JP3625433B2 - 粒状構造体及びその製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、様々な粒状体（以下、「コア」と呼ぶ）を内包出来る、３−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニット及び３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットから選択されたモノマーユニットのホモあるいは共重合ポリマーを外被とする粒状構造体（（以下、「カプセル構造体」と呼ぶ））等に関し、塗料、インキ、コーティング剤、接着剤、消火剤、化粧品、土建材料、更には農薬、医薬、診断薬、肥料等の各種製剤等の用途として幅広く利用できる。また、本発明は界面活性剤や有機溶媒を用いずに上記の粒状構造体を作成する製造方法に関する。また、この粒状構造体の、特に電子写真用トナーへの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロカプセルはトナー、塗料、インキ、コーティング剤、接着剤、消火剤、化粧品、土建材料、農薬、医薬、診断薬、肥料等、様々な用途への利用が検討されている。例えば特開平５−０８５８７３号公報には徐放性肥料が、特開平６−２９５０５９には感熱記録材料が、特開平９−２０８４９４号公報には、徐放性医薬製剤に関するマイクロカプセルが開示されている。
【０００３】
また、特開平８−２８６４１６号公報では、帯電の安定化を図ったカプセルトナーが、特開平９−２９２７３５号公報では、熱感受性カプセルトナーが開示され、その他、特開平５−１１９５３１号公報、特開平５−２４９７２５号公報、特開平６−３３２２２５号公報、特開平９−４３８９６号公報、特開平１０−７８６７６号公報、特開平１１−７１６３号公報、特開２０００−６６４４４号公報、特開２０００−１１２１７４号公報、特開２０００−３３０３２１号公報などのカプセルトナーが開示されている。
【０００４】
近年、省エネルギーの観点から、電子写真において用いられるトナーの性質として、低温定着性が要求されている。トナーの低温定着性を達成するには、トナーを構成している結着樹脂のガラス転移温度を下げることが直接的であり、過去に多くの検討がなされている。しかし、トナーのガラス転移温度を下げ過ぎると、トナー粒子同士が凝集（ブロッキング）を起こしたり、帯電不良が発生し易くなる等の不具合を生じてしまい、トナーに要求される諸特性が損なわれることがわかっている。
【０００５】
そこでこの問題を改善するために、低いガラス転移温度をもつ樹脂からなるコア（芯材料）の表面を、ガラス転移温度の高い樹脂からなるシェルによりカプセル化したカプセルトナーが多数提案されている。これらは懸濁重合法や界面重合法によりカプセル化されており、例えば、特開平５−１１３６８７号公報では、着色剤を含むコアバインダーを、界面重合法によりポリエーテル・ウレアポリマーのシェルでカプセル化することにより、トナー同士が凝集することを抑制すると共に、トナー画像の定着性等を改良している。一方、特開平１１−１９４５３１号公報では高いガラス転移温度の樹脂からなるコアの表面を、低いガラス転移温度の樹脂からなるシェルによりカプセル化したカプセルトナーが提案され、低温定着性等を実現している。
【０００６】
上記のマイクロカプセルは、界面重合法（２種のモノマーもしくは反応物を分散相と連続相に別々に溶解しておき、両者の界面においてモノマーを重合させて壁膜を形成させる方法）、懸濁重合法（水性媒体中で芯物質をモノマー中に分散し、次いで系の温度を上昇することで壁膜を形成させる方法）、乳化重合法（界面活性剤を溶解した水媒体中に水不溶のモノマーを添加して攪拌し、乳化剤のミセルにモノマーを取り込ませ、ミセル内でモノマーを重合して壁膜を形成させる方法）、ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法（液体または気体のモノマーと触媒、もしくは反応性の物質２種を連続相核粒子側のどちらか一方から供給して反応を起こさせ壁膜を形成させる方法）、コアセルベーション（相分離）法（芯物質粒子を分散している高分子溶液を高分子濃度の高い濃厚相と希薄相に分離させ、壁膜を形成させる方法）、液中乾燥法（芯物質を壁膜物質の溶液に分散した液を調製し、この分散液の連続相が混和しない液中に分散液を入れて複合エマルションとし、壁膜物質を溶解している媒質を徐々に除くことで壁膜を形成させる方法）、等の化学的方法によって製造されてきた。
【０００７】
しかし上記従来の方法によって製造されたマイクロカプセルでは、大量に使用する懸濁安定剤や乳化剤などの界面活性剤や重合反応剤などがカプセル内やカプセル外被に残留することが、カプセルの使用目的によっては問題となる場合がある。例えばトナーでは電気特性や流動性に影響する場合があることが問題になっている。また、医療・化粧品・肥料・農薬等、人体や環境中に使用する場合には、用途が非常に限定されたり、また使用できる界面活性剤や重合反応剤が厳しく制限されることになる。
【０００８】
また、上記従来の方法による製造方法では、マイクロカプセル中にコアと同時に分散媒を内包してしまうため、マイクロカプセル全体積中に占めるコアの体積密度が低いという問題がある。これは例えばカラー複写機のトナーなどが高精彩、高解像度の画質を要求される中で問題になってきている。
【０００９】
そこでマイクロカプセルの外被を構成するポリマーをコアに吸着させ、それによって直接コア表面を被覆する方法が検討されている。例えば、ＩＣＩ社の商品名「Ｓｏｌｓｐｅｒｓｅ」のように、顔料とポリマーの両者に結合可能な分散剤を使用し、分散剤を介して顔料表面にポリマーを被覆する方法（「色材ハンドブック」ｐ４２８）や、表面処理によって無機物粒子のイオン性を弱くする、あるいはポリマーに極性基を導入することでポリマーを無機粒子に吸着させ、被覆する方法が検討されている。また、特開平８−２８６４１６号公報などでは、カプセルを形成するモノマーと同じ成分をコアに含有させることで両者の親和性を上げ、コア表面にカプセル外被を形成するなどの方法が採られている。しかし、これらの方法ではコアとして使用可能な材料が限定され、また、操作が煩雑となるなどの問題があった。
【００１０】
また、上記従来のマイクロカプセルの製造方法では、モノマーの重合やポリマーの溶解等のために有機溶媒を用いる場合が多く、有機溶媒に可溶なコアを使用することができなかったり、また大量生産のために大量に有機溶媒を使用する場合、設備や人体・環境への負荷が大きくなる傾向にある。
【００１１】
ところでここ数年、地球温暖化防止の観点から、大気中の二酸化炭素濃度の原因となる石油資源の使用量を削減しようとする動きが活発化しており、それとともに、植物の光合成作用により、大気中の二酸化炭素を固定化することで得られる糖質を原料としたプラスティックの生産が注目されている。
【００１２】
中でも、アルカリゲネス属等、多くの微生物に糖質を与えることによって合成され、細胞質内にグラニュルの形で蓄積されるポリ−３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸（以下、ＰＨＢと略す場合もある）や３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸との共重合体（以下、ＰＨＢ／Ｖと略す場合もある）等のポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略す場合がある）は、従来の石油由来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用できることから、非石油系プラスティックの代表として取り上げられるまでになっている。その上、微生物等、各種生物によって分解可能な生分解性を有しており、環境中や生物体内での残留性が極めて低いという利点を有する。
【００１３】
さらに生体適合性に優れていることを利用した医療材料、また光学活性を有するアイソタクチックポリマーであることを利用した光学材料等、機能性材料としても、非常に優れた面を有している。
【００１４】
以上のような機能性を有するＰＨＡを、石油系プラスティックを代替して積極的に活用していくことは、環境や生物に対する負荷の軽減に貢献し、また材料技術の進歩につながるものと確信される。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、環境や生物に対する負荷が低く、種々の機能性を有するＰＨＡを利用して、コアの材質の制約が少なく、コアが高密度に内包されたカプセル構造体を提供することにある。また、従来マイクロカプセルの汚染源となっていた界面活性剤、重合反応剤等の添加物を使用せず、有機溶媒を使用しないカプセル構造体の簡便な製造方法を提供することにある。
【００１６】
さらに上記カプセル構造体を利用した形態として、低温定着性と耐ブロッキング性等を発揮しうる電子写真用カプセルトナー及びその製造方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、３−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニット及び３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットより選択される少なくとも一つのモノマーユニットを有するＰＨＡ（以下、ｓｃｌ−ＰＨＡ（短鎖長ＰＨＡ；ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡの意味）と略す）の合成酵素をコア（芯材料）表面に固定化し、ここに３−ヒドロキシプロピオニル補酵素Ａ、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａ及び３−ヒドロキシバレリル補酵素Ａより選択される少なくとも一つを加えて反応させることにより、コア表面にｓｃｌ−ＰＨＡを合成させ、コアをｓｃｌ−ＰＨＡで被覆した構造体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
即ち本発明は、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素によって合成されたｓｃｌ−ＰＨＡがコアの少なくとも一部を被覆したカプセル構造体に関する。
【００１９】
また、コアにｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化し、該酵素により３−ヒドロキシプロピオニル補酵素Ａ、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａ、３−ヒドロキシバレリル補酵素Ａより選択される少なくとも一つを重合させることにより、コアの少なくとも一部をｓｃｌ−ＰＨＡで被覆することを特徴とする、ｓｃｌ−ＰＨＡを外被とするカプセル構造体の製造方法に関する。
【００２０】
また本発明は、ガラス転移温度がトナーの低温定着性と耐ブロッキング性にとって好適なｓｃｌ−ＰＨＡをカプセル構造体外被として用いることで、低温定着性と耐ブロッキング性を具備した上記カプセル構造体からなる電子写真用トナー、及びその製造方法に関する。
【００２１】
なお、本発明における粒状構造体は、その表面の少なくとも一部にポリヒドロキシアルカノエートを被覆した構成を有し、目的とする特性が得られる範囲内で全表面が必ずしも被覆されている必要はない。全表面が被覆された状態では、先に述べたとおり、粒状体をコアとし、ポリヒドロキシアルカノエートの被覆層をシェルとしたマイクロカプセル構造の粒状構造体を得ることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、ｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌から抽出したｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素に、（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種を与えることでｓｃｌ−ＰＨＡを合成する、ｓｃｌ−ＰＨＡのｉｎ−ｖｉｔｒｏ（無細胞系）合成を利用したものである。
【００２４】
ｓｃｌ−ＰＨＡはｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌の体内で次のような複数の酵素反応系により合成されている。ｓｃｌ−ＰＨＡの生合成は、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種を基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素を本発明ではｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素と呼ぶことにする。その中で、例えばＰＨＢを合成する酵素であれば、通常、ＰＨＢ合成酵素（ＰＨＢポリメラーゼ、ＰＨＢシンターゼともいう）と呼ばれている。
【００２５】
なお、ＣｏＡとは補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ）の略称であり、その化学構造は下記化学式の通りである。
【００２６】
【化１】

【００２７】
本発明ではこの酵素反応系の最後の段階を利用しており、（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種をｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素によって重合することでｓｃｌ−ＰＨＡを合成している。
【００２８】
ｓｃｌ−ＰＨＡをｉｎ−ｖｉｔｒｏで合成した例はこれまでにいくつか知られており、例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６２７９−６２８３（１９９５）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることによりＰＨＢを合成している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２５，５５−６０（１９９９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることによりＰＨＢを合成している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．，２１，７７−８４（２０００）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。また、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１６８，３１９−３２４（１９９８）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることによりＰＨＢを合成している。
