KR20020083921A

KR20020083921A - 입상 구조체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20020083921A
Application number: KR1020020022613A
Authority: KR
Inventors: 코자키신야; 야노테츠야; 노모토츠요시; 혼마츠토무
Original assignee: 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2002-11-04
Also published as: JP2002327046A; EP1253476A2; EP1253476A3; KR100512813B1; US20030096115A1; JP3625433B2; DE60235735D1; EP1253476B1

Abstract

본 발명에 의하면, 환경이나 생물에 대한 부하가 적고, 각종 기능성을 지닌 PHA를 이용해서, 코어의 재질의 제약이 적고, 코어가 고밀도로 내포된 캡슐구조체가 제공된다. 본 발명의 입상구조체는, 3-하이드록시프로피온산유닛, 3-하이드록시-n-부티르산유닛 및 3-하이드록시-n-발레르산유닛의 선택된 적어도 1개의 모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트에 의해서 적어도 일부가 피복되어 있는 입상체를 지닌다.

Description

입상 구조체 및 그 제조방법{GRANULAR STRUCTURE AND PROCESS OF PRODUCTION THEREOF}

본 발명은 입상체(이하, "코어"라 칭함)를 내포할 수 있는, 3-하이드록시프로피온산, 3-하이드록시-n-부티르산 및 3-하이드록시-n-발레르산으로부터 선택된 모노머유닛의 단독중합체 또는 공중합체를 외장으로 하는 입상 구조체(이하, "캡슐구조체"라 칭함)에 관한 것이다. 이 입상 구조체는, 도료, 잉크, 코팅제, 접착제, 소화제, 화장품, 토건재료, 농약, 의약, 진단약, 비료 등의 각종 제제 등의 용도로서 폭넓게 이용가능하다. 또, 본 발명은 계면활성제나 유기용매를 이용하지 않고 상기 입상 구조체를 작성하는 제조방법에 관한 것이다. 또한, 이 입상구조체의, 특히 전자사진용 토너에의 이용에 관한 것이다.

마이크로캡슐은, 도료, 잉크, 코팅제, 접착제, 소화제, 화장품, 토건재료, 농약, 의약, 진단약, 비료 등, 다양한 용도에의 이용이 검토되고 있다. 예를 들면, 일본국 공개특허 평 5-85873호 공보에는, 서방성 비료가, 일본국 공개특허 평 6-295059호 공보에는 감열기록재료가, 일본국 공개특허 평 9-208494호 공보에는 서방성 의약제에 관한 마이크로캡슐제법이 개시되어 있다.

또, 일본국 공개특허 평 8-286416호 공보에는, 대전의 안정화를 도모한 캡슐토너가, 일본국 공개특허 평 9-292735호 공보에는 감열캡슐토너가, 일본국 공개특허 평 5-119531호 공보, 일본국 공개특허 평 5-249725호 공보, 일본국 공개특허 평 6-332225호 공보, 일본국 공개특허 평 9-43896호 공보, 일본국 공개특허 평 10-78676호 공보, 일본국 공개특허 평 11-7163호 공보, 일본국 공개특허 제 2000-66444호 공보, 일본국 공개특허 제 2000-112174호 공보, 일본국 공개특허 제 2000-330321호 공보 등에는 캡슐토너가 개시되어 있다.

근년, 에너지절약의 관점에서, 전자사진에 있어서 이용되는 토너의 성질로서, 저온정착성이 요구되고 있다. 토너의 저온정착성을 달성하기 위해서는, 토너를 구성하고 있는 결착수지의 유리전이온도를 낮추는 것이 직접적으로 효과가 있고, 과거에 다수의 검토가 되어 왔다. 그러나, 토너의 유리전이온도를 지나치게 내리면, 토너입자끼리의 블로킹을 일으키거나, 대전불량이 발생하기 쉬워지는 등의 불편이 생겨 버려, 토너의 특성을 손상시키게 된다.

상기 문제를 해소하기 위하여, 낮은 유리전이온도를 지닌 수지로 이루어진 코어(심재료)의 표면을, 유리전이온도가 높은 수지로 이루어진 셸(즉, 외피)에 의해 캡슐화한 코어-셸구조를 지닌 캡슐토너가 다수 제안되어 있다. 이것은 현탁중합법이나 계면중합법에 의해 캡슐화되어 있고, 예를 들면, 일본국 공개특허 평 5-113687호 공보에서는, 착색제를 함유하는 코어바인더를, 계면중합법에 의해 폴리에테르-우레아폴리머의 외피로 캡슐화함으로써, 토너입자끼리의 블로킹(응집)을 방지하는 동시에, 토너상의 정착성 등을 개량하고 있다. 한편, 일본국 공개특허 평11-194531호 공보에서는, 높은 유리전이온도의 수지로 이루어진 코어의 표면을, 낮은 유리전이온도의 수지로 이루어진 외피에 의해 캡슐화한 캡슐토너가 제안되어, 저온정착성을 실현하고 있다.

