KR100532721B1 - 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체 및 그 제조방법 - Google Patents

폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

구조체의 기재의 표면의 적어도 일부가 폴리히드록시알카노에이트로 피복된 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제조하는 방법에 있어서, 기재표면위에 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 고정하는 공정과, 합성효소의 기질이 되도록 3-히드록시아실 조효소 A를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트와 합성효소를 기재표면위에 합성하는 공정과, 합성된 폴리히드록시알카노에이트로 기재표면의 적어도 일부를 피복하는 공정을 포함하고, 상기 합성효소는 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 것을 특징으로 한다. 구조체의 기재의 표면의 적어도 일부가 폴리히드록시알카노에이트로 피복된 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체는, 기재와, 해당 기재 표면위에 고정화된 폴리히드록시알카노에이트 합성효소와, 기재표면의 적어도 일부가 피복된 폴리히드록시알카노에이트를 포함하고, 상기 합성효소는 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 것을 특징으로 한다.

Description

폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체 및 그 제조방법{POLYHYDROXYALKANOATE-CONTAINING STRUCTURE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은, 폴리히드록시알카노에이트 생합성반응이 초래된 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 기재에 고정화하고, 폴리히드록시알카노에이트를 합성하기 위하여 효소를 사용하여 3-히드록시아실 조효소 A를 중합함으로써 폴리히드록시알카노에이트로 기재의 적어도 일부를 피복하는 단계를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 포함하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 기재에 고정화함으로써 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 폴리히드록시알카노에이트, 기재 및 해당 기재의 적어도 일부를 피복하는 폴리히드록시알카노에이트를 기재에 고정화한 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 가지는 구조체에 관한 것이다. 본 발명의 구조체는, 폴리히드록시알카노에이트가 입상의 기재위에 피복된 입상의 구조체와, 평판 또는 막형상의 기재의 적어도 일부가 폴리히드록시알카노에이트로 피복된 평판 또는 막형상의 구조체를 포함한다.
본 발명의 구조체는 작용기구조체로서 응용의 넓은 범위를 발견할 수 있다. 예를 들면, 피막구조체는 뛰어난 분산안정성의 안료분산제 및 뛰어난 정전특성의 전자사진용 토너 등의 각종 작용기구조체로서 다수의 응용을 가질 수 있고, 또한 OHP필름과 전자장치를 포함하는 각종 작용기로서 적층구조체를 가질 수 있다.
고분자재료는 현대 산업 및 실생활에 필수적이다. 저가이고 경량이고 양호한 성형성을 가진 재료는, 가정용 전기기구를 위한 박스뿐만 아니라 패키징재료와 완충재료 또는 파이버재료로서 널리 이용된다. 한편, 액정재료 및 피복제 등의 다양한 기능 재료는 이들 고분자재료의 안정한 특성을 이용함으로써 또한 얻을 수 있고, 이에 의해 고분자의 분자 사슬에 각종 기능을 나타내는 치환기를 위치시킨다. 이들 기능 재료는 구조재료용의 고분자보다도 부가가치가 높고, 따라서 소량으로도 대형 시장수요를 가지는 것을 기대할 수 있다. 이들 작용기 고분자재료는, 고분자의 합성공정에서 유기, 합성 화학적 방법에 의해 또는 치환기를 가진 합성된 고분자를 수정함으로써 지금까지 제조되어 왔다. 기능성 고분자재료를 위한 기본 골격의 고분자는 대부분의 경우에 유기, 합성화학적 방법에 의해 원료에 기인한 석유로부터 얻었다. 이들 고분자의 대표적인 예는, 폴리에틸렌, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리(염화비닐) 및 폴리아크릴아미드를 포함한다.
또한, 본 발명자들은 고분자화합물에 많은 부가가치를 부여하기 위한 기재로서 고분자화합물로 피복되는 구조체의 기재를 다층구조체에 초점을 맞추었다. 매우 유용한 기능성의 복합구조체는 고분자화합물로 특정 기재를 피복함으로써 얻을 수 있다.
기재를 피복하기 위하여 이용되는 고분자화합물은 종래와 같이 합성되고 유기합성공정에 의해 구조체를 만들고, 다음에 다양한 기능이 그들에 부가되어 있지만, 최근에 생명공학적 수법에 의한 고분자화합물을 제조하는 연구가 활발하게 행해지고 있고, 그 일부는 실용화되어 있다. 공지된 예는, 폴리-3-히드록시-n-부티르산(이하 PHB로 약칭)이나, 3-히드록시-n-부티르산과 3-히드록시-n-발레르산과의 공중합체(이하, PHB/V) 등의 폴리히드록시알카노에이트(이하, PHA라 약칭할 경우도 있음)로부터 유래된 고분자화합물과, 박테리아 셀룰로스와 풀루란 등의 다당류 및 폴리--글루타민산과 폴리리신 등의 폴리아미노산을 포함한다. 특히, PHA는 종래의 플라스틱과 마찬가지로 용융가공 등에 의해 각종 제품에 이용될 수 있고, 뛰어난 생체적합성을 나타내고, 따라서 의료용 유연성 재료를 포함하는 응용도 기대되고 있다.
최근에, 상기의 PHB합성효소 또는 PHA합성효소를 균체로부터 인출하여, 생체외(in vitro)에서 PHA를 합성하는 것이 시도되고 있다.
예를 들면, 문헌「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6279-6283(1995)」에서는, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)로부터 유래된 PHB합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써, 3-히드록시-n-부티르산 유닛으로 이루어진 PHB의 합성에 성공한 것이 보고되어 있다. 또한, 문헌「Int. J. Biol. Macromol., 25, 55-60 (1999)」에서는, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)로부터 유래된 PHB합성효소에, 3-히드록시부티릴 CoA 또는 3-히드록시발레릴 CoA를 작용시킴으로써, 3-히드록시-n-부티르산 유닛 또는 3-히드록시-n-발레르산 유닛으로 이루어진 PHA의 합성에 성공하는 것이 보고되어 있다. 또한, 이 보고서에서, 라세미 3-히드록시부티릴 CoA를 효소에 반응시키는 경우에, 효소의 입체선택성에 기인하여, (R)-3-히드록시-n-부티르산 유닛만으로 이루어진 PHB가 합성된다. 문헌「Macromol. Rapid Commun., 21, 77-84 (2000)」에는, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 유래의 PHB합성효소를 이용한 생체외의 PHB의 합성이 보고되고 있다.
또한, 문헌「FEMS Microbiol. Lett., 168, 319-324 (1998)」에는, 크로마티움 비노삼(Chromatium vinosum) 유래의 PHB합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써, 3-히드록시-n-부티르산 유닛으로 이루어진 PHB의 합성에 성공한 것이 보고되어 있다.
문헌「Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43 (2000)」에는, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 PHA합성효소에 3-히드록시데카노일 CoA를 작용킴으로써, 3-히드록시데칸산 유닛으로 이루어진 PHA를 합성하는 것이 보고되어 있다.
상기 설명한 바와 같이, 생명공학적 수법을 고분자화합물의 합성에 적용시킴으로써, 종래의 유기합성법에 의한 합성에서는 실현이 곤란하였던 신규 고분자화합물을 합성할 수 있고, 신규한 기능 및 구조체의 부여가 가능해진다. 또한, 종래의 유기 합성 화학법은 다단계의 제조공정을 요구하지만, 생명공학법은 많은 경우에 1단계만을 필요로 하고, 따라서 제조공정을 단순화하고, 비용을 절감하고 정비시간을 단축하는 것이 기대된다. 또한, 상기 방법은, 유기용매, 산을 감소시키는 것이 가능하고, 알킬, 계면활성제 등은 무당계 원료 및 저정제 원료로부터 목표재료를 합성하고 온화한 반응조건을 설정하고, 이에 의해 낮은 환경적 부하 및 자원순환형의 합성공정을 실현할 수 있다. 또한, 저순도원료의 합성의 보다 상세한 설명을 위하여, 생명공학적 합성공정은 일반적으로 효소 또는 촉매의 기질특이성이 높으므로, 저순도의 재료가 사용되어도 선택적으로 처리하기 위한 목표반응을 허용하고, 따라서 폐기물의 사용과 원료의 재활용을 가능하게 한다.
한편, 상기 설명한 바와 같이, 본 발명자들은, 고분자화합물에 큰 부가가치를 부여하기 위한 하나의 요소로서, 고분자화합물로 기재를 피복함으로써 제조된 구조체에 초점을 맞추었다. 이와 같이 고분자화합물에 의한 특정 기재의 피복은, 매우 유용한 기능성을 가진 복합구조체를 제공할 수 있다. 특히, 이러한 구조체는 상기 설명한 바와 같이 생명공합적 접근에 의해 제조될 수 있으면, 종래의 유기합성법에서는 실현하기 곤란하였던 신규의 고분자 화합물의 이용이나 새로운 기능·구조체의 부여가 가능한 것으로 기대할 수 있고, 이에 의해 환경부가가 낮고 자원순환형의 제조공정을 저비용으로 실현할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 생물의 촉매작용에 특유의 극히 엄밀한 분자인식이나 입체선택성을 이용해서, 종래의 유기합성화학적 수법에서는 실현이 고란하였던 새로운 기능성 고분자화합물이나, 극히 키랄성이 높은 고분자화합물에 의해 피복된 캡슐구조체나 적층구조체를, 극히 간편하고 환경부하가 낮은 프로세스로 제조하는 것이 가능해진다.
따라서, 본 발명의 목적은, 생명공학적 수법을 이용한 고분자화합물구조체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이고, 보다 상세하게는, PHB합성효소 또는 PHA합성효소를 균체 밖으로 인출해서, 생체외(in vitro)에서 PHA를 합성함으로써, PHA에 의해서 기재를 피복한 구조체를 제조하도록 하는 경우에, 보다 효율적인 효소의 이용방법을 제공하는 것에 있다. 또, 본 발명의 다른 목적은, 기능성 복합구조체로서 광범위하게 이용될 수 있는 고분자화합물로 기재를 피복한 구조체 및 그의 효율적인 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 기재에 대해서 결합능을 지닌 펩티드의 아미노산서열을 펩티드 라이브러리로부터 스크리닝하고, 이 아미노산 서열의 펩티드를, 유전자 공학적 수법을 이용해서 PHA합성효소에 융합시켜서 제시시킨 바, 해당 PHA합성효소를 효과적으로 기재 표면에 고정화하는 것이 가능하고, 여기에 3-히드록시아실 조효소 A를 첨가해서 합성반응을 행하면, 해당 기재를 소망의 PHA로 효율적으로 피복하는 것이 가능한 것을 발견하여, 본 발명을 완성하는데 이르렀다. 다시 말하면, 본 발명은, 폴리히드록시알카노에이트에 의해서 기재의 적어도 일부가 피복된, 폴리알카노에이트를 함유하는 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이고, 또한 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 해당 기재에 고정화하는 공정과, 효소의 기질로 되는 3-히드록시아실 조효소 A를 첨가하는 공정을 포함하는 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 기재의 표면위에 PHA합성효소를 효과적으로 고정화할 수 있고, 따라서, 3-히드록시아실 조효소 A의 첨가에 의해 합성반응이 행해지는 경우에, 독립한 PHA입자가 생성되지 않아, 기재표면을 효과적으로 PHA로 피복할 수 있다.
본 발명에 관련된 구조체는, 기재표면의 적어도 일부가 PHA로 피복된 구조체를 가지고, 또한 기재전체가 PHA층으로 피복된 경우에는, 기재를 핵으로 하는 피막구조체를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, PHA로 피복되는 기재에 대하여는, PHA합성효소를 고정화할 수 있으면, 일반적인 고분자화합물이나 수지, 유리 또는 금속 등의 무기고체재료를 필요에 따라 선택해서, 이용할 수 있다. 또, 기재의 종류 또는 구조체는 필요에 따라 선택될 수 있고, PHA합성효소를 고정하는 방법, 제조된 구조체의 적용의 형태에 따라 이용된다.
입상의 기재(코어)의 예는, 스티렌, α-메틸스티렌, β-메틸스티렌, o-메틸스티렌, m-메틸스티렌, p-메틸스티렌, 2,4-디메틸스티렌, p-n-부틸스티렌, p-tert-부틸스티렌, p-n-헥실스티렌, p-n-옥틸스티렌, p-n-노닐스티렌, p-n-데실스티렌, p-n-도데실스티렌, p-메톡시스티렌 및 p-페닐스티렌 등의 스티렌계 중합성 모노머와, 메틸아크릴레이트, 에틸아크릴레이트, n-프로필아크릴레이트, 이소-프로필아크릴레이트, n-부틸아크릴레이트, 이소-부틸아크릴레이트, tert-부틸아크릴레이트, n-아밀아크릴레이트, n-헥실아크릴레이트, 2-에틸헥실아크릴레이트, n-옥틸아크릴레이트, n-노닐아크릴레이트, 시클로헥실아크릴레이트, 벤질아크릴레이트, 디메틸포페이트 에틸아크릴레이트, 디에틸포스페이트 에틸아크릴레이트, 디부틸포스페이트 에틸아크릴레이트 및 2-벤조일옥시에틸아크릴레이트 등의 아크릴 중합성 모노머와, 메틸메타크릴레이트, 에틸메타크릴레이트, n-프로필메타크릴레이트, 이소-프로필메타크릴레이트, n-부틸메타크릴레이트, 이소-부틸메타크릴레이트, tert-부틸메타크릴레이트, n-아밀메타크릴레이트, n-헥실메타크릴레이트, 2-에틸헥실메타크릴레이트, n-옥틸메타크릴레이트, n-노닐메타크릴레이트, 디에틸포스페이트 에틸메타크릴레이트 및 디부틸포스페이트 에틸메타크릴레이트 등의 메타크릴 중합성 모노머와, 메틸렌 지방족 모노카르복실레이트와, 비닐아세테이트, 비닐프로피오네이트, 비닐벤조에이트, 비닐부틸에이트, 비닐벤조에이트 및 비닐포르메이트 등의 비닐에테르와, 비닐메틸에테르, 비닐에틸에테르, 비닐이소부틸에테르 등의 비닐에테르와, 비닐메틸케톤, 비닐헥실케톤, 비닐이소프로필케톤 등의 비닐케톤과 포함하는 비닐계 중합성 모노머로 구성되는 군으로부터 선택된 중합성 모노머를 중합시킴으로써 제조된 수지미립자와; 극성기와 착색제의 고분자 등의 각종 첨가제를 상기 설명한 모노머에 첨가함으로써 제조된 수지미립자와; 파라핀왁스, 폴리올레핀왁스, 피처 트롭시(Fischer Tropshch) 왁스, 아미드왁스, 고지방산, 에스테르왁스, 그 유도체, 그 그래프트화합물 및 그 블록화합물을 포함하는 미립자와; 카올리나이트, 벤토나이트, 활석, 운모 등의 점토광물과; 알루미나와 티타늄 디옥사이드 등의 산화금속과; 실리카겔, 히드록시아파타이트, 칼슘포스페이트겔 등의 불용성 무기염과; 카본블랙, 구리옥사이드, 망간디옥사이드, 아니린블랙, 활성화카본, 비자성 페라이트, 매그니타이트 등의 블랙안료와; 크롬옐로우, 아연옐로우, 산화철옐로우, 카드뮴옐로우, 미네랄패스트옐로우, 니켈티타늄옐로우, 네부르옐로우, 나프톨옐로우S, 한자르옐로우G, 한자옐로우10G, 벤진옐로우G, 벤진옐로우GR, 퀴놀린옐로우레이크, 퍼머넌트옐로우NCG, 투르트라딘레이크 등의 옐로우안료와; 오렌지크롬, 몰리브덴오렌지, 퍼머넌트오렌지GTR, 피라졸오렌지, 불칸오렌지, 벤지딘오렌지G, 인단트렌 브릴리언트오렌지RK, 인단트렌 브릴리언트오렌지GK 등의 오렌지안료와; 레드산화철, 카드뮴레드리드, 머큐리술페이트, 카드뮴, 퍼머넌트레드4R, 리톨레드, 피라졸레드, 와칭레드, 칼슘염, 레이크레드C, 레이크레드D, 브릴리언트카민6B, 브릴리언트카민3B, 에옥신레이크, 로다민레이크B, 안리자린레이크 등의 레드안료와; 밀오리블루, 코발트블루, 알칼리블루레이크, 빅토리아블루레이크, 프탈로시아닌블루, 비금속 프탈로시아닌블루, 부분염화 프탈로시아닌블루, 패스트스카이블루, 인단트렌블루BC 등의 블루안료와; 망간바이올렛, 패스트바이올렛B, 메틸바이올렛레이크 등의 바이올렛안료와; 크롬옥사이드, 크롬그린, 안료그린B, 맬러카이트그린레이크, 파이널옐로우그린G 등의 그린안료와; 아연화이트, 티타늄옥사이드, 안티모니화이트, 아연술페이트 등의 화이트안료와; 산화바륨분말, 바륨카보네이트, 클레이, 실리카, 화이트카본, 활석, 알루미나화이트 등의 체질안료를 포함한다. 물론, 입상의 기재는 이들 물질에 한정되지 않는다. 필요에 따라, 이들 물질은 2종류이상의 물질의 조합에 이용할 수 있다. 기재의 형상은 필요에 따라 그 적용에 좌우하여 선택될 수 있고, 예를 들면 0.1㎛ 내지 1.0mm의 입자크기를 가진 입자를 이용하는 것이 양호하다.
또한, 기재의 다른 형태는, 폴리(에틸렌 테르에프탈레이트)(PET), 디아세테이트, 트리아세테이트, 셀로판, 셀룰로이드, 폴리카보네이트, 폴리이미드, 폴리비닐 클로라이드, 폴리(비닐리덴 클로라이드), 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 등의 플라스틱으로 이루어진 막과; 폴리(비닐클로라이드), 폴리(비닐알코올), 아세틸셀룰로오스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 테플론 등의 다공질 고분자막과; 목재판, 유리판, 실리콘기판, 면, 레이온, 아크릴, 실크, 폴리에스테르 등의 섬유와; 상질지, 중질지, 아트지, 본드지, 재생지, 산화바륨페이퍼, 주철피복페이퍼, 골판지, 수지피복페이퍼 등의 페이퍼를 포함한다. 물론, 기재는 이들 재료에 한정되지 않는다. 또한, 상기한 기재는, 그 표면이 평탄하거나 평탄하지 않은 경우에도, 또는 그것이 투명, 반투명, 불투명인 경우에도 허용될 수 있다. 또한, 상기한 기재의 2개이상의 재료를 다른 하나에 결합함으로써 이루어진 재료가 허용될 수 있다.
본 발명의 기재에 대해서 결합친화성을 가진 펩티드의 아미노산서열을 얻기 위하여, 이하 설명하는 파지 표시 펩티드 라이브러리(phage display peptide library)의 예를 이용할 수 있다. 파지 랜덤 펩티드 라이브러리의 형성에 대하여, 랜덤합성유전자는, 예를 들면 M13베이스 파지의 표면단백질(예를 들면, 유전자 III 단백질)의 N말단측 유전자에 연결된다. 그 방법은, Scott, Jk. 및 Smith 씨에 의해 보고되어 있고(문헌「GP., Science Vol. 249, 386, 1990」), Cwirla, SE 씨 등에 의해 보고되어 있다(문헌「Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 87, 6378, 1990」). 삽입되는 유전자의 크기는, 펩티드가 안정하게 발현되면 특별히 한정되지 않지만, 6 내지 40의 아미노산 개수에 대응(대략 600 내지 4000의 분자량에 대응)하는 크기는 형성된 라이브러리의 모든 랜덤 서열을 커버하기 위하여 적절하고, 7 내지 18의 아미노산에 대응하는 크기는 결합력을 가지도록 이들 서열을 위하여 적절하다. 목표기재에 대해서 결합되는 파지(phage)를 선택하기 위하여, 기재는, 예를 들면 기둥 또는 판에 고정되고, 또한 상기 언급한 라이브러리는 기재에 의해 접촉되고, 다음에 결합파지가 유지되지만 비결합파지는 세정된다. 세정후에 남겨진 파지는 산 등에 의해 용출되고, 용출액은 완충제로 중화되고, 다음에 파지는 그것을 증폭시키기 위하여 대장균에 혼합된다. 복수회의 이 선택의 반복은, 목표기재에 대해서 결합능을 지닌 복수의 클론을 집중시킨다. 이 때에, 단일의 클론을 얻기 위하여, 파지는 배양판위에 클로니를 만들기 위하여 대장균에 다시 혼합되게 한다. 각 단일의 클로니를 액체배지에서 배양한 후, 배지의 상청액에 존재하는 파지는 폴리에틸렌 클리콜 등에 의해 촉진 정제된다. 펩티드의 구조체는 이 염기서열의 분석에 의해 결정된다.
화학적으로 합성된 펩티드는 랜덤아미노산서열을 처리하는 펩티드 라이브러리의 형성을 위해 상기 파지가용법에 부가하여 사용될 수 있다. 상기 방법은, 예를 들면 비드를 이용하는 방법(문헌「Lam, KS et al., Nature, 354, 82, 1991」), 액체집중법(문헌「Houghton, RA et al., Nature, 354, 84, 1991」) 및 마이크로플레이트법(문헌「Fodor, SPA et al., Science, 251, 767, 1991」)을 포함하고, 이는 본 발명에 적용될 수 있다. 상기 설명한 방법에 의해 얻은 기재에 대해서 결합 친화성을 가진 펩티드의 아미노산서열은 통상의 유전공학법에 의해 폴리히드록시알카노에이트 합성효소로 서열을 융합함으로써 이용된다. 기재에 대해서 결합능을 지닌 펩티드는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 N말단 또는 C말단에 접속됨으로써 발현될 수 있다. 또는, 적합한 스페이서 서열은 펩티드를 발현시키기 위하여 삽입된다.
스페이서 서열은 대략 3 내지 400의 아미노산의 범위를 가지고, 서열은 어떤 아미노산을 함유해도 된다. 보다 바람직하게는, 스페이서 서열은, PHA합성효소의 작용을 방지하지 않거나 또는 기재에 PHA합성효소의 결합을 방해하지 않는 것이다.
〈PHA〉
본 발명에 이용가능한 PHA로서는, PHA의 생합성반응에 관련되는 PHA합성효소에 의해 합성될 수 있는 PHA이면, 특히 한정되지 않는다.
여기서, PHA의 생합성은, 원료인 알칸산으로부터, 생체내의 여러가지의 대사경로(예를 들면, β산화계나 지방산 합성경로)를 거쳐 생성된 (R)-3-히드록시아실 CoA를 기질로 사용한 효소에 의한 중합반응에 의해 행해진다. 이 중합반응을 촉매하는 효소가 PHA합성효소(PHA 폴리메라제, PHA 합성효소라고도 함)이다. "CoA"는 조효소 A(coenzyme A)의 약칭이며, 그 화학구조체는 다음과 같다.
β산화계 및 PHA합성효소에 의한 중합반응을 거쳐, 알칸산으로부터 PHA가 생성될 때까지의 반응을 이하에 나타낸다.
한편, 지방산 합성경로를 거치는 경우는, 해당 경로내에 생긴 (R)-3-히드록시아실-ACP(ACP는 아실 캐리어 프로테인을 의미함)로부터 변환된 (R)-3-히드록시아실 CoA를 기질로서 사용하고, 상기한 바와 마찬가지의 방식으로 PHA합성효소에 의해 PHA가 합성되는 것이 고려된다.
또한, 상기의 PHB합성효소 및 PHA합성효소를 균체의 외부로 인출하여, 생체외(in vitro)에서 PHA를 합성할 수 있는 것이 공지되어 있고, 이하와 같은 실례가 있다.
예를 들면, 문헌「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6279-6283(1995)」에서는, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)로부터 유래된 PHB합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써, 3-히드록시-n-부티르산 유닛으로 이루어진 PHB를 합성하는 것이 보고되어 있다. 또한, 문헌「Int. J. Biol. Macromol., 25, 55-60 (1999)」에서는, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)로부터 유래된 PHB합성효소에, 3-히드록시부티릴 CoA 또는 3-히드록시발레릴 CoA를 작용시킴으로써, 3-히드록시-n-부티르산 유닛 또는 3-히드록시-n-발레르산 유닛으로 이루어진 PHA의 합성에 성공하는 것이 보고되어 있다. 또한, 이 보고에 의하면, 라세미 3-히드록시부티릴 CoA를 효소에 반응시키는 경우에, (R)-3-히드록시-n-부티르산 유닛만으로 구성되는 PHB가 효소의 입체선택성에 기인하여 합성된다. 문헌「Macromol. Rapid Commun., 21, 77-84 (2000)」에는, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 유래의 PHB합성효소를 이용한 생체외의 PHB의 합성이 보고되고 있다. 또한, 문헌「FEMS Microbiol. Lett., 168, 319-324 (1998)」는, 크로마티움 비노삼(Chromatium vinosum) 유래의 PHB합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA를 작용시키는 것으로, 3-히드록시-n-부티르산 유닛으로 이루어진 PHB를 합성하는 것에 성공한 것이 보고되어 있다. 문헌「Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43 (2000)」에는, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 PHA합성효소에 3-히드록시데카노일 CoA를 작용시키는 것으로, 3-히드록시데칸산 유닛으로 이루어진 PHA를 합성하는 것이 보고되어 있다.
이 방식으로, PHA합성효소는, 생물체내에서의 PHA합성반응계에 있어서의 최종 단계를 촉매하는 효소이고, 생물체내에 있어 합성될 수 있는 것이 알려져 있는 모든 PHA는 이러한 효소의 촉매작용에 의해 합성된다. 따라서, 소망의 PHA에 대응하는 3-히드록시아실 CoA를, 본 발명에 있어서의 배지에 고정화된 상기 효소에 작용시키는 것에 의해, 생물체내에 있어 합성될 수 있는 것이 알려져 있는 모든 종류의 PHA로 안료를 피복한 피막구조체를 작성하는 것이 가능하다.
본 발명에 사용된 PHA의 구체적인 예로서는, 하기 식[1] 내지 식[10]으로 표시되는 단량체 유닛의 적어도 하나를 가지는 PHA를 예시할 수 있다:
(식중, 상기 단량체는, R1 및 a의 조합이 아래와 같은 조합:
R1이 수소원자(H)이고, a가 0 내지 10의 정수인 단량체,
R1이 할로겐원자이고, a가 1 내지 10의 정수인 단량체,
R1이 발색단이고, a가 1 내지 10의 정수인 단량체,
R1이 카르복실기 또는 그 염이고, a가 1 내지 10의 정수인 단량체,
R1이
이고, a가 1 내지 7의 정수인 단량체 중의 어느 것인 단량체 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나임);
(식중, b는 0 내지 7의 정수이고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
(식중, c는 1 내지 8의 정수이고, R3는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
(식중, d는 0 내지 7의 정수이고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
(식중, e는 1 내지 8의 정수이고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5 및 -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
(식중, f는 0 내지 7의 정수임);
(식중, g는 1 내지 8의 정수임);
(식중, h는 1 내지 7의 정수이고, R6는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2 및 -C(CH3)3으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3 및 -C2H5 중의 어느 것이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3 및 -OC2H5 중의 어느 하나임);
(식중, i는 1 내지 7의 정수이고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 것이고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3 및 -C2H5 중의 어느 것이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3 및 -OC2H5 중의 어느 하나임); 및
(식중, j는 1 내지 9의 정수임).
또한, 상기 설명한 할로겐원자의 예로서는, 불소, 염소, 브롬 등을 들 수 있다.