【００２９】
このようにｉｎ−ｖｉｔｒｏでのｓｃｌ−ＰＨＡ合成例はいくつかあるが、本発明のように、カプセル構造体として利用した報告はない。
【００３０】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、例えば、ＰＨＢやＰＨＢ／Ｖ生産菌として知られている微生物を用いることができる。このような微生物として、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）などが知られている。また、本発明者らにより分離された、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏＳＣＬ−ＰＨＡ ＴＢ６４）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ． ＴＬ２）などを用いることができる。なお、ＫＫ０１株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５として、ＴＢ６４株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９３３として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９１３として、経済産業省生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにそれぞれ寄託されている。
【００３１】
また、このような野生株以外に、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産するために、形質転換体を用いることもできる。ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニングに関しては、これまでにアルカリゲネス・ユートロファスのＰＨＢシンターゼ遺伝子（ｐｈｂＣ）がクローニングされている。また本発明者らはバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）ＫＫ０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）のｐｈｂＣについてクローニングを完了しており、またラルストーニャ・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＴＢ６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９３３）のｐｈｂＣについてもクローニングを完了している。形質転換体はこのｐｈｂＣを含むベクターを宿主に導入する事によって作出できる。ｐｈｂＣを含むベクターは、例えばプラスミドベクター、ファージベクター等にｐｈｂＣを挿入することによって得られる。宿主としては、例えば大腸菌（エシェリチア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が良く用いられる。
【００３２】
以上に挙げたようなｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌は、単独で、あるいは必要に応じて２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３３】
本発明に用いるこれらの微生物を培養する培地としては、各微生物の増殖に必要な成分、例えば炭素源、窒素源、リン源、その他無機塩及び必要に応じその他の有機成分等を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００３４】
培養は液体培養、固体培養等該微生物が増殖し、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産する培養方法ならいかなる培養方法でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００３５】
培養温度としては使用する菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば １４〜４０℃、好ましくは ２０〜３７℃程度が適当である。
【００３６】
また、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いた場合、大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体であれば、培地及び培養方法は前記と同様でよいが、発現ベクター等により耐性を付与した菌株に関しては、必要に応じて培地にカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて誘導性のプロモーターを用いている場合は、培養に際して該プロモーターに対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【００３７】
培養したｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌からのｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の抽出は、培養液をフレンチプレス、超音波破砕、凍結融解等によって破砕する方法や、硫酸アンモニウム等により蛋白質成分を沈殿・回収した硫安塩析などの方法によって行えばよい。また、遠心分離機によって培養液から菌体を分離回収し、濃縮してからこれらの方法を施してもよい。
【００３８】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素は精製を行うことが好ましいが、精製を行わない粗酵素の状態で用いてもよい。ただし粗酵素を用いた場合、コア表面にｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素以外のたんぱく質等の菌体成分が固定化されるため、コア表面に固定化されるｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の密度が低くなること、また菌体成分中のプロテアーゼ等によってｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素活性が低下することなどを考慮する必要がある。
【００３９】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法としては、例えばヌクレアーゼ等の分解酵素を用いて核酸成分を低分子化した後、イオンクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、等電点分画法、密度勾配遠心法、電気泳動法、分子ふるい法、二相分離法等の方法を単独または複数組み合わせることによって行えばよい。
【００４０】
特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼで切断する。あるいは、発現ベクターとしてｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）などで還元条件として切断する。アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、あるいはチオレドキシン（ＴＲＸ）等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
また、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素には必要に応じて、金属塩、グリセリン、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの安定化剤、付活剤を適宜添加して用いることができる。
【００４１】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、従来公知の各種方法を用いることができるが、例えば、（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種がｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してｓｃｌ−ＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定する方法を用いることができる。
【００４２】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素をコアに固定化する方法に関しては、コア材料の種類や構造、作製したカプセル構造体の使用形態等に応じていかなる方法を用いてもよいが、特にイオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法が簡便である。
【００４３】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素などの酵素たんぱく質は、アミノ酸の多数結合したポリペプチドであり、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。したがって程度の差はあるが、イオン性や疎水性もしくはイオン性、疎水性両方の性質を有する固体に吸着することが可能である。
【００４４】
主にイオン吸着によってｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化するコアとしては、イオン性官能基を表面に発現しているものであれば良く、例えば、カオリナイト、ベントナイト、タルク、雲母等の粘土鉱物、アルミナ、二酸化チタン等の金属酸化物、シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩などが挙げられる。また、これら粘土鉱物や金属酸化物、不溶性無機塩を主要な成分としている無機顔料もイオン吸着性コアとして挙げられる。またこの他に、イオン交換樹脂、キトサン、ポリアミノポリスチレン等、イオン性官能基を有する有機ポリマーが挙げられる。
【００４５】
また、主に疎水吸着によってｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化するコアとしては、コア表面が非極性であればよく、例えばスチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、メタクリル系ポリマー、ビニルエステル類、ビニル系ポリマーなど、イオン性官能基を表面に発現していない、もしくは疎水性官能基を表面に発現している多くの有機ポリマーが挙げられる。また、芳香環を複数有するアゾ顔料や縮合多環のフタロシアニン系顔料、アントラキノン系顔料等の有機顔料、カーボンブラックなどを挙げられる。
【００４６】
イオン吸着または疎水吸着によるｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素のコアへの固定化は、酵素とコアを所定の溶液中で混合することによって達成される。このとき、コアの表面に均等にｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素が吸着されるように反応容器を適当な強度で振とうすることが望ましい。
【００４７】
また、溶液のｐＨや塩濃度、温度等を適当に選択することで、コアとｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素のイオン吸着性、疎水吸着性をある程度制御することができる。そのため、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の活性の許容される範囲内で溶液の調整を行うことが望ましい。
【００４８】
また、あらかじめ電気泳動やぬれ角等を測定し、コアやｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した溶液条件を設定することができる。
【００４９】
さらに直接コアとｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の吸着量を測定して溶液条件を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、コアの分散された溶液に濃度既知のｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を添加し、吸着反応を行った後に溶液中のｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いればよい。
【００５０】
イオン吸着や疎水吸着によってｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化しにくいコアの場合は、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を考慮すれば、共有結合法によってもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有するコアをジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基、アミノ基を有するコアと酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有するコアと酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、臭化シアンで活性化した多糖類コアと酵素のアミノ基を反応させる方法、コアのアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基、アミノ基を有するコアと酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有するコアと酵素のチオール基との間で交換反応させる方法などがある。
