排除使用上述范围之外的pH条件的可能性，其取决于PHA合成酶的最合适的pH和pH稳定性。

此外，当基材是粉状时，为在水性培养基中维持基材的分散情况，可加入一种表面活性剂，只要该表面活性剂的类型和浓度不影响其后的步骤。表面活性剂的例子可包括，例如阴离子型表面活性剂，例如油酸钠，十二烷基磺酸钠，十二烷基硫酸钠，十二烷基-N-甲基甘氨酸钠，胆酸钠，脱氧胆酸钠和牛脱氧胆酸钠；阳离子型表面活性剂，例如十六烷基三甲基铵溴化物和十二烷基吡啶氯化物；两性表面活性剂，例如3-[(络胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸(CHAPS)，3-[(3-(络胆酰胺丙基)二甲基氨基)]-2-羟基-1-丙烷磺酸(CHAPSO)，棕榈酰基溶血卵磷脂和十二烷基-β-丙氨酸；和非离子表面活性剂，例如辛基葡糖苷，辛基硫代葡糖苷，庚基硫代葡耱苷，癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)，聚氧乙烯十二烷基醚(Brij，Lubrol)，聚氧乙烯壬基苯基醚(Nonidet P-40，Triton N)，聚氧乙烯脂肪酸酯(Span)和聚氧乙烯山梨醇酯(Tween)。

此外，为维持基材在水性培养基中的粉状分散状态，可加入一种合适的辅助溶剂，只要其类型和浓度不影响随后的步骤。对于该辅助溶剂，可以选择和使用一种或两种选自例如，如己烷之类的直链脂肪烃，及例如一元醇，如甲醇和乙醇的衍生物，如甘油的多元醇，以及脂肪酸醚和羧酸酯的物质。

在一种指定水性培养基中将基材和PHA合酶混合以得到指定浓度，可用离子吸附方法或者疏水吸附方法将PHA合酶固定在基材上。在这种情况下，理想的是用合适的强度振荡或搅拌反应容器，由此酶被均匀地吸附到基材表面。

在上述固定处理方法中，理想的是在制备基材和酶混合物水性培养基组合物时考虑到基材和PHA合成酶的表面电荷正负、电荷量和疏水性随着水性培养基的pH和盐浓度而变化的事实。例如，当基材主要是离子吸附性时，则降低盐的浓度可以增加使基材和PHA合酶之间吸附的电荷量。此外，改变pH可增加这两者的相反电荷的量。当基材主要是疏水吸附性时，增加盐的浓度可以增加这两者的疏水性。此外，通过预先测量湿润角和电泳以检查基材和PHA合酶的充电情况和疏水性，可构建一种适于表面吸附的组合物。此外，直接测量所吸附的基材和PHA合酶的量也可获得该组合物。用于测量吸附量的方法可包括向基材加入一种已知浓度的PHA合酶溶液，进行吸附处理，此后测定溶液中HA合酶浓度，以求出所吸附的酶量。

当考虑到失活的可能性以及操作的复杂性时，为了强化用离子吸附方法或疏水吸附方法将酶固定的方法，可使用共价键联方法。这种方法包括例如对具有芳香氨基的基材进行重氮化以使重氮基与酶偶联成为最终材料的方法，在具有羧基、氨基的基材和酶之间形成肽键的方法，在具有卤素基团的基材和酶的氨基等的之间进行烷基化的方法，使通过溴化氰活化的基材和酶的氨基发生反应的方法，使基材的氨基和酶的氨基交联的方法，在具有醛或酮基的化合物和异氰化物的存在下，使具有羧基和氨基的基材和酶反应的方法，使具有二硫基团的基材和酶的硫醇之间发生交换反应的方法。

可直接使用用上述方法制备的固定酶，进一步冷冻干燥使用也可。对酶进行固定处理的时间理想的在1分钟到24小时之间，更理想的在10分钟和1小时之间。过度的储藏或保存是不利的，因为这样能导致酶活性降低。

当例如基材组成囊状结构体的芯部时，固定在基材上的酵含量范围可设为每克10个单位(U)到1000个单位(U)之间，理想的在50个单位(U)到500个单位(U)，其中一个单位(U)被定义为当在通过3-羟基酰基CoA聚合合成PHA的反应中所释放的CoA的量为每分钟1微摩尔时PHA合成酶的量。

加入3-羟基酰基CoA底物的步骤中，通过将上述固定化酶引入到含所需PHA的原料3-羟基酰基CoA的水性反应溶液中，在基材表面上的PHA合成酶合成出PHA，由此形成一种结构体，该结构体的基材上涂覆有PHA。上述水性反应溶液应当制备成一种反应体系，以使PHA合成酶的活性被充分发挥，例如用缓冲溶液从pH 5.5调整到pH 9.0，优选为pH 7.0调整到pH 8.5。但是依据所要使用的PHA合成酶的最适pH以及pH稳定性，除了以上范围之外，也可以设定其它条件。如果要充分发挥PHA合成酶的活性，可以依据所要设定的pH范围依据需要来选择缓冲液的种类。用于一般生物化学反应的可用缓冲液包括，例如醋酸缓冲液，磷酸缓冲液，磷酸钾缓冲液，3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)缓冲液，N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液，三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液，甘氨酸缓冲液，和2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)缓冲液，只要能充分运用了所用PHA合成酶的活性，则所用缓冲液的浓度没有限制，一般为5.0mM到1.0M，优选从0.1M到0.2M。需要依据所用PHA合成酶的特性来构建反应温度，一般为4℃到50℃，优选为20℃到40℃。但是依据所用PHA合酶的温度适应性以及耐热性，除了以上范围之外，也可以构建其它条件。反应时间随着所用PHA合酶的稳定性或类似情况而变化，一般为1分钟到24小时，优选选择30分钟到3小时。如果需要，反应溶液中3-羟基酰基CoA的浓度设在所用PHA合酶的活性充分运用的范围之内，一般为0.1mM到1.0M，优选设在0.2mM到0.2M之间。此外，当反应溶液中3-羟基酰基CoA的浓度较高时，则反应系统的pH值一般倾向于降低，因此优选将上述缓冲液的浓度设定得稍微高一些，当所设定的3-羟基酰基CoA浓度较高时也一样，缓冲液浓度也优选设得高些。

同样在上述步骤中，随时间而改变在水性反应溶液中的如组分3-羟基酰基CoA的类型和浓度，由此在与基材垂直的方向上改变覆盖基材的PHA单体单元的组成。

这种单体单元改变了的基材的形式可以是这样一种形式，例如其中PHA覆盖物组分的变化是连续的，且基材覆盖有一层在垂直方向形成组合梯度的PHA。生产方法可以是例如一种这样的方法，其中在合成PHA时，将不同组成的3-羟基酰基CoA加入到反应溶液中。

此外，作为另外一种形式，可以是一种这样的形式，其中PHA覆盖物的组合是阶段性变化的，且不同组合的PHA以多层覆盖基材。该形式的生产方法可以是这样一种方法，其中PHA是用某种3-羟基酰基CoA组合物合成的，此后在制备时，在暂时底物上使用冲洗步骤或类似方式从反应溶液中收集基材，然后再一次向其中加入3-羟基酰基CoA反应溶液等。

如果需要将上述反应得到的结构体送至冲洗步骤。冲洗方法没有特别限定，只要其不会给结构体带来不合乎要求的变化，与该结构体的制作目的不违背。当为囊状结构体时，其基材是芯部，PHA为外壳，含在反应溶液中的不需要的组分可以除去，例如通过离心分离的方式使该结构体沉降，以及除去上清液。在这种情况下，通过加入在其中PHA不溶解的清洁剂，例如水，缓冲溶液或者甲醇，可进一步进行清洁，然后实施离心分离。此外，可用过滤或类似方法代替离心分离方法。另一方面，结构体是在板状基材涂布PHA形成的情况下，可例如将其浸入上述的清洁剂中，来实施清洗步骤。而且如果需要可将该结构体给送至干燥步骤。此外，可在使用之前，用各种辅助处理方法，化学修饰等来处理该结构体。

例如可通过将底物表面上的PHA进行化学修饰获得具有更多有用功能和特性的含聚羟基链烷酸酯的结构体。例如引入接枝链，由此可获得具有各种特性的含聚羟基链烷酸酯的结构体，且这些特性是从接枝链得来的。如果将下文将要描述的聚硅氧烷作为接枝链引入，在可以获得例如具有改进机械强度，分散性，耐气候性，水排斥性(耐水性)，耐热性等的含聚羟基链烷酸酯的结构体。此外，通过使基材表层上的PHA交联，可改进含聚羟基链烷酸酯结构体的机械强度，耐化学药品性，耐热性等。

用于进行化学修饰的方法没有特别地限定，只要该方法的目的是获得所需功能和结构体即可，但是，例如可将如下方法作为一种合适的方法，其中合成出在侧链上具有反应性功能基团的PHA，利用官能团的化学反应来实现化学修饰。

上述反应性基团的类型没有特别的限定，只要该方法的目的是获得所需功能和结构体即可，可以是例如如前所述的环氧基团。当其为一种具有环氧基的通常聚合物时，在侧链上有环氧基的PHA可被化学转化。具体来说，例如转化为羟基，或可以引入砜基团。或者可以加入具有硫醇基和胺基的化合物，例如加入端基为反应性功能基的化合物，具体而言是一种具有与环氧基有高反应性的氨基的化合物，由此形成聚合物接枝链。

在端基具有氨基的化合物可包括，例如聚乙烯胺，聚乙烯亚胺，和氨基改性聚合物，例如氨基改性的聚硅氧烷(氨基改性的硅油)。其中，对于氨基改性的聚硅氧烷来说，可使用J. Amer.Chem.Soc.，78，2278(1956)所述的方法合成的氨基改性聚硅氧烷或者类似物，可预期通过加入聚合物接枝链获得如下效果，改进机械强度，分散性，耐光性，耐候性，水排斥性(耐水性)和耐热性等。

此外，具有环氧基团的聚合物的其它化学转变的另一个实施例是用二胺例如六亚甲基二胺进行，琥珀酸酐，2-乙基-4-甲基咪唑或类似物进行交联反应，物理化学转变的一个例子是用电子射线等辐射的交联反应。其中，在侧链具有环氧基的PHA和六亚甲基二胺之间的反应按照如下所示的方案进行，以制备一种交联聚合物。

在本发明含聚羟基链烷酸酯的结构体中，固定在基材上的酶具有增强聚羟基链烷酸酯和基材之间的亲和力和粘结性的效果，因此使聚羟基链烷酸酯难以从基材剥离。

在一种所得结构体中，确定基材涂布有PHA的方法包括例如，用气相色谱法或者类似方法进行组分分析以及用电子显微镜或者类似方法进行形状观测的组合方法，以及使用飞行时间副离子质谱分析装置(TOF-SIMS)和离子溅射技术对从各组合物层质谱所得结构体进行评价的方法。但是作为更直接，简单，容易的确定方法，还可使用将尼罗蓝A着色和荧光显微镜观察组合的方法，该方法是由本发明的发明者最近研究出来的。本发明的发明者研究了简单易行的确定以PHA合酶体外合成PHA的方法，用尼罗蓝A显示PHA，该试剂具有特异性与PHA结合并发射荧光的特性，这在Appl.Environ.Microbiol.，44，238-241(1982)中已有报道，尼罗蓝A可用于简单地确定在生物体的微生物细胞中的PHA产物，通过设立合适的使用方法和使用条件，还可将其用于鉴别体外的PHA合成，由此完成前述方法。即该方法可在生物体外简单地鉴定PHA合，该方法包括过滤一种指定浓度的尼罗蓝A溶液，将所得滤液与含PHA的反应溶液混合，通过一显微镜用给定波长的激发光照射该混合物，以控制该混合物，仅使合成的PHA发射出荧光，然后观察该荧光。只要所用基材在上述条件下不发射荧光，则可以直接观察涂布在基材表面上的PHA，以及将上述方法用于观察、评论本发明的结构体。

<结构体的应用>

本发明的特征能够制作出难以用普通有机合成方法制作的结构体。因此本发明可以提供具有优异特性的结构体，而用传统的有机合成方法制作的囊状结构体或层叠状结构体则显示不出这些特性。例如本发明使得利用最新的高分子化合物和提供具有新功能和结构体的聚合物得以实现，而用传统的有机合成方法是难以实现的。更具体而言，难以用传统有机合成方法制成的具有新功能的高分子化合物，涂布了具有非常高手性的高分子化合物的囊状结构体和层叠结构体等可通过利用活有机体催化反应非常精确的识别能力和立体选择性，用非常简单和容易的方法来制备。

上述结构体的应用包括例如，用于静电照相高性能囊状调色剂，具有卓越分散稳定性的微囊化颜料油墨，用于电泳显示用的电泳颗粒以及用于滤色器的着色组合物。

(实施例)

下文将利用实施例更详细地描述本发明。但是，以下将描述的各实施例均是本发明最优选的实施方案中的一个，但是本发明的范围不限于这些实施例。

(参考例1)

制备能得到PHA合成酶的转化体，以及制备PHA合成酶。

用以下方法制备能得到PHA合成酶的转化体。

在30℃下在100mlLB培养液(1％聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠，pH7.4)中培养YN2菌株至过夜，然后用Marmer等方法分离和收集染色体DNA。用一种限制酶Hind III将所得染色体DNA充分分解。pUC18作为一种载体，被该限制酶Hind III切断。实施端基去磷酸化作用(MolecularCloning，1，572，(1989)；Cold Spring Harbor Laboratory出版社)，此后使用DNA连接试剂盒Ver.11(Takara Shuzo Co.，Ltd.)将载体的裂解部位(克隆位点)与被Hind III充分分解的染色体DNA片段偶合。将其中组合有该染色体DNA片段的质粒载体用于使大肠杆菌HB101菌株转化，以制备YN2菌株的DNA文库。

此后，为了选择包含YN2菌株的PHA合成酶基因的DNA片段，制备用于菌落杂交的探针。合成由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6碱基序列构成的寡核苷酸(Amasham Pharmacia.Biotech)，且这些寡核苷酸用作引物，使带有染色体DNA作为PCR的模板进行PCR。用PCR扩增的DNA片段用作探针。对探针的标记是用市售可得的标记酶AlkPhosDirect(Amasham Pharmacia.Biotech)实施的。通过菌落杂交方法，用所得标记了的探针从YN2菌株的DNA文库中选取如下Escherichia Coli菌株，该菌株具有重组的包括PHA合成酶基因的质粒。用碱法从选取的菌株中收集质粒，由此可以获得含有PHA合成酶基因的DNA片段。

此时所得DNA片段基因重组入包括较宽寄主范围(broad-host-range)复制区域的载体pBBR 122(Mo Bi Tec)，该区域不属于不匹配组Inc P，Inc Q和Inc W构成一不匹配基团中的任一种。当用电穿孔方法将该重组的质粒转化YN2ml菌株(PHA合成能力缺失的菌株)时，YN2ml菌株的PHA合成能力恢复，因此显示出互补性能。因此保证了所选DNA片段的基因包括一能被翻译为菊苣假单胞菌YN2ml菌株PHA合成酶的PHA合成酶基因区。

对于该包括PHA合成酶基因的DNA片段，用Sanger’s方法确定碱基序列。结果发现在确定的碱基序列中，存在用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4表示的碱基序列，分别编码一种肽。如下所述，可以保证由各肽链组合而成的蛋白质均具有酶活性，且用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4表示的碱基序列是PHA合成酶基因。具体而言，其保证了SEQ ID NO：2碱基序列编码用SEQID NO：1表示的氨基酸序列，SEQ ID NO：4碱基序列编码用SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列，且仅具有这些氨基酸序列中的任何一种的蛋白质即具有PHA合成能力。

对于用SEQ ID NO：2表示的碱基序列的PHA合成酶基因，用染色体DNA作为模板进行PCR，可以制备全长的PHA合成酶基因。

对于用SEQ ID NO：2表示的碱基序列，分别设计和合成了具有在其启动密码子上游的碱基序列的寡核苷酸，且其作为一种上游引物(SEQ ID：7)，和具有在其终止密码子下游的碱基序列的寡核苷酸引物(SEQ ID：8)，且其作为一种下游引物(Amasham Pharmacia.Biotech)。使用这些寡核苷酸作为引物，以扩增PHA合成酶基因的全长(LA-PCR试剂盒；Takara Shuzo Co.，Ltd.)

以一种类似方式，对于用SEQ ID：4表示的碱基序列的PHA合成酶基因，用染色体DNA作为模板，以重新制备PHA合成酶基因的全长。对于用SEQID：4表示的碱基序列，分别设计和合成了具有在其初始密码子上游的碱基序列的寡核苷酸(SEQ ID：9)，且其作为一种上游引物，和具有在其终止密码了下游的碱基序列的寡核苷酸(SEQ ID：10)，且其作为一种下游引物(AmashamPharmacia.Biotech)。使用这些寡核苷酸作为引物进行PCR用于扩增PHA合成酶全长的基因(LA-PCR试剂盒；Takara Shuzo Co.，Ltd.)。

此后，用限制酶Hind III分别将PCR扩增过的包括所得PHA合成酶全长的基因的片段完全分解。此外，表达载体pTrc99A也被限制酶Hind III裂解，并将其进行去磷酸化处理(Molecular Cloning，Vol.1，p.572，1989；Cold SpringHarbor Laboratory出版)。用DNA连接试剂盒Ver.II(Takara Shuzo Co.，Ltd.)将包括所得PHA合成酶基因全长基因、并除去了两端不必要的碱基序列的DNA片段连接到该表达载体pTrc99A的裂解部位。

使用所得的重组质粒用氯化钙方法转化大肠杆菌(HB101：Takara ShuzoCo.，Ltd)。培养所得的重组物，对重组质粒进行扩增，并收集各个种类的重组质粒。含SEQ ID：2的DNA基因的重组质粒被定义为pYN2-C1(从SEQ ID：2得到)，含SEQ ID：4DNA基因的重组质粒被定义为pYN2-C2(从SEQ ID：4得到)。

用pYN2-C1和pYN2-C2，并用氯化钙方法转化大肠杆菌(HB101fB菌株，缺失fadB的变体)，得到重组的大肠杆菌菌株，pYN2-C1重组菌株和pYN2-C2重组菌株分别具有其自身重组质粒。

将pYN2-C1重组菌株和pYN2-C2重组菌株分别接种在200毫升的含0.5％酵母提取物和0.1％辛酸的M9培养基中，并在37℃下和用125次/分钟摇动培养液。24小时后，通过离心方法收集细胞，并用通常方法回收质粒DNA。

对于pYN2-C1，已经分别设计和合成了作为上游引物的寡核苷酸(SEQID：11)，和作为下游引物的寡核苷酸(SEQ ID：12)(Amasham Pharmacia.Biotech)。使用这些寡核苷酸作为引物，以pYN2-C1作为模板进行PCR，以扩增PHA合成酶全长的基因，该基因在上游具有BamHI和SacI限制部位，在下游部位具有Xhol限制部位(LA-PCR试剂盒；Takara Shuzo Co.，Ltd)。

类似的，对于pYN2-C2，已经分别设计和合成了作为上游引物的寡核苷酸(SEQ ID：13)，和作为下游引物的寡核苷酸(SEQ ID：14)(AmashamPharmacia.Biotech)。使用这些寡核苷酸作为引物以pYN2-C2作为模板进行PCR，以扩增PHA合成酶全长的基因，该基因在上游具有BamHI限制部位，在下游部位具有XhoI限制部位(LA-PCR试剂盒；Takara Shuzo Co.，Ltd)。

各纯化了的PCR扩增产物被BamHI和XhoI消化，并被插入到质粒pGEX-6P-1(由Amasham Pharmacia.Biotech Co.Ltd制造)的相应部位。这些载体(pGEX-C1和pGEX-C2)用于转化大肠杆菌(JM109)变形，以获得一种用于表达的菌株。该菌株用Miniprep(Wizard Minipreps DNAPurification Systems，由PROMEGA Co.，Ltd.制造)大量制得的BamHI和XhoI质粒DNA处理得到的DNA片段加以确认的。将所得菌株在10毫升LB-Amp培养基中预培养至过夜，此后将0.1毫升的菌株加入到10ml LB-Amp培养基中，然后在170rpm，37℃下摇动培养3小时。此后，加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下继续培养4到12小时。

收集IPTG诱导的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，在4℃下，在1/10量的PBS中再悬浮。通过冷冻，解冻和超声波处理将细胞压碎，并对其进行离心分离(8000×g，10分钟，4℃)，以除去细胞碎屑。用SDS-PAGE确定在上清液(无细胞的萃取物)中存在所需表达蛋白质，此后用谷胱甘肽Sepharose 4B珠粒(由Amasham Pharmacia.Biotech Co.Ltd制造)纯化该引入和表达了的GTS融合蛋白质。

在纯化时使用的谷胱甘肽Sepharose要预处理，以避免事先存在非特异性吸附。具体而言，用相同量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose三次(8000×g，1分钟，4℃)，此后加入含4％BSA的相同量的PBS，以在4℃下处理谷胱甘肽Sepharose 1小时。处理后，用相同量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose两次，然后在1/2量的PBS中再悬浮。将40微升预处理了的谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升无细胞的萃取液中，在4℃下温和地搅拌。由此，融合蛋白质GST-YN2-C1和GST-YN2-C2被吸附到谷胱甘肽Sepharose上。

在GST-YN2-C1和GST-YN2-C2被吸附之后，通过离心分离方法收集谷胱甘肽Sepharose(8000×g，1分钟，4℃)，并用400微升PBS冲洗3次。此后，加入40微升的10mM谷胱甘肽，在4℃下搅拌1小时，以洗脱吸附的融合蛋白质。离心分离之后收集上清液(8000×g，2分钟，4℃)，且此后针对PBS进行透析法，以纯化GST融合蛋白质。由SDS-PAGE确定了该蛋白质表现为单带。

用PreScission蛋白酶(Amasham Pharmacia.Biotech，5U)消化500微克的各GST融合蛋白质，此后通过谷胱甘肽Sepharose以除去蛋白酶和GST。流过级分进一步用PBS平衡的交联葡聚酸凝胶G200柱子进行处理，以获得最终纯化的表达蛋白质YN2-C1和YN2-C2。由SDS-PAGE确定了这些蛋白质分别显示为60.8kDa和61.5kDa的单条带。

用前面所述的方法测量各纯化了的酶的活性。同样，用一系列Micro BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Chemical Co.，Ltd.)测量试样中蛋白质的浓度，在表1中显示了测定各纯化酶的活性的结果。

表1

	活性	比活性
			YN2-C1	2.1U/mL	4.1U/mg蛋白质
YN2-C2	1.5U/mL	3.6U/mg蛋白质

用一种生物溶液试样浓缩试剂(Mizubutorikun AB-1100，由Ato Co.，Ltd.制造)将各纯化的酶溶液浓缩，以获得10U/ml的纯化酶溶液。

(参考例2)合成3-羟基酰基-CoA

用以下方法制备(R)-3-羟基辛酰CoA，基于Rehm BHA，Kruger N，Steinbuchel A(1998)Journal of Biological Chemistry 273 pp24044-24051，其被加入了一些变化。将酰基-CoA合成酶(由Sigma-Aldrich Com.制造)溶解在含ATP 2mM，MgCl₂ 5mM，辅酶A 2mM，和(R)-3-羟基辛酸盐2mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲溶液中(50mM，pH 7.5)，以得到0.1mU/微升的溶液。在37摄氏度的温水浴中培养该溶液，按时取样以便能用HPLC分析反应进度。向反应溶液试样中加入硫酸到0.02N浓度，来终止酶反应，此后通过正庚烷萃取除去未反应的(R)-3-羟基辛酸酯底物。在用HPLC进行分析时，使用RP18色谱柱(nucleosil C18，7微米，Knauser)，用线形浓度梯度的乙腈进行洗脱，用25mM磷酸盐缓冲液(pH 5.3)作为流动相，用二级管阵列检测器监测200到500nm的吸附光谱，以检测酶反应产生的硫酯化合物。用同样的方式制备(R)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA和(R)-3-羟基-5-(4-氟代苯基)戊酰CoA。

实施例1获得一种氨基酸序列，其具有与铜酞菁键联的亲和力

(1)将铜酞菁(α类型：Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.)悬浮在甲醇中，以得到5mg/ml的浓度。将1.5ml的该悬浮液施加到聚苯乙烯制成的板上，通过蒸发除去甲醇，由此使铜酞菁涂层固定在聚苯乙烯制成的板上。已经确定即使用含0.1％的Tween-20的TBS缓冲液(50mM Tris-盐酸pH7.51 50mM NaCl)进行冲洗。也不会除去固定了的铜酞菁涂层。

(2)将一种含牛血清白蛋白(BSA)(0.1M NaHCO₃(pH 8.6)，5mg/mlBSA，0.1mg/ml抗生蛋白链菌素，0.02％NaN₃)的封闭缓冲液填充在聚苯乙烯板上，该板上固定有铜酞菁，在4℃下静置1小时。然后除去该封闭缓冲液，用TBST缓冲液冲洗该板10次(TBS缓冲液+0.1％Tween-20)。

(3)将相当于1.4×10¹¹pfu的Ph.D.-7噬菌体显示肽文库(由New EnglandBiolabs Inc.制造)加在板上，并将其在25℃下静置60分钟。

(4)除支板上的溶液，用TBST缓冲液冲洗该板10次。

(5)加入1ml洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)1mg/ml BSA)之后，将其静置3分钟，将该溶液移到一微量离心分离管中，然后加入150微升的1M的Tris-盐酸(pH 9.1)。中和该溶液以得到一种洗脱了的噬菌体。