상기 PHA를 합성하는 기질로서 이용할 수 있는 3-히드록시아실 CoA의 구체적인 예로는, 하기 식[12] 내지 식[21]로 표시되는 3-히드록시아실 CoA를 예시할 수 있다:
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, R1 및 a의 조합이 상기 설명한 식[1]로 표시되는 단량체에 있어서의 R1 및 a의 조합과 마찬가지로 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, b 및 R2는 상기 설명한 식[2]로 표시되는 단량체에 있어서의 b 및 R2와 마찬가지로 각각 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, c 및 R3는 상기 설명한 식[3]으로 표시되 단량체에 있어서의 c 및 R3와 마찬가지로 각각 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, d 및 R4는 상기 설명한 식[4]로 표시되는 단량체에 있어서의 d 및 R4와 마찬가지로 각각 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, e 및 R5는 상기 설명한 식[5]로 표시되는 단량체에 있어서의 e 및 R5와 마찬가지로 각각 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, f는 상기 설명한 식[6]으로 표시되는 단량체에 있어서의 f와 마찬가지로 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, g는 상기 설명한 식[7]로 표시되는 단량체에 있어서의 g와 마찬가지로 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, h 및 R6는 상기 설명한 식[8]로 표시되는 단량체에 있어서의 h 및 R6와 마찬가지로 각각 정의됨);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, i 및 R7는 상기 설명한 식[9]로 표시되는 단량체에 있어서의 i 및 R7와 마찬가지로 각각 정의됨); 및
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, j는 상기 설명한 식[10]으로 표시되는 단량체에 있어서의 j와 마찬가지로 정의됨).
또한, PHA함유 구조체에 있어서 기재의 표면이 친수성인 경우에, PHA함유 구조체를 구성하는 PHA로서, 친수성 작용기를 가진 PHA를 이용한다. 친수성 작용기로서는 어떠한 것이라도 사용되어도 되지만, 음이온성 작용기를 이용할 수 있고, 음이온성 작용기로서는 어떠한 것을 이용해도 되지만, 특히 카르복실기를 이용할 수 있다. 카르복실기를 가지는 PHA로서는, 하기 식[11]로 표시되는 단량체 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나로 구성된 PHA를 예시할 수 있다:
(식중, k는 1 내지 10의 정수임).
또한, 상기 PHA의 구체적인 예는, 식[23]으로 표시되는 3-히드록시피멜산을 함유하는 PHA를 예시할 수 있다:
.
또한, 상기 식[11]로 표시되는 PHA를 합성하는 기질로서 이용된 3-히드록시아실 CoA로서, 하기 식[22]로 표시되는 3-히드록시아실 CoA를 예시할 수 있다:
(식중, SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, k는 상기 설명한 식[11]로 표시되는 단량체에 있어서의 k와 마찬가지로 정의됨).
또한, 상기 식[23]으로 표시되는 3-히드록시피멜산을 함유하는 PHA를 합성하는 기질로서 이용하는 3-히드록시아실 CoA는, 하기 식[24]:
로 표시되는 3-히드록시피멜릴 CoA를 들 수 있다.
또한, 상기 설명한 할로겐원자의 구체적인 예로서는, 불소, 염소, 브롬 등을 들 수 있다. 또한, 상기 설명한 발색단으로서는, 그 3-히드록시아실 CoA체가 PHA합성효소의 촉매작용에 의해 영향을 받는 한 특히 한정은 되지 않지만, 고분자 합성시의 입체장애 등을 고려하면, 3-히드록시아실 CoA 분자내에 있어, CoA가 결합한 카르복실기와 발색단사이에 1 내지 5의 탄소원자를 가진 메틸렌사슬이 있는 것이 바람직하다. 또한, 발색단의 광흡수파장이 가시영역이면, 착색된 PHA함유 구조체를 얻을 수 있다. 이러한 발색단의 예로서는, 니트로소, 니트로, 아조, 디아릴메탄, 트리아릴메탄, 크산텐, 아크리딘, 퀴놀린, 메틴, 티아졸, 인다민, 인도페놀, 락톤, 아미노케톤, 히드록시케톤, 스틸벤, 아진, 옥사진, 티아진, 안트라퀴논, 프탈로시아닌 및 인디고이드 등을 포함한다.
본 발명에 이용되는 PHA로서는, 상기 설명한 복수의 단량체를 포함한 랜덤공중합체나 블록공중합체를 이용해도 되고, 이에 의해 각 단량체에 포함되는 작용기의 특성을 이용하여 PHA의 물성 제어나 PHA에 복수의 기능의 부여, 작용기사이의 상호작용을 이용한 새로운 기능의 발현 등이 가능해진다. 또한, 기질인 3-히드록시아실 CoA의 첨가량이나 첨가순서를 적절하게 선택함으로써, 임의의 순서 및 조성배의 블록공중합체를 기재의 표면에 합성하는 것도 가능하다. 또한, 필요에 따라, 화학수식 등은 PHA의 합성시나 또는 후에 실시해도 된다.
기질인 3-히드록시아실 CoA의 종류나 농도 등의 조성이 시간이 경과함에 따라 변화함으로써 외측으로의 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 적층방향으로 PHA의 단량체조성을 변화시킬 수 있다. 이에 의해, 기재와 친화성이 낮은 PHA로 피복구조체를 형성할 필요가 있는 경우, 우선 기재를 해당 기재와 친화성이 높은 PHA로 피복하고, 그 기재와 친화성이 높은 PHA의 단량체조성을, 목적으로 하는 PHA의 단량체조성을 적층방향으로 변화시켜서 예를 들면 다층구조체 또는 그래디언트구조체로 할 수 있고, 이에 의해 기재와의 결합을 강고하게 한 PHA피막을 형성하는 것이 가능해진다.
또한, PHA의 화학수식은 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 개선된 특성을 제공할 수 있다. 예를 들면, PHA에 그래프트사슬의 도입은, 기재의 적어도 일부가 상기 그래프트사슬에 기인하는 특성을 갖춘 PHA로 피복되는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제공할 수 있다. 또한, PHA의 가교는, 기재의 적어도 일부가 물리화학적 특성(예를 들면, 기계적 강도, 내약품성 및 내열성)이 다양한 PHA로 피복되는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제공할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "화학수식"은 고분자물질의 분자내 또는 분자간 화학반응을 행하거나, 또는 고분자물질과 다른 화학적인 것 사이의 화학반응을 행함으로써 고분자물질의 분자구조체를 변질시키는 것을 의미한다. 용어 "가교"는 망구조체를 형성하기 위하여 고분자물질의 분자내 또는 분자간 결합을 화학적으로 또는 물리화학적으로 만드는 것을 의미한다. 또한, 가교제(crosslinking agent)란, 상기 가교반응을 행하기 위하여 첨가되는, 상기 설명한 고분자물질과 일정한 반응성을 가진 물질을 의미한다.
또한, 본 발명에 의한 구조체에 이용된 PHA합성효소에 의해 합성되는 PHA는, 일반적으로 R-구성만으로 구성되는 동일서열 고분자이다.
PHA의 합성기질인 3-히드록시아실 CoA는, 효소를 이용한 생체외(in vitro)합성법, 미생물이나 식물 등의 생물체를 이용한 생체내(in vivo)합성법, 화학합성법등 중에서 적절하게 선택한 방법을 이용해 합성할 수 있다. 특히, 효소합성법은 상기 기질의 합성에 일반적으로 이용되고 있는 방법이고, 시판의 아실 CoA 합성효소(아실 CoA 리가제, E.C. 6.2.1.3)을 이용한 하기 반응,
아실 CoA 신타제
3-히드록시알칸산 + CoA → 3-히드록시아실 CoA
을 이용한 방법 등이 알려져 있다(문헌「(Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)」; 문헌「Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43 (2000)」등). 효소나 생물체를 이용한 합성공정에는, 배치식의 합성방법을 이용해도 되고, 또는 고정화 효소나 고정화 세포를 이용해 연속 생산해도 된다.
〈PHA합성효소 및 그 생산균〉
본 발명에 이용하는 PHA합성효소는, 상기 효소를 생산하는 미생물로부터 적절하게 선택된 미생물, 또는 그것들 미생물의 PHA합성효소유전자를 숙주미생물에 도입한 형질전환체에 의해 생산된 것을 이용할 수 있다.
PHA합성효소를 생산하는 미생물로서는, PHB나 PHB/V생산균을 이용할 수 있고, 또한 이러한 균으로서, 아에로모나스속(Aeromonas sp.), 알카리게네스속(Alcaligenes sp.), 크로마티움속(Chromatium sp.), 코마모나스속(Comamonas sp.), 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 파라콕카스속(Paracoccus sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) 등 외에, 본 발명자 등에 의해 분리된, 바크홀데리아 세파시아 KK01균주(Burkholderia cepacia KK01), 랄스토냐 유트로파 TB64균주(Ralstonia eutropha TB64), 알카리게네스속 TL2균주(Alcaligenes sp. TL2) 등을 이용할 수 있다. 또한, KKO1균주는 기탁번호 FERM BP-4235로서, TB64균주는 기탁번호 FERM BP-6933으로서 또한 TL2균주는 기탁번호 FERM BP-6913으로서, 경제산업성 생명공학 공업기술연구소 특허미생물 기탁센터에 각각 기탁되어 있다.
또한, PHA합성효소를 생산하는 미생물로서, mcl-PHA나 unusual-PHA의 생산균을 이용할 수 있고, 또한 이러한 균으로서 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleoborans), 슈도모나스 레지노보란스(Pseudomonas resinovorans), 슈도모나스속 61-3균주(Pseudomonas sp. 61-3), 슈도모나스 푸티다 KT2442균주(Pseudomonas putida KT2442), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외에, 본 발명자들에 의해 분리된, 슈도모나스 푸티다 P91균주(Pseudomonas putida P91), 슈도모나스 치코리이 H45균주(Pseudomonas cichorii H45), 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichorii YN2), 슈도모나스 제세니이 P161균주(Pseudomonas jessenii P161) 등의 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)의 미생물이나, 일본국 특개평 2001-78753호 공보에 기재의 바크홀데리아속 0K3균주(Burkholderia sp. OK3)(FERM P-17370), 일본국 특개평 2001-69968호 공보에 기재의 바크홀데리아속 OK4균주(Burkholderia sp. OK4)(FERM P-17371) 등의 바크홀데리아속(Burkholderia sp.)의 미생물을 이용할 수 있다. 또한, 이들 미생물이외에, 아에로모나스속(Aeromonas sp.), 코마모나스속(Comamonas sp.) 등에 속하고, mcl-PHA나 unusual-PHA를 생산하는 미생물을 또한 이용할 수 있다.
또한, P91균주는 기탁번호 FERM BP-7373으로서, H45균주는 기탁번호 FERM BP-7374로서, YN2균주는 기탁번호 FERM BP-7375로서 또는 P161균주는 기탁번호 FERM BP-7376으로서, 특허절차를 위해 미생물의 기탁의 국제인정에 관한 부다페스트조약에 의거하여 산업기술종합연구소의 국제기탁기관(통상 산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소)에 기탁되었다.
본 발명에 의한 PHA합성효소의 생산에 이용된 미생물의 통상의 배양, 예를 들면, 보존균주의 작성, PHA합성효소의 생산에 필요한 균수나 활성상태를 확보하기 위한 증식 등에는, 이용된 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택해 이용한다. 예를 들면, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치는 것이 아닌 한, 일반적인 천연배지(육즙 배지, 효모추출물 등)나, 영양원을 첨가한 합성배지 등, 어떠한 종류의 배지도 이용할 수 있다.
배양으로서는, 액체배양이나 고체배양 등, 상기 미생물이 증식하는 방법이면 어떠한 방법도 이용할 수 있다. 또한, 배치(batch)배양, 페드배치(fed-batch)배양, 반연속배양 및 연속배양 등의 종류에 상관없이 행해져도 된다. 액체배치배양의 형태로서는, 진탕 플라스크에 의해 진탕시켜 산소를 공급하는 방법 및 단지발효기에 의한 교배환기방식의 산소공급방법이 있다. 또한, 이러한 복수의 공정을 접속한 다단방식을 채용해도 된다.
상기 설명한 바와 같은 PHA생산미생물을 이용하여 PHA합성효소를 생산하는 경우에, 예를 들면 옥탄산이나 노난산 등의 알칸산을 포함한 무기배지에서 상기 미생물을 증식시키고, 대수증식상으로부터 고정상의 초기에 걸친 미생물을 원심분리 등으로 회수하여, 소망의 효소를 추출하는 방법 등을 이용할 수 있다. 상기 설명한 바와 같은 조건으로 배양을 실시하면, 첨가한 알칸산에 유래하는 mcl-PHA가 미생물내에 합성되지만, 이 경우에, 일반적으로, PHA합성효소는 미생물내에 형성되는 PHA의 미립자에 결합해 존재한다고 여겨지고 있다. 그러나, 본 발명자들의 검토에 의하면, 상기의 방법으로 배양한 균체의 파쇄액을 원심분리한 상청에도, 상당 정도의 효소활성이 존재하고 있는 것을 알 수 있다. 이것은, 상기 설명한 바와 같이 대수증식상에 고정상의 초기단계까지 걸친 비교적 배양초기에는, 세포내에서 상기 효소가 활발하게 생산되고 있으므로, 유리상태의 PHA합성효소도 상당 정도 존재하기 때문이라고 추정된다.
상기 배양방법에 이용하는 무기배지로서는, 인원(예를 들면, 인산염), 질소원(예를 들면, 암모늄염 또는 질산염) 등, 미생물이 증식할 수 있는 성분을 포함하고 있는 한, 어떤 배지이어도 되고, 또한 무기배지의 예로서는, MSB배지, E배지(문헌「J. Biol. Chem., 218, 97-106 (1956)」) 및 M9배지 등을 포함해도 된다. 또한, 본 발명에 사용된 M9배지의 조성은 이하와 같다.
Na2HPO4 : 6.2 g
KH2PO4 : 3.0 g
NaCl : 0.5 g
NH4Cl : 1.0 g
(배지 1리터 중, pH 7.0)
또한, 미생물의 양호한 증식 및 PHA합성효소의 생산을 행하기 위하여, 상기의 무기배지에 이하에 나타내는 미량성분용액을 0.3%(v/v) 정도 첨가하는 것이 바람직하다.
(미량성분용액)
니트릴로트리아세트산 : 1.5 g
MgS04 : 3.0 g
MnS04 : 0.5 g
NaCl : 1.0 g
FeS04 : 0.1 g
CaCl2 : 0.1 g
CoCl2 : 0.1 g
ZnS04 : 0.l g
CuS04 : 0.1 g
AlK(S04)2 : 0.1 g
H3B03 : 0.1 g
Na2MoO4 : 0.1 g
NiCl2 : 0.1 g
(배지의 1리터중)
배양온도는, 상기 미생물이 양호하게 증식가능한 한 온도면 되고, 예를 들면, 14 내지 40℃이고, 20 내지 35℃가 바람직하다.
또한, 상기 PHA생산균의 PHA합성효소유전자를 가진 형질전환체를 이용하여 소망의 PHA합성효소를 생산하는 것이 가능하다. PHA합성효소유전자의 클로닝, 발현벡터의 제작 및 형질전환체의 제작은, 정법에 따라 실시할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로서 얻은 형질전환체에 대해서는, 배양에 이용된 배지로서 천연배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 포함한다. 배양온도는, 25 내지 37℃의 범위내에 있다. 또한, 호기성배양이 8 내지 27시간동안 행해지고, 이에 의해 미생물이 증식된다. 다음에, 세포는 세포내에 축적된 PHA합성효소를 회수하기 위하여 회수될 수 있다. 필요에 따라, 카나마이신, 암피실린, 테트라시클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질이 배지에 첨가된다. 또한, 유도촉진제가 발현벡터에 사용된 경우에, 촉진제에 대응하는 유도물질은 촉진발현 위하여 형질전환체의 배양시에 배지에 첨가해도 된다. 유도물질의 예는, 이소프로필-l-티오-β-디-갈락토시드(IPTG), 테트라시클린 및 인돌아크릴산(IAA) 등을 포함한다.
PHA합성효소로서는, 미생물의 세포의 파쇄액이나, 황산암모늄 등에 의해 단백질성분을 침전회수하여 얻은 술페이트염 암모늄 등의 결점효소를 이용해도 되고, 또는 각종 방법으로 정제한 효소를 이용해도 된다. 필요에 따라, 상기 효소에는 금속염, 글리세린, 디티오트레이톨, EDTA 및 소혈청알부민(BSA) 등의 안정화제 및 활성제를 첨가해도 된다.
PHA합성효소의 분리 및 정제에는, PHA합성효소의 효소활성이 보관유지되는 방법이면 어떠한 방법도 이용할 수 있다. 예를 들면, 얻은 미생물의 세포를, 프렌치 프레스, 초음파파쇄기, 리소자임 또는 각종 계면활성제 등을 이용해 파쇄하고, 다음에, 원심분리에 의해 얻은 파쇄효소액 또는 조제된 술페이트염 암모늄을, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환크로마토그래피 또는 겔여과 등의 수단을 단독 또는 조합함으로써 처리하고, 이에 의해 정제효소를 얻을 수 있다. 특히, 유전자재조합단백질은, N말단이나 C말단에 히스티딘 잔여물 등의 "태그"를 결합한 융합단백질의 형태로 발현시켜, 이 태그를 통해서 친화성 수지에 결합시킴으로써, 보다 간단하게 정제할 수 있다. 융합단백질로부터 소망의 단백질을 분리하기 위하여, 트롬빈, 혈액응고인자 Xa 등의 프로테아제로 절단, pH의 저하 및 결합경합제로서 고농도의 이미다졸을 첨가 등의 방법을 이용하는 것이 양호하다. 또는, 발현벡터로서 pTYB1(New England Biolab사 제품)을 이용한 경우와 마찬가지로 태그가 인테인을 포함한 경우는, 디티오트레이톨 등으로 환원조건하에 결합의 절단을 행한다. 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 허용하는 융합단백질에는, 히스티딘 태그 이외에 글루타치온-S-트랜스페라제(GST), 키틴결합도메인(CBD), 말토스결합단백질(MBP) 및 티오레독신(TRX) 등도 공지되어 있다. GST융합단백질은, GST 친화성 수지에 의해 정제할 수 있다.
PHA합성효소의 활성측정은, 이미 공지된 각종 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면, 3-히드록시아실 CoA가 PHA합성효소의 촉매작용에 의해 PHA로 중합된 과정에서 방출되는 CoA를, 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)으로 발색시켜서 측정하는 것을 측정원리로 하는, 이하에 나타내는 방법에 따라 활성화를 측정할 수 있다. 시약 1: 소혈청알부민(시그마사 제품)을 0.1M 트리스 염산버퍼(pH 8.0)에 3.0mg/㎖의 농도로 용해, 시약 2: 3-히드록시옥타노일 CoA를 0.1M 트리스 염산버퍼(pH 8.0)에 3.0mM의 농도로 용해, 시약 3: 트리클로로아세트산을 0.1M 트리스 염산버퍼(pH 8.0)에 10mg/㎖의 농도로 용해, 시약 4: 5,5'-디티오비스-(2-니트로 벤조산)을 0.1M 트리스 염산버퍼(pH 8.0)에 2.0mM의 농도로 용해. 제 1반응(PHA합성반응): 시료(효소)용액 100㎕에 시약 1을 100㎕ 첨가하여 혼합하고, 30℃로 1분간 프리인큐베이트한다. 여기에, 시약 2를 100㎕ 첨가하여 혼합하고, 30℃로 1 내지 30분간 인큐베이트한 후, 시약 3을 첨가하여 반응을 중지시킨다. 제 2반응(유리 CoA의 발색반응): 반응 중지한 제 1반응액은 원심분리(15,000×g, 10분)를 하고, 이 용액의 상청액 500㎕에 시약 4를 500㎕ 첨가하고, 또한 30℃로 10분간 인큐베이트한 후, 412nm의 흡광도를 측정한다. 효소활성의 산출: 1분 당 1μ몰의 CoA를 방출시키는 효소량을 1단위(U)로 한다.
〈구조체의 제조〉
본 발명의 폴리히드록시알카노에이트를 함유하는 구조체를 제조하는 방법의 일례로서는, (1) 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 PHA합성효소를 기재에 고정화하는 공정, (2) 3-히드록시아실 CoA 또는 기질을 첨가하는 공정, (3) PHA 합성반응을 행하는 공정, (4) 필요에 따라, 적용에 좌우하여, 폴리히드록시알카노에이트를 함유하는 구조체, 폴리히드록시알카노에이트로 피복되는 구조체를 처리하는 공정을 적어도 가지는 방법을 예시할 수 있다.
본 발명의 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열은 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해 결정된 아미노산서열, 또는 기재의 화학적 성질에 의해 합리적으로 설계된 아미노산서열이다.
본 발명의 랜덤 펩티드 라이브러리는, 랜덤펩티드가 가용성 형태로 화학적으로 합성된 랜덤 합성 펩티드 라이브러리와, 펩티드가 수지비드에서 합성된 고체상 고정펩티드 라이브러리와, 화학적으로 합성된 랜덤서열의 DNA가 생체외 리보솜으로 생합성된 펩티드 라이브러리와, 예를 들면 랜덤합성유전자가 M13베이스파지의 표면단백질(예를 들면, 유전자 III단백질)에 연결된 파지표시 펩티드 라이브러리와, 상기 설명한 방법과 마찬가지로, 미생물의 멤브레인 단백질, Omp A(문헌「Francisco et al., 1993, PNAS, 90, 104444-10448, or Pistor and Hoborn, 1989, Klin. Wochenschr., 66, 110-116」), PAL(문헌「Fuchs et al., 1991, Bio/Technology, 9, 1369-1372」), Lamb(문헌「Charbit et al., 1988, Gene, 70, 181-189 and Bradbury et al., 1993, Bio/Technology, 1565-1568」), fimbrin(문헌「Hedegaard and Klemm, 1989, Gene, 85, 115-124, and Hofnung, 1991, Methods Cell Biol, 34, 77-105」) 및 IgA 프로테아제 β도메인(문헌「Klauser et al., 1990, EMBO J., 9, 1991-1999」가 융합되고 존재하는 랜덤 펩티드 라이브러리를 포함한다.
화학적인 합성펩티드 라이브러리가 이용되는 경우에, 이들 랜덤 펩티드 라이브러리에 의해 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열의 스크리닝의 방법은, 기재와 접촉하도록 펩티드 라이브러리를 초래하는 공정과, 기재에 대해서 결합능을 지니지 않는 펩티드를 제거하는 공정과, 기재에 대해서 결합하는 펩티드를 회수해서, 에드만 분해 등을 이용하여 아미노산서열을 결정하는 공정을 포함한다.
한편, 파지표시 펩티드 라이브러리를 이용하는 경우에, 기재가 입자형상이면, 또는 기재가 평판이면 기재는 컬럼 또는 평판에 고정되고, 상기 설명한 라이브러리는 접촉을 위하여 기재표면위에 직접 첨가되고, 다음에 결합파지가 유지되고 비결합파지가 세정된다. 세정후 남겨진 파지는 산 등에 의해 용출된다. 완충제로 중화한 후에, 파지는 대장균에 혼합되어 그것을 증폭시킨다. 이 선택의 복수회의 반복은, 목표 기재에 대해서 결합능을 지닌 복수의 클론에 집중된다. 이 때에, 단일 클론을 얻기 위하여, 파지는 배양플레이트위에 클로니를 만들기 위하여 대장균에 다시 혼합하게 한다. 각 단일의 클로니가 액체배지에서 배양된 후, 배지의 상청에 존재하는 파지는 폴리에틸렌 글리콜 등으로 정제된 침전물이다. 펩티드의 구조체는 이 염기서열의 분석에 의해 결정된다.
파지표시 펩티드 라이브러리에 의해 기재에 대해서 결합능을 지닌 펩티드의 스크리닝은, 기재에 더 강고하게 결합된 파지가 농축되는 작용, 소위 패닝(panning)을 포함하여 확실한 펩티드후보가 되도록 본 발명을 위하여 적절하게 사용될 수 있다. 파지랜덤 펩티드 라이브러리를 형성하는 방법은, 예를 들면 M13베이스파지의 표면단백질(예를 들면, 유전자 III단백질)의 N말단측 유전자에 랜덤합성유전자를 결합하는 공정을 포함한다. 이 방법은, Scott, Jk. and Smith(문헌「GP., Science Vol. 249, 389, 1990」), Cwirla, SE et al.(문헌「Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 87, 6378, 1990) 등에 의해 보고되어 있다. 삽입되는 유전자의 크기는, 펩티드가 안정하게 발현되면 특별히 제한되지 않지만, 제작한 라이브러리가 모든 랜덤 서열을 망라하고, 또한, 결합능을 지니게 하기 위해서는, 6 내지 40의 아미노산 개수에 상당하는 길이(대략 600 내지 4000의 분자량에 상당)가 적절하고, 7 내지 18 아미노산에 대응하는 크기가 바람직하다.
파지표시 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해 기재에 대해서 결합능을 지니는 2종류이상의 펩티드가 얻어진 경우에, 이들 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드의, 일부 또는 전부의 아미노산서열을, 기재에 대한 결합능의 유지 혹은 강화시킬 수 있는 적당한 조합으로, 직렬로 연결한 서열을, 기재에 대해서 결합능을 지니는 펩티드로서 이용해도 된다. 이 경우에, 2종류의 아미노산서열사이의 적절한 스페이서 서열을 설정하는 것이 바람직하다. 스페이서 서열은 대략 3 내지 400 아미노산의 범위를 가지는 것이 바람직하고, 서열은 어떤 아미노산을 함유해도 된다. 보다 바람직하게는, 스페이서 서열은, PHA합성효소의 작용을 방지하지 않거나 또는 기재에 PHA합성효소의 결합을 방해하지 않는 것이다.
본 발명의 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열은, 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해 결정된 아미노산서열, 또는 기재의 화학적 성질에 의해 합리적으로 설계된 아미노산서열이 될 수 있다.
기재에 대한 PHA합성효소의 고정은, 합성효소에 융합되고 제시된 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 통해서 확립된다. PHA합성효소를 함유하는 효소 단백질은 다수의 아미노산이 조합된 폴리펩티드이고, 이는 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 글루탐산 등의 유리의 이온성 아미노산을 통한 이온흡착의 특성을 나타내고, 또한 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린 등의 유리의 소수성 기를 가진 아미노산을 통하여 또한 유기 폴리머에 기인하여 소수성 흡착의 특성을 제공한다. 따라서, 효소 단백질은, 고정의 정도는 차이가 있지만, 친수성, 소수성 또는 친수성과 소수성 양자의 특성을 가진 기재에 고정될 수 있다.
기재표면에 이온성 작용기, 예를 들면 주된 조성물로서 점토광물, 산화금속 등을 함유하는 무기안료가 주로 존재하는 기재를 이용하는 경우에, PHA합성효소는 이 합성효소에 융합되고 존재하는 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열로서 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 글루탐산트 등의 유리 이온기를 가진 다수의 아미노산을 함유하는 서열을 선택함으로써 이온흡착법에 의해 고정될 수 있다.
또한, 표면이 주로 비극성인 기재, 예를 들면 복수의 방향족 또는 축합된 다환 프탈로시아닌 베이스안료를 가진 아조 안료 등의 카본결정을 함유하는 무기안료와 안트라퀴논베이스 안료 또는 카본블랙 등의 유기안료를 이용한 경우에, PHA합성효소는 합성효소에 융합되고 존재하는 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열로서 알라닌, 바린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린 등의 유리 소수성기를 가진 다수의 아미노산을 함유하는 서열을 선택함으로써 소수성 흡착을 통하여 고정될 수 있다.
상기 방법에 의해 얻어진 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열은, 통상의 유전공학법에 의해 폴리히드록시알카노에이트합성효소로 융합되어 이용된다. 기재에 대한 결합능을 지닌 펩티드는 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 N말단 또는 C말단을 연결함으로써 발현될 수 있다. 또한, 적절한 스페이서서열의 삽입에 의해 발현될 수 있다.