【００５１】
また、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素をリガンドが導入されたコアにアフィニティ吸着によって固定化してもよい。この場合、リガンドとしてｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の酵素活性を維持しながらアフィニティ吸着を行えるものであれば、いかなるものも選択できる。また、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素にタンパク質等の他の生体高分子を結合させ、結合した生体高分子をアフィニティ吸着することでｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化してもよい。ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素と生体高分子との結合は遺伝子組換え等によって行ってもよいし、化学的に行ってもよい。例えば、実施例に後述するように、形質転換によってグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素に融合し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのリガンドであるグルタチオンを導入したセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に融合タンパク質をアフィニティ吸着し、固定化することができる。
【００５２】
コアに固定化する酵素の量は、カプセル構造体の外被として形成させる膜厚やコアの表面積に応じて適宜設定すればよいが、１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とした場合、コア１ ｇあたり１０ 単位（Ｕ）から１，０００単位（Ｕ）、望ましくは５０ 単位（Ｕ）から５００単位（Ｕ） の範囲内に設定すると良い。
【００５３】
上記方法により作製された固定化酵素は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。
【００５４】
本発明の方法に用いるコアとしては、前述の方法等によってｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化することのできるものであればいかなるものでも良く、有機高分子化合物や無機系固形物から適宜選択して用いることができる。また、単独もしくは複数の混合物として用いてもよい。
【００５５】
本発明では、カプセル構造体の製造に有機溶媒を用いず、水溶媒で製造するため、親水性の無機顔料など、有機溶媒には分散性が悪いが、水溶媒には分散性の良い材料もコアとして用いることができる。また、有機溶媒では溶解してしまう材料もコアとして用いることができる。
【００５６】
さらに本発明においては、ｓｃｌ−ＰＨＡから構成されるカプセル外被の生分解性機能をより効果的にするため、コア材料として生分解性プラスチックを使用するのも好ましい。生分解性プラスチックとしては、微生物によって生産したｓｃｌ−ＰＨＡを利用してもよく、また、「エコスター」「エコスタープラス」（萩原工業）「バイオポール」（アイ・シー・アイ・ジャパン）「アジコート」（味の素）「プラクセル」「ポリカプロラクトン」（ダイセル化学）「ショーレックス」「ビオノーレ」（昭和電工）「ラクティ」（島津製作所）「レイシア」（三井化学）等の市販の生分解性プラスチックを使用しても良い。
【００５７】
また、本発明に効果的に適用されるコアとして顔料が挙げられる。顔料としては、公知の有機若しくは無機の顔料を使用することができる。ブラック系の顔料としては無機系のカ−ボンブラック、四三酸化鉄、有機系のシアニンブラック等が挙げられる。ホワイト系の顔料としては亜鉛華，酸化チタン，アンチモン白，硫化亜鉛などが挙げられる。イエロー系顔料としては、無機系の黄鉛、カドミウムイエロー、黄色酸化鉄、チタン黄、オーカー等が挙げられる。また、難溶性金属塩（アゾレーキ）のアセト酢酸アニリド系モノアゾ顔料としては、ハンザイエローＧ（ Ｃ．Ｉ．Ｎｏ． ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １、以下、同様）、ハンザイエロー１０Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ３）、ハンザイエローＲＮ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ６５）、ハンザブリリアントイエロー５ＧＸ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ７４）、ハンザブリリアントイエロー１０ＧＸ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ９８）、パーマネントイエローＦＧＬ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ９７）、シムラレーキファストイエロー６Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １３３）、リオノールイエローＫ−２Ｒ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １６９）、またアセト酢酸アニリドジスアゾ顔料としては、ジスアゾイエローＧ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １２）、ジスアゾイエローＧＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １３）、ジスアゾイエロー５Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １４）、ジスアゾイエロー８Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １７）、ジスアゾイエローＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ５５）、パーマネントイエローＨＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ８３）が挙げられる。縮合アゾ顔料としては、クロモフタルイエロー３Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ９３）、クロモフタルイエロー６Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ９４）、クロモフタルイエローＧＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ９５）が挙げられる。更に、ベンズイミダゾロン系モノアゾ顔料としては、ホスタパームイエローＨ３Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ１５４）、ホスタパームイエローＨ４Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １５１）、ホスタパームイエローＨ２Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １２０）、ホスタパームイエローＨ６Ｇ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １７５）、ホスタパームイエローＨＬＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ１５６）が挙げられる。また、イソインドリノン系顔料としては、イルガジンイエロー３ＲＬＴＮ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １１０）、イルガジンイエロー２ＲＬＴ、イルガジンイエロー２ＧＬＴ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １０９）、ファストゲンスーパーイエローＧＲＯＨ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １３７）、ファストゲンスーパーイエローＧＲＯ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １１０）、サンドリンイエロー６ＧＬ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １７３）が挙げられ、その他、スレン系顔料であるフラバントロン（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２４）、アントラミリミジン（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １０８）、フタロイルアミド型アントラキノン（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １２３）、ヘリオファストイエローＥ３Ｒ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ ９９）、金属錯体顔料であるアゾ系ニッケル錯体顔料（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｇｒｅｅｎ１０）、ニトロソ系ニッケル錯体顔料（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ１５３）、アゾメチン系銅錯体顔料（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １１７）、更にキノフタロン顔料であるフタルイミドキノフタロン顔料（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １３８）等が挙げられる。また、マゼンタ系顔料としては無機系のカドミウムレッド、ベンガラ、銀朱、鉛丹、アンチモン朱が挙げられる。また、アゾ系顔料のアゾレーキ系としては、ブリリアントカーミン６Ｂ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ５７：１）、レーキレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ５３：１）、パーマネントレッドＦ５Ｒ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ４８）、リソールレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ４９）、ペルシアオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ１７）、クロセイオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ１８）、ヘリオオレンジＴＤ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ１９）、ピグメントスカーレット（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ６０：１）、ブリリアントスカーレットＧ（ ｐｉｇｍｅｎｔ６４：１）、ヘリオレッドＲＭＴ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ５１）、ボルドー１０Ｂ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ６３）、ヘリオボルドーＢＬ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ５４）が挙げられ、また、不溶性アゾ系（モノアゾ、ジスアゾ系、縮合アゾ系）としては、パラレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１）、レーキレッド４Ｒ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ３）、パーマネントオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ５）、パーマネントレッドＦＲ２（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ２）、パーマネントレッドＦＲＬＬ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ９）、パーマネントレッドＦＧＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１１２）、ブリリアントカーミンＢＳ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１１４）、パーマネントカーミンＦＢ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ５）、Ｐ．Ｖ．カーミンＨＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１５０）、パーマネントカーミンＦＢＢ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１４６）、ノバパームレッドＦ３ＲＫ−Ｆ５ＲＫ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１７０）、ノバパームレッドＨＦＧ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ３８）、ノバパームレッドＨＦ４Ｂ（ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１８７）、ノバパームオレンジＨＬ．ＨＬ−７０（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ３６）、Ｐ．Ｖ．