JP2004018723A - 塗料組成物及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】顔料を使用した塗料組成物において、分散安定剤を使用せずとも顔料の分散が安定で凝集を生じにくく、色彩性に優れた高品質の塗膜を形成し得る塗料組成物、及び界面活性剤を使用しないか、あるいはその使用量を大幅に低減できる簡便なその製造方法を提供すること。
【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエートによって顔料粒子の表面の少なくとも一部を被覆した色材と、該色材の分散用媒体とを少なくとも用いて塗料組成物を得る。
【選択図】 なし
【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエートによって顔料粒子の表面の少なくとも一部を被覆した色材と、該色材の分散用媒体とを少なくとも用いて塗料組成物を得る。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顔料の分散状態が安定で凝集を生じ難く、塗膜の物理的特性等に優れた塗料組成物、及び界面活性剤を使用しないか、あるいはその使用量を大幅に低減できる簡便なその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、塗膜の物理的特性の向上や機能性付与等を目的として、顔料等の塗料添加剤のマイクロカプセル化技術が検討されてきた。例えば、顔料をマイクロカプセル化することにより、該顔料の塗料組成物中における分散安定性を向上させることができ、該塗料の保存安定性や塗膜の物理的強度、光沢等を向上させることができる。
【０００３】
例えば、特開平６−２４８１９６号公報には、顔料粒子表面の全部または一部分をフルオロオレフィン系共重合体で被覆することによって、塗料用水分散性顔料を得ることができると開示されている。また、特開平５−３２０２７６号公報には、両親媒性グラフトポリマーを用いて疎水性顔料をマイクロカプセル化することで、耐水性に優れる外被を有するマイクロカプセル化顔料を製造する方法が開示されており、該マイクロカプセル化顔料を塗料組成物に用いることにより、分散性と塗膜の耐水性を両立させた塗料を得られるとされている。また、特開平５−９４３０号公報には、メラミン架橋タイプの１液型ベース塗料に、ウレタン樹脂で被覆したアルミニウム顔料を含有させることにより、アルミニウム顔料の凝集破壊の生じないメタリック塗料を得る方法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来、上記のようなマイクロカプセルは、種々の化学的製造方法、例えば界面重合法（２種のモノマーもしくは反応物を分散相と連続相に別々に溶解しておき、両者の界面においてモノマーを重合させて壁膜を形成させる方法）、懸濁重合法（水性媒体中で芯物質をモノマー中に分散し、次いで系の温度を上昇することで壁膜を形成させる方法）、乳化重合法（界面活性剤を溶解した水媒体中に水不溶のモノマーを添加して攪拌し、乳化剤のミセルにモノマーを取り込ませ、ミセル内でモノマーを重合して壁膜を形成させる方法）、ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法（液体または気体のモノマーと触媒、もしくは反応性の物質２種を連続相核粒子側のどちらか一方から供給して反応を起こさせ壁膜を形成させる方法）、コアセルベーション法（芯物質粒子を分散している高分子溶液を高分子濃度の高い濃厚相と希薄相に分離させ、壁膜を形成させる方法）、液中乾燥法（芯物質を壁膜物質の溶液に分散した液を調製し、この分散液の連続相が混和しない液中に分散液を入れて複合エマルションとし、壁膜物質を溶解している媒質を徐々に除くことで壁膜を形成させる方法）等によって製造されている。
【０００５】
しかし、これら従来の方法によって製造されたマイクロカプセルにおいては、大量に使用する懸濁安定剤や乳化剤等の界面活性剤がカプセル内やカプセル外被に残留する場合があり、塗料組成物を塗布した際の塗膜の耐水性や、塗膜と被塗装面との接着性の点で課題となる場合があった。
【０００６】
また、これら従来の製造方法では、重合過程で使用する分散媒等の共存物を、顔料と共にマイクロカプセル中に内包してしまう場合があり、マイクロカプセル中の顔料の密度をより高くして、塗膜の色彩性を向上せしめるためには、製造方法の更なる改善が望まれていた。
【０００７】
本発明の課題は、顔料の分散状態が安定で凝集を生じ難く、塗膜の物理的特性や色彩性等に優れた塗料組成物、及び界面活性剤を使用しないか、あるいはその使用量を大幅に低減できる簡便なその製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略する）合成酵素を顔料粒子に固定化し、ここに３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを加えて反応させることにより、顔料を界面活性剤なしに容易に微細なマイクロカプセルに内包できること、その際、ＰＨＡが顔料表面を直接被覆するため、顔料が高密度に内包されていること、さらに適当な種類の３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを選択することで、マイクロカプセル化顔料の外被であるＰＨＡを、親水性、親油性、あるいはその他の性質を有する組成のものに任意に設定できることを見出した。また、該ＰＨＡに化学修飾を施すことにより、各種の特性等を改良したマイクロカプセル化顔料を得ることができることを見出した。さらに詳しくは、例えば、該ＰＨＡにグラフト鎖を導入することで、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡにより、顔料の少なくとも一部を被覆したマイクロカプセル化顔料を得ることができることを見出した。また、該ＰＨＡを架橋化せしめることで、所望の物理化学的性質（例えば、機械的強度、耐薬品性、耐熱性等）を備えたＰＨＡにより、顔料の少なくとも一部を被覆したマイクロカプセル化顔料を得ることができることを見出した。
【０００９】
そして上記特性によって、該マイクロカプセル化顔料が、ＰＨＡの組成を適宜選択することにより、水性，油性いずれの塗料組成物においても、界面活性剤なしに良好な分散性を示すこと、そのため物理的特性等に優れた塗料が製造でき、さらに形成した塗膜が被塗装面との接着性や色彩性等に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、顔料表面の一部をＰＨＡで被覆したマイクロカプセル化顔料と、該マイクロカプセル化顔料の分散用媒体とを含む塗料組成物に関する。
【００１１】
またマイクロカプセル化顔料と、該マイクロカプセル化顔料の分散用媒体とを含有する塗料組成物の製造方法であって、水系媒体中に分散された顔料表面に固定されたＰＨＡ合成酵素の存在下で、３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを基質としてＰＨＡ合成反応を行うことで、該顔料表面の少なくとも一部をＰＨＡで被覆してマイクロカプセル化顔料を得る工程と、該マイクロカプセル化顔料を分散用媒体に分散する工程とを有することを特徴とする塗料組成物の製造方法に関する。
【００１２】
なお、本発明における塗料組成物とは、被塗装面の保護（耐候性・耐水性・耐薬品性などの向上、傷などからの保護、腐食および錆の防止、カビ・水性生物等の付着防止など）および被塗装面への意匠性の付与の少なくともいずれかの効果を有する塗膜の形成に用いる着色組成物を言う。また、化学修飾とは、高分子材料の分子内または分子間、あるいは高分子材料と他の化学物質との間で化学反応を行わせることにより、該高分子材料の分子構造を改変することを言う。また、架橋とは、高分子材料の分子内または分子間を化学的あるいは物理化学的にに結合せしめて網状構造を作ることを言い、架橋剤とは、前記架橋反応を行うために添加する、前記高分子材料と一定の反応性を有する物質を言う。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００１４】
＜ＰＨＡ＞
本発明に利用可能なＰＨＡとしては、ＰＨＡの生合成反応に関わるＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば、特に限定はされない。
【００１５】
ここで、ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素（ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう）である。なお、ＣｏＡとは補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ）の略称であり、その化学構造は下記式の通りである。
【００１６】
【化３４】
【００１７】
以下に、β酸化系及びＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００１８】
【化３５】
【００１９】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである）から変換された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００２０】
さらに、上記のＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＰＨＡを合成できることもわかっている。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６２７９−６２８３（１９９５）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＡ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５，５５−６０（１９９９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＡ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡや３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットや３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．，２１，７７−８４（２０００）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＡ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。また、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６８，３１９−３２４（１９９８）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３（２０００）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００２１】
このように、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡを、本発明における基材に固定化された該酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のＰＨＡで顔料を被覆したマイクロカプセル化顔料を作成することが可能である。
【００２２】
このようなＰＨＡとして、具体的には、下記式［１］から［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも１つ有するＰＨＡを例示することができる。
【００２３】
【化３６】
【００２４】
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１及びａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００２５】
Ｒ１が水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が ハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
【００２６】
【化３７】
【００２７】
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００２８】
【化３８】
【００２９】
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３０】
【化３９】
【００３１】
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３２】
【化４０】
【００３３】
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３４】
【化４１】
【００３５】
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３６】
【化４２】
【００３７】
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【００３８】
【化４３】
【００３９】
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）
【００４０】
【化４４】
【００４１】
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００４２】
【化４５】
【００４３】
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００４４】
【化４６】
【００４５】
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素等を挙げることができる。
【００４６】
上記ＰＨＡを合成する基質として用いることのできる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、具体的には、下記式［１１］から［２０］で表される３−ヒドロキシアシルＣｏＡを例示することができる。
【００４７】
【化４７】
【００４８】
（ただし、前記式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１及びａの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも１つであり、かつ、前記式［１］で表されるモノマーユニットにおけるＲ１及びａと対応する。
Ｒ１が 水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が ハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
【００４９】
【化４８】
【００５０】
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００５１】
【化４９】
【００５２】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂは前記式［２］で表されるモノマーユニットにおけるｂと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は前記式［２］で表されるモノマーユニットにおけるＲ２と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５３】
【化５０】
【００５４】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃは前記式［３］で表されるモノマーユニットにおけるｃと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は前記式［３］で表されるモノマーユニットにおけるＲ３と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５５】
【化５１】
【００５６】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄは前記式［４］で表されるモノマーユニットにおけるｄと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は前記式［４］で表されるモノマーユニットにおけるＲ４と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５７】
【化５２】
【００５８】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるｅと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるＲ５と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５９】
【化５３】
【００６０】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記式［６］で表されるモノマーユニットにおけるｆと対応する０から７の整数のいずれかを表す。）
【００６１】
【化５４】
【００６２】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記式［７］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する１から８の整数のいずれかを表す。）
【００６３】
【化５５】
【００６４】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈは前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるｈと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるＲ６と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００６５】
【化５６】
【００６６】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｉは前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるｉと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるＲ７と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００６７】
【化５７】
【００６８】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記化学式［１０］で表されるモノマーユニットにおけるｊと対応する１から９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素等を挙げることができる。また、前記の発色団としては、その３−ヒドロキシアシルＣｏＡ体がＰＨＡ合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害等を考慮すると、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ分子内において、ＣｏＡの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数１から５のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、該発色団を有するＰＨＡによるマイクロカプセル化顔料の着色組成物としての用途としては、例えば、顔料の発色成分との複合作用による、より効果的な発色性等が期待できる。このような発色団の例としては、ニトロソ，ニトロ，アゾ，ジアリールメタン，トリアリールメタン，キサンテン，アクリジン，キノリン，メチン，チアゾール，インダミン，インドフェノール，ラクトン，アミノケトン，ヒドロキシケトン，スチルベン，アジン，オカサジン，チアジン，アントラキノン，フタロシアニン，インジゴイド等が挙げられる。
【００６９】
本発明において用いられるＰＨＡとしては、上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。
【００７０】
さらに、基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、顔料の内側から外側に向かう方向においてＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。これによって、例えば、顔料と親和性の低いＰＨＡで被覆構造体を形成する必要がある場合、顔料を、まず該顔料と親和性の高いＰＨＡで被覆し、その顔料と親和性の高いＰＨＡのモノマーユニット組成を、目的とするＰＨＡのモノマーユニット組成に内側から外側に向かう方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、顔料との結合を強固にしたＰＨＡ被膜を形成することが可能となる。
【００７１】
また、マイクロカプセル化顔料表層のＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する特性を備えたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。また、顔料表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、機械的強度や耐薬品性等に優れたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。
【００７２】
なお、本発明の構造体に用いる、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【００７３】
ＰＨＡの合成基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、例えば、酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法、微生物や植物等の生物体を用いたｉｎ ｖｉｖｏ合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣｏＡシンセターゼ（アシルＣｏＡリガーゼともいう、Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）を用いた下記反応、
【００７４】
【化５８】
【００７５】
を用いた方法等が知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３（２０００）等）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産しても良い。
【００７６】
＜ＰＨＡ合成酵素及びその生産菌＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主生物に導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００７７】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、ＰＨＢや３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットと３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットとの共重合体（以下、ＰＨＢ／Ｖと略す）の生産菌を用いることができ、このような微生物として、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）等の他に、本発明者らにより分離された、バークホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＴＢ６４）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＴＬ２）等を用いることができる。
【００７８】
また、ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物として、中鎖長アルカン側鎖を有するＰＨＡ（以下、ｍｃｌ−ＰＨＡと略す）やフェニル基等の官能基を側鎖に有するＰＨＡ（以下、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡ と略す）の生産菌を用いることができ、このような微生物として、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ），シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ），シュードモナス属 ６１−３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３），シュードモナス・プチダ・ＫＴ２４４２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２），シュードモナス・アエルギノーサ等の他に、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１），シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５），シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２），シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１）等のシュードモナス属微生物や、特開２００１−７８７５３号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７０），特開２００１−６９９６８号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７１）等のバークホルデリア属微生物を用いることができる。
【００７９】
また、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．），コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）等に属し、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産する微生物を用いることもできる。
【００８０】
なお、前記ＫＫ０１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５として、ＴＢ６４株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９３３として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９１３として、Ｐ９１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３として、Ｈ４５株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５として、Ｐ１６１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