스페이서서열은 대략 3 내지 400 아미노산의 범위를 가지는 것이 바람직하고, 서열은 어떤 아미노산을 함유해도 된다. 보다 바람직하게는, 스페이서 서열은, PHA합성효소의 작용을 방지하지 않거나 또는 기재에 PHA합성효소의 결합을 방해하지 않는 것이다.
파지표시 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해 기재에 대해서 결합능을 지닌 2종류이상의 펩티드가 결정되는 경우에, 이들 펩티드를 PHA합성효소에 개별적으로 융합함으로써 제조된 복수종의 PHA합성효소의 혼합물을 본 발명에서 이용할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 PHA합성효소를 분리하고 정제하는 방법에 대하여, PHA합성효소의 효소활성을 유지하기 위한 방법이면 어떤 방법이라도 이용할 수 있다.
기재에 PHA합성효소를 고정하는 단계는, 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 PHA합성효소를 수용성 배지에서 기재와 접촉되게 함으로써 달성된다.
이 단계에서의 PHA 합성용의 수용성 배지의 조성물은, PHA합성반응을 행하는 단계를 방해하지 않는 어떤 조성물이어도 되지만, 조성물은 후속의 단계를 단순화하기 위하여 PHA합성효소가 활성화할 수 있도록 하는 조성물로 조정되어도 된다. PHA효소가 활성화할 수 있도록 하는 조성물로서, 예를 들면 완충제가 이용되어도 된다. 완충제에 대하여, 생화학반응에서 사용하기 위한 일반적인 완충제, 예를 들면 아세트산 버퍼, 인산 버퍼, 인산칼륨 버퍼, 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산(MOPS) 버퍼, N-트리스(히드록시메틸) 메틸-3-아미노프로판 술폰산(TAPS) 버퍼, 트리스염산 버퍼, 글리신 버퍼 및 2-(사이클로헥실아미노)에탄술폰산(CHES) 버퍼를 적절하게 사용한다. PHA합성효소가 활성할 수 있도록 하는 완충제의 농도는 일반적인 농도, 즉 5mM 내지 1.0M의 범위내에 있지만, 10 내지 200mM의 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 또한, pH가 5.5 내지 9.0의 범위, 바람직하게 7.0 내지 8.5의 범위에 있도록 조절되지만, pH농도가 사용될 PHA합성효소의 가장 적합한 pH 및 pH안정성에 의존하는 상기 설명한 범위이외에 설정되는 가능성을 배제하지 않는다.
또한, 기재가 분말인 경우에, 수성 배지에서 안료분산조건을 유지하기 위하여, 계면활성제가 다음의 공정를 방해하지 않는 형태와 농도를 가지는 한 적합한 계면활성제를 첨가해도 된다. 계면활성제의 예는, 예를 들면, 올레산 나트륨, 도데실술폰산 나트륨, 도데실 황산 나트륨, 도데실-N-사르코신산 나트륨, 콜산 나트륨, 데옥시콜산 나트륨 및 타우로데옥시콜산 나트륨 등의 음이온계면활성제와; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 도데실피리디늄 클로라이드 등의 양이온계면활성제와; 3-[(콜아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산(CHAPS), 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산(CHAPSO), 팔미토일리소레시틴 및 도데실-β-알라닌 등의 양성이온계면활성제와; 옥틸글루코시드, 옥틸티오글루코시드, 헵틸티오글루코시드, 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10), 폴리옥시에틸렌도데실에테르(Brij, Lubrol), 폴리옥시에틸렌-i-옥틸페닐에테르(Triton X), 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(Nonidet P-40, Triton N), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(Span) 및 폴리옥시에틸렌소르비톨 에스테르(Tween) 등의 비이온계면활성제를 포함한다.
또한, 수성 배지에서 분말의 상태에서 기재의 분산을 유지하기 위하여, 용매가 다음의 공정를 방해하지 않는 형태와 농도를 가지는 한 적합한 보조용매가 첨가되어도 된다. 보조용매에 대하여, 예를 들면, 헥산 등의 선형 지방족 탄화수소, 메탄올 및 에탄올 등의 1가 알코올과, 글리세롤, 지방산 에스테르 및 카르복실레이트 등의 다가알코올 등의 유도체로부터 선택된 물질의 1개 또는 2개의 형태를 선택하여 사용해도 된다.
이온흡착법 또는 소수성 흡착법에 의한 기재위에 PHA합성효소의 고정화는, 특정 농도를 부여하기 위하여 특정 수성 배지에 PHA합성효소로 기재를 혼합함으로써 달성될 수 있다. 이 경우에, 효소가 기재표면에 균등하게 흡착될 수 있도록, 반응용기는 적절한 강도로 진동되거나 교반되는 것이 바람직하다.
상기 설명한 고정화 처리에 대해, 기재와 효소의 혼합된 수성 배지의 조성물은, 수성 배지의 pH와 염농도에 좌우하여 기재와 PHA합성효소의 표면전하의 정부나 전하량 및 소수성이 변화하는 사실을 고려하여 제작하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 기재가 주로 이온흡착성인 경우에는, 염농도를 내리는 것으로, 기재와 PHA합성효소와의 흡착에 기여하는 전하량을 증가시킬 수 있다. 또한, pH를 변동함으로써, 양자의 대향 전하량을 증가시킬 수 있다. 기재가 주로 소수성 및 흡착성인 경우에는, 염농도를 증가시킴으로써 양자의 소수성를 증가시킬 수 있다. 또한, 전기영동이나 젖음각의 측정은, 기재와 PHA합성효소의 하전 상태와 소수성을 조사하여, 흡착에 적절한 조성을 설정을 할 수 있다. 또한, 기재와 PHA합성효소와의 흡착량을 직접 측정하여 조성을 평가할 수 있다. 흡착량의 측정은, 예를 들면, 기재에 기존 농도의 PHA합성효소 용액을 첨가하는 공정과, 흡착 처리를 행하는 공정과, 용액의 PHA합성효소 농도를 측정하여, 차감법에 의해 흡착 효소량을 평가하는 공정을 포함해도 된다.
이온 흡착법이나 소수 흡착법에 의한 효소의 고정화를 보강하기 위하여, 조작의 번잡함이나 효소의 실활의 가능성을 고려하는 경우에 공유결합법을 이용해도 된다. 그 방법은, 예를 들면, 방향족 아미노기를 가지는 기재를 디아조화하고, 이것에 효소를 디아조결합하는 방법, 카르복실기, 아미노기를 가지는 기재와 효소의 사이에 펩티드 결합을 형성시키는 방법, 할로겐기를 가지는 기재와 효소의 아미노기 사이에 알킬화하는 방법, 시아노겐브로마이드에 의해 활성화된 기재를 효소의 아미노기와 반응시키는 방법, 기재의 아미노기와 효소의 아미노기와의 사이를 가교하는 방법, 알데히드기 또는 케톤기를 가지는 화합물과 이소시아니드 화합물의 존재하에서, 카르복실기, 아미노기를 가지는 기재와 효소를 반응시키는 방법 및 디설파이드기를 가지는 기재와 효소의 티올기와의 사이에 교환 반응시키는 방법을 포함한다.
상기 방법에 의해 제작된, 효소를 고정화한 효소는, 그대로 이용할 수 있고, 한층 더 동결건조를 행한 다음 사용할 수도 있다. 효소의 고정화 처리를 실시하는 시간은 1분 내지 24시간이 바람직하고, 10분 내지 1시간이 보다 바람직하다. 과도한 지속 또는 방치는 효소활성의 저하가 초래되기 때문에 바람직하지 않다.
예를 들면, 기질이 캡슐화 구조체의 코어를 구성하는 경우에, 3-히드록시아실 CoA의 중합에 의해 PHA가 합성되는 반응에 대해 방출되는 CoA량이 1분간에 1μ몰이 되는 PHA합성효소량을 1단위(U)로 했을 때, 기재에 고정하는 인지질의 양은, 인지질 1g당 10단위(U)로부터 1,000단위(U), 바람직하게는 50단위(U)로부터 500단위(U)의 범위내로 설정해도 된다.
기질인 3-히드록시 CoA를 첨가하는 공정에서, 기재표면위의 PHA합성효소는, PHA로 피복된 기재와 기질을 형성하기 위하여 소망의 PHA의 원료가 되도록 3-히드록시아실 CoA를 함유하는 수용성 반응액에 상기 고정화한 효소의 도입에 의해 PHA를 합성한다. 상기 수용성 반응용액은, PHA합성효소의 활성이 충분히 행해지고, 완충제용액에 의해 pH 5.5에서 pH 9.0으로 조절되고, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 8.5로 조정되는 반응계로서 제조된다. 그러나, 이용되는 PHA합성효소의 안정성과 pH적합성에 좌우하여 상기 범위외의 다른 조건을 설정하여도 된다. 필요에 따라, 완충제용액의 종류는, PHA합성효소의 활성이 충분히 행해지면 설정되는 pH범위에 좌우하여 선택될 수 있다. 일반적인 생화학반응을 위하여 사용가능한 완충제는, 예를 들면, 아세트산 버퍼, 인산 버퍼, 인산칼륨 버퍼, 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산(MOPS) 버퍼, N-트리스(히드록시메틸) 메틸-3-아미노프로판 술폰산(TAPS) 버퍼, 트리스염산 버퍼, 글리신 버퍼 및 2-(사이클로헥실아미노) 에탄술폰산(CHES) 버퍼를 포함한다. 이용되는 PHA합성효소의 활성이 충분히 행해지면 이용되는 완충제의 농도는 제한되지 않고, 일반적으로 5mM 내지 1.0M이고, 바람직하게 0.1M 내지 0.2mM이다.
반응온도는, 필요에 따라, 사용하는 PHA합성효소의 특성에 좌우하여 적절하게 설정하지만, 통상 4℃ 내지 50℃로, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃로 설정된다. 그러나, 이용하는 PHA합성효소의 최적의 온도나 내열성에 좌우하여, 상기 범위 이외에 조건을 설정해도 된다. 반응시간은, 필요에 따라, 사용하는 PHA합성효소의 안정성 등에 좌우하여, 통상 1분 내지 24시간, 바람직하게는 30분내지 3시간의 범위내에서 적절하게 선택하여 설정한다. 필요에 따라, 반응용액에서 3-히드록시아실 CoA의 농도는, 사용하는 PHA합성효소의 활성이 완전하게 행해진 범위내에서, 일반적으로 0.1mM 내지 1.0M로 설정되고, 바람직하게는 0.2mM 내지 0.2M로 설정된다. 또한, 반응용액에서 3-히드록시아실 CoA의 농도가 높은 경우에, 반응계의 pH는 일반적으로 감소하는 경향이 있고, 따라서 3-히드록시아실 CoA가 고농도로 설정되는 경우에 더하여 상기 완충제는 약간 높은 농도로 설정되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 공정에서, 수용성 반응액의 3-히드록시아실 CoA의 종류나 농도 등의 조성을 시간이 경과함에 따라 변화시킴으로써, 기재의 수직방향으로 기재를 피복하는 PHA의 단량체의 조성을 변화시킬 수 있다.
이 단량체 조성의 변화한 기재의 형태는 예를 들면, PHA 피막의 조성 변화가 연속적이고, 수직방향으로 조성의 기울기를 형성한 1층의 PHA가 기재를 피복한 형태이어도 된다. 제조방법은, 예를 들면, PHA를 합성하면서 반응액에 다른 조성의 3-히드로시아실 CoA를 첨가하는 방법이어도 된다.
또한, 다른 형태로서는, PHA 피막의 조성이 점차적으로 변화하고, 조성이 다른 PHA가 기재를 다층에 피복한 형태이어도 된다. 이 형태를 위한 제조방법은, 어느 3-히드록시아실 CoA의 특정한 조성으로 PHA를 합성한 후, 세정공정을 이용하여 조제중의 기재를 반응액으로부터 일단 회수하고, 이것에, 다른 조성의 3-히드록시아실 CoA의 반응액을, 부가하여 첨가하는 등 방법이어도 된다.
상기 설명한 반응에 의해 얻어진 구조체는, 필요에 따라 세정공정에 제공한다. 세정방법은, 구조체의 제조의 목적에 대하여 구조체에서 소망하지 않는 변화를 초래하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 구조체가 외피가 되는 PHA와 코어가 되는 기재를 가진 캡슐화 구조체인 경우에, 예를 들면 원심분리에 의해 구조체를 침전시키고, 상청액을 제거함으로써 반응용액에서 얻은 불필요한 조성물을 제거할 수 있다. 이 경우에, PHA를 용해시키지 않는 물, 완충제용액 또는 메탄올 등의 세정제를 첨가하고, 다음에 원심분리를 행함으로써 세정을 행할 수 있다. 또한, 여과 등의 방법은 원심분리대신에 이용해도 된다. 한편, 구조체는 PHA로 피복된 판형상의 기재인 구조체이고, 세정은 예를 들면 상기한 세정제에 그것을 고정시킴으로써 행해질 수 있다. 또한, 상기한 구조체는 필요에 따라 건조공정을 부여할 수 있다. 또한, 구조체는 이용전에 화학적 수식 등의 각종 2차처리에 의해 처리될 수 있다.
예를 들면, 유용한 기능과 특성을 더 가진 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체는 화학적 수식을 위해 기재의 표면위에 PHA를 부여함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 그래프트사슬이 도입되고, 이에 의해 그래프트사슬로부터 유래된 각종 특성을 가진 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 얻을 수 있다. 이하 설명하는 바와 같은 폴리실록산이 그래프트사슬로서 도입되면, 보다 개선된 기계적 강도, 분산성, 내후성, 내수성, 내열성 등을 가진 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 얻을 수 있다. 또한, 가교된 기재의 표면층위에 PHA를 가짐으로써, 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 기계적 강도, 내화학성, 내열성을 개선시킬 수 있다.
소망의 기능과 구조체를 얻는 목적을 달성할 수 있는 방법인 한 화학 수식을 위한 방법이 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 측쇄위의 반응성 작용기를 가진 PHA를 합성할 수 있고, 화학적 수식이 작용기의 화학적 반응을 이용하여 달성된 방법이 적합한 방법으로서 이용되어도 된다.
상기 설명한 반응성 작용기의 형태는, 소망의 기능 및 구조체를 얻는 목적을 제공하는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 상기 설명한 바와 같이 에폭시기이어도 된다. 측쇄위에 에폭시기를 가진 PHA는 에폭시기를 가진 통상의 폴리머의 경우와 마찬가지로 화학적으로 전환될 수 있다. 상세하게는, 예를 들면, 히드록실기로의 전환 및 술폰기의 도입이 가능하다. 또한, 티올과 아민을 가진 조성물을 첨가할 수 있고, 예를 들면 말단에서 각 작용기를 가진 조성물, 보다 상세하게는 에폭시기를 가진 높은 반응성을 지닌 아미노기를 가진 화합물을 첨가하여 반응시키고, 이에 의해 폴리머의 그래프트사슬이 형성된다.
말단위에 아미노기를 가진 조성물은, 예를 들면 폴리비닐 아민, 폴리에틸렌 이민, 아미노 변성폴리실록산(아미노 변성 실리콘 오일) 등의 아미노 변성 폴리머를 포함한다. 이들 중, 아미노 변성 폴리실록산에 대하여, 시판의 변성 실리콘오일을 사용해도 되고, 또한, 문헌「J. Amer. Chem. Soc., 78, 2278 (1956)」등에 기재의 방법으로 합성해 사용할 수도 있고 상기 폴리머의 그래프트사슬의 첨가에 의한 기계적 강도, 분산성, 내광성, 내후성, 내수성, 내열성의 개선 등의 효과를 기대할 수 있다.
또한, 에폭시기를 가지는 폴리머의 화학적 변환의 다른 예는 헥사메틸렌디아민등의 디아민 화합물, 무수 숙신산, 2-에틸-4-메틸이미다졸 등에 의한 가교반응이, 물리화학적 변환의 예로서 전자선 조사 등에 의한 가교반응이다. 이들 중, 에폭시기를 측쇄에 가지는 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응은, 아래에 설명하는 스킴(scheme)에 따라서 진행하여, 가교 폴리머를 생성한다.
본 발명의 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체에 있어서, 기재에 고정된 효소는, 폴리히드록시알카노에이트와 기재사이의 친화성과 접착성을 향상시키는 효과를 가지므로, 기재를 피복한 폴리히드록시알카노에이트를 거의 박리할 수 없다.
상기 구조체에서, 기재가 PHA로 피복되는 것을 확인하는 방법은, 예를 들면 가스크로마토그래피 등에 의한 조성분석과 전자현미경 등에 의한 형태관찰의 조합의 방법과, 비행 시간형 2차 이온질량분석장치(TOF-SIMS)(time-of-the flight secondary mass spectrometry analysis apparatus)와 이온스퍼터링 기술을 이용하여 각 조성의 질량스펙트럼으로부터 구조체를 평가하는 방법을 포함한다. 그러나, 본 발명에 의해 신규 개발된 더 직접, 단순하고, 용이한 확인법으로서, 나일블루 A균주와 형광현미경관찰의 조합의 방법은 또한 이용될 수 있다. PHA합성효소를 이용하여 생체외 PHA합성을 단순하고 용이하게 확인하는 방법에 대한 본 발명자들의 연구에 의해, 형광을 방출하기 위하여 PHA에 특히 결합의 특성을 가진 시약이고, 생체내 미생물균체내에 PHA생성의 간단한 확인작업을 위하여 나일블루 A가 이용될 수 있는 문헌「Appl. Environ. Microbiol., 44, 238-241 (1982)」에 보고된 나일블루 A가, 적절한 이용방법과 이용조건을 설정함으로써, 생체외 PHA합성을 체크하기 위하여 또한 이용될 수 있고, 이는 상기 설명한 방법을 완료하는 것을 나타냈다. 즉, 이 방법은 생체외 PHA합성을 단순하게 체크할 수 있고, 그 방법은, 특정 농도의 나일블루 A용액을 여과하는 공정과, PHA를 함유하는 반응용액으로 최종 여과물을 혼합하는 공정과, 형광현미경에 의해 주어진 파장의 여기광으로 혼합물을 조사하고 그것을 제어하는 공정과, 합성된 PHA로부터만 형광을 방출하고 그것을 관찰하는 공정을 포함한다. 상기 설명한 조건하에서 이용된 기재가 형광을 방출하지 않는 한, 기재의 표면이 피복된 PHA는 본 발명의 구조체의 제작을 위한 상기 설명한 방법을 적용함으로써 직접 관찰되고 평가될 수 있다.
〈구조체의 이용〉
본 발명의 특징은, 종래의 유기합성법에 의해서는 제조가 곤란하였던 구조체의 제작을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 종래의 유기합성공정에 의해 제작된 캡슐화 구조체 또는 적층구조체에 의해 나타나지 않는 뛰어난 특성을 지닌 구조체를 제공할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 신규 기능과 구조체를 가진 폴리머를 제공하고 고분자성 화합물을 신규하게 이용할 수 있는 것을 가능하게 하고, 이는 종래의 유기합성화학적 수법에 의해 실현되는 것이 어렵다. 보다 상세하게는, 종래의 유기합성접근에 의해 제작하기 어려운 신규의 기능성 고분자화합물, 매우 높은 키럴성의 고분자 화합물로 피복된 적층구조체와 캡슐화구조체는, 매우 정밀한 분자인식능력과 활성 유기물의 촉매작용의 입체선택성을 이용함으로써 매우 단순하고 용이한 처리에 의해 제작될 수 있다.
상기 설명한 바와 같은 구조체의 적용은, 예를 들면 전자사진용 고기능 캡슐토너, 뛰어난 분산안정성을 가진 마이크로캡슐화 안료 잉크, 전기영동표시용 전기영동입자 및 컬러필터용 착색조성물을 포함한다.
(실시예)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이하에 설명하는 실시예는 본 발명의 최선의 실시형태의 일례이지만, 본 발명의 기술적 범위는 이것의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(제 1참고예 )
PHA합성효소 생산능을 가진 형질전환체의 제작 및 PHA합성효소의 생산
PHA합성효소 생산능을 가진 형질전환체를 이하의 방법으로 제작했다.
YN2균주를 100㎖의 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨, pH 7.4)에서, 30℃에서 하룻밤 배양 후, 마머(Marmer)씨 등의 방법에 의해 염색체 DNA를 분리회수했다. 얻어진 염색체 DNA를 제한효소 Hind III로 완전분해했다. 벡터로서 pUC18를 사용하고, 제한효소 Hind III로 절단했다. 말단의 탈인산 처리(문헌「Molecular Cloning, 1, 572, (1989); Cold Spring Harbor Laboratory 출판」)후, DNA 라이게이션 키트 Ver.II(타카라주조 주식회사)를 이용하여, 벡터의 절단 부위(클로닝 사이트)와 염색체 DNA의 Hind III의 완전분해된 단편을 연결했다. 이 염색체 DNA 단편을 짜넣은 핵외 유전자 벡터(plasmid vector)를 이용하여, 대장균(Escherichia coli) HB101균주를 형질전환하고, YN2균주의 DNA 라이브러리를 제작했다.
다음에, YN2균주의 PHA합성효소 유전자를 포함한 DNA 단편을 선택하기 위해, 콜로니 하이브리다이즈용의 프로브의 조제를 실시했다. 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 합성하고(아마샘 파마시아·바이오 텍)(Amasham Pharmacia·Biotech), 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용하여, 염색체 DNA를 템플릿으로서 하여 PCR를 실시했다. PCR 증폭된 DNA 단편을 프로브로서 이용했다. 프로브의 표식화는, 시판의 표식 효소계 AlkPhosDirect(아마샘 파마시아·바이오 텍)를 이용하였다. 얻은 표식화 프로브를 이용하여, YN2균주의 염색체 DNA 라이브러리로부터 콜로니하이브리다이제이션법에 따라 PHA합성효소 유전자를 포함한 재조합 핵외 유전자를 가지는 대장균 균주를 선발했다. 선발한 균주로부터, 알칼리법에 따라 핵외 유전자를 회수함으로써, PHA합성효소 유전자를 포함한 DNA 단편을 얻을 수 있었다.
여기서 취득한 유전자 DNA 단편을, 불화합성 그룹(incompatibility group)을 구성하는 Inc P, Inc Q, 혹은 Inc W의 어느 쪽에도 속하지 않는 광숙주역복제 영역을 포함한 벡터 pBBR 122 (Mo Bi Tec)에 재결합하였다. 이 재결합의 핵외 유전자를 슈도모나스 치코리이 YN2ml균주(Psuedomonas cichorii YN2ml strain)(PHA 합성력의 결손균주)로 일렉트로포레이션법에 의해 형질전환한 경우에, YN2ml균주의 PHA 합성력이 복귀하여, 상보성을 나타냈다. 따라서, 선발된 유전자 DNA단편은, 슈도모나스 치코리이 YN2ml균주(Psuedomonas cichorii YN2ml strain)내에 있어, PHA합성효소로 형질전환가능한 PHA합성효소 유전자영역을 포함하는 것이 확인된다.
이 PHA합성효소 유전자를 포함한 DNA 단편에 대해, 산가법(Sanger's method)에 의해 염기서열을 결정했다. 그 결과, 결정된 염기서열중에는, 펩티드를 각각 코딩하는, 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 존재하는 것이 확인되었다. 이하 설명하는 바와 같이, 각각의 펩티드사슬로 구성된 단백질은, 모두 효소활성을 가지고 있어 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열은 각각 PHA합성효소 유전자인 것을 확인할 수 있었다. 특히, 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열을 서열번호 2의 염기서열이 코딩하고 있고, 서열번호 3로 표시되는 아미노산서열을 서열번호 4의 염기서열이 코딩하고 있으며, 이들의 아미노산서열 어느 한 쪽만을 가지는 단백질만으로, PHA 합성력이 발휘되는 것을 확인했다.
서열번호 2로 표시되는 염기서열의 PHA합성효소 유전자에 대해, 염색체 DNA를 템플릿으로 하여 PCR를 실시하여, PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 다시 제조했다.
서열번호 2로 표시되는 염기서열에 대해서, 상류측 프라이머가 되는 그 개시 코돈보다 상류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드(서열번호 7) 및 하류측 프라이머가 되는 종지 코돈(stop codon)보다 하류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드(서열번호 8)를 각각 설계하여 합성했다(아마샘 파마시아·바이오 텍). 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여, 염색체 DNA를 템플릿으로 해서 PCR를 실시하여, PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 증폭했다(LA-PCR 키트; 타카라주조 주식회사).
마찬가지의 방법으로, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 PHA합성효소 유전자에 대해서도, 염색체 DNA를 템플릿으로 해서 PCR를 실시하여, PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 다시 제조했다. 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 대해서, 상류측 프라이머가 되는 그 개시 코돈보다 상류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드(서열번호 9) 및 하류측 프라이머가 되는 종지 코돈보다 하류의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드(서열번호 10)를 각각 설계하여 합성했다(아마샘 파마시아·바이오 텍). 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 하여 PCR를 실시하여, PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 증폭했다(LA-PCR 키트; 타카라주조 주식회사).
다음에, 얻은 PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 포함한 PCR 증폭 단편을, 제한효소 Hind III를 이용하여 각각 완전분해했다. 또한, 발현 벡터 pTrc99A도 제한효소 Hind III로 절단하여, 탈인산화 처리(문헌「Molecular Cloning, 1권, 572페이지, 1989년; Cold Spring Harbor Laboratory 출판」)했다. 이 발현 벡터 pTrc99A의 절단 부위에, 양말단의 불필요한 염기서열을 제거하고 PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 포함한 DNA 단편을, DNA 라이게이션 키트 Ver.II(타카라주조 주식회사)를 이용해 연결한다.
얻은 재조합 핵외 유전자로 대장균(Escherichia coli)(HB101: 타카라주조 주식회사)을 염화 칼륨법에 의해 형질전환했다. 얻은 재조합체를 배양하여, 재조합 핵외 유전자의 증폭을 실시하고, 재조합 핵외 유전자를 각각 회수했다. 서열번호 2의 유전자 DNA를 보관 유지하는 재조합 핵외 유전자를 pYN2-C1(서열번호 2로부터 유래함), 서열번호 4의 유전자 DNA를 보관 유지하는 재조합 핵외 유전자를 pYN2-C2(서열번호 4로부터 유래함)로 했다.
pYN2-C1 및 pYN2-C2를 이용하여 대장균(Escherichia coli)(strain HB101fB, fadB 결손균주)을 염화 칼륨법에 의해 형질전환하고, 각각의 재조합 핵외 유전자를 보관 유지하는 재조합 대장균주, pYN2-C1재조합균주, pYN2-C2재조합균주를 얻었다.
pYN2-C1재조합균주, pYN2-C2재조합균주 각각을 효모추출물 0.5%, 옥탄산 0.1%를 포함한 M9배지 200㎖에서 식균하고, 37℃, 125스트로크/분에 진탕배양했다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 통상의 법에 의해 핵외 유전자 DNA를 회수했다.
pYN2-C1에 대해서, 상류측 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드(서열번호 11) 및 하류측 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드(서열번호 12)를 각각 설계·합성했다(아마샘 파마시아·바이오 텍). 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 이용하고, pYN2-C1를 템플릿으로서 하여 PCR를 실시하고, 상류에 BamHI 및 SacI 제한 부위, 하류에 SpeI 및 XhoI 제한 부위를 가지는 PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 증폭했다(LA-PCR 키트; 타카라주조 주식회사).
마찬가지 방법으로, pYN2-C2에 대해서, 상류측 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드(서열번호 13) 및 하류측 프라이머가 되는 올리고뉴클레오티드(서열번호 14)를 각각 설계·합성했다(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사). 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고, pYN2-C2를 템플릿으로서 하여 PCR를 실시하고, 상류에 BamHI 제한 부위, 하류에 XhoI 제한 부위를 가지는 PHA합성효소 유전자의 완전한 길이를 증폭했다(LA-PCR 키트; 타카라주조 주식회사).