カーミンＨＦ４Ｃ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１８５）、ホスタバームブラウンＨＦＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｒｏｗｎ２５）、バルカンオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ１６）、ピラゾロンオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ１３）、ピラゾロンレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ３８）が挙げられ、更に、縮合アゾ顔料としてクロモフタールオレンジ４Ｒ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ３１）、クロモフタールスカーレットＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１６６）、クロモフタールレッドＢＲ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１４４）が挙げられる。また、縮合多環系顔料であるアントラキノン顔料としてピランスロンオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ４０）、アントアントロンオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ１６８）、ジアントラキノニルレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１７７）が挙げられ、チオインジゴ系顔料としてチオインジゴマゼンタ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ３８）、チオインジゴバイオレット（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ３６）、チオインジゴレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ８８）が挙げられ、ペリノン系顔料としてペリノンオレンジ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｏｒａｎｇｅ４３）が挙げられ、更にペリレン系顔料として、ペリレンレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１９０）、ペリレンバーミリオン（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１２３）、ペリレンマルーン（ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１７９）、ペリレンスカーレット（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１４９）、ペリレンレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１７８）が挙げられ、キナクリドン系顔料としてキナクリドンレッド（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ１９）、キナクリドンマゼンタ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ１２２）、キナクリドンマルーン（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ２０６）、キナクリドンスカーレット（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ２０７）が挙げられ、その他、縮合多環顔料としてピロコリン系顔料、赤色系フルオルビン系顔料、染付けレーキ系顔料（水溶性染料＋沈殿剤→レーキ化固着）が挙げられる。
【００５８】
シアン系顔料としては、無機系の群青、紺青、コバルトブルー、セルリアンブルー等が挙げられ、またフタロシアニン系として、ファーストゲンブル−ＢＢ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １５）、スミトン・シアニン・ブルーＨＢ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １５）、シアニンブルー５０２０（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １５：１）、スミカプリント・シアニン・ブルーＧＮ−Ｏ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １５）、ファスト・スカイブルーＡ−６１２（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｂｌｕｅ １７）、シアニン・グリーンＧＢ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｇｒｅｅｎ７）、シアニングリーンＳ５３７−２Ｙ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｇｒｅｅｎ３６）、スミトン・ファストバイオレットＲＬ（ ｐｉｇｍｅｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ２３）が挙げられ、また、スレン系顔料であるインダントロンブルー（ＰＢ−６０Ｐ，ＰＢ−２２，ＰＢ−２１，ＰＢ−６４）、塩基性染料レーキ顔料であるメチルバイオレット・リン・モリブデン酸レーキ（ＰＶ−３）等が挙げられる。また体質顔料としてバライト粉，炭酸バリウム，クレー，シリカ，ホワイトカーボン，タルク，アルミナホワイトなどが挙げられる。その他、上記顔料の表面に樹脂をコーティングした加工顔料も同様に使用することができる。
【００５９】
また、本発明のカプセル構造体を、電子写真用のカプセルトナーとして用いる場合には、コアとして、従来公知のトナーや、従来公知のトナーとして使用される材料から構成される粒子を用いることができる。
【００６０】
本発明のトナーとして使用されうる材料として、バインダー樹脂、着色剤、荷電制御剤、磁性材料等が挙げられる。
【００６１】
バインダー樹脂としては、通常、トナーを製造する際に用いられているものであればいずれも使用することができ、特に限定されない。例えば、スチレン系ポリマー、ポリエステル系ポリマー、エポキシ系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマーおよびポリウレタン系ポリマーなどが挙げられ、単独または混合して使用することができる。スチレン系ポリマーとしては、スチレンと（メタ）アクリル酸エステルとの共重合体およびこれらと共重合可能な他の単量体の共重合体、スチレンとジエン系単量体（ブタジエン、イソプレンなど）との共重合体およびこれらと共重合可能な他の単量体の共重合体などが挙げられる。ポリエステル系ポリマーとしては芳香族ジカルボン酸と芳香族ジオールのアルキレンオキサイド付加物との重縮合物などが挙げられる。エポキシ系ポリマーとしては芳香族ジオールとエピクロルヒドリンとの反応物およびこれの変性物などが挙げられる。ポリオレフィン系ポリマーとしてはポリエチレン、ポリプロピレンおよびこれらと他の共重合可能な単量体との共重合体鎖などが挙げられる。ポリウレタン系ポリマーとしては芳香族ジイソシアネートと芳香族ジオールのアルキレンオキサイド付加物との重付加物などが挙げられる。
【００６２】
このバインダー樹脂を製造する方法としては、従来よりトナーの製造方法として知られている方法を用いればよく、破砕法、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法等の重合法を用いることもできる。また、重合方法に応じて架橋剤、重合開始剤を用いることもできる。
以下に述べる着色剤、荷電制御剤、磁性材料等は、バインダー樹脂の製造時に添加しても、また、バインダー樹脂を製造した後に膨潤、或いは機械的打ち込み等により導入してもよい。
【００６３】
着色剤としては、通常、トナーを製造する際に用いられているものであればいかなるものも使用することができ、特に限定されない。そのうち、顔料としては例えば前述のものを用いることができる。また、バインダー樹脂を用いる場合は着色剤として染料を用いることもできる。染料としては、例えば、三菱化成製のダイアレジン Ｙｅｌｌｏｗ−３Ｇ、Ｙｅｌｌｏｗ−Ｆ、Ｙｅｌｌｏｗ−Ｈ２Ｇ、Ｙｅｌｌｏｗ−ＨＧ、Ｙｅｌｌｏｗ−ＨＣ、Ｙｅｌｌｏｗ−ＨＬ、Ｏｒａｎｇｅ−ＨＳ、Ｏｒａｎｇｅ−Ｇ、Ｒｅｄ−ＧＧ、Ｒｅｄ−Ｓ、Ｒｅｄ−ＨＳ、Ｒｅｄ−Ａ、Ｒｅｄ−Ｋ、Ｒｅｄ−Ｈ５Ｂ、Ｖｉｏｌｅｔ−Ｄ、Ｂｌｕｅ−Ｊ、Ｂｌｕｅ−Ｇ、Ｂｌｕｅ−Ｎ、Ｂｌｕｅ−Ｋ、Ｂｌｕｅ−Ｐ、Ｂｌｕｅ−Ｈ３Ｇ、Ｂｌｕｅ−４Ｇ、Ｇｒｅｅｎ−Ｃ、Ｂｒｏｗｎ−Ａや、保土ヶ谷化学製の藍染ＳＯＴ染料 Ｙｅｌｌｏｗ−１、Ｙｅｌｌｏｗ−３、Ｙｅｌｌｏｗ−４、Ｏｒａｎｇｅ−１、Ｏｒａｎｇｅ−２、Ｏｒａｎｇｅ−３、Ｓｃａｒｌｅｔ−１、Ｒｅｄ−１、Ｒｅｄ−２、Ｒｅｄ−３、Ｂｒｏｗｎ−２、Ｂｌｕｅ−１、Ｂｌｕｅ−２、Ｖｉｏｌｅｔ−１、Ｇｒｅｅｎ−１、Ｇｒｅｅｎ−２、Ｇｒｅｅｎ−３、Ｂｌａｃｋ−１、Ｂｌａｃｋ−４、Ｂｌａｃｋ−６、Ｂｌａｃｋ−８や、ＢＡＳＦのｓｕｄａｎ染料 Ｙｅｌｌｏｗ−１４６、Ｙｅｌｌｏｗ−１５０、Ｏｒａｎｇｅ−２２０、Ｒｅｄ−２９０、Ｒｅｄ−３８０、Ｒｅｄ−４６０、Ｂｌｕｅ−６７０や、オリエント化学工業製の、オイルブラック、オイルカラー Ｙｅｌｌｏｗ−３Ｇ、Ｙｅｌｌｏｗ−ＧＧ−Ｓ、Ｙｅｌｌｏｗ−＃１０５、Ｏｒａｎｇｅ−ＰＳ、Ｏｒａｎｇｅ−ＰＲ、Ｏｒａｎｇｅ−＃２０１、Ｓｃａｒｌｅｔ−＃３０８、Ｒｅｄ−５Ｂ、Ｂｒｏｗｎ−ＧＲ、Ｂｒｏｗｎ−＃４１６、Ｇｒｅｅｎ−ＢＧ、Ｇｒｅｅｎ−＃５０２、Ｂｌｕｅ−ＢＯＳ、Ｂｌｕｅ−ＩＩＮ、Ｂｌａｃｋ−ＨＢＢ、Ｂｌａｃｋ−＃８０３、Ｂｌａｃｋ−ＥＢ、Ｂｌａｃｋ−ＥＸ、住友化学工業製のスミプラスト ブルーＧＰ、ブルーＯＲ、レッド−ＦＢ、レッド−３Ｂ、イエローＦＬ７Ｇ、イエローＧＣや、日本化薬製の カヤロン ポリエステルブラックＥＸ−ＳＦ３００、カヤセットＲｅｄ Ｂ、ブルーＡ−２Ｒ 等を挙げることができる。
【００６４】
上記の染料及び顔料は、単独で使用しても、混合して使用してもよい。なお、環境保全や人体に対する安全性などを考慮した場合には、各種食用色素を好適に使用することができる。
【００６５】
上記着色剤のカプセル化トナー中の含有量は、所望とする着色効果などに応じて広く選択することが可能であるが、通常、バインダー樹脂１００質量部に対して、０．１質量部乃至１５質量部程度であればよく、より好ましくは、１．０質量部乃至１０質量部程度であればよい。ここで、着色剤の含有量が０．１質量部未満であると、トナーとしての隠蔽力不足になり、１５質量部を超える場合には、着色剤の種類によってはＯＨＰの透明性が劣るようになる。
【００６６】
帯電制御剤としては、通常、トナーを製造する際に用いられているものであれば、正荷電制御剤若しくは負荷電制御剤、いずれも使用することができ、特に限定されない。
【００６７】
例えば、ニグロシン系染料、トリフェニルメタン系染料、四級アンモニウム塩、アミン系或いはイミン系化合物、サリチル酸又はアルキルサリチル酸の金属化合物、含金モノアゾ系染料、カルボキシリル基又はスルホシキル基を有する化合物、ニトロフミン等のフミン酸及びフミン塩類等を挙げることができる。
【００６８】
上記荷電制御剤のカプセル化トナー中の含有量は、通常、バインダー樹脂１００質量部に対して、０．１〜５０質量％、好ましくは０．３〜３０質量％である。ここで、荷電制御剤の含有量が０．１質量％未満であると、帯電量が低く、５０質量％を超えるとトナーの帯電安定性が悪くなる。
【００６９】
本発明のカプセル化トナーは、磁性材料をコアに含有させ磁性トナーとしてもよい。この場合には、磁性材料に、着色剤の役割を兼ねさせることもできる。この際に使用される磁性材料としては、マグネタイト、ヘマタイト、フェライトの如き酸化鉄；鉄、コバルト、ニッケルのような金属或いはこれらの金属とアルミニウム、コバルト、銅、鉛、マグネシウム、スズ、亜鉛、アンチモン、ベリリウム、ビスマス、カドミウム、カルシウム、マンガン、セレン、チタン、タングステン、バナジウムのような金属との合金及びその混合物が挙げられる。本発明において用いることのできるこれらの磁性材料としては、平均粒子径が２μｍ以下、好ましくは０．１〜０．５μｍ程度のものが好ましい。
【００７０】
上記磁性材料のカプセルトナー中の含有量は、通常、バインダー樹脂１００質量部に対し２０〜２００質量部、特に好ましくは、バインダー樹脂１００質量部に対して４０〜１５０質量部とすることが好ましい。
【００７１】
以上が、本発明のカプセル構造体を、カプセルトナーとして使用する場合のコアの例示であるが、上記カプセルトナーのコアはｓｃｌ−ＰＨＡでカプセル化されるため、コアのガラス転移温度（Ｔｇ）としては、通常、低温定着性をトナーに求めた場合のガラス転移温度である４０〜７５℃の範囲内になくてもかまわない。例えば、２０〜４０℃、７５〜１２０℃等であっても有効に使用することができる。
【００７２】
本発明に使用されるカプセル構造体のコアの粒径としては、特に限定されないが、０．０１μｍ以上がカプセル構造体の作成上望ましい。粒径の上限は特にないが、粒子表面にｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を均等な密度で吸着させる点から、１ｍｍ程度までが扱いやすい。
カプセルトナーの場合、高画質化を達成するために、重量平均径で３〜８μｍの範囲内のコアを使用するのが好ましい。そしてカプセルトナーとして重量平均径で３〜１０μｍの範囲とするのが好ましい。重量平均径が３μｍ未満のカプセルトナーでは、転写効率の低下が生じ、感光体上に転写残トナーが多く残り易く、カブリ・転写不良に基づく画像の不均一ムラの原因となり易く、好ましくない。また、カプセルトナーの重量平均径が１０μｍを超える場合には、文字やライン画像の飛び散りが生じ易い。
【００７３】
本発明のカプセル構造体の製造方法では、コアの粒径が均一であれば、カプセル構造体の粒径も比較的均一にすることができるが、逆に粒径や形状の不均一なコアもほぼ一様にカプセル化することができるため、コアの粒径や形状の均一性は問わない。
【００７４】
コアの粒径や粒度分布の測定は、例えば、コールターカウンターＴＡ−ＩＩ型或いはコールターマルチサイザー（コールター社製）等を用いて測定を行えばよい。
【００７５】