【００８１】
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地，酵母エキス等）や、栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００８２】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養，フェドバッチ培養，半連続培養，連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振盪フラスコによって振盪させて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる通気攪拌方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用しても良い。
【００８３】
前記のＰＨＡ生産微生物を用いてＰＨＡ合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法等を用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するｍｃｌ−ＰＨＡが菌体内に合成されることになるが、この場合一般に、ＰＨＡ合成酵素は菌体内に形成されるＰＨＡの微粒子に結合して存在するとされている。
【００８４】
しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のＰＨＡ合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【００８５】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（リン酸塩等）、窒素源（アンモニウム塩，硝酸塩等）等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地，Ｅ培地（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１８，９７−１０６（１９５６）），Ｍ９培地等を用いることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【００８６】
Ｎａ２ＨＰＯ４： ６．２ ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ： ３．０ ｇ
ＮａＣｌ ： ０．５ ｇ
ＮＨ４Ｃｌ ： １．０ ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加するのが好ましい。
【００８７】
（微量成分溶液）
ニトリロ三酢酸：１．５ ｇ
ＭｇＳＯ４ ：３．０ ｇ
ＭｎＳＯ４ ：０．５ ｇ
ＮａＣｌ ：１．０ ｇ
ＦｅＳＯ４ ：０．１ ｇ
ＣａＣｌ２ ：０．１ ｇ
ＣｏＣｌ２ ：０．１ ｇ
ＺｎＳＯ４ ：０．１ ｇ
ＣｕＳＯ４ ：０．１ ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ４）２ ：０．１ ｇ
Ｈ３ＢＯ３ ：０．１ ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４ ：０．１ ｇ
ＮｉＣｌ２ ：０．１ ｇ
（１リットル中）
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば １４〜４０℃、好ましくは ２０〜３５℃程度が適当である。
【００８８】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製及び形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。
【００８９】
大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地，Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は ２５〜３７℃の範囲で、好気的に８〜２７時間培養することにより微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素を回収することができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン，アンピシリン，テトラサイクリン，クロラムフェニコール，ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。
【００９０】
また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ），テトラサイクリン，インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【００９１】
ＰＨＡ合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物等の粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて金属塩，グリセリン，ジチオスレイトール，ＥＤＴＡ，ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定化剤や付活剤を適宜添加して用いることができる。
【００９２】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製には、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体をフレンチプレス，超音波破砕機，リゾチーム，各種界面活性剤等を用いて破砕した後、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー，陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得る。
【００９３】
特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン，血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼで切断する、ｐＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。発現ベクターとしてｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ等で還元条件として切断する。
【００９４】
アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ），キチン結合ドメイン（ＣＢＤ），マルトース結合タンパク（ＭＢＰ），あるいはチオレドキシン（ＴＲＸ）等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【００９５】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。
【００９６】
試薬１：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｇ／ｍＬ溶解、
試薬２：３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｍｏｌ／Ｌ溶解、
試薬３：トリクロロ酢酸を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に １０ｍｇ／ｍＬ溶解、
試薬４：５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に２．０ｍｍｏｌ／Ｌ溶解。
【００９７】
第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液 １００μＬに試薬１を １００μＬ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を １００μＬ添加して混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートした後、試薬３を添加して反応を停止させる。
【００９８】
第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を遠心分離（１４７，０００ｍ／ｓ２（１５，０００Ｇ）、１０分間）し、この上清 ５００μＬに試薬４を ５００μＬ添加し、３０℃で １０分間インキュベートした後、４１２ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００９９】
＜塗料組成物製造方法＞
本発明のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物の製造方法の一例としては、▲１▼顔料を水性媒体に分散する工程、▲２▼水性媒体に分散された顔料にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を固定化する工程、▲３▼基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する工程、▲４▼ＰＨＡ合成反応を行う工程、▲５▼マイクロカプセル化顔料を塗料組成物として加工する工程を少なくとも有する方法を例示することができる。
【０１００】
顔料を水性媒体に分散する工程は、選択した１つまたは複数の顔料を水性媒体に添加し、分散処理を行った後、必要であれば所望の粒径範囲に分級することによって行う。
【０１０１】
本発明で用いられる顔料は、各種の有機及び無機の着色顔料，体質顔料，防錆・防汚顔料等から１種または２種以上を適宜選択して用いることができる。
【０１０２】
有機顔料の例としては、アゾ系，フタロシアニン系，ベンゾイミダゾロン系，キナクリドン系，イソインドリノン系，ピラスロン系，ジブロムアンザンスロン系，インダスロン系，アンスラピリミジン系，フラバスロン系，ペリレン系，ペリノン系，キノフタロン系，フタロン系，チオインジゴ系，インジゴ系，ジオキサジン系，アントラキノン系，キサンテン系，メチン系，アゾメチン系の顔料及びその他の金属錯体系を含む縮合多環系顔料等を挙げることができる。
【０１０３】
無機顔料の例としては、ミロリブルー，酸化鉄，コバルト紫，マンガン紫，群青，紺青，コバルトブルー，セルリアンブルー，ビリジアン，エメラルドグリーン，コバルトグリーン等を挙げることができる。
【０１０４】
体質顔料の例としては、炭酸カルシウム，硫酸バリウム，カオリン，シリカ，タルク等を挙げることができる。
【０１０５】
防錆・防汚顔料の例としては、鉛丹，クロム酸亜鉛，シアナミド鉛，塩基性クロム酸鉛，亜鉛末，亜酸化銅等を挙げることができる。
【０１０６】
上記顔料は、公知の各種の表面処理等を施して用いても良い。表面処理の例としては、界面活性剤処理や、カップリング処理や、顔料誘導体処理等が挙げられる。
【０１０７】
分散処理は、ホモミキサー，水平ミニミル，ボールミル，ロールミル，サンドグラインダー，摩砕機，超音波処理等によって行うことができる。また、液体ジェット相互作用室内で少なくとも６．８９ＭＰａ（１，０００ｐｓｉ）の液圧で多数のノズルに混合物を通す方法によって行うこともできる。
【０１０８】
本工程の合成反応用の水性媒体の組成は、顔料を所望の状態に分散させ得るもので、かつ後述する酵素を顔料に固定化する工程やＰＨＡ合成反応を行う工程を妨げないものであれば良いが、後の工程の省略化を図るために、本工程の水性媒体の組成をＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成としておくこともできる。
【０１０９】
ここで、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成として、例えば緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファー，リン酸バッファー，リン酸カリウムバッファー，３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー，Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー，トリス塩酸バッファー，グリシンバッファー，２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファー等が好適に用いられる。
【０１１０】
ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができるが、望ましくは １０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌで行うことが好ましい。また、ｐＨは５．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５となるように調製するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１１１】
また、水性媒体中での顔料の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度、さらには本発明の着色組成物の目的を妨げない種類及び濃度であれば、適当な界面活性剤を添加しても良い。
【０１１２】
このような界面活性剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム，コール酸ナトリウム，デオキシコール酸ナトリウム，タウロデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド，ドデシルピリジニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤、３−〔（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ），３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ），パルミトイルリゾレシチン，ドデシル−β−アラニン等の両性イオン界面活性剤、オクチルグルコシド，オクチルチオグルコシド，ヘプチルチオグルコシド，デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０），ポリオキシエチレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ，Ｌｕｂｒｏｌ），ポリオキシエチレン−ｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ），ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ），ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（Ｓｐａｎ），ポリオキシエチレンソリビトールエステル（Ｔｗｅｅｎ）等の非イオン界面活性剤等を挙げることができる。
【０１１３】
また、水性媒体中での顔料の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度、さらには本発明の着色組成物の目的を妨げない種類及び濃度であれば、適当な補助溶媒を添加しても良い。補助溶媒としては、例えば、ヘキサン等の直鎖脂肪族炭化水素、メタノール，エタノール等の１価アルコール類、グリセロール等の多価アルコール類、脂肪酸エーテル類、カルボン酸エステル類等の誘導体から選ばれる一種または二種以上のものを選択し使用することができる。
【０１１４】
ＰＨＡ合成酵素を顔料に固定化する工程は、先の顔料分散液にＰＨＡ合成酵素を添加し、固定化処理を施すことによって行うことができる。固定化処理は、該酵素の活性が保持され得るものであり、かつ、所望の顔料において適用可能なものであれば、通常行われている酵素固定化方法の中から任意に選択して行うことができる。例えば、共有結合法，イオン吸着法，疎水吸着法，物理的吸着法，アフィニティ吸着法，架橋法，格子型包括法等を例示することができるが、特にイオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法が簡便である。
【０１１５】
ＰＨＡ合成酵素等の酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン，ヒスチジン，アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸等の遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，メチオニン，トリプトファン，フェニルアラニン，プロリン等の遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する顔料に吸着させることが可能である。
【０１１６】
主にイオン吸着法によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、イオン性官能基を表面に発現している顔料を用いれば良く、例えば、粘土鉱物や金属酸化物等を主要な成分とする無機顔料を用いることができる。
【０１１７】
また、主に疎水吸着によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、表面が非極性である顔料を用いればよく、例えば、芳香環を複数有するアゾ顔料，縮合多環のフタロシアニン系顔料，アントラキノン系顔料等の有機顔料，カーボンブラック等の炭素結晶からなる無機顔料を用いることができる。
【０１１８】
イオン吸着法または疎水吸着法によるＰＨＡ合成酵素の顔料への固定化は、顔料とＰＨＡ合成酵素を所定の水性媒体中で所定の濃度となるように混合することによって達成される。このとき、酵素が顔料の表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１１９】
上記固定化処理において、顔料と酵素の混合された水性媒体の組成としては、水性媒体のｐＨや塩濃度によって顔料及びＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化することから、それを考慮した組成とするのが望ましい。
【０１２０】
例えば、顔料が主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、顔料とＰＨＡ合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、ｐＨを変える事により、両者の反対電荷を増やすことができる。顔料が主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、顔料やＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した組成を設定することもできる。
【０１２１】
さらに、顔料とＰＨＡ合成酵素との吸着量を直接測定して組成を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、顔料が分散された溶液に濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いれば良い。
【０１２２】
イオン吸着法や疎水吸着法によって酵素を固定化し難い顔料の場合は、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を配慮した処理を必要に応じて行うことで共有結合法による固定化を用いてもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有する顔料をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基、アミノ基を有する顔料と酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有する顔料と酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、固体粒子のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基，アミノ基を有する顔料と酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有する顔料と酵素のチオール基との間で交換反応させる方法等がある。
【０１２３】
また、アフィニティ吸着によって酵素をリガンドが導入された顔料に固定化しても良い。この場合、リガンドとしてＰＨＡ合成酵素の酵素活性を維持しながらアフィニティ吸着を行えるものであれば、いかなるものも選択できる。また、ＰＨＡ合成酵素にタンパク質等の他の生体高分子を結合させ、結合した生体高分子をアフィニティ吸着することで酵素を固定化しても良い。ＰＨＡ合成酵素と生体高分子との結合は遺伝子組換え等によって行っても良いし、化学的に行っても良い。例えば、実施例に後述するように、形質転換によってＧＳＴをＰＨＡ合成酵素に融合し、ＧＳＴのリガンドであるグルタチオンを導入したセファロースに融合タンパク質をアフィニティ吸着し、固定化することができる。
【０１２４】
また、顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチドをＰＨＡ合成酵素に融合して提示させ、顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列のペプチド部分と、顔料との結合性に基づいて、顔料表面にＰＨＡ合成酵素を固定化することもできる。
【０１２５】
顔料に対する結合能を有するアミノ酸配列は、例えば、ランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定することができる。
【０１２６】
例えばＭ１３系ファージの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ 蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージディスプレイペプチドライブラリーを好適に用いることが出来るが、この場合顔料に対する結合能を有するアミノ酸配列の決定するには、次のような手順をとる。
【０１２７】
即ち、顔料に対してファージディスプレイペプチドライブラリーを添加することによって接触させ、その後洗浄により結合ファージと非結合ファージを分離する。顔料結合ファージを酸等により溶出し緩衝液で中和した後、大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の顔料に結合能の有る複数のクローンが濃縮される。
【０１２８】
ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
【０１２９】
上記方法により得られた顔料に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素に融合して利用される。顔料に対する結合能を有するペプチドはＰＨＡ合成酵素のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。スペーサー配列としては、およそ３〜４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでも良い。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素が機能するのを妨害せず、また、ＰＨＡ合成酵素が顔料に結合するのを妨害しないものである。
【０１３０】
上記方法により作製された、酵素を固定化した顔料は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。
【０１３１】
３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合によりＰＨＡが合成される反応において放出されるＣｏＡ量が１分間に１μｍｏｌとなるＰＨＡ合成酵素量を１Ｕとしたとき、顔料に固定する酵素の量は、顔料１ｇ当り １０〜１，０００Ｕ、望ましくは ５０〜５００Ｕの範囲内に設定すると良い。
【０１３２】
酵素の固定化処理を行う時間は１分間〜２４時間、望ましくは １０分間〜１時間に設定すると良い。
【０１３３】
また、前工程の顔料を分散する工程を省略して、水性媒体に分散する前の顔料を酵素溶液に直接添加し、酵素溶液中で分散を行いながら、酵素を顔料に固定化しても良い。この場合、顔料に固定化された酵素が保有するイオン性官能基による電気的反発や立体障害によって、顔料が水性媒体中で分散することを容易にし、水性媒体への界面活性剤の添加を不要にする、もしくは少量化することが可能となる。
【０１３４】
基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する工程は、前工程の酵素が固定化された顔料の水性分散液に対し、別途用意した３−ヒドロキシアシルＣｏＡの保存液を目的濃度に達するように添加することによって達成される。基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、一般に０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌ、望ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、さらに望ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度で添加される。
【０１３５】
また、上記工程において、水系反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、顔料を被覆するＰＨＡのモノマーユニット組成を、顔料の内側から外側に向かう方向に変化させることができる。
【０１３６】
このモノマーユニット組成の変化した顔料の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、マイクロカプセル化顔料の内側から外側に向かう方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが顔料を被覆した形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら反応液中に別組成の３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する等の方法によれば良い。
【０１３７】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが顔料を多層に被覆した形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成でＰＨＡを合成した後、遠心分離等によって調製中の顔料を反応液から一旦回収し、これに異なる３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成からなる反応液を再度添加する等の方法によれば良い。