(6)用该洗脱了的噬菌体感染对数增殖初期大肠杆菌ER2537(由NewEngland Biolabs Inc.制造)，该噬菌体被扩增。在37℃下培养4.5小时。此后，通过离心分离从细胞中分离出该噬菌体，用聚乙二醇沉降来纯化。使该纯化和扩增的噬菌体悬浮在TBS缓冲液中，通过用合适的稀释系列感染在肠杆菌，测定其效作(滴度)(大肠杆菌)。

(7)用该扩增的噬菌体将上述步骤(1)到(6)再重复3次。但是将TBST缓冲液中使用的Tween-20的浓度升高至0.5％，以提高冲洗条件。

此后第二次对如下试样实施相同的操作，其中仅用BSA对聚苯乙烯制成的板进行封闭，并用其作对照。在各循环中洗脱的噬菌体效作(滴度)显示在表2中。

表2

在各循环中洗脱噬菌体的效价

	原溶液(A)	对比键合(B)	酞菁键合(C)	C/A	C/B
						第一次	1.4×1011		5×105	3.6×10-6
第二次	6.5×1011	8.5×105	2.6×106	4×10-6	3
						第三次	6.0×1011	1.2×106	1×109	1.6×10-3	800
第四次	8.5×1011	2×106	5.3×109	6.2×10-3	2700

(A，B，C的单位用pfu/ml表示)

通过用最终洗脱的噬菌体使大过量的大肠杆菌感染来进行克隆。用各克隆感染大肠杆菌和扩增，制备ssDNA，无序区域的碱基序列被译出，显示出的肽被测序。表3中示出了所挑的30个克隆的氨基酸序列和频率。

表3

确定的氨基酸序列和频率

确定的氨基酸序列	数目(A)	频率(A/30)
			SEQ ID No：15VFHKLVNVal-Phe-His-Lys-Leu-Val-Trp	23	0.77
SEQ ID No：182VYHRLVWVal-Tyr-His-Arg-Leu-Val-Asn	5	0.16
			SEQ ID No：183VIHRLVWVal-Ile-His-Arg-Leu-Val-Trp	2	0.07

可以确定，氨基酸序列VxHxLVx(SEQ ID No：178)，尤其是与铜酞菁具有亲和力的氨基酸序列VFHKLVW(SEQ ID No：15)与铜酞菁键联的特点。

实施钏2制备与铜酞菁有键联亲和力的PHA合酶

按照如下方式使氨基酸序列VFHKLVW(SEQ ID No：15)的铜酞菁亲和序列通过间隔序列GGGS(SEQ ID No：177)与PHA合酶的N端融合，构建大肠杆菌表达载体。用于编码该氨基酸序列的DNA被制成一种双链合成寡核苷酸，并连接到pGEX-C1质粒的适当限制性酶切位点(BamHI和SacI)。在这种情形下，依照制造者的手册，使用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)将两种合成寡核苷酸O1(5’GATCCGTGTTCCACAAATTAGTGTGGGGTGGAGG TTCGGAGCT，SEQ ID No：16)和O2(5’CCGAACCTCCACCCCACACT AATTTGTGGAACACG，SEQ ID No：17)磷酸化。在80℃下，连续对其加热5分钟，然后静置使其慢慢降至室温。该双链DNA片段直接用于此后的克隆步骤。

用BamHI和SacI消化质粒pGEX-C1，并插入上述双链DNA片段。用这种载体转化大肠杆菌(JM109)变形，得到表达用菌株。通过使用pGEX5’测序引物(Amarham Pharmacid Biotech)，以及用Miniprep(Wizard MiniprepsDNA纯化系统，由PROMEGA制造)制备的质粒DNA作为模板，测序以确定插入的碱基序列。用10ml LB-Amp培养基将所得菌株进行预培养过夜之后，将0.1ml含该菌株的所得产物加入到10ml LB-Amp培养基中，在37℃和170rpm下振荡培养3小时。然后加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下继续培养4到12小时。

收集IPTG诱导的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，并在4℃，1/10量的PBS中重新使其悬浮。通过冷冻解冻和超声波处理将细胞破碎，用离心分离方式将细胞碎屑除去(8000×g，10分钟，4℃)。用SDS-PAGE确定在上清液中存在目标表达蛋白质之后，用谷胱甘肽Sepharose凝胶4B(谷胱甘肽Sepharose凝胶4B珠粒：由Amasham Pharmasia Biotech Corp.制造)纯化已诱导和表达了的GST融合蛋白质。

事先对所用谷胱甘肽Sepharose进行非特异吸附抑制处理。即用等量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose3次之后(8000×g，1分钟，4℃)，在4℃下用等量含4％BSA的PBS处理1小时。处理之后，用等量的PBS冲洗两次，并重新使其悬浮在1/2量的PBS中。将预处理过的40微升谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升不含细胞的萃取液中，并在4℃下平静地搅拌。由此将融合的蛋白质GST-YN2-C1吸附到谷胱甘肽Sepharose上。

吸附后用离心分离方法(8000×g，1分钟，4℃)收集谷胱甘肽Sepharose，并用400微升PBS冲洗3次。此后加入40微升10mM还原了的谷甘肽，在4℃下搅拌该溶液1小时，将所吸附的融合的蛋白质洗脱出来。离心分离(8000×g，2分钟，4℃)之后，收集上清液，对PBS进行透析，以纯化GST融合蛋白质。已经确定由SDS-PAGE给出了一单带。

当Pre Scission蛋白酶(Amasham Pharmasia Biotech Corp.，5U)消化500微克的各GST融合蛋白质之后，通过谷胱甘肽Sepharose除去该蛋白酶和GST。进一步用PBS平衡了的SephadexG200柱子处理流通级分，以得到最终纯化的表达蛋白质YN2-C1(pht)。已经确定由SDS-PAGE给出了一61.9kDa的单带。

用以上所述的步骤测量纯化的酶活性此外，用一套微量的BCA蛋白质确定试剂(由Pierce Chemical com.制造)测量试样中蛋白质的浓度。酶的浓度为1.9U/ml，比活性为4.0U/mg蛋白质。用生物体溶液试样浓缩试剂(Mizubutorikun AB-1100，由ATTO公司制造)浓缩纯化了的酶，以获得10U/ml的纯化酶溶液。

实施例3对与铜酞菁键联的亲和力的评价

使铜酞菁悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，将相当于实施例2中制备的0.5U的PHA合成酶YN2-C1(pht)和参考例1中制备的YN2-C1加入到该悬浮液中，并在室温下振荡30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)，收集作为沉淀的铜酞菁颗粒，该颗粒与含未与铜酞菁键联的酶的上清液中分离开。再一次使铜酞菁悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，重复离心操作，由此冲洗铜酞菁。在表4中列出了所测得的冲洗后铜酞菁悬浮液的酶活性。

表4

对酶与铜酞菁键联的亲和力的评价

	活性U
		YN2-C1(pht)	0.04
YN2-C1	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C1相比，与铜酞菁亲和序列融合的酶YN2-C1(pht)具有更高的酶活性，因此能够有效地将其固定在基材的表面上。

实施例4铜酞菁PHT囊状结构体

使铜酞菁悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，向其中加入相当0.5U量的的PHA合成酶YN2-C1(pht)或PHA合成酶YN2-C1，并在室温下振荡30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)收集作为沉淀的铜酞菁颗粒之后，再一次使其悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，以使其为0.5％(w/v)。随后，加入参考例2中制备的(R)-3-羟基辛酰CoA，以使其最终度为5mM。在37℃下温育30分钟，以进行合成反应。

用尼罗蓝A对该反应混合物中生成的PHA进行染色，并用荧光显微镜进行观察。在加入YN2-C1的试样中，观察到游离的PHA颗粒。另一方面，在加入YN2-C1(pht)的试样中，未观察到游离的PHA颗粒，由此证实了已经由合成酶实施了有效的PHA合成反应。

通过离心方法(10,000×g，4℃和10分钟)将反应混合物分离，则得到具有囊状结构体的含水滤饼，铜酞菁在其中作为芯部。重新使这种含水滤饼悬浮在水中，通过离心操作再一次收集该囊状结构体。重复该操作3次进行冲洗。

将所制得的囊状结构体的含水滤饼的一部分真空干燥，使其悬浮在20毫升氯仿中，在60℃下，将该悬浮液搅拌20小时，以提取形成薄膜的PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤该提取物，用旋转蒸发器进行真空浓缩，然后依据常规方法进行甲醇解作用。用气相色谱-质谱装置(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)对所得产品进行分析，以确定甲基酯化的PHA单体单元。结果确定了所关心的PHA是具有3-羟基辛酸的PHA单体单元，如图1A和1B所示。此外，用凝胶渗透色谱(GPC；TOSOH CORPORATION HLC-8020，柱子；Polymer Laboratory PLgel MIXED-C(5微米)，溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯换算)对该PHA进行分子量测定，得出Mn＝21,000和Mw＝40,000。

实施例5与炭黑具有键合亲和力的氨基酸序列的获取

(1)使炭黑(Sigma Aldrich Japan Inc.)悬浮在甲醇中，使其浓度为5mg/ml。将1.5ml该悬浮液施涂在聚苯乙烯板上，通过挥发除去甲醇，以得到固定在聚苯乙烯板表面上的炭黑涂层。已经证实即使用含0.1％Tween-20的TBS缓冲液(50mM Tris-盐酸pH7.5 150mM NaCl)对其进行冲洗，固定的炭黑也不会被除去。

(2)将含牛血清白蛋白(BSA)的封闭缓冲液(0.1MNaHCO₃(pH8.6)，5mg/ml BSA，0.1mg/ml抗生蛋白链菌素，0.02％NaN₃)填充在其上固定有炭黑的聚苯乙烯板上，在4℃下将该板保持静置1小时。然后除去该封闭缓冲液，用TBST缓冲液冲洗10次(TBS缓冲液+0.1％Tween-20)。

(3)将相当于1.4×10¹¹pfu量的Ph.D.-7噬菌体显示肽文库(由NewEngland Biolabs Inc.制造)加到该板上，在25℃下将该板保持静置60分钟。

(4)除去板上的溶液，用TBST缓冲液冲洗该板10次。

(5)加入1ml洗脱缓冲溶液(0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)1mg/ml BSA)之后，将该板保持静置3分钟，将该溶液移至微量离心管中，然后加入150微升的Tris-盐酸(pH9.1)，以中和得到洗脱的噬菌体。

(6)用洗脱的噬菌体对呈对数生长早期的大肠杆菌ER2537(由NewEngland Biolabs Inc.制造)进行感染，则该噬菌体被扩增。在37℃下培养4.5小时。此后，通过离心作用将该噬菌体从细胞中分离出来，并在聚乙二醇中沉降以进行纯化。使纯化和扩增了的噬菌体悬浮在TBS缓冲液中，用合适的稀释系列通过感染大肠杆菌测定效价(滴度)。

(7)用扩增了的噬菌体将以上所述的步骤(1)到(6)再重复3次。但是，将所用的TBST缓冲液中Tween-20(非离子活性剂)的浓度提高至0.5％，以提高冲洗条件。第二次之后仍对试样进行相同的操作，其中仅用BSA对聚苯乙烯制成的板进行封闭，且将其用作对照。在表5中显示了各循环中洗脱噬菌体的效价(滴度)。

表5各循环中洗脱噬菌体的效价

	原溶液(a)	对照键合(B)	炭黑键合(C)	C/A	C/B
						第一次	1.4×1011		3.0×105	2.1×10-6
第二次	6.4×1011	7.5×105	1.6×106	2.5×10-6	2
						第三次	6.5×1011	1.4×106	1.4×109	2.2×10-3	1000
第四次	8.4×1011	2.3×106	5.6×109	6.7×10-3	2400

(A、B和C的单位用pfu/ml表示)

用最终洗脱的噬菌体感染大过量的大肠杆菌，并对该噬菌体进行克隆。用各克隆感染大肠杆菌和扩增之后，制备ssDNA，则无序区域的碱基序列被解码，并确定出表达的肽的氨基酸序列。在表6中显示选出的30种克隆的氨基酸序列和频率。

表6

确定的氨基酸序列和频率

确定的氨基酸序列	数目(A)	频率(A/30)
			SEQ ID No：18WFWILVNTrp-Phe-Trp-Ile-Leu-Val-Asn	25	0.83
SEQ ID No：184WYWILTNTrp-Tyr-Trp-Ile-Leu-Thr-Asn	5	0.17

已经确定具有氨基酸序列WxWILxN(SEQ ID No：179)，尤其是与炭黑有亲和力的氨基酸序列WFWILVN(SEQ ID No：18)的炭黑键联特点。

实施例6制备与炭黑具有键联亲和力的PHA合酶

按照以下方式通过将氨基酸序列WFWILVN(SEQ ID No：18)的炭黑亲和序列通过间隔序列GGGS(SEQ ID NO：177)与PHA合酶的C端融合，构建表达的大肠杆菌表达载体。对这种氨基酸序列进行编码的DNA被制成双链合成寡核苷酸，并连接到pGEX-C2质粒的适当限制裂解部位(SpeI和XhoI)。在这种情形下，依照手册的描述，使用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)将两种合成寡核苷酸O3(5’CTAGTTGGTTCTGGATTTTAGTGAACGGTGGAGGTTCGC，SEQ ID No：19)和O4(5’TCGAGCGAACCTCCACCGTTCACTAAAATCCAGAACCAA，SEQ ID No：20)磷酸化。在80℃下，连续对其加热5分钟，然后静置使其慢慢冷却至室温。该双链DNA片段直接用于此后的克隆步骤。

用SpeI和XhoI消化质粒pGEX-C2，并插入上述双链DNA片段。用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，得到表达用菌株。用Miniprep(WizardMinipreps DNA纯化体系，由PROMEGA制造)制备的质粒DNA作为模板，通过使用pGEX3’测序引物(由Amasham Pharmasia Biotech Corp.)测序，来确定插入的碱基序列，以确认该菌株。用10ml LB-Amp培养基将所得菌株进行预培养过夜之后，将0.1ml含该菌株的所得产物加入到10ml LB-Amp培养基中，在37℃和170rpm下振荡培养3小时。然后加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下继续培养4到12小时。

收集IPTG诱导的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，并在4℃，1/10量的PBS中重新使其悬浮。通过冷冻解冻和超声波处理将细胞破碎，用离心分离方式将细胞碎屑除去(8000×g，10分钟，4℃)。用SDS-PAGE确定在上清液中存在目标表达蛋白质之后，用谷胱甘肽Sepharose凝胶4B珠：(由Amasham Pharmasia Biotech Corp.制造)纯化已诱导和表达了的GST融合蛋白质。

事先对所用谷胱甘肽Sepharose进行非特异性吸附抑制处理。即用等量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose3次之后(8000×g，1分钟，4℃)，在4℃下用等量的包含所加4％BSA的PBS处理1小时。处理之后，用等量的PBS冲洗两次，并重新使其悬浮在1/2量的PBS中。将预处理过的40微升谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升不含细胞的萃取液中，并在4℃下平静地搅拌。由此融合的蛋白质GST-YN2-C1被吸附到谷胱甘肽Sepharose上。

吸附后用离心分离方法(8000×g，1分钟，4℃)收集谷胱甘肽Sepharose，并用400微升PBS冲洗3次。此后加入40微升10mM谷胱甘肽，在4℃下搅拌该溶液1小时，将所吸附的融合的蛋白质洗脱出来。离心分离(8000×g，2分钟，4℃)之后，收集上清液，对PBS进行渗析，以纯化GST融合蛋白质。已经确定由SDS-PAGE给出了一单条带。

当PreScission蛋白酶(Amasham Pharmasia Biotech Corp.，5U)消化500微克的各GST融合蛋白质之后，通过谷胱甘肽Sepharose除去该蛋白酶和GST。进一步用PBS平衡了的SephadexG200柱子处理流出级分，以得到最终纯化的表达蛋白质YN2-C2(cb)。已经确定由SDS-PAGE给出了一61.9kDa的单条带。

用以上所述的步骤测量纯化的酶活性。此外，用微量BCA蛋白质确定试剂盒(由Pierce Chemical com.制造)测量试样中蛋白质的浓度。酶的浓度为2.1U/ml，比活性为4.1U/mg蛋白质。用有机体溶液试样浓缩试剂(MizubutorikunAB-1100，由ATTO公司制造)浓缩纯化了的酶，以获得10U/ml纯化的酶溶液。

实施例7评价与炭黑的键联亲和力

使炭黑悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，将相当于实施例6中制备的0.5U量的PHA合成酶YN2-C2(cb)和参考例1中制备的YN2-C2加入到该悬浮液中，并在室温下振荡30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)，收集作为沉淀的炭黑颗粒，该颗粒与含有未与炭黑键联的酶的上清液中分离开。再一次使炭黑悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，重复离心操作，由此冲洗炭黑。在表7中列出了所测得的冲洗后炭黑悬浮液的酶活性。

表7

对酶与炭黑键联的亲和力的评价

	活性U
		YN2-C2(cb)	0.04
YN2-C2	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C2相比，与炭黑亲和序列融合的酶YN2-C2(cb)具有更高的酶活性，因此能够有效地将其固定在基材的表面上。

实施例8炭黑PHA囊状结构体

使炭黑悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，向其中加入相当于0.5U量的PHA合成酶YN2-C2(cb)或PHA合成酶YN2-C2，并在室温下振荡30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)收集炭黑之后，再一次使其悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，以使其为0.5％(w/v)。随后，加入参考例2中制备的(R)-3-羟基-5-苯基戊酰CoA，以使其最终浓度为5mM。在37℃下温育30分钟，以进行合成反应。

用尼罗蓝A对该反应混合物中生成的PHA进行染色，并用荧光显微镜进行观察。在加入YN2-C2的试样中，观察到游离的PHA颗粒。另一方面，在加入YN2-C2(cb)的试样中，未观察到游离的PHA颗粒，由此证实了已经由合酶实施了有效的PHA合成反应。

通过离心方法(10,000×g，4℃和10分钟)将反应混合物分离，则得到具有囊状结构体的含水滤饼，炭黑在囊状结构体中作为芯部。重新使这种含水滤饼悬浮在水中，通过离心操作再一次收集该囊状结构体。重复该操作3次进行冲洗。

将所制得的囊状结构体的含水滤饼的一部分真空干燥，使其悬浮在20毫升氯仿中，在60℃下，将该悬浮液搅拌20小时，以提取形成薄膜的PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤该提取物，用旋转蒸发器进行真空浓缩，然后依据常规方法进行甲醇解作用。用气相色谱-质谱装置(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)对所得产品进行分析，以确定甲基酯化的PHA单体单元。结果确定了所关心的PHA是具有3-羟基-5-苯基戊酸的PHA单体单元，如图2A和2B所示。此外，用凝胶渗透色谱(GPC；TOSOHCORPORATIONHLC-8020，柱子；Polymer Laboratory PLgel MIXED-C(5微米)，溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯换算)对该PHA进行分子量评价，得出Mn＝16,000和Mw＝36,000。

与硅具有键合亲和力的氨基酸序列的获取

(1)用甲醇冲洗单晶硅基板(由FZ方法制造，(100)面，电阻率为100Ω·cm到1kΩ·cm)的表面，然后用含牛血清白蛋白(BSA)的封闭缓冲液(0.1M NaHCO₃(pH8.6)，5mg/ml BSA，0.1mg/ml抗生蛋白链菌素，0.02％NaN₃)填充该基板表面，在4℃下将该板保持静置1小时。然后除去该封闭缓冲液，用TBST缓冲液(TBS缓冲液+0.1％Tween-20)冲洗硅板。

(2)将相当于1.4×10¹¹pfu量的Ph.D.-7噬菌体显示肽文库(由NewEngland Biolabs Inc.制造)加到该硅板上，在25℃下保持静置该板60分钟。

(3)除去硅板上的溶液，用TBST缓冲液冲洗该基板。

(4)加入1ml洗脱缓冲溶液(0.2M甘氨酸-HCl(pH2.2)1mg/ml BSA)以填充该表面之后，将该板保持静置3分钟，将该溶液移至微量离心管中，然后加入150微升的1M的Tris-盐酸(pH9.1)，以中和得到洗脱的噬菌体。

(5)用洗脱的噬菌体感染呈对数生长早期的大肠杆菌ER2537(由NewEngland Biolabs Inc.制造)，则该噬菌体被扩增。在37℃下培养4.5小时。此后，通过离心作用将该噬菌体从细胞中分离出来，并在聚乙二醇中沉降以进行纯化。使该纯化和扩增了的噬菌体悬浮在TBS缓冲液中，用合适的稀释系列感染大肠杆菌测定效价(滴度)。

(6)用扩增了的噬菌体将以上所述的步骤(1)到(5)再重复3次。但是，将所用的TBST缓冲液中Tween-20的浓度提高至0.5％，冲洗条件也被分隔开。在表5中显示了各循环中洗脱噬菌体的效价(滴度)。

表8各循环中洗脱噬菌体的效价

	原溶液(a)	硅板键合(C)	B/A
				第一次	1.4×1011	2.8×103	2.0×10-8
第二次	6.5×1011	1.6×105	2.5×10-7
				第三次	6.4×1011	1.2×107	1.9×10-5
第四次	8.4×1011	5.3×108	6.3×10-4

(A，B和C的单位用pfu/ml表示)

用最终洗脱的噬菌体感染大过量的大肠杆菌，并对该噬菌体进行克隆。用各克隆感染大肠杆菌和扩增之后，制备ssDNA，则无序区域的碱基序列被解码，并确定出表达的肽的氨基酸序列。在表9中显示选出的30种克隆的氨基酸序列和频率。

表9

确定的氨基酸序列和频率

确定的氨基酸序列	数目(A)	频率(A/30)
			SEQ ID No：21DSHFTINAsp-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn	22	0.73
SEQ ID No：185DTFHTINAsp-Thr-Phe-His-Thr-Ile-Asn	5	0.17
			SEQ ID No：186ESHFTINGlu-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn	3	0.1

已经确定具有氨基酸序列DSxxTIN(SEQ ID No：180)，尤其是与硅板有亲和力的氨基酸序列DSHFTIN(SEQ ID No：21)的硅板键联特点。

实施例10制备与硅板具有键联亲和力的PHA合酶

按照以下方式通过将氨基酸序列DSHFTIN(SEQ ID No：21)的硅板亲和序列通过间隔序列GGGS(SEQ ID NO：177)与PHA合酶的N端融合，构建表达的大肠杆菌表达载体。对这种氨基酸序列进行编码的DNA被制成双链合成寡核苷酸，并连接到pGEX-C2质粒的适当限制裂解部位(BamHI和SacI)。在这种情形下，依照制造者的描述，使用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)将两种合成寡核苷酸O5(5’GATCCGATTCACATTTTACTATTAATGGTGGAGGTTCGGAGCT，SEQ ID No：22)和O6(5’CCGAACCTCCACCCATTAATAGTAAAATGTGAATCG，SEQ ID No：23)磷酸化。在80℃下，连续对其加热5分钟，然后静置使其慢慢冷却至室温。该双链DNA片段直接用于此后的克隆步骤。

用BamHI和SacI消化质粒pGEX-C1，并插入上述双链DNA片段。用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，得到表达用菌株。用Miniprep(WizardMinipreps DNA纯化体系，由PROMEGA制造)制备的质粒DNA作为模板通过使用pGEX5’测序引物(由Amasham Pharmasia Biotech Corp.)测序，来确定插入的碱基序列，以鉴定该菌株。用10ml LB-Amp培养基将所得菌株进行预培养过夜之后，将0.1ml含该菌株的所得产物加入到10ml LB-Amp培养基中，在37℃和170rpm下振荡培养3小时。然后加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下继续培养4到12小时。

收集IPTG诱导的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，并在4℃，1/10量的PBS中重新使其悬浮。通过冷冻解冻和超声波处理将细胞破碎，用离心分离方式将细胞碎屑除去(8000×g，10分钟，4℃)。用SDS-PAGE确定在上清液中存在目标表达蛋白质之后，用谷胱甘肽Sepharose凝胶4B珠粒：由(Amasham Pharmasia Biotech Corp.制造)纯化已引发和表达了的GST融合蛋白质。

事先对所用谷胱甘肽Sepharose进行非特异性吸附抑制处理。即用等量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose3次之后(8000×g，1分钟，4℃)，在4℃下用等量的包含所加4％BSA的PBS处理1小时。处理之后，用等量的PBS冲洗两次，并重新使其悬浮在1/2量的PBS中。将预处理过的40微升谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升不含细胞的萃取液中，并在4℃下平静地搅拌。由此融合的蛋白质GST-YN2-C1被吸附到谷胱甘肽Sepharose上。

吸附后用离心分离方法(8000×g，1分钟，4℃)收集谷胱甘肽Sepharose，并用400微升PBS冲洗3次。此后加入40微升10mM还原了的谷胱甘肽，在4℃下搅拌该溶液1小时，将所吸附的融合蛋白质洗脱出来。离心分离(8000×g，2分钟，4℃)之后，收集上清液，对PBS进行渗析，以纯化GST融合蛋白质。已经确定由SDS-PAGE给出了一单条带。

当PreScission蛋白酶(Amasham Pharmasia Biotech Corp.，5U)消化500微克的各GST融合蛋白质之后，通过谷胱甘肽Sepharose除去该蛋白酶和GST。进一步用PBS平衡了的SephadexG200柱子处理流通馏份，以得到最终纯化的表达蛋白质YN2-C1(Si)。已经确定由SDS-PAGE给出了一61.9kDa的单条带。