通常、水溶媒中で本発明のごときマイクロカプセルを製造する場合、コアが有機顔料など疎水性のものであれば、カプセル形成時にコアが凝集するという問題が生じるが、本方法ではカプセル形成前にｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固体粒子に吸着させるため、酵素たんぱく質のイオン性官能基による電気的反発力や立体反発力によって疎水性の固体粒子を水媒体中である程度分散することができ、疎水性コアのカプセル化を比較的容易にすることができる。
【００７６】
しかし、コアに酵素を固定化する段階では、ある程度の分散処理をすることが好ましい。その際、界面活性剤等を用いずにカプセルを製造できるという本発明の特長を生かすため、攪拌や超音波処理など、機械的な分散手法を用いるのが好ましいが、用途的に問題なければ、酵素活性に影響しない組成及び濃度の、従来公知の界面活性剤を用いてコアを分散させてもかまわない。
【００７７】
コアに固定化された上記ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素によってｓｃｌ−ＰＨＡの合成を行うためのモノマーとして、（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを使用する。（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは市販されており、シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）等で入手できる。また、酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法、微生物や植物などの生物体を用いたｉｎ ｖｉｖｏ合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。例えば、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣｏＡシンセターゼ（アシルＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）を用いた下記反応、
【００７８】
【化２】

【００７９】
による酵素合成法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，３７−４３（２０００） など）を用いることができる。
【００８０】
本発明では、上記ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を固定化したコアを分散した水系反応液に（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種を添加し、反応条件を整えることでｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素により（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種を重合し、それによってコアをｓｃｌ−ＰＨＡで被覆して、ｓｃｌ−ＰＨＡを外被としたカプセル構造体を形成する。
【００８１】
上記水系反応液は、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整されたものであれば、どのようなものを用いても良いが、例えば通常、緩衝液を用いてｐＨ５．５からｐＨ９．０、好ましくはｐＨ７．０からｐＨ ８．５となるように調製する。ただし、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外の条件を設定してもかまわない。
【００８２】
緩衝液の種類は、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するｐＨ領域に応じて適宜選択して用いることができるが、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファーなどを用いると良い。緩衝液の濃度も、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常５．０ ｍＭから１．０ Ｍ、好ましくは０．１ Ｍから０．２ Ｍの濃度のものを使用すると良い。反応温度も、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素に応じて適宜設定すればよいが、通常、４℃から５０℃、好ましくは２０℃から４０℃に設定すると良い。ただし、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定してもかまわない。反応時間は、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間から２４時間、好ましくは３０分間から３時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種の濃度（２種以上の場合はそれらの合計）は、使用するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で適宜設定するものであるが、通常、０．１ ｍＭから１．０ Ｍ、好ましくは０．２ ｍＭから０．２ Ｍの範囲内で設定すると良い。なお、反応液中における（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種の濃度が高い場合、一般に、反応系のｐＨが低下する傾向にあるため、（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種の濃度を高く設定する場合は、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
【００８３】
上記カプセル構造体製造時においては、コアの表面に固定化されているｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素に（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも１種が均等に供給されることが望ましく、反応容器を適当な強度で振とうすることが好ましい。
【００８４】
本発明によって得られた上記カプセル構造体がｓｃｌ−ＰＨＡで被覆されていることを確認する方法として、例えばガスクロマトグラフィー等による組成分析と電子顕微鏡等による形態観察とを組み合わせた方法や、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）とイオンスパッタリング技術を用いて、各構成層のマススペクトルから構造を判定する方法などを用いることができる。しかし、さらに直接的かつ簡便な確認方法として、本発明者らによって新たに開発された、ナイルブルーＡ染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることもできる。本発明者らは、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を用いた無細胞系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのｓｃｌ−ＰＨＡ合成を簡便に判定できる方法について鋭意検討を続けてきた結果、ｓｃｌ−ＰＨＡに特異的に結合して蛍光を発する性質を有する薬剤であり、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４４，２３８−２４１（１９８２） において微生物細胞（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのｓｃｌ−ＰＨＡ生産の簡易的判別に用いることができると報告されているナイルブルーＡが、適切な使用方法および使用条件の設定によって、無細胞系でのｓｃｌ−ＰＨＡ合成の判定にも用いることができることを見出し、上記の方法を完成させた。即ち、本方法では、所定濃度のナイルブルーＡ溶液を、ｓｃｌ−ＰＨＡを含む反応液に混合し、蛍光顕微鏡で一定の波長の励起光を照射しながら観察することにより、合成されたｓｃｌ−ＰＨＡのみから蛍光を発せしめ、これを観察することによって、無細胞系でのｓｃｌ−ＰＨＡ合成を簡易に判定することができる。使用したコアが上記条件下で蛍光を発する性質を有するものでない限り、上記方法を本発明の構造体の製造に応用することにより、コアの表面を被覆したｓｃｌ−ＰＨＡを直接的に観察し、評価することができる。
【００８５】
上記カプセル構造体のｓｃｌ−ＰＨＡ外被の膜厚は、反応時間、３ＨＢ−ＣｏＡ濃度、酵素濃度、温度等の反応条件を変えることで０．０１〜１０μｍの範囲内である程度制御することが可能である。また、電子写真用カプセルトナーの場合、０．１μｍ未満の場合は定着性が劣り、２μｍを超えるとオフセットが発生し易くなるといった問題から、ｓｃｌ−ＰＨＡ外被の膜厚は０．１μｍ〜２μｍ程度とするのが好ましい。
【００８６】
また、本発明のカプセル構造体の製造方法では、同一分散液中のコアに被覆されるｓｃｌ−ＰＨＡ外被の膜厚をある程度均一にすることができるため、コアの粒径をあらかじめ揃えることで、カプセル構造体の粒径をある程度均一にすることができる。逆に粒径や形状の不均一なコアも、ある程度均一な膜厚で被覆することが可能である。
【００８７】
また、本発明のカプセル構造体では、ｓｃｌ−ＰＨＡ外被をコアの表面に直接形成することができるため、カプセル構造体中のコアの密度を高くすることができる。このコアの密度は、コアの粒径とｓｃｌ−ＰＨＡ外被の膜厚によって制限されるが、１０〜９５体積％の範囲内で制御することが可能であり、目的に応じて設定すればよい。
【００８８】
ｓｃｌ−ＰＨＡ外被の膜厚は、カプセル構造体をエポキシ樹脂で固めた後、ミクロトームにより超薄切片を作製し、四酸化ルテニウム、四酸化オスニウムなどにより染色した後、透過型電子顕微鏡により観察することで、あるいはコールターカウンターマルチサイザー（コールター社製）等の粒径測定装置を用いて、カプセル化前後のコアの粒径の差を測定することで求めることができる。
【００８９】
同様に、本発明のカプセル構造体では、外被を構成するｓｃｌ−ＰＨＡの分子量を、反応時間、３ＨＢ−ＣｏＡ濃度、酵素濃度、温度等の反応条件変えることで、Ｍｎ（数平均分子量）（ポリスチレン換算）で１，０００から１，０００万程度の範囲内で制御することが可能である。例えば、電子写真用カプセルトナーとして使用する場合は、３，０００から１００万程度とするのが望ましい。
【００９０】
この分子量の制御によってある程度カプセル外被のｓｃｌ−ＰＨＡのガラス転移温度を制御することができる。電子写真用カプセルトナーとして使用する場合、ガラス転移温度が４５℃未満であると、保存時にトナーの融着やブロッキングが生じ易くなり、また７５℃を超えると低温での定着性が劣るようになるため、カプセル外被のｓｃｌ−ＰＨＡのガラス転移温度は４５℃〜７５℃の範囲、好ましくは、５０℃〜７０℃の範囲となるように設定することが好ましい。
【００９１】
ｓｃｌ−ＰＨＡの分子量は、コアがクロロホルムに溶解しないことが前提となるが、例えば、カプセル構造体外被のｓｃｌ−ＰＨＡをクロロホルムに溶解し、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）により測定すればよい。
【００９２】
ガラス転移温度の測定は、例えば、パーキンエルマー社製のＤＳＣ−７のような高精度の内熱式入力補償型の示差走査熱量計を用いて測定を行えばよい。測定方法としては、ＡＳＴＭ Ｄ３４１８−８２に準じて行えばよい。
【００９３】
本発明のカプセル構造体の外被を構成するｓｃｌ−ＰＨＡは生分解性の機能を有するため、適当なコアを選ぶことで、生物に対し安全であり、環境に廃棄されても汚染を引き起こすことがない。また、自然界もしくは生体内において、カプセル外被が徐々に分解するため、徐放性機能を発現することが可能で、農薬や医薬製剤等の用途に有用である。
【００９４】
また、本発明のカプセル構造体外殻のｓｃｌ−ＰＨＡはＲ体のみからなるアイソタクチックなポリマーであるため、光学材料としての用途にも利用することが可能である。
【００９５】
本発明のカプセル構造体は、上記の方法により製造されるが、界面活性剤を使用せずに製造することが可能であるため、界面活性剤による汚染のないカプセル構造体として使用できる。また３ＨＢ−ＣｏＡや緩衝液に由来する塩によるカプセル構造体の汚染はごく微量であり、生物的には無害であり、かつ容易に洗浄しうるため、カプセルの使用目的に影響することはほとんどない。
【００９６】
また、本発明の製造方法は酵素反応のみを用いたものであるため、温度等の反応条件が温和で、乳化や懸濁のための高速攪拌などを必要とせず、またコアに酵素とモノマーを加えるだけという、極めて簡便な製造プロセスで行うことが可能である。
【００９７】
さらに、本発明の製造方法は有機溶媒を使用しないため、有機溶媒を使用する際に必要となる密閉度の高い容器、排気装置、高度な廃液処理などが不要となり、コストも抑制され、ラージスケール化が容易で人体や環境への負荷も少ない、といった特徴を有する。
【００９８】
本発明の製造方法によって得られたカプセル構造体は反応液のまま水分散体として用いることができるし、緩やかな遠心分離や吸引ろ過等によりカプセル構造体を回収した後、別の水溶液に分散させて使用することもできる。また、回収したカプセル構造体をｓｃｌ−ＰＨＡ不溶性の有機溶媒に分散させたり、溶媒置換を行ってｓｃｌ−ＰＨＡ不溶性の有機溶媒に分散して溶剤分散体として用いることもできる。また、上記の方法を用いて、カプセル構造体を洗浄することもできる。
【００９９】
粉末状のカプセル構造体を取得するためには、粒径の大きい場合には緩やかな遠心分離や吸引ろ過等によりウェットケーキを得たのち、減圧乾燥やジェットミルなどで乾燥を行えばよい。また、粒径の小さな場合にはスプレードライ法などにより乾燥を行えばよい。
【０１００】
粒径の揃ったコアを用いることで、製造されるカプセル構造体の粒径をある程度揃えることが可能であるが、より粒径を揃えるため、カプセル構造体製造後にさらに分級を行ってもよい。
【０１０１】
さらに上記カプセル構造体に目的に応じて添加物を施用したり、各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０１０２】