정제한 각각의 PCR 증폭 산물을 BamHI 및 XhoI에 의해 소화하고, 핵외 유전자 pGEX-6P-1 (아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)의 대응하는 부위에 삽입했다. 이들 벡터(pGEX-C1, pGEX-C2)를 이용하여 대장균 JM109를 형질전환하고, 발현용 균주를 얻었다. Miniprep (Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PR0MEGA사 제품)를 이용하여 대량으로 조제한 핵외 유전자 DNA를 BamHI, XhoI로 처리해서 얻을 수 있는 DNA 단편에 의해 균주를 체크하였다. 얻은 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 하룻밤 미리 배양한 후, 그 균주 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서, 170rpm으로 3시간 진탕배양했다. 그 후, IPTG를 첨가(최종농도 1mM)하고, 37℃로 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1㎖의 PBS에 다시 현탁하였다. 동결 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청액(supernatant)(무세포추출물)에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4OμL를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 적절하게 교반했다. 이에 의해, 융합 단백질 GST-YN2-C1 및 GST-YN2-C2를 글루타치온세파로스에 흡착시켰다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수한 후 PBS에 대해서 투석하고, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μg를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획(flow-through fractions)을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 YN2-C1 및 YN2-C2의 최종 정제물을 얻었다. SDS-PAGE에 의해 각각 60.8 kDa, 및 61.5 kDa의 싱글 밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
각 정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정했다. 각 정제 효소의 활성 측정의 결과를 표 1에 나타냈다.
활성 비활성(Specific Activity)
YN2-C1 2.1 U/㎖ 4.1 U/mg 단백질
YN2-C2 1.5 U/㎖ 3.6 U/mg 단백질
(참고예 2) 3-히드록시 아실-CoA의 합성
(R)-3-히드록시 옥타노일-CoA는, 어떤 변형에 의해 부가되는, 문헌「Rhem BHA, Kruger N, Steinbuchel A(1998) Journal of Biological Chemistry 273 pp.24044-24051」에 의거하여 이하의 방법에 의해 제작한다. ATP 2mM, MgCl2 5mM, 조효소 A 2mM 및 (R)-3-히드록시옥타노에이트 2mM을 함유한 트리스-염화수소산 버퍼용액(50mM, pH 7.5)에 아실-CoA합성효소(시그마 알드리치사 제품)를 용해하여, 0.1mU/㎕의 최종용액을 얻었다. 용액을 37℃의 온조에서 인큐베이트하고 시간별로 시료화하여, 반응의 진행을 HPLC로 분석하였다. 0.02N의 농도를 얻기 위한 시료의 반응용액에 황산을 첨가하여 효소반응을 완료시키고, 다음에 반응되지 않은 기질인 (R)-3-히드록시옥타노에이트를 n-헵탄에 의한 추출물에 의해 제거한다. HPLC에 의한 분석시에, RP18컬럼(뉴클레오실 C18, 7㎛, Knauser)을 이용하고, 이동상으로서 25mM 포스페이트버퍼용액(pH 5.3)을 이용하여 아세토니트릴의 선형밀도기울기에 의해 용출을 행하고, 또한 200 내지 500nm의 흡수스펙트럼을 다이오드어레이검출기로 감시하여, 효소작용에 의해 생성된 티오에스테르 화합물을 검출하였다. (R)-3-히드록시-5-페닐 발레릴 CoA 및 (R)-3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)발레릴 CoA는 동일한 방법으로 제작하였다.
(제 1실시예) 구리 프탈로시아닌에 결합친화력을 가진 아미노산의 획득
(1) 구리 프탈로시아닌(알파형: 도쿄 카세이 코교사 제품)을 메탄올에 현탁하여 5mg/㎖의 농도를 얻었다. 현탁액 1.5㎖를 폴리스티렌으로 이루어진 플레이트에 피복하고, 메탄올을 증발에 의해 제거하고, 이에 의해 구리 프탈로시아닌의 피복은 폴리스티렌으로 이루어진 플레이트의 표면에 고정된다. 0.1% Tween-20을 포함하는 TBS버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.5 150mM NaCl)로 세정한 경우에도, 고정된 구리 프탈로시아닌의 피복이 제거되지 않는 것을 확인하였다.
(2) 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 블로킹버퍼(0.1M NaHCO3 (pH 8.6), 5mg/㎖ BSA, 0.1mg/㎖ 스트렙트아비딘(streptavidin), 0.02% NaN3)를 그 위에 고정된 구리 프탈로시아닌으로 폴리스티렌 플레이트위에 채우고, 1시간동안 4℃에서 여전히 유지한다. 다음에 블로킹버퍼를 폐기하고, 플레이트를 TBST버퍼(TBS버퍼 +0.1% Tween-20)로 10회 세정한다.
(3) Ph.D. -7 파지표시펩티드 라이브러리(뉴 잉글랜드 바이오랩사 제품)의 1.4×1011의 당량을 플레이트에 첨가하고, 이는 25℃에서 60분동안 여전히 유지한다.
(4) 플레이트의 용액을 폐기하고, 플레이트를 TBST버퍼로 10회 세정한다.
(5) 용출버퍼(0.2M Glycine-HCl(pH 2.2) 1mg/㎖ BSA) 1㎖를 첨가하고 용액을 3분동안 여전히 지속한 후, 용액을 마이크로도우스 원심분리관으로 이동시키고, 다음에 1M Tris-HCl 150㎕(pH 9.1)를 첨가하였다. 용액을 중화하여 용출된 파지를 얻었다.
(6) 대수증식의 초기단계에서 대장균 ER2537(Escherichia coli ER2537)(뉴잉글랜드 바이오랩사 제품)을 용출된 파지로 감염되고, 증폭된 파지가다. 그것은 4.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에, 파지는 원심분리에 의해 세포로부터 분리되고, 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 정제된다. 정제되고 증폭된 파지를 TBS버퍼에서 현탁하고, 대장균에 일련의 희석에 적합한 감염에 의해 적정값을 측정하였다.
(7) 상기 설명한 방법 (1) 내지 (6)은 증폭 파지를 이용하여 3회 더 반복한다. 그러나, 사용되는 TBST버퍼에서 Tween-20의 농도를 0.5%까지 증가시키고, 또한 세정의 조건을 엄격하게 하였다.
2회째부터는, 폴리스티렌으로 이루어진 플레이트에 BSA에 의한 블로킹만이 행해지는 시료에 대해서도 마찬가지의 조작을 행하여, 대조표준으로서 사용한다. 각 사이클에서 용출된 파지의 적정값은 표 2에 나타낸다.
각 사이클에서 용출된 파지의 적정값
모액(A) 조절 정합(B) 프탈로시아닌 결합(C) C/A C/B
1회째 1.4×1011 5×105 3.6×10-6
2회째 6.5×1011 8.5×105 2.6×106 4×10-6 3
3회째 6.0×1011 1.2×106 1×109 1.6×10-3 800
4회째 8.5×1011 2×106 5.3×109 6.2×10-3 2700
(A,B,C의 단위는 pfu/㎖로 나타냄)
클로닝은 최종적으로 용출된 파지로 감염되는 대장균을 대규모 과잉으로 함으로써 행해진다. 각 클론으로 대장균을 감염시키고 클론을 증폭한 후, ssDNA를 제작하고, 램덤영역의 염기서열을 해독하고, 표시하고 있는 펩티드의 아미노산서열을 결정하였다. 픽업한 30클론의 아미노산서열과 빈도를 표 3에 나타낸다.
결정된 아미노산서열 및 빈도
결정된 아미노산서열 개수 (A) 빈도 (A/30)
서열번호 15VFHKLVWVal-Phe-His-Lys-Leu-Val-Trp 23 0.77
서열번호 182VYHRLVNAal-Tyr-His-Arg-Leu-Val-Asn 5 0.16
서열번호 183VIHRLVWVal-Ile-His-Arg-Leu-Val-Trp 2 0.07
아미노산서열 VXHXLVX(서열번호 178)의 구리 프탈로시아닌 결합모티프, 특히 구리 프탈로시아닌에 친화력을 가진 아미노산서열 VFHKLVW(서열번호 15)를 검출하였다.
(제 2실시예) 구리 프탈로시아닌에 결합친화력을 가진 PHA합성효소의 제작
아미노산서열 VFHKLVW(서열번호 15)의 구리 프탈로시아닌 친화력서열을 스페이서 서열 GGGS(서열번호 177)를 개재해서, PHA합성효소의 N말단에 융합해서 발현되는 대장균 발현벡터를 다음과 같이 확립하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA는 2본쇄 합성올리고뉴클레오티드로서 제조되고, pGEX-C1 핵외 유전자의 적절한 제한 절단 부위(BamHI, SacI)에 연결된다. 이 경우에, 제조업자의 설명서에 따라, 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 O1(5' GATCCGTGTTCCACAAATTAGTGTGGGGTGGAGGTTCGGAGCT; SEQ ID NO(본 명세서에 있어서 "SEQ ID NO"는 "서열번호"를 의미함: 16)과 O2(5' CCGAACCTCCACCCCACACTAATTTGTGGAACACG; 서열번호 17)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 인산화하였다. 그것을 80℃에서 5분동안 연속적으로 가열한 후, 실온에서 서서히 냉각되도록 남겨놓았다. 이 2본쇄 DNA단편은 클로닝을 위해 직접 사용되었다.
핵외 유전자 pGEX-C1을 BamHI와 SacI에 의해 소화하고, 상기 설명한 2본쇄 DNA단편을 삽입하였다. 대장균 JM109는 이 벡터를 사용하여 형질전환하고, 발현을 위한 균주를 얻었다. 균주의 체크는, pGEX5' 시퀀싱 프라이머(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사)를 이용하고 또한 템플릿으로서 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)에 의해 제조된 핵외 유전자 DNA를 이용하여 배열함으로써 염기서열의 삽입을 결정해서 행하였다.
얻어진 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 하룻밤 미리 배양한 후, 그 균주 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서 170rpm으로 3시간 진탕배양했다. 그 후, IPTG를 첨가(최종농도 1mM)하고, 37℃에서 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1/10양의 PBS에 재현탁하였다. 동결 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4OμL를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 조용하게 교반했다. 이에 의해, 융합 단백질 GST-YN2-C1를 글루타치온세파로스에 흡착시켰다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간동안 교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수한 후 PBS에 대해서 투석하고, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μg를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획(flow-through fractions)을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 YN2-C1(pht)의 최종 정제물을 얻었다. SDS-PAGE에 의해 61.9 kDa의 싱글 밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정했다. 효소농도는 1.9U/㎖이고, 비활성은 4.0U/mg단백질이었다. 각 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
(제 3실시예) 구리 프탈로시아닌에의 결합친화력의 평가
구리 프탈로시아닌을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 이 현탁액 10㎖는 테플론제조의 원심분리관으로 샘플화되고, 제 2실시예에서 제조된 PHA합성효소 YN2-C1 및 제 1참조예에서 제조된 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량은 이 현탁액에 첨가되고, 이는 실온에서 30분동안 진탕된다. 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해, 구리 프탈로시아닌입자를 침전물로서 회수하고, 구리 프탈로시아닌에 결합되지 않은 효소를 함유하는 상청액으로부터 분리된다. 구리 프탈로시아닌은 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 다시 현탁하고, 원심분리를 반복하고, 이에 의해 구리 프탈로시아닌을 세정하였다. 세정된 구리 프탈로시아닌의 현탁액의 효소활성을 측정한 결과는 표 4에 나타낸다.
구리 프탈로시아닌에의 효소의 결합친화력의 평가
활성 U
YN2-C1(pht) 0.04
YN2-C1 0.01
구리 프탈로시아닌 친화성 서열로 융합된 효소 YN2-C1(pht)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 따라서 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 4실시예) 구리 프탈로시아닌의 PHA피막구조체
구리 프탈로시아닌을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 이 현탁액 10㎖는 테플론제조의 원심분리관으로 샘플화되고, PHA합성효소 YN2-C1(pht) 또는 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량을 이 현탁액에 첨가하고, 관을 실온에서 30분동안 진탕한다. 일단, 구리 프탈로시아닌을 원심분리에 의해 회수하고, 이것을 0.1% Tween-20을 함유한 TBS버퍼에서 다시 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 다음에, 제 2실시예에서 제조한 (R)-3-히드록시 옥타노일 CoA을 첨가하고, 따라서 5mM의 최종농도를 얻는다. 합성반응은 37℃에서 30분동안 인큐베이팅함으로써 행해진다.
반응혼합물에서 생성된 PHA는 나일블루 A에 의해 염색되고, 현광현미경에 의해 관찰되었다. YN2-C1이 첨가된 시료에서, 유리의 PHA입자가 관찰되었다. 반면에 YN2-C1(pht)이 첨가된 시료에서, 유리의 PHA입자가 관찰되지 않았고, 이에 의해 합성효소에 의한 효과적인 PHA합성이 행해진 것을 확인하였다.
반응혼합물을 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 분리하고, 코어로서 구리 프탈로시아닌을 가진 피막구조체에 의해 수성 케이크를 얻었다. 이 수성케이크를 물에서 재현탁한 후, 피막구조체를 원심분리에 의해 다시 회수하였다. 이 작업을 3회 반복함으로써 세정을 행하였다.
제조된 피막구조체의 수성 케이크의 일부는 진공건조하고, 클로로포름 20㎖에서 현탁하고, 또한 막을 형성하는 PHA를 추출하기 위하여 현탁액을 60℃에서 20시간동안 교반하였다. 0.45㎛의 구멍크기의 막여과에 의해 추출물을 여과하고, 회전증발기에 의해 진공원심분리를 행하고, 또한 종래의 방법에 의해 후속의 메타놀리시스를 행하였다. 메틸 에스테르화 PHA단량체를 확인하기 위하여 가스 크로마토그래프 질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050)에 의해 최종 산물을 분석하였다. 그 결과, 확인한 PHA가 도 1(a) 및 도 1(b)에 도시한 바와 같은 단량체 유닛으로서 3-히드록시옥탄산을 가진 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA를 겔투과크로마토그래프(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=21,000 및 Mw=40,000을 얻었다.
(제 5실시예) 카본블랙에 결합친화력을 가진 아미노산의 획득
(1) 카본블랙(시그마 알드리치 저팬사 제품)를 메탄올에 현탁하여 5mg/㎖의 농도를 얻었다. 현탁액 1.5㎖를 폴리스티렌 플레이트에 피복하고, 메탄올을 증발에 의해 제거하고, 이에 의해 카본블랙의 피복은 폴리스티렌 플레이트의 표면에 고정된다. 0.1% Tween-20을 포함하는 TBS버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.5 150mM NaCl)로 세정한 경우에도, 고정된 구리 프탈로시아닌의 피복이 제거되지 않는 것을 확인하였다.
(2) 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 블로킹버퍼(0.1M NaHCO3 (pH 8.6), 5mg/㎖ BSA, 0.1mg/㎖ 스트렙트아비딘, 0.02% NaN3)를 그 위에 고정된 카본블랙으로 폴리스티렌 플레이트위에 채우고, 1시간동안 4℃에서 플레이트를 여전히 지속한다. 다음에 블로킹버퍼를 폐기하고, 플레이트를 TBST버퍼(TBS버퍼 +0.1% Tween-20)로 10회 세정한다.
(3) Ph.D. -7 파지표시펩티드 라이브러리(뉴 잉글랜드 바이오랩사 제품)의 1.4×1011 pfu의 당량을 플레이트에 첨가하고, 이는 25℃에서 60분동안 여전히 유지한다.
(4) 플레이트의 용액을 폐기하고, 플레이트를 TBST버퍼로 10회 세정한다.
(5) 용출버퍼(0.2M Glycine-HCl (pH 2.2) 1mg/㎖ BSA) 1㎖를 첨가하고 용액을 3분동안 여전히 유지한 후, 용액을 마이크로도우스 원심분리관으로 이동시키고, 다음에 중화를 위해 1M Tris-HCl 150㎕(pH 9.1)를 첨가하여 용출된 파지를 얻었다.
(6) 대수증식의 초기단계에서 대장균 ER2537(Escherichia coli ER2537)(뉴잉글랜드 바이오랩사 제품)을 용출된 파지로 감염시키고, 파지를 증폭하였다. 그것은 4.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에, 파지는 원심분리에 의해 균체로부터 분리되고, 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 정제된다. 정제되고 증폭된 파지를 TBS버퍼에서 현탁하고, 대장균을 적합한 일련의 희석으로 감염시킴으로써 적정값을 측정하였다.
(7) 상기 설명한 방법 (1) 내지 (6)은 증폭 파지를 이용하여 3회 더 반복한다. 그러나, 사용되는 TBST버퍼에서 Tween-20의 농도를 0.5%까지 증가시키고, 또한 세정의 조건을 엄격하게 하였다. 이하, 2회째부터는, 폴리스티렌으로 이루어진 플레이트에 BSA에 의한 블로킹만이 행해지는 시료에 대해서도 마찬가지의 조작을 행하여, 대조표준으로서 사용한다. 각 사이클에서 용출된 파지의 적정값은 표 5에 나타낸다.
각 사이클에서 용출된 파지의 적정값
모액(A) 조절 정합(B) 카본블랙 정합(C) C/A C/B
1회째 1.4×1011 3.0×105 2.1×10-6
2회째 6.4×1011 7.5×105 1.6×106 2.5×10-6 2
3번째 6.5×1011 1.4×106 1.4×109 2.2×10-3 1000
4번째 8.4×1011 2.3×106 5.6×109 6.7×10-3 2400
(A,B,C의 단위는 pfu/㎖로 나타냄)
대규모의 과잉의 대장균은 최종적으로 용출된 파지로 감염되고, 파지는 클로닝된다. 각 클론을 대장균에 감염시키고 증폭한 후, ssDNA를 제작하고, 램덤영역의 염기서열을 해독하고, 표시하고 있는 펩티드의 아미노산 서열을 결정하였다. 픽업한 30클론의 아미노산서열과 빈도를 표 6에 나타낸다.
결정된 아미노산서열 및 빈도
결정된 아미노산서열 개수 (A) 빈도 (A/30)
서열번호 18WFWILVNTrp-Phe-Trp-Ile-Leu-Val-Asn 25 0.83
서열번호 184WYWILTNTrp-Tyr-Trp-Ile-Leu-Thr-Asn 5 0.17
아미노산서열 WXWILXN(서열번호 179)을 가진 카본블랙 결합모티프, 특히 카본블랙에 친화력을 가진 아미노산서열 WFWILVN(서열번호 18)를 검출하였다.
(제 6실시예) 카본블랙에 결합친화력을 가진 PHA합성효소의 제작
PHA합성효소의 C말단으로 아미노산서열 WFWILVN(서열번호 18)의 카본블랙 친화력서열을 융합함으로써 스페이서 서열 GGGS(서열번호 177)를 개재하여 발현된 대장균 발현벡터를 다음과 같이 확립하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA는 2본쇄 합성올리고뉴클레오티드로서 제조되고, pGEX-C2 핵외 유전자의 적절한 제한 절단 부위(SpeI, XhoI)에 연결된다. 이 경우에, 제조업자의 설명에 의해서, 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 O3(5' CTAGTTGGTTCTGGATTTTAGTGAACGGTGGAGGTTCGC; 서열번호 19)과 O4(5' TCGAGCGAACCTCCACCGTTCACTAAAATCCAGAACCAA; 서열번호 20)를, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 인산화하였다. 그것을 80℃에서 5분동안 연속적으로 가열한 후, 실온에서 서서히 냉각시켰다. 이 2본쇄 DNA단편은 클로닝을 위해 직접 사용되었다. 핵외 유전자 pGEX-C2를 SpeI와 XhoI에 의해 소화하고, 상기 설명한 2본쇄 DNA단편을 삽입하였다. 대장균 JM109는 이 벡터를 이용하여 형질전환하고, 발현을 위한 균주를 얻었다. 균주의 체크는, pGEX3' 시퀀싱 프라이머(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사)를 이용하고 또한 템플릿으로서 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)에 의해 제조된 핵외 유전자 DNA를 이용하여 배열함으로써 염기서열의 삽입을 결정해서 행하였다. 얻어진 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 하룻밤 미리 배양한 후, 그 균주 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서, 170rpm으로 3시간 진탕배양했다. 그 후, IPTG를 첨가(최종농도 1mM)하고, 37℃로 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1/10양의 PBS에 재현탁하였다. 동결 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4OμL를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 조용하게 교반하였다. 이에 의해, 융합 단백질 GST-YN2-C1를 글루타치온세파로스에 흡착시켰다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간동안 교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수한 후 PBS에 대해서 투석하고, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μg를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획(flow-through fractions)을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 YN2-C2(cb)의 최종 정제물을 얻었다. SDS-PAGE에 의해 61.9 kDa의 싱글 밴드를 나타내는 것을 확인했다.
정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정했다. 효소농도는 2.1U/㎖이고, 비활성은 4.1U/mg단백질이었다. 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
(제 7실시예) 카본블랙에의 결합친화력의 평가
카본블랙을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 이 현탁액 10㎖을 테플론제의 원심분리관으로 샘플링하고, 제 6실시예에서 제조된 PHA합성효소 YN2-C2(cb) 및 제 1참조예에서 제조된 YN2-C2의 0.5U에 대한 동량은 이 현탁액에 첨가되고, 이는 실온에서 30분동안 진탕된다. 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해, 카본블랙입자를 침전물로서 회수하고, 카본블랙에 결합되지 않은 효소를 함유하는 상청액으로부터 분리된다. 카본블랙은 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 다시 현탁하고, 원심분리를 반복하고, 이에 의해 카본블랙을 세정하였다. 세정된 카본블랙의 현탁액의 효소활성을 측정한 결과는 표 7에 나타낸다.
카본블랙에의 효소의 결합친화력의 평가
활성 U
YN2-C2(cb) 0.04
YN2-C2 0.01
카본블랙 친화성 서열로 융합된 효소 YN2-C2(cb)가 조절의 효소 YN2-C2에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 따라서 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 8실시예) 카본블랙의 PHA피막구조체
카본블랙을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 이 현탁액 10㎖는 테플론제의 원심분리관으로 샘플링되고, PHA합성효소 YN2-C2(cb) 또는 YN2-C2의 0.5U에 대한 동량을 이 현탁액에 첨가하고, 용액을 실온에서 30분동안 진탕한다. 일단, 카본블랙을 원심분리에 의해 회수하고, 이것을 0.1% Tween-20을 함유한 TBS버퍼에서 다시 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 다음에, 제 2참조예에서 제조한 (R)-3-히드록시-5-페닐발레릴 CoA을 첨가하고, 따라서 5mM의 최종농도를 얻는다. 합성반응은 37℃에서 30분동안 인큐베이팅함으로써 행해진다.
반응혼합물에서 생성된 PHA는 나일블루 A에 의해 염색되고, 현광현미경에 의해 관찰되었다. YN2-C2이 첨가된 시료에서, 유리의 PHA입자가 관찰되었다. 반면에 YN2-C2(cb)이 첨가된 시료에서, 유리의 PHA입자가 관찰되지 않았고, 이에 의해 합성효소에 의한 효과적인 PHA합성이 행해진 것을 확인하였다.
반응혼합물을 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 분리하고, 코어로서 카본블랙을 가진 피막구조체에 의해 수성 케이크를 얻었다. 이 수성케이크를 물에서 재현탁한 후, 피막구조체를 원심분리에 의해 다시 회수하였다. 이 작업을 3회 반복함으로써 세정을 행하였다.
제조된 피막구조체의 수성 케이크의 일부는 진공건조하고, 클로로포름 20㎖에서 현탁하고, 또한 막을 형성하는 PHA를 추출하기 위하여 현탁액을 60℃에서 20시간동안 교반하였다. 0.45㎛의 구멍크기의 막여과에 의해 추출물을 여과하고, 회전증발기에 의해 진공원심분리를 행하고, 또한 종래의 방법에 의해 후속의 메타놀리시스를 행하였다. 메틸 에스테르화 PHA단량체를 확인하기 위하여 가스 크로마토그래프 질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050)에 의해 최종 산물을 분석하였다. 그 결과, 확인한 PHA가 도 2(a) 및 도 2(b)에 도시한 바와 같은 단량체 유닛으로서 3-히드록시-5-페닐발레르산을 가진 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA를 겔투과크로마토그래프(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=16,000 및 Mw=36,000을 얻었다.
(제 9실시예) 실리콘기판에 결합친화력을 가진 아미노산의 획득
(1) 실리콘기판(FZ법에 의해 제조, 면(100), 비저항 100Ω·cm 내지 1㏀·cm)을 메탄올로 세정하고, 기판의 표면을 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 블로킹버퍼(0.1M NaHCO3 (pH 8.6), 5mg/㎖ BSA, 0.1mg/㎖ 스트렙트아비딘, 0.02% NaN3)로 채우고, 그것을 4℃에서 1시간동안 놓아두었다. 다음에 블로킹버퍼를 폐기하고, 실리콘기판을 TBST버퍼(TBS버퍼 +0.1% Tween-20)로 10회 세정하였다.
(2) Ph.D. -7 파지표시펩티드 라이브러리(뉴 잉글랜드 바이오랩사 제품)의 1.4×1011 pfu의 당량을 실리콘기판에 첨가하고, 25℃에서 60분동안 여전히 유지한다.
(3) 실리콘기판위의 용액을 폐기하고, 기판을 TBST버퍼로 세정하였다.
(4) 용출버퍼(0.2M Glycine-HCl (pH 2.2) 1mg/㎖ BSA) 1㎖를 기판에 채우고, 용액을 3분동안 여전히 유지하고, 용액을 마이크로도우스 원심분리관으로 이동시키고, 다음에 중화를 위해 1M Tris-HCl 150㎕(pH 9.1)를 첨가하여 용출된 파지를 얻었다.
(5) 대수증식의 초기단계에서 대장균 ER2537(Escherichia coli ER2537)(뉴잉글랜드 바이오랩사 제품)을 용출된 파지로 감염시키고, 파지를 증폭하였다. 그것은 4.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에, 파지는 원심분리에 의해 균체로부터 분리되고, 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 정제된다. 정제되고 증폭된 파지를 TBS버퍼에서 현탁하고, 대장균을 적합한 일련의 희석으로 감염시킴으로써 적정값을 측정하였다.
(6) 상기 설명한 방법 (1) 내지 (5)은 증폭 파지를 이용하여 3회 더 반복한다. 그러나, 사용되는 TBST버퍼에서 Tween-20의 농도를 0.5%까지 증가시키고, 또한 세정의 조건을 엄격하게 하였다. 각 사이클에서 용출된 파지의 적정값은 표 8에 나타낸다.
각 사이클에서 용출된 파지의 적정값
모액(A) 실리콘기판정합(B) B/A
1회째 1.4×1011 2.8×103 2.0×10-8
2회째 6.5×1011 1.6×105 2.5×10-7
3회째 6.4×1011 1.2×107 1.9×10-5
4회째 8.4×1011 5.3×108 6.3×10-4
(A,B,C의 단위는 pfu/㎖로 나타냄)
대규모의 과잉의 대장균은 최종적으로 용출된 파지로 감염되고, 파지는 클로닝된다. 각 클론을 대장균에 감염시키고 증폭한 후, ssDNA를 제작하고, 램덤영역의 염기서열을 해독하고, 표시하고 있는 펩티드의 아미노산 서열을 결정하였다. 픽업한 30클론의 아미노산서열과 빈도를 표 9에 나타낸다.