用以上所述的步骤测量纯化的酶活性。此外，用微量BCA蛋白质确定试剂盒(由Pierce Chemical com.制造)测量试样中蛋白质的浓度。酶的浓度为2.1U/ml，比活性为4.1U/mg蛋白质。用有机体溶液试样浓缩试剂(MizubutorikunAB-1100，由ATTO公司制造)浓缩纯化了的酶，以获得10U/ml纯化的酶溶液。

(实施例11)评价与硅板的键联亲和力

用含0.1％Tween-20的TBST缓冲液冲洗硅板表面。将相当于实施例10中制备的0.5U的PHA合成酶YN2-C1(Si)或参考例中制备的YN2-C1加入到其中，并在室温下振荡30分钟。用TBST缓冲液冲洗该硅板表面，除去未键合到硅板上的酶。用TBST缓冲液填充该冲洗过的硅板表面，并加入酶底物3-羟基辛酰CoA，由CoA的产率测量固定在硅板上的酶活性。结果列在表10中。

表10

对酶与硅板的键联亲和力的评价

	活性U
		YN2-C1(Si)	0.05
YN2-C1	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C1相比，与硅板亲和序列融合的酶YN2-C1(Si))具有更高的酶活性，因此能够有效地将其固定在基材的表面上。

(实施例12)硅板PHA层叠结构体

用含0.1％Tween-20的TBST缓冲液冲洗硅板表面，向其加入相当于0.5U的PHA合成酶YN2-C1(Si)或PHA合成酶YN2-C1，并在室温下振荡30分钟。用TBST缓冲液冲洗该硅板表面，除去未键合到硅板上的酶。用TBST缓冲液填充该冲洗过的硅板表面，并加入参考例2中制得的酶底物(R)-3-羟基-5-(4-氟代苯基)戊酰CoA，以使其最终浓度为5mM。在37℃下温育30分钟，以进行合成反应。

用尼罗蓝A对该反应混合物中和在硅板上生成的PHA进行染色，并用荧光显微镜进行观察。在加入YN2-C1的试样中，观察到游离的PHA颗粒。另一方面，在加入YN2-C1(Si)的反应混合物上清液中，未观察到游离的PHA颗粒，由此证实了已经由合酶实施了有效的PHA合成反应。此外通过荧光染色观察到层叠在硅板上的PHA。

将所制得的PHA层叠硅板结构体进行真空干燥，随后将其浸在20毫升氯仿中，在60℃下，搅拌该溶液20小时，以提取层叠的PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤该提取物，用旋转蒸发器进行真空浓缩，然后依据常规方法进行甲醇解作用。用气相色谱-质谱装置(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)对所得产品进行分析，以确定甲基酯化的PHA单体单元。结果证实了所关心的PHA是具有(R)-3-羟基-5-(4-氟代苯基)戊酸的PHA单体单元，如图3A和3B所示。此外，用凝胶渗透色谱(GPC；TOSOHCORPORATION HLC-8020，柱子；Polymer Laboratory PLgel MIXED-C(5微米)，溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯校正)对该PHA进行分子量评价，得出Mn＝17,000和Mw＝37,000。

(实施例13)制备囊状结构体(梯级结构体)

将1重量份的铜酞菁颗粒(体均粒径为1.45微米)和39重量份的PBS加入到10重量份例2中制备的YN2-C1(pht)达蛋白质(10U/ml)中，其中通过沉积作用使铜酞菁颗粒直径均衡，在30℃下温和地振荡该混合物30分钟，以将PHA合酶固定在铜酞菁上。通过离心作用(10,000×g，4℃和10分钟)将其分离，使沉积物悬浮在PBS溶液中，然后再一次通过离心分离(10,000×g，4℃和10分钟)得到固定化酶。

将该固定的酶浸在100重量份含30mM(R)-3-羟基辛酰CoA(通过Eur.J.Biochem.，250和432-439(1997)中的方法制备)和0.1％牛血清白蛋白(由Sigma-Aldrich Com.制造)的0.1M磷酸缓冲液中(pH7.0)。此后，在30℃下温和振荡该反应混合物的同时，向该反应体系加入含30mM(R)-3-羟基庚二酰CoA(通过J.Bacteriol.，182，2753-2760(2000)中的方法制备)和0.1％牛血清白蛋白(由Sigma-Aldrich Com.制造)的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)，使用微管泵(MP-3N，由TOKYORIKAKIKAICO，LTD.制造)加入速率为每分钟25重量份。

将所得产品振荡30分钟之后，用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)进行冲洗，除去未反应的物质等，随后风干所得产物，由此获得囊状结构体。

用飞行时间类型的二级离子质谱装置(TOF-SIMS IV，由CAMECA制造)测量在该囊状结构体表面上形成的聚合物质量。所得质谱表明囊状结构体表面由3-羟基庚二酸和3-羟基辛酸(摩尔比为17∶1)的共聚物组成。此外，当用同样方式进一步用TOF-SIMS进行质谱分析时，通过离子溅射逐渐削去囊状结构体的表面，上述共聚物中的3-羟基庚二酸的组成比例逐渐下降。从该结果可以明白该例子中的囊状结构体具有这样一种结构体，其中表面被履盖具有亲水官能团的聚羟基庚二酸酯，更低的区域覆盖具有亲水官能团的3-羟基庚二酸和具有疏水官能团的3-羟基辛酸的共聚物，当其延伸至更低的层时，3-羟基辛酸的组成比例增加。

此外，用凝胶渗透色谱(GPC；TOSOH CORPORATION HLC-8020，柱子；Polymer Laboratory PLgel MIXED-C(5微米)，溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯校正)对PHA进行分子量评价，得出Mn＝21,000和Mw＝40,000。

(实施例14)制备囊状结构体(化学修饰)

将1重量份的铜酞菁颗粒(颗粒直径为0.12微米到135微米)和39重量份的PBS加入到10重量份例2中制备的YN2-C1(pht)表达蛋白质(10U/ml)中，在30℃下温和地振荡该混合物30分钟，以将PHA合酶固定在铜酞菁上。通过离心作用(10,000×g，4℃和10分钟)将其分离，使沉积物悬浮在PBS溶液中，然后再一次通过离心分离(10,000×g，4℃和10分钟)得到固定的酶。

将该固定的酶浸在48重量份的0.1M磷酸缓冲液中(pH7.0)，并向该悬浮液中加入0.8重量份的(R，S)-3-羟基-5-苯氧基戊酰CoA和0.2重量份的(R，S)-3-羟基-7，8-环氧基辛酰CoA，和0.1重量份的牛血清白蛋白(由Sigma-Aldrich Com.制造)，其中(R，S)-3-羟基-5-苯氧基戊酰CoA是这样制备的，将由3-苯氧基-丙醛和溴代醋酸乙酯通过Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧基戊酸酯进行水解，由此水解得到3-羟基-5-苯氧基戊酸，后依据Eur.J.Biochem.，250和432-439(1997)中的方法进行制备；其中(R，S)-3-羟基-7，8-环氧基辛酰CoA是这样制备的，依据Int.J.Biol.Macromol.，12和85-91(1990)中给出的方法，将合成得到的3-羟基-7-辛烯酸的不饱和部分用3-氯过苯甲酸实施环氧化作用，然后依据Eur.J.Biochem.，250和432-439(1997)中的方法进行制备，此后，在30℃下温和振荡所得产物2小时，以得到试样1。

重复上述相同步骤，除了将(R，S)-3-羟基-7，8-环氧基辛酰CoA改为3-羟基辛酰CoA，以制备试样2，作为对照。

将上述10微升试样在载玻片上制备成试样之后，加入10微升1％的尼罗蓝A水溶液，并在载玻片上混合，在其上放置一盖玻片，随后用荧光曗微镜(330-380nm激发滤片，420nm长通吸附滤片，由Nikon Corporation制造)对最终产物进行观察。此后，在所有的试样中，证实了铜酞菁颗粒表面发出了荧光。因此表明铜酞菁颗粒表面覆盖有PHA。

作为比较，将1重量份的铜酞菁加入到49重量份的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中，在30℃下温和振荡该溶液2.5小时，用相同的方法用尼罗蓝A对产物进行染色，并用荧光显微镜进行观察。结果铜酞菁颗粒表明根本就没有发出荧光。

此外，用离心方法(10,000×g，4℃和10分钟)收集一部分试样，真空干燥之后，将其悬浮在氯仿中，在60℃下搅拌该溶液20小时，萃取出构成薄膜的PHA。对该萃取物进行¹H-NMR分析(所用装置：FT-NMR：Bruker DPX400，所测的核素：¹H，使用的溶剂：重氯仿(带有TMS))。在表11中显示了从所得数据计算出的各侧链单元的百分比。

表11

囊状结构体PHA膜的组成

(¹H-NMR，％比)

单体单元	试样1	试样2
			3-羟基-5-苯氧基戊酸	84％	76％
3-羟基-7，8-环氧基辛酸	16％	-
			3-羟基辛酸	-	24％

将上述试样1重量的50％进行离心分离(10,000×g，4℃和10分钟)，收集该囊状结构体，使所得产物悬浮在50重量份的纯水中，并重复该操作3次。随后，将0.5重量份的六亚甲基二胺溶解在该悬浮液中，作为交联剂。确定溶解后，用冷冻-干燥方法除去水(参考例3)。此外，在70℃下在氯仿中使试样3反应12小时(参考例4)。使上述试样3和试样4悬浮在氯仿中，在60℃下搅拌该悬浮液20小时，以提取构成薄膜的PHA，真空蒸发除去氯仿，并用微分扫描热量仪(DSC；由Perkin Elmer，Inc.制造，Pyrsi 1，温度每分钟升高10摄氏度)进行测量。则试样3在邻近90℃处给出清晰的放热峰，这表明聚合物中的环氧基团和六亚甲基二胺之间发生了反应，聚合物之间发生键联。另一方面，在实施例4中，未观察到清晰的热缺陷，这表明交联反应基本上完成。

此外，对相同的试样进行红外吸附的测量(FT-IR；由Perkin Elmer，Inc.制造，1720X)。则在试样3中观察到的氨基峰(在3340cm^-1附近)和环氧基团(在822cm^-1附近)在试样4中消失。

从以上结果可明了：通过侧链中具有环氧单元的PHA和六亚甲基二胺之间的反应得到一种交联聚合物，

另一方面。作为比较，虽然对试样2进行了同样的评价，在上述情况下的评价结果清楚地表明聚合物之间未发生交联。

(实施例15)与铜酞菁有键合亲和力的氨基酸序列的获取

(1)将铜酞菁(α类型：Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.)悬浮在含0.1％的Tween-20的TBS缓冲液(50mM Tris-盐酸pH7.5 150mM NaCl)中，以得到5mg/ml的浓度。将10微升该悬浮液加到Eppendorf试管中，并加入990微升的TBST(TBS缓冲液+0.1％Tween-20)缓冲液进行稀释

(2)将相当于4×10¹⁰pfu量的ph.D.-12噬菌体显示肽文库(由NewEngland Biolabs Inc.制造)加到该试管中，并将其在25℃下静置10分钟。

(3)通过离心(20630×g，5分钟)分离该试管后，除去上清液，收集作为沉淀的颜料。再一次使颜料悬浮在TBST缓冲液中，重复离心操作，用TBST缓冲液冲洗该颜料10次。

(4)加入100微升洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)1mg/ml BSA)之后，静置该溶液1分钟，进行离心分离(20630×g，5分钟)，将上清液移至另一Eppendorf试管中，然后加入15微升的1M的Tris-盐酸(pH 9.1)。中和该溶液以得到一种洗脱了的噬菌体。

(5)用该洗脱了的噬菌体感染以对数生长的早期大肠杆菌ER2537(由NewEngland Biolabs Inc.制造)，该噬菌体被扩增。在37℃下培养4.5小时。此后，通过离心分离从细胞中分离出该噬菌体，在聚乙二醇中沉降来纯化。使该纯化和扩增的噬菌体悬浮在TBS缓冲液中，通过用合适的稀释剂系列感染大肠杆菌测量其效价(滴度)。

(6)使用该扩增的噬菌体将上述步骤(1)到(5)再重复3次。但是将TBST缓冲液中使用的Tween-20的浓度升高至0.5％，冲洗条件被分隔开。此后从第二次之后，对Eppendorf试管实施相同的操作作为对照。各循环中洗脱噬菌体的效价显示在表12中。

表12

各循环中洗脱噬菌体的效价

	原溶液(A)	对照键合(B)	酞菁键合(C)	C/A	C/B
						第一次	4.0×1011		1.2×106	3.0×10-6
第二次	1.6×1011	1.1×105	1.7×105	1.1×10-5	1
						第三次	2.0×1011	1.6×105	3.0×108	1.5×10-3	1800
第四次	1.7×1011	2.7×106	5.3×109	3.1×10-2	2000

(A，B，C的单位用pfu/ml表示)

通过用最终洗脱的噬菌体使大过量的大肠杆菌感染来进行克隆。用各克隆(clone)感染大肠杆菌和扩增克隆之后，制备ssDNA，无序区域的碱基序列被解读，对的肽测序，由此得到与铜酞菁有键合亲和力的氨基酸序列

表13中示出了所得到的氨基酸序列和频率。

表13确定的氨基酸序列和频率

确定的氨基酸序列	数目(A)	频率(A/36)
			Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(SEQ ID No：24)	6	0.17
Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(SEQ ID No：25)	6	0.17
			Lys-Cys-Cys-Tyr-Tyr-Asp-His-Ser-His-Ala-Leu-Ser(SEQ ID No：26)	4	0.11
Glu-Tyr-Leu-Ser-Ala-Ile-Val-Ala-Gly-Pro-Trp-Pro(SEQ ID No：27)	3	0.08
			Lys-Leu-Trp-Ile-Leu-Glu-Pro-Thr-Val-Thr-Pro-Thr(SEQ ID No：28)	3	0.08
Gln-Ser-Asn-Leu-Lye-Val-Ile-Pro-Ser-Trp-Trp-Phe(SEQ ID No：29)	3	0.08
			Trp-Ile-Pro-Pro-Gln-Trp-Ser-Arg-Leu-Ile-Glu-Pro(SEQ ID No：30)	3	0.08
Asp-His-Pro-Gln-Ala-Lys-Pro-Asn-Trp-Tyr-Gly-Val(SEQ ID No：31)	1	0.02
			Gly-Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-Arg-Leu-Ala-Gln(SEQ ID No：32)	1	0.02
Lys-Leu-Thr-Thr-Gln-Tyr-Met-Ala-Arg-Ser-Ser-Ser(SEQ ID No：33)	1	0.02
			Lys-Val-Trp-Met-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Gln-Ala-Thr(SEQ ID No：34)	1	0.02
Asn-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Phe-Ile-Asp-Thr-Pro-Trp(SEQ ID No：35)	1	0.02
			Arg-Leu-Asn-Leu-Asp-Ile-Ile-Ala-Val-Thr-Ser-Val(SEQ ID No：36)	1	0.02
Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(SEQ ID No：37)	1	0.02
			Thr-Asn-Arg-His-Asn-Pro-His-His-Leu-His-His-Val(SEQ ID No：38)	1	0.02

(实施例16)

重复实施例2中的相同步骤，按照如下方式制备与铜酞菁有键合亲和力的PHA合酶。按照如下方法构建通过间隔序列GS(SEQ ID No：177)将PHA合酶的N端与各氨基酸序列(从SEQ ID No：24到SEQ ID No：38)融合在一起来表达的大肠杆菌表达载体。制成对这些氨基酸序列进行编码的双链合成DNA，得到以下表14中的一系列合成寡核苷酸。

表14

用于表达各氨基酸序列的合成DNA系列

SEQ ID NO：           SEQ ID NO：合成DNA的碱基序列

氨基酸序列

SEQ ID NO：氨基酸序列	SEQ ID NO：合成DNA的碱基序列
		SEQ ID NO：24KYDSRHLHTHSH	SEQ ID NO：645′-GATCCAAATATGATAGCCGTCATCTGCATACCCATAGCCATGAGCT-3′SEQ ID NO：655′-CATGGCTATGGGTATGCAGATGACGGCTATCATATTTG-3′
SEQ ID NO：25PNRLGRRPVRWE	SEQ ID NO：665′-GATCCCCGAACCGTCTGGGCCGTCGTCCGGTGCGTTGGGAAGAGCT-3′SEQ ID NO：675′-CTTCCCAACGCACCGGACGACGGCCCAGACGGTTCGGG-3
		SEQ ID NO：26KCCYYDHSHALS	SEQ ID NO：685′-GATCCAAATGCTGCTATTATGATCATAGCCATGCGCTGAGCGAGCT-3′SEQ ID NO：695′-CGCTCAGCGCATGGCTATGATCATAATAGCAGCATTTG-3′
SEQ ID NO：27EYLSAIVAGPWP	SEQ ID NO：705′-GATCCGAATATCTGAGCGCGATTGTGGCGGGCCCGTGGCCGGAGCT-3′SEQ ID NO：715′-CCGGCCACGGGCCCGCCACAATCGCGCTCAGATATTCG-3′
		SEQ ID NO：28KLWILEPTVTPT	SEQ ID NO：725′-GATCCAAACTGTGGATTCTGGAACCGACCGTGACCCCGACCGAGCT-3′SEQ ID NO：735′-CGGTCGGGGTCACGGTCGGTTCCAGAATCCACAGTTTG-3′
SEQ ID NO：29QSNLKVIPSWWF	SEQ ID NO：745′-GATCCCAGAGCAACCTGAAAGTGATTCCGAGCTGGTGGTTTGAGCT-3′SEQ ID NO：755′-CAAACCACCAGCTCGGAATCACTTTCAGGTTGCTCTGG-3′
		SEQ ID NO：30WIPPQWSRLIEP	SEQ ID NO：765′-GATCCTGGATTCCGCCGCAGTGGAGCCGTCTGATTGAACCGGAGCT-3′SEQ ID NO：775′-CCGGTTCAATCAGACGGCTCCACTGCGGCGGAATCCAG-3′
SEQ ID NO：31DHPQAKPNWYGV	SEQ ID NO：785′-GATCCGATCATCCGCAGGCGAAACCGAACTGGTATGGCGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：795′-CCACGCCATACCAGTTCGGTTTCGCCTGCGGATGATCG-3′
		SEQ ID NO：32GLPPYSPHRLAQ	SEQ ID NO：805′-GATCCGGCCTGCCGCCGTATAGCCCGCATCGTCTGGCGCAGGAGCT-3′SEQ ID NO：815′-CCTGCGCCAGACGATGCGGGCTATACGGCGGCAGGCCG-3′
SEQ ID NO：33KLTTQYMARSSS	SEQ ID NO：825′-GATCCAAACTGACCACCCAGTATATGGCGCGTAGCAGCAGCGAGCT-3′SEQ ID NO：835′-CGCTGCTGCTACGCGCCATATACTGGGTGGTCAGTTTG-3′
		SEQ ID NO：34KVWMLPPLPQAT	SEQ ID NO：845′-GATCCAAAGTGTGGATGCTGCCGCCGCTGCCGCAGGCGACCGAGCT-3′SEQ ID NO：855′-CGGTCGCCTGCGGCAGCGGCGGCAGCATCCACACTTTG-3′
SEQ ID NO：35NVTSTAFIDTPW	SEQ ID NO：865′-GATCCAACGTGACCAGCACCGCGTTTATTGATACCCCGTGGGAGCT-3′SEQ ID NO：875′-CCCACGGGGTATCAATAAACGCGGTGCTGGTCACGTTG-3′

SEQ ID NO：36RLNLDIIAVTSV	SEQ ID NO：885′-GATCCCGTCTGAACCTGGATATTATTGCGGTGACCAGCGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：895′-CCACGCTGGTCACCGCAATAATATCCAGGTTCAGACGG-3′
		SEQ ID NO：37TLPSPLALLTVH	SEQ ID NO：905′-GATCCACCCTGCCGAGCCCGCTGGCGCTGCTGACCGTGCATGAGCT-3′SEQ ID NO：915′-CATGCACGGTCAGCAGCGCCAGCGGGCTCGGCAGGGTG-3′
SEQ ID NO：38TNRHNPHHLHHV	SEQ ID NO：925′-GATCCACCAACCGTCATAACCCGCATCATCTGCATCATGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：935′-CCACATGATGCAGATGATGCGGGTTATGACGGTTGGTG-3′

依照手册的描述，分别用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)将对应于各氨基酸序列的两种合成DNA磷酸化。随后，将等摩尔量的两种合成DNA混合，并在80℃下加热5分钟，然后慢慢冷却至室温形成双链DNA片段。将所形成的双链DNA片段直接用于此后的克隆步骤。

用BamHI和SacI消化质粒pGEX-C1，并插入上述双链DNA片段。用这些载体使大肠杆菌(JM109)变形，以获得一种用于表达的菌株，用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，得到表达用菌株。用Miniprep(Wizard Minipreps DNA纯化体系，由PROMEGA制造)制备的质粒DNA作为模板通过使用pGEX5’测序引物(由Amasham Pharmasia Biotech Corp.)测序，来确定插入的碱基序列，以鉴定该菌株。将所得菌株在10毫升LB-Amp培养基中预培养至过夜，此后将0.1毫升含菌株的所得产物加入到10ml LB-Amp培养基中，然后在170rpm，37℃下摇动培养3小时。此后，加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下连续培养4到12小时。

收集IPTG引发的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，在4℃下，在1/10量的PBS中使其重新悬浮。通过冷冻，解冻和超声波处理将细胞压碎，并对其进行离心分离(8000×g，10分钟，4℃)，以除去细胞碎屑。用SDS-PAGE确定在上清液(无细胞的萃取物)中存在目标表达蛋白质，此后用谷胱甘肽Sepharose4B珠(由Amasham Pharmasia Biotech Co.Ltd制造)纯化该引入和表达了的GTS融合蛋白质。

事先对所用的谷胱甘肽Sepharose进行抑制非特异性吸附的处理。即，用相同量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose三次(8000×g，1分钟，4℃)，此后加入含4％BSA的相同量的PBS，以在4℃下处理谷胱甘肽Sepharose 1小时。处理后，用相同量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose两次，然后在1/2量的PBS中再悬浮。将40微升预处理了的谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升无细胞的萃取液中，在4℃下温和地搅拌。因此，融合蛋白质GST-aa24-YN2-C1到GST-aa38-YN2-C1被吸附到谷胱甘肽Sepharose上。[在融合蛋白质GST-aa##-YN2-C1中，aa##是指融合在PHA合酶和GST之间的含SEQ ID NO：##的氨基酸序列的多肽被表达。]

在吸附之后，通过离心(8000×g，1分钟，4℃)分离方法收集谷胱甘肽Sepharose，并用400微升PBS冲洗3次。此后，加入40微升的10mM还原谷胱甘肽，在4℃下搅拌1小时，以洗脱吸附的融合蛋白质。离心(8000×g，2分钟，4℃)分离之后收集上清液，且此后针对PBS进行渗析法，以纯化GST融合蛋白质。由SDS-PAGE证实了得到一单条带。

用PreScission蛋白酶(Amasham Pharmasia Biotech.5U)消化500微克的各GST融合蛋白质，此后通过谷胱甘肽Sepharose以除去蛋白酶和GST。流通片段进一步用与PBS平衡的交联葡聚酸凝胶G200柱子进行处理，以获得最终纯化的表达蛋白质aa24-YN2-C1(pht)到aa38-YN2-C1(pht)。[在表达蛋白质aa##-YN2-C1(pht)中，aa##是指含SEQ ID NO：##的氨基酸序列的多肽通过与PHA合酶的N端融合而被表达。]

用前面所述的方法测量各纯化了的酶的活性。此外，用Micro BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Chemical Com..制造)测量试样中蛋白质的浓度。酶的浓度为1.9U/mL，比活性为4.0U/mg蛋白质。用生物体溶液试样浓缩试剂(Mizubutorikun AB-1100，由ATTO Corporation制造)对纯化的酶进行浓缩，以获得10U/ml的纯化的酶溶液。

(实施例17)对与铜酞菁键合亲和力的评价

使铜酞菁悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，将相当于实施例16中制备的0.5U量的PHA合成酶aa24-YN2-C1(pht)到aa38-YN2-C1(pht)和参考例1中制备的YN2-C1加入到该悬浮液中，并在室温下振荡30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)，收集作为沉淀的铜酞菁颗粒，该颗粒与含未与铜酞菁键联的酶的上清液分离开。再一次使铜酞菁悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，重复离心操作，由此冲洗铜酞菁。在表15中列出了所测得的冲洗后铜酞菁悬浮液的酶活性。

表15

对酶与铜酞菁键联亲和力的评价

酶	融合氨基酸序列	酶活性U
			Aa24-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：24KYDSRHLHTHSH	0.06
Aa25-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：25PNRLGRRPVRWE	0.06
			Aa26-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：26KCCYYDHSHALS	0.05
Aa27-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：27EYLSAIVAGPWP	0.05
			Aa28-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：28KLWILEPTVTPT	0.05
Aa29-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：29QSNLKVIPSWWF	0.05
			Aa30-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：30WIPPQWSRLIEP	0.05
Aa31-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：31DHPQAKPNWYGV	0.05
			Aa32-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：32GLPPYSPHRLAQ	0.05
Aa33-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：33KLTTQYMARSSS	0.05
			Aa34-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：34KVWMLPPLPQAT	0.05
Aa35-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：35NVTSTAFIDTPW	0.05
			Aa36-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：36RLNLDIIAVTSV	0.05
Aa37-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：37TLPSPLALLTVH	0.04
			Aa38-YN2-C1(pht)	SEQ ID NO：38TNRHNPHHLHHV	0.04
YN2-C1	-	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C1相比，与铜酞菁亲和序列融合的酶aa24-YN2-C1(pht)到aa38-YN2-C1(pht)具有更高的酶活性，能够有效地固定在基材的表面上。

(实施例18)