例えば、電子写真用カプセルトナーでは、流動性、帯電性、現像性、耐久性を向上する目的で種々の外添剤を添加して使用することができる。この際に使用する外添剤としては、通常、トナーに使用されている従来公知のいかなる外添剤でも用いることができる。具体的には、例えば、シリカ、酸化チタン、アルミナ等の微粉末が挙げられる。そして、例えばシリカであれば、ＢＥＴが３０ｍ^２／ｇ以上、特に３００ｍ^２／ｇ以上のものが良好な結果を与える。この場合のシリカ微粉末の量としては、カプセルトナー１００質量部に対して、０．０１〜８質量部、好ましくは０．１〜５質量部程度使用する。この際に使用するシリカ微粉末としては、必要に応じて、疎水化及び帯電性コントロールの目的で、シリコーンワニス、各種変性シリコーンワニス、シリコーンオイル、各種変性シリコーンオイル、シランカップリング剤、官能基を有するシランカップリング剤、その他の有機ケイ素化合物の如き処理剤で処理されたものを使用することが好ましい。これらの処理剤は混合して使用してもよい。
【０１０３】
また、本発明の電子写真用カプセルトナーの現像性及び耐久性を向上させるために、酸化亜鉛、酸化アルミニウム、酸化コバルト、二酸化マンガン、チタン酸ストロンチウム、チタン酸マグネシウムのような無機粉体を添加することも好ましい。
【０１０４】
更に、本発明の電子写真用カプセルトナーに、下記に挙げるような滑剤粉末を添加してもよい。例えば、テフロン、ポリフッ化ビニリデンの如きフッ素樹脂；フッ化カーボンの如きフッ素化合物；ステアリン酸亜鉛の如き脂肪酸金属塩；脂肪酸、脂肪酸エステルの如き脂肪酸誘導体；硫化モリブデン等が挙げられる。
【０１０５】
本発明の電子写真用カプセルトナーは、単独で非磁性一成分現像剤として使用されたり、磁性キャリアとともに磁性二成分現像剤を構成したりする非磁性トナーや、単独で磁性一成分トナーとして使用される磁性トナー等、従来公知の種々のトナーに適用することができる。ここで二成分現像方法に用いる場合のキャリアとしては、従来知られているものをいずれも使用することができる。具体的には、表面酸化または未酸化の鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、クロム、希土類の如き金属及びそれらの合金または酸化物で形成される平均粒径２０〜３００μｍの粒子を、キャリア粒子として使用できる。また、本発明において用いるキャリアは、上記したキャリア粒子の表面が、スチレン系樹脂、アクリル系樹脂、シリコーン系樹脂、フッ素系樹脂、ポリエステル樹脂の如き物質によって付着または被覆されているものであることが好ましい。また、本発明を用いてキャリア粒子をｓｃｌ−ＰＨＡで被覆してもよい。
【０１０６】
なお、本発明のカプセル構造体およびその利用方法およびその製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１０７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。尚、実施例中で使用する「部」はすべて「質量部」を意味する。
＜ＰＨＢ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製＞
ＴＢ６４株を１００ｍｌのＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で、３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した。ベクターはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，５７２頁，１９８９年；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）の後、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解断片と連結した。次に、この連結ＤＮＡ断片を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＴＢ６４株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１０８】
次に、ＴＢ６４株のＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るための表現型スクリーニングを行った。選択培地には２％グルコースを含有するＬＢ培地を用い、寒天平板培地上のコロニーが適当な大きさに生育してきた時点でスダンブラックＢ溶液を噴霧し、ＵＶ光照射により蛍光を発するコロニーを取得した。取得したコロニーからアルカリ法によりプラスミドを回収することでＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１０９】
ここで取得した遺伝子断片を不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ）に組み換え、この組み換えプラスミドをラルストーニャ・ユートロファＴＢ６４ｍ１株（ＰＨＢ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＴＢ６４ｍ１株のＰＨＢ合成能が復帰し、相補性を示した。
【０１１０】
このＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含む断片についてサンガー法により塩基配列を決定した。その結果、配列番号：１で示される塩基配列を有するＰＨＢ合成系酵素遺伝子が該断片中に存在することが確認できた。
【０１１１】
次に、配列番号：２で示されるＰＨＢ合成酵素遺伝子の開始コドン近傍の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計・合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク）、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、 ＰＨＢ合成酵素遺伝子を含む断片を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１１２】
次に、上のようにして得られたＰＣＲ増幅断片について制限酵素ＢａｍＨＩを用いて完全分解し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素ＢａｍＨＩで切断、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，５．７．２頁，１９８９年；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）したものに、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて連結した。
【０１１３】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）を塩化カルシウム法により形質転換し（宝酒造）、得られた組換え体より回収した組換えプラスミドをｐＴＢ６４−ｐｈｂとした。
【０１１４】
ｐＴＢ６４−ｐｈｂで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）を塩化カルシウム法により形質転換し、ｐＴＢ６４−ｐｈｂ組換え株を得た。
【０１１５】
＜ＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製＞
ｐＴＢ６４−ｐｈｂ組換え株をＬＢ培地２００ｍｌに植菌して、３７℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。１２時間培養の後、培養液２００ｍｌをグルコース２％を含むＬＢ培地２００ｍｌに植菌して（計４００ｍｌ）、３７℃、１２５ストローク／分で１２時間振盪培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離によって回収し、常法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
【０１１６】
ｐＴＢ６４−ｐｈｂに対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：４）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＴＢ６４−ｐｈｂをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＢ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１１７】
精製したＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ‐６Ｐ‐１（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０１１８】
＜ＰＨＢ合成酵素の調製＞
得られた発現用菌株をアンピシリン（１００μｇ／Ｌ）を添加した２×ＹＴ培地（ポリペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ＰＨ ７．０）１００ｍｌで３０℃にて一晩前培養した。
これをアンピシリン（１００μｇ／Ｌ）を添加した２×ＹＴ培地（ポリペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ＰＨ ７．０）１０リットルに添加し、３０℃にて３時間培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、３０℃にて３時間培養した。
【０１１９】
回収した培養液を４℃、８０００ｇで１０分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液５００ｍｌに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回４０ｍｌずつ注入し、フレンチプレスによって２２００ｋｇ／ｃｍ^２に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。菌体破砕液を４℃、８０００ｇで１０分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を０．４５μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除き、上清中に目的のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合したＰＨＢ合成酵素が存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【０１２０】
次に、このＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ ＳｅＳＣＬ−ＰＨＡｒｏｓｅ ４Ｂ ： アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。グルタチオン・セファロース４Ｂの７５％スラリー６．６５ｍｌを４℃、５００ｇで５分間遠心処理し、上清を取り除いた後、４℃のＰＢＳ溶液２００ｍｌに再懸濁し、さらに４℃、５００ｇで５分間遠心処理し、上清を取り除いた。さらに４℃のＰＢＳ溶液５ｍｌに再懸濁し、グルタチオン・セファロース４Ｂ の５０％スラリーとした。
【０１２１】
このグルタチオン・セファロース４Ｂの５０％スラリー１０ｍｌに先ほど調整した上清全量を添加し、室温で３０分間緩やかに振とうしてグルタチオン・セファロース４Ｂに上清中の目的とする融合たんぱく質をアフィニティ吸着させた。その後、４℃、５００ｇで５分間遠心処理し、上清を取り除いた後、４℃のＰＢＳ溶液５ｍｌに再懸濁し、再び同様の遠心処理を行い、上清を除いた。このＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素を固定化したグルタチオン・セファロース４Ｂを固定化酵素（１）とした。
【０１２２】
その後、ＰＢＳ溶液への再懸濁と遠心処理を２回繰り返して洗浄した後、最後に５℃のクリベージ緩衝液（Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭ、ＰＨ７）５ｍｌに懸濁した。これに４％ のプレシション・プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ；アマシャム ファルマシア バイオテク社製）のクリベージ緩衝液溶液０．５ｍｌを添加し、５℃で４時間緩やかに振とうした。これを４℃、５００ｇで５分間遠心処理し、上清を回収した。次に上記と同様に調整したグルタチオン・セファロース４Ｂの５０％スラリー１ｍｌを、４℃、５００ｇで５分間遠心処理し、上清を除いた後のグルタチオン・セファロース４Ｂに先ほど回収した上清を添加し、緩やかに攪拌して上清中に残留したプレシション・プロテアーゼをグルタチオン・セファロース４Ｂに吸着させた。次いで４℃、５００ｇで５分間遠心処理して上清を回収した。この上清はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示し、精製されていることを確認した。
【０１２３】
また、含有するＰＨＢ合成酵素活性を以下の方法で測定した。まず、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１ Ｍ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０） に３．０ ｍｇ／ｍｌ溶解した溶液１００μｌを酵素溶液１００μｌに添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートした。これに、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを０．１ Ｍ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０） に３．０ ｍＭ溶解した溶液１００μｌを添加して混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートしたのち、トリクロロ酢酸を０．１ Ｍ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０） に１０ ｍｇ／ｍｌ溶解した溶液３００μｌを添加して反応を停止させた。反応停止したこの溶液を遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）し、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１ Ｍ トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０） に２．０ ｍＭ溶解した溶液５００μｌを上清５００μｌに添加し、３０℃で１０分間インキュベートしたのち、４１２ ｎｍの吸光度を測定した。そして１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）として、酵素活性を計算した。その結果、比活性として７．５Ｕ／ｍｌが得られた。この液を、ライホゲルを添加して限外濾過濃縮し、１０ Ｕ／ｍｌとしたものを精製酵素液（１）とした。