【０１３８】
ＰＨＡ合成反応を行う工程は、合成するＰＨＡによって所望の形状のマイクロカプセル化顔料が得られるように、反応溶液の組成を前工程までに調製していない場合にはＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成となるように調製を行い、反応温度及び反応時間を調整する方法によって行う。
【０１３９】
ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る反応溶液中の緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち、５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用できるが、望ましくは １０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌで行う。また、ｐＨは５．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５となるように調整するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１４０】
反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４〜５０℃、好ましくは ２０〜４０℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１４１】
反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間〜２４時間、好ましくは ３０分間〜３時間の範囲内で適宜選択して設定する。
【０１４２】
前記工程によって得られるマイクロカプセル化顔料における、外被を構成するＰＨＡのモノマーユニット組成及び構造は、該マイクロカプセル化顔料からクロロホルム等によってＰＨＡを抽出した後、ガスクロマトグラフィーや、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）とイオンスパッタリング技術等を用いて分析することができる。
【０１４３】
ＰＨＡの分子量に特に制限はないが、マイクロカプセル化顔料の強度を維持するため、数平均分子量として１，０００〜１０，０００，０００、好ましくは、１０，０００〜１０，０００，００ の範囲にすると良い。ＰＨＡの分子量は、マイクロカプセル化顔料からクロロホルム等によってＰＨＡを抽出した後、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定すれば良い。
【０１４４】
また、本工程で得られたマイクロカプセル化顔料に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０１４５】
例えば、顔料表層のＰＨＡに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。なかでも、グラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。特に、後述するポリシロキサンをグラフト鎖として導入すれば、機械的強度，分散性，耐候性，撥水性，耐水性，耐熱性等が向上したマイクロカプセル化顔料を得ることができる。また、マイクロカプセル化顔料表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、該マイクロカプセル化顔料の機械的強度，耐薬品性，耐熱性等を向上させることが可能である。
【０１４６】
化学修飾の方法は、所望の機能や構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定されないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を用いることができる。
【０１４７】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能や構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物等を添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０１４８】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン，ポリエチレンイミン，アミノ変性ポリシロキサン等のアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，２２７８（１９５６）等に記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加による機械的強度，分散性，耐候性，撥水性，耐水性，耐熱性の改善等の効果が期待できる。
【０１４９】
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミン等のジアミン化合物，無水コハク酸，２−エチル−４−メチルイミダゾール等による架橋反応が、物理化学的変換の例として電子線照射等による架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０１５０】
【化５９】
【０１５１】
本発明のマイクロカプセル化顔料の製造方法では、顔料に直接ＰＨＡを被覆できるため、マイクロカプセル中の顔料の密度を高めることができる。マイクロカプセル化顔料におけるＰＨＡの被覆量としては、顔料に対して１〜３０質量％の範囲の質量組成比、好ましくは１〜２０質量％の範囲、より好ましくは１〜１５質量％とする。また、前記マイクロカプセル化顔料の粒径は、通常 ２０μｍ以下とするのが望ましく、さらに光沢ある平滑な塗面を得るためには、粒径を１μｍ以下とすると有効である。マイクロカプセル化顔料の粒径は、吸光度法，静的光散乱法，動的光散乱法，遠心沈降法等の既知の方法により測定でき、例えば、コールターカウンターマルチサイザー等の粒径測定装置を用いることができる。
【０１５２】
本発明のマイクロカプセル化顔料は、上記のように顔料密度が高く、かつ微小であるという特長を有しているため、該マイクロカプセル化顔料を含有する塗料組成物を用いることで、色彩性の良好な塗膜を形成せしめることができる。
【０１５３】
本発明において、前記マイクロカプセル化顔料を含有させる塗料成分は、塗膜形成樹脂及びその他の塗料添加剤を配合した通常の溶剤系，非水分散液型，水溶液型，水分散液型等のものが使用できる。従って、ビヒクル（展色剤）となる塗膜形成樹脂には、アクリル樹脂，ポリエステル樹脂，ポリ塩化ビニル樹脂，フッ素樹脂等、通常用いられる塗膜形成樹脂が使用できる。
【０１５４】
上記の塗膜形成樹脂には、必要に応じて硬化剤を添加してもよく、例えば、メラミン樹脂，グアナミン樹脂，尿素樹脂等のアミノ樹脂や（ブロック）ポリイソシアネート化合物等を硬化剤として用いることができる。
【０１５５】
さらに、防汚剤，防カビ剤，レベリング剤、タレ防止剤、消泡剤、紫外線吸収剤、老化防止剤、滑剤等の塗料添加物を添加して用いることもできる。
【０１５６】
本発明の塗料組成物は、例えば、刷毛塗り，浸漬法，スプレー塗装，ロール塗装，静電塗装，電着塗装等の公知の塗装法により塗装することが出来る。塗装対象物としては、例えば、木，紙，繊維，プラスチック，セラミックス，セメント，金属等の各種素材を挙げることができる。
【０１５７】
本発明の塗料組成物は、揮発乾燥等により塗膜を硬化せしめても良く、また、例えば、１００〜２５０℃で５秒〜３０分の加熱条件で焼付けることにより硬化塗膜を得ても良い。
【０１５８】
また、感光性樹脂や光重合性モノマーを構成成分として含み、さらに必要に応じて光重合開始剤等の添加剤を含有する光硬化性塗料として用いる場合は、紫外線，可視光，レーザー光等を照射することで塗膜を硬化させることができる。光硬化性塗料は一般に低公害で速乾性に優れるため、木質系基材等の塗装に広く用いられている。
【０１５９】
本発明のマイクロカプセル化顔料を光硬化性塗料として用いる場合、感光性樹脂としては従来公知のいずれのものを用いても良い。例えば、水酸基，カルボキシル基，アミノ基等の反応性置換基を有する線状高分子に、必要によりイソシアナート基，アルデヒド基，エポキシ基等を介して、（メタ）アクリル系化合物，ケイ皮酸系化合物，ビニルエステル系化合物等の反応性不飽和結合を有する化合物から導かれる光架橋性基を導入した樹脂等を用いることができる。さらには、スチレン／無水マレイン酸共重合体，α−オレフィン／無水マレイン酸共重合体等の酸無水物を構造単位に含む線状高分子、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート等の水酸基を有する（メタ）アクリル系化合物でハーフエステル化されたものを用いることもできる。これらは、必要に応じて２種以上の組合せで用いることもできる。感光性樹脂は、着色組成物中の全固形分に対して５〜９０質量％、好ましくは ２０〜７０質量％の範囲で使用される。
【０１６０】
光重合性モノマーとしては、ノニルフェニルカルビトールアクリレート，２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレート，２−エチルヘキシルカルビトールアクリレート，２−ヒドロキシエチルアクリレート，Ｎ−ビニルピロリドン等の単官能モノマー、トリプロピレングリコールジアクリレート，トリエチレングリコールジアクリレート，テトラエチレングリコールジアクリレート，ポリエチレングリコールジアクリレート，ビスフェノールＡジアクリレート等の２官能モノマー、トリメチロールプロパントリアクリレート，ペンタエリスリトールトリアクリレート等の３官能モノマー、ジペンタエリスリトールペンタ，ヘキサアクリレート等のその他の多官能モノマー等が挙げられる。これらの光重合性モノマーは２種類以上組み合わせて使用することもできる。光重合性モノマーは、着色組成物中の全固形分に対して５〜９０質量％、好ましくは ２０〜７０質量％の範囲で使用される。
【０１６１】
光重合開始剤としては、ベンゾイン及びそのアルキルエーテル類，アセトフェノン類，チオキサントン類，ケタール類，ベンゾフェノン類，アントラキノン類，キサントン類，トリアジン類，ヘキサアリールビスイミダゾール系化合物等が挙げられる。これらの光重合開始剤は、単独または２種類以上組み合わせて用いることができる。光重合開始剤はバインダー樹脂及び光重合性モノマーの合計量に対して０．２〜３０質量％、好ましくは２〜２０質量％の範囲で使用される。
【０１６２】
一方、前記電着塗装は、電着塗料槽内に浸漬した導電性を有する被塗物を介して電流を通して、電着塗料中の固形成分を被塗物表面に析出せしめ、これにより塗膜を形成する塗装法であり、塗装工程の自動化が容易であり、塗料の被塗物への付き回り性が良く、厚みの均一な塗膜が得られる等の利点を有することから、従来より自動車塗装ライン等の各種塗装ラインで広く用いられている。
【０１６３】
本発明のマイクロカプセル化顔料は、アニオン系やカチオン系いずれの電着塗料としても用いることができ、例えば、アクリル系樹脂，エポキシ系樹脂，ポリエステル系樹脂，フッ素系樹脂，ポリブタジエン系樹脂等を、マイクロカプセル化顔料及び硬化剤と共にイオン交換水に分散させた組成物として用いる。硬化剤としてはメラミン樹脂，ブロックポリイソシアネート等が例示できる。
【０１６４】
一般に、電着塗料には、各成分の分散を促進するために界面活性剤が使用されるが、本発明のマイクロカプセル化顔料を用いることにより、界面活性剤の使用を低減あるいは全く使用しないことができ、該界面活性剤に起因する塗膜の物理的特性の低下等を防ぐことができる。
【０１６５】
なお、本発明の着色組成物及びその製造方法は、上記に限定されるものではない。
【０１６６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は質量基準である。
【０１６７】
＜参考例１＞ ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＹＮ２株を １００ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン（日本製薬（株）製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で ３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全分解した。
【０１６８】
ベクターにはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５７２，（１９８９）；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）の後、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１６９】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：１及び配列番号：２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）を利用して行った。
【０１７０】
得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１７１】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１７２】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：３及び配列番号：４で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０１７３】
即ち、配列番号：３で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：５）及び下流側プライマー（配列番号：６）、配列番号：４で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：７）及び下流側プライマー（配列番号：８）をそれぞれ合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。
【０１７４】
これらのプライマーを用いて、配列番号：３及び配列番号：４で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。次に、得られたＰＣＲ増幅断片及び発現ベクターｐＴｒｃ ９９Ａを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，５７２ 頁，１９８９年；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）した後、この発現ベクターｐＴｒｃ ９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【０１７５】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：３の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ１、配列番号：４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ２とした。ｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ｆＢ ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【０１７６】
＜参考例２＞ ＰＨＡ合成酵素の生産１
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：９）及び下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号： １０）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット、宝酒造（株）製）。
【０１７７】
同様にｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）及び下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１２）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット、宝酒造（株）製）。
【０１７８】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０１７９】
得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地 １０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加し（終濃度 １ｍｍｏｌ／Ｌ）、３７℃で４から １２時間培養を続けた。
【０１８０】
ＩＰＴＧ 誘導した大腸菌を集菌（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分間、４℃）し、１／１０量の４℃リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；８ｇ ＮａＣｌ，１．４４ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２４ｇ ＫＨ２ＰＯ４，０．２ｇ ＫＣｌ，１０００ｍＬ精製水）に再懸濁した。凍結融解及びソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１０分間、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。
【０１８１】
目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）で精製した。使用するグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。即ち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分間、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。
【０１８２】
前処理したグルタチオンセファロース ４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１及びＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【０１８３】
吸着後、遠心（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分間、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン ４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分間、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０１８４】
各ＧＳＴ融合タンパク質 ５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ ２００ カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１及びＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ ６０．８ｋＤａ、及び ６１．５ｋＤａのシングルバンドを確認した。
【０１８５】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０Ｕ／ｍＬの精製酵素溶液を得た。
【０１８６】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０１８７】
【表１】
【０１８８】
＜参考例３＞ ＰＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ９１株、Ｈ４５株、ＹＮ２株またはＰ１６１株を、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、オクタン酸０．１％とを含むＭ９培地 ２００ｍＬに植菌して、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）によって回収し、０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）２００ｍＬに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）２．０ｍＬに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕した後、遠心分離（１１８０００ｍ／ｓ２（１２，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して上清を回収して粗酵素溶液を得た。各粗酵素活性は前述の方法で測定し、その結果を表２に示した。
【０１８９】
【表２】
【０１９０】
該粗酵素溶液を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０Ｕ／ｍＬの粗酵素溶液を得た。
【０１９１】
＜参考例４＞ ３−ヒドロキシアシルＣｏＡの合成
３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡは、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）に記載の方法に基づいて合成した。３−ヒドロキシピメリルＣｏＡは、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，２７５３−２７６０（２０００）に記載の方法に基づいて合成した。３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡは、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化して調製した３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸を３−ヒドロキシオクタン酸の替わりに用いる以外は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）に記載の方法に基づいて合成した。
【０１９２】
＜実施例１＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造１
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を０．１μｍ以下となるようにサンドミルで分散し、この１質量部にｐＹＮ２−Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液（１０ Ｕ／ｍＬ）１０ 質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し、３０℃にて ３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０１９３】
上記固定化酵素を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０１９４】
回収したマイクロカプセル化顔料の一部を真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で ２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した後、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、該ＰＨＡは３−ヒドロキシピメリン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０１９５】
さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度； ４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝６０，０００ であった。
【０１９６】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径をレーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０、日機装社製）を用いて測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．１０４μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．１１２μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０１９７】
＜実施例２＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造２
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を用いて実施例１と同様の方法で固定化酵素を得た。これを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ ０．８質量部、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ ０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪して酵素反応した後、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した。
【０１９８】
前記沈殿物の一部を真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で ２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について１Ｈ−ＮＭＲ分析（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））を行った。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３−ヒドロキシピメリン酸ユニット ７７％、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニット ２３％であった。
【０１９９】
また、前記酵素反応前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、酵素反応前の粒子径０．１０３μｍに対し、酵素反応後の粒子径は０．１１３μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２００】
前記沈殿物１質量部に対し、９９質量部のイオン交換水を添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させた。ここに、架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部となるよう溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した（これを粒子１とする）。さらに、粒子１を ７０℃で １２時間反応させた（これを粒子２とする）。