将两种能与铜酞菁键合的氨基酸序列Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(SEQ ID NO：24)和Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(SEQ ID NO：25)按照指定顺序通过间隔序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：181)串联连接，以得到Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(SEQ ID NO：144)，并按照以下方式进一步用间隔序列GS将其融合到PHA合酶的N端，以构建大肠杆菌表达载体。对该氨基酸序列进行解码的DNA形成双链DNA片段，其方式是分别用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)对Seq.1：5’-GATCCAAATATGATAGCCGTCATCTGCATACCCATAGCCATGGCG G CGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCGAACCGTCTGGGCCGTCGTCCG GT GCGTTGGGAAGAGCT-3’(SEQ ID NO：145)和Seq.2：5’-CTTCCCAACGCACCGGACGACGGCCCAGACGGTTCGGGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCATGGCTATGGGTATGCAGATGACGGCTATCATATTTG-3’(SEQ ID NO：146)进行磷酸化之后，混合等摩尔量的两种物质，在80℃下加热5分钟，然后慢慢冷却至室温。如实施例16的方式，将这样形成的双链DNA片段插入到质粒pGEX-C1的BamHI和SacI部位，用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，以得到表达用菌株，如实施例16的方式，氨基酸序列SEQ ID No：144融合在其N端的表达蛋白质aa144-YN2-C1(pht)被纯化，以给出10U/ml的纯化了的酶溶液。与实施例17同样评价了纯化了的酶键联到铜酞菁上的能力。结果列在表16中。

表16

对酶与铜酞菁键联亲和力的评价

酶	融合氨基酸序列	酶活性U
			aa144-YN2-C1(pht)	SEQ ID No：144KYDSRHLHTHSHGGGSGGGSPNRLGRRPVRWE	0.11
YN2-C1	-	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C1相比，与铜酞菁亲和序列融合的酶aa144-YN2-C1(pht)具有更高的酶活性，能够有效地固定在基材的表面上。

(实施例19)与炭黑具有键合亲和力的氨基酸序列的获取

(1)使炭黑(Sigma Aldrich Japan Inc.)悬浮，以得到浓度为5mg/ml的含0.1％Tween-20的TBS缓冲液(50mMTris-盐酸pH7.5 150mM NaCl)。将10微升该悬浮液加到Eppendorf试管中，并加入990微升的TBST(TBS缓冲液+0.1％Tween-20)缓冲液进行稀释。

(2)将相当于4×10¹⁰pfu量的Ph.D.-12噬菌体显示肽文库(由NewEngland Biolabs Inc.制造)加到该试管中，并将其在25℃下静置10分钟。

(3)通过离心(20630×g，5分钟)分离该试管后，除去上清液，收集作为沉淀的颜料。再一次使颜料悬浮在TBST缓冲液中，重复离心操作，用TBST缓冲液冲洗该颜料10次。

(4)加入100微升洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)1mg/ml BSA)之后，静置该溶液1分钟，进行离心分离(20630×g，5分钟)，将上清液移至另一Eppendorf试管中，然后加入15微升的1M的Tris-盐酸(pH 9.1)，中和该溶液以得到一种洗脱了的噬菌体。

(5)用该洗脱了的噬菌体感染以对数生长的早期大肠杆菌ER2537(由NewEngland Biolabs Inc.制造)，该噬菌体被扩增。在37℃下培养4.5小时。此后，通过离心分离从细胞中分离出该噬菌体，在聚乙二醇中沉降来纯化。使该纯化和扩增的噬菌体悬浮在TBS缓冲液中，通过用合适的稀释剂系列感染Escherichia col对其进行效价(滴度)测定。

(6)使用该扩增的噬菌体将上述步骤(1)到(5)再重复4次。但是将TBST缓冲液中使用的Tween-20的浓度升高至0.5％，冲洗条件被分隔开。此后从第二次之后，对Eppendorf试管实施相同的操作作为对照。各循环中洗脱噬菌体的效价显示在表17中。

表17

各循环中洗脱噬菌体的效价

	原溶液(A)	对照键联(B)	炭黑键联(C)	C/A	C/B
						第一次	4.0×1011		8.9×106	2.2×10-5
第二次	1.6×1011	1.1×105	3.8×106	2.4×10-5	35
						第三次	2.0×1011	1.6×105	6.0×106	3.0×10-5	40
第四次	1.7×1011	1.1×106	1.5×108	8.8×10-4	140
						第五次	1.9×1011	2.0×106	2.7×109	1.4×10-2	1400

(A，B，C的单位用pfu/ml表示)

通过用最终洗脱的噬菌体使大过量的大肠杆菌感染来进行克隆。用各克隆(clone)感染大肠杆菌和扩增克隆之后，制备ssDNA，无序区域的碱基序列被译出，由此得到与炭黑有键合亲和力的氨基酸序列。表18中示出了所得到的氨基酸序列和频率。

表18

确定的氨基酸序列和频率

确定的氨基酸序列	数目(A)	频率(A/38)
			Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(SEQ ID NO：39)	4	0.10
Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(SEQ ID NO：40)	3	0.08
			Trp-His-Trp-Ser-Trp-Thr-Pro-Trp-Pro-Ser-His-His(SEQ ID NO：41)	2	0.05
Trp-Pro-Trp-Ala-Trp-His-Pro-Ser-Arg-Asp-Val-Tyr(SEQ ID NO：42)	2	0.05
			Trp-His-Gly-Tyr-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Asn-Thr-Thr(SEQ ID NO：43)	2	0.05
Trp-Trp-Thr-Pro-Trp-Met-Ser-His-Ala-Tyr-Pro-Val(SEQ ID NO：44)	2	0.05
			Trp-Pro-Asn-Pro-Tyr-Trp-Gly-Trp-Phe-Ala-Ala-Val(SEQ ID NO：45)	2	0.05
Thr-Ser-Trp-His-Thr-Trp-Trp-Trp-Arg-Gln-Pro-Pro(SEQ ID NO：46)	2	0.05
			Asn-Ala-Trp-His-Lys-Tyr-Trp-Trp-Pro-Ile-Thr-Lys(SEQ ID NO：47)	2	0.05
His-Pro-Asn-Asn-Asp-Trp-Ser-Lys-Ala-Pro-Gln-Phe(SEQ ID NO：48)	2	0.05
			Trp-Trp-Thr-Pro-Gln-Pro-Trp-Trp-Ser-Phe-Pro-Ile(SEQ ID NO：49)	1	0.03
Trp-Pro-His-Thr-Ser-Trp-Trp-Gln-Thr-Pro-Leu-Thr(SEQ ID NO：50)	1	0.03
			Trp-His-Val-Asn-Trp-Asp-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Arg(SEQ ID NO：51)	1	0.03
Ser-Trp-Pro-Trp-Trp-Thr-Ala-Tyr-Arg-Val-His-Ser(SEQ ID NO：52)	1	0.03
			Trp-His-Ser-Asn-Trp-Tyr-Gln-Ser-Ile-Pro-Gln-Val(SEQ ID NO：53)	1	0.03
Gly-Tyr-Trp-Pro-Trp-Lys-Phe-Glu-His-Ala-Thr-Val(SEQ ID NO：54)	1	0.03
			Ala-Trp-Trp-Pro-Thr-Thr-Phe-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Tyr(SEQ ID NO：55)	1	0.03
Asn-Pro-Trp-Trp-Ser-His-Tyr-Tyr-Pro-Arg-Ser-Val(SEQ ID NO：56)	1	0.03
			Trp-Pro-His-Asn-Tyr-Pro-Leu-Asn-His-Ser-Asn-Pro(SEQ ID NO：57)	1	0.03
Thr-Trp-Ala-His-Pro-Leu-Glu-Ser-Asp-Tyr-Leu-Arg(SEQ ID NO：58)	1	0.03
			His-Thr-Tyr-Tyr-His-Asp-Gly-Trp-Arg-Leu-Ala-Pro(SEQ ID NO：59)	1	0.03
Thr-Phe-Val-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-His-Leu-Ile-Ala(SEQ ID NO：60)	1	0.03
			Arg-Val-Pro-Pro-Ser-Lys-Leu-Thr-Arg-Pro-Pro-Phe(SEQ ID NO：61)	1	0.03
His-Ser-Ile-Tyr-Ser-Val-Thr-Pro-Ser-Thr-Ala-Ser(SEQ ID NO：62)	1	0.03
			Leu-Asn-Thr-Gln-Asn-His-Ala-Pro-Leu-Pro-Ser-Ile(SEQ ID NO：63)	1	0.03

(实施例20)

按照如下方法制备与炭黑有键合亲和力的PHA合酶。按照以下方式通过间隔序列GS将PHA合酶的N端融合到各氨基酸序列(从SEQ ID No：39到SEQID No：63)上，来表达大肠杆菌表达载体。在对这些氨基酸序列解码时，由于DNA被制作成双链合成DNA，制备了以下表19中的一细合成DNA。

表19

用于表达各氨基酸序列的合成DNA

SEQ ID No：氨基酸序列	SEQ ID No：合成DNA碱基序列
		SEQ ID NO：39WPHAWKVWWPAS	SEQ ID NO：945′-GATCCTGGCCGCATGCGTGGAAAGTGTGGTGGCCGGCGAGCGAGCT-3′SEQ ID NO：955′-CGCTCGCCGGCCACCACACTTTCCACGCATGCGGCCAG-3′
SEQ ID NO：40NWWWPPYIRHQP	SEQ ID NO：965′-GATCCAACTGGTGGTGGCCGCCGTATATTCGTCATCAGCCGGAGCT-3′SEQ ID NO：975′-CCGGCTGATGACGAATATACGGCGGCCACCACCAGTTG-3′

SEQ ID NO：41WHWSWTPWPSHH	SEQ ID NO：985′-GATCCTGGCATTGGAGCTGGACCCCGTGGCCGAGCCATCATGAGCT-3′SEQ ID NO：995′-CATGATGGCTCGGCCACGGGGTCCAGCTCCAATGCCAG-3′
		SEQ ID NO：42WPWAWHPSRDVY	SEQ ID NO：1005′-GATCCTGGCCGTGGGCGTGGCATCCGAGCCGTGATGTGTATGAGCT-3′SEQ ID NO：1015′-CATACACATCACGGCTCGGATGCCACGCCCACGGCCAG-3′
SEQ ID NO：43WHGYWYSNLNTT	SEQ ID NO：1025′-GATCCTGGCATGGCTATTGGTATAGCAACCTGAACACCACCGAGCT-3′SEQ ID NO：1035′-CGGTGGTGTTCAGGTTGCTATACCAATAGCCATGCCAG-3′
		SEQ ID NO：44WWTPWMSHAYPV	SEQ ID NO：1045′-GATCCTGGTGGACCCCGTGGATGAGCCATGCGTATCCGGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：1055′-CCACCGGATACGCATGGCTCATCCACGGGGTCCACCAG-3′
SEQ ID NO：45WPNPYWGWFAAV	SEQ ID NO：1065′-GATCCTGGCCGAACCCGTATTGGGGCTGGTTTGCGGCGGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：1075′-CCACCGCCGCAAACCAGCCCCAATACGGGTTCGGCCAG-3′
		SEQ ID NO：46TSWHTWWWRQPP	SEQ ID NO：1085′-GATCCACCAGCTGGCATACCTGGTGGTGGCGTCAGCCGCCGGAGCT-3′SEQ ID NO：1095′-CCGGCGGCTGACGCCACCACCAGGTATGCCAGCTGGTG-3′
SEQ ID NO：47NAWHKYWWPITK	SEQ ID NO：1105′-GATCCAACGCGTGGCATAAATATTGGTGGCCGATTACCAAAGAGCT-3′SEQ ID NO：1115′-CTTTGGTAATCGGCCACCAATATTTATGCCACGCGTTG-3′
		SEQ ID NO：48HPNNDWSKAPQF	SEQ ID NO：1125′-GATCCCATCCGAACAACGATTGGAGCAAAGCGCCGCAGTTTGAGCT-3′SEQ ID NO：1135′-CAAACTGCGGCGCTTTGCTCCAATCGTTGTTCGGATGG-3′
SEQ ID NO：49WWTPQPWWSFPI	SEQ ID NO：1145′-GATCCTGGTGGACCCCGCAGCCGTGGTGGAGCTTTCCGATTGAGCT-3′SEQ ID NO：1155′-CAATCGGAAAGCTCCACCACGGCTGCGGGGTCCACCAG-3′
		SEQ ID NO：50WPHTSWWQTPLT	SEQ ID NO：1165′-GATCCTGGCCGCATACCAGCTGGTGGCAGACCCCGCTGACCGAGCT-3′SEQ ID NO：1175′-CGGTCAGCGGGGTCTGCCACCAGCTGGTATGCGGCCAG-3′
SEQ ID NO：51WHVNWDPMAWYR	SEQ ID NO：1185′-GATCCTGGCATGTGAACTGGGATCCGATGGCGTGGTATCGTGAGCT-3′SEQ ID NO：1195′-CACGATACCACGCCATCGGATCCCAGTTCACATGCCAG-3′
		SEQ ID NO：52SWPWWTAYRVHS	SEQ ID NO：1205 ′-GATCCAGCTGGCCGTGGTGGACCGCGTATCGTGTGCATAGCGAGCT-3′SEQ ID NO：1215′-CGCTATGCACACGATACGCGGTCCACCACGGCCAGCTG-3′
SEQ ID NO：53WHSNWYQSIPQV	SEQ ID NO：1225′-GATCCTGGCATAGCAACTGGTATCAGAGCATTCCGCAGGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：1235′-CCACCTGCGGAATGCTCTGATACCAGTTGCTATGCCAG-3′
		SEQ ID NO：54GYWPWKFEHATV	SEQ ID NO：1245′-GATCCGGCTATTGGCCGTGGAAATTTGAACATGCGACCGTGGAGCT-3′SEQ ID NO：1255′-CCACGGTCGCATGTTCAAATTTCCACGGCCAATAGCCG-3′

SEQ ID NO：55AWWPTTFPPYYY	SEQ ID NO：1265′-GATCCGCGTGGTGGCCGACCACCTTTCCGCCGTATTATTATGAGCT-3′SEQ ID NO：1275′-CATAATAATACGGCGGAAAGGTGGTCGGCCACCACGCG-3′
		SEQ ID NO：56NPWWSHYYPRSV	SEQ ID NO：1285′-GATCCAACCCGTGGTGGAGCCATTATTATCCGCGTAGCGTGGAGCT-3 ′SEQ ID NO：1295′-CCACGCTACGCGGATAATAATGGCTCCACCACGGGTTG-3′
SEQ ID NO：57WPHNYPLNHSNP	SEQ ID NO：1305′-GATCCTGGCCGCATAACTATCCGCTGAACCATAGCAACCCGGAGCT-3′SEQ ID NO：1315′-CCGGGTTGCTATGGTTCAGCGGATAGTTATGCGGCCAG-3′
		SEQ ID NO：58TWAHPLESDYLR	SEQ ID NO：1325′-GATCCACCTGGGCGCATCCGCTGGAAAGCGATTATCTGCGTGAGCT-3′SEQ ID NO：1335′-CACGCAGATAATCGCTTTCCAGCGGATGCGCCCAGGTG-3′
SEQ ID NO：59HTYYHDGWRLAP	SEQ ID NO：1345′-GATCCCATACCTATTATCATGATGGCTGGCGTCTGGCGCCGGAGCT-3′SEQ ID NO：1355′-CCGGCGCCAGACGCCAGCCATCATGATAATAGGTATGG-3′
		SEQ ID NO：60TFVQTPLSHLIA	SEQ ID NO：1365′-GATCCACCTTTGTGCAGACCCCGCTGAGCCATCTGATTGCGGAGCT-3 ′SEQ ID NO：1375′-CCGCAATCAGATGGCTCAGCGGGGTCTGCACAAAGGTG-3′
SEQ ID NO：61RVPPSKLTRPPF	SEQ ID NO：1385′-GATCCCGTGTGCCGCCGAGCAAACTGACCCGTCCGCCGTTTGAGCT-3′SEQ ID NO：1395′-CAAACGGCGGACGGGTCAGTTTGCTCGGCGGCACACGG-3′
		SEQ ID NO：62HSIYSVTPSTAS	SEQ ID NO：1405′-GATCCCATAGCATTTATAGCGTGACCCCGAGCACCGCGAGCGAGCT-3′SEQ ID NO：1415′-CGCTCGCGGTGCTCGGGGTCACGCTATAAATGCTATGG-3′
SEQ ID NO：63LNTQNHAPLPSI	SEQ ID NO：1425′-GATCCCTGAACACCCAGAACCATGCGCCGCTGCCGAGCATTGAGCT-3′SEQ ID NO：1435′-CAATGCTCGGCAGCGGCGCATGGTTCTGGGTGTTCAGG-3′

依照手册的描述，使用T4聚核苷酸激酶将表19中提到的各氨基酸序列的两种合成DNA磷酸化。此后，混合等摩尔量的两种合成DNA，并在80℃下加热5分钟，然后慢慢冷却至室温，形成双链DNA片段。该双链DNA片段直接用于此后的克隆步骤。

用BamHI和SacI消化质粒pGEX-C1，并插入上述双链DNA片段。用这种载体将大肠杆菌(JM109)变形，得到表达用菌株。用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，得到表达用菌株。用Miniprep(Wizard Minipreps DNA纯化体系，由PROMEGA制造)制备的质粒DNA作为模板通过使用pGEX5’测序引物(由Amasham Pharmasia Biotech Corp.)测序，来确定插入的碱基序列，以鉴定该菌株。用10mlLB-Amp培养基将所得菌株进行预培养至过夜之后，将0.1ml含该菌株的所得产物加入到10ml LB-Amp培养基中，在37℃和170rpm下振荡培养3小时。然后加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下继续培养4到12小时。

收集IPTG诱导的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，并在4℃，1/10量的PBS中重新使其悬浮。通过冷冻解冻和超声波处理将细胞破碎，用离心分离方式将细胞碎屑除去(8000×g，10分钟，4℃)。用SDS-PAGE证实在上清液中存在目标表达蛋白质之后，用谷胱甘肽Sepharose凝胶4B珠粒：(由Amasham Pharmasia Biotech Corp.制造)纯化已引发和表达了的GST融合蛋白质。

事先对所用谷胱甘肽Sepharose进行非特异性吸附抑制处理。即用等量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose3次之后(8000×g，1分钟，4℃)，在4℃下用等量的包含所加4％BSA的PBS处理1小时。处理之后，用等量的PBS冲洗两次，并重新使其悬浮在1/2量的PBS中。将预处理过的40微升谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升不含细胞的萃取液中，并在4℃下平静地搅拌。由此融合的蛋白质GST-aa39-YN2-C1到GST-aa63-YN2-C1被吸附到谷胱甘肽Sepharose上。[在融合蛋白质GST-aa##-YN2-C1中，aa##是指含SEQ ID NO：##的氨基酸序列的多肽被融合在PHA合酶和GST之间来表达。]

在吸附之后，通过离心分离方法(8000×g，1分钟，4℃)收集谷胱甘肽Sepharose，并用400微升PBS冲洗3次。此后，加入40微升的10mM还原谷胱甘肽，在4℃下搅拌1小时，以洗脱吸附的融合蛋白质。离心分离(8000×g，2分钟，4℃)之后收集上清液，且此后针对PBS进行渗析法，以纯化GST融合蛋白质。由SDS-PAGE证实了得到一单条带。

用PreScission蛋白酶(Amasham Pharmacia.Biotech，5U)消化500微克的各GST融合蛋白质，此后通过谷胱甘肽Sepharose以除去蛋白酶和GST。流通片段进一步用与PBS平衡的交联葡聚酸凝胶G200柱子进行处理，以获得最终纯化的表达蛋白质aa39-YN2-C1(cb)到aa63-YN2-C1(cb)。[在表达蛋白质aa##-YN2-C1(cb)中，aa##是指含SEQ ID NO：##的氨基酸序列的多肽通过与PHA合酶的N端融合而被表达。]

用前面所述的方法测量各纯化了的酶的活性。此外，用微BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Chemical Com.)测量试样中蛋白质的浓度。酶的浓度为1.9U/mL，比活性为4.0U/mg蛋白质。用生物体溶液试样浓缩试剂(Mizubutorikun AB-1100，由ATTO Corporation制造)对纯化的酶进行浓缩，以获得10U/ml的纯化的酶溶液。

(实施例21)对与炭黑键合亲和力的评价

使炭黑悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，将相当于例20中制备的0.5U的PHA合成酶aa39-YN2-C1(cb)到aa63-YN2-C1(cb)和参考例1中制备的YN2-C1加入到该悬浮液中，并在室温下振荡该所得溶液30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)，收集作为沉淀的炭黑颗粒，该颗粒从含有未与炭黑键合的酶的上清液中分离开。再一次使炭黑悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，重复离心操作，由此冲洗炭黑。在表20中列出了所测得的冲洗后炭黑悬浮液的酶活性。

表20

对酶与炭黑键联亲和力的评价

酶	融合蛋白质序列	酶活性U
			aa39-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：39WPHAWKVWWPAS	0.06
aa40-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：40NWWWPPYIRHQP	0.06
			aa41-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：41WHWSWTPWPSHH	0.05
aa42-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：42WPWAWHPSRDVY	0.05
			aa43-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：43WHGYWYSNLNTT	0.05
aa44-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：44WWTPWMSHAYPV	0.05
			aa45-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：45WPNPYWGWFAAV	0.05
aa46-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：46TSWHTWWWRQPP	0.05
			aa47-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：47NAWHKYWWPITK	0.05
aa48-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：48HPNNDWSKAPQF	0.05
			aa49-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：49WWTPQPWWSFPI	0.05

aa50-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：50WPHTSWWQTPLT	0.05
			aa51-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：51WHVNWDPMAWYR	0.05
aa52-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：52SWPWWTAYRVHS	0.04
			aa53-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：53WHSNWYQSIPQV	0.04
aa54-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：54GYWPWKFEHATV	0.04
			aa55-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：55AWWPTTFPPYYY	0.04
aa56-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：56NPWWSHYYPRSV	0.04
			aa57-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：57WPHNYPLNHSNP	0.04
aa58-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：58TWAHPLESDYLR	0.04
			aa59-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：59HTYYHDGWRLAP	0.04
aa60-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：60TFVQTPLSHLIA	0.04
			aa61-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：61RVPPSKLTRPPF	0.04
aa62-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：62HSIYSVTPSTAS	0.04
			aa63-YN2-C1(cb)	SEQ ID NO：63LNTQNHAPLPSI	0.04
YN2-C1	-	0.01

证明了与对照的酶YN2-C1相比，与炭黑亲和序列融合的酶aa39-YN2-C1(cb)到aa63-YN2-C1(cb)具有更高的酶活性，因此能够有效地将其固定在基材的表面上。

(实施例22)

将两种能与炭黑键合的氨基酸序列Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(SEQ ID NO：39)和Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(SEQ ID NO：40)按照指定顺序通过间隔序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：181)串联连接，以得到Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(SEQ IDNO：147)，并按照以下方式进一步用间隔序列GS将其融合到PHA合酶的N端，以构建大肠杆菌表达载体。对该氨基酸序列进行解码的DNA形成双链DNA片段，其方式是分别用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)对Seq.1：5’-GATCCTGGCCGCATGCGTGGAAAGTGTGGTGGCCGGCGAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCAACTGGTGGTGGTCGCCGTATATTCGTCATCAGCCGGAGCT-3’(SEQ ID NO：148)和Seq.2：5’-CCGGCTGATGACGAATATACGGCGGCCACCACCAGTTGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCGCTCGCCGGCCACCACACTTTCCACGCATGCGGCCAG-(SEQID NO：149)进行磷酸化之后，混合等摩尔量的两种物质，在80℃下加热5分钟，然后慢慢冷却至室温。如实施例20的方式，将这样形成的双链DNA片段插入到质粒pGEX-C1的BamHI和SacI部位，用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，以得到表达用菌株。如实施例20的方式，氨基酸序列SEQ ID No：147融合在其N端的表达蛋白质aa147-YN2-C1(cb)被纯化，以给出10U/ml的纯化了的酶溶液。按照例21的方法评价纯化了的酶键联到炭黑上的能力。结果列在表21中。

表21

对酶与炭黑键联亲和力的评价

酶	融合氨基酸序列	酶活性U
			aa147-YN2-C1(cb)	SEQ ID No：147WPHAWKVWWPASGGGSGGGSNWWWPPYIRHQP	0.15
YN2-C1	-	0.01

证明了与对照的酶YN2-C1相比，与炭黑亲和序列融合的酶aa147-YN2-C1(cb)具有更高的酶活性，能够有效地固定在基材的表面上。

(实施例23)静电成像显影调色剂的制备和评价

用一种砂磨机分散铜酞菁，以使颗粒粒径不超过0.1微米，向1重量份的该铜酞菁加入39重量份的含0.1％Tween-20的PBS缓冲液，并使其悬浮。将10毫升该悬浮液试样放入由聚四氟乙烯制成的离心管中，向其中加入4U的例16中制备的PHA合酶aa24-YN2-C1(pht)，在室温下振荡30分钟，使PHA合酶吸附在颜料表面上。对其进行离心分离(98,000m/s²(10000G)，4℃和10分钟)，在PBS悬浮液中使该沉淀悬浮，再一次进行离心分离(98,000m/s²(10000G)，4℃和10分钟)，将PHA合酶固定在铜酞菁上。