【０１２４】
＜ＰＨＢ合成酵素含有粗酵素液の調製方法＞
ＫＫ０１及びＴＬ２株を、酵母エキス０．５％、ミネラル溶液（下記参照）０．３％を含有したＭ９培地（下記組成）１０リットルで３０℃、２４時間培養し、回収した培養液を４℃、８０００ｇで１０分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液５００ｍｌに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回４０ｍｌずつ注入し、フレンチプレスによって２２００ｋｇ／ｃｍ^２に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。得られた菌体破砕液を４℃、８０００ｇで１０分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を０．４５μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除き、含有するＰＨＢ合成酵素活性を前述の方法で測定した。その結果、比活性としてＫＫ０１株からは１．６Ｕ／ｍｌ、ＴＬ２株からは１．２Ｕ／ｍｌが得られた。この液を、ライホゲルを添加して限外濾過濃縮し、１０ Ｕ／ｍｌとした粗酵素液を、ＫＫ０１株由来のものを粗酵素液（１）、ＴＬ２株由来のものを粗酵素液（２）とした。
（Ｍ９培地）
Ｎａ_２ＨＰＯ_４： ６．２ ｇ
ＫＨ_２ＰＯ_４ ： ３．０ ｇ
ＮａＣｌ ： ０．５ ｇ
ＮＨ_４Ｃｌ ： １．０ ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
（ミネラル溶液）
ニトリロ三酢酸： １．５ ｇ
ＭｇＳＯ_４ ： ３．０ ｇ
ＭｎＳＯ_４ ： ０．５ ｇ
ＮａＣｌ ： １．０ ｇ
ＦｅＳＯ_４ ： ０．１ ｇ
ＣａＣｌ_２ ： ０．１ ｇ
ＣｏＣｌ_２ ： ０．１ ｇ
ＺｎＳＯ_４ ： ０．１ ｇ
ＣｕＳＯ_４ ： ０．１ ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２ ： ０．１ ｇ
Ｈ_３ＢＯ_３ ： ０．１ ｇ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４ ： ０．１ ｇ
ＮｉＣｌ_２ ： ０．１ ｇ
（１リットル中、ｐＨ７．０）
＜実施例１＞
ＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素を固定化したグルタチオン・セファロース４Ｂをコアとした本発明のカプセル構造体を下記の方法で調製した。
【０１２５】
固定化酵素（１）１質量部を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。
上記反応液１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０ ｎｍ励起フィルタ、４２０ ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、グルタチオン・セファロース４Ｂ表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該グルタチオン・セファロース４ＢはＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１２６】
対照として、０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）９０質量部にグルタチオン・セファロース４Ｂ １０質量部を添加し、３０℃で２．５時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、グルタチオン・セファロース４Ｂ表面は全く蛍光を発しなかった。
【０１２７】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径 ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３−ヒドロキシ酪酸ユニットからなるＰＨＢであることが確認された。
【０１２８】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝３４，０００、Ｍｗ＝５４，０００であった。
【０１２９】
＜実施例２＞
精製されたＰＨＢ合成酵素液を用いて、アルミナをコアとした本発明のカプセル構造体を下記の方法で調製した。
精製酵素液（１）１０質量部にアルミナ粒子（粒径０．１２μｍ〜１３５μｍ）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０１３０】
上記固定化酵素を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。
【０１３１】
上記反応液１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０ ｎｍ励起フィルタ、４２０ ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１３２】
対照として、０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４９質量部にアルミナ粒子１質量部を添加し、３０℃で２．５時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０１３３】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径 ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３−ヒドロキシ酪酸ユニットからなるＰＨＢであることが確認された。
【０１３４】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝３１，０００、Ｍｗ＝５０，０００であった。
【０１３５】
＜実施例３＞
ＰＨＢ合成酵素を含有した粗酵素液を用いて、アルミナをコアとした本発明のカプセル構造体を調製した。
【０１３６】
粗酵素液（１）１０質量部にアルミナ粒子（粒径０．１２μｍ〜１３５μｍ）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０１３７】
上記固定化酵素を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。
【０１３８】
上記反応液１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０ ｎｍ励起フィルタ、４２０ ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１３９】
対照として、０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４９質量部にアルミナ粒子１質量部を添加し、３０℃で２．５時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０１４０】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径 ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３−ヒドロキシ酪酸ユニットからなるＰＨＢであることが確認された。
【０１４１】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝２８，０００、Ｍｗ＝４５，０００であった。
【０１４２】
＜実施例４＞
ＰＨＢ合成酵素を含有した粗酵素液を用いて、アルミナをコアとした本発明のカプセル構造体を調製した。
【０１４３】
粗酵素液（２）１０質量部にアルミナ粒子（粒径０．１２μｍ〜１３５μｍ）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０１４４】
上記固定化酵素を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。
【０１４５】
上記反応液１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０ ｎｍ励起フィルタ、４２０ ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＢにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１４６】
対照として、０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４９質量部にアルミナ粒子１質量部を添加し、３０℃で２．５時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０１４７】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径 ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、モノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、３−ヒドロキシ酪酸ユニットからなるＰＨＢであることが確認された。
【０１４８】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝２９，０００、Ｍｗ＝４６，０００であった。
【０１４９】
＜実施例５＞
３リットルの四つ口セパラブルフラスコに、還流冷却管、温度計、窒素導入管、撹拌機を取り付け、このフラスコ中に下記の組成からなる混合物を投入し、高速攪拌装置ＴＫ−ホモミキサーで１０，０００ｒｐｍ、１０分間攪拌して造粒した後、回転数を１，０００ｒｐｍに減速し、窒素ガスによるバブリングを十分に行った。次に、攪拌装置を三日月形状の攪拌羽根に変更し、緩やかな攪拌と共に、８０℃に加熱したオイルバス中で１６時間重合した。

重合反応終了後、反応容器を室温まで冷却した後、分散液を５回のデカンテーションにより洗浄し、濾過、水洗、乾燥して青色の粉体であるコア粒子（１）を得た。得られたコア粒子をコールターカウンターマルチサイザー（コールター社製）を用いて測定したところ、重量平均粒径で６．５μｍであった。
【０１５０】
また、このコア粒子（１）のガラス転移温度（Ｔｇ）を示差走査熱量計（パーキンエルマー社製ＤＳＣ−７）によって測定したところ、８８．５℃であった。
【０１５１】
このコア粒子（１）のカプセル化は次のように行った。精製酵素液（１）１０質量部にコア粒子（１）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素をコア粒子表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
上記固定化酵素を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。
【０１５２】
反応終了後、得られた粒子を濾別、水洗後、４０℃、４時間減圧乾燥して、青色のカプセルトナー（１）を得た。このカプセルトナー（１）の重量平均粒子径を前述と同様に測定したところ、７．１μｍであった。
【０１５３】
また、このカプセルトナー（１）のガラス転移温度（Ｔｇ）を前述と同様に測定したところ、７０．８℃であった。
【０１５４】
このカプセルトナー（１）を光学顕微鏡により観察した結果、円滑な表面を有する粒子の内部に青色のコア粒子の存在が認められた。
【０１５５】
また、カプセルトナー（１）を導電性テープによりアルミ製の試料台に固定し、イオンコーターにより金を薄く蒸着した。走査型電子顕微鏡により高分子微粒子の形状を観察したところ、表面が平滑なカプセル外被によってコア粒子（１）が完全に被覆されていることが確認された。
【０１５６】
さらに、カプセルトナー（１）をエポキシ樹脂で固めた後、ミクロトームにより超薄切片を作製し、四酸化オスニウムにより染色した後、透過型電子顕微鏡により、拡大倍率１万倍〜１０万倍で観察したところ、１つのコアと、外被とからなる２層構造を有するカプセル構造が観察された。そして染色の濃度差から外被の厚さを求めたところ、平均０．３４μｍであった。
【０１５７】
この測定結果を用いてカプセルトナー（１）に占める青色コア粒子（１）の体積割合を求めたところ、７７％（Ｖ／Ｖ）であり、カプセル構造体中に高密度に着色成分であるコア粒子が充填されていることがわかった。
【０１５８】
次に、カプセルトナー（１）１０質量部に対し、解砕処理したＢＥＴ値３６０ｍ^２／ｇの疎水性シリカ０．２部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してトナー組成物（１）とした。
【０１５９】
作製したトナーの画像評価を行うため、上記で得たトナー６部に対して、平均粒径が３５μｍのフェライトコアにシリコーン樹脂をコートしたキャリア９４部をポリ瓶に入れ、ターブラーミキサーで混合撹拌して二成分現像剤（１）を作製した。そして、この現像剤をキヤノン製フルカラーレーザーコピア複写機ＣＬＣ−５００改造機に搭載し、２３℃，６０％ＲＨ環境下、初期及び１万枚複写後の画像についてＳＥＭで観察し、画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行なった。
【０１６０】
画質の評価としては、１画素内でのレーザーのパルス幅変調（ＰＷＭ）による多値記録により、極小スポットの再現性を顕微鏡観察により評価した。その結果、得られる画像は、ハーフトーンのドット再現性が、初期及び１万枚複写後も非常に良好であり、現像器及び感光体の汚染も発生しなかった。又、１万枚複写後の現像剤を走査電子顕微鏡で観察したところ、トナーの破砕やつぶれ等は全くなく、キャリア表面へのトナースペントも観察されなかった。