상기 마이크로캡슐은, 계면중합법, 현탁중합법, 유화중합법, in-situ중합법, 코어세르베이션(상분리)법, 액중 건조법 등의 화학적 방법에 의해서 제조가능하다. 계면중합법에서는, 2종의 모노머 혹은 반응물을 분산상과 연속상으로 개별로 용해시켜 놓고, 해당 두 상의 계면에 있어서 모노머를 중합시켜서 외피벽을 형성시키고 있다. 현탁중합법에서는, 수성 매체중에서 심물질을 모노머중에 분산시키고, 이어서 계의 온도를 상승시킴으로써 외피벽을 형성시키고 있다. 유화중합법에서는, 유화제를 용해시킨 수성 매체중에 수불용성의 모노머를 첨가해서 교반하고, 유화제의 마이셀(micelles)에 모노머를 도입시키고, 마이셀내에 모노머를 중합해서 외피벽을 형성시키고 있다. in-situ중합법에서는, 액체 또는 기체의 모노머와 촉매, 혹은 반응성의 물질 2종을 연속상 혹은 핵입자쪽으로부터 공급해서 반응을 일으켜 외피벽을 형성시키고 있다. 코아세르베이션(상분리)법에서는, 심물질입자를 분산시키고 있는 고분자용액을 고분자농도가 높은 농후상과 고분자농도가 낮은 희박상으로 분리시켜, 외피벽을 형성시키고 있다. 액중건조법에서는, 심물질을 외피벽물질의 용액에 분산시킨 액을 조제하고, 이 분산액의 연속상이 혼화되지 않은 액중에 분산액을 도입해서 복합에멀젼을 형성하고, 외피벽물질을 용해시키고 있는 매질을 서서히 제거함으로써 외피벽을 형성시키고 있다.

그러나, 상기 종래의 방법에 의해서 제조된 마이크로캡슐에서는, 대량으로사용하는 현탁안정제나 유화제 등의 계면활성제나 중합반응제 등이 캡슐내나 캡슐외피에 잔류하는 것이, 캡슐의 사용목적에 따라서는 문제로 될 경우가 있다. 예를 들면, 캡슐토너내의 잔류물은 해당 토너의 전기특성이나 유동성에 영향을 미치는 경우가 있는 일이 문제로 되고 있다. 또, 의료, 화장품, 비료, 농약 등, 인체나 환경중에 사용할 경우에는, 용도가 매우 한정되거나, 또, 사용가능한 계면활성제나 중합반응제가 엄격히 제한되는 것으로 된다.

또, 상기 종래의 방법에 의한 마이크로캡슐의 제조방법에서는, 마이크로캡슐중에 코어재료와 동시에 분산매를 내포해버리므로, 마이크로캡슐 전체적중에 차지하는 코어의 체적밀도가 낮다고 하는 문제가 있다. 이것은 예를 들면, 컬라복사기의 토너 등이 고휘도, 고해상도의 화질이 요구되는 중에 문제로 되고 있다.

이러한 문제를 해소하기 위해, 여기서 마이크로캡슐의 외피를 구성하는 폴리머를 코어에 흡착시키고, 그것에 의해서 직접 코어표면을 피복하는 방법이 검토되고 있다. 예를 들면, "Solsperse"(상품명, ICI사 제품)와 같이, 안료와 폴리머의 양자에 결합가능한 분산제를 사용하여, 해당 분산제를 개재해서 안료표면에 폴리머를 피복하는 방법("색재핸드북" p428)이나, 표면처리에 의해서 무기물입자의 잉크성을 약하게 하거나, 혹은 폴리머에 극성기를 도입함으로써 폴리머를 무기입자에 흡착시켜, 피복하는 방법이 검토되고 있다. 또, 일본국 공개특허 평 8-286416호 공보 등에서는, 캡슐을 형성하는 모노머와 마찬가지 성분을 코어에 함유시킴으로써 양자의 친화성을 높여, 코어표면에 캡슐외장을 형성하는 등의 방법이 채용되고 있다. 그러나, 이들 방법에서는, 코어로서 사용가능한 재료가 한정되고, 또, 조작이 번잡해지는 등의 문제가 있다.

한편, 상기 종래의 마이크로캡슐의 제조방법에서는, 모노머의 중합이나 폴리머의 용해 등을 위해 유기용매를 이용하는 경우가 많고, 이것은, 유기용매에 가용인 코어의 사용을 방지하고, 또, 대량생산을 위해 대량으로 유기용매를 사용할 경우, 설비나 인체, 환경에의 부하가 증대되는 경향이 있다.