使上述固定了的酶悬浮在48重量份的0.1M磷酸缓冲液中(pH7.0)，此后向其中加入1重量份的(R，S)-3-羟基-5-苯氧基戊酰CoA和0.1重量份的牛血清白蛋白(由Sigma-Aldrich Com.制造)，其中(R，S)-3-羟基-5-苯氧基戊酰CoA是这样制备的，按照J.Org.Chem.，55，1490-1492(1990)给出的方法，将由3-苯氧基-丙醛和溴代醋酸乙酯的在Zn存在下进行Reformatsky反应得到的3-羟基-5-苯氧基戊酸酯进行水解，由此水解得到3-羟基-5-苯氧基戊酸，然后依据Eur.J.Biochem.，250和432-439(1997)中的方法进行处理。将所得混合液在30℃下温和振荡2小时。将制得的蓝色微囊状颜料进行过滤，洗涤和干燥，由此获得着色剂1。

该着色剂1真空干燥后，使其悬浮在20毫升氯仿中，在60℃下搅拌20小时，以萃取构成薄膜的聚合物。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤该提取物，用旋转蒸发器进行真空浓缩，然后依据常规方法进行甲醇解作用。用气相色谱-质谱装置(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)对所得产品进行分析。结果证实了所得着色剂1薄膜的主成分是含3-羟基-5-苯氧基戊酸单元的PHA。

此外，用凝胶渗透色谱(GPC；TOSOH CORPORATION HLC-8020，柱子；Polymer Laboratory PLg MIXED-C(5微米)，溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯校正)对该PHA进行分子量评价，得出Mn＝29,000。

此外，用激光Doppler系统粒径分布测量器(UPA-150；由NIKKISOCo.，LTD.制造)测量微囊化之前和之后的颜料的体积平均粒径。结果总结在表22中。

此后，用双螺杆轴挤出机(L/D＝30)将以下形成组合物的材料混合，熔融和捏合：

苯乙烯-丙烯酸丁酯共聚物树脂(玻璃化转变温度为70℃)：100质量份，

着色剂1：5质量份

电荷控制剂(由Hoechst：NXVP 434制造)：2质量份。

该捏合的混合物冷却后，通过一种粉碎方法，用锤磨机进行粗磨，用喷射磨进行粉化，并进行分类，获得青色着色颗粒(1)。在该青色着色颗粒(1)的颗粒尺寸中，重均颗粒直径为7.1微米，细粉量为6.0数目％。

对于100重量份的蓝色着色颗粒(1)，用Henschel混合机将1.5重量份的用六甲基二硅氮烷作为流动促进剂处理过的疏水二氧化硅细粉(BET：250m²/g)与之干混，以得到该实施例中的青色调色剂(1)。此外将7重量份的所得青色调色剂(1)和93重量份的涂布了树脂的磁性铁氧体载体(平均颗粒直径：45微米)混合，以制备用于磁刷显影剂(1)的双组分体系青色显影剂，然后进行如下所述的评价。

<对比例1>

除了使用YN2-C1代替PHA合酶aa24-YN2-C1(pht)，用实施例23的同样方法得到青色调色剂(2)。此外，重复实施例23的同样方法用该调色剂制得双组分体系青色显影剂(2)。如实施例23中的方法，对该调色剂进行性能评价。

<对比例2>

除了使用10U的YN2-C1代替4U的PHA合酶aa24-YN2-C1(pht)，用实施例23的同样方法得到青色调色剂(3)。此外，重复实施例23的同样方法用该调色剂制得双组分体系青色显影剂(3)。如实施例23中的方法，对该调色剂进行性能评价。

<对比例3>

除了使用5重量份的铜酞菁代替着色剂1，用实施例23的同样方法得到青色调色剂(4)。此外，重复实施例23的同样方法用该调色剂制得双组分体系青色显影剂(4)。如实施例23中的方法，对该调色剂进行性能评价。

<评价1>

在搅拌10到300秒之后，在通常的温度和湿度(25℃，60％RH)下，以及在高温和湿度(30℃，80％RH)下测量上述显影剂(1)，(2)，(3)和(4)调色剂的充电量。结果总结在表22中。

表22

	调色剂序号	颜料尺寸		在通常的温度和湿度下的充电量(μC/g)		在较高的温度和湿度下的充电量(μC/g)
								微囊化之前(微米)	微囊化之后(微米)	搅拌10秒	搅拌300秒	搅拌10秒	搅拌300秒
		实施例23	1	0.804	0.102	-23.6	-27.7							-22.1	-26.5
对比例1	2							0.796	0.853	-20.9	-25.3	-18.3	-22.4
		对比例2	3	0.811	0.107	-24.1	-27.5							-21.8	-26.4
对比例3	4							0.808		-18.4	-14.8	-14.1	-19.6

微囊化之前和之后的颜料尺寸显示了对比例1中颜料的微囊化不足以与对比例2的相比。这似乎是因为向对比例1中加入的酶的量比对比例2中的情况要小。另一方面，在实施例23中加入的酶的量与对比例1中的相同，但是其微囊化几乎与对比例2中的相当，同时显示出优良的带电量。

结果是实施例23可用少量的酶对颜料进行微囊化，表明其可有效地增加调色剂的充电量。

此后，用上述着色剂进行成像。使用一种成像设备，其是如图4所示，在市售可购得的激光打印机LBP-EX(Canon Inc)中安装一种重复使用的装置而重新设置和改进的。换言之，如图3A和3B所示成像装置设有一种操作系统，其包括用与感光鼓20接触的清洁器21的弹性刮刀22刮去打印后残留在感光鼓20上的印刷过的调色剂，用清洁辊将调色剂转移至清洁器21的内部，进一步使其通过清洁重用装置23，用一设置有转移螺钉的供料用管道24使调色剂通过一漏斗25回到显影设备26中，再一次重复使用回收的调色剂。

在如图4所示的成像装置中，用第一充电辊27对感光鼓20表面进行充电。其上分散有导电碳，并涂布了尼龙树脂的橡胶辊(直径12mm，接触压力50g/cm)用于第一充电辊27，以通过激光曝光(600dpi，未在图中示出)在静电潜像支持体(感光鼓20)上形成暗区电压VD＝-700V亮区电压VL＝-200V的静电潜像。显影套筒28用作调色剂支持体，其表面涂有分散有炭黑的树脂，且其表面粗糙度Ra为1.1。

图5显示了用于单组分显影剂的显影装置主要部分的局部扩增视图，其中单组分显影剂使用实施例24和对比例2中的显影剂。关于显影静电潜像的条件，将显影套筒的速度设定为与其相对的感光鼓20表面移动速度的1.1倍，且进一步将感光鼓20和显影套筒28之间的间距α(S和D之间)设定为270微米。接触一种聚氨酯橡胶刮刀29，用作控制调色剂层厚度的元件。此外，将用于固定调色剂图像的加热定影装置的温度设在160℃。而且，使用图6和7中所示的定影装置。

如上所示，在通常的温度和湿度下(25℃和60％RH)，在持续提供调色剂的同时，以一种连续模式(即，不停止显影设备，增加调色剂消耗的模式)打印，印张为30,000张，打印速度为8张(A4尺寸)/分钟。对打印出的所得影像进行浓度测量，以基于以下提出的标准评价其耐用性。此外，观察第10,000张上的影像，以基于以下提出的标准评价其图象灰雾。而且，同时还观察耐用性测试之后、构成成像装置的各单元状态，以评价各单元和上述各种调色剂之间的匹配程度。所得结果在表23中给出。

(在耐用性过程中影像浓度的转变)

在普通复印机用纸上打印出给定数目的张数(75g/m2)，以评价在打印的最后，相对于最初影像的影像浓度持有程度。此外，为进行评价，使用Macbeth反射器(Macbeth Corp.)测量相对于印出影像白色部分的影像浓度，其底稿浓度为0.00。

A：优秀(打印最后的影像浓度为1.40或更大)

B：良好(打印最后的影像浓度为1.35或更大，且小于1.40)

C：一般(打印最后的影像浓度为1.00或更大，且小于1.35)

D：差(打印最后的影像浓度小于1.00)。

(影像灰雾)

在普通打印机上打印出给定数目的普通纸张(75g/m2)，以基于在打印最后的实心有阴影白色图象进行评价。更具体的是按照如下方式进行评价。

在打印之后，用一种反射器(Rflectometer Odel TC-6DS，Tokyo DenshokuCo.，Ltd)测量打印完成后白色部分的反射浓度的最差值和打印前平均反射浓度，并分别标记为Ds和Dr。将其差值作为灰雾量，并按照以下标准进行评价。

A：优秀(灰雾量为0％或更大，但小于1.5％)

B：良好(灰雾量为1.5％或更大，但小于3.0％)

C：可用(灰雾量为3.0％或更大，但小于5.0％)

D：不可用(打灰雾量为5.0％或更大)。

(对成像装置匹配性的评价)

1与显影套筒的匹配

目测评价残留调色剂在显影套筒表面上定影的状态，和在打印测试之后残留调色剂对印出影像的影响。

A：优秀(不发生)

B：良好(几乎不发生)

C：可用(存在定影，但是对图象的影响很小)

D：不可用(存在大量的定影现象，造成不均匀的图象)。

2与感光鼓的匹配性能

目测评价感光鼓上的刮痕，以及残留调色剂发生定影的状态，及其对印出影像的影响。

A：优秀(不发生)

B：良好(产生轻微的刮痕，但不影响图象)

C：可用(存在定影和刮痕，但是不太影响图象)

D：不可用(存在大量的定影现象，造成垂直线状的图象缺陷)。

3与定影装置的匹配性能

观察定影膜表面状态，以获得表面性能的结论和残留调色剂的定影状态。将其结果进行平均以评价耐用性。

(1)表面性能

目测和评价打印测试之后在定影膜表面上的刮痕和擦痕情况。

A：优秀(不发生)

B：良好(几乎不发生)

C：可用

D：不可用

(2)残留调色剂的定影状态

目测和评价打印测试之后在定影膜表面上的定影情况。

A：优秀(不发生)

B：良好(几乎不发生)

C：可用

D：不可用

表23

	调色剂	对印出影像的评价					与各单元的匹配性的评价
											在耐用性过程中影像浓度的转变				影像灰雾10,000张	显影套筒	感光鼓	定影单元
		初始状态	1,000张	10,000张	30,000张	表面性能	调色剂定影
								实施例例23	1	A	A	A	A	A				A	A	A	A
比较例1	2	A	A	A	B	B	A								B	A	B
								比较例2	3	A	A	A	A	A				A	A	A	A
比较例3	4	A	A	B	C	C	A								B	A	B

实施例23和比较例2中的调色剂都得到较好的结果，二者对颜料进行了足够的微囊化。结果，表明实施例23用少量的酶可有效地获得优秀的成像能力。

(实施例24)制备和评价滤色片

用混砂机分散铜酞菁，使其尺寸为约0.1微米。对于1重量份的该材料加入39重量份含0.1％Tween-20的PBS缓冲液，使所得溶液悬浮。将该悬浮液(10ml)放置在由聚四氟乙烯制成的试管中，并向其中加入例16中制备的4U相当于PHA合酶aa25-YN2-C1(pht)，然后在室温下搅拌所得溶液30分钟，使PHA合酶吸附在颜料的表面。对其进行离心分离(98,000m/s²(10,000G)，4℃，10分钟)并使沉淀悬浮在PBS溶液中，然后再次将该悬浮液进行离心分离(98,000m/s²(10,000G)，4℃，10分钟)，使PHA合酶固定在铜酞菁上。

使上述固定了的酶悬浮在48重量份的0.1M的磷酸缓冲液中(pH7.0)，向该悬浮液中加入1重量份的(R)-3-羟基庚二酰CoA(通过Eur：J.Biochem.，250和432-439(1997)中的方法制备)和0.1重量份牛血清白蛋白(由Sigma-Aldrich Com.制造)。此后，在30℃下温和振荡所得溶液2小时。通过离心分离方法回收所形成的微囊化颜料(10,000×g，4℃，10分钟)。向4重量份的该微囊化颜料中加入10重量份的乙二醇，15重量份的二乙二醇，0.6重量份的苯乙烯/马来酸树脂的单乙醇胺盐(平均分子量为30,000，酸值为300)，和70.4重量份的离子交换水，然后用搅拌桨(80rpm)搅拌该溶液，该分散液作为着色组合物(1)。

此外，用实施例23中的方法确定前述回收了的微囊化颜料PHA单体单元。该PHA证实为由3-羟基庚二酸构成的PHA。

此外，用实施例23的方法用凝胶渗透色谱确定该PHA的分子量，得出Mn＝47,000。

此后，通过喷墨记录装置用着色组合物(1)在玻璃板上形成蓝色油墨点。此外，在80℃下干燥该点20分钟，并进一步在180℃下干燥该点1小时，以形成一着色层。由此得到的该着色层的厚度为0.4微米。此后，用旋涂机在该颜料粒子层上涂布一种热固性树脂(Highcoat LC-2001，Sanyo Chemical IndustriesCo.，Ltd.)，作为一种透明保护膜，由此使干燥后的薄膜厚度为0.5微米。在120℃预烘烤该薄膜30分钟后，在200℃再烘烤30分钟，形成一保护膜，得到本发明滤色片(1)。

<比较例4>

除了用YN2-C1代替PHA合酶aa25-YN2-C1(pht)，用实施例24的相同方法得到青色调色剂(2)。此后，用实施例24的方法使用该调色剂得到双组份青色显影剂(2)。按照例24的方法对该调色剂的性能进行评价。

<比较例5>

除了用10U当量的YN2-C1代替4U当量的PHA合酶aa25-YN2-C1(pht)，用实施例24的相同方法得到青色调色剂(3)。此后，用实施例24的方法使用该调色剂得到双组份青色显影剂(3)。按照例24的方法对该调色剂的性能进行评价。

<比较例6>

除了用4重量份的铜酞菁代替着色组合物(1)，用实施例24的相同方法得到作为对比的青色调色剂(4)。此后，用实施例24的方法使用该调色剂得到双组份青色显影剂(4)。按照例24的方法对该调色剂的性能进行评价。

<评价2>

用激光多普勒型粒径分布测量装置(UPA-150，Nikkiso Co.，Ltd.)确定实施例24和表胶粒4-6中着色组合物的微囊化颜料的体均粒径和在室温下保存30天后的体均粒径。将结果示于表24中。

此时，在颜料微囊化之前的粒径为0.102微米。

表24

	着色组合物	体均粒径/微米(存储前)	体均粒径/微米(存储后)
				实施例24	1	0.124	0.132
比较例4	2	0.108	0.359
				比较例5	3	0.129	0.141
比较例6	4	0.102	0.458

微囊化之前和之后(存储前)的颜料粒径表明比较例4中颜料的微囊化不足以与比较例5中的相比。这似乎是因为向对比例4中加入的酶的量比对比例5中的情况要小。另一方面，在实施例24中加入的酶的量与对比例4中的相同，但是其微囊化几乎与对比例5中的相当。

在实施例24和比较例5中均能进行充分地微囊化，其微囊化颜料的体均粒径在存储前后显示几乎相当的值，显示出优秀的存储稳定性。

因此，实施例24可用少量的酶对颜料进行微囊化，显示出其可有效地阻止颜料凝聚。

此后，按照如下方法评价滤色片(1)，(2)，(3)和(4)，在表25中总结了其结果。

(1)凝聚非均匀性

通过相差显微镜用透射光观察所制备的滤色片的影像。

(2)着色层与板之间的粘结性

在125℃，和85％的湿度下通过高压蒸锅测试6小时，来评价所制备的滤色片。

(3)透明性

通过测试透过率评价滤色片的透明性。测量时使用在400nm到700nm之间所得到的最大透过率处的波长。此外，测定是测定10处像素，并将其进行平均。

此外同时目测进行感官评价。

(4)着色性能

基于感官评价目测所制备的滤色片的着色性能。

(5)对比度(去极化性能)

将两种偏光板面对面放置，由此能改变其光轴，在该偏光板之间与偏光板接触放置滤色片。在该状态下，使用一种用于液晶显示板的背部光源(商标：SLC3LC1EX4UA，Toshiba Lighting & Technology Corp.)用背光照射该滤色片，以改变两个偏光板的光轴。当光轴位于合适的角度以及当二者平行时用亮度计(“Topcon”BM-5A)测量自然光的亮度。计算这些亮度值的比率作为消偏性能。

此外，同时目测进行感官评价。

表25

	滤色片	凝聚非均匀性	粘结性	透明性	着色性	对比度
							实施例24	1	无	没问题	84良好	良好	1014良好
对比例4	2	轻微存在	没问题	76稍差	稍差	943稍差
							对比例5	3	无	没问题	85良好	良好	1017良好
对比例6	4	轻微存在	没问题	71稍差	稍差	904稍差

例24和比较例5可充分地对颜料进行微囊化，其中的滤色片均未显示出凝聚非均匀性，并具有优越的性能，如在粘结性，透明性，着色性和对比度方面。

结果，实施例24表明具有优秀性能的滤色片可通过少量的酶来有效地制备。

(实施例25)制备和评价电泳颗粒

使炭黑颜料悬浮在20mM的含1％重量份Tween-20表面活性剂的磷酸缓冲液(pH7.0)中，使其浓度为25％重量份。用球磨机混合该溶液，以制备一种炭黑的分散液。用激光散射方法发现该分散液为单一分散状态，其粒径为1.2微米。

然后，向该分散液中加入实施例20中制备的PHA合酶aa39-YN2-C1(cb)，使酶的浓度为40U/ml，并将所得混合液在20℃下静置30分钟。此后，向产物中加入参考例2中制备的(R)-3-羟基辛酰CoA，使辅酶的最终浓度为5mM。在37℃下温育30分钟进行合成反应。

对该反应体系进行离心分离(10,000×g，4℃，10分钟)，以得到一种电泳颗粒的含水滤饼。使该含水滤饼重新悬浮在乙醇中，然后用另一离心操作回收电泳颗粒。将该操作重复3次，以进行脱水。然后用煤油使该电泳颗粒悬浮，并用分散介质代替煤油重复离心操作和冲洗以给出电泳显示分散体系(1)。

对上述电泳颗粒进行真空干燥，并将所得产物悬浮在20毫升氯仿中，然后在60℃下搅拌该悬浮液20小时，以萃取包含在外壳中的PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤该萃取物，用旋转蒸发器进行真空浓缩，然后依据常规方法进行甲醇解作用。用气相色谱-质谱分析装置(GC-MS，SShimadzuQP-5050，EI方法)对所得产品进行分析，以确定PHA单体单元的甲基酯化化合物。结果确定了该PHA是具有3-羟基辛酸的PHA单体单元，如图3A和3B所示。此外，用凝胶渗透色谱(GPC：Toso HLC-8020，柱子；PolymerLaboratory PL gel MIXED-C(5微米)，溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯校正)对该PHA进行分子量评价，得出Mn＝22,000和Mw＝42,000。

<比较例7>

除了用YN2-C1代替PHA合酶aa39-YN2-C1(cb)，用与实施例25相同的方法制备电泳颗粒(2)。此后，用与实施例25相同的方法用该颗粒得到电泳显示分散体系(2)。

<比较例8>

除了用100U当量的YN2-C1代替40U当量的PHA合酶aa39-YN2-C1(cb)，用与实施例25相同的方法制备电泳颗粒(3)。此后，用与实施例25相同的方法用该颗粒得到电泳显示分散体系(3)。

<比较例9>

将炭黑(25g)加入到75g热熔融的聚乙烯树脂，然后用辊磨机使其均匀分散。然后冷却该化合物使其硬化，并粉碎成细粒，以得到电泳颗粒(4)。此后，用与实施例25相同的方法用该颗粒得到电泳显示分散体系(4)。

<评价3>

评价电泳颗粒相对于一种绝缘介质的分散性能。

向3g置于测试试管中的电泳颗粒试样加入50毫升分散介质(煤油)，如果需要还加入0.6g表面活性剂(多元羧酸衍生物)，并用磁搅拌搅拌所得混合液2小时。立刻取出上清液(1.0毫升)，并在用电炉进行加热完全除去分散介质之后进行称重。此时用Wo(g)表示该重量。此外，使上述混合液静置一段预定时间，类似地再从测试试管中取出1.0毫升的上清液，并用电炉进行加热完全除去分散介质之后再进行称重。用Wi(g)表示该重量。此后，基于如下公式计算分散稳定性S。

(公式1)

分散稳定性S％＝Wi(g)/Wo(g)×100

在表26中给出了电泳颗粒的分散稳定性S，用激光散射方法得到的粒径。

	电泳颗粒	粒径(微米)	分散稳定性(20分钟之后)
				例25	1	1.6	97％
比较例7	2	1.3	24％
				比较例8	3	1.7	97％
比较例9	4	1.2	2％

微囊化之前和之后的颜料尺寸显示了对比例7中颜料的微囊化不足以与对比例8的相比。这似乎是因为向对比例7中加入的酶的量比对比例8中的情况要小。另一方面，在实施例25中加入的酶的量与对比例7中的相同，但是其微囊化几乎与对比例8中的相当，

在实施例25和比较例8中电泳颗粒都可充分微囊化，而且其在分散介质中的分散稳定性均优秀。

因此，实施例25可用少量酶对颜料进行微囊化，这表示当将该颜料制成电泳颗粒时其可有效地改进分散稳定性。

下一步证实各电泳颗粒的移动情况。

在150微米的由PES膜制成的第一可透光板上形成膜状ITO电极，通过对该板进行光刻和湿法蚀刻，形成线形布图。在该板上形成通过不规则光反射增白的含氧化钛颗粒的树脂层，以作为一绝缘层。此后，在其上形成膜状的碳化钛，作为第二电极，并通过光刻和湿法蚀刻将其制成线形。进一步单独对第一电极进行蚀刻，并穿出圆孔。在第二电极上也形成高度透明的聚酰亚胺层。然后在第二个板的连接处形成热封粘结层。

该第二可透光板由PES膜制成，并通过热压模制方法形成凹形，且在与第一板的粘结部分与第一板形成一热封粘结层。

在该第二个板的凹处，分别装载透明的绝缘液体和实施例25、比较例7-9中制备的各电泳颗粒(1)，(2)，(3)，(4)。用折射系数比第二板材料的PES膜要大的二碘甲烷作为绝缘介质。

装载之后，对第一和第二板的粘结层进行挤压并热封。

在该结构体上设置一施压电路，以得到一种显示装置。

此后，用这样制成的显示装置进行显示。将所施加的电压设置为±50V。

当施加电压使第一电极为阳极，第二电极为阴极时，其中颜料被充分微囊化的电泳颗粒(1)和(3)移动到第二电极上，并位于凹状结构体第二板底面的周边。当从第二板侧面观察时，因为该第二板的凹状结构体作为一透镜，因此光被集中在第一板的中心部分，然后进入到已曝光的，增白的绝缘层，使整个透镜呈白色。此外，当施加电压使极性反转，由此使第一电极为阴极，第二电极为阳极时，电泳颗粒被集中在中心部位，使得整个透镜看起来为黑色电泳颗粒。此时，响应速率为20毫秒或更少，由此得到能显示出两种颜色的显示装置。

另一方面，对于电泳颗粒(2)和(4)，其中不能对颜料进行充分的微囊化，由施加电压导致的移动不均匀，因此不能使整个透镜看起来呈白色或黑色。

(实施例26)颜料油墨的制备和评价

使炭黑颜料悬浮在20mM的含1％重量份Tween-20表面活性剂的磷酸缓冲液(pH7.0)中，使其浓度为25％重量份。用球磨机混合该溶液，以制备一种炭黑的分散液。用激光散射方法发现该分散液为单一分散状态，其粒径为102nm。

然后，向该分散液中加入实施例20中制备的PHA合酶aa40-YN2-C1(cb)，使酶的浓度为40U/ml，并将所得混合液在20℃下静置30分钟。此后，向产物中加入参考例2中制备的(R)-3-羟基辛酰CoA，使辅酶的最终浓度为5m M。在37℃下温育30分钟进行合成反应。

对该反应系统进行离心分离(10,000×g，4℃，10分钟)，以得到一种微囊化颜料的含水滤饼，其芯部为炭黑。使该含水滤饼重新悬浮在水中，然后用另一离心操作回收微囊化颜料(1)。为进行清洗，将该操作重复3次。

对一部分制备好的含水滤饼微囊化颜料进行真空干燥，并将所得产物悬浮在20毫升氯仿中，然后在60℃下搅拌该悬浮液20小时，以萃取包含在外壳中的PHA。用孔径为0.45微米的膜过滤器过滤该萃取物，用旋转蒸发器进行真空浓缩，然后依据常规方法进行甲醇解作用。用气相色谱-质谱分析装置(GC-MS，SShimadzu QP-5050，EI方法)对所得产品进行分析，以确定PHA单体单元的甲基酯化化合物。结果确定了该PHA是具有3-羟基辛酸的PHA单体单元。此外，用凝胶渗透色谱(GPC：Toso HLC-8020，柱子；PolymerLaboratory PL gel MIXED-C(5微米），溶剂；氯仿，柱温：40℃，聚苯乙烯校正)对该PHA进行分子量评价，得出Mn＝18,000和Mw＝37,000。

用上述微囊化颜料(1)制备水性黑色油墨。该黑色油墨的组成在以下示出。各组分的量是用重量份表示的。使用一种分散搅拌器(TK Homodyspa 20型Tokushu Kika Kogyo Co.，Ltd.)，分散时间为3小时。

微囊化颜料                                      50份

甘油                                            6份

二乙二醇                                        7份

聚氧乙烯十二烷基醚                              0.2份

Proxel XL-2：防腐剂(ZENECA Corp.)               0.3份

苯并三唑：抗腐蚀剂(Kanto Kagaku Co.，Ltd)       0.005份

水                                              平衡份

<比较例10>

除了用YN2-C1代替PHA合酶aa40-YN2-C1(pht)，用实施例26的相同方法得到微囊化颜料(2)。此后，用实施例26的方法使用该颗粒得到水性颜料油墨(2)。