결정된 아미노산서열 및 빈도
결정된 아미노산서열 개수 (A) 빈도 (A/30)
서열번호 21DSHFTINAsp-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn 22 0.73
서열번호 185DTFHTINAsp-Thr-Phe-His-Thr-Ile-Asn 5 0.17
서열번호 186ESHFTINGlu-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn 3 0.1
아미노산서열 DSXXTIN(서열번호 180)을 가진 실리콘기판 결합모티프, 특히 실리콘기판에 친화력을 가진 아미노산서열 DSHFTIN(서열번호 21)를 검출하였다.
(제 10실시예) 실리콘기판에 결합친화력을 가진 PHA합성효소의 제작
PHA합성효소의 N말단으로 아미노산서열 DSHFTIN(서열번호 21)의 실리콘기판 친화력서열을 융합함으로써 스페이서 서열 GGGS(서열번호 177)를 개재하여 발현된 대장균 발현벡터를 다음과 같이 확립하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA는 2본쇄 합성올리고뉴클레오티드로서 제조되고, pGEX-C1 핵외 유전자의 적절한 제한 절단 부위(BamHI, SacI)에 연결된다. 이 경우에, 제조업자의 설명서에 따라, 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 O5(5' GATCCGATTCACATTTTACTATTAATGGTGGAGGTTCGGAGCT, 서열번호 22)과 O6(5' CCGAACCTCCACCATTAATAGTAAAATGTGAATCG, 서열번호 23)을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 인산화하였다. 그것을 80℃에서 5분동안 연속적으로 가열한 후, 실온에서 서서히 냉각시켰다. 이 2본쇄 DNA단편은 클로닝을 위해 직접 사용되었다.
핵외 유전자 pGEX-C1를 BamHI와 SacI에 의해 소화하고, 상기 설명한 2본쇄 DNA단편을 삽입하였다. 대장균 JM109는 이 벡터를 이용하여 형질전환하고, 발현을 위한 균주를 얻었다. 균주의 체크는, pGEX5' 시퀀싱 프라이머(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사)를 이용하고 또한 템플릿으로서 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)에 의해 제조된 핵외 유전자 DNA를 이용하여 배열함으로써 염기서열의 삽입을 결정해서 행하였다. 얻어진 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 하룻밤 미리 배양한 후, 그 균주 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서, 170rpm으로 3시간 진탕배양했다. 그 후, IPTG를 첨가(최종농도 1mM)하고, 37℃로 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1/10양의 PBS에 재현탁하였다. 동결 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4O㎕를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 조용하게 교반했다. 이에 의해, 융합 단백질 GST-YN2-C1를 글루타치온세파로스에 흡착시켰다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간동안 교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수한 후 PBS에 대해서 투석하고, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μg를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 YN2-C1(Si)의 최종 정제물을 얻었다. SDS-PAGE에 의해 61.9 kDa의 싱글 밴드를 나타내는 것을 확인했다.
정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정했다. 효소농도는 2.1U/㎖이고, 비활성은 4.1U/mg단백질이었다. 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
(제 11실시예) 실리콘기판에의 결합친화력의 평가
실리콘기판을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼로 세정하였다. 제 10실시예에서 제조된 PHA합성효소 YN2-C1(Si) 및 참조예에서 제조된 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량은 여기에 첨가되고, 이는 실온에서 30분동안 진탕된다. 실리콘기판은 TBS버퍼로 세정하고, 실리콘기판에 결합되지 않은 효소를 제거하였다. 세정된 실리콘기판표면은 TBST버퍼로 채우고, 효소의 기질인 3-히드록시 옥타노일 CoA를 거기에 첨가하고, 실리콘기판에 고정된 효소활성을 CoA의 발생비율에 의해 측정하였다. 그 결과는 표 10에 나타낸다.
실리콘기판에의 효소의 결합친화력의 평가
활성 U
YN2-C1(Si) 0.05
YN2-C1 0.01
실리콘기판 친화성 서열로 융합된 효소 YN2-C1(Si)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 따라서 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 12실시예) 실리콘기판의 PHA적층구조체
실리콘기판을 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼로 세정하였다. PHA합성효소 YN2-C1(Si) 또는 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량을 여기에 첨가하고, 그것을 실온에서 30분동안 진탕한다. 실리콘기판표면을 TBS버퍼로 세정하고, 또한 실리콘기판에 결합되지 않은 효소를 제거하였다. 세정된 실리콘기판표면은 TBST버퍼로 채우고, 제 2참조예에서 제조한 (R)-3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)발레릴 CoA을 첨가하고, 따라서 5mM의 최종농도를 얻는다. 합성반응은 37℃에서 30분동안 인큐베이팅함으로써 행해진다.
반응혼합물 상청액 및 실리콘기판에서 생성된 PHA는 나일블루 A에 의해 염색되고, 현광현미경에 의해 관찰되었다. YN2-C1이 첨가된 시료에서, 유리의 PHA입자가 관찰되었다. 반면에 YN2-C1(Si)이 첨가된 시료에서, 유리의 PHA입자가 반응혼합물 상청액에서 관찰되지 않았고, 이에 의해 합성효소에 의한 효과적인 PHA합성이 행해진 것을 확인하였다. 또한, 실리콘기판위에 적층된 PHA는 형광스테이닝에 의해 관찰될 수 있다.
제조된 PHA적층 실리콘기판구조체를 진공건조하고, 다음에 클로로포름 20㎖에 침지하고, 또한 적층된 PHA를 추출하기 위하여 현탁액을 60℃에서 20시간동안 교반하였다. 0.45㎛의 구멍크기의 막여과에 의해 추출물을 여과하고, 회전증발기에 의해 진공원심분리를 행하고, 또한 종래의 방법에 의해 후속의 메타놀리시스를 행하였다. 메틸 에스테르화 PHA단량체를 확인하기 위하여 가스 크로마토그래프 질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050)에 의해 최종 산물을 분석하였다. 그 결과, 확인한 PHA가 도 3(a) 및 도 3(b)에 도시한 바와 같은 단량체 유닛으로서 (R)-3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산을 가진 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA를 겔투과크로마토그래프(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=17,000 및 Mw=37,000을 얻었다.
(제 13실시예) 피막구조체의 제작
(그래디언트 구조체)
입자직경이 침강법에 의해 균등화된 구리 프탈로시아닌 입자(체적은 입자직경 1.45㎛를 의미함)의 1질량부와 PBS의 39질량부를, 제 2실시예에서 제조한 발현단백질 YN2-C1(pht)(10U/㎖)에 첨가하고, 그 혼합물을 30℃에서 30분동안 적절하게 진탕하여 구리 프탈로시아닌에 PHA합성효소를 침지하였다. 이것은 원심분리기(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 분리되고, 침전물을 PHS용액에서 현탁하고, 다음에 원심분리기(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 다시 분리하여 침전된 효소를 얻었다.
침지된 효소는, 30 mM (R)-3-히드록시옥타노일 CoA(문헌「Eur. J. Biochem., 250, and 432-439 (1997)」의 방법에 의해 제조)와 0.1% 소혈청알부민(시그마 알드리치사 제품)를 포함하는 0.1M 인산버퍼(pH 7.0) 100질량부에 침지되었다. 다음에, 반응혼합물을 이 반응계에 30℃에서 조용하게 진탕하면서, 30 mM (R)-3-히드록시피메일 CoA(문헌「J. Bacteriol., 182, 2753-2760 (2000)」의 방법에 의해 제조)와 0.1% 소혈청알부민(시그마 알드리치사 제품)을 포함하는 0.1M 인산버퍼(pH 7.0)를 마이크로 튜브펌프(MP-3N, 도쿄 리카키카이사 제품에 의해 제조됨)를 이용하여 1분당 25질량부의 비율로 첨가하였다.
30분간 진탕한 후, 최종산물을 미반응 물질 등을 제거하기 위하여 공기건조에 의해 0.1 M 인산버퍼(pH 7.0)로 세정하고, 이에 의해 피막구조체를 얻었다.
이 피막구조체의 표면위에 형성된 폴리머의 질량은 비행 시간 2차이온질량분석장치(TOF-SIMS Ⅳ, CAMECA사 제품)에 의해 측정된다. 얻어진 질량 스펙트럼은, 3-히드록시피멜산 및 3-히드록시옥탄산(몰비 17: 1)의 공중합체로 이루어진 것을 도시한다. 또한, 질량스펙트럼 측정이 동일한 방식으로 TOF-SIMS로 진행되는 경우에, 이온스퍼터링에 의해 피막구조체표면을 조금씩 절단함으로써, 상기 설명한 공중합체에서 3-히드록시피멜산의 조성비가 점차적으로 감소하고, 또한 3-히드록시옥탄산의 조성비가 증가하였다. 그 결과, 실시예의 피막구조체는, 표면이 친수성 작용기를 가진 폴리히드록시 피멜레이트로 피복되고, 또한 하부영역은 하부층에서 연장함에 따라 3-히드록시옥탄산의 조성비가 증가하는, 친수성 작용기를 가진 3-히드록시피멜산과 친수성 작용기를 가진 3-히드록시옥탄산의 공중합체로 피복된 구조체를 가지는 것이 명백하게 되었다.
또한, PHA를 겔투과크로마토그래피(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 분자량에 대하여 평가한 결과, Mn=21,000 및 Mw=40,000을 얻었다.
(제 14실시예) 피막구조체의 제조
(화학적 변성)
구리 프탈로시아닌 입자(입자직경 0.12㎛ 내지 135㎛를 의미함)의 1질량부와 PBS의 39질량부를, 제 2실시예에서 제조한 발현단백질 YN2-C1(pht)(10U/㎖)에 첨가하고, 그 혼합물을 30℃에서 30분동안 조용하게 진탕하여 구리 프탈로시아닌에 PHA합성효소를 침지하였다. 이것은 원심분리기(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 분리되고, 침전물을 PHS용액에서 현탁하고, 다음에 원심분리기(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 다시 분리하여 침전된 효소를 얻었다.
침지된 효소는, 0.1M 인산버퍼(pH 7.0)의 48질량부에서 현탁하고, 3-히드록시-5-페녹시발레르산을 부여하기 위하여 가수분해된 에틸 브로모아세테이트와 3-페녹시-프로판알의 레포르마스키반응에 의해 얻어진 3-히드록시-5-페녹시 발레리아네이트를 가수분해하고 다음에 문헌「Eur. J. Biochem., 250, and 432-439 (1997)」의 방법에 따라 제조를 행함으로써 제작된 (R,S)-3-히드록시-5-페녹시발레릴 CoA의 0.8질량부와, 문헌「Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)」의 방법에 따라 합성한 3-히드록시-7-옥텐산의 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화하고 다음에 문헌「Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)」의 방법에 따라 제조를 행함으로써 제작된 (R,S)-3-히드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA의 0.2질량부와, 소혈청알부민(시그마 알드리치사 제품)의 0.1질량부를 상기 현탁액에 첨가하고, 다음에 최종산물을 30℃에서 2시간동안 적절하게 진탕하여 시료 1을 얻었다.
(R,S)-3-히드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA을 3-히드록시옥타노일 CoA로 변경한 것을 제외하고는 상기 수순과 동일한 수순을 반복하여 대조표준으로서 시료 2를 었었다.
상기 설명한 시료 10㎕가 슬라이드 글래스위에 시료화한 후에, 1% 나일블루 A 수용액 10㎕를 슬라이스 글래스에 첨가하여 혼합하고, 그 위에 커버유리를 놓고, 다음에 결과를 형광현미경(330-380nm여과필터, 420nm롱패스흡수필터, 니콘주식회사 제품)으로 관찰하였다. 다음에, 모든 시료에서, 구리 프탈로시아닌입자 표면이 형광을 방출하는 것을 확인하였다. 따라서, 구리 프탈로시아닌 입자의 표면이 PHA로 피복되었다.
비교로서, 구리 프탈로시아닌 1질량부를 0.1M 인산버퍼(pH 7.0) 49질량부에 첨가하고 30℃에서 2.5시간동안 적절하게 진탕하고, 다음에 최종물을 동일한 방식으로 나일블루 A로 염색하고 형광현미경을 사용하여 관찰하였다. 그 결과, 구리 프탈로시아닌입자표면은 형광이 전혀 방출되지 않는다.
또한, 시료의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하여 진공건조한 후, 클로로포름에 현탁하여, 60℃로 20시간동안 교반하여 피막을 구성하는 PHA를 추출하였다. 이 추출액에 대해 1H-NMR 분석을 실시했다(사용 기기: FT-NMR; Bruker DPX400, 측정 핵종: lH, 사용 용매: 겹클로로포름(TMS들이)). 결과 데이터로부터 계산한 각 측쇄 유닛의 유닛%는 표 11에 나타낸다.
피막구조체의 피막 PHA의 구성 1H-NMR, 유닛%
모노머 유닛 시료 1 시료 2
3-히드록시-5-페녹시 발레르산 84% 76%
3-히드록시-7,8-에폭시 옥탄산 16% -
3-히드록시옥탄산 - 24%
상기 설명한 시료 1의 50질량부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하여 피막구조체를 회수하고, 정제수 50질량부에서 결과물의 현탁작업을 3회 반복하였다. 다음에, 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5질량부를 현탁액에 용해시켰다. 용해를 확인 후, 동결건조에 의해 물을 제거하였다(시료 3으로 칭함). 또한, 시료 3을 70℃로 12시간 반응시켰다(시료 4로 칭함). 상기 설명한 시료 3 및 시료 4를 클로로포름에 현탁하여, 60℃로 20시간동안 교반하여 피막을 구성하는 PHA를 추출하고, 진공 건조하여 클로로포름을 제거하고, 시차주사 열량계(DSC; 퍼킨 엘머사 제품, Pyris 1, 온도상승: 1O℃/분)장치로 측정을 실시했다. 다음에, 시료 3에서는 90℃부근에 명확한 발열 피크가 관찰되고, 폴리머중의 에폭시기와 헥사메틸렌디아민과의 반응이 일어나서, 폴리머끼리의 가교가 진행되고 있는 것이 나타난다. 한편, 시료 4에서는 명확한 히트 플로우는 보지 못하고, 가교 반응이 거의 완료하고 있는 것이 나타난다.
동일한 샘플에 대해, 적외흡수를 측정했다(FT-IR; 퍼킨 엘머사 제품, 1720X). 다음에, 시료 3에서 볼 수 있던 아민 피크(3340 cm-1 부근) 및 에폭시피크(822 cm-1 부근)가 시료 4에서는 소실하고 있다.
이상의 결과로부터, 측쇄에 에폭시 유닛을 가지는 PHA와 헥사메틸렌디아민을 반응시킴으로써, 가교 폴리머를 얻을 수 있는 것이 분명해졌다.
한편, 비교로서, 동일한 평가를 시료 2에 대하여 행하였지만, 폴리머끼리의 가교를 명확하게 나타내는 상기 설명한 경우와 마찬가지의 평가결과는 얻을 수 없었다.
(제 15실시예) 구리 프탈로시아닌에의 결합친화력을 가진 아미노산서열의 획득
(1) 구리 프탈로시아닌(알파형: 도쿄 카세이 코교사 제품)을 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl)에 현탁하여 5mg/㎖의 농도를 얻었다. 이 10㎕를 에펜도르프관에 첨가하고, TBST버퍼(TBS버퍼 +0.1% Tween-20) 990㎕를 희석을 위해 첨가하였다.
(2) Ph.D. -12 파지표시펩티드 라이브러리(뉴 잉글랜드 바이오랩사 제품)의 1.4×1010의 당량을 관에 첨가하고, 이는 25℃에서 10분동안 놓아두었다.
(3) 관을 원심분리(20,630×g, 5분)에 의해 분리한 후, 상청액을 폐기하고 안료를 침전물로서 회수하였다. 회수된 안료를 TBST버퍼에서 다시 현탁하고, 다음에 안료를 TBST버퍼에 의해 10회 세정하였다.
(4) 용출버퍼(0.2M Glycine-HCl(pH 2.2) 1mg/㎖ BSA) 100㎕를 첨가하고 용액을 1분동안 놓아둔 후, 원심분리(20,630×g, 5분)를 행하여 상청액을 다른 에펜도르프관으로 이동시키고, 다음에 중화를 위해 1M Tris-HCl(pH 9.1) 15㎕를 첨가하여 용출된 파지를 얻었다.
(5) 대수증식의 초기단계에서 대장균 ER2537(Escherichia coli ER2537)(뉴잉글랜드 바이오랩사 제품)을 용출된 파지로 감염시키고, 파지를 증폭시켰다. 그것을 4.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에, 파지는 원심분리에 의해 균체로부터 분리되고, 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 정제하였다. 정제되고 증폭된 파지를 TBS버퍼에서 현탁하고, 대장균에 일련의 희석에 적합한 감염에 의해 적정값을 측정하였다.
(6) 상기 설명한 방법 (1) 내지 (5)은 증폭 파지를 이용하여 3회 더 반복한다. 그러나, 사용되는 TBST버퍼에서 Tween-20의 농도를 0.5%까지 증가시키고, 또한 세정의 조건을 엄격하게 하였다. 지금까지, 동일한 동작은 대조표준으로서 에펜도르프관을 위하여 2회째부터 행하였다. 각 사이클에서 용출된 파지의 적정값은 표 12에 나타낸다.
각 사이클에서 용출된 파지의 적정값
모액(A) 조절 정합(B) 프탈로시아닌 정합(C) C/A C/B
1회째 4.0×1011 1.2×106 3.0×10-6
2회째 1.6×1011 1.1×105 1.7×105 1.1×10-5 1
3회째 2.0×1011 1.6×105 3.0×108 1.5×10-3 1800
4회째 1.7×1011 2.7×106 5.3×109 3.1×10-2 2000
(A,B,C의 단위는 pfu/㎖로 나타냄)
대규모의 과잉의 대장균은 최종적으로 용출된 파지로 감염되고, 파지는 클로닝된다. 각 클론을 대장균에 감염시키고 증폭한 후, ssDNA를 제작하고, 램덤영역의 염기서열을 해독하고, 표시하고 있는 펩티드의 아미노산 서열을 검출함으로써, 구리 프탈로시아닌에의 결합친화력을 가진 아미노산서열을 얻었다.
그 결과의 아미노산서열과 빈도를 표 13에 나타낸다.
(제 16실시예)
제 2실시예에서와 동일한 수순을 반복하고, 구리 프탈로시아닌에의 결합친화력을 가진 PHA합성효소를 다음과 같이 제조하였다. 각 아미노산서열(서열번호 24 내지 서열번호 38)로 스페이서 서열 GS를 개재하여 PHA합성효소의 N말단에 융합함으로써 발현된 대장균 발현벡터를 다음과 같이 확립하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA에서, 그것은 2본쇄 합성올리고뉴클레오티드로서 제조되므로, 다음 표 14의 한 세트의 합성 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.
표 14에서의 각 아미노산서열에 대한 2종류의 합성DNA는, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 각각 인산화하였다. 다음에, 같은 몰량의 2종류의 합성 DNA를 혼합하고 80℃에서 5분동안 가열하고, 다음에 실온에서 서서히 냉각시켜, 2본쇄 DNA단편을 형성하였다. 형성된 2본쇄 DNA단편은 클로닝을 위해 직접 사용되었다.
핵외 유전자 pGEX-C1을 BamHI와 SacI에 의해 소화하고, 상기 설명한 2본쇄 DNA단편을 삽입하였다. 대장균 JM109는 벡터를 사용하여 형질전환하고, 발현을 위한 균주를 얻었다. 균주의 체크는, pGEX5' 시퀀싱 프라이머(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사)를 이용하고 또한 템플릿으로서 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)에 의해 제조된 핵외 유전자 DNA를 이용하여 배열함으로써 염기서열의 삽입을 결정해서 행하였다. 얻어진 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 하룻밤 미리 배양한 후, 그 균주 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서, 170rpm으로 3시간 진탕배양했다. 그 후, IPTG를 첨가(최종농도 1mM)하고, 37℃로 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1/10양의 PBS에 재현탁하였다. 동결 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4O㎕를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 조용하게 교반했다. 이에 의해, 융합 단백질 GST-aa24-YN2-C1 내지 GST-aa38-YN2-C1을 글루타치온세파로스에 흡착시켰다. 융합 단백질 GST-aa##-YN2-C1에서, aa##는, PHA합성효소와 GST사이에 융합되는 서열번호 ##의 아미노산서열을 함유하는 폴리펩타이드가 발현된 것을 의미한다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간동안 교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수한 후 PBS에 대해서 투석하고, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μg를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 aa24-YN2-C1(pht) 내지 aa38-YN2-C1(pht)의 최종 정제물을 얻었다. 융합 단백질 GST-aa##-YN2-C1에서, aa##는, 서열번호 ##의 아미노산서열을 함유하는 폴리펩타이드가 PHA합성효소의 N말단로 융합됨으로써 발현되는 것을 의미한다.
각 정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정하였다. 효소농도는 1.9U/㎖이고, 비활성은 4.0U/mg단백질이었다. 각 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
(제 17실시예) 구리 프탈로시아닌에의 결합친화력의 평가
구리 프탈로시아닌을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 이 현탁액 10㎖는 테플론제의 원심분리관으로 샘플링되고, 제 16실시예에서 제조된 PHA합성효소 aa24-YN2-C1(pht) 내지 aa38-YN2-C1(pht)및 제 1참조예에서 제조된 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량을 이 현탁액에 첨가하고, 실온에서 30분동안 진탕하였다. 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해, 구리 프탈로시아닌입자를 침전물로서 회수하고, 구리 프탈로시아닌에 결합되지 않은 효소를 함유하는 상청액으로부터 분리하였다. 구리 프탈로시아닌은 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 다시 현탁하고, 원심분리를 반복하고, 이에 의해 구리 프탈로시아닌을 세정하였다. 세정된 구리 프탈로시아닌의 현탁액의 효소활성을 측정한 결과는 표 15에 나타낸다.
구리 프탈로시아닌 친화성 서열로 융합된 효소 aa24-YN2-C1(pht) 내지 aa38-YN2-C1(pht)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 따라서 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 18실시예)
구리 프탈로시아닌에 결합될 수 있는 2종류의 아미노산서열, Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(서열번호 24)와 Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 25)를, Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 144)를 부여하기 위하여 스페이서 서열 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 181)를 개재하여 나타낸 일련의 순서로 모두 연결하고, 스페이서서열 GS의 사용을 통하여 PHA합성효소의 N말단에 더 융합하여, 다음의 대장균 발현벡터를 제작하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA는, 서열 1: 5'-GATCCAAATATGATAGCCGTCATCTGCATACCCATAGCCATGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCGAACCGTCTGGGCCGTCGTCCGGTGCGTTGGGAAGAGCT-3'(서열번호 145)와 서열 2: 5'-CTTCCCAACGCACCGGACGACGGCCCAGACGGTTCGGGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCATGGCTATGGGTATGCAGATGACGGCTATCATATTTG-3'(서열번호 146)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 인산화하고, 그들에 같은 몰량을 혼합하고, 80℃에서 5분동안 가열하고 다음에 실온에서 천천히 냉각함으로써, 2본쇄 DNA단편으로서 형성되었다. 이와 같이 형성된 2본쇄 DNA단편은, 제 16실시예와 마찬가지로 핵외 유전자 pGEX-C1의 BamHI/SacI 부위에 삽입되고, 대장균 JM109는 발현용 균주의 수율을 위해 이 벡터를 이용하여 형질전환되었다. 제 16실시예에 의한 것과 마찬가지로, 발현된 단백질 aa144-YN2-C1(pht), 그 N말단에서 융합되는 서열번호 144의 아미노산서열을 정제하여 10U/㎖의 정제된 효소용액이 부여되었다. 구리 프탈로시아닌에 결합되는 정제 효소의 능력은 제 17실시예와 마찬가지로 평가하였다. 그 결과는 표 16에 나타낸다.
구리 프탈로시아닌에의 효소의 결합친화력의 평가
효소 융합 아미노산서열 활성 U
aa144-YN2-C1(pht) 서열번호 144KYDSRHLHTHSHGGGSGGGSPNRLGRRPVRWE 0.11
YN2-C1 - 0.01
구리 프탈로시아닌 친화성 서열로 융합된 효소 aa144-YN2-C1(pht)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 19실시예) 카본블랙에 결합친화력을 가진 아미노산서열의 획득
(1) 카본블랙(시그마 알드리치 저팬사 제품)을 현탁하여, 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl)의 5mg/㎖의 농도가 부여되었다. 이 10㎕를 에펜도르프관에 첨가하고, TBST버퍼(TBS버퍼 +0.1% Tween-20) 990㎕를 첨가하여 희석하였다.
(2) Ph.D. -12 파지표시펩티드 라이브러리(뉴 잉글랜드 바이오랩사 제품)의 1.4×1010의 당량을 관에 첨가하고, 이는 25℃에서 10분동안 놓아두었다.
(3) 관을 원심분리(20,630×g, 5분)에 의해 분리한 후, 상청액을 폐기하고 안료를 침전물로서 회수하였다. 회수된 안료를 TBST버퍼에서 다시 현탁하고, 원심분리를 반복하고, 다음에 안료를 TBST버퍼에 의해 10회 세정하였다.
(4) 용출버퍼(0.2M Glycine-HCl(pH 2.2) 1mg/㎖ BSA) 100㎕를 첨가하고 용액을 1분동안 놓아둔 후, 원심분리(20,630×g, 5분)를 행하여 상청액을 다른 에펜도르프관으로 이동시키고, 다음에 1M Tris-HCl(pH 9.1) 15㎕를 첨가하고 중화하여 용출된 파지를 얻었다.
(5) 대수증식의 초기단계에서 대장균 ER2537(Escherichia coli ER2537)(뉴잉글랜드 바이오랩사 제품)을 용출된 파지로 감염시키고, 파지를 증폭시켰다. 그것을 4.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에, 파지는 원심분리에 의해 균체로부터 분리되고, 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 정제하였다. 정제되고 증폭된 파지를 TBS버퍼에서 현탁하고, 대장균에 일련의 희석에 적합한 감염에 의해 적정값을 측정하였다.
(6) 상기 설명한 방법 (1) 내지 (5)는 증폭 파지를 이용하여 4회 더 반복한다. 그러나, 사용되는 TBST버퍼에서 Tween-20의 농도를 0.5%까지 증가시키고, 또한 세정의 조건을 엄격하게 하였다. 지금까지, 동일한 동작은 대조표준으로서 에펜도르프관을 위하여 2회째부터 행하였다. 각 사이클에서 용출된 파지의 적정값은 표 17에 나타낸다.
각 사이클에서 용출된 파지의 적정값
모액(A) 조절 정합(B) 카본블랙 정합(C) C/A C/B
1회째 4.0×1011 8.9×106 2.2×10-5
2회째 1.6×1011 1.1×105 3.8×106 2.4×10-5 35
3회째 2.0×1011 1.6×105 6.0×106 3.0×10-5 40
4회째 1.7×1011 1.1×106 1.5×108 8.8×10-4 140
5회째 1.9×1011 2.0×106 2.7×109 1.4×10-2 1400
(A,B,C의 단위는 pfu/㎖로 나타냄)
대규모의 과잉의 대장균은 최종적으로 용출된 파지로 감염되고, 파지는 클로닝된다. 각 클론을 대장균에 감염시키고 증폭한 후, ssDNA를 제작하고, 램덤영역의 염기서열을 해독하고, 이에 의해 카본블랙에의 결합친화력을 가진 아미노산서열을 얻었다. 그 결과의 아미노산서열과 빈도를 표 18에 나타낸다.
(제 20실시예)
카본블랙에의 결합친화력을 가진 PHA합성효소를 다음과 같이 제조하였다. 각 아미노산서열(서열번호 39 내지 서열번호 63)로 스페이서 서열 GS를 개재하여 PHA합성효소의 N말단에 융합함으로써 발현된 대장균 발현벡터를 다음과 같이 확립하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA에서, 그것은 2본쇄 합성 DNA로서 제조되므로, 다음 표 19의 한 세트의 합성 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.