근년, 지구온난화방지의 관점에서, 대기중의 이산화탄소농도의 원인으로 되는 석유자원의 사용량을 삭감하고자 하는 노력이 활발해지고 있고, 그것과 마찬가지 이유에서, 대기중의 이산화탄소를 고정화함으로써 얻어지는 당질을 원료로 한 플라스틱재료의 생산이 주목되고 있다.

비석유계 플라스틱재료로서는, 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 등의 미생물에 당질을 부여함으로써 합성되어, 세포질내에 과립의 형태로 축적되는 폴리-3-하이드록시-n-부티르산(이하, "PBH"라 칭할 경우도 있음)이나 3-하이드록시-n-부티르산과 3-하이드록시-n-발레르산(이하, "PHB/V"라 칭할 경우도 있음)의 공중합체 등의 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 칭할 경우가 있음)를 들 수 있다. 이들 재료는, 종래의 석유유래의 플라스틱과 마찬가지로, 용융가공 등에 의해 각종 제품에 이용가능하다. 게다가, 이들 플라스틱재료는, 미생물 등, 각종 생물에 의해서 분해가능한 생분해성을 지니고 있어, 환경중이나 생체내에서의 잔류성이 극히 낮다고 하는 이점을 지닌다. 또한, 생체적합성이 우수하다는 것을 이용한 의료재료, 또는 광학활성을 지닌 아이소택틱 폴리머인 것을 이용한 광학재료 등, 기능성 재료로서도 매우 우수한 면을 지니고 있다.

이상과 같은 기능성을 지닌 PHA를, 석유계 플라스틱재료를 대체해서 활용하는 것은, 환경이나 생물에 대한 부하의 경감에 공헌하고, 또, 재료기술의 진보로 이어지는 것으로 확신된다.

본 발명의 목적은, 환경이나 생물에 대한 부하가 적고, 보다 높은 기능성을 지닌 PHA를 이용해서 코어재질의 제약이 적고, 코어가 고밀도로 내포된 캡슐구조체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 마이크로캡슐의 오염원으로 되고 있던 계면활성제, 중합금지제 등의 첨가물을 사용하지 않고, 또는 유기용매를 사용하지 않는 캡슐구조체의 간편한 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은, 상기 캡슐구조체를 이용한 형태로서, 저온정착성과 내블로킹성 등을 발휘할 수 있는 전자사진용 캡슐토너 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 예의 검토를 행한 결과, 3-하이드록시프로피온산유닛, 3-하이드록시-n-부티르산유닛 및 3-하이드록시-n-발레르산유닛으로부터 선택된 적어도 1개의 모노머유닛을 지닌 PHA(이하, "scl-PHA"(단사슬길이(short chain length) PHA)라 칭함)를 합성가능한 효소를 코어(심재료)의 표면에 고정화하고, 여기에 3-하이드록시프로필오닐보조효소 A, 3-하이드록시부티릴보조효소 A 및 3-하이드록시발레릴보조효소 A로부터 선택된 적어도 1종을 가해서 반응시킴으로써, 코어표면에 scl-PHA를 합성시켜, 코어와 scl-PHA의 외피를 지닌구조체를 얻는 것이 가능하다는 것을 발견하고, 이러한 지견에 의거해서 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 캡슐구조체는, scl-PHA합성효소에 의해서 합성된 scl-PHA외피로 코어의 적어도 일부가 피복되어 있다.

본 발명의 외피로서 scl-PHA를 지닌 캡슐구조체를 제조하는 방법은, 코어에 scl-PHA합성효소를 고정화하고; 이 효소의 작용에 의해, 3-하이드록시프로필오닐보조효소 A, 3-하이드록시부티릴보조효소 A 및 3-하이드록시발레릴보조효소 A로부터 선택된 적어도 1종을 중합시킴으로써, 코어의 적어도 일부를 scl-PHA로 피복하는 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명의 저온정착성과 내블로킹성을 지닌 전자사진용 토너는, 유리전이온도가 저온정착성 및 내블로킹성에 적합한 scl-PHA로부터 형성된 캡슐구조체외피을 지닌 상기 캡슐구조체를 함유해서 이루어진다.

상기 전자사진용 토너의 제조방법도 제공된다.

또한, 본 발명의 입상 구조체는, 해당 입자의 표면의 적어도 일부에 폴리하이드록시알카노에이트를 피복한 구성을 지닐 필요가 있으나, 목적으로 하는 특성을 얻을 수 있다면, 폴리하이드록시알카노에이트는, 해당 입자의 전체 표면이 피복되어 있을 필요는 없다. 전체 표면이 피복된 상태에서는, 앞서 설명한 바와 같이, 입상체를 코어로 하고, 폴리하이드록시알카노에이트의 피복층을 외피로 한 마이크로캡슐구조의 입상 구조체를 얻는 것이 가능하다.