<比较例11>

除了用100U当量的YN2-C1代替40U当量的PHA合酶aa39-YN2-C1(cb)，用实施例26的相同方法得到微囊化颜料(3)。此后，用实施例26的方法使用该颜料得到水性颜料油墨(3)。

<比较例12>

除了用粉碎成细粒的炭黑代替微囊化颜料外，用实施例26的相同方法得到水性颜料油墨(4)。

<评价4>

按照上文所述的方法评价水性颜料油墨(1)，(2)，(3)和(4)的分散稳定性和平均粒径。分散稳定性以相分离程度作为量度，用半透明的上层的高度与分散液体的整个高度的比值来表示，其中半透明的上层是在70℃存储3天之后沉淀的颜料组分产生的，平均粒径被定义为用激光多普勒粒径分布分析装置(UPA-150型，Lease & Nothropp)测量定义为中位直径的平均粒径。将结果示于表27中。

表27

	水性颜料油墨	平均粒径(nm)		相分离
					制备之后立即测量	70℃3天之后
		实施例26	1				181	192	0
比较例10	2			163	752	11
		比较例11	3				183	194	0
比较例12	4			151	2358	28

微囊化之前和之后的颜料尺寸显示了对比例10中颜料的微囊化不足以与对比例11的相比。这似乎是因为向对比例10中加入的酶的量比对比例11中的情况要小。另一方面，在实施例26中加入的酶的量与对比例10中的相同，但是其微囊化几乎与对比例11中的相当，

在实施例26和对比例11中可充分地进行微囊化，且其中水性颜料油墨的分散稳定性均优秀。

因此，实施例26可用少量酶对颜料进行微囊化，这表示当将该颜料制成水性颜料油墨时其可有效地改进分散稳定性。

以下将对作为喷墨打印机油墨的油墨进行评价。

用喷射频率为7.2k Hz，记录头分辨率为360dpi的喷墨打印机以及上述水性颜料油墨(1)，(2)，(3)和(4)在主扫描方向以720dpi的间距进行打印。从记录头释放出的每滴油墨的量为约微微升，通过将墨滴喷射在由360dpi×720dpi的分辨率形成的一图象元素进行记录。然后，通过打印实心阴影图像，字母图案等评价图象的OD，点的周边形状，实心阴影均匀性，刺穿性能，平滑性和图象的圆度。此外，使用Canon Inc.制造的PB纸张作为打印介质。在这种情况下。

OD是指测量5mm×5mm的实心阴影图像部分得到的值

点的周边形状是通过用一种扩增镜目测线形图像边缘部分尖锐度来检查的

A：线条边缘是以直线形式清晰地相连

B：线条边缘的线性稍有丢失，但是实用起来不存在问题

D：线条边缘的线性丢失。

实心阴影均匀性是通过目测观察5mm×5mm的实心阴影图案浓度的均匀性来检测的

A：未观察到白点部分

B：观察到白点部分，但是不明显，且实用起来不存在问题

D：白点部分明显，且影响图象的质量。

刺穿性能是通过观察打印了实心阴影图案部分的图案是否能从纸张的背面看见来检查的。而且用Macbeth反射仪测量该背面相应部分的光学浓度。

A：几乎不能看透，用Macbeth反射仪测量的光学浓度小于0.2

B：可微微看透，但不明显，用Macbeth反射仪测量的光学浓度为0.2或更大，但是小于0.25。

圆度是用扩增镜观察由一滴油墨在打印介质上形成的墨滴的形状来确定的。

A：从统计的观点来看几乎所有的点都接近于圆，

B：从统计的观点来看点不圆，但不会给成像带来问题

C：从统计的观点来看相当多的点不圆，并形成变形的点

结果示于以下的表28。

表28

	水性颜料油墨	OD	点的尺寸(微米)	圆点的形状	实心阴影均匀性	刺穿性	圆度
								实施例26	1	1.46	69	A	A	A	A
比较例10	2	1.32	51	B	B	B	B
								比较例11	3	1.48	70	A	A	A	A
比较例12	4	1.08	45	D	D	B	C

对于实施例24和比较例5中制备的可对颜料充分进行微囊化的油墨，当在喷墨打印机中使用这两种油墨时，在记录培养基(纸)上凝聚的颜料变成细小的粒状，在油墨滴中均匀分散，并具有合适展度的点尺寸，而且，点内部图象密度分布也是均匀的，油墨点在周边和外围的形状也是优秀的，几乎没有洇纸现象或类似情况。

因此表26显示用少量的酶可以有效地制备具有优秀性能的水性颜料油墨。

(实施例27)能键合到氧化钛上的氨基酸序列的获取

(1)将氧化钛(Wako Pure Chemical Industries Co.，Ltd.，氧化钛(IV)，金红石类型)悬浮在含0.1％的Tween-20的TBS缓冲液(50mM Tris-盐酸pH7.5150mM NaCl)中，以得到5mg/ml的浓度。将该悬浮液(10微升)加到Eppeldorf试管中，并加入990微升的TBST(TBS缓冲液+0.1％Tween-20)缓冲液进行稀释。

(2)将4×10¹⁰pfu当量的ph.D.-12噬菌体显示肽文库(New EnglandBiolabs nc.)加到该试管中，并将其在25℃下静置10分钟。

(3)通过对该试管进行离心(20,630×g，5分钟)分离后，除去上清液，收集作为沉淀的颜料。再一次使颜料悬浮在TBST缓冲液中，重复离心操作，用TBST缓冲液冲洗该颜料10次。

(4)加入100微升洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)1mg/ml BSA)之后，静置该溶液1分钟，进行离心分离(20,630×g，5分钟)，然后将上清液移至另一Eppendorf试管中。向该溶液加入15微升的1M的Tris-盐酸(pH 9.1)。中和该溶液以得到一种洗脱了的噬菌体。

(5)用该洗脱了的噬菌体感染以对数生长早期的大肠杆菌ER2537(NewEngland Biolabs)，该噬菌体被扩增。在37℃下培养4.5小时。此后，通过离心分离从细胞中分离出该噬菌体，在聚乙二醇中沉降来纯化。使该纯化和扩增的噬菌体悬浮在TBS缓冲液中，通过用合适的稀释系列感染大肠杆菌来测定效价(滴度)。

(6)使用该扩增的噬菌体将上述步骤(1)到(5)再重复4次。但是注意将TBST缓冲液中使用的Tween-20的浓度升高至0.5％，冲洗条件被分隔开。从第二次之后，对Eppendorf试管实施相同的操作作为对照。各循环中洗脱噬菌体的效价(滴度)显示在表29中。

表29

各循环中洗脱噬菌体的效价

	原溶液(A)	对照键合(B)	氧化钛键合(C)	C/A	C/B
						第一次	4.0×1011		8.9×106	2.2×10-5
第二次	1.6×1011	1.1×105	3.8×106	2.4×10-5	35
						第三次	2.0×1011	1.6×105	6.0×106	3.0×10-5	40
第四次	1.7×1011	1.1×106	1.5×108	8.8×10-4	140
						第五次	1.9×1011	2.0×106	2.7×109	1.4×10-2	1400

(A，B，C的单位用pfu/ml表示)

通过用最终洗脱的噬菌体使大过量的大肠杆菌感染来进行克隆。用各克隆(clone)感染大肠杆菌和扩增克隆之后，制备ssDNA。通过对无序区域的碱基序列进行解码，得到能键合到氧化钛上的氨基酸序列。表30中示出了所得到的氨基酸序列和频率。

表30

确定的氨基酸序列和频率

确定的氨基酸序列	数目(A)	频率(A/29)
			His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His(SEQ ID NO：150)	13	0.45
Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(SEQ ID NO：151)	7	0.24
			Leu-Ser-Thr-His-Tyr-Val-Asn-Arg-Ser-His-Ile-Thr(SEQ ID NO：152)	4	0.14
Ala-Tyr-His-Ile-Asn-Gln-Leu-Gly-Ala-Pro-Pro-Ala(SEQ ID NO：153)	1	0.03
			Leu-His-Leu-Thr-Pro-His-Pro-Gly-Asp-Thr-Leu-Thr(SEQ ID NO：154)	1	0.03
Gln-Asp-Val-His-Leu-Thr-Gln-Gln-Ser-Arg-Tyr-Thr(SEQ ID NO：155)	1	0.03
			Leu-Glu-Ile-Pro-Ser-Asn-Gly-Leu-Asn-His-Lys-Ile(SEQ ID NO：156)	1	0.03
Leu-Glu-Ile-Pro-Ser-Asn-Gly-Leu-Asn-His-Asn-Ile(SEQ ID NO：157)	1	0.03

(实施例28)

按照如下方法制备能键合到氧化钛上的PHA合酶。按照如下方法构建通过间隔序列GS将PHA合酶的N端与各氨基酸序列(从SEQ ID No：150到SEQ IDNo：157)融合在一起来表达的大肠杆菌表达载体。表31给出了一系列合成寡核苷酸将其排列为双链DNA，以制备对这些氨基酸序列进行解码的DNA。

表31

用于表达各氨基酸序列的合成DNA系列

SEQ ID NO：氨基酸序列	SEQ ID NO：合成DNA的碱基序列
		SEQ ID NO：150HATGTHGLSLSH	SEQ ID NO：1585′-GATCCCATGCGACCGGCACCCATGGCCTGAGCCTGAGCCATGAGCT  -3′SEQ ID NO：1595′-CATGGCTCAGGCTCAGGCCATGGGTGCCGGTCGCATGG-3′
SEQ ID NO：151TLPSPLALLTVH	SEQ ID NO：1605′-GATCCACCCTGCCGAGCCCGCTGGCGCTGCTGACCGTGCATGAGCT  -3′SEQ ID NO：1615′-CATGCACGGTCAGCAGCGCCAGCGGGCTCGGCAGGGTG-3′
		SEQ ID NO：152LSTHYVNRSHIT	SEQ ID NO：1625′-GATCCCTGAGCACCCATTATGTGAACCGTAGCCATATTACCGAGCT  -3′SEQ ID NO：1635′-CGGTAATATGGCTACGGTTCACATAATGGGTGCTCAGG-3′
SEQ ID NO：153AYHINQLGAPPA	SEQ ID NO：1645′-GATCCGCGTATCATATTAACCAGCTGGGCGCGCCGCCGGCGGAGCT  -3′SEQ ID NO：1655′-CCGCCGGCGGCGCGCCCAGCTGGTTAATATGATACGCG-3′
		SEQ ID NO：154LHLTPHPGDTLT	SEQ ID NO：1665′-GATCCCTGCATCTGACCCCGCATCCGGGCGATACCCTGACCGAGCT  -3′SEQ ID NO：1675′-CGGTCAGGGTATCGCCCGGATGCGGGGTCAGATGCAGG-3′
SEQ ID NO：155QDVHLTQQSRYT	SEQ ID NO：1685′-GATCCCAGGATGTGCATCTGACCCAGCAGAGCCGTTATACCGAGCT  -3′SEQ ID NO：1695′-CGGTATAACGGCTCTGCTGGGTCAGATGCACATCCTGG-3′
		SEQ ID NO：156LEIPSNGLNHKI	SEQ ID NO：1705′-GATCCCTGGAAATTCCGAGCAACGGCCTGAACCATAAAATTGAGCT  -3′SEQ ID NO：1715′-CAATTTTATGGTTCAGGCCGTTGCTCGGAATTTCCAGG-3′
SEQ ID NO：157LEIPSNGLNHNI	SEQ ID NO：1725′-GATCCCTGGAAATTCCGAGCAACGGCCTGAACCATAACATTGAGCT-3′SEQ ID NO：1735 ′-CAATGTTATGGTTCAGGCCGTTGCTCGGAATTTCCAGG-3′

依照制造者的说明，用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)将各氨基酸序列的两种合成DNA磷酸化。随后，将等摩尔量的两种合成DNA混合，并在95℃下加热5分钟，然后慢慢冷却至室温形成双链DNA片段。将所形成的双链DNA片段直接用于此后的克隆步骤。

用BamHI和SacI消化质粒pGEX-C1，并插入上述双链DNA片段。用这些载体转化大肠杆菌(JM109)，以获得一种用于表达的菌株。用Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems，由PROMEGA制造)制得的质粒DNA作为模板，用pEGX5’测序引物(Amasham Pharmasia Biotech Corp.)测序，确定插入的碱基序列，来确认该菌株。将所得菌株在10毫升LB-Amp培养基中预培养至过夜，此后将0.1毫升含菌株的所得产物加入到10ml LB-Amp培养基中，然后在170rpm，37℃下摇动培养3小时。此后，加入IPTG(最终浓度为1mM)，在37℃下连续培养4到12小时。

收集IPTG诱导的大肠杆菌(8000×g，2分钟，4℃)，在4℃下，在1/10量的PBS中使其重新悬浮。通过冷冻，解冻和超声波处理破坏该菌株，并对其进行离心分离(8000×g，10分钟，4℃)，以除去细胞碎屑。用SDS-PAGE确定在上清液中存在目标表达蛋白质，此后用谷胱甘肽Sepharose 4B珠(AmashamPharmasia.Biotech Corp.)纯化该引入和表达了的GTS融合蛋白质。

事先对所用的谷胱甘肽Sepharose进行控制非特异性吸附的处理。即，用相同量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose三次(8000×g，1分钟，4℃)，此后加入含4％BSA的相同量的PBS，以在4℃下处理谷胱甘肽Sepharose 1小时。处理后，用相同量的PBS冲洗谷胱甘肽Sepharose两次，然后在1/2量的PBS中再悬浮。将40微升预处理了的谷胱甘肽Sepharose加入到1毫升无细胞的萃取液中，在4℃下温和地搅拌。因此，融合蛋白质GST-aa150-YN2-C1到GST-aa157-YN2-C1被吸附到谷胱甘肽Sepharose上。[在融合蛋白质GST-aa##-YN2-C1中，aa##是指融合在PHA合酶和GST之间的含SEQ ID NO：##的氨基酸序列的多肽被表达。]

在吸附之后，通过离心(8000×g，1分钟，4℃)分离方法收集谷胱甘肽Sepharose，并用400微升PBS冲洗所得材料3次。此后，加入40微升的10mM还原谷胱甘肽，在4℃下搅拌该溶液1小时，以洗脱吸附的融合蛋白质。离心(8000×g，2分钟，4℃)分离之后收集上清液，且此后针对PBS进行渗析，以纯化GTS融合蛋白质。由SDS-PAGE证实了该蛋白质得到一单条带。

用PreScission蛋白酶(Amasham Pharmacia.Biotech，5U)消化各GTS融合蛋白质(500微克)，此后通过谷胱甘肽Sepharose以除去蛋白酶和GST。流通片段进一步用与PBS平衡的交联葡聚酸凝胶G200柱子进行处理，以获得最终纯化的各aa150-YN2-C1(ti)到aa157-YN2-C1(ti)表达蛋白质。[在表达蛋白质aa##-YN2-C1(ti)中，aa##是指由SEQ ID NO：##氨基酸序列组成的多肽与PHA合酶的N端融合而被表达。]

用前面所述的方法测量各纯化了的酶的活性。此外，用Micro BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Chemical Corp.)测量试样中蛋白质的浓度。酶的浓度为1.9U/mL，相对活性为4.0U/mg蛋白质。用生物体溶液试样浓缩试剂(Mizubutorikun Kun AB-1100，由Ato Co.，Ltd.制造)对纯化的酶进行浓缩，以获得10U/ml的纯化的酶溶液。

(实施例29)对与氧化钛键合能力的评价

使氧化钛悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，使其为0.5％(w/v)。取出10毫升这种悬浮液的试样，加入到由聚四氟乙烯制成的离心管中，将相当于实施例28中制备的0.5U量的PHA合成酶aa150-YN2-C1(ti)到aa157-YN2-C1(ti)和参考例1中制备的0.5U当量的YN2-C1加入到该悬浮液中，并在室温下振荡该溶液30分钟。通过离心操作(10,000×g，4℃，10分钟)，收集作为沉淀的氧化钛颗粒，该颗粒与含未与氧化钛键联的酶的上清液中分离开。再一次使氧化钛悬浮在含0.1％Tween-20的TBS缓冲液中，重复离心操作，由此冲洗氧化肽。测量洗净后氧化钛悬浮液的酶活性。结果在表32中列出。

表32

对酶与氧化钛铜酞菁键联亲和力的评价

酶	融合氨基酸序列	酶活性U
			aa150-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：150HATGTHGLSLSH	0.06
aa151-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：151TLPSPLALLTVH	0.06
			aa152-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：152LSTHYVNRSHIT	0.05
aa153-YN2-Cl(ti)	SEQ ID NO：153AYHINQLGAPPA	0.05
			aa154-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：154LHLTPHPGDTLT	0.05
aa155-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：155QDVHLTQQSRYT	0.05
			aa156-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：156LEIPSNGLNHKI	0.05
aa157-YN2-C1(ti)	SEQ ID NO：157LEIPSNGLNHM	0.05
			YN2-C1	-	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C1相比，与氧化钛亲和序列融合的酶aa150-YN2-C1(ti)到aa157-YN2-C1(ti)具有更高的酶活性，因此能够有效地将其固定在基材的表面上。

(实施例30)

将两种能与氧化钛键合的氨基酸序列His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His(SEQ ID NO：150)和Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(SEQ ID NO：151)按照指定顺序通过间隔序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：181)串联连接，以得到His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(SEQ ID NO：174)，并按照以下方式进一步用间隔序列GS将其融合到PHA合酶的N端，以制备大肠杆菌表达载体。对该氨基酸序列进行解码的DNA形成双链DNA片段，其方式是分别用T4聚核苷酸激酶(由Gibco制造)对Seq.1：5’-GATCCCATGCGACCGGCACCCATGGCCTGAGCCTGAGCCATGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCACCCTGCCGAGCCCGCTGGCGCTGCTGACCGTGCATGAGCT-3’(SEQ ID NO：175)和Seq.2：5’-CATGCACGGTCAGCAGCGCCAGCGGGCTCGGCAGGGTGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCATGGCTCAGGCTCAGGCCATGGGTGCCGGTCGCATGG-3’(SEQ ID NO：176)进行磷酸化之后，混合等摩尔量的两种物质，在95℃下加热5分钟，然后慢慢冷却至室温。如实施例28的方式，将这样形成的双链DNA片段插入到质粒pGEX-C1的BamHI/SacI部位，用这种载体转化大肠杆菌(JM109)，以得到表达用菌株。如实施例28的方式，氨基酸序列SEQID No：174融合在其N端的表达蛋白质aa174-YN2-C1(ti)被纯化，以给出10U/ml的纯化了的酶溶液。如实施例29，评价纯化了的酶键联到氧化钛上的能力。结果列在表33中。

表33

对酶与氧化钛键联亲和力的评价

酶	融合氨基酸序列	酶活性U
			aa174-YN2-C1(ti)	SEQ ID No：174HATGTHGLSLSHGGGSGGGSTLPSPLALLTVH	0.15
YN2-C1	-	0.01

已经证明了与对照的酶YN2-C1相比，与氧化钛亲和序列融合的酶aa174-YN2-C1(ti)具有更高的酶活性，能够更有效地固定在基材的表面上。

依据本发明制备含聚羟基链烷酸酯结构体的方法，通过选择能与各种基材键合的氨基酸序列，可有效地将含有能键合到基材的氨基酸序列的聚羟基链烷酸酯合成酶固定在基材上。而且，通过在该基材表面加入3-羟基酰基辅酶A使其成为酶的底物，可在表面有效地涂布一种所需的含聚羟基链烷酸酯结构体。因为其表面涂布由各种性能的聚羟基链烷酸酯，本发明含聚羟基链烷酸酯的结构体作为功能性结构体可获得广泛的应用。

                              序列表<110>佳能株式会社<120>含聚羟基链烷酸酯的结构体及其生产方法<130>CF016534<150>JP P2001-210052<151>2001-07-10<150>JP P2002-172978<151>2002-06-13<160>186<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>559<212>PRT<213>Pseudomonas cichorii YN2；FERM BP-7375<400>1Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn1               5                   10                  15Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu

        20                  25                  30Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His

    35                  40                  45Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu

50                  55                  60Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala65                  70                  75                  80Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr

            85                  90                  95Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn

        100                 105                 110Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met

    115                 120                 125Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val

130                 135                 140Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser145                 150                 155                 160His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val

            165                 170                 175Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly

        180                 185                 190Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro

    195                 200                 205Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln

210                 215                 220Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala225                 230                 235                 240Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg

            245                 250                 255Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu

        260                 265                 270Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys

    275                 280                 285Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala

290                 295                 300Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu305                 310                 315                 320Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala

            325                 330                 335Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr

        340                 345                 350Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp

    355                 360                 365Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu

370                 375                 380Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp385                 390                 395                 400Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe

            405                 410                 415Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr

        420                 425                 430Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly

    435                 440                 445Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln

450                 455                 460Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile465                 470                 475                 480Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr

            485                 490                 495Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr

        500                 505                 510Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln

    515                 520                 525Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala

530                 535                 540Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg545                 550                 555<210>2<211>1680<212>DNA<213>Pseudomonas cichorii YN2；FERM BP-7375<400>2atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt     60aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg    120caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc    180aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc    240gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg    300cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt    360gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gccatggcgc cgaccaacac cgcggccaac    420ccggcggcag tcaaacgctt tttcgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg    480cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca    540ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg    600ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg    660gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg    720cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag    780gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgatgtc    840gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gcgcctgctc cggcggcatc    900acttgcaccg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg    960accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg atgttgccct gttcgtcaat   1020gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc   1080gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc   1140aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac   1200accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca   1260ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg   1320gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac   1380aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc   1440cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg   1500gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc ataccgattc ctggtggctg   1560cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg   1620ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacggtaa   1680<210>3<211>560<212>PRT<213>Pseudomonas cichorii YN2；FERM BP-7375<400>3Met Arg Asp Lys Pro Ala Arg Glu Ser Leu Pro Thr Pro Ala Lys Phe1                5                  10                  15Ile Asn Ala Gln Ser Ala Ile Thr Gly Leu Arg Gly Arg Asp Leu Val

        20                  25                  30Ser Thr Leu Arg Ser Val Ala Ala His Gly Leu Arg His Pro Val His

    35                  40                  45Thr Ala Arg His Ala Leu Lys Leu Gly Gly Gln Leu Gly Arg Val Leu

50                  55                  60Leu Gly Asp Thr Leu His Pro Thr Asn Pro Gln Asp Arg Arg Phe Asp65                  70                  75                  80Asp Pro Ala Trp Ser Leu Asn Pro Phe Tyr Arg Arg Ser Leu Gln Ala

            85                  90                  95Tyr Leu Ser Trp Gln Lys Gln Val Lys Ser Trp Ile Asp Glu Ser Asn

        100                 105                 110Met Ser Pro Asp Asp Arg Ala Arg Ala His Phe Ala Phe Ala Leu Leu

    115                 120                 125Asn Asp Ala Val Ser Pro Ser Asn Ser Leu Leu Asn Pro Leu Ala Ile

130                 135                 140Lys Glu Ile Phe Asn Ser Gly Gly Asn Ser Leu Val Arg Gly Ile Gly145                150                  155                 160His Leu Val Asp Asp Leu Leu His Asn Asp Gly Leu Pro Arg Gln Val

            165                 170                 175Thr Arg His Ala Phe Glu Val Gly Lys Thr Val Ala Thr Thr Thr Gly

        180                 185                 190Ala Val Val Phe Arg Asn Glu Leu Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro

    195                 200                 205Met Ser Glu Lys Gln Tyr Ser Lys Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln

210                 215                 220Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Phe Asp Leu Ser Pro His Asn Ser Phe Val225                 230                 235                 240Gln Phe Ala Leu Lys Asn Gly Leu Gln Thr Phe Val Ile Ser Trp Arg

            245                 250                 255Asn Pro Asp Val Arg His Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Val Glu

        260                 265                 270Ala Val Glu Glu Ala Met Asn Val Cys Arg Ala Ile Thr Gly Ala Arg

    275                 280                 285Glu Val Asn Leu Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala

290                 295                 300Leu Gln Gly His Leu Gln Ala Lys Arg Gln Leu Arg Arg Val Ser Ser305                 310                 315                 320Ala Thr Tyr Leu Val Ser Leu Leu Asp Ser Gln Leu Asp Ser Pro Ala

            325                 330                 335Thr Leu Phe Ala Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg Arg Ser

        340                 345                 350Tyr Gln Lys Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala

    355                 360                 365Trp Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Ser Tyr Phe Val Asn Asn Tyr

370                 375                 380Leu Met Gly Lys Glu Pro Pro Ala Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn Asn385                 390                 395                 400Asp Asn Thr Arg Leu Pro Ala Ala Leu His Gly Asp Leu Leu Asp Phe

            405                 410                 415Phe Lys His Asn Pro Leu Ser His Pro Gly Gly Leu Glu Val Cys Gly

        420                 425                 430Thr Pro Ile Asp Leu Gln Lys Val Thr Val Asp Ser Phe Ser Val Ala

    435                 440                 445Gly Ile Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Asp Ala Val Tyr Arg Ser Thr

450                 455                 460Leu Leu Leu Gly Gly Glu Arg Arg Phe Val Leu Ala Asn Ser Gly His465                 470                 475                 480Val Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Asn Asn Pro Lys Ala Asn Tyr Leu

            485                 490                 495Glu Gly Ala Lys Leu Ser Ser Asp Pro Arg Ala Trp Tyr Tyr Asp Ala

        500                 505                 510Lys Pro Val Asp Gly Ser Trp Trp Thr Gln Trp Leu Gly Trp Ile Gln