표 19에서의 각 아미노산서열에 대한 2종류의 합성DNA는, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 각각 인산화하였다. 다음에, 같은 몰량의 2종류의 합성 DNA를 혼합하고 80℃에서 5분동안 가열하고, 다음에 실온에서 서서히 냉각시켜, 2본쇄 DNA단편을 형성하였다. 형성된 2본쇄 DNA단편은 클로닝을 위해 직접 사용되었다.
핵외 유전자 pGEX-C1을 BamHI와 SacI에 의해 소화하고, 상기 설명한 2본쇄 DNA단편을 삽입하였다. 대장균 JM109는 벡터를 사용하여 형질전환하고, 발현을 위한 균주를 얻었다. 균주의 체크는, pGEX5' 시퀀싱 프라이머(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사)를 이용하고 또한 템플릿으로서 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)에 의해 제조된 핵외 유전자 DNA를 이용하여 배열함으로써 염기서열의 삽입을 결정해서 행하였다. 얻어진 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 하룻밤 미리 배양한 후, 그 균주 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서, 170rpm으로 3시간 진탕배양했다. 그 후, IPTG를 첨가(최종농도 1mM)하고, 37℃로 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1/10양의 PBS에 재현탁하였다. 동결 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4O㎕를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 조용하게 교반했다. 이에 의해, 융합 단백질 GST-aa39-YN2-C1 내지 GST-aa63-YN2-C1을 글루타치온세파로스에 흡착시켰다. 융합 단백질 GST-aa##-YN2-C1에서, aa##는, PHA합성효소와 GST사이에 융합되는 서열번호 ##의 아미노산서열을 함유하는 폴리펩타이드가 발현된 것을 의미한다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간동안 교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수한 후 PBS에 대해서 투석하고, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μg를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 aa39-YN2-C1(cb) 내지 aa63-YN2-C1(cb)의 최종 정제물을 얻었다. 융합 단백질 GST-aa##-YN2-C1(cb)에서, aa##는, 서열번호 ##의 아미노산서열을 함유하는 폴리펩타이드가 PHA합성효소의 N말단로 융합됨으로써 발현되는 것을 의미한다.
각 정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정하였다. 효소농도는 1.9U/㎖이고, 비활성은 4.0U/mg단백질이었다. 각 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
(제 21실시예) 카본블랙에의 결합친화력의 평가
카본블랙을 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 0.5%(w/v)가 부여된다. 이 현탁액 10㎖는 테플론제의 원심분리관으로 샘플링되고, 제 20실시예에서 제조된 PHA합성효소 aa39-YN2-C1(cb) 내지 aa63-YN2-C1(cb)및 제 1참조예에서 제조된 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량을 이 현탁액에 첨가하고, 실온에서 30분동안 진탕하였다. 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해, 카본블랙입자를 침전물로서 회수하고, 카본블랙에 결합되지 않은 효소를 함유하는 상청액으로부터 분리하였다. 카본블랙은 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 다시 현탁하고, 원심분리를 반복하고, 이에 의해 카본블랙을 세정하였다. 세정된 카본블랙의 현탁액의 효소활성을 측정한 결과는 표 20에 나타낸다.
카본블랙 친화성 서열로 융합된 효소 aa39-YN2-C1(cb) 내지 aa63-YN2-C1(cb)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 따라서 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 22실시예)
카본블랙에 결합될 수 있는 2종류의 아미노산서열, Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(서열번호 39)와 Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(서열번호 40)를, Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(서열번호 147)를 부여하기 위하여 스페이서 서열 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 181)를 개재하여 나타낸 일련의 순서로 모두 연결하고, 스페이서서열 GS의 사용을 통하여 PHA합성효소의 N말단에 더 융합하여, 다음의 대장균 발현벡터를 제작하였다. 이 아미노산서열을 엔코딩하는 DNA는, 서열 1: 5'-GATCCTGGCCGCATGCGTGGAAAGTGTGGTGGCCGGCGAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCAACTGGTGGTGGCCGCCGTATATTCGTCATCAGCCGGAGCT-3'(서열번호 148)와 서열 2: 5'-CCGGCTGATGACGAATATACGGCGGCCACCACCAGTTGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCGCTCGCCGGCCACCACACTTTCCACGCATGCGGCCAG-3'(서열번호 149)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 인산화하고, 그들에 같은 몰량을 혼합하고, 80℃에서 5분동안 가열하고 다음에 실온에서 천천히 냉각함으로써, 2본쇄 DNA단편으로서 형성되었다. 이와 같이 형성된 2본쇄 DNA단편은, 제 20실시예와 마찬가지로 핵외 유전자 pGEX-C1의 BamHI/SacI 부위에 삽입되고, 대장균 JM109는 발현용 균주의 수율을 위해 이 벡터를 이용하여 형질전환되었다. 제 20실시예에 의한 것과 마찬가지로, 발현된 단백질 aa147-YN2-C1(cb), 그 N말단에서 융합되는 서열번호 147의 아미노산서열을 정제하여 10U/㎖의 정제된 효소용액이 얻어졌다. 카본블랙에 결합되는 정제 효소의 능력은 제 21실시예와 마찬가지로 평가하였다. 그 결과는 표 21에 나타낸다.
카본블랙에의 효소의 결합친화력의 평가
효소 융합 아미노산서열 활성 U
aa147-YN2-C1(cb) 서열번호 147WPHAWKVWWPASGGGSGGGSNWWWPPYIRHQP 0.15
YN2-C1 - 0.01
카본블랙 친화성 서열로 융합된 효소 aa147-YN2-C1(cb)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 23실시예) 정전하 화상현상토너의 제조 및 평가
구리 프탈로시아닌은, 샌드밀에 의해 분산되고, 따라서 더이상 0.1㎛의 입자직경이 부여되지 않고, 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS버퍼 39질량부를 이 구리 프탈로시아닌 1질량부에 첨가해서 현탁하였다. 이 현탁액 10㎖가 테플론제의 원심분리관에 샘플링되고, 제 16실시예에서 제조된 PHA합성효소 aa24-YN2-Cl(pht)의 4U에 대한 동량을 거기에 첨가하고, 실온에서 30분간 진탕하여, 안료 표면위에 흡착되는 PHA합성효소를 초래하였다. 이것에 원심분리(98,000m/s2 (10,000G), 4℃, 10분)가 부여되고, 침전물을 PBS용액에서 현탁하고, 원심분리(98,000m/s2 (10,000G), 4℃, 10분)가 다시 실시되어, 구리 프탈로시아닌에 PHA합성효소를 고정하였다.
상기 설명한 각 고정화 효소를 0.1M 인산버퍼(pH 7.0) 48질량부에서 현탁하였다. 다음에, (R,C)-3-히드록시-5-페녹시발레릴 CoA 1질량부는, 재료로서 문헌「J. Org. Chem., 55, 1490-1492 (1990)」에 기재된 방법에 의해 합성된 에틸 브로모아세테이트와 3-페녹시 프로판알을 이용하여 아연으로 레포르마스키반응에 의해 얻어진 3-히드록시-5-페녹시 발레리네이트를 합성하고, 3-히드록시-5-페녹시 발레르산을 얻기 위하여 문헌「Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)」의 방법에 의해 처리된 이 처리에 의해 제조되고, 소혈청알부민(시그마 알드리치사 제품) 0.1질량부를 거기에 첨가하였다. 최종 혼합물은 30℃에서 2시간동안 완만하게 진탕하였다. 제조된 블루 마이크로캡슐화 안료(이하, 착색제로 칭함)를 여과, 세정 및 건조하여, 착색제 1을 얻었다.
이 착색제 1의 진공건조한 후, 클로로포름 20㎖에서 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 휘저었고, 피막을 구성하는 폴리머를 추출하였다. 0.45㎛의 구멍크기의 막여과에 의해 추출물을 여과하고, 회전증발기에 의해 진공원심분리를 행한 후, 종래의 방법에 의해 후속의 메타놀리시스를 행하고, 가스 크로마토그래프 질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 최종 산물을 분석하였다. 그 결과, 얻어진 착색제 1의 피막의 주요성분이 (R)-3-히드록시-5-페닐발레르산유닛을 가진 PHA인 것이 확인되었다.
또한, PHA를 겔투과크로마토그래프(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=29,000이 부여되었다.
마이크로캡슐화 전후의 안료는 레이저 도플러시스템 입자크기 분포측정기(UPA-150; NIKKISO사 제품)를 이용하여 체적평균입자직경에 대해 측정하였다. 그 결과는 표 22에 요약하였다.
다음에, 조성을 위한 다음의 재료를 이축 추출기(L/D=30)에 의해 혼합, 용융 및 반죽하였다.
· 스티렌-부틸 아크릴레이트 공중합체 수지(70℃의 유리전이온도): 100질량부
· 착색제 1: 5질량부
· 전하조절제(Hoechst사 제품;NXVP434): 2질량부
반죽된 혼합물을 냉각한 후, 해머밀에 의해 거칠게 연마하고, 제트밀로 미분쇄하고 분류하여, 그라인딩법에 의한 시안 착색입자(1)를 얻었다. 시안 착색입자(1)의 입자크기에서, 7.1㎛의 중량평균입자직경과 6.0수%의 미세분말의 양이 부여되었다.
시안 착색입자(1) 100질량부에 대하여, 플로우 임프로버로서 헥사메틸디실라잔에 의해 처리된 소수성 실리카 미립자 1.5질량부를 헨첼믹서에 의해 건조배합하여 실시예의 시안토너(1)를 얻었다. 또한, 얻어진 시안토너(1) 7질량부와 수지피복된 자성 페라이트 캐리어(평균입자직경: 45㎛) 93질량부를 혼합하여, 자성 브러시 현상(1)을 위한 2성분계 시안현상액을 제조하고, 이하 설명하는 평가를 행하였다.
〈제 1비교예〉
YN2-C1을 PHA합성효소 aa24-YN2-C1(pht)대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 23실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 시안토너(2)를 얻었다. 또한, 제 23실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 토너를 사용하는 것을 반복하여, 2성분계 시안현상액(2)을 얻었다. 이 토너는 제 23실시예와 마찬가지로 특성을 평가하였다.
〈제 2비교예〉
YN2-C1의 10U에 대한 동량을 PHA합성효소 aa24-YN2-C1(pht)의 4U에 대한 동량대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 23실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 시안토너(3)를 얻었다. 또한, 제 23실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 토너를 사용하는 것을 반복하여, 2성분계 시안현상액(3)을 얻었다. 이 토너는 제 23실시예와 마찬가지로 특성을 평가하였다.
〈제 3비교예〉
구리 프탈로시아닌 5질량부를 착색제 1 대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 23실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 시안토너(4)를 얻었다. 또한, 제 23실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 토너를 사용하는 것을 반복하여, 2성분계 시안현상액(4)을 얻었다. 이 토너는 제 23실시예와 마찬가지로 특성을 평가하였다.
〈평가 1〉
10초 내지 300초동안 교반한 후, 표준온도 및 습도(25℃, 60% RH) 및 고온 및 습도(30℃, 80% RH)의 환경하에 상기 언급한 현상제(1),(2),(3),(4)에 대해 충전된 토너의 양을 측정하였다. 그 결과는 표 22에 요약하였다.
토너번호 안료입자크기 표준온도와 습도에서전하량(μC/g) 고온 및 습도에서전하량(μC/g)
마이크로캡슐화 전(㎛) 마이크로캡슐화 후(㎛) 10초 교반 300초 교반 10초 교반 300초 교반
제 23실시예 1 0.804 0.102 -23.6 -27.7 -22.1 -26.5
제 1비교예 2 0.796 0.853 -20.9 -25.3 -18.3 -22.4
제 2비교예 3 0.811 0.107 -24.1 -27.5 -21.8 -26.4
제 3비교예 4 0.808 -18.4 -14.8 -14.1 -19.6
마이크로캡슐화 전후의 안료의 크기는, 제 1비교예에서 안료의 캡슐밀봉이 제 2비교예와 비교하여 충분하지 않은 것을 도시한다. 이것은, 제 1비교에서 안료에 첨가된 효소의 양이 제 2비교예의 경우보다 작기 때문인 것으로 추정된다. 한편, 제 23실시예에서 첨가된 효소의 양은 제 1비교예의 것과 동일하지만, 마이크로캡슐화은 제 2비교예의 것과 거의 등가이고, 그 대량의 전하를 도시한다.
그 결과, 제 23실시예는 소량의 효소에 의해 안료를 마이크로캡슐화할 수 있고, 충전된 토너의 양이 효과적으로 증가될 수 있는 것을 나타낸다.
다음에, 화상형성은 상기 설명한 착색제를 이용하여 행한다. 도 4에 도시한 바와 같이, 시판의 레이저빔프린터 LBP-EX(캐논사 제품)에서 재사용기구를 설치함으로써 개선되고 리세트된 화상형성장치는 화상을 형성하는 수단으로서 채용된다. 다시 말하면, 도 3(a) 및 도 (3b)에 도시한 바와 같은 화상형성장치는, 인쇄후에 광전도체드럼(20)에 접촉하는 클리너(21)의 탄성블레이드(22)에 의해 광전도체드럼(20)위에 잔류하는 인쇄되지 않은 토너를 스크래핑하는 공정과, 클리너롤러에 의해 클리너(21)의 내부에 토너를 전송하는 공정과, 클리너 리유즈(23)를 통해서 그것을 더 통과시키는 공정과, 전송스크루를 가진 공급용 파이프(24)에 의해 호퍼(25)를 통하여 현상장치(26)에 토너를 되돌리는 공정과, 재생한 토너를 재사용하는 공정을 포함하는 작동시스템을 구비한다.
도 4에 도시한 바와 같은 화상형성장치에서, 광전도체드럼(20)의 표면은 1차 충전롤러(27)에 의해 충전된다. 도전성 카본이 분산되고 나일론 수지로 도포된 러버롤러(직경 12mm, 접촉압력 50g/cm)를 1차 충전롤러(27)를 위해 사용하여, 레이저광노출(600dpi, 도면에 도시하지 않음)에 의해 정전 잠상서포터(광전도체드럼(20))위에 어두운 공간전압 VD=-700V 및 밝은 공간전압 VL=-200V로 정전 잠상을 형성한다. 토너서포터를 현상슬리브(28)를 사용함으로써, 카본블랙이 분산된 수지로 피복된 표면은 1.1의 표면거칠기 Ra를 가진다.
도 5는 제 24실시예 및 제 2비교예에서 사용된 1조성 현상제를 위한 현상장치의 주요부분의 확대 단면도를 도시한다. 정전잠상을 현상하는 조건에 대하여, 현상슬리브(28)의 속도는 광전도체드럼(20)의 대향면의 이동속도의 1.1배로 설정하고, 또한 광전도체드럼(20)과 현상슬리브(28)사이의 스페이스α(S와 D사이)는 270㎛로 설정되었다. 우레탄 루버블레이드(29)는 토너의 층두께를 조정하는 부재로서 사용하기 위하여 접촉된다. 또한, 토너화상을 정착시키는 열정착장치는 160℃의 온도로 설정되었다. 또한, 도 6 및 도 7에 도시한 정착장치를 사용하였다.
상기 설명한 바와 같이, 표준온도 및 습도(25℃, 60% RT)에서, 토너를 성공적으로 공급하면서, 연속모드(즉, 현상장치를 중지하지 않고 토너의 소비를 증가시키는 모드)에서 8매(A4사이즈)/분의 인쇄속도로 30,000매를 인쇄하였다. 화상농도는, 이하에 표시한 판별기준에 의거하여 그들의 내구성을 평가하기 위하여 얻어진 화상을 인쇄하여 측정하였다. 또한, 이하 나타내는 판별기준에 의거하여 화상포그를 평가하기 위하여 10,000번째 종이를 관찰하였다. 또한, 동시에, 각 유닛과 상기한 각 토너사이의 일치를 평가하기 위하여 내구 테스트후에 화상형성장치를 구성하는 각 유닛의 상태를 관찰하였다. 그 결과는 표 23에 나타낸다.
(내구동안 화상농도전이)
종래 프린터용 보통지(75g/㎡)의 부여된 개수는 초기 화상의 것에 대하여 인쇄 종료시의 화상의 화상농도유지의 정도를 평가하기 위하여 인쇄하였다. 또한, 평가용 사본농도 0.00을 가진 인쇄된 화상의 백색부분에 관하여 화상농도를 측정하기 위하여 맥베쓰반사계(Macbeth Corp.)를 사용하였다.
A: 뛰어남 (인쇄 종료시에 화상농도는 1.40이상이다.)
B: 양호 (인쇄 종료시에 화상농도는 1.35이상 1.40이하이다.)
C: 통과 (인쇄 종료시에 화상농도는 1.00이상 1.35이하이다.)
D: 불량 (인쇄 종료시에 화상농도는 1.00이하이다.)
(화상포그)
종래 프린터용 보통지(75g/㎡)의 부여된 개수는 인쇄 종료시에 전체 백색 음영화상에 의거하여 평가를 위해 인쇄하였다. 보다 상세하게, 다음의 방식으로 평가를 행하였다.
반사율측정기(Reflectometer Odel TC-6DS, Tokyo Denshoku Co., Ltd)를 이용하여 측정한 인쇄한 후 백색부분 반사농도의 나쁜 값과 인쇄 전의 평균반사농도는 Ds와 Dr로 각각 나타내었다. 차이(Ds-Dr)는 포그의 양으로서 취하고, 다음의 판별기준으로 평가하였다.
A: 뛰어남 (포그의 양은 0%이상 1.5%이하이다.)
B: 양호 (포그의 양은 1.5%이상 3.0%이하이다.)
C: 실용성 (포그의 양은 3.0%이상 5.0%이하이다.)
D: 실용불가 (포그의 양은 5.0%이상이다.)
(화상형성장치를 위한 매칭평가)
1. 현상슬리브로 매칭
현상슬리브표면위에 잔류하는 토너의 고착상태와 인쇄테스트후에 인쇄된 화상위에 잔류하는 토너의 효과는 시각적으로 평가할 수 있다.
A: 뛰어남 (발생하지 않음)
B: 양호 (거의 발생하지 않음)
C: 실용성 (고착은 존재하지만 화상에의 영향은 적음)
D: 실용불가 (고착이 많이 존재하여, 불균일 화상을 초래함)
2. 광전도체드럼으로 매칭
광전도체드럼표면위에 스크래치와 잔류하는 토너고착의 발생의 상태와 인쇄된 화상위의 효과는 시각적으로 평가할 수 있다.
A: 뛰어남 (발생하지 않음)
B: 양호 (스크래치는 약간 발생하지만, 화상은 효과적이지 않음)
C: 실용성 (고착 및 스크래치는 존재하지만, 화상에의 영향은 거의 없음)
D: 실용불가 (고착이 많이 존재하고, 라인형상의 화상결함에 수직으로 상승함)
3. 정착장치로 매칭
고정막표면의 상태는 표면특성의 결과와 잔류하는 토너의 고정상태를 얻을 수 있도록 관찰하였다. 그 결과는 내구성을 평가하기 위하여 평균화 하였다.
(1) 표면특성
인쇄테스트 후에 고정된 막표면위의 스크래치와 스크레이프의 상태는 시각적으로 관찰되고 평가되었다.
A: 뛰어남 (발생하지 않음)
B: 양호 (거의 발생하지 않음)
C: 실용성
D: 실용불가
(2) 잔류하는 토너의 고착상태
인쇄테스트후에 고정된 막표면위에 잔류하는 토너의 고착상태는 시각적으로 관찰되고 평가되었다.
A: 뛰어남 (발생하지 않음)
B: 양호 (거의 발생하지 않음)
C: 실용성
D: 실용불가
토너 출력 화상평가 각 유닛용 매칭평가
내구시의 화상농도전이 화상포그10,000매 현상슬리브 광전도체 드럼 정착장치
초기단계 1,000매 10,000매 30,000매 표면특성 토너고착
제 23실시예 1 A A A A A A A A A
제 1비교예 2 A A A B B A B A B
제 2비교예 3 A A A A A A A A A
제 3비교예 4 A A B C C A B A B
모든 판별기준에서 양호한 결과는, 안료의 마이크로캡슐화가 충분하게 행해진 제 23실시예 및 제 2비교예의 토너에 대해 얻었다. 그 결과, 제 23실시예는 뛰어난 화상형성능력의 토너가 소량의 효소로 효과적으로 생성되는 것을 도시한다.
(제 24실시예) 컬러필터의 제조 및 평가
구리 프탈로시아닌은 샌드밀에 의해 분산되고, 따라서 그 크기는 대략 0.1㎛였다. 이 재료의 1질량부를 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS버퍼 39질량부에 첨가하여 얻어진 용액을 현탁하였다. 이 현탁액(10㎖)은 테플론 제조의 원심분리관에 놓고, 제 16실시예에서 제조된 PHA합성효소 aa25-YN2-C1(pht)의 4U동량을 이것에 첨가하고, 다음에 얻어진 용액을 실온에서 30분간 교반하여 안료표면위에 흡착되는 PHA합성효소를 초래하였다. 이것을 원심분리(98,000m/s2 (10,000G), 4℃, 10분)하고, 침전물을 PBS용액에서 현탁하고, 다음에 현탁액을 다시 원심분리(98,000m/s2 (10,000G), 4℃, 10분)하여, 구리 프탈로시아닌 위에 PHA합성효소를 고정하였다.
상기 설명한 고정화효소를 0.1M 인산버퍼(pH 7.0)의 48질량부에서 현탁하고, 이 현탁액에 문헌「Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)」의 방법에 의해 제조된 (R)-3-히드록시피멜릴 CoA 1질량부와 소혈청알부민(시그마 케미컬사 제품) 0.1질량부를 첨가하고, 다음에 얻어진 용액을 30℃에서 2시간동안 적절하게 진탕하였다. 생성한 마이크로캡슐화 안료를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하였다. 이 마이크로캡슐화 안료 4질량부에 대해, 10질량부의 에틸렌 글리콜과, 15질량부의 디에틸렌 글리콜과, 0.6질량부의 스티렌/말레산 수지의 모노에탄올 아민염(분자량 30,000, 산가 300을 의미함)과, 70.4질량부의 이온교환수를 첨가하고, 다음에 상기 용액을 교반블레이드(80rpm)로 교반하고 분산시켜서, 착색조성물(1)을 부여하였다.
또한, 상기와 같이 회수한 마이크로캡슐화 안료의 PHA단량체를 제 23실시예로서 나타내었다. PHA는 3-히드록시피멜산으로 구성된 PHA인 것이 확인되었다.
또한 PHA의 분자량은, Mn=47,000을 부여하기 위하여 겔투과크로마토그래피로 제 23실시예에서와 마찬가지로 결정하였다.
다음에, 착색조성물(1)을 이용하는 잉크제트기록장치에 의해 블루잉크도트를 유리판위에 형성하였다. 또한, 도트를 80℃에서 20분동안 건조시키고 180℃에서 1시간동안 더 건조시켜서, 착색층을 형성하였다. 이와 같이 얻어진 착색층의 두께는 0.4㎛였다. 다음에, 이 안료 미립자층상에 투명 보호막으로서 열경화형 수지(하이코트 LC-2001, 산요 케미컬사 제품)를 스피너에 의해 건조막의 두께가 0.5㎛가 되도록 도포하였다. 120℃로 30분간 프리베이크한 후, 200℃로 30분간 막을 베이크해서, 보호막을 형성하여, 본 발명의 컬러필터(1)를 얻었다.
〈제 4비교예〉
YN2-C1을 PHA합성효소 aa25-YN2-C1(pht)대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 24실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 시안토너(2)를 얻었다. 또한, 제 24실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 토너를 사용하는 것을 반복하여, 2조성물 시안현상액(2)을 얻었다. 이 토너는 제 24실시예와 마찬가지로 특성을 평가하였다.
〈제 5비교예〉
YN2-C1의 10U에 대한 동량을 PHA합성효소 aa25-YN2-C1(pht)의 4U에 대한 동량대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 24실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 시안토너(3)를 얻었다. 또한, 제 24실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 토너를 사용하는 것을 반복하여, 2조성물 시안현상액(3)을 얻었다. 이 토너는 제 24실시예와 마찬가지로 특성을 평가하였다.
〈제 6비교예〉
구리 프탈로시아닌 4질량부를 착색조성물(1) 대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 24실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 시안토너(4)를 얻었다. 또한, 제 24실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 토너를 이용하여 2조성물 시안현상액(4)을 얻었다. 이 토너는 제 24실시예와 마찬가지로 특성을 평가하였다.
〈평가 2〉
제 24실시예 및 제 4비교예 내지 제 6비교예에서 착색조성물의 마이크로캡슐화 안료의 체적평균입자크기와 실온에서 30일간 저장한 후의 체적평균입자크기를, 레이저 드롭퍼 방식 입도분포측정기(UPA-150; 닛키소 사 제품)를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 표 24에 나타내었다.
여기서, 마이크로캡슐화 전의 입자크기는 0.102㎛이었다.
착색 조성물 체적평균입자크기/㎛(저장 전) 체적평균입자크기/㎛(저장 후)
제 24실시예 1 0.124 0.132
제 4비교예 2 0.108 0.359
제 5비교예 3 0.129 0.141
제 6비교예 4 0.102 0.458
마이크로캡슐화 전후(저장전에서 저장)의 안료의 크기는, 제 4비교예에서 안료의 마이크로캡슐화가 제 5비교예에 비해서 충분하지 않은 것을 나타낸다. 이것은, 제 4비교예에서 안료에 첨가된 효소의 양이 제 5비교예의 경우보다 작기 때문인 것으로 추측된다. 한편, 제 24실시예에서 첨가된 효소의 양이 제 4비교예에서의 것과 동일하지만, 마이크로캡슐화는 제 5비교예의 것과 거의 등가이다.
마이크로캡슐화가 충분히 행해진 제 24실시예 및 제 5비교예에서 마이크로캡슐화 안료의 체적 평균입자크기는, 저장전후에 거의 등가값을 가리키고, 뛰어난 저장 안정성을 나타낸다.
그 결과, 제 24실시예는 소량의 효소에 의해 안료를 마이크로캡슐화할 수 있고, 안료의 응고를 효과적으로 방지할 수 있는 것을 나타낸다.
다음에, 컬러필터(1),(2),(3),(4)를 다음의 방식으로 평가하였고, 결과는 표 25에 요약하였다.
(1) 응집 얼룩짐
제조한 컬러필터의 화상을 위상차 현미경으로 투과광에 의한 관찰을 실시하였다.
(2) 착색층의 기판과의 밀착성
제작한 컬러필터를 125℃, 85% RH 및 6시간의 조건으로 압력조리기구테스트에 의해 평가하였다.
(3) 투명성
컬러필터의 투명성에 대해, 투과율을 측정함으로써 평가하였다. 400nm 내지 700nm의 범위에서 최대 투과율을 얻을 수 있는 파장으로 측정하였다. 또한, 측정은 화소에 대해 10개소에서 행하여, 평균화하였다.
또한, 동시에 육안에 의한 작용평가를 행하였다.
(4) 색채성
컬러필터의 색채성을, 육안에 의한 작용 평가에 의해 평가하였다.
(5) 콘트라스트(소편특성)
2매의 편광판을 그의 광축을 변화할 수 있도록 서로 면하여 배치하고, 이들 편광판사이에 편광판과 접촉시켜서 컬러필터를 배치하였다. 이 상태로, 액정표시패널용 백라이트(상품명: SLC3LC1EX4UA, 토시바 라이텍사 제품)를 이용하여 컬러필터에 백라이트를 조사하고, 2매의 편광판의 광축을 변화시켰다. 광축이 직교할 때와 평행이 될 때에 있어서의 자연광에서의 휘도를 휘도계("Topcon" BM-5A)를 이용하여 측정하였다. 이들 휘도의 비를 소편특성으로서 산출하였다.