【０２０１】
上記粒子１及び粒子２をクロロホルムに懸濁し、６０℃で ２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出し、真空乾燥によりクロロホルムを除去し、示差走査熱量計（ＤＳＣ；パーキンエルマー社製、Ｐｙｒｉｓ １、昇温： １０℃／分）装置で測定を行った。その結果、粒子１では ９０℃付近に明確な発熱ピークがみられ、ポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示される。一方、粒子２では明確なヒートフローは見られず、架橋反応がほぼ完了していることが示される。
【０２０２】
さらに、同様のサンプルにつき、赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）。その結果、粒子１で見られたアミン（３３４０ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２ｃｍ−１付近）のピークが粒子２では消失している。
【０２０３】
以上の結果より、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとを反応させることにより、架橋ポリマーが得られることがわかった。
【０２０４】
一方、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡの代わりに３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを使用する以外は、上記と同様の方法で試料を作製し評価したが、前記の如き、ポリマー同士の架橋を明確に示す評価結果は得られなかった。
【０２０５】
前記粒子２の１質量部をイオン交換水 ９９ 質量部に懸濁し、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収する操作を３回繰返して、マイクロカプセル化顔料を得た。
【０２０６】
該マイクロカプセル化顔料をイオン交換水，トルエン，キシレン，へキサンまたはメタノールに懸濁し ３０日間室温で貯蔵したが、マイクロカプセル化顔料の貯蔵安定性において問題はなかった。従って該マイクロカプセル化顔料は、水性，油性いずれの塗料組成物中でも使用できることがわかった。
【０２０７】
＜実施例３＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造３
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を用いて実施例１と同様の方法で固定化酵素を得た。これを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０２０８】
回収したマイクロカプセル化顔料の外被を成すＰＨＡを、実施例１と同様にＧＣ−ＭＳで分析した。その結果、該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様に評価した結果、Ｍｎ＝ ４２，０００ であった。
【０２０９】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．１２７μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．１４３μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２１０】
＜実施例４＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造４
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を用いて実施例１と同様の方法で固定化酵素を得た。この１質量部を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ ０．８質量部、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ ０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した後、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した。
【０２１１】
前記沈殿物１質量部を ９９ 質量部のイオン交換水に懸濁し、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した後、凍結乾燥により水を除去した。この沈殿物１質量部に対して、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）１０ 質量部を添加し、７０℃で２時間反応させ、さらにメタノール ９９ 質量部に懸濁し、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことにより洗浄し乾燥することで、ポリシロキサンのグラフト鎖を有するマイクロカプセル化顔料を得た。
【０２１２】
＜実施例５＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造５
無機赤色顔料であるべんがらを０．３μｍ以下となるようにサンドミルで分散し、この１質量部にＰ１６１株由来のＰＨＡ合成酵素の粗酵素（１０Ｕ／ｍＬ）１ 質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し、３０℃にて ３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０２１３】
上記固定化酵素を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８ 質量部に懸濁し、３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０２１４】
回収したマイクロカプセル化顔料の一部を真空乾燥した後、マイクロカプセル化顔料の外被を成すＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるホモポリマーであった。また、イオンスパッタリングによりマイクロカプセル化顔料表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったが、いずれも３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるホモポリマーで構成されていた。
【０２１５】
これより、本比較例のマイクロカプセル化顔料は、親水性の顔料の上を直接疎水性の３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡが被覆したマイクロカプセル化顔料であることがわかった。さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様に評価した結果、Ｍｎ＝ ３８，０００ であった。
【０２１６】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．２４２μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．２６５μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２１７】
＜実施例６＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造６
無機赤色顔料であるべんがらを用いて実施例５と同様の方法で固定化酵素を得た。これを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で １０分間緩やかに振盪した。次いで、３０℃で緩やかに振盪しながら３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を含む０．１ ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）をマイクロチューブポンプ（東京理化器械社製ＭＰ−３Ｎ）を用いて１分間に１質量部の割合で添加した。１１０分間反応後、生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０２１８】
回収したマイクロカプセル化顔料の表面に形成されたＰＨＡの質量を、実施例５と同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳで測定した結果、該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシピメリン酸ユニットとの共重合体（モル比 １５ ：１）であった。また、イオンスパッタリングによりマイクロカプセル化顔料表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、前記共重合体における３−ヒドロキシオクタン酸ユニットの割合が次第に減少して、最終的に３−ヒドロキシピメリン酸ユニットからなるホモポリマーに変化することが確認された。
【０２１９】
これより、本実施例のマイクロカプセル化顔料は、親水性の顔料を親水性官能基を有する３−ヒドロキシピメリン酸ユニットからなるＰＨＡで被覆し、その上を３−ヒドロキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシピメリン酸ユニットとの共重合体によって、表層に至るにつれて疎水性の３−ヒドロキシオクタン酸ユニットの組成比率を高めながら被覆したマイクロカプセル化顔料であることがわかった。さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様に評価した結果、Ｍｎ＝ ３９，０００ であった。
【０２２０】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．２３６μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．２５８μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２２１】
＜比較例１＞ 比較用顔料の製造１
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を０．１μｍ以下となるようにサンドミルで分散した。
【０２２２】
＜比較例２＞ 比較用顔料の製造２
アクリル樹脂 １６質量部、メラミン樹脂４質量部、赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）１０質量部、イオン交換水 ７０質量部からなる混合物をビーズミル分散機を用いて２時間分散させることによって混合して顔料の水分散体とした。
【０２２３】
＜比較例３＞ 比較用顔料の製造３
無機赤色顔料であるべんがらを０．３μｍ以下となるようにサンドミルで分散した。
【０２２４】
＜実施例７＞ 塗料組成物の製造及び評価１
実施例１または実施例２のマイクロカプセル化顔料、または、比較例１の顔料１０部、アクリル樹脂溶液（Ｍｗ＝ ２５，０００、酸価 ６０、固形分 ２０％）１２．５部、イオン交換水 ２０部、及び ３ｍｍφアルミナビーズ １５０部を ２２５ｍＬのガラス容器に入れ、ペイントコンディショナーで３時間分散させた。さらに、上記アクリル樹脂 ３７．５部とメチル化メラミン樹脂４．３部を加えて混合し塗料組成物を得た。
【０２２５】
これらの塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を、レーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０、日機装社製）を用いて測定した。
【０２２６】
その結果、表３に示す通り、実施例１及び実施例２のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例１の顔料を用いた塗料組成物中の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は、貯蔵前と比較して大きく、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。
【０２２７】
【表３】
【０２２８】
また、実施例１及び実施例２のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物を、前記ペイントコンディショナーで ２４時間過剰に処理した後、光学顕微鏡で観察したところ、実施例２のマイクロカプセル化顔料は良好に分散していたが、実施例１のマイクロカプセル化顔料は一部に凝集が見られ、また被覆したＰＨＡの剥離が一部に観察された。従って、外被を成すＰＨＡが架橋化されていることにより、物理的負荷に対する耐久性がさらに向上することがわかる。
【０２２９】
次に、前記の塗料組成物をフィルムアプリケーターでＰＥＴ フィルム上に展色し、１４０℃で ３０分間焼き付けて塗膜を得た。この塗膜について以下の評価を行った。
【０２３０】
（１）付着性：
塗膜に１ｍｍ間隔の碁盤目を入れ、セロハンテープを貼り付けて剥離し、マス目の残存度合を評価した。
【０２３１】
（２）色彩性：
目視による官能評価により評価した。
【０２３２】
（３）耐候性：
サンシャインウェザオメーターで１，０００時間後の光沢保持率を測定した。光沢はデジタル変角光沢計（ＵＧＶ−５Ｄ、スガ試験機（株）製）を用いて ６０ 度鏡面光沢を測定した。
【０２３３】
（４）鉛筆硬度：
鉛筆（三菱鉛筆（株）製）を用いて塗膜に傷が付くまでの硬度で評価した。
【０２３４】
その結果、表４に示す通り、実施例１及び実施例２の塗料組成物で作製した塗膜は、被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。一方、比較例１の塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２３５】
【表４】
【０２３６】
＜実施例８＞ 塗料組成物の製造及び評価２
実施例３のマイクロカプセル化顔料または比較例１の顔料を真空乾燥した後、その１質量部に対し、９質量部の感光性ポリアミド樹脂（ＰＡ−１０００Ｃ、宇部興産（株）製）を添加し、混練機によって分散させ塗料組成物とした。
【０２３７】
前記塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を、実施例７と同様に測定した。その結果、表５に示す通り、実施例３のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径は、貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例１の顔料を用いた塗料組成物中の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は貯蔵前と比較して大きく、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。
【０２３８】
【表５】
【０２３９】
次に、前記の塗料組成物をフィルムアプリケーターでＰＥＴ フィルム上に展色し、８０℃で １０分間ベークした。次に、フォトマクスを介して適切な光量でＵＶ硬化し、さらに １４０℃で ３０分間ポストベークして塗膜を得た。この塗膜について実施例７と同様の評価を行った。
【０２４０】
その結果、表６に示す通り、実施例３のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。一方、比較例１の顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２４１】
【表６】
【０２４２】
＜実施例９＞ 塗料組成物の製造及び評価３
アクリル系共重合体（スチレン：メチルメタクリレート：ｎ−ブチルアクリレート：ジメチルアミノエチルメタクリレート：ヒドロキシエチルアクリレート＝ ３０：２０：２０：１０：１０、Ｍｎ＝ １５，０００）７５ 質量部と、ヘキサメチレンジイソシアネートのオキシムブロック化物 ２５ 質量部とをヒドロキシ酢酸で中和後、イオン交換水 ８００ 質量部を添加して分散した。ここに実施例１または実施例４のマイクロカプセル化顔料を １００ 質量部（顔料としておおよそ ５０ 質量部）添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させ塗料組成物とした。
【０２４３】
次に、前記アクリル系共重合体 ７５ 質量部と、ヘキサメチレンジイソシアネートのオキシムブロック化物 ２５ 質量部とをヒドロキシ酢酸で中和後、イオン交換水 ４００ 質量部を添加して分散した。ここに比較例２の顔料の水分散体を ５００ 質量部（顔料として ５０ 質量部）添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させ塗料組成物とした。
【０２４４】
前記塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を実施例７と同様に測定した。その結果、表７に示す通り、実施例１及び実施例４のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例２の顔料を用いた塗料組成物中の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は、貯蔵前と比較して大きく、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。
【０２４５】
【表７】
【０２４６】
次に、前記塗料組成物中にアルミニウム板を浸漬し、次の条件で電着塗装した。印加電圧 １５０Ｖ、塗料温度 ２５℃、電着時間２分間。電着終了後、アルミニウム板を水洗し水切りした後、１８０℃で ３０分間焼き付けて塗膜を得た。この塗膜について実施例７と同様の評価を行った。
【０２４７】
その結果、表８に示す通り、実施例１及び実施例４のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。特に、実施例４のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、耐候性がより優れていた。一方、比較例２の顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２４８】
【表８】
【０２４９】
＜実施例１０＞ 塗料組成物の製造及び評価４
実施例５または実施例６のマイクロカプセル化顔料または比較例３の顔料を真空乾燥した後、その４質量部に対し、エチレングリコール １０ 質量部、ジエチレングリコール １５ 質量部、スチレンーマレイン酸樹脂のモノエタノールアミン塩（平均分子量 ３０，０００、酸価 ３００）０．６質量部、イオン交換水 ７０．４質量部を添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させ塗料組成物とした。
【０２５０】
前記塗料組成物をそのまま用いた場合と、ボルテックス・ミキサーによって５分間激しく攪拌した場合での、塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を、実施例７と同様に測定した。
【０２５１】
その結果、表９に示す通り、攪拌を行わなかった場合、実施例５及び実施例６のマイクロカプセル化顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例３の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は貯蔵前と比較して増大し、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。また、攪拌を行った場合においても、実施例６のマイクロカプセル化顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、親水性顔料を用いた場合の貯蔵安定性がさらに向上していることが示された。
【０２５２】
【表９】
【０２５３】
次に、前記塗料組成物を用いて実施例９と同様の方法で作製した塗膜について、実施例７と同様の評価を行った。その結果、表１０ に示す通り、実施例５及び実施例６のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。一方、比較例３の顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２５４】
【表１０】
【０２５５】
【発明の効果】
本発明のマイクロカプセル化顔料を含有する塗料組成物は、水性、油性、両方の塗料組成物として使用でき、分散安定剤を使用せずとも顔料の分散状態が安定で凝集を生じ難い。また、顔料密度が高いため、色彩性の良好な塗膜が形成できる。さらに、界面活性剤の使用を抑えられるため、形成した塗膜が耐水性や被塗装面との付着性に優れている。また、その製造方法も簡便である。
【０２５６】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顔料の分散状態が安定で凝集を生じ難く、塗膜の物理的特性等に優れた塗料組成物、及び界面活性剤を使用しないか、あるいはその使用量を大幅に低減できる簡便なその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、塗膜の物理的特性の向上や機能性付与等を目的として、顔料等の塗料添加剤のマイクロカプセル化技術が検討されてきた。例えば、顔料をマイクロカプセル化することにより、該顔料の塗料組成物中における分散安定性を向上させることができ、該塗料の保存安定性や塗膜の物理的強度、光沢等を向上させることができる。
【０００３】
例えば、特開平６−２４８１９６号公報には、顔料粒子表面の全部または一部分をフルオロオレフィン系共重合体で被覆することによって、塗料用水分散性顔料を得ることができると開示されている。また、特開平５−３２０２７６号公報には、両親媒性グラフトポリマーを用いて疎水性顔料をマイクロカプセル化することで、耐水性に優れる外被を有するマイクロカプセル化顔料を製造する方法が開示されており、該マイクロカプセル化顔料を塗料組成物に用いることにより、分散性と塗膜の耐水性を両立させた塗料を得られるとされている。また、特開平５−９４３０号公報には、メラミン架橋タイプの１液型ベース塗料に、ウレタン樹脂で被覆したアルミニウム顔料を含有させることにより、アルミニウム顔料の凝集破壊の生じないメタリック塗料を得る方法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来、上記のようなマイクロカプセルは、種々の化学的製造方法、例えば界面重合法（２種のモノマーもしくは反応物を分散相と連続相に別々に溶解しておき、両者の界面においてモノマーを重合させて壁膜を形成させる方法）、懸濁重合法（水性媒体中で芯物質をモノマー中に分散し、次いで系の温度を上昇することで壁膜を形成させる方法）、乳化重合法（界面活性剤を溶解した水媒体中に水不溶のモノマーを添加して攪拌し、乳化剤のミセルにモノマーを取り込ませ、ミセル内でモノマーを重合して壁膜を形成させる方法）、ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法（液体または気体のモノマーと触媒、もしくは反応性の物質２種を連続相核粒子側のどちらか一方から供給して反応を起こさせ壁膜を形成させる方法）、コアセルベーション法（芯物質粒子を分散している高分子溶液を高分子濃度の高い濃厚相と希薄相に分離させ、壁膜を形成させる方法）、液中乾燥法（芯物質を壁膜物質の溶液に分散した液を調製し、この分散液の連続相が混和しない液中に分散液を入れて複合エマルションとし、壁膜物質を溶解している媒質を徐々に除くことで壁膜を形成させる方法）等によって製造されている。
【０００５】
しかし、これら従来の方法によって製造されたマイクロカプセルにおいては、大量に使用する懸濁安定剤や乳化剤等の界面活性剤がカプセル内やカプセル外被に残留する場合があり、塗料組成物を塗布した際の塗膜の耐水性や、塗膜と被塗装面との接着性の点で課題となる場合があった。
【０００６】
また、これら従来の製造方法では、重合過程で使用する分散媒等の共存物を、顔料と共にマイクロカプセル中に内包してしまう場合があり、マイクロカプセル中の顔料の密度をより高くして、塗膜の色彩性を向上せしめるためには、製造方法の更なる改善が望まれていた。
【０００７】
本発明の課題は、顔料の分散状態が安定で凝集を生じ難く、塗膜の物理的特性や色彩性等に優れた塗料組成物、及び界面活性剤を使用しないか、あるいはその使用量を大幅に低減できる簡便なその製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略する）合成酵素を顔料粒子に固定化し、ここに３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを加えて反応させることにより、顔料を界面活性剤なしに容易に微細なマイクロカプセルに内包できること、その際、ＰＨＡが顔料表面を直接被覆するため、顔料が高密度に内包されていること、さらに適当な種類の３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを選択することで、マイクロカプセル化顔料の外被であるＰＨＡを、親水性、親油性、あるいはその他の性質を有する組成のものに任意に設定できることを見出した。また、該ＰＨＡに化学修飾を施すことにより、各種の特性等を改良したマイクロカプセル化顔料を得ることができることを見出した。さらに詳しくは、例えば、該ＰＨＡにグラフト鎖を導入することで、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡにより、顔料の少なくとも一部を被覆したマイクロカプセル化顔料を得ることができることを見出した。また、該ＰＨＡを架橋化せしめることで、所望の物理化学的性質（例えば、機械的強度、耐薬品性、耐熱性等）を備えたＰＨＡにより、顔料の少なくとも一部を被覆したマイクロカプセル化顔料を得ることができることを見出した。
【０００９】
そして上記特性によって、該マイクロカプセル化顔料が、ＰＨＡの組成を適宜選択することにより、水性，油性いずれの塗料組成物においても、界面活性剤なしに良好な分散性を示すこと、そのため物理的特性等に優れた塗料が製造でき、さらに形成した塗膜が被塗装面との接着性や色彩性等に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、顔料表面の一部をＰＨＡで被覆したマイクロカプセル化顔料と、該マイクロカプセル化顔料の分散用媒体とを含む塗料組成物に関する。
【００１１】
またマイクロカプセル化顔料と、該マイクロカプセル化顔料の分散用媒体とを含有する塗料組成物の製造方法であって、水系媒体中に分散された顔料表面に固定されたＰＨＡ合成酵素の存在下で、３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを基質としてＰＨＡ合成反応を行うことで、該顔料表面の少なくとも一部をＰＨＡで被覆してマイクロカプセル化顔料を得る工程と、該マイクロカプセル化顔料を分散用媒体に分散する工程とを有することを特徴とする塗料組成物の製造方法に関する。