【０１６１】
また、トナーの耐ブロッキング性の評価を行うために、５０〜７０℃まで１℃おきに設定した温度下に、上記で得たトナー組成物（１）をそれぞれ３日間放置した後の凝集性を観察し、各トナー組成物を前述のキャリアを用いて同様に現像化して画像評価を行った。そして、ハイライト領域のガサツキ具合の変化する点を耐ブロッキング温度とした。その結果、トナー組成物（１）の耐ブロッキング温度は６２℃と高く、耐ブロッキング性に優れることがわかった。
【０１６２】
また、定着性の評価としては、ＣＬＣ−５００と同じ定着器構成を有する外部定着器による定着試験を行った。定着試験の方法としては、幅２ｃｍ、長さ１０ｃｍの短冊を作り、その上の未定着画像を、外部定着器の上部ローラーの温度をモニターしながら短冊の長さ方向にそってローラーを通過させることによって定着させ、得られた定着画像について、短冊の後部にオフセットが見られるか否かで定着性を判断した。その結果、定着開始温度が９７℃と低く、低温定着性に優れることがわかった。
【０１６３】
＜比較例１＞
カプセルトナー（１）の代わりに、コア粒子（１）をカプセル化せずにそのままトナー組成物及び二成分現像剤に使用して実施例５と同様の評価を行った。その結果、耐ブロッキング温度は７４℃と高かったが、定着開始温度が１１５℃と高かった。
【０１６４】
＜実施例６＞
下記組成の混合物を１５０−１８０℃に調整されたニーダーにて溶融混合処理（１０分）した後冷却、固化せしめた。次いで、粗粉砕機により粗粉砕した後、ジェットミル粉砕機にて微粉砕を行い、さらに気流式分級機にて分級し、黒色の粉体であるコア粒子（２）を得た。
【０１６５】

得られたコア粒子の粒径をコールターカウンターマルチサイザー（コールター社製）を用いて測定したところ、重量平均粒径で４．３μｍであった。また、このコア粒子（２）のガラス転移温度（Ｔｇ）を示差走査熱量計（パーキンエルマー社製ＤＳＣ−７）によって測定したところ、４２．６℃であった。
【０１６６】
このコア粒子（２）のカプセル化は次のように行った。粗酵素液（１）１０質量部にコア粒子（２）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素をコア粒子表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０１６７】
上記固定化酵素を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。反応終了後、得られた粒子を濾別、水洗後、４０℃、４時間減圧乾燥して、黒色のカプセルトナー（２）を得た。このカプセルトナー（２）の重量平均粒子径を前述と同様に測定したところ、４．８μｍであった。
【０１６８】
また、このカプセルトナー（２）のガラス転移温度（Ｔｇ）を前述と同様に測定したところ、７０．２℃であった。
【０１６９】
このカプセルトナー（２）を光学顕微鏡により観察した結果、円滑な表面を有する粒子の内部に青色のコア粒子の存在が認められた。
【０１７０】
また、実施例５と同様に走査型電子顕微鏡による観察を行ったところ、表面が平滑なカプセル外被によってコア粒子（２）が完全に被覆されていることが確認された。
【０１７１】
さらに、実施例５と同様に透過型電子顕微鏡による観察を行ったところ、１つのコアと、外被とからなる２層構造を有するカプセル構造が観察された。そして染色の濃度差から外被の厚さを求めたところ、平均０．２６μｍであった。
【０１７２】
この測定結果を用いてカプセルトナー（２）に占める黒色コア粒子（２）の体積割合を求めたところ、７３％（Ｖ／Ｖ）であり、カプセル構造体中に高密度に着色成分であるコア粒子が充填されていることがわかった。
【０１７３】
次に、実施例５と同様に疎水性シリカを外添してトナー組成物（２）とし、さらに同様に二成分現像剤（２）を作製し、画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行なった。その結果、得られる画像は、ハーフトーンのドット再現性が、初期及び１万枚複写後も非常に良好であり、現像器及び感光体の汚染も発生しなかった。又、１万枚複写後の現像剤を走査電子顕微鏡で観察したところ、トナーの破砕やつぶれ等は全くなく、キャリア表面へのトナースペントも観察されなかった。
【０１７４】
また、実施例５と同様にトナーの耐ブロッキング性の評価を行った。その結果、トナー組成物（２）の耐ブロッキング温度は６０℃と高く、耐ブロッキング性に優れることがわかった。
【０１７５】
又、実施例５と同様に定着性の評価を行った。その結果、定着開始温度が９４℃と低く、低温定着性に優れることがわかった。
【０１７６】
＜比較例２＞
カプセルトナー（２）の代わりに、コア粒子（２）をカプセル化せずにそのままトナー組成物及び二成分現像剤に使用して実施例５と同様の評価を行った。その結果、定着開始温度が９２℃と低く、低温定着性に優れていたが、耐ブロッキング温度は５１℃と低く、耐ブロッキング性に劣ることがわかった。
【０１７７】
＜実施例７＞
下記組成の混合物を１５０−１８０℃に調整されたニーダーにて溶融混合処理（１０分）した後冷却、固化せしめた。次いで、粗粉砕機により粗粉砕した後、ジェットミル粉砕機にて微粉砕を行い、さらに気流式分級機にて分級し、黄色の粉体であるコア粒子（３）を得た。
【０１７８】

得られたコア粒子の粒径をコールターカウンターマルチサイザー（コールター社製）を用いて測定したところ、重量平均粒径で７．５μｍであった。
また、このコア粒子（３）のガラス転移温度（Ｔｇ）を示差走査熱量計（パーキンエルマー社製ＤＳＣ−７）によって測定したところ、８８．５℃であった。
【０１７９】
このコア粒子（３）のカプセル化は次のように行った。粗酵素液（２）１０質量部にコア粒子（１）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＢ合成酵素をコア粒子表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
上記固定化酵素を０．１ Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。
【０１８０】
反応終了後、得られた粒子を濾別、水洗後、４０℃、４時間減圧乾燥して、黄色のカプセルトナー（３）を得た。このカプセルトナー（３）の重量平均粒子径を前述と同様に測定したところ、８．４μｍであった。また、このカプセルトナー（３）のガラス転移温度（Ｔｇ）を前述と同様に測定したところ、７０．８℃であった。
【０１８１】
このカプセルトナー（３）を光学顕微鏡により観察した結果、円滑な表面を有する粒子の内部に青色のコア粒子の存在が認められた。
【０１８２】
また、実施例５と同様に走査型電子顕微鏡による観察を行ったところ、表面が平滑なカプセル外被によってコア粒子（３）が完全に被覆されていることが確認された。
【０１８３】
さらに、実施例５と同様に透過型電子顕微鏡による観察を行ったところ、１つのコアと、外被とからなる２層構造を有するカプセル構造が観察された。そして染色の濃度差から外被の厚さを求めたところ、平均０．４７μｍであった。
【０１８４】
この測定結果を用いてカプセルトナー（２）に占める黒色コア粒子（２）の体積割合を求めたところ、７１％（Ｖ／Ｖ）であり、カプセル構造体中に高密度に着色成分であるコア粒子が充填されていることがわかった。
【０１８５】
次に、実施例５と同様に疎水性シリカを外添してトナー組成物（３）とし、さらに同様に二成分現像剤（３）を作製し、画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行なった。その結果、得られる画像は、ハーフトーンのドット再現性が、初期及び１万枚複写後も非常に良好であり、現像器及び感光体の汚染も発生しなかった。又、１万枚複写後の現像剤を走査電子顕微鏡で観察したところ、トナーの破砕やつぶれ等は全くなく、キャリア表面へのトナースペントも観察されなかった。
【０１８６】
また、実施例５と同様にトナーの耐ブロッキング性の評価を行った。その結果、トナー組成物（３）の耐ブロッキング温度は６２℃と高く、耐ブロッキング性に優れることがわかった。
【０１８７】
又、実施例５と同様に定着性の評価を行った。その結果、定着開始温度が９８℃と低く、低温定着性に優れることがわかった。
【０１８８】
＜比較例３＞
カプセルトナー（３）の代わりに、コア粒子（３）をカプセル化せずにそのままトナー組成物及び二成分現像剤に使用して実施例５と同様の評価を行った。その結果、耐ブロッキング温度は７７℃と高かったが、定着開始温度が１１９℃と高かった。
【０１８９】
【発明の効果】
本発明によれば、粒状体の材質の制約が少なく、粒状体が高密度に内包されたｓｃｌ−ＰＨＡを外被とする粒状構造体を提供することが可能となる。また、本発明によれば、上記の優れた粒状構造体を、界面活性剤、重合反応剤等によって汚染されない、かつ有機溶媒を使用しない簡便な製造方法を提供することが可能となる。また、本発明の粒状構造体を利用して、低温定着性と耐ブロッキング性を発揮しうる電子写真用トナーを提供できる。さらに、本発明の粒状構造体の製造方法を利用した、上記電子写真用トナーの製造方法を提供できる。
【０１９０】
【配列表】

Claims (12)

1. 粒状体をコアとし、該粒状体表面の少なくとも一部に対して、ポリヒドロキシアルカノエートによる被覆がなされている構造を有する粒状構造体であって、
   前記粒状体表面の少なくとも一部に対する被覆構造に用いるポリヒドロキシアルカノエートは、
   微生物由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を利用して、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ合成可能な短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートであり、
   該短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニット及び３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットより選択される少なくとも一つのモノマーユニットを有する短鎖長ポリヒドロキシアルカノエートである
   ことを特徴とする粒状構造体。
2. 前記粒状体が着色剤を少なくとも含有している
   ことを特徴とする請求項１に記載の粒状構造体。
3. 前記着色剤が顔料を少なくとも含有している
   ことを特徴とする請求項２に記載の粒状構造体。
4. 前記粒状体が顔料粒子である
   ことを特徴とする請求項１に記載の粒状構造体。
5. 粒状体をコアとし、該粒状体表面の少なくとも一部に対して、３−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニット及び３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットより選択される少なくとも一つのモノマーユニットを有するポリヒドロキシアルカノエートによる被覆がなされている構造を有する粒状構造体を製造する方法であって、
   前記粒状体を水性媒体に分散する工程と、
   水性媒体に分散された粒状体の表面にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を固定化する工程と、
   該固定化酵素により、３−ヒドロキシプロピオニル補酵素Ａ、３−ヒドロキシブチリル補酵素Ａ及び３−ヒドロキシバレリル補酵素Ａより選択される少なくとも一つを重合させて前記ポリヒドロキシアルカノエートをｉｎ−ｖｉｔｒｏ合成させることにより、該粒状体の少なくとも一部を該ポリヒドロキシアルカノエートで被覆する工程とを有する
   ことを特徴とする粒状構造体の製造方法。
6. 前記粒状体が着色剤を少なくとも含有している
   ことを特徴とする請求項５に記載の粒状構造体の製造方法。
7. 前記着色剤が顔料を少なくとも含有している
   ことを特徴とする請求項６に記載の粒状構造体の製造方法。
8. 前記粒状体が顔料である
   ことを特徴とする請求項５に記載の粒状構造体の製造方法。
9. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、
   ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物、または該生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産されるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である
   ことを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の粒状構造体の製造方法。
10. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物は、
    バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＫＫ０１、ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏＳＣＬ−ＰＨＡ ＴＢ６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−６９３３）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．ＴＬ２、ＦＥＲＭ ＢＰ−６９１３）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である
    ことを特徴とする請求項９に記載の粒状構造体の製造方法。
11. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒状構造体を使用する方法であって、
    電子写真用現像剤の調製に利用される、トナー粒子成分として使用する
    ことを特徴とする使用方法。
12. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒状構造体を使用する方法であって、
    電子写真用一成分現像剤として利用される、トナー粒子として使用する
    ことを特徴とする使用方法。