    515                 520                 525Glu Arg Ser Gly Ala Gln Lys Glu Thr His Met Ala Leu Gly Asn Gln

530                 535                 540Asn Tyr Pro Pro Met Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val Arg Val Arg545                 550                 555                560<210>4<211>1683<212>DNA<213>Pseudomonas cichorii YN2 ； FERM BP-7375<400>4atgcgcgata aacctgcgag ggagtcacta cccacccccg ccaagttcat caacgcacaa     60agtgcgatta ccggcctgcg tggccgggat ctggtttcga ctttgcgcag tgtcgccgcc    120catggcctgc gccaccccgt gcacaccgcg cgacacgcct tgaaactggg tggtcaactg    180ggacgcgtgt tgctgggcga caccetgcat cccaccaacc cgcaagaccg tcgcttcgac    240gatccggcgt ggagtctcaa tcccttttat cgtcgcagcc tgcaggcgta cctgagctgg    300cagaagcagg tcaagagctg gatcgacgaa agcaacatga gcccggatga ccgcgcccgt    360gcgcacttcg cgttcgccct gctcaacgat gccgtgtcgc cgtccaacag cctgctcaat    420ccgctggcga tcaaggaaat cttcaactcc ggcggcaaca gcctggtgcg cgggatcggc    480catctggtcg atgacctctt gcacaacgat ggcttgcccc ggcaagtcac caggcatgca    540ttcgaggttg gcaagaccgt cgccaccacc accggcgccg tggtgtttcg caacgagctg    600ctggagctga tccaatacaa gccgatgagc gaaaagcagt attccaaacc gctgctggtg    660gtgccgccac agatcaacaa gtactacatt tttgacctca gcccccataa cagcttcgtc    720cagttcgcgc tcaagaacgg cctgcaaacc ttcgtcatca gctggcgcaa tccggatgta    780cgtcaccgcg aatggggcct gtcgacctac gtcgaagcgg tggaagaagc catgaatgtc    840tgccgggcaa tcaccggcgc gcgcgaggtc aacctgatgg gcgcctgcgc tggcgggctg    900accattgctg ccctgcaggg ccacttgcaa gccaagcgac agctgcgccg cgtctccagc    960gcgacgtacc tggtgagcct gctcgacagc caactggaca gcccggccac actcttcgcc   1020gacgaacaga ccctggaggc ggccaagcgc cgctcctacc agaaaggtgt gctggaaggc   1080cgcgacatgg ccaaggtttt cgcctggatg cgccccaacg atttgatctg gagctacttc   1140gtcaacaatt acctgatggg caaggagccg ccggcgttcg acattctcta ctggaacaat   1200gacaacacac gcctgccggc cgccctgcat ggtgacttgc tggacttctt caagcacaac   1260ccgctgagcc atccgggtgg cctggaagtg tgcggcaccc cgatcgactt gcaaaaggtc   1320accgtcgaca gtttcagcgt ggccggcatc aacgatcaca tcacgccgtg ggacgcggtg   1380tatcgctcaa ccctgttgct cggtggcgag cgtcgctttg tcctggccaa cagcggtcat   1440gtgcagagca ttctcaaccc gccgaacaat ccgaaagcca actacctcga aggtgcaaaa   1500ctaagcagcg accccagggc ctggtactac gacgccaagc ccgtcgacgg tagctggtgg   1560acgcaatggc tgggctggat tcaggagcgc tcgggcgcgc aaaaagaaac ccacatggcc   1620ctcggcaatc agaattatcc accgatggag gcggcgcccg ggacttacgt gcgcgtgcgc   1680tga                                                                 1683<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>5tgctggaact gatccagtac                                                 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>6gggttgagga tgctctggat gtg                                             23<210>7<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>7ggaccaagct tctcgtctca gggcaatgg                                       29<210>8<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>8cgagcaagct tgctcctaca ggtgaaggc                                       29<210>9<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>9gtattaagct tgaagacgaa ggagtgttg                                       29<210>10<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>10catccaagct tcttatgatc gggtcatgcc                                      30<210>11<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>11agtggatcct ccgagctcag taacaagagt aacgatgagt tgaag                     45<210>12<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>12atactcgaga ctactagtcc gttcgtgcac gtacgtgcct ggcgc                     45<210>13<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>13agtggatcct ccgagctccg cgataaacct gcgagggagt cacta                     45<210>14<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>14atactcgaga ctactagtgc gcacgcgcac gtaagtcccg ggcgc                     45<210>15<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>15Val Phe His Lys Leu Val Trp1               5<210>16<211>43<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>16gatccgtgtt ccacaaatta gtgtggggtg gaggttcgga gct                       43<210>17<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>17ccgaacctcc accccacact aatttgtgga acacg                                35<210>18<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>18Trp Phe Trp Ile Leu Val Asn1           5<210>19<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>19ctagttggtt ctggatttta gtgaacggtg gaggttcgc                            39<210>20<211>39<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>20tcgagcgaac ctccaccgtt cactaaaatc cagaaccaa                            39<210>21<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>SiO2结合多肽<400>21Asp Ser His Phe Thr Ile Asn1               5<210>22<211>43<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>22gatccgattc acattttact attaatggtg gaggttcgga gct                       43<210>23<211>35<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>23ccgaacctcc accattaata gtaaaatgtg aatcg                                35<210>24<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>24Lys Tyr Asp Ser Arg His Leu His Thr His Ser His1               5                   10<210>25<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>25Pro Asn Arg Leu Gly Arg Arg Pro Val Arg Trp Glu1               5                   10<210>26<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>26Lys Cys Cys Tyr Tyr Asp His Ser His Ala Leu Ser1               5                   10<210>27<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>27Glu Tyr Leu Ser Ala Ile Val Ala Gly Pro Trp Pro1               5                   10<210>28<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>28Lys Leu Trp Ile Leu Glu Pro Thr Val Thr Pro Thr1               5                   10<210>29<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>29Gln Ser Asn Leu Lys Val Ile Pro Ser Trp Trp Phe1               5                   10<210>30<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>30Trp Ile Pro Pro Gln Trp Ser Arg Leu Ile Glu Pro1               5                   10<210>31<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>31Asp His Pro Gln Ala Lys Pro Asn Trp Tyr Gly Val1               5                   10<210>32<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>32Gly Leu Pro Pro Tyr Ser Pro His Arg Leu Ala Gln1               5                   10<210>33<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>33Lys Leu Thr Thr Gln Tyr Met Ala Arg Ser Ser Ser1               5                   10<210>34<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>34Lys Val Trp Met Leu Pro Pro Leu Pro Gln Ala Thr1               5                   10<210>35<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>35Asn Val Thr Ser Thr Ala Phe Ile Asp Thr Pro Trp1               5                   10<210>36<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>36Arg Leu Asn Leu Asp Ile Ile Ala Val Thr Ser Val1               5                   10<210>37<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>37Thr Leu Pro Ser Pro Leu Ala Leu Leu Thr Val His1               5                   10<210>38<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>38Thr Asn Arg His Asn Pro His His Leu His His Val1               5                   10<210>39<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>39Trp Pro His Ala Trp Lys Val Trp Trp Pro Ala Ser1               5                   10<210>40<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>40Asn Trp Trp Trp Pro Pro Tyr Ile Arg His Gln Pro1               5                   10<210>41<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>41Trp His Trp Ser Trp Thr Pro Trp Pro Ser His His1               5                   10<210>42<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>42Trp Pro Trp Ala Trp His Pro Ser Arg Asp Val Tyr1               5                   10<210>43<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>43Trp His Gly Tyr Trp Tyr Ser Asn Leu Asn Thr Thr1               5                   10<210>44<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>44Trp Trp Thr Pro Trp Met Ser His Ala Tyr Pro Val1               5                   10<210>45<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>45Trp Pro Asn Pro Tyr Trp Gly Trp Phe Ala Ala Val1               5                   10<210>46<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>46Thr Ser Trp His Thr Trp Trp Trp Arg Gln Pro Pro1               5                   10<210>47<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>47Asn Ala Trp His Lys Tyr Trp Trp Pro Ile Thr Lys1               5                   10<210>48<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>48His Pro Asn Asn Asp Trp Ser Lys Ala Pro Gln Phe1               5                   10<210>49<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>49Trp Trp Thr Pro Gln Pro Trp Trp Ser Phe Pro Ile1               5                   10<210>50<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>50Trp Pro His Thr Ser Trp Trp Gln Thr Pro Leu Thr1               5                   10<210>51<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>51Trp His Val Asn Trp Asp Pro Met Ala Trp Tyr Arg1               5                   10<210>52<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>52Ser Trp Pro Trp Trp Thr Ala Tyr Arg Val His Ser1               5                   10<210>53<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>53Trp His Ser Asn Trp Tyr Gln Ser Ile Pro Gln Val1               5                   10<210>54<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>54Gly Tyr Trp Pro Trp Lys Phe Glu His Ala Thr Val1               5                   10<210>55<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>55Ala Trp Trp Pro Thr Thr Phe Pro Pro Tyr Tyr Tyr1               5                   10<210>56<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>56Asn Pro Trp Trp Ser His Tyr Tyr Pro Arg Ser Val1               5                   10<210>57<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>57Trp Pro His Asn Tyr Pro Leu Asn His Ser Asn Pro1               5                   10<210>58<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>58Thr Trp Ala His Pro Leu Glu Ser Asp Tyr Leu Arg1               5                   10<210>59<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>59His Thr Tyr Tyr His Asp Gly Trp Arg Leu Ala Pro1               5                   10<210>60<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>60Thr Phe Val Gln Thr Pro Leu Ser His Leu Ile Ala1               5                   10<210>61<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>61Arg Val Pro Pro Ser Lys Leu Thr Arg Pro Pro Phe1               5                   10<210>62<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>62His Ser Ile Tyr Ser Val Thr Pro Ser Thr Ala Ser1               5                   10<210>63<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>63Leu Asn Thr Gln Asn His Ala Pro Leu Pro Ser Ile1               5                   10<210>64<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>64gatccaaata tgatagccgt catctgcata cccatagcca tgagct                    46<210>65<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>65catggctatg ggtatgcaga tgacggctat catatttg                             38<210>66<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>66gatccccgaa ccgtctgggc cgtcgtccgg tgcgttggga agagct                    46<210>67<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>67cttcccaacg caccggacga cggcccagac ggttcggg                             38<210>68<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>68gatccaaatg ctgctattat gatcatagcc atgcgctgag cgagct                    46<210>69<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>69cgctcagcgc atggctatga tcataatagc agcatttg                             38<210>70<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>70gatccgaata tctgagcgcg attgtggcgg gcccgtggcc ggagct                    46<210>71<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>71ccggccacgg gcccgccaca atcgcgctca gatattcg                             38<210>72<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>72gatccaaact gtggattctg gaaccgaccg tgaccccgac cgagct                    46<210>73<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>73cggtcggggt cacggtcggt tccagaatcc acagtttg                             38<210>74<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>74gatcccagag caacctgaaa gtgattccga gctggtggtt tgagct                    46<210>75<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>75caaaccacca gctcggaatc actttcaggt tgctctgg                             38<210>76<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>76gatcctggat tccgccgcag tggagccgtc tgattgaacc ggagct                    46<210>77<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>77ccggttcaat cagacggctc cactgcggcg gaatccag                             38<210>78<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>78gatccgatca tccgcaggcg aaaccgaact ggtatggcgt ggagct                    46<210>79<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>79ccacgccata ccagttcggt ttcgcctgcg gatgatcg                             38<210>80<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>80gatccggcct gccgccgtat agcccgcatc gtctggcgca ggagct                    46<210>81<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>81cctgcgccag acgatgcggg ctatacggcg gcaggccg                             38<210>82<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>82gatccaaact gaccacccag tatatggcgc gtagcagcag cgagct                    46<210>83<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>83cgctgctgct acgcgccata tactgggtgg tcagtttg                             38<210>84<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>84gatccaaagt gtggatgctg ccgccgctgc cgcaggcgac cgagct                    46<210>85<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>85cggtcgcctg cggcagcggc ggcagcatcc acactttg                             38<210>86<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>86gatccaacgt gaccagcacc gcgtttattg ataccccgtg ggagct                    46<210>87<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>87cccacggggt atcaataaac gcggtgctgg tcacgttg                             38<210>88<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>88gatcccgtct gaacctggat attattgcgg tgaccagcgt ggagct                    46<210>89<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>89ccacgctggt caccgcaata atatccaggt tcagacgg                             38<210>90<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PGR扩增的引物<400>90gatccaccct gccgagcccg ctggcgctgc tgaccgtgca tgagct                    46<210>91<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>91catgcacggt cagcagcgcc agcgggctcg gcagggtg                             38<210>92<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>92gatccaccaa ccgtcataac ccgcatcatc tgcatcatgt ggagct                    46<210>93<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>93ccacatgatg cagatgatgc gggttatgac ggttggtg                             38<210>94<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>94gatcctggcc gcatgcgtgg aaagtgtggt ggccggcgag cgagct                    46<210>95<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>95cgctcgccgg ccaccacact ttccacgcat gcggccag                             38<210>96<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>96atccaactg gtggtggccg ccgtatattc gtcatcagcc ggagct                    46<210>97<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>97ccggctgatg acgaatatac ggcggccacc accagttg                            38<210>98<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>98gatcctggca ttggagctgg accccgtggc cgagccatca tgagct                   46<210>99<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>99catgatggct cggccacggg gtccagctcc aatgccag                             38<210>100<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>100gatcctggcc gtgggcgtgg catccgagcc gtgatgtgta tgagct                    46<210>101<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>101catacacatc acggctcgga tgccacgccc acggccag                             38<210>102<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>102gatcctggca tggctattgg tatagcaacc tgaacaccac cgagct                    46<210>103<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>103cggtggtgtt caggttgcta taccaatagc catgccag                             38<210>104<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>104gatcctggtg gaccccgtgg atgagccatg cgtatccggt ggagct                    46<210>105<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>105ccaccggata cgcatggctc atccacgggg tccaccag                             38<210>106<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>106gatcctggcc gaacccgtat tggggctggt ttgcggcggt ggagct                    46<210>107<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>107ccaccgccgc aaaccagccc caatacgggt tcggccag                              38<210>108<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>108gatccaccag ctggcatacc tggtggtggc gtcagccgcc ggagct                    46<210>109<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>109ccggcggctg acgccaccac caggtatgcc agctggtg                             38<210>110<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>110gatccaacgc gtggcataaa tattggtggc cgattaccaa agagct                    46<210>111<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>111ctttggtaat cggccaccaa tatttatgcc acgcgttg                             38<210>112<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>112gatcccatcc gaacaacgat tggagcaaag cgccgcagtt tgagct                    46<210>113<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>113caaactgcgg cgctttgctc caatcgttgt tcggatgg                             38<210>114<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>114gatcctggtg gaccccgcag ccgtggtgga gctttccgat tgagct                    46<210>115<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>115caatcggaaa gctccaccac ggctgcgggg tccaccag                             38<210>116<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>116gatcctggcc gcataccagc tggtggcaga ccccgctgac cgagct                    46<210>117<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>117cggtcagcgg ggtctgccac cagctggtat gcggccag                            38<210>118<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>118gatcctggca tgtgaactgg gatccgatgg cgtggtatcg tgagct                   46<210>119<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>119cacgatacca cgccatcgga tcccagttca catgccag                            38<210>120<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>120gatccagctg gccgtggtgg accgcgtatc gtgtgcatag cgagct                    46<210>121<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>121cgctatgcac acgatacgcg gtccaccacg gccagctg                             38<210>122<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>122gatcctggca tagcaactgg tatcagagca ttccgcaggt ggagct                    46<210>123<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>123ccacctgcgg aatgctctga taccagttgc tatgccag                            38<210>124<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>124gatccggcta ttggccgtgg aaatttgaac atgcgaccgt ggagct                   46<210>125<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>125ccacggtcgc atgttcaaat ttccacggcc aatagccg                            38<210>126<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>126gatccgcgtg gtggccgacc acctttccgc cgtattatta tgagct                    46<210>127<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>127cataataata cggcggaaag gtggtcggcc accacgcg                             38<210>128<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>128gatccaaccc gtggtggagc cattattatc cgcgtagcgt ggagct                    46<210>129<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>129ccacgctacg cggataataa tggctccacc acgggttg                             38<210>130<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>130gatcctggcc gcataactat ccgctgaacc atagcaaccc ggagct                    46<210>131<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>131ccgggttgct atggttcagc ggatagttat gcggccag                             38<210>132<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>132gatccacctg ggcgcatccg ctggaaagcg attatctgcg tgagct                    46<210>133<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>133cacgcagata atcgctttcc agcggatgcg cccaggtg                             38<210>134<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>134gatcccatac ctattatcat gatggctggc gtctggcgcc ggagct                    46<210>135<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>135ccggcgccag acgccagcca tcatgataat aggtatgg                            38<210>136<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>136gatccacctt tgtgcagacc ccgctgagcc atctgattgc ggagct                   46<210>137<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>137ccgcaatcag atggctcagc ggggtctgca caaaggtg                            38<210>138<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>138gatcccgtgt gccgccgagc aaactgaccc gtccgccgtt tgagct                    46<210>139<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>139caaacggcgg acgggtcagt ttgctcggcg gcacacgg                             38<210>140<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>140gatcccatag catttatagc gtgaccccga gcaccgcgag cgagct                    46<210>141<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>141cgctcgcggt gctcggggtc acgctataaa tgctatgg                             38<210>142<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>142gatccctgaa cacccagaac catgcgccgc tgccgagcat tgagct                    46<210>143<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>143caatgctcgg cagcggcgca tggttctggg tgttcagg                             38<210>144<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>144Lys Tyr Asp Ser Arg His Leu His Thr His Ser His Gly Gly Gly Ser1               5                   10                  15Gly Gly Gly Ser Pro Asn Arg Leu Gly Arg Arg Pro Val Arg Trp Glu

        20                  25                  30<210>145<211>106<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>145gatccaaata tgatagccgt catctgcata cccatagcca tggcggcggc agcggcggcg    60gcagcccgaa ccgtctgggc cgtcgtccgg tgcgttggga agagct                  106<210>146<211>98<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>146cttcccaacg caccggacga cggcccagac ggttcgggct gccgccgccg ctgccgccgc    60catggctatg ggtatgcaga tgacggctat catatttg                            98<210>147<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>147Trp Pro His Ala Trp Lys Val Trp Trp Pro Ala Ser Gly Gly Gly Ser1               5                   10                  15Gly Gly Gly Ser Asn Trp Trp Trp Pro Pro Tyr Ile Arg His Gln Pro

        20                  25                  30<210>148<211>106<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>148gatcctggcc gcatgcgtgg aaagtgtggt ggccggcgag cggcggcggc agcggcggcg    60gcagcaactg gtggtggccg ccgtatattc gtcatcagcc ggagct                  106<210>149<211>98<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>149ccggctgatg acgaatatac ggcggccacc accagttgct gccgccgccg ctgccgccgc    60cgctcgccgg ccaccacact ttccacgcat gcggccag                            98<210>150<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>150His Ala Thr Gly Thr His Gly Leu Ser Leu Ser His1               5                   10<210>151<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>151Thr Leu Pro Ser Pro Leu Ala Leu Leu Thr Val His1               5                   10<210>152<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>152Leu Ser Thr His Tyr Val Asn Arg Ser His Ile Thr1               5                   10<210>153<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>153Ala Tyr His Ile Asn Gln Leu Gly Ala Pro Pro Ala1               5                   10<210>154<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>154Leu His Leu Thr Pro His Pro Gly Asp Thr Leu Thr1               5                   10<210>155<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>155Gln Asp Val His Leu Thr Gln Gln Ser Arg Tyr Thr1               5                   10<210>156<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>156Leu Glu Ile Pro Ser Asn Gly Leu Asn His Lys Ile1               5                   10<210>157<211>12<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>157Leu Glu Ile Pro Ser Asn Gly Leu Asn His Asn Ile1               5                   10<210>158<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>158gatcccatgc gaccggcacc catggcctga gcctgagcca tgagct                    46<210>159<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>159catggctcag gctcaggcca tgggtgccgg tcgcatgg                             38<210>160<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>160gatccaccct gccgagcccg ctggcgctgc tgaccgtgca tgagct                    46<210>161<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>161catgcacggt cagcagcgcc agcgggctcg gcagggtg                             38<210>162<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>162gatccctgag cacccattat gtgaaccgta gccatattac cgagct                    46<210>163<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>163cggtaatatg gctacggttc acataatggg tgctcagg                             38<210>164<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>164gatccgcgta tcatattaac cagctgggcg cgccgccggc ggagct                    46<210>165<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>165ccgccggcgg cgcgcccagc tggttaatat gatacgcg                            38<210>166<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>166gatccctgca tctgaccccg catccgggcg ataccctgac cgagct                   46<210>167<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>167cggtcagggt atcgcccgga tgcggggtca gatgcagg                             38<210>168<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>168gatcccagga tgtgcatctg acccagcaga gccgttatac cgagct                    46<210>169<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>169cggtataacg gctctgctgg gtcagatgca catcctgg                             38<210>170<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>170gatccctgga aattccgagc aacggcctga accataaaat tgagct                    46<210>171<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>171caattttatg gttcaggccg ttgctcggaa tttccagg                             38<210>172<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>172gatccctgga aattccgagc aacggcctga accataacat tgagct                    46<210>173<211>38<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>173caatgttatg gttcaggccg ttgctcggaa tttccagg                             38<210>174<211>32<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>TiO2结合多肽<400>174His Ala Thr Gly Thr His Gly Leu Ser Leu Ser His Gly Gly Gly Ser1               5                   10                  15Gly Gly Gly Ser Thr Leu Pro Ser Pro Leu Ala Leu Leu Thr Val His

        20                  25                  30<210>175<211>106<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>175gatcccatgc gaccggcacc catggcctga gcctgagcca tggcggcggc agcggcggcg    60gcagcaccct gccgagcccg ctggcgctgc tgaccgtgca tgagct                  106<210>176<211>98<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于PCR扩增的引物<400>176catgcacggt cagcagcgcc agcgggctcg gcagggtgct gccgccgccg ctgccgccgc    60catggctcag gctcaggcca tgggtgccgg tcgcatgg                            98<210>177<211>4<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>连接序列<400>177Gly Gly Gly Ser1<210>178<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<220><22l>MISC特性<222>(1)..(7)<223>X表示任意氨基酸<400>178Val Xaa His Xaa Leu Val Xaa1               5<210>179<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<220><221>MISC特性<222>(1)..(7)<223>X表示任意氨基酸<400>179Trp Xaa Trp Ile Leu Xaa Asn1               5<210>180<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>SiO2结合多肽<220><221>MISC特性<222>(1)..(7)<223>X表示任意氨基酸<400>180Asp Ser Xaa Xaa Thr Ile Asn1               5<210>181<211>8<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>连接序列<400>181Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1               5<210>182<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>182Val Tyr His Arg Leu Val Asn1               5<210>183<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>铜酞菁结合多肽<400>183Val Ile His Arg Leu Val Trp1               5<210>184<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>炭黑结合多肽<400>184Trp Tyr Trp Ile Leu Thr Asn1               5<210>185<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>SiO2结合多肽<400>185Asp Thr Phe His Thr Ile Asn1               5<210>186<211>7<212>PRT<213>人工合成序列<220><223>SiO2结合多肽<400>186Glu Ser His Phe Thr Ile Asn1               5

Claims (81)

1.一种制造含羟基链烷酸酯结构体的方法，其中该结构体的基材表面的至少一部分涂覆有聚羟基链烷酸酯，该方法包括以下步骤：

将聚羟基链烷酸酯合酶固定在所述基材的表面上，

在所述基材表面使用3-羟基酰基辅酶A，使其成为所述合酶的底物来合成聚羟基链烷酸酯，并在所述基材的至少一部分上涂布合成的聚羟基链烷酸酯，其中

所述合酶含有能键合到所述基材上的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的制造方法，其中聚羟基链烷酸酯由至少一种选自以下组的单体单元组成，该组由通式[1]到[10]表示的单体单元组成，且各相应的3-羟基酰基辅酶A选自由通式[12]到[21]表示的组成的组：

(其中该单体单元至少从以下组选择一个，该组由具有任何以下R1和a组合的单体单元组成：)

R1表示氢原子(H)，a表示0到10的整数的单体单元；

R1表示卤原子，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示发色团，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示羧基或其盐，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示

a表示1到7的整数的单体单元。)

(其中b表示0到7的整数，R2表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中c表示1到8的整数，R3表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中d表示0到7的整数，R4表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中e表示1到8的整数，R5表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅-CF₇，-CH₃，-CH₅和-C₃H₇组成。)

(其中f表示0到7的整数)

(其中g表示1到8的整数)

(其中h表示1到7的整数，R6表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-COOR’，-SO₂R”，-CH₃，-C₂H₅，-C₃H₇，(H(CH₃)₂，-C(CH₃)₃组成，其中R’表示氢原子(H)，Na，K，-CH₃和-C₂H₅，R”表示-OH，-ONa，-OK，卤原子，-OCH₃和-OC₂H₅。)

(其中i表示1到7的整数，R7表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-COOR’，-SO₂R”组成，其中R’表示氢原子(H)，Na，K，-CH₃和-C₂H₅，R”表示-OH，-ONa，-OK，卤原子，-OCH₃和-OC₂H₅)