또한, 동시에 육안에 의한 작용 평가를 행하였다.
컬러필터 응집 얼룩짐 밀착성 투명성 색채성 콘트라스트
제 24실시예 1 없음 양호 84양호 양호 1014양호
제 4비교예 2 약간 있음 양호 76약간 떨어짐 약간떨어짐 943약간 떨어짐
제 5비교예 3 없음 양호 85양호 양호 1017양호
제 6비교예 4 약간 있음 양호 71약간 떨어짐 약간 떨어짐 904약간 떨어짐
안료의 마이크로캡슐화를 충분히 행한 제 24실시예와 제 5비교예에서 컬러필터는, 응집 얼룩짐이 없고, 밀착성, 투명성, 색채성, 콘트라스트 등의 뛰어난 특성을 가진다.
그 결과, 제 24실시예는, 뛰어난 특성의 컬러필터가 소량의 효소에 의해 효과적으로 제조될 수 있는 것을 나타낸다.
(제 25실시예) 전기영동입자의 제조 및 평가
Tween-20의 계면활성제 1%질량을 함유하는 20mM 인산버퍼(pH 7.0)에 25%질량의 농도로 카본블랙의 안료를 현탁하였다. 이 용액을 볼밀로 혼합하여, 카본블랙의 분산을 제조하였다. 분산은, 레이저산란법을 이용하여 1.2㎛의 입자크기에 의해 단일분산상태가 되는 것을 발견하였다.
다음에, 효소의 농도가 40U/㎖가 되도록 분산에 제 20실시예에서 생산한 PHA합성효소 aa39-YN2-C1(cb)를 첨가하고, 결과 혼합물을 20℃에서 30분간 놓아두게 하였다. 그 후, 결과물에 제 2참조예에서 생성한 (R)-3-히드록시옥타노일 CoA를 첨가하여, 효소의 최종농도가 5mM이 되었다. 합성반응은 37℃에서 30분동안 인큐베이션에 의해 행하였다.
카본블랙이 마이크로캡슐화된 전기영동입자의 수소함유케이크를 산출하기 위하여 반응계를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하였다. 수소함유케이크를 에탄올에서 재현탁하고, 다음에 전기영동입자를 다른 원심분리작업에 의해 회수하였다. 이 동작은 탈수를 행하기 위하여 3회 반복하였다. 다음에, 전기영동입자를 등유를 이용하여 현탁하고, 원심분리를 반복함으로써 분산매체를 등유로 재배치하고 세정하여, 전기영동표시분산계(1)를 부여하였다.
상기 설명한 전기영동입자를 진공건조하고, 결과 물질을 클로로포름 20㎖에서 현탁하고, 다음에 현탁액을 60℃에서 20시간동안 교반하여, 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출물은, 0.45㎛의 구멍크기의 막여과와, 회전증발기에 의한 진공원심분리와, 통상의 방법에 의한 메타놀리시스와, 가스 크로마토그래피/질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의한 분석과, 메틸 에스테르화 PHA단량체의 후속의 확인을 행하였다. 그 결과, PHA가 도 3(a) 및 도 3(b)에 도시한 바와 같은 단량체 유닛으로서 3-히드록시옥탄산을 가진 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA를 겔투과크로마토그래프(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=22,000 및 Mw=42,000을 얻었다.
〈제 7비교예〉
YN2-C1을 PHA합성효소 aa39-YN2-C1(cb)대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 25실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 전기영동입자(2)를 얻었다. 또한, 제 25실시예에서와 마찬가지로 이 입자를 이용하여, 전기영동표시분산계(2)를 얻었다.
〈제 8비교예〉
YN2-C1의 100U에 대한 동량을 PHA합성효소 aa39-YN2-C1(cb)의 40U에 대한 동량대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 25실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 전기영동입자(3)를 얻었다. 또한, 제 25실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 입자를 이용하여 전기영동표시분산계(3)를 얻었다.
〈제 9비교예〉
카본블랙(25g)을 75g의 열융합된 폴리에틸렌수지에 첨가하고, 롤밀을 이용하여 균일하게 분산시켰다. 다음에 혼합물을 냉각에 의해 경화시키고, 미세하게 분쇄하여, 전기영동입자(4)를 산출하였다. 제 25실시예에서와 마찬가지로 이 입자를 이용하여 전기영동표시분산계(4)를 얻었다.
〈평가 3〉
절연매체용 전기영동입자의 분산성을 평가하였다.
필요에 따라, 테스트관에 놓여진 전기영동입자의 3g의 시편에 50㎖의 분산매체(등유)와, 0.6g의 계면활성제(폴리카르복실산 유도체)를 첨가하고, 결과혼합물은 자성교반기로 2시간동안 교반하였다. 오븐에서 가열함으로써 분산매체의 제거를 완료한 후에 상청액(1.0㎖)을 즉시 인출하고 세정하였다. 여기서, 중량은 Wo(g)로 나타내었다. 또한, 상기 설명한 혼합물을 소정의 시간동안 놓아두게 하고, 다음에 오븐에서 가열함으로써 분산매체의 제거를 완료한 후에 10㎖의 상청액을 테스트관에서 인출하고 다음에 중량을 측정하였다. 중량은 Wi(g)로 나타내었다. 다음에 분산안정성(S)을 다음의 방정식에 의거하여 산출하였다.
(방정식 1)
분산안정성 S(%)=Wi(g)/Wo(g)×100
전기영동입자의, 레이저분산법에 의한 입자크기와 분산안정성(S)의 결과를 표 26에 나타낸다.
전기영동입자 입자크기(㎛) 분산안정성(20분 후)
제 25실시예 1 1.6 97%
제 7비교예 2 1.3 24%
제 8비교예 3 1.7 97%
제 9비교예 4 1.2 2%
마이크로캡슐화 전후의 안료의 크기는, 제 7비교예에서 안료의 마이크로캡슐화가 제 8비교예에 비해 충분하지 않은 것을 나타낸다. 이것은, 제 7비교예에서 안료에 첨가된 효소의 양이 제 8비교예의 경우보다 작기 때문인 것으로 추측된다. 한편, 제 25실시예에서 첨가된 효소의 양은 제 7비교예의 것과 동일하지만, 마이크로캡슐화는 제 8비교예의 것과 거의 등가이다.
마이크로캡슐화가 충분히 행해진 제 25실시예와 제 8비교예에서 분산매체에서 전기영동입자의 분산안정성이 뛰어나다.
그 결과, 제 25실시예는 소량의 효소에 의해 안료를 마이크로캡슐화할 수 있고, 안료가 전기영동입자가 되는 경우에 분산안정성을 효과적으로 개선시킬 수 있는 것을 나타낸다.
다음에, 각 전기영동입자의 이동을 확인하였다.
두께 150㎛로 PES막으로 이루어진 제 1의 광투과가능한 기판위에 ITO전극을 막형성하고, 포토리소그래피와 습식에칭에 의해 라인형상으로 기판에 대해 패터닝을 행하였다. 광의 불규칙한 반사에 의해 백색화된 티타늄옥사이드를 함유하는 수지층을 절연층으로서 이 기판위에 형성하기 위하여 제조하였다. 또한, 티타늄 카르비드를 제 2전극으로서 그 위에 막형성하고, 포토리소그래피와 습식에칭에 의해 라인형상의 형태로 제조하였다. 또한, 제 1전극만을 에칭하고 원형으로 구멍을 만들었다. 높은 투명성 폴리이미드층을 제 2전극위에 또한 형성하였다. 다음에, 제 2기판의 접합에서 열밀봉접착층을 패턴으로 형성하였다.
PES막으로 이루어진 제 2의 광투과가능한 기판을 열프레스성형에 의해 오목형상으로 형성하고, 제 1기판에의 접합부분에서 제 1기판으로서 열밀봉접착층을 형성하였다.
이 제 2기판의 오목부에서, 투명절연액체 및 제 25실시예 및 제 7비교예 내지 제 9비교예에서 각각 생성한 전기영동입자(1),(2),(3),(4)를 별도로 적재하였다. 제 2기판재료의 PHS막보다 큰 굴절률을 가진 디이오딘메탄을 절연매체로서 사용하였다.
적재후에, 제 1 및 제 2기판을 적층하고 접착층을 위치결정하고, 열밀봉하였다.
이것은 표시장치를 부여하기 위하여 전압인가회로로 제공된다.
그 후, 이와 같이 제조된 표시장치를 이용하여 표시를 행하였다. 인가전압은 ±50V로 설정하였다.
제 1전극이 양극이 되고, 제 2전극이 음극이 되도록 전압을 인가한 경우에, 안료의 마이크로캡슐화를 충분히 행하지 않은 전기영동입자(1),(3)는 오목구조체의 제 2기판의 바닥면 주변에 위치한 제 2전극위로 이동된다. 이것이 제 2기판측으로부터 관찰된 경우에, 제 2기판의 오목구조체가 렌즈로서 작동되기 때문에, 따라서 광은 제 1기판의 중심부에서 집광되고 다음에 렌즈전체를 백색으로 보이게 하기 위하여 노출되고 백색화된 절연층으로 들어간다. 또한, 극성이 전환되어 제 1전극이 음극이 되고 제 2전극이 양극이 되도록 전압이 인가되는 경우에, 전기영동입자는 중심부에서 회수되고, 렌즈전체에 전기영동입자의 흑색이 나타난다. 이 때에, 응답속도는 20msec이하가 되고, 따라서 2가지의 색을 표시할 수 있는 표시장치를 산출하였다.
한편, 안료의 마이크로캡슐화가 충분히 행해지지 않은 전기영동입자(2),(4)에 대하여, 전압인가에 의한 이동은 불균일하고, 따라서 렌즈전체가 백색 또는 흑색으로 보이게 하지 않는다.
(제 26실시예)
안료잉크의 제조 및 평가
Tween-20의 계면활성제 1%질량을 함유하는 20mM 인산버퍼(pH 7.0)에 25%질량의 농도로 카본블랙의 안료를 현탁하였다. 이 용액을 볼밀로 혼합하여, 카본블랙의 분산을 제조하였다. 분산은, 레이저산란법을 이용하여 102nm의 입자크기에 의해 단일분산상태가 되는 것을 발견하였다.
다음에, 효소의 농도가 40U/㎖가 되도록 분산에 제 20실시예에서 생산한 PHA합성효소 aa40-YN2-C1(cb)를 첨가하고, 결과 혼합물을 20℃에서 30분간 놓아두게 하였다. 그 후, 결과물에 제 2참조예에서 생성한 (R)-3-히드록시옥타노일 CoA를 첨가하여, 효소의 최종농도가 5mM이 되었다. 합성반응은 37℃에서 30분동안 인큐베이션에 의해 행하였다.
코어로서 카본블랙을 가진 마이크로캡슐화 전기영동입자의 물함유케이크를 산출하기 위하여 반응계를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하였다. 물함유케이크를 물에서 재현탁하고, 다음에 마이크로캡슐화 안료(1)를 다른 원심분리작업에 의해 회수하였다. 이 작업은 세정을 위하여 3회 반복하였다.
생성한 마이크로캡슐화 안료의 물함유케이크의 일부는 진공건조하고, 결과 물질을 클로로포름 20㎖에서 현탁하고, 다음에 현탁액을 60℃에서 20시간동안 교반하여, 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출물은, 0.45㎛의 구멍크기의 막여과와, 회전증발기에 의한 진공원심분리와, 통상의 방법에 의한 메타놀리시스와, 가스 크로마토그래피/질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의한 분석과, 메틸 에스테르화 PHA단량체의 후속의 확인을 행하였다. 그 결과, PHA가 단량체유닛으로서 3-히드록시옥탄산을 가진 PHA인 것이 확인되었다. 또한, PHA를 겔투과크로마토그래프(GPC; TOSOH CORPORATION HLC-8020, column; Polymer Laboratory PLgel MIXED-C (5㎛), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌으로 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=18,000 및 Mw=37,000을 얻었다.
수용성 블랙잉크는 상기 설명한 마이크로캡슐화 안료(1)를 이용하여 제조하였다. 블랙잉크의 조성물은 다음과 같다. 각 조성물의 양은 질량부로 나타낸다. 분산교반기(TK Homodyspa 20type Tokushu Kika Kogyo Co., Ltd.)가 이용되고, 분산시간은 3시간이었다.
마이크로캡슐화 안료 50질량부
글리세린 6질량부
디에틸렌 글리콜 7질량부
폴리옥시에틸렌 도데실 에테르 0.2질량부
프로셀 XL-2: 방부제(ZENECA Corp.) 0.3질량부
벤조트리아졸: 부식억제제(Kanto Kagaku Co., Ltd.) 0.005질량부
물 나머지
〈제 10비교예〉
YN2-C1을 PHA합성효소 aa40-YN2-C1(cb)대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 26실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 마이크로캡슐화 안료(2)를 얻었다. 또한, 제 26실시예에서와 마찬가지로 이 안료를 이용하여, 수용성 안료 잉크(2)를 얻었다.
〈제 11비교예〉
YN2-C1의 100U에 대한 동량을 PHA합성효소 aa39-YN2-C1(cb)의 40U에 대한 동량대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 26실시예와 마찬가지의 방식으로 행하여 마이크로캡슐화 안료(3)를 얻었다. 또한, 제 26실시예에서와 마찬가지의 방식으로 이 안료를 이용하여 수용성 안료 잉크(3)를 얻었다.
〈제 12비교예〉
미세하게 분쇄된 카본블랙을 마이크로캡슐화 안료대신에 사용하는 것을 제외하고는 제 26실시예와 마찬가지의 방식으로 수용성 안료잉크(4)를 제조하였다.
〈평가 4〉
분산안정성과 평균분자크기는 상기 설명한 바와 같이 제조된 수용성 안료 잉크(1),(2),(3),(4)에 대하여 평가하였다. 분산안정성은 70℃에서 3일간 저장한 후에 측정함으로써 상분리의 연장에 의거하여 전체분산액의 높이에 안료성분의 침전에 의해 발생된 반투명 상부층의 비율로서 표현되었다. 평균입자크기는 레이저 도플러시스템 입자크기 분포측정기(UPA 150형, Lease & Nothropp)로 측정된 중앙값 지름으로서 규정하였다. 그 결과는 표 27에 부여하였다.
수용성안료 잉크 평균입자직경(nm) 상분리
제조직후 70℃, 3일후
제 26실시예 1 181 192 0
제 10비교예 2 163 752 11
제 11비교예 3 183 194 0
제 12비교예 4 151 2358 28
마이크로캡슐화 전후의 안료의 크기는, 제 10비교예에서 안료의 마이크로캡슐화가 제 11비교예에 비해서 충분하지 못한 것을 나타낸다. 이것은, 제 10비교예에서 안료에 첨가된 효소의 양이 제 11비교예의 경우보다 작기 때문인 것으로 추정된다. 한편, 제 26실시예에 첨가된 효소의 양은 제 10비교예에서의 것과 동일하지만, 마이크로캡슐화는 제 11비교예의 것과 거의 등가이다.
마이크로캡슐화가 충분히 행해진 제 26실시예와 제 11비교예의 수용성 안료의 분산안정성은 뛰어나다.
그 결과, 제 26실시예는 적은 양의 효소에 의해 안료를 마이크로캡슐화할 수 있고, 안료가 수용성 안료 잉크가 되는 경우에 분산 안정성을 효과적으로 개선시킬 수 있는 것을 나타낸다.
다음에, 잉크를 잉크제트프린터용 잉크로서 평가하였다.
주주사방향으로 720dpi의 간격에서 7.2kHz의 방출주파수에서 360dpi해상도를 가진 기록헤드로 구비된 잉크제트프린터에 의한 상기 설명한 수용성 안료 잉크(1),(2),(3),(4)를 이용하여 인쇄를 행하였다. 기록헤드의 잉크의 드로플렛 당 방출량은 대략 25pL로 인출되고, 기록은 360dpi×720dpi의 해상도에 의해 형성된 한 화소에 한 방울의 잉크를 주사함으로써 행해진다. 다음에, OD, 구형상의 도트, 고체형상의 불균일성, 스트라이크 쓰로우프, 평활화 및 화상의 거칠기를 고체형상의 화상과 문자패턴을 인쇄함으로써 평가하였다. 또한, 캐논사에 의한 PB시트를 인쇄매체로서 사용하였다. 이 경우에,
·OD는 5mm×5mm의 고체형상의 패턴의 부분을 측정함으로써 얻어진 값을 칭한다.
·도트주변형상은 루페를 이용하여 라인형상의 에지부분의 형태를 시각적으로 관찰함으로써 체크하였다.
A: 라인에지는 직선형태로 명확하게 연결되었다.
B: 라인에지의 선형성은 약간 잃었지만, 실제적으로는 거의 문제가 없다.
D: 라인에지의 선형성을 잃었다.
·고체형상균일성은 5mm×5mm의 고체형상의 패턴위의 농도의 균일성을 시각적으로 관찰함으로써 검사하였다.
A: 백색의 점부분이 관찰되지 않았다.
B: 백색의 점부분이 관찰되지만, 뚜렷이 나타나지 않는 것은 문제가 없다.
D: 백색의 점부분이 뚜렷이 나타나고, 화질에 영향이 있다.
·스트라이크 쓰로우는 고체음영패턴이 인쇄된 부분의 패턴이 블랙으로부터 관찰에 의해 시트를 통과하는 것을 볼 수 있는 지의 여부를 관찰함으로써 체크하였다. 또한, 블랙의 대응하는 부분의 광학농도는 맥베쓰 반사계로 측정하였다.
A: 쓰로우를 거의 볼 수 없고, 맥베쓰 반사계에 의한 광학농도는 0.2이하이다.
B: 쓰로우를 약간 볼 수 있지만, 인식할 수 없다.
맥베쓰 반사계에 의한 광학농도는 0.2이상 0.25이하이다.
·잉크의 드롭에 의해 인쇄매체위에 형성된 잉크도트의 형상을 로퍼로 관찰함으로써 둥근것을 결정하였다.
A: 거의 모든 도트는 통계적인 관점에서 거의 둥글다.
B: 도트는 통계적인 관점에서 둥글지 않지만, 화상형성에 문제를 일으키지 않는다.
C: 비교적 다수의 도트가 통계적인 관점에서 둥글지 않고, 변형된 도트가 형성되었다.
그 결과는 이하 표 28에 나타낸다.
수용성 안료잉크 OD 도트크기(㎛) 도트주변 형상 고체음영균일성 스트라이크쓰로우 둥근 것
제 26실시예 1 1.46 69 A A A A
제 10비교예 2 1.32 51 B B B B
제 11비교예 3 1.48 70 A A A A
제 12비교예 4 1.08 45 D D B C
안료의 마이크로캡슐화가 충분히 행해지지 않은 제 24실시예 및 제 5비교예에서 제조된 잉크에 대하여, 잉크제트프린터용 잉크에 사용된 경우에, 기록매체(페이퍼)위의 안료의 응집은 잉크도트에서 균일하게 분산되도록 미세한 입자가 되고, 적절한 퍼짐의 도트크기를 가지고, 또한 도트내의 화상농도분포는 균일하고 잉크도트는 피더링 등이 거의 없이 주변 및 외부형상에서 뛰어나다.
그 결과, 제 26실시예는 소량의 효소에 의해 뛰어난 특성을 가진 수용성 안료잉크를 효과적으로 제조할 수 있는 것을 도시한다.
(제 27실시예) 티타늄옥사이드에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열의 획득
(1) 티타늄옥사이드(Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd., titanium oxide(Ⅳ), rutile type)를 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl)에서 현탁하고, 농도는 5mg/㎖였다. 이 용액(10㎕)을 에펜도르프관에 첨가하고, 990㎕의 TBST버퍼(TBS버퍼 +0.1% Tween-20)로 희석하였다.
(2) Ph.D. -12 파지표시펩티드 라이브러리(뉴 잉글랜드 바이오랩사 제품)의 1.4×1010의 당량을 관에 첨가하고, 이는 25℃에서 10분동안 놓아두었다.
(3) 관을 원심분리(20,630×g, 5분)에 의해 분리한 후, 상청액을 폐기하고 안료를 침전물로서 회수하였다. 회수된 안료를 TBST버퍼에서 다시 현탁하고, 현탁액을 원심분리하였다. 이 작업을 10회 반복하여 안료를 TBST버퍼로 세정하였다.
(4) 100㎕의 용출버퍼(0.2M Glycine-HCl(pH 2.2) 1mg/㎖ BSA)를 첨가하고 용액을 1분동안 놓아둔 후, 원심분리(20,630×g, 5분)를 행하여 상청액을 다른 에펜도르프관으로 이동시켰다. 중화를 위하여 이 용액에 15㎕의 1M Tris-HCl(pH 9.1)를 첨가하고, 용출된 파지를 얻었다.
(5) 대수증식의 초기단계에서 대장균 ER2537(Escherichia coli ER2537)(뉴잉글랜드 바이오랩사 제품)을 용출된 파지로 감염시키고, 파지를 증폭시켰다. 그것을 4.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 다음에, 파지는 원심분리에 의해 균체로부터 분리되고, 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 정제하였다. 정제되고 증폭된 파지를 TBS버퍼에서 현탁하고, 대장균에 일련의 희석에 적합한 감염에 의해 적정값을 측정하였다.
(6) 상기 설명한 방법 (1) 내지 (5)은 증폭 파지를 이용하여 4회 더 반복한다. 그러나, 사용되는 TBST버퍼에서 Tween-20의 농도를 0.5%까지 증가시키고, 또한 세정의 조건을 엄격히 한 것에 유의해야 한다. 동일한 동작은 대조표준으로서 에펜도르프관을 위하여 2회째부터 행하였다. 각 사이클에서 용출된 파지의 적정값은 표 29에 나타낸다.
각 사이클에서 용출된 파지의 적정값
모액(A) 조절 정합(B) 티타늄옥사이드 정합(C) C/A C/B
1회째간 4.0×1011 8.9×106 2.2×10-5
2회째 1.6×1011 1.1×105 3.8×106 2.4×10-5 35
3회째 2.0×1011 1.6×105 6.0×106 3.0×10-5 40
4회째 1.7×1011 1.1×106 1.5×108 8.8×10-4 140
5회째 1.9×1011 2.0×106 2.7×109 1.4×10-2 1400
(A,B,C의 단위는 pfu/㎖로 나타냄)
최종적으로 용출된 파지는, 대규모의 과잉의 대장균으로 감염시킴으로써 클로닝된다. 각 클론을 대장균에 감염시키고 증폭한 후, ssDNA를 제작하였다. 티타늄옥사이드에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열은 램덤영역의 염기서열을 해독함으로써 얻었다. 이에 의해 얻어진 아미노산서열과 빈도를 표 30에 나타낸다.
(제 28실시예)
티타늄옥사이드에 대해서 결합능을 지닌 PHA합성효소를 다음과 같이 제조하였다. 각 아미노산서열(서열번호 150 내지 서열번호 157)로 스페이서 서열 GS를 개재하여 PHA합성효소의 N말단에 융합함으로써 발현된 대장균 발현벡터를 다음과 같이 확립하였다. 표 31에 부여된 것과 같이 합성된 올리고뉴클레오티드는 이들 2본쇄 DNA로서 이들 아미노산서열을 코딩하는 DNA의 제조를 위하여 배열된다.
표 31에서의 각 아미노산서열에 대한 2종류의 합성DNA는, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 각각 인산화하였다. 다음에, 같은 몰량의 2종류의 합성 DNA를 혼합하고 혼합물을 95℃에서 5분동안 가열하고, 다음에 실온에서 서서히 냉각시키고, 이에 의해 2본쇄 DNA단편을 형성하였다. 형성된 2본쇄 DNA단편은 클로닝을 위해 직접 사용되었다.
핵외 유전자 pGEX-C1을 BamHI와 SacI에 의해 소화하고, 상기 설명한 2본쇄 DNA단편을 삽입하였다. 대장균 JM109는 벡터를 사용하여 형질전환하고, 발현을 위한 균주를 얻었다. 균주의 확인은, pGEX5' 시퀀싱 프라이머(아마샘 파마시아·바이오 텍 주식회사)를 이용하고 또한 템플릿으로서 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)에 의해 제조된 핵외 유전자 DNA를 이용하여 배열함으로써 염기서열의 삽입을 결정해서 행하였다. 얻어진 균주를 LB-Amp 배지 10㎖에서 미리 배양한 후, 그 균주를 함유하는 최종물의 0.1㎖를, 10㎖의 LB-Amp 배지에 첨가하고, 37℃에서, 170rpm으로 3시간 교반에 의해 배양했다. 그 후, IPTG를 그것(최종농도 1mM)에 첨가하고, 37℃로 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG로 유도한 대장균을 집균(8000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 1/10양의 PBS에 재현탁하였다. 동결, 융해 및 초음파처리에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(8000×g, 10분, 4℃)하여 고형의 오염물을 제거하였다. 목적의 발현 단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST융합 단백질을 글루타치온세파로스 4B 비드(Glutathion Sepharose 4B beads: 아마샘 파마시아·바이오 텍사 제품)로 정제했다.
사용한 글루타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 글루타치온세파로스를 동일량의 PBS로 3회 세정(8000×g, 1분, 4℃)한 후, 4% BSA 함유 PBS의 동일량을 첨가하고 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후, 동일량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁하였다. 미리 처리한 글루타치온세파로스 4O㎕를, 무세포 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃로 적절하게 교반했다. 이 방식으로, 융합 단백질 GST-aa150-YN2-C1 내지 GST-aa157-YN2-C1을 글루타치온세파로스에 흡착시켰다. 융합 단백질 GST-aa##-YN2-C1에서, aa##는, PHA합성효소와 GST사이에 융합되는 서열번호 ##의 아미노산서열을 함유하는 폴리펩타이드가 발현된 것을 의미한다.
흡착 후, 원심분리(8000×g, 1분, 4℃)하여 글루타치온세파로스를 회수하고, 400μL의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 글루타치온 40μL를 첨가하고, 4℃로 1시간동안 교반하고, 흡착한 융합 단백질을 용출하였다. 원심분리(8000×g, 2분, 4℃)하여 상청액을 회수하였다. PBS에 대해서 투석을 행하여, GST 융합 단백질을 정제했다. SDS-PAGE에 의해, 단백질이 싱글밴드를 나타내는 것을 확인했다.
각 GST 융합 단백질(500μg)를 PreScission 프로테아제(아마샘 파마시아·바이오 텍, 5U)로 소화한 후, 글루타치온 세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로쓰루 분획을, PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼으로 처리하고, 발현 단백질 aa150-YN2-C1(ti) 내지 aa157-YN2-C1(ti)의 최종 정제물을 얻었다. 융합 단백질 GST-aa##-YN2-C1(ti)에서, aa##는, 서열번호 ##의 아미노산서열을 함유하는 폴리펩타이드가 PHA합성효소의 N말단로 융합됨으로써 발현되는 것을 의미한다.
각 정제 효소의 활성은 상기 설명한 방법으로 측정했다. 또한, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 키트(피어스 케미컬사 제품)에 의해 측정하였다. 효소농도는 1.9U/㎖이고, 비활성은 4.0U/mg단백질이었다. 각 정제 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용하여 농축하고, 1OU/㎖의 정제 효소용액을 얻었다.
(제 29실시예) 티타늄옥사이드에의 결합력의 평가
티타늄옥사이드를 0.1% Tween-20함유 TBS버퍼에서 현탁하고, 따라서 농도는 0.5%(w/v)였다. 이 10㎖의 용액을 테플론제의 원심분리관에 놓고, 제 28실시예에서 제조된 PHA합성효소 aa150-YN2-C1(ti) 내지 aa157-YN2-C1(ti) 및 제 1참조예에서 제조된 YN2-C1의 0.5U에 대한 동량을 이 현탁액에 첨가하고, 실온에서 30분동안 교반하였다. 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해, 티타늄옥사이드입자를 침전물로서 회수하고, 티타늄옥사이드에 결합되지 않은 효소를 함유하는 상청액으로부터 분리하였다. 티타늄옥사이드는 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 다시 현탁하고, 원심분리를 반복하고 세정하였다. 세정된 티타늄옥사이드의 현탁액의 효소활성을 측정하였다. 그 결과는 표 32에 나타낸다.