【００１２】
なお、本発明における塗料組成物とは、被塗装面の保護（耐候性・耐水性・耐薬品性などの向上、傷などからの保護、腐食および錆の防止、カビ・水性生物等の付着防止など）および被塗装面への意匠性の付与の少なくともいずれかの効果を有する塗膜の形成に用いる着色組成物を言う。また、化学修飾とは、高分子材料の分子内または分子間、あるいは高分子材料と他の化学物質との間で化学反応を行わせることにより、該高分子材料の分子構造を改変することを言う。また、架橋とは、高分子材料の分子内または分子間を化学的あるいは物理化学的にに結合せしめて網状構造を作ることを言い、架橋剤とは、前記架橋反応を行うために添加する、前記高分子材料と一定の反応性を有する物質を言う。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００１４】
＜ＰＨＡ＞
本発明に利用可能なＰＨＡとしては、ＰＨＡの生合成反応に関わるＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば、特に限定はされない。
【００１５】
ここで、ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素（ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう）である。なお、ＣｏＡとは補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ）の略称であり、その化学構造は下記式の通りである。
【００１６】
【化３４】
以下に、β酸化系及びＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００１８】
【化３５】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである）から変換された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００２０】
さらに、上記のＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＰＨＡを合成できることもわかっている。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６２７９−６２８３（１９９５）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＡ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５，５５−６０（１９９９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＡ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡや３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットや３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．，２１，７７−８４（２０００）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＡ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。また、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６８，３１９−３２４（１９９８）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３（２０００）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００２１】
このように、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡを、本発明における基材に固定化された該酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のＰＨＡで顔料を被覆したマイクロカプセル化顔料を作成することが可能である。
【００２２】
このようなＰＨＡとして、具体的には、下記式［１］から［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも１つ有するＰＨＡを例示することができる。
【００２３】
【化３６】
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１及びａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００２５】
Ｒ１が水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が ハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
【００２６】
【化３７】
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００２８】
【化３８】
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３０】
【化３９】
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３２】
【化４０】
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３４】
【化４１】
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３６】
【化４２】
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【００３８】
【化４３】
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）
【００４０】
【化４４】
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００４２】
【化４５】
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００４４】
【化４６】
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素等を挙げることができる。
【００４６】
上記ＰＨＡを合成する基質として用いることのできる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、具体的には、下記式［１１］から［２０］で表される３−ヒドロキシアシルＣｏＡを例示することができる。
【００４７】
【化４７】
（ただし、前記式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１及びａの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも１つであり、かつ、前記式［１］で表されるモノマーユニットにおけるＲ１及びａと対応する。
Ｒ１が 水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が ハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
【００４９】
【化４８】
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００５１】
【化４９】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂは前記式［２］で表されるモノマーユニットにおけるｂと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は前記式［２］で表されるモノマーユニットにおけるＲ２と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５３】
【化５０】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃは前記式［３］で表されるモノマーユニットにおけるｃと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は前記式［３］で表されるモノマーユニットにおけるＲ３と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５５】
【化５１】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄは前記式［４］で表されるモノマーユニットにおけるｄと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は前記式［４］で表されるモノマーユニットにおけるＲ４と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５７】
【化５２】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるｅと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるＲ５と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＦ３，−Ｃ２Ｆ５，−Ｃ３Ｆ７，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５９】
【化５３】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記式［６］で表されるモノマーユニットにおけるｆと対応する０から７の整数のいずれかを表す。）
【００６１】
【化５４】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記式［７］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する１から８の整数のいずれかを表す。）
【００６３】
【化５５】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈは前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるｈと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるＲ６と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５，−Ｃ３Ｈ７，−ＣＨ（ＣＨ３）２，−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００６５】
【化５６】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｉは前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるｉと対応する１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるＲ７と対応する、水素原子（Ｈ），ハロゲン原子，−ＣＮ，−ＮＯ２，−ＣＯＯＲ’，−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ），Ｎａ，Ｋ，−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ”は−ＯＨ，−ＯＮａ，−ＯＫ，ハロゲン原子，−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００６７】
【化５７】
（ただし、式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記化学式［１０］で表されるモノマーユニットにおけるｊと対応する１から９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素等を挙げることができる。また、前記の発色団としては、その３−ヒドロキシアシルＣｏＡ体がＰＨＡ合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害等を考慮すると、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ分子内において、ＣｏＡの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数１から５のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、該発色団を有するＰＨＡによるマイクロカプセル化顔料の着色組成物としての用途としては、例えば、顔料の発色成分との複合作用による、より効果的な発色性等が期待できる。このような発色団の例としては、ニトロソ，ニトロ，アゾ，ジアリールメタン，トリアリールメタン，キサンテン，アクリジン，キノリン，メチン，チアゾール，インダミン，インドフェノール，ラクトン，アミノケトン，ヒドロキシケトン，スチルベン，アジン，オカサジン，チアジン，アントラキノン，フタロシアニン，インジゴイド等が挙げられる。
【００６９】
本発明において用いられるＰＨＡとしては、上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。
【００７０】
さらに、基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、顔料の内側から外側に向かう方向においてＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。これによって、例えば、顔料と親和性の低いＰＨＡで被覆構造体を形成する必要がある場合、顔料を、まず該顔料と親和性の高いＰＨＡで被覆し、その顔料と親和性の高いＰＨＡのモノマーユニット組成を、目的とするＰＨＡのモノマーユニット組成に内側から外側に向かう方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、顔料との結合を強固にしたＰＨＡ被膜を形成することが可能となる。
【００７１】
また、マイクロカプセル化顔料表層のＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する特性を備えたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。また、顔料表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、機械的強度や耐薬品性等に優れたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。
【００７２】
なお、本発明の構造体に用いる、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【００７３】
ＰＨＡの合成基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、例えば、酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法、微生物や植物等の生物体を用いたｉｎ ｖｉｖｏ合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣｏＡシンセターゼ（アシルＣｏＡリガーゼともいう、Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）を用いた下記反応、
【００７４】
【化５８】
を用いた方法等が知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３（２０００）等）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産しても良い。
【００７６】
＜ＰＨＡ合成酵素及びその生産菌＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主生物に導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００７７】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、ＰＨＢや３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットと３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットとの共重合体（以下、ＰＨＢ／Ｖと略す）の生産菌を用いることができ、このような微生物として、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）等の他に、本発明者らにより分離された、バークホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＴＢ６４）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＴＬ２）等を用いることができる。
【００７８】
また、ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物として、中鎖長アルカン側鎖を有するＰＨＡ（以下、ｍｃｌ−ＰＨＡと略す）やフェニル基等の官能基を側鎖に有するＰＨＡ（以下、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡ と略す）の生産菌を用いることができ、このような微生物として、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ），シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ），シュードモナス属 ６１−３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３），シュードモナス・プチダ・ＫＴ２４４２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２），シュードモナス・アエルギノーサ等の他に、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１），シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５），シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２），シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１）等のシュードモナス属微生物や、特開２００１−７８７５３号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７０），特開２００１−６９９６８号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７１）等のバークホルデリア属微生物を用いることができる。
【００７９】
また、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．），コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）等に属し、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産する微生物を用いることもできる。
【００８０】
なお、前記ＫＫ０１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５として、ＴＢ６４株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９３３として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９１３として、Ｐ９１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３として、Ｈ４５株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５として、Ｐ１６１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
【００８１】
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地，酵母エキス等）や、栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００８２】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養，フェドバッチ培養，半連続培養，連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振盪フラスコによって振盪させて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる通気攪拌方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用しても良い。
【００８３】
前記のＰＨＡ生産微生物を用いてＰＨＡ合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法等を用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するｍｃｌ−ＰＨＡが菌体内に合成されることになるが、この場合一般に、ＰＨＡ合成酵素は菌体内に形成されるＰＨＡの微粒子に結合して存在するとされている。
【００８４】
しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のＰＨＡ合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【００８５】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（リン酸塩等）、窒素源（アンモニウム塩，硝酸塩等）等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地，Ｅ培地（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１８，９７−１０６（１９５６）），Ｍ９培地等を用いることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【００８６】
Ｎａ２ＨＰＯ４： ６．２ ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ： ３．０ ｇ
ＮａＣｌ ： ０．５ ｇ
ＮＨ４Ｃｌ ： １．０ ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加するのが好ましい。
【００８７】
（微量成分溶液）
ニトリロ三酢酸：１．５ ｇ
ＭｇＳＯ４ ：３．０ ｇ
ＭｎＳＯ４ ：０．５ ｇ
ＮａＣｌ ：１．０ ｇ
ＦｅＳＯ４ ：０．１ ｇ
ＣａＣｌ２ ：０．１ ｇ
ＣｏＣｌ２ ：０．１ ｇ
ＺｎＳＯ４ ：０．１ ｇ
ＣｕＳＯ４ ：０．１ ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ４）２ ：０．１ ｇ
Ｈ３ＢＯ３ ：０．１ ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４ ：０．１ ｇ
ＮｉＣｌ２ ：０．１ ｇ
（１リットル中）
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば １４〜４０℃、好ましくは ２０〜３５℃程度が適当である。
【００８８】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製及び形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。
【００８９】
大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地，Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は ２５〜３７℃の範囲で、好気的に８〜２７時間培養することにより微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素を回収することができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン，アンピシリン，テトラサイクリン，クロラムフェニコール，ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。
【００９０】
また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ），テトラサイクリン，インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【００９１】
ＰＨＡ合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物等の粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて金属塩，グリセリン，ジチオスレイトール，ＥＤＴＡ，ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定化剤や付活剤を適宜添加して用いることができる。
【００９２】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製には、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体をフレンチプレス，超音波破砕機，リゾチーム，各種界面活性剤等を用いて破砕した後、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー，陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得る。
【００９３】
特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン，血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼで切断する、ｐＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。発現ベクターとしてｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ等で還元条件として切断する。