(其中j表示1到9的整数)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R1和a的定义与在以上通式[1]表示的单体单元中的R1和a的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R2和b的定义与在以上化学式[2]表示的单体单元中的R2和b的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R3和c的定义分别与在以上所述的化学式[3]表示的单体单元中的R3和c的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R4和d的定义分别与在以上所述的化学式[4]表示的单体单元中的R4和d的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且R5和e的定义分别与在以上所述的化学式[5]表示的单体单元中的R5和e的组合一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且f的定义与在以上所述的化学式[6]表示的单体单元中的f一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且g的定义与在以上所述的化学式[7]表示的单体单元中的g一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且h和R6的定义分别与在以上所述的化学式[8]表示的单体单元中的h和R6一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且i和R7的定义分别与在以上所述的化学式[9]表示的单体单元中的i和R7一样。)

(其中-SCoA表示键合到链烷酸的CoA，且j的定义与在以上所述的化学式[10]表示的单体单元中的j一样)。

3.如权利要求2所述的制造方法，其中所述聚羟基链烷酸酯有一羧基，且含有至少一个选自以下组的单体单元，该组由通式[11]表示的单体组成，且各相应的3-羟基酰基辅酶A选自以下组，该组由通式[22]表示的3-羟基酰基辅酶

A组成，所述通式为：

其中k表示1到10的整数，和

其中该通式中的-SCoA表示键合到羧酸的辅酶A，k的定义与式[11]中的一样。

4.如权利要求1所述的制造方法，其中

通过随时间改变所述3-羟基酰基辅酶A的组分，使所述聚羟基链烷酸酯的3-羟基链烷酸单元组分在所述含聚羟基链烷酸酯结构体的层叠方向变化。

5.如权利要求1所述的制造方法，该方法进一步包括在至少一部分聚羟基链烷酸酯上进行化学修饰的步骤，且所述基材聚羟基链烷酸酯。

6.如权利要求5所述的制造方法，其中所述进行化学修饰的步骤是向至少一部分所述聚羟基链烷酸酯中加入一接枝链段。

7.如权利要求6所述的制造方法，其中所述加入接枝链段的步骤是使至少一部分所述聚羟基链烷酸酯与在其端部具有反应性官能团的化合物发生反应的步骤。

8.如权利要求6所述的制造方法，其中所述聚羟基链烷酸酯有至少由一种具有环氧基团的单体单元组成。

9.如权利要求7所述的制造方法，其中所述在其端部具有反应性官能团的化合物是一种具有氨基的化合物。

10.如权利要求9所述的制造方法，其中所述具有氨基的化合物是端部氨基改性的化合物。

11.如权利要求10所述的制造方法，其中所述端部氨基改性的化合物是至少一种选自以下组的化合物，该组由聚乙烯胺，聚乙烯亚胺和端部氨基改性的聚硅氧烷组成。

12.如权利要求5所述的制造方法，其中所述化学修饰步骤是使至少一部分聚羟基链烷酸酯发生交联的步骤。

13.如权利要求12所述的制造方法，其中所述交联步骤是至少一部分聚羟基链烷酸酯与一种交联剂反应的步骤。

14.如权利要求12所述的制造方法，其中所述聚羟基链烷酸酯至少由一种具有环氧基的单体组成。

15.如权利要求13所述的制造方法，其中所述交联剂是至少一种选自以下组的化合物，该组由二胺化合物，琥珀酸酐和2-甲基-4-甲基咪唑组成。

16.如权利要求15所述的制造方法，其中所述二胺化合物是六亚甲基二胺。

17.如权利要求12所述的制造方法，其中所述交联步骤是用电子射线对所述聚羟基链烷酸酯进行辐射的步骤。

18.如权利要求1所述的制造方法，其中所述能键合到基材上的氨基酸序列是通过筛选无序肽文库来确定的氨基酸序列。

19.一种含聚羟基链烷酸酯的结构体，该结构体至少一部分基材表面涂有聚羟基链烷酸酯，其包括：

基材，固定在基材表面的聚羟基链烷酸酯合酶，和涂布在至少一部分基材表面上的聚羟基链烷酸酯，其中所述合酶含有能键合到所述基材上的氨基酸序列。

20.如权利要求19所述的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述聚羟基链烷酸酯由至少一种选自以下组的单体单元组成，该组由通式[1]到[10]表示的单体单元组成：

(其中该单体单元至少从以下组选择一个，该组由具有任何以下R1和a组合的单体单元组成：)

R1表示氢原子(H)，a表示0到10的整数的单体单元；

R1表示卤原子，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示发色团，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示羧基或其盐，a表示1到10的整数的单体单元；

R1表示

a表示1到7的整数的单体单元。)

(其中b表示0到7的整数，R2表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中c表示1到8的整数，R3表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中d表示0到7的整数，R4表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅和-C₃F₇组成。)

(其中e表示1到8的整数，R5表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-CF₃，-C₂F₅-C₃F₇，-CH₃，-C₂H₅和-C₃H₇组成。)

(其中f表示0到7的整数)

(其中g表示1到8的整数)

(其中h表示1到7的整数，R6表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-COOR’，-SO₂R”，-CH₃，-C₂H₅，-C₃H₇，-CH(CH₃)₂，-C(CH₃)₃组成，其中R’表示氢原子(H)，Na，K，-CH₃和-C₂H₅，R”表示OH，-ONa，-OK，卤原子，-OCH₃和-OC₂H₅。)

(其中i表示1到7的整数，R7表示选自以下组的任何一个基团，该组由氢原子(H)，卤原子，-CN，-NO₂，-COOR’，-SO₂R”组成，其中R’表示氢原子(H)，Na，K，-CH₃和-C₂H₅，R”表示-OH，-ONa，-OK，卤原子，-OCH₃和-OC₂H₅)

(其中j表示1到9的整数)。

21.如权利要求20的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述聚羟基链烷酸酯具有亲水功能基。

22.如权利要求21的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述聚羟基链烷酸酯具有阴离子功能基。

23.如权利要求22的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述聚羟基链烷酸酯具有一羧基。

24.如权利要求23的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述具有羧基的聚羟基链烷酸酯含有至少一种选自以下组的基团，该组由通式[11]表示的单体单元组成，

其中k是1-10之一的整数。

25.如权利要求19的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述聚羟基链烷酸酯的单体单元组分在所述含聚羟基链烷酸酯的结构体的层叠方向发生变化。

26.如权利要求19的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中至少一部分所述聚羟基链烷酸酯被化学修饰。

27.如权利要求26的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述被化学修饰了的聚羟基链烷酸酯是具有至少一接枝链段的聚羟基链烷酸酯。

28.如权利要求27的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述接枝链段是对含至少一种具有环氧基的单体单元的聚羟基链烷酸酯进行化学修饰得到的接枝链段。

29.如权利要求27的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述接枝链段是具有氨基的化合物的接枝链段。

30.如权利要求29的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述接枝链段是端部氨基改性的化合物的接枝链段。

31.如权利要求29的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述端部氨基改性的化合物是至少一种选自以下组的化合物，该组由聚乙烯胺，聚乙烯亚胺和端部氨基改性的聚硅氧烷组成。

32.如权利要求26的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述聚羟基链烷酸酯的至少一部分是交联的聚羟基链烷酸酯。

33.如权利要求32所述的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述交联的聚羟基链烷酸酯是通过使至少含有具有环氧基的单体单元的聚羟基链烷酸酯交联制成的。

34.如权利要求32所述的聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述交联的聚羟基链烷酸酯是通过使至少一种选自以下组的方式交联得到的聚羟基链烷酸酯，该组由二胺化合物，琥珀酸酐、2-乙基-4-甲基咪唑和电子射线辐射组成。

35.如权利要求34所述的聚羟基链烷酸酯的结构体，其中所述二胺化合物是六亚甲基二胺。

36.如权利要求1的制造方法，其中基材是铜酞菁，能键合到所述基材上的氨基酸序列是至少一种选自以下组的氨基酸序列的全部或一部分，该组由以下氨基酸序列组成：

Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His  (SEQ ID NO：24)

Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu  (SEQ ID NO：25)

Lys-Cys-Cys-Tyr-Tyr-Asp-His-Ser-His-Ala-Leu-Ser  (SEQ ID NO：26)

Glu-Tyr-Leu-Ser-Ala-Ile-Val-Ala-Gly-Pro-Trp-Pro  (SEQ ID NO：27)

Lys-Leu-Trp-Ile-Leu-Glu-Pro-Thr-Val-Thr-Pro-Thr  (SEQ ID NO：28)

Gln-Ser-Asn-Leu-Lys-Val-Ile-Pro-Ser-Trp-Trp-Phe  (SEQ ID NO：29)

Trp-Ile-Pro-Pro-Gln-Trp-Ser-Arg-Leu-Ile-Glu-Pro  (SEQ ID NO：30)

Asp-His-Pro-Gln-Ala-Lys-Pro-Asn-Trp-Tyr-Gly-Val  (SEQ ID NO：31)

Gly-Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-Arg-Leu-Ala-Gln  (SEQ ID NO：32)

Lys-Leu-Thr-Thr-Gln-Tyr-Met-Ala-Arg-Ser-Ser-Ser  (SEQ ID NO：33)

Lys-Val-Trp-Met-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Gln-Ala-Thr  (SEQ ID NO：34)

Asn-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Phe-Ile-Asp-Thr-Pro-Trp  (SEQ ID NO：35)

Arg-Leu-Asn-Leu-Asp-Ile-Ile-Ala-Val-Thr-Ser-Val  (SEQ ID NO：36)

Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His  (SEQ ID NO：37)

Thr-Asn-Arg-His-Asn-Pro-His-His-Leu-His-His-Val  (SEQ ID NO：38)

37.如权利要求36的制造方法，其中基材是酮酞菁，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(SEQID：24)的全部或一部分。

38.如权利要求36的制造方法，其中基材是酮酞菁，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(SEQID：25)的全部或一部分。

39.如权利要求1的制造方法，其中基材是炭黑，能键合到所述基材上的氨基酸序列是至少一种选自以下组的氨基酸序列的全部或一部分，该组由以下氨基酸序列组成：

Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser  (SEQ ID NO：39)

Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro  (SEQ ID NO：40)

Trp-His-Trp-Ser-Trp-Thr-Pro-Trp-Pro-Ser-His-His  (SEQ ID NO：41)

Trp-Pro-Trp-Ala-Trp-His-Pro-Ser-Arg-Asp-Val-Tyr  (SEQ ID NO：42)

Trp-His-Gly-Tyr-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Asn-Thr-Thr  (SEQ ID NO：43)

Trp-Trp-Thr-Pro-Trp-Met-Ser-His-Ala-Tyr-Pro-Val  (SEQ ID NO：44)

Trp-Pro-Asn-Pro-Tyr-Trp-Gly-Trp-Phe-Ala-Ala-Val  (SEQ ID NO：45)

Thr-Ser-Trp-His-Thr-Trp-Trp-Trp-Arg-Gln-Pro-Pro  (SEQ ID NO：46)

Asn-Ala-Trp-His-Lys-Tyr-Trp-Trp-Pro-Ile-Thr-Lys  (SEQ ID NO：47)

His-Pro-Asn-Asn-Asp-Trp-Ser-Lys-Ala-Pro-Gln-Phe  (SEQ ID NO：48)

Trp-Trp-Thr-Pro-Gln-Pro-Trp-Trp-Ser-Phe-Pro-Ile  (SEQ ID NO：49)

Trp-Pro-His-Thr-Ser-Trp-Trp-Gln-Thr-Pro-Leu-Thr  (SEQ ID NO：50)

Trp-His-Val-Asn-Trp-Asp-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Arg  (SEQ ID NO：51)

Ser-Trp-Pro-Trp-Trp-Thr-Ala-Tyr-Arg-Val-His-Ser  (SEQ ID NO：52)

Trp-His-Ser-Asn-Trp-Tyr-Gln-Ser-Ile-Pro-Gln-Val  (SEQ ID NO：53)

Gly-Tyr-Trp-Pro-Trp-Lys-Phe-Glu-His-Ala-Thr-Val  (SEQ ID NO：54)

Ala-Trp-Trp-Pro-Thr-Thr-Phe-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Tyr  (SEQ ID NO：55)

Asn-Pro-Trp-Trp-Ser-His-Tyr-Tyr-Pro-Arg-Ser-Val  (SEQ ID NO：56)

Trp-Pro-His-Asn-Tyr-Pro-Leu-Asn-His-Ser-Asn-Pro  (SEQ ID NO：57)

Thr-Trp-Ala-His-Pro-Leu-Glu-Ser-Asp-Tyr-Leu-Arg  (SEQ ID NO：58)

His-Thr-Tyr-Tyr-His-Asp-Gly-Trp-Arg-Leu-Ala-Pro  (SEQ ID NO：59)

Thr-Phe-Val-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-His-Leu-Ile-Ala  (SEQ ID NO：60)

Arg-Val-Pro-Pro-Ser-Lys-Leu-Thr-Arg-Pro-Pro-Phe  (SEQ ID NO：61)

His-Ser-Ile-Tyr-Ser-Val-Thr-Pro-Ser-Thr-Ala-Ser  (SEQ ID NO：62)

Leu-Asn-Thr-Gln-Asn-His-Ala-Pro-Leu-Pro-Ser-Ile  (SEQ ID NO：63)

40.如权利要求39的制造方法，其中基材是炭黑，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(SEQ ID：39)的全部或一部分。

41.如权利要求39的制造方法，其中基材是炭黑，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Asp-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(SEQ ID：40)的全部或一部分。

42.如权利要求1的制造方法，其中基材是氧化钛，能键合到所述基材上的氨基酸序列是至少一种选自以下组的氨基酸序列的全部或一部分，该组由以下氨基酸序列组成：

His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His  (SEQ ID NO：150)

Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His  (SEQ ID NO：151)

Leu-Ser-Thr-His-Tyr-Val-Asn-Arg-Ser-His-Ile-Thr  (SEQ ID NO：152)

Ala-Tyr-His-Ile-Asn-Gln-Leu-Gly-Ala-Pro-Pro-Ala  (SEQ ID NO：153)

Leu-His-Leu-Thr-Pro-His-Pro-Gly-Asp-Thr-Leu-Thr  (SEQ ID NO：154)

Gln-Asp-Val-His-Leu-Thr-Gln-Gln-Ser-Arg-Tyr-Thr  (SEQ ID NO：155)

Leu-Glu-Ile-Pro-Ser-Asn-Gly-Leu-Asn-His-Lys-Ile  (SEQ ID NO：156)

Leu-Glu-Ile-Pro-Ser-Asn-Gly-Leu-Asn-His-Asn-Ile  (SEQ ID NO：157)

43.如权利要求42的制造方法，其中基材是氧化钛，能键合到所述基材上的氨基酸序列是His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His(SEQID：150)的全部或一部分。

44.如权利要求42的制造方法，其中基材是氧化钛，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(SEQID：151)的全部或一部分。

45.如权利要求1的制造方法，其中基材是硅板，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Asp-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn(SEQ ID：21)。

46.如权利要求19的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是铜酞菁，能键合到所述基材上的氨基酸序列是至少一种选自以下组的氨基酸序列的全部或一部分，该组由以下氨基酸序列组成：

Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His  (SEQ ID NO：24)

Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu  (SEQ ID NO：25)

Lys-Cys-Cys-Tyr-Tyr-Asp-His-Ser-His-Ala-Leu-Ser  (SEQ ID NO：26)

Glu-Tyr-Leu-Ser-Ala-Ile-Val-Ala-Gly-Pro-Trp-Pro  (SEQ ID NO：27)

Lys-Leu-Trp-Ile-Leu-Glu-Pro-Thr-Val-Thr-Pro-Thr  (SEQ ID NO：28)

Gln-Ser-Asn-Leu-Lys-Val-Ile-Pro-Ser-Trp-Trp-Phe  (SEQ ID NO：29)

Trp-Ile-Pro-Pro-Gln-Trp-Ser-Arg-Leu-Ile-Glu-Pro  (SEQ ID NO：30)

Asp-His-Pro-Gln-Ala-Lys-Pro-Asn-Trp-Tyr-Gly-Val  (SEQ ID NO：31)

Gly-Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-Arg-Leu-Ala-Gln  (SEQ ID NO：32)

Lys-Leu-Thr-Thr-Gln-Tyr-Met-Ala-Arg-Ser-Ser-Ser  (SEQ ID NO：33)

Lys-Val-Trp-Met-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Gln-Ala-Thr  (SEQ ID NO：34)

Asn-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Phe-Ile-Asp-Thr-Pro-Trp  (SEQ ID NO：35)

Arg-Leu-Asn-Leu-Asp-Ile-Ile-Ala-Val-Thr-Ser-Val  (SEQ ID NO：36)

Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His  (SEQ ID NO：37)

Thr-Asn-Arg-His-Asn-Pro-His-His-Leu-His-His-Val  (SEQ ID NO：38)

47.如权利要求46的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是铜酞菁，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(SEQ ID：24)的全部或一部分。

48.如权利要求46的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是铜酞菁，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(SEQ ID：25)的全部或一部分。

49.如权利要求19的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是炭黑，能键合到所述基材上的氨基酸序列是至少一种选自以下组的氨基酸序列的全部或一部分，该组由以下氨基酸序列组成：

Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser  (SEQ ID NO：39)

Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro  (SEQ ID NO：40)

Trp-His-Trp-Ser-Trp-Thr-Pro-Trp-Pro-Ser-His-His  (SEQ ID NO：41)

Trp-Pro-Trp-Ala-Trp-His-Pro-Ser-Arg-Asp-Val-Tyr  (SEQ ID NO：42)

Trp-His-Gly-Tyr-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Asn-Thr-Thr  (SEQ ID NO：43)

Trp-Trp-Thr-Pro-Trp-Met-Ser-His-Ala-Tyr-Pro-Val  (SEQ ID NO：44)

Trp-Pro-Asn-Pro-Tyr-Trp-Gly-Trp-Phe-Ala-Ala-Val  (SEQ ID NO：45)

Thr-Ser-Trp-His-Thr-Trp-Trp-Trp-Arg-Gln-Pro-Pro  (SEQ ID NO：46)

Asn-Ala-Trp-His-Lys-Tyr-Trp-Trp-Pro-Ile-Thr-Lys  (SEQ ID NO：47)

His-Pro-Asn-Asn-Asp-Trp-Ser-Lys-Ala-Pro-Gln-Phe  (SEQ ID NO：48)

Trp-Trp-Thr-Pro-Gln-Pro-Trp-Trp-Ser-Phe-Pro-Ile  (SEQ ID NO：49)

Trp-Pro-His-Thr-Ser-Trp-Trp-Gln-Thr-Pro-Leu-Thr  (SEQ ID NO：50)

Trp-His-Val-Asn-Trp-Asp-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Arg  (SEQ ID NO：51)

Ser-Trp-Pro-Trp-Trp-Thr-Ala-Tyr-Arg-Val-His-Ser  (SEQ ID NO：52)

Trp-His-Ser-Asn-Trp-Tyr-Gln-Ser-Ile-Pro-Gln-Val  (SEQ ID NO：53)

Gly-Tyr-Trp-Pro-Trp-Lys-Phe-Glu-His-Ala-Thr-Val  (SEQ ID NO：54)

Ala-Trp-Trp-Pro-Thr-Thr-Phe-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Tyr  (SEQ ID NO：55)

Asn-Pro-Trp-Trp-Ser-His-Tyr-Tyr-Pro-Arg-Ser-Val  (SEQ ID NO：56)

Trp-Pro-His-Asn-Tyr-Pro-Leu-Asn-His-Ser-Asn-Pro  (SEQ ID NO：57)

Thr-Trp-Ala-His-Pro-Leu-Glu-Ser-Asp-Tyr-Leu-Arg  (SEQ ID NO：58)

His-Thr-Tyr-Tyr-His-Asp-Gly-Trp-Arg-Leu-Ala-Pro  (SEQ ID NO：59)

Thr-Phe-Val-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-His-Leu-Ile-Ala  (SEQ ID NO：60)

Arg-Val-Pro-Pro-Ser-Lys-Leu-Thr-Arg-Pro-Pro-Phe  (SEQ ID NO：61)

His-Ser-Ile-Tyr-Ser-Val-Thr-Pro-Ser-Thr-Ala-Ser  (SEQ ID NO：62)

Leu-Asn-Thr-Gln-Asn-His-Ala-Pro-Leu-Pro-Ser-Ile  (SEQ ID NO：63)

50.如权利要求49的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是炭黑，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(SEQ ID：39)的全部或一部分。

51.如权利要求49的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是炭黑，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Asp-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(SEQ ID：40)的全部或一部分。

52.如权利要求19的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是氧化钛，能键合到所述基材上的氨基酸序列是至少一种选自以下组的氨基酸序列的全部或一部分，该组由以下氨基酸序列组成：

His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His  (SEQ ID NO：150)

Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His  (SEQ ID NO：151)

Leu-Ser-Thr-His-Tyr-Val-Asn-Arg-Ser-His-Ile-Thr  (SEQ ID NO：152)

Ala-Tyr-His-Ile-Asn-Gln-Leu-Gly-Ala-Pro-Pro-Ala  (SEQ ID NO：153)

Leu-His-Leu-Thr-Pro-His-Pro-Gly-Asp-Thr-Leu-Thr  (SEQ ID NO：154)

Gln-Asp-Val-His-Leu-Thr-Gln-Gln-Ser-Arg-Tyr-Thr  (SEQ ID NO：155)

Leu-Glu-Ile-Pro-Ser-Asn-Gly-Leu-Asn-His-Lys-Ile  (SEQ ID NO：156)

Leu-Glu-Ile-Pro-Ser-Asn-Gly-Leu-Asn-His-Asn-Ile  (SEQ ID NO：157)

53.如权利要求52的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是氧化钛，能键合到所述基材上的氨基酸序列是His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His(SEQ ID：150)的全部或一部分。

54.如权利要求52的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是氧化钛，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(SEQ ID：151)的全部或一部分。

55.如权利要求19的含聚羟基链烷酸酯的结构体，其中基材是硅板，能键合到所述基材上的氨基酸序列是Asp-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn(SEQ IDNO：21)。

56.如权利要求1的制造方法，其中聚羟基链烷酸酯合酶是能产生所述合酶的微生物产生的一种聚羟基链烷酸酯合酶，或者是通过向宿主中掺入与所述生产能力相关的基因制成的一种转化体。

57.如权利要求56的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物是属于假单胞菌属的一种微生物。

58.如权利要求57的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物为至少一种选自以下组的微生物，该组由Pseudomonas putida P91，FERMBP-7373；Pseudomonas cichorii H45，FERM BP-7374；Pseudomonas cichoriiYN2，FERM BP-7375和Pseudomonas jessenii P161，FERM BP-7376组成。

59.如权利要求56的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物是属于Burkholderia sp的一种微生物。

60.如权利要求59的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物为至少一种选自以下组的微生物，该组由Burkholderia cepacia KK01，FERM BP-4235；Burkholderia sp.OK3，FERM P-17370和Burkholderia sp.OK4，FERM P-17371组成。

61.如权利要求56的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物是属于Alcaligenes sp的一种微生物。

62.如权利要求61的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物为Alcaligenes sp.TL2，FERM BP-6913。

63.如权利要求56的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物是属于Ralstonia sp的一种微生物。

64.如权利要求63的制造方法，其中能产生所述聚羟基链烷酸酯合酶的微生物为Ralstonia eutropha TB64，FERM BP-6933。

65.如权利要求56的制造方法，其中所述转化体的宿主微生物是大肠埃希氏菌大肠杆菌。

66.一种含着色剂的静电成像显影调色剂，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布着色材料表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求19的结构体，其中该结构体的基材是着色材料，且该结构体构成至少一部分调色剂。

67.一种含着色剂的静电成像显影调色剂，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布铜酞菁表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求46的结构体，且该结构体构成至少一部分调色剂。

68.一种含着色剂的静电成像显影调色剂，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布炭黑表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求49的结构体，且该结构体构成至少一部分调色剂。

69.一种含着色剂的静电成像显影调色剂，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布氧化钛表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求52的结构体，且该结构体构成至少一部分调色剂。

70.一种用于滤色片的含着色剂的着色组合物，该着色剂是是用聚羟基链烷酸酯涂布着色材料表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求19的结构体，其中该结构体的基材是着色材料，且该结构体构成至少一部分调色剂。

71.一种用于滤色片的含着色剂的着色组合物，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布铜酞菁表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求46的结构体，且该结构体构成至少一部分调色剂。

72.一种用于滤色片的含着色剂的着色组合物，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布炭黑表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求49的结构体，且该结构体构成至少一部分调色剂。

73.一种用于滤色片的含着色剂的着色组合物，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布氧化钛表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求52的结构体，且该结构体构成至少一部分调色剂。

74.一种含着色剂的电泳颗粒，该着色剂是是用聚羟基链烷酸酯涂布着色材料表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求19的结构体，其中该结构体的基材是着色材料，且该结构体构成该颗粒的至少一部分。

75.一种含着色剂的电泳颗粒，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布铜酞菁表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求46的结构体，且该结构体构成该颗粒的至少一部分。

76.一种含着色剂的电泳颗粒，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布炭黑表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求49的结构体，且该结构体构成该颗粒的至少一部分。

77.一种含着色剂的电泳颗粒，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布氧化钛表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求52的结构体，且该结构体构成该颗粒的至少一部分。

78.一种含着色剂的颜料油墨，该着色剂是是用聚羟基链烷酸酯涂布着色材料表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求19的结构体，其中该结构体的基材是着色材料，且该结构体构成该油墨的至少一部分。

79.一种含着色剂的颜料油墨，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布铜酞菁表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求46的结构体，且该结构体构成该油墨的至少一部分。

80.一种含着色剂的颜料油墨，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布炭黑表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求49的结构体，且该结构体构成该油墨的至少一部分。

81.一种含着色剂的颜料油墨，该着色剂是用聚羟基链烷酸酯涂布氧化钛表面的至少一部分得到的，其中

该结构体为权利要求52的结构体，且该结构体构成该油墨的至少一部分。

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