티타늄옥사이드 친화성 서열로 융합된 효소 aa150-YN2-C1(ti) 내지 aa157-YN2-C1(ti)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 따라서 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
(제 30실시예)
티타늄옥사이드에 결합될 수 있는 2종류의 아미노산서열, His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His(서열번호 150)와 Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(서열번호 151)를, His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(서열번호 174)를 부여하기 위하여 스페이서 서열 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 181)를 개재하여 나타낸 일련의 순서로 모두 연결하고, 스페이서서열 GS의 사용을 통하여 PHA합성효소의 N말단에 더 융합하여, 다음의 대장균 발현벡터를 제작하였다. 이 아미노산 서열을 엔코딩하는 DNA는, 서열 1: 5'-GATCCCATGCGACCGGCACCCATGGCCTGAGCCTGAGCCATGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCACCCTGCCGAGCCCGCTGGCGCTGCTGACCGTGCATGAGCT-3'(서열번호 175)와 서열 2: 5'-CATGCACGGTCAGCAGCGCCAGCGGGCTCGGCAGGGTGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCATGGCTCAGGCTCAGGCCATGGGTGCCGGTCGCATGG-3'(서열번호 176)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco사 제품)를 이용하여 인산화하고, 그들에 같은 몰량을 혼합하고, 95℃에서 5분동안 가열하고 다음에 실온에서 천천히 냉각함으로써, 2본쇄 DNA단편으로서 형성되었다. 이와 같이 형성된 2본쇄 DNA단편은, 제 28실시예와 마찬가지로 핵외 유전자 pGEX-C1의 BamHI/SacI 부위에 삽입되고, 대장균 JM109는 발현용 균주의 수율을 위해 이 벡터를 이용하여 형질전환되었다. 제 28실시예에 의한 것과 마찬가지로, 발현된 단백질 aa174-YN2-C1(ti), 그 N말단에서 융합되는 서열번호 174의 아미노산 서열을 정제하여 10U/㎖의 정제된 효소용액이 부여되었다. 티타늄옥사이드에 결합되는 정제 효소의 능력은 제 29실시예와 마찬가지로 평가하였다. 그 결과는 표 33에 나타낸다.
티타늄옥사이드에의 효소의 결합친화력의 평가
효소 융합 아미노산 서열 활성 U
aa174-YN2-C1(ti) 서열번호 174HATGTHGLSLSHGGGSGGGSTLPSPLALLTVH 0.15
YN2-C1 - 0.01
티타늄옥사이드 친화성 서열로 융합된 효소 aa174-YN2-C1(ti)가 조절의 효소 YN2-C1에 비하여 높은 효소 활성을 가지고, 기재표면위에 효과적으로 고정될 수 있는 것이 확인되었다.
본 발명의 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제조하는 방법에 의하면, 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트합성효소는 각종 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 선택함으로써 기재위에 효과적으로 고정할 수 있다. 또한, 기재의 표면은, 효소의 기질이 되도록 3-히드록시아실 조효소 A의 첨가에 의해 소망의 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체로 효과적으로 피복될 수 있다. 본 발명의 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체는, 그 표면이 다양한 특성의 폴리히드록시알카노에이트로 피복된 기능성 구조체로서 넓은 각종 응용을 발견할 수 있다.
도 1(a) 및 도 1(b)는 제 4실시예에서 구리프탈로시아닌을 사용한 PHA피막구조체의 외피의 GC-MS분석결과를 도시하는 도면.
도 2(a) 및 도 2(b)는 제 8실시예에서 카본블랙을 사용한 PHA피막구조체의 외피의 GC-MS분석결과를 도시하는 도면.
도 3(a) 및 도 3(b)는 제 12실시예에서 실리콘기판을 사용한 PHA적층구조체의 적층체의 GC-MS분석결과를 도시하는 도면.
도 4는 토너의 재사용기구를 가진 화상형성장치의 개략도.
도 5는 단일성분 현상제를 위한 현상장치의 주요부분의 개략도.
도 6은 정착장치의 주요부분의 확대 사시도.
도 7은 정착장치가 실행되는 경우에 막조건을 예시하는 주요부분의 확대 개략도.
〈도면의 주요부분에 대한 설명〉
20: 광전도체드럼 21: 클리너
22: 탄성블레이드 23: 클리어 리유즈
24: 공급용 파이프 25: 호퍼(hopper)
26: 현상장치 27: 충전롤러
28: 현상슬리브 29: 우레탄 루버블레이드
<110> Canon Kabushiki Kaisha <120> Polyhydroxyalkanoate-containing structure and manufacturing method thereof <130> CFO16534 <150> JP P2001-210052 <151> 2001-07-10 <150> JP P2002-172978 <151> 2002-06-13 <160> 186 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM BP-7375 <400> 1 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 2 <211> 1680 <212> DNA <213> Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM BP-7375 <400> 2 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gccatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt tttcgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgatgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gcgcctgctc cggcggcatc 900 acttgcaccg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg atgttgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc ataccgattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacggtaa 1680 1680 <210> 3 <211> 560 <212> PRT <213> Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM BP-7375 <400> 3 Met Arg Asp Lys Pro Ala Arg Glu Ser Leu Pro Thr Pro Ala Lys Phe 1 5 10 15 Ile Asn Ala Gln Ser Ala Ile Thr Gly Leu Arg Gly Arg Asp Leu Val 20 25 30 Ser Thr Leu Arg Ser Val Ala Ala His Gly Leu Arg His Pro Val His 35 40 45 Thr Ala Arg His Ala Leu Lys Leu Gly Gly Gln Leu Gly Arg Val Leu 50 55 60 Leu Gly Asp Thr Leu His Pro Thr Asn Pro Gln Asp Arg Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Leu Asn Pro Phe Tyr Arg Arg Ser Leu Gln Ala 85 90 95 Tyr Leu Ser Trp Gln Lys Gln Val Lys Ser Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Met Ser Pro Asp Asp Arg Ala Arg Ala His Phe Ala Phe Ala Leu Leu 115 120 125 Asn Asp Ala Val Ser Pro Ser Asn Ser Leu Leu Asn Pro Leu Ala Ile 130 135 140 Lys Glu Ile Phe Asn Ser Gly Gly Asn Ser Leu Val Arg Gly Ile Gly 145 150 155 160 His Leu Val Asp Asp Leu Leu His Asn Asp Gly Leu Pro Arg Gln Val 165 170 175 Thr Arg His Ala Phe Glu Val Gly Lys 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Ile Leu Tyr Trp Asn Asn 385 390 395 400 Asp Asn Thr Arg Leu Pro Ala Ala Leu His Gly Asp Leu Leu Asp Phe 405 410 415 Phe Lys His Asn Pro Leu Ser His Pro Gly Gly Leu Glu Val Cys Gly 420 425 430 Thr Pro Ile Asp Leu Gln Lys Val Thr Val Asp Ser Phe Ser Val Ala 435 440 445 Gly Ile Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Asp Ala Val Tyr Arg Ser Thr 450 455 460 Leu Leu Leu Gly Gly Glu Arg Arg Phe Val Leu Ala Asn Ser Gly His 465 470 475 480 Val Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Asn Asn Pro Lys Ala Asn Tyr Leu 485 490 495 Glu Gly Ala Lys Leu Ser Ser Asp Pro Arg Ala Trp Tyr Tyr Asp Ala 500 505 510 Lys Pro Val Asp Gly Ser Trp Trp Thr Gln Trp Leu Gly Trp Ile Gln 515 520 525 Glu Arg Ser Gly Ala Gln Lys Glu Thr His Met Ala Leu Gly Asn Gln 530 535 540 Asn Tyr Pro Pro Met Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val Arg Val Arg 545 550 555 560 <210> 4 <211> 1683 <212> DNA <213> Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM BP-7375 <400> 4 atgcgcgata aacctgcgag ggagtcacta cccacccccg ccaagttcat caacgcacaa 60 agtgcgatta ccggcctgcg tggccgggat 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Primer for PCR multiplication <400> 69 cgctcagcgc atggctatga tcataatagc agcatttg 38 <210> 70 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 70 gatccgaata tctgagcgcg attgtggcgg gcccgtggcc ggagct 46 <210> 71 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 71 ccggccacgg gcccgccaca atcgcgctca gatattcg 38 <210> 72 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 72 gatccaaact gtggattctg gaaccgaccg tgaccccgac cgagct 46 <210> 73 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 73 cggtcggggt cacggtcggt tccagaatcc acagtttg 38 <210> 74 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 74 gatcccagag caacctgaaa gtgattccga gctggtggtt tgagct 46 <210> 75 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 75 caaaccacca gctcggaatc actttcaggt tgctctgg 38 <210> 76 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 76 gatcctggat tccgccgcag tggagccgtc tgattgaacc ggagct 46 <210> 77 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 77 ccggttcaat cagacggctc cactgcggcg gaatccag 38 <210> 78 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 78 gatccgatca tccgcaggcg aaaccgaact ggtatggcgt ggagct 46 <210> 79 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 79 ccacgccata ccagttcggt ttcgcctgcg gatgatcg 38 <210> 80 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 80 gatccggcct gccgccgtat agcccgcatc gtctggcgca ggagct 46 <210> 81 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 81 cctgcgccag acgatgcggg ctatacggcg gcaggccg 38 <210> 82 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Primer for PCR multiplication <400> 114 gatcctggtg gaccccgcag ccgtggtgga gctttccgat tgagct 46 <210> 115 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 115 caatcggaaa gctccaccac ggctgcgggg tccaccag 38 <210> 116 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 116 gatcctggcc gcataccagc tggtggcaga ccccgctgac cgagct 46 <210> 117 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 117 cggtcagcgg ggtctgccac cagctggtat gcggccag 38 <210> 118 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 118 gatcctggca tgtgaactgg gatccgatgg cgtggtatcg tgagct 46 <210> 119 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 119 cacgatacca cgccatcgga tcccagttca catgccag 38 <210> 120 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 120 gatccagctg gccgtggtgg 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PCR multiplication <400> 162 gatccctgag cacccattat gtgaaccgta gccatattac cgagct 46 <210> 163 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 163 cggtaatatg gctacggttc acataatggg tgctcagg 38 <210> 164 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 164 gatccgcgta tcatattaac cagctgggcg cgccgccggc ggagct 46 <210> 165 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 165 ccgccggcgg cgcgcccagc tggttaatat gatacgcg 38 <210> 166 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 166 gatccctgca tctgaccccg catccgggcg ataccctgac cgagct 46 <210> 167 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 167 cggtcagggt atcgcccgga tgcggggtca gatgcagg 38 <210> 168 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 168 gatcccagga tgtgcatctg acccagcaga gccgttatac cgagct 46 <210> 169 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 169 cggtataacg gctctgctgg gtcagatgca catcctgg 38 <210> 170 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 170 gatccctgga aattccgagc aacggcctga accataaaat tgagct 46 <210> 171 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 171 caattttatg gttcaggccg ttgctcggaa tttccagg 38 <210> 172 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 172 gatccctgga aattccgagc aacggcctga accataacat tgagct 46 <210> 173 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 173 caatgttatg gttcaggccg ttgctcggaa tttccagg 38 <210> 174 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TiO2-binding peptide <400> 174 His Ala Thr Gly Thr His Gly Leu Ser Leu Ser His Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Thr Leu Pro Ser Pro Leu Ala Leu Leu Thr Val His 20 25 30 <210> 175 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 175 gatcccatgc gaccggcacc catggcctga gcctgagcca tggcggcggc agcggcggcg 60 gcagcaccct gccgagcccg ctggcgctgc tgaccgtgca tgagct 106 <210> 176 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR multiplication <400> 176 catgcacggt cagcagcgcc agcgggctcg gcagggtgct gccgccgccg ctgccgccgc 60 catggctcag gctcaggcca tgggtgccgg tcgcatgg 98 <210> 177 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 177 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Copper phthalocyanine-binding peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> MISC_FEATURE(X stands for any amino acids) <400> 178 Val Xaa His Xaa Leu Val Xaa 1 5 <210> 179 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carbon Black-binding peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> MISC_FEATURE(X stands for any amino acids) <400> 179 Trp Xaa Trp Ile Leu Xaa Asn 1 5 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiO2-binding peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> MISC_FEATURE(X stands for any amino acids) <400> 180 Asp Ser Xaa Xaa Thr Ile Asn 1 5 <210> 181 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 181 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Copper phthalocyanine-binding peptide <400> 182 Val Tyr His Arg Leu Val Asn 1 5 <210> 183 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Copper phthalocyanine-binding peptide <400> 183 Val Ile His Arg Leu Val Trp 1 5 <210> 184 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carbon Black-binding peptide <400> 184 Trp Tyr Trp Ile Leu Thr Asn 1 5 <210> 185 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiO2-binding peptide <400> 185 Asp Thr Phe His Thr Ile Asn 1 5 <210> 186 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiO2-binding peptide <400> 186 Glu Ser His Phe Thr Ile Asn 1 5

Claims (81)

  1. 구조체의 기재표면의 적어도 일부가 폴리히드록시알카노에이트로 피복되는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 기재표면에 폴리히드록시알카노에이트 합성효소를 고정화하는 공정과;
    상기 합성효소의 기질이 되도록 3-히드록시아실 조효소 A를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트를 상기 기재표면위에 합성하고, 합성된 폴리히드록시알카노에이트로 상기 기재표면의 적어도 일부를 피복하는 공정을 구비하고,
    상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소는, 해당 합성효소의 생산능을 가진 미생물 또는 상기 생산능에 관여하는 유전자를 숙주에 도입함으로써 제조된 형질전환체에 의해 생산된 폴리히드록시알카노에이트 합성효소이고,
    상기 합성효소는, 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해서 결정된, 또는 상기 기재의 화학적 성질에 의해 합리적으로 설계된, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 포함하며,
    상기 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식[1] 내지 식[10]으로 표시되는 단량체 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법:
    (식중, "a"는 정수를 나타내고, 또한 "a"와 R1의 조합은,
    수소원자와 0 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    할로겐원자와 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    발색단과 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    카르복실기 또는 그 염과 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    과 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨);
    (식중, b는 0 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, c는 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R3는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -N02, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, d는 0 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, e는 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5 및 -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, f는 0 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄);
    (식중, g는 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄);
    (식중, h는 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R6는 수소원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2 및 -C(CH3)3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3 및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택되고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3 및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택됨);
    (식중, i는 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R7는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3 및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택되고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3 및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택됨); 및
    (식중, j는 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 각 단량체 유닛에 대응하는 3-히드록시아실 조효소 A는, 하기 식[12] 내지 식[21]로 표시되는 3-히드록시아실 조효소 A인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트함유 구조체의 제조방법:
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, "a"는 정수를 나타내고, 또한 R1 및 a의 조합이 상기 설명한 식[1]로 표시되는 단량체에 있어서의 R1 및 a의 조합과 마찬가지로 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, b 및 R2는 상기 설명한 식[2]로 표시되는 단량체에 있어서의 b 및 R2와 마찬가지로 각각 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, c 및 R3는 상기 설명한 식[3]으로 표시되는 단량체에 있어서의 c 및 R3와 마찬가지로 각각 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, d 및 R4는 상기 설명한 식[4]로 표시되는 단량체에 있어서의 d 및 R4와 마찬가지로 각각 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, e 및 R5는 상기 설명한 식[5]로 표시되는 단량체에 있어서의 e 및 R5와 마찬가지로 각각 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, f는 상기 설명한 식[6]으로 표시되는 단량체에 있어서의 f와 마찬가지로 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, g는 상기 설명한 식[7]로 표시되는 단량체에 있어서의 g와 마찬가지로 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, h 및 R6는 상기 설명한 식[8]로 표시되는 단량체에 있어서의 h 및 R6와 마찬가지로 각각 규정됨);
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, i 및 R7는 상기 설명한 식[9]로 표시되는 단량체에 있어서의 i 및 R7와 마찬가지로 각각 규정됨); 및
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 CoA를 나타내고, j는 상기 설명한 식[10]으로 표시되는 단량체에 있어서의 j와 마찬가지로 규정됨).
  3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는, 카르복실기를 지니고, 또한, 하기 식[11]:
    (식중, k는 1 내지 10의 정수를 나타냄)로 표시되는 단량체 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종으로 이루어지고, 또한 각 대응하는 3-히드록시아실 조효소 A는, 하기 식[22]:
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합한 조효소 A를 나타내고, k는 상기 설명한 식[11]로 표시되는 단량체에 있어서의 k와 마찬가지로 규정됨)로 표시되는 3-히드록시아실 조효소 A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 3-히드록시알칸산 유닛의 조성은, 시간이 경과함에 따라 상기 3-히드록시아실 조효소 A의 조성을 변화시킴으로써 상기 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 적층방향을 변경시키는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 기재를 피복하는 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부에 대하여 화학수식을 행하는 공정을 부가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 화학수식을 행하는 공정은, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부에 그래프트사슬을 부가하는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 그래프트사슬을 부가하는 공정은, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부와, 말단에 반응성 작용기를 가진 화합물을 반응시키는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 에폭시기를 가진 단량체 유닛을 적어도 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서, 말단에 반응성 작용기를 가진 상기 화합물은 아미노기를 가진 화합물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 아미노기를 가진 화합물은 말단 아미노변성화합물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 말단 아미노변성화합물은 폴리비닐아민, 폴리에틸렌이민 및 말단 아미노변성 폴리실록산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  12. 제 5항에 있어서, 상기 화학수식을 행하는 공정은 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부를 가교화시키는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 가교화시키는 공정은, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부와, 가교제를 반응시키는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 에폭시기를 가진 단량체 유닛을 적어도 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 가교제는, 디아민 화합물, 무수 숙신산 및 2-메틸-4-메틸이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 디아민화합물은 헥사메틸렌디아민인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  17. 제 12항에 있어서, 상기 가교화시키는 공정은, 상기 폴리히드록시알카노에이트에 전자선을 조사하는 공정인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해 결정된 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  19. 구조체의 기재 표면의 적어도 일부를 폴리히드록시알카노에이트로 피복한 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체에 있어서,
    기재, 해당 기재 표면위에 고정된 폴리히드록시알카노에이트 합성효소 및 상기 기재의 적어도 일부를 피복하는 폴리히드록시알카노에이트를 포함하고,
    상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소는, 해당 합성효소의 생산능을 가진 미생물 또는 상기 생산능에 관여하는 유전자를 숙주에 도입함으로써 제조된 형질전환체에 의해 생산된 폴리히드록시알카노에이트 합성효소이고,
    상기 합성효소는, 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해서 결정된, 또는 상기 기재의 화학적 성질에 의해 합리적으로 설계된, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 포함하며,
    상기 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식[1] 내지 식[10]으로 표시되는 단량체 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체:
    (식중, "a"는 정수를 나타내고, 또한 "a"와 R1의 조합은,
    수소원자와 0 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    할로겐원자와 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    발색단과 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    카르복실기 또는 그 염과 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합,
    과 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨);
    (식중, b는 0 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, c는 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R3는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -N02, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, d는 0 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5 및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, e는 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5 및-C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 나타냄);
    (식중, f는 0 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄);
    (식중, g는 1 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄);
    (식중, h는 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R6는 수소원자(H), 할로겐 원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2 및 -C(CH3)3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3 및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택되고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3 및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택됨);
    (식중, i는 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타내고, R7는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3 및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택되고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3 및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택됨); 및
    (식중, j는 1 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 정수를 나타냄).
  20. 삭제
  21. 제 19항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 친수성 작용기를 지닌 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 음이온성 작용기를 가진 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 카르복실기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 카르복실기를 가진 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식[11]:
    (식중, k는 1 내지 10의 정수)로 표시되는 단량체 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  25. 제 19항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 단량체 유닛의 조성이, 상기 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 적층방향으로 변화하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  26. 제 19항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부는 화학적으로 수식되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 화학적으로 수식된 폴리히드록시알카노에이트가, 적어도 그래프트사슬을 가진 폴리히드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 그래프트사슬은 적어도 에폭시기를 가진 단량체 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 화학적으로 수식함으로써 제조된 그래프트사슬인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 그래프트사슬은 아미노기를 가진 화합물의 그래프트사슬인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 아미노기를 가진 화합물은 말단 아미노변성화합물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 말단 아미노변성화합물은, 폴리비닐아민, 폴리에틸렌이민 및 말단 아미노변성폴리실록산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  32. 제 26항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부가, 가교된 폴리히드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 가교된 폴리히드록시알카노에이트는, 적어도 에폭시기를 가진 단량체를 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 가교함으로써 제조된 폴리히드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 가교된 폴리히드록시알카노에이트는, 디아민화합물, 무수 숙신산, 2-메틸-4-메틸이미다졸 및 전자선방사로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나에 의해 가교된 폴리히드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 디아민화합물은 헥사메틸디아민인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  36. 제 1항에 있어서, 상기 기재가 구리 프탈로시아닌이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 하기 서열번호 24 내지 38:
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 기재가 구리 프탈로시아닌이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His (서열번호 24)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  38. 제 36항에 있어서, 상기 기재가 구리 프탈로시아닌이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu (서열번호 25)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  39. 제 1항에 있어서, 상기 기재가 카본블랙이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 하기 서열번호 39 내지 63:
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 기재가 카본블랙이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser (서열번호 39)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 기재가 카본블랙이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro (서열번호 40)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  42. 제 1항에 있어서, 상기 기재가 티타늄옥사이드이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 하기 서열번호 150 내지 157:
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 기재가 티타늄옥사이드이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His (서열번호 150)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  44. 제 42항에 있어서, 상기 기재가 티타늄옥사이드이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His (서열번호 151)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  45. 제 1항에 있어서, 상기 기재가 실리콘기판이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Asp-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn (서열번호 21)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  46. 제 19항에 있어서, 상기 기재가 구리 프탈로시아닌이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 하기 서열번호 24 내지 38:
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 기재가 구리 프탈로시아닌이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(서열번호 24)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  48. 제 46항에 있어서, 상기 기재가 구리 프탈로시아닌이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 25)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  49. 제 19항에 있어서, 상기 기재가 카본블랙이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 하기 서열번호 39 내지 63:
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 기재가 카본블랙이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser (서열번호 39)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  51. 제 49항에 있어서, 상기 기재가 카본블랙이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro (서열번호 40)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  52. 제 19항에 있어서, 상기 기재가 티타늄옥사이드이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이, 하기 서열번호 150 내지 157:
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 기재가 티타늄옥사이드이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 His-Ala-Thr-Gly-Thr-His-Gly-Leu-Ser-Leu-Ser-His (서열번호 150)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  54. 제 52항에 있어서, 상기 기재가 티타늄옥사이드이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His (서열번호 151)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  55. 제 19항에 있어서, 상기 기재가 실리콘기판이고, 해당 기재에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열이 Asp-Ser-His-Phe-Thr-Ile-Asn (서열번호 21)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체.
  56. 삭제
  57. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물은 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물이, 슈도모나스 푸티다 P91균주(Pseudomonas Putida P91)(FERM BP-7373), 슈도모나스 치코리이 H45균주(Pseudomonas cichorii H45)(FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichorii YN2)(FERM BP-7375) 및 슈도모나스 제세니이 P161균주(Pseudomonas jessenii P161)(FERM BP-7376)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  59. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물이, 바크홀데리아속(Burkholderia sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물이, 바크홀데리아 세파시아 KK01균주(Burkholderia cepacia KK01)(FERM BP-4235), 바크홀데리아속 OK3균주(Burkholderia sp. 0K3)(FERM P-17370) 및 바크홀데리아속 0K4균주(Burkholderia sp. 0K4)(FERM P-17371)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  61. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가지는 미생물이, 알카리게네스속(Alcaligenes sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  62. 제 61항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물이, 알카리게네스속 TL2균주(Alcaligenes sp. TL2)(FERM BP-6913)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  63. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물이, 랄스토냐속(Ralstonia sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  64. 제 63항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 합성효소의 생산능을 가진 미생물이, 랄스토냐 유트로파 TB64균주(Ralstonia eutropha TB64)(FERM BP-6933)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  65. 제 1항에 있어서, 상기 형질전환체의 숙주 미생물이 대장균(Escheichia coli)인 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트 함유 구조체의 제조방법.
  66. 폴리히드록시알카노에이트로 착색재료의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 정전하 화상현상토너에 있어서,
    구조체의 기재가 착색재료인 제 19항에 기재된 구조체가, 토너의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 정전하 화상현상토너.
  67. 폴리히드록시알카노에이트로 구리 프탈로시아닌의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 정전하 화상현상토너에 있어서,
    제 46항에 기재된 구조체가 토너의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 정전하 화상현상토너.
  68. 폴리히드록시알카노에이트로 카본블랙의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 정전하 화상현상토너에 있어서,
    제 49항에 기재된 구조체가 토너의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 정전하 화상현상토너.
  69. 폴리히드록시알카노에이트로 티타늄옥사이드의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 정전하 화상현상토너에 있어서,
    제 52항에 기재된 구조체가 토너의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 정전하 화상현상토너.
  70. 폴리히드록시알카노에이트로 착색재료의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 컬러필터용 착색조성물에 있어서,
    구조체의 기재가 착색재료인 제 19항에 기재된 구조체가, 토너의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 컬러필터용 착색조성물.
  71. 폴리히드록시알카노에이트로 구리 프탈로시아닌의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 컬러필터용 착색조성물에 있어서,
    제 46항에 기재된 구조체가 조성물의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 컬러필터용 착색조성물.
  72. 폴리히드록시알카노에이트로 카본블랙의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 컬러필터용 착색조성물에 있어서,
    제 49항에 기재된 구조체중의 어느 하나가 조성물의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 컬러필터용 착색조성물.
  73. 폴리히드록시알카노에이트로 티타늄옥사이드의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 컬러필터용 착색조성물에 있어서,
    제 52항에 기재된 구조체가 조성물의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 컬러필터용 착색조성물.
  74. 폴리히드록시알카노에이트로 착색재료의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 전기영동입자에 있어서,
    구조체의 기재가 착색재료인 제 19항에 기재된 구조체가 전기영동입자의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 전기영동입자.
  75. 폴리히드록시알카노에이트로 구리 프탈로시아닌의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 전기영동입자에 있어서,
    제 46항에 기재된 구조체가 전기영동입자의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 전기영동입자.
  76. 폴리히드록시알카노에이트로 카본블랙의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 전기영동입자에 있어서,
    제 49항에 기재된 구조체가 전기영동입자의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 전기영동입자.
  77. 폴리히드록시알카노에이트로 티타늄옥사이드의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 전기영동입자에 있어서,
    제 52항에 기재된 구조체가 전기영동입자의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 전기영동입자.
  78. 폴리히드록시알카노에이트로 착색재료의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 안료잉크에 있어서,
    구조체의 기재가 착색재료인 제 19항에 기재된 구조체의 어느 하나가 잉크의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 안료잉크.
  79. 폴리히드록시알카노에이트로 구리 프탈로시아닌의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 안료잉크에 있어서,
    제 46항에 기재된 구조체가 잉크의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 안료잉크.
  80. 폴리히드록시알카노에이트로 카본블랙의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 안료잉크에 있어서,
    제 49항에 기재된 구조체가 잉크의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 안료잉크.
  81. 폴리히드록시알카노에이트로 티타늄옥사이드의 표면의 적어도 일부를 피복함으로써 얻어진 착색제를 함유하는 안료잉크에 있어서,
    제 52항에 기재된 구조체가 잉크의 구성의 적어도 일부인 것을 특징으로 하는 안료잉크.
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