【００９４】
アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ），キチン結合ドメイン（ＣＢＤ），マルトース結合タンパク（ＭＢＰ），あるいはチオレドキシン（ＴＲＸ）等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【００９５】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。
【００９６】
試薬１：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｇ／ｍＬ溶解、
試薬２：３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０ｍｍｏｌ／Ｌ溶解、
試薬３：トリクロロ酢酸を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に １０ｍｇ／ｍＬ溶解、
試薬４：５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に２．０ｍｍｏｌ／Ｌ溶解。
【００９７】
第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液 １００μＬに試薬１を １００μＬ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を １００μＬ添加して混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートした後、試薬３を添加して反応を停止させる。
【００９８】
第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を遠心分離（１４７，０００ｍ／ｓ２（１５，０００Ｇ）、１０分間）し、この上清 ５００μＬに試薬４を ５００μＬ添加し、３０℃で １０分間インキュベートした後、４１２ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００９９】
＜塗料組成物製造方法＞
本発明のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物の製造方法の一例としては、▲１▼顔料を水性媒体に分散する工程、▲２▼水性媒体に分散された顔料にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を固定化する工程、▲３▼基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する工程、▲４▼ＰＨＡ合成反応を行う工程、▲５▼マイクロカプセル化顔料を塗料組成物として加工する工程を少なくとも有する方法を例示することができる。
【０１００】
顔料を水性媒体に分散する工程は、選択した１つまたは複数の顔料を水性媒体に添加し、分散処理を行った後、必要であれば所望の粒径範囲に分級することによって行う。
【０１０１】
本発明で用いられる顔料は、各種の有機及び無機の着色顔料，体質顔料，防錆・防汚顔料等から１種または２種以上を適宜選択して用いることができる。
【０１０２】
有機顔料の例としては、アゾ系，フタロシアニン系，ベンゾイミダゾロン系，キナクリドン系，イソインドリノン系，ピラスロン系，ジブロムアンザンスロン系，インダスロン系，アンスラピリミジン系，フラバスロン系，ペリレン系，ペリノン系，キノフタロン系，フタロン系，チオインジゴ系，インジゴ系，ジオキサジン系，アントラキノン系，キサンテン系，メチン系，アゾメチン系の顔料及びその他の金属錯体系を含む縮合多環系顔料等を挙げることができる。
【０１０３】
無機顔料の例としては、ミロリブルー，酸化鉄，コバルト紫，マンガン紫，群青，紺青，コバルトブルー，セルリアンブルー，ビリジアン，エメラルドグリーン，コバルトグリーン等を挙げることができる。
【０１０４】
体質顔料の例としては、炭酸カルシウム，硫酸バリウム，カオリン，シリカ，タルク等を挙げることができる。
【０１０５】
防錆・防汚顔料の例としては、鉛丹，クロム酸亜鉛，シアナミド鉛，塩基性クロム酸鉛，亜鉛末，亜酸化銅等を挙げることができる。
【０１０６】
上記顔料は、公知の各種の表面処理等を施して用いても良い。表面処理の例としては、界面活性剤処理や、カップリング処理や、顔料誘導体処理等が挙げられる。
【０１０７】
分散処理は、ホモミキサー，水平ミニミル，ボールミル，ロールミル，サンドグラインダー，摩砕機，超音波処理等によって行うことができる。また、液体ジェット相互作用室内で少なくとも６．８９ＭＰａ（１，０００ｐｓｉ）の液圧で多数のノズルに混合物を通す方法によって行うこともできる。
【０１０８】
本工程の合成反応用の水性媒体の組成は、顔料を所望の状態に分散させ得るもので、かつ後述する酵素を顔料に固定化する工程やＰＨＡ合成反応を行う工程を妨げないものであれば良いが、後の工程の省略化を図るために、本工程の水性媒体の組成をＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成としておくこともできる。
【０１０９】
ここで、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成として、例えば緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファー，リン酸バッファー，リン酸カリウムバッファー，３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー，Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー，トリス塩酸バッファー，グリシンバッファー，２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファー等が好適に用いられる。
【０１１０】
ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができるが、望ましくは １０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌで行うことが好ましい。また、ｐＨは５．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５となるように調製するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１１１】
また、水性媒体中での顔料の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度、さらには本発明の着色組成物の目的を妨げない種類及び濃度であれば、適当な界面活性剤を添加しても良い。
【０１１２】
このような界面活性剤の例として、オレイン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム，コール酸ナトリウム，デオキシコール酸ナトリウム，タウロデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド，ドデシルピリジニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤、３−〔（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ），３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ），パルミトイルリゾレシチン，ドデシル−β−アラニン等の両性イオン界面活性剤、オクチルグルコシド，オクチルチオグルコシド，ヘプチルチオグルコシド，デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０），ポリオキシエチレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ，Ｌｕｂｒｏｌ），ポリオキシエチレン−ｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ），ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ），ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（Ｓｐａｎ），ポリオキシエチレンソリビトールエステル（Ｔｗｅｅｎ）等の非イオン界面活性剤等を挙げることができる。
【０１１３】
また、水性媒体中での顔料の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度、さらには本発明の着色組成物の目的を妨げない種類及び濃度であれば、適当な補助溶媒を添加しても良い。補助溶媒としては、例えば、ヘキサン等の直鎖脂肪族炭化水素、メタノール，エタノール等の１価アルコール類、グリセロール等の多価アルコール類、脂肪酸エーテル類、カルボン酸エステル類等の誘導体から選ばれる一種または二種以上のものを選択し使用することができる。
【０１１４】
ＰＨＡ合成酵素を顔料に固定化する工程は、先の顔料分散液にＰＨＡ合成酵素を添加し、固定化処理を施すことによって行うことができる。固定化処理は、該酵素の活性が保持され得るものであり、かつ、所望の顔料において適用可能なものであれば、通常行われている酵素固定化方法の中から任意に選択して行うことができる。例えば、共有結合法，イオン吸着法，疎水吸着法，物理的吸着法，アフィニティ吸着法，架橋法，格子型包括法等を例示することができるが、特にイオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法が簡便である。
【０１１５】
ＰＨＡ合成酵素等の酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン，ヒスチジン，アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸等の遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，メチオニン，トリプトファン，フェニルアラニン，プロリン等の遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する顔料に吸着させることが可能である。
【０１１６】
主にイオン吸着法によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、イオン性官能基を表面に発現している顔料を用いれば良く、例えば、粘土鉱物や金属酸化物等を主要な成分とする無機顔料を用いることができる。
【０１１７】
また、主に疎水吸着によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、表面が非極性である顔料を用いればよく、例えば、芳香環を複数有するアゾ顔料，縮合多環のフタロシアニン系顔料，アントラキノン系顔料等の有機顔料，カーボンブラック等の炭素結晶からなる無機顔料を用いることができる。
【０１１８】
イオン吸着法または疎水吸着法によるＰＨＡ合成酵素の顔料への固定化は、顔料とＰＨＡ合成酵素を所定の水性媒体中で所定の濃度となるように混合することによって達成される。このとき、酵素が顔料の表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１１９】
上記固定化処理において、顔料と酵素の混合された水性媒体の組成としては、水性媒体のｐＨや塩濃度によって顔料及びＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化することから、それを考慮した組成とするのが望ましい。
【０１２０】
例えば、顔料が主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、顔料とＰＨＡ合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、ｐＨを変える事により、両者の反対電荷を増やすことができる。顔料が主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、顔料やＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した組成を設定することもできる。
【０１２１】
さらに、顔料とＰＨＡ合成酵素との吸着量を直接測定して組成を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、顔料が分散された溶液に濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いれば良い。
【０１２２】
イオン吸着法や疎水吸着法によって酵素を固定化し難い顔料の場合は、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を配慮した処理を必要に応じて行うことで共有結合法による固定化を用いてもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有する顔料をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基、アミノ基を有する顔料と酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有する顔料と酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、固体粒子のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基，アミノ基を有する顔料と酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有する顔料と酵素のチオール基との間で交換反応させる方法等がある。
【０１２３】
また、アフィニティ吸着によって酵素をリガンドが導入された顔料に固定化しても良い。この場合、リガンドとしてＰＨＡ合成酵素の酵素活性を維持しながらアフィニティ吸着を行えるものであれば、いかなるものも選択できる。また、ＰＨＡ合成酵素にタンパク質等の他の生体高分子を結合させ、結合した生体高分子をアフィニティ吸着することで酵素を固定化しても良い。ＰＨＡ合成酵素と生体高分子との結合は遺伝子組換え等によって行っても良いし、化学的に行っても良い。例えば、実施例に後述するように、形質転換によってＧＳＴをＰＨＡ合成酵素に融合し、ＧＳＴのリガンドであるグルタチオンを導入したセファロースに融合タンパク質をアフィニティ吸着し、固定化することができる。
【０１２４】
また、顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチドをＰＨＡ合成酵素に融合して提示させ、顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列のペプチド部分と、顔料との結合性に基づいて、顔料表面にＰＨＡ合成酵素を固定化することもできる。
【０１２５】
顔料に対する結合能を有するアミノ酸配列は、例えば、ランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定することができる。
【０１２６】
例えばＭ１３系ファージの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ 蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージディスプレイペプチドライブラリーを好適に用いることが出来るが、この場合顔料に対する結合能を有するアミノ酸配列の決定するには、次のような手順をとる。
【０１２７】
即ち、顔料に対してファージディスプレイペプチドライブラリーを添加することによって接触させ、その後洗浄により結合ファージと非結合ファージを分離する。顔料結合ファージを酸等により溶出し緩衝液で中和した後、大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の顔料に結合能の有る複数のクローンが濃縮される。
【０１２８】
ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
【０１２９】
上記方法により得られた顔料に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素に融合して利用される。顔料に対する結合能を有するペプチドはＰＨＡ合成酵素のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。スペーサー配列としては、およそ３〜４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでも良い。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素が機能するのを妨害せず、また、ＰＨＡ合成酵素が顔料に結合するのを妨害しないものである。
【０１３０】
上記方法により作製された、酵素を固定化した顔料は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。
【０１３１】
３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合によりＰＨＡが合成される反応において放出されるＣｏＡ量が１分間に１μｍｏｌとなるＰＨＡ合成酵素量を１Ｕとしたとき、顔料に固定する酵素の量は、顔料１ｇ当り １０〜１，０００Ｕ、望ましくは ５０〜５００Ｕの範囲内に設定すると良い。
【０１３２】
酵素の固定化処理を行う時間は１分間〜２４時間、望ましくは １０分間〜１時間に設定すると良い。
【０１３３】
また、前工程の顔料を分散する工程を省略して、水性媒体に分散する前の顔料を酵素溶液に直接添加し、酵素溶液中で分散を行いながら、酵素を顔料に固定化しても良い。この場合、顔料に固定化された酵素が保有するイオン性官能基による電気的反発や立体障害によって、顔料が水性媒体中で分散することを容易にし、水性媒体への界面活性剤の添加を不要にする、もしくは少量化することが可能となる。
【０１３４】
基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する工程は、前工程の酵素が固定化された顔料の水性分散液に対し、別途用意した３−ヒドロキシアシルＣｏＡの保存液を目的濃度に達するように添加することによって達成される。基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、一般に０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌ、望ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、さらに望ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌの終濃度で添加される。
【０１３５】
また、上記工程において、水系反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、顔料を被覆するＰＨＡのモノマーユニット組成を、顔料の内側から外側に向かう方向に変化させることができる。
【０１３６】
このモノマーユニット組成の変化した顔料の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、マイクロカプセル化顔料の内側から外側に向かう方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが顔料を被覆した形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら反応液中に別組成の３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する等の方法によれば良い。
【０１３７】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが顔料を多層に被覆した形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成でＰＨＡを合成した後、遠心分離等によって調製中の顔料を反応液から一旦回収し、これに異なる３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成からなる反応液を再度添加する等の方法によれば良い。
【０１３８】
ＰＨＡ合成反応を行う工程は、合成するＰＨＡによって所望の形状のマイクロカプセル化顔料が得られるように、反応溶液の組成を前工程までに調製していない場合にはＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成となるように調製を行い、反応温度及び反応時間を調整する方法によって行う。
【０１３９】
ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る反応溶液中の緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち、５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用できるが、望ましくは １０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌで行う。また、ｐＨは５．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５となるように調整するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１４０】
反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４〜５０℃、好ましくは ２０〜４０℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１４１】
反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間〜２４時間、好ましくは ３０分間〜３時間の範囲内で適宜選択して設定する。
【０１４２】
前記工程によって得られるマイクロカプセル化顔料における、外被を構成するＰＨＡのモノマーユニット組成及び構造は、該マイクロカプセル化顔料からクロロホルム等によってＰＨＡを抽出した後、ガスクロマトグラフィーや、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）とイオンスパッタリング技術等を用いて分析することができる。
【０１４３】
ＰＨＡの分子量に特に制限はないが、マイクロカプセル化顔料の強度を維持するため、数平均分子量として１，０００〜１０，０００，０００、好ましくは、１０，０００〜１０，０００，００ の範囲にすると良い。ＰＨＡの分子量は、マイクロカプセル化顔料からクロロホルム等によってＰＨＡを抽出した後、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定すれば良い。
【０１４４】
また、本工程で得られたマイクロカプセル化顔料に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０１４５】
例えば、顔料表層のＰＨＡに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。なかでも、グラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたマイクロカプセル化顔料を得ることができる。特に、後述するポリシロキサンをグラフト鎖として導入すれば、機械的強度，分散性，耐候性，撥水性，耐水性，耐熱性等が向上したマイクロカプセル化顔料を得ることができる。また、マイクロカプセル化顔料表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、該マイクロカプセル化顔料の機械的強度，耐薬品性，耐熱性等を向上させることが可能である。
【０１４６】
化学修飾の方法は、所望の機能や構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定されないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を用いることができる。
【０１４７】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能や構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物等を添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０１４８】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン，ポリエチレンイミン，アミノ変性ポリシロキサン等のアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，２２７８（１９５６）等に記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加による機械的強度，分散性，耐候性，撥水性，耐水性，耐熱性の改善等の効果が期待できる。
【０１４９】
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミン等のジアミン化合物，無水コハク酸，２−エチル−４−メチルイミダゾール等による架橋反応が、物理化学的変換の例として電子線照射等による架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０１５０】
【化５９】
本発明のマイクロカプセル化顔料の製造方法では、顔料に直接ＰＨＡを被覆できるため、マイクロカプセル中の顔料の密度を高めることができる。マイクロカプセル化顔料におけるＰＨＡの被覆量としては、顔料に対して１〜３０質量％の範囲の質量組成比、好ましくは１〜２０質量％の範囲、より好ましくは１〜１５質量％とする。また、前記マイクロカプセル化顔料の粒径は、通常 ２０μｍ以下とするのが望ましく、さらに光沢ある平滑な塗面を得るためには、粒径を１μｍ以下とすると有効である。マイクロカプセル化顔料の粒径は、吸光度法，静的光散乱法，動的光散乱法，遠心沈降法等の既知の方法により測定でき、例えば、コールターカウンターマルチサイザー等の粒径測定装置を用いることができる。
【０１５２】
本発明のマイクロカプセル化顔料は、上記のように顔料密度が高く、かつ微小であるという特長を有しているため、該マイクロカプセル化顔料を含有する塗料組成物を用いることで、色彩性の良好な塗膜を形成せしめることができる。
【０１５３】
本発明において、前記マイクロカプセル化顔料を含有させる塗料成分は、塗膜形成樹脂及びその他の塗料添加剤を配合した通常の溶剤系，非水分散液型，水溶液型，水分散液型等のものが使用できる。従って、ビヒクル（展色剤）となる塗膜形成樹脂には、アクリル樹脂，ポリエステル樹脂，ポリ塩化ビニル樹脂，フッ素樹脂等、通常用いられる塗膜形成樹脂が使用できる。
【０１５４】
上記の塗膜形成樹脂には、必要に応じて硬化剤を添加してもよく、例えば、メラミン樹脂，グアナミン樹脂，尿素樹脂等のアミノ樹脂や（ブロック）ポリイソシアネート化合物等を硬化剤として用いることができる。
【０１５５】
さらに、防汚剤，防カビ剤，レベリング剤、タレ防止剤、消泡剤、紫外線吸収剤、老化防止剤、滑剤等の塗料添加物を添加して用いることもできる。
【０１５６】
本発明の塗料組成物は、例えば、刷毛塗り，浸漬法，スプレー塗装，ロール塗装，静電塗装，電着塗装等の公知の塗装法により塗装することが出来る。塗装対象物としては、例えば、木，紙，繊維，プラスチック，セラミックス，セメント，金属等の各種素材を挙げることができる。
【０１５７】
本発明の塗料組成物は、揮発乾燥等により塗膜を硬化せしめても良く、また、例えば、１００〜２５０℃で５秒〜３０分の加熱条件で焼付けることにより硬化塗膜を得ても良い。
【０１５８】
また、感光性樹脂や光重合性モノマーを構成成分として含み、さらに必要に応じて光重合開始剤等の添加剤を含有する光硬化性塗料として用いる場合は、紫外線，可視光，レーザー光等を照射することで塗膜を硬化させることができる。光硬化性塗料は一般に低公害で速乾性に優れるため、木質系基材等の塗装に広く用いられている。
【０１５９】
本発明のマイクロカプセル化顔料を光硬化性塗料として用いる場合、感光性樹脂としては従来公知のいずれのものを用いても良い。例えば、水酸基，カルボキシル基，アミノ基等の反応性置換基を有する線状高分子に、必要によりイソシアナート基，アルデヒド基，エポキシ基等を介して、（メタ）アクリル系化合物，ケイ皮酸系化合物，ビニルエステル系化合物等の反応性不飽和結合を有する化合物から導かれる光架橋性基を導入した樹脂等を用いることができる。さらには、スチレン／無水マレイン酸共重合体，α−オレフィン／無水マレイン酸共重合体等の酸無水物を構造単位に含む線状高分子、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート等の水酸基を有する（メタ）アクリル系化合物でハーフエステル化されたものを用いることもできる。これらは、必要に応じて２種以上の組合せで用いることもできる。感光性樹脂は、着色組成物中の全固形分に対して５〜９０質量％、好ましくは ２０〜７０質量％の範囲で使用される。
【０１６０】
光重合性モノマーとしては、ノニルフェニルカルビトールアクリレート，２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレート，２−エチルヘキシルカルビトールアクリレート，２−ヒドロキシエチルアクリレート，Ｎ−ビニルピロリドン等の単官能モノマー、トリプロピレングリコールジアクリレート，トリエチレングリコールジアクリレート，テトラエチレングリコールジアクリレート，ポリエチレングリコールジアクリレート，ビスフェノールＡジアクリレート等の２官能モノマー、トリメチロールプロパントリアクリレート，ペンタエリスリトールトリアクリレート等の３官能モノマー、ジペンタエリスリトールペンタ，ヘキサアクリレート等のその他の多官能モノマー等が挙げられる。これらの光重合性モノマーは２種類以上組み合わせて使用することもできる。光重合性モノマーは、着色組成物中の全固形分に対して５〜９０質量％、好ましくは ２０〜７０質量％の範囲で使用される。
【０１６１】
光重合開始剤としては、ベンゾイン及びそのアルキルエーテル類，アセトフェノン類，チオキサントン類，ケタール類，ベンゾフェノン類，アントラキノン類，キサントン類，トリアジン類，ヘキサアリールビスイミダゾール系化合物等が挙げられる。これらの光重合開始剤は、単独または２種類以上組み合わせて用いることができる。光重合開始剤はバインダー樹脂及び光重合性モノマーの合計量に対して０．２〜３０質量％、好ましくは２〜２０質量％の範囲で使用される。
【０１６２】
一方、前記電着塗装は、電着塗料槽内に浸漬した導電性を有する被塗物を介して電流を通して、電着塗料中の固形成分を被塗物表面に析出せしめ、これにより塗膜を形成する塗装法であり、塗装工程の自動化が容易であり、塗料の被塗物への付き回り性が良く、厚みの均一な塗膜が得られる等の利点を有することから、従来より自動車塗装ライン等の各種塗装ラインで広く用いられている。
【０１６３】
本発明のマイクロカプセル化顔料は、アニオン系やカチオン系いずれの電着塗料としても用いることができ、例えば、アクリル系樹脂，エポキシ系樹脂，ポリエステル系樹脂，フッ素系樹脂，ポリブタジエン系樹脂等を、マイクロカプセル化顔料及び硬化剤と共にイオン交換水に分散させた組成物として用いる。硬化剤としてはメラミン樹脂，ブロックポリイソシアネート等が例示できる。
【０１６４】
一般に、電着塗料には、各成分の分散を促進するために界面活性剤が使用されるが、本発明のマイクロカプセル化顔料を用いることにより、界面活性剤の使用を低減あるいは全く使用しないことができ、該界面活性剤に起因する塗膜の物理的特性の低下等を防ぐことができる。
【０１６５】
なお、本発明の着色組成物及びその製造方法は、上記に限定されるものではない。
【０１６６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は質量基準である。
【０１６７】
＜参考例１＞ ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＹＮ２株を １００ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン（日本製薬（株）製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で ３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全分解した。
【０１６８】
ベクターにはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１，５７２，（１９８９）；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）の後、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１６９】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：１及び配列番号：２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）を利用して行った。
【０１７０】
得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１７１】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１７２】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：３及び配列番号：４で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０１７３】
即ち、配列番号：３で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：５）及び下流側プライマー（配列番号：６）、配列番号：４で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：７）及び下流側プライマー（配列番号：８）をそれぞれ合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。
【０１７４】
これらのプライマーを用いて、配列番号：３及び配列番号：４で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。次に、得られたＰＣＲ増幅断片及び発現ベクターｐＴｒｃ ９９Ａを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，５７２ 頁，１９８９年；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）した後、この発現ベクターｐＴｒｃ ９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【０１７５】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：３の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ１、配列番号：４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ２とした。ｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ｆＢ ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【０１７６】
＜参考例２＞ ＰＨＡ合成酵素の生産１
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：９）及び下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号： １０）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット、宝酒造（株）製）。
【０１７７】
同様にｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）及び下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１２）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット、宝酒造（株）製）。
【０１７８】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０１７９】
得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地 １０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加し（終濃度 １ｍｍｏｌ／Ｌ）、３７℃で４から １２時間培養を続けた。
【０１８０】
ＩＰＴＧ 誘導した大腸菌を集菌（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分間、４℃）し、１／１０量の４℃リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；８ｇ ＮａＣｌ，１．４４ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２４ｇ ＫＨ２ＰＯ４，０．２ｇ ＫＣｌ，１０００ｍＬ精製水）に再懸濁した。凍結融解及びソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１０分間、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。
【０１８１】
目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）で精製した。使用するグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。即ち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分間、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。
【０１８２】
前処理したグルタチオンセファロース ４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１及びＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【０１８３】
吸着後、遠心（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、１分間、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン ４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（７８０００ｍ／ｓ２（８，０００Ｇ）、２分間、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０１８４】
各ＧＳＴ融合タンパク質 ５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ ２００ カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１及びＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ ６０．８ｋＤａ、及び ６１．５ｋＤａのシングルバンドを確認した。
【０１８５】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０Ｕ／ｍＬの精製酵素溶液を得た。
【０１８６】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０１８７】
【表１】
＜参考例３＞ ＰＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ９１株、Ｈ４５株、ＹＮ２株またはＰ１６１株を、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、オクタン酸０．１％とを含むＭ９培地 ２００ｍＬに植菌して、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）によって回収し、０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）２００ｍＬに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を０．１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）２．０ｍＬに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕した後、遠心分離（１１８０００ｍ／ｓ２（１２，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して上清を回収して粗酵素溶液を得た。各粗酵素活性は前述の方法で測定し、その結果を表２に示した。
【０１８９】
【表２】
該粗酵素溶液を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０Ｕ／ｍＬの粗酵素溶液を得た。
【０１９１】
＜参考例４＞ ３−ヒドロキシアシルＣｏＡの合成
３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡは、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）に記載の方法に基づいて合成した。３−ヒドロキシピメリルＣｏＡは、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，２７５３−２７６０（２０００）に記載の方法に基づいて合成した。３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡは、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化して調製した３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸を３−ヒドロキシオクタン酸の替わりに用いる以外は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）に記載の方法に基づいて合成した。
【０１９２】
＜実施例１＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造１
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を０．１μｍ以下となるようにサンドミルで分散し、この１質量部にｐＹＮ２−Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液（１０ Ｕ／ｍＬ）１０ 質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し、３０℃にて ３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０１９３】
上記固定化酵素を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０１９４】
回収したマイクロカプセル化顔料の一部を真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で ２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した後、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、該ＰＨＡは３−ヒドロキシピメリン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０１９５】
さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度； ４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝６０，０００ であった。
【０１９６】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径をレーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０、日機装社製）を用いて測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．１０４μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．１１２μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０１９７】
＜実施例２＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造２
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を用いて実施例１と同様の方法で固定化酵素を得た。これを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ ０．８質量部、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ ０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪して酵素反応した後、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した。
【０１９８】
前記沈殿物の一部を真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で ２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について１Ｈ−ＮＭＲ分析（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ ＤＰＸ ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））を行った。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３−ヒドロキシピメリン酸ユニット ７７％、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニット ２３％であった。
【０１９９】
また、前記酵素反応前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、酵素反応前の粒子径０．１０３μｍに対し、酵素反応後の粒子径は０．１１３μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２００】
前記沈殿物１質量部に対し、９９質量部のイオン交換水を添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させた。ここに、架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部となるよう溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した（これを粒子１とする）。さらに、粒子１を ７０℃で １２時間反応させた（これを粒子２とする）。
【０２０１】
上記粒子１及び粒子２をクロロホルムに懸濁し、６０℃で ２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出し、真空乾燥によりクロロホルムを除去し、示差走査熱量計（ＤＳＣ；パーキンエルマー社製、Ｐｙｒｉｓ １、昇温： １０℃／分）装置で測定を行った。その結果、粒子１では ９０℃付近に明確な発熱ピークがみられ、ポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示される。一方、粒子２では明確なヒートフローは見られず、架橋反応がほぼ完了していることが示される。
【０２０２】
さらに、同様のサンプルにつき、赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）。その結果、粒子１で見られたアミン（３３４０ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２ｃｍ−１付近）のピークが粒子２では消失している。
【０２０３】
以上の結果より、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとを反応させることにより、架橋ポリマーが得られることがわかった。
【０２０４】
一方、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡの代わりに３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを使用する以外は、上記と同様の方法で試料を作製し評価したが、前記の如き、ポリマー同士の架橋を明確に示す評価結果は得られなかった。
【０２０５】
前記粒子２の１質量部をイオン交換水 ９９ 質量部に懸濁し、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収する操作を３回繰返して、マイクロカプセル化顔料を得た。
【０２０６】
該マイクロカプセル化顔料をイオン交換水，トルエン，キシレン，へキサンまたはメタノールに懸濁し ３０日間室温で貯蔵したが、マイクロカプセル化顔料の貯蔵安定性において問題はなかった。従って該マイクロカプセル化顔料は、水性，油性いずれの塗料組成物中でも使用できることがわかった。
【０２０７】
＜実施例３＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造３
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を用いて実施例１と同様の方法で固定化酵素を得た。これを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０２０８】
回収したマイクロカプセル化顔料の外被を成すＰＨＡを、実施例１と同様にＧＣ−ＭＳで分析した。その結果、該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様に評価した結果、Ｍｎ＝ ４２，０００ であった。
【０２０９】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．１２７μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．１４３μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２１０】
＜実施例４＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造４
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を用いて実施例１と同様の方法で固定化酵素を得た。この１質量部を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ ０．８質量部、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ ０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した後、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した。
【０２１１】
前記沈殿物１質量部を ９９ 質量部のイオン交換水に懸濁し、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ、４℃、１０分間）して沈殿物を回収した後、凍結乾燥により水を除去した。この沈殿物１質量部に対して、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）１０ 質量部を添加し、７０℃で２時間反応させ、さらにメタノール ９９ 質量部に懸濁し、遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことにより洗浄し乾燥することで、ポリシロキサンのグラフト鎖を有するマイクロカプセル化顔料を得た。
【０２１２】
＜実施例５＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造５
無機赤色顔料であるべんがらを０．３μｍ以下となるようにサンドミルで分散し、この１質量部にＰ１６１株由来のＰＨＡ合成酵素の粗酵素（１０Ｕ／ｍＬ）１ 質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し、３０℃にて ３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０２１３】
上記固定化酵素を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８ 質量部に懸濁し、３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０２１４】
回収したマイクロカプセル化顔料の一部を真空乾燥した後、マイクロカプセル化顔料の外被を成すＰＨＡの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるホモポリマーであった。また、イオンスパッタリングによりマイクロカプセル化顔料表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったが、いずれも３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるホモポリマーで構成されていた。
【０２１５】
これより、本比較例のマイクロカプセル化顔料は、親水性の顔料の上を直接疎水性の３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡが被覆したマイクロカプセル化顔料であることがわかった。さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様に評価した結果、Ｍｎ＝ ３８，０００ であった。
【０２１６】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．２４２μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．２６５μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２１７】
＜実施例６＞ 塗料用マイクロカプセル化顔料の製造６
無機赤色顔料であるべんがらを用いて実施例５と同様の方法で固定化酵素を得た。これを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で １０分間緩やかに振盪した。次いで、３０℃で緩やかに振盪しながら３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ １質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を含む０．１ ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）をマイクロチューブポンプ（東京理化器械社製ＭＰ−３Ｎ）を用いて１分間に１質量部の割合で添加した。１１０分間反応後、生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（９８０００ｍ／ｓ２（１０，０００Ｇ）、４℃、１０分間）により回収した。
【０２１８】
回収したマイクロカプセル化顔料の表面に形成されたＰＨＡの質量を、実施例５と同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳで測定した結果、該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシピメリン酸ユニットとの共重合体（モル比 １５ ：１）であった。また、イオンスパッタリングによりマイクロカプセル化顔料表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、前記共重合体における３−ヒドロキシオクタン酸ユニットの割合が次第に減少して、最終的に３−ヒドロキシピメリン酸ユニットからなるホモポリマーに変化することが確認された。
【０２１９】
これより、本実施例のマイクロカプセル化顔料は、親水性の顔料を親水性官能基を有する３−ヒドロキシピメリン酸ユニットからなるＰＨＡで被覆し、その上を３−ヒドロキシオクタン酸ユニットと３−ヒドロキシピメリン酸ユニットとの共重合体によって、表層に至るにつれて疎水性の３−ヒドロキシオクタン酸ユニットの組成比率を高めながら被覆したマイクロカプセル化顔料であることがわかった。さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例１と同様に評価した結果、Ｍｎ＝ ３９，０００ であった。
【０２２０】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径を実施例１と同様に測定したところ、マイクロカプセル化前の粒子径０．２３６μｍに対し、マイクロカプセル化後の粒子径は０．２５８μｍであり、顔料をＰＨＡが被覆しているものと推測された。
【０２２１】
＜比較例１＞ 比較用顔料の製造１
赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）を０．１μｍ以下となるようにサンドミルで分散した。
【０２２２】
＜比較例２＞ 比較用顔料の製造２
アクリル樹脂 １６質量部、メラミン樹脂４質量部、赤色顔料（Ｃ．Ｉ．ピグメントレッド １６８）１０質量部、イオン交換水 ７０質量部からなる混合物をビーズミル分散機を用いて２時間分散させることによって混合して顔料の水分散体とした。
【０２２３】
＜比較例３＞ 比較用顔料の製造３
無機赤色顔料であるべんがらを０．３μｍ以下となるようにサンドミルで分散した。
【０２２４】
＜実施例７＞ 塗料組成物の製造及び評価１
実施例１または実施例２のマイクロカプセル化顔料、または、比較例１の顔料１０部、アクリル樹脂溶液（Ｍｗ＝ ２５，０００、酸価 ６０、固形分 ２０％）１２．５部、イオン交換水 ２０部、及び ３ｍｍφアルミナビーズ １５０部を ２２５ｍＬのガラス容器に入れ、ペイントコンディショナーで３時間分散させた。さらに、上記アクリル樹脂 ３７．５部とメチル化メラミン樹脂４．３部を加えて混合し塗料組成物を得た。
【０２２５】
これらの塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を、レーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０、日機装社製）を用いて測定した。
【０２２６】
その結果、表３に示す通り、実施例１及び実施例２のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例１の顔料を用いた塗料組成物中の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は、貯蔵前と比較して大きく、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。
【０２２７】
【表３】
また、実施例１及び実施例２のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物を、前記ペイントコンディショナーで ２４時間過剰に処理した後、光学顕微鏡で観察したところ、実施例２のマイクロカプセル化顔料は良好に分散していたが、実施例１のマイクロカプセル化顔料は一部に凝集が見られ、また被覆したＰＨＡの剥離が一部に観察された。従って、外被を成すＰＨＡが架橋化されていることにより、物理的負荷に対する耐久性がさらに向上することがわかる。
【０２２９】
次に、前記の塗料組成物をフィルムアプリケーターでＰＥＴ フィルム上に展色し、１４０℃で ３０分間焼き付けて塗膜を得た。この塗膜について以下の評価を行った。
【０２３０】
（１）付着性：
塗膜に１ｍｍ間隔の碁盤目を入れ、セロハンテープを貼り付けて剥離し、マス目の残存度合を評価した。
【０２３１】
（２）色彩性：
目視による官能評価により評価した。
【０２３２】
（３）耐候性：
サンシャインウェザオメーターで１，０００時間後の光沢保持率を測定した。光沢はデジタル変角光沢計（ＵＧＶ−５Ｄ、スガ試験機（株）製）を用いて ６０ 度鏡面光沢を測定した。
【０２３３】
（４）鉛筆硬度：
鉛筆（三菱鉛筆（株）製）を用いて塗膜に傷が付くまでの硬度で評価した。
【０２３４】
その結果、表４に示す通り、実施例１及び実施例２の塗料組成物で作製した塗膜は、被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。一方、比較例１の塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２３５】
【表４】
＜実施例８＞ 塗料組成物の製造及び評価２
実施例３のマイクロカプセル化顔料または比較例１の顔料を真空乾燥した後、その１質量部に対し、９質量部の感光性ポリアミド樹脂（ＰＡ−１０００Ｃ、宇部興産（株）製）を添加し、混練機によって分散させ塗料組成物とした。
【０２３７】
前記塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を、実施例７と同様に測定した。その結果、表５に示す通り、実施例３のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径は、貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例１の顔料を用いた塗料組成物中の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は貯蔵前と比較して大きく、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。
【０２３８】
【表５】
次に、前記の塗料組成物をフィルムアプリケーターでＰＥＴ フィルム上に展色し、８０℃で １０分間ベークした。次に、フォトマクスを介して適切な光量でＵＶ硬化し、さらに １４０℃で ３０分間ポストベークして塗膜を得た。この塗膜について実施例７と同様の評価を行った。
【０２４０】
その結果、表６に示す通り、実施例３のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。一方、比較例１の顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２４１】
【表６】
＜実施例９＞ 塗料組成物の製造及び評価３
アクリル系共重合体（スチレン：メチルメタクリレート：ｎ−ブチルアクリレート：ジメチルアミノエチルメタクリレート：ヒドロキシエチルアクリレート＝ ３０：２０：２０：１０：１０、Ｍｎ＝ １５，０００）７５ 質量部と、ヘキサメチレンジイソシアネートのオキシムブロック化物 ２５ 質量部とをヒドロキシ酢酸で中和後、イオン交換水 ８００ 質量部を添加して分散した。ここに実施例１または実施例４のマイクロカプセル化顔料を １００ 質量部（顔料としておおよそ ５０ 質量部）添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させ塗料組成物とした。
【０２４３】
次に、前記アクリル系共重合体 ７５ 質量部と、ヘキサメチレンジイソシアネートのオキシムブロック化物 ２５ 質量部とをヒドロキシ酢酸で中和後、イオン交換水 ４００ 質量部を添加して分散した。ここに比較例２の顔料の水分散体を ５００ 質量部（顔料として ５０ 質量部）添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させ塗料組成物とした。
【０２４４】
前記塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を実施例７と同様に測定した。その結果、表７に示す通り、実施例１及び実施例４のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例２の顔料を用いた塗料組成物中の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は、貯蔵前と比較して大きく、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。
【０２４５】
【表７】
次に、前記塗料組成物中にアルミニウム板を浸漬し、次の条件で電着塗装した。印加電圧 １５０Ｖ、塗料温度 ２５℃、電着時間２分間。電着終了後、アルミニウム板を水洗し水切りした後、１８０℃で ３０分間焼き付けて塗膜を得た。この塗膜について実施例７と同様の評価を行った。
【０２４７】
その結果、表８に示す通り、実施例１及び実施例４のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。特に、実施例４のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、耐候性がより優れていた。一方、比較例２の顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２４８】
【表８】
＜実施例１０＞ 塗料組成物の製造及び評価４
実施例５または実施例６のマイクロカプセル化顔料または比較例３の顔料を真空乾燥した後、その４質量部に対し、エチレングリコール １０ 質量部、ジエチレングリコール １５ 質量部、スチレンーマレイン酸樹脂のモノエタノールアミン塩（平均分子量 ３０，０００、酸価 ３００）０．６質量部、イオン交換水 ７０．４質量部を添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させ塗料組成物とした。
【０２５０】
前記塗料組成物をそのまま用いた場合と、ボルテックス・ミキサーによって５分間激しく攪拌した場合での、塗料組成物中の顔料の体積平均粒子径及び ３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を、実施例７と同様に測定した。
【０２５１】
その結果、表９に示す通り、攪拌を行わなかった場合、実施例５及び実施例６のマイクロカプセル化顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例３の顔料の貯蔵後の体積平均粒子径は貯蔵前と比較して増大し、貯蔵安定性としては満足できるものではなかった。また、攪拌を行った場合においても、実施例６のマイクロカプセル化顔料の体積平均粒子径は貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、親水性顔料を用いた場合の貯蔵安定性がさらに向上していることが示された。
【０２５２】
【表９】
次に、前記塗料組成物を用いて実施例９と同様の方法で作製した塗膜について、実施例７と同様の評価を行った。その結果、表１０ に示す通り、実施例５及び実施例６のマイクロカプセル化顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は被塗装面への付着性，色彩性，耐候性，硬度の全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。一方、比較例３の顔料を用いた塗料組成物で作製した塗膜は、これらの特性について満足できるものではなかった。
【０２５４】
【表１０】
【発明の効果】
本発明のマイクロカプセル化顔料を含有する塗料組成物は、水性、油性、両方の塗料組成物として使用でき、分散安定剤を使用せずとも顔料の分散状態が安定で凝集を生じ難い。また、顔料密度が高いため、色彩性の良好な塗膜が形成できる。さらに、界面活性剤の使用を抑えられるため、形成した塗膜が耐水性や被塗装面との付着性に優れている。また、その製造方法も簡便である。
【０２５６】
【配列表】
Claims (41)
- ポリヒドロキシアルカノエートによって顔料粒子の表面の少なくとも一部を被覆した色材を含有することを特徴とする塗料組成物。
- ポリヒドロキシアルカノエートが、式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを有するポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１に記載の塗料組成物。
Ｒ１が水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記色材の内側から外側に向かう方向において変化していることを特徴とする請求項２に記載の塗料組成物。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項２に記載の塗料組成物。
- 前記の化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートが、少なくともグラフト鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項４に記載の塗料組成物。
- 前記グラフト鎖が、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの化学修飾によるグラフト鎖であることを特徴とする請求項５に記載の塗料組成物。
- 前記グラフト鎖が、アミノ基を有する化合物のグラフト鎖であることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の塗料組成物。
- 前記アミノ基を有する化合物が、末端アミノ変性化合物であることを特徴とする請求項７に記載の塗料組成物。
- 前記末端アミノ変性化合物が、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項８に記載の塗料組成物。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項４に記載の塗料組成物。
- 前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートが架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであるであることを特徴とする請求項１０に記載の塗料組成物。
- 前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、ジアミン化合物、無水コハク酸、２−エチル−４−メチルイミダゾール、電子線照射からなる群より選択される少なくとも一つにより架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載の塗料組成物。
- 前記ジアミン化合物がヘキサメチレンジアミンであることを特徴とする請求項１２に記載の塗料組成物。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートの数平均分子量が１，０００から１０，０００，０００であることを特徴とする請求項１から請求項１３に記載の塗料組成物。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートの数平均分子量が３，０００から１，０００，０００であることを特徴とする請求項１４に記載の塗料組成物。
- 色材と、該色材の分散用媒体とを含有する塗料組成物の製造方法であって、水性媒体に分散された顔料粒子の表面に固定されたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の存在下で、３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを基質として、ポリヒドロキシアルカノエート合成反応を行うことで該顔料表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して色材を得る工程と、該色材を分散用媒体に分散する工程とを有する塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエートが、式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを有するポリヒドロキシアルカノエートであり、それぞれ対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが式［１１］から式［２０］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａのいずれかである、請求項１６に記載の塗料組成物の製造方法。
Ｒ１が 水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が ハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が 発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
Ｒ１が 水素原子（Ｈ）でありａが０から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が ハロゲン原子でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から １０ の整数であるモノマーユニット、Ｒ１が発色団でありａが１から １０ の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、
- 前記３−ヒドロキシアシル補酵素Ａの組成を経時的に変化させることにより、前記ポリヒドロキシアルカノエートの３−ヒドロキシアルカン酸ユニット組成を前記色材の内側から外側に向かう方向において変化させることを特徴とする請求項１７に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記製造方法が、前記顔料粒子を被覆するポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部に化学修飾を施す工程をさらに有する請求項１７に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記の化学修飾を施す工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部にグラフト鎖を付加せしむ工程であることを特徴とする請求項１９に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記グラフト鎖を付加せしむ工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と、末端に反応性官能基を有する化合物とを反応させる工程であることを特徴とする請求項２０に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項２１に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記の末端に反応性官能基を有する化合物が、アミノ基を有する化合物であることを特徴とする請求項２１または請求項２２に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記アミノ基を有する化合物が、末端アミノ変性化合物であることを特徴とする請求項２３に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記末端アミノ変性化合物が、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項２４に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記の化学修飾を施す工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部を架橋化せしむ工程であることを特徴とする請求項１９に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記架橋化工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と架橋剤とを反応させる工程であることを特徴とする請求項２６に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項２７に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記架橋剤が、ジアミン化合物、無水コハク酸、２−メチル−４−メチルイミダゾールからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項２７または請求項２８に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記ジアミン化合物がヘキサメチレンジアミンであることを特徴とする請求項２９に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記架橋化工程が、ポリヒドロキシアルカノエートに電子線を照射する工程であることを特徴とする請求項２６に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が、該酵素の生産能を有する微生物、または該生産能に関与する遺伝子を宿主微生物に導入した形質転換体により生産されるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１６または請求項１７に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物である、請求項３２に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）からなる群から選択される少なくとも１つ以上の微生物である、請求項３３に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）に属する微生物である、請求項３２に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バークホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１、ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）、バークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７０）、バークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７１）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項３５に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）に属する微生物である、請求項３２に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＴＬ２、ＦＥＲＭ ＢＰ−６９１３）である、請求項３７に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、ラルストーニャ属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ．）に属する微生物である、請求項３２に記載の塗料組成物の製造方法。
- ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＴＢ６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−６９３３）である、請求項３９に記載の塗料組成物の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項３２に記載の塗料組成物の製造方法。
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2002
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