본 발명에 의하면, 입상체의 재질의 제약이 없고, 입상체가 고밀도로 내포된scl-PHA를 외피로 하는 입상 구조체를 제공하는 것이 가능해진다. 또, 본 발명에 의하면, 상기의 우수한 입상 구조체를, 계면활성제, 중합반응제 등에 의해서 오염되지 않고, 또, 유기용매를 사용하지 않는 간편한 제조방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 입상 구조체를 이용해서, 저온정착성과 내블로킹성을 발휘할 수 있는 전자사진용 토너를 제공할 수 있다. 나아가서는, 본 발명의 입상 구조체의 제조방법을 이용한, 상기 전자사진용 토너의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 및 기타 목적과, 효과, 특징 및 이점 등은, 이하의 실시예의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은, scl-PHA생산균으로부터 추출한 scl-PHA합성효소에, (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종을 공급함으로써 scl-PHA를 합성하는, scl-PHA의in-vitro(무세포계)합성을 이용한 것이다.

scl-PHA는, scl-PHA생산균의 체내에서 다음과 같은 복수의 효소반응계에 의해 합성되고 있다. scl-PHA의 생합성은, 각종 탄소원으로부터, 생체내의 다양한 대사경로를 거쳐 생산된 (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종을 기질로 한, 효소에 의한 중합반응에 의해 행해진다. 이 중합반응을 촉매하는 효소를 본 발명에서는 scl-PHA합성효소라 부른다. 그중에서, 예를 들면, PHB를 합성가능한 효소라면, 통상, PHB합성효소(PHB폴리메라제 혹은 PHB신타제라고도 칭함)라 불리고 있다.

또, "CoA"란, 보조효소 A의 약칭이며, 하기 화학식 1:

로 표시된 화학구조를 지닌다.

본 발명에서는, 이 효소반응계의 최후의 단계를 이용하고 있고, (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종을 scl-PHA합성효소에 의해서 중합함으로써 scl-PHA를 합성하고 있다.

scl-PHA를in vitro에서 합성한 예는, 이제까지 여러 개가 알려져 있고, 예를 들면, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 92, 6279-6283(1995)에서는, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)유래의 PHB합성효소에 3-하이드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써 PHB를 합성하고 있다. 또, Int. J. Biol. Macromol., 25, 55-60(1999)에서는, 알칼리게네스 유트로퍼스유래의 PHB합성효소에, 3-하이드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써 PHB를 합성하고 있다. 또, 이 보고에서는, 라세미체의 3-하이드록시부티릴 CoA를 작용시킨 바, 효소의 입체선택성에 의해서, R체의 3-하이드록시-n-부티르산유닛만으로 이루어진 PHB가 합성된 것으로 하고 있다. Macromol. Rapid Commun., 21, 77-84(2000)에 있어서도, 알칼리게네스 유트로퍼스유래의 PHB합성효소를 이용한 세포밖에서의 PHB합성이 보고되어 있다. 또, FEMS Microbiol. Lett., 168, 319-324(1998)에서는, 크로마티움 비노섬(Chromatium vinosum)유래의 PHB합성효소에 3-하이드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써 PHB를 합성하고 있다.

이와 같이in vitro에서의 scl-PHA합성예는 몇가지 있으나, 본 발명과 같이, 캡슐구조체로서 이용한 보고는 없다.

scl-PHA합성효소를 생산하는 미생물로서는, 예를 들면, PHB나 PHB/V생산균으로서 알려져 있는 미생물을 이용하는 것이 가능하다. 이와 같은 미생물로서, 아에로모나스속(Aeromonas sp.), 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.), 크로마티움속(Chromatium sp.), 코마모나스속(Comamonas sp.), 메틸로막테리움속(Methylobacterium sp.), 파라코커스속(Paracoccus sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) 등이 알려져 있다. 또, 이것에 유용한 균으로서는, 본 발명자들에 의해 분리된 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KK01, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64 및 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) TL2 등을 들 수 있다. 또, KK01균주는 기탁번호 FERM BP-4235로서, TB64균주는 FERM BP-6933으로서, 또, TL2균주는 FERM BP-6913으로서, 일본국 경제산업성 생명공학공업기술연구소 특허미생물기탄센터에 각각 기탁되어 있다.

상기 야생의 균주이외에, scl-PHA합성효소를 생산하기 위해, 형질전환체를 이용하는 것도 가능하다. 클로닝, 발현벡터의 제작 및 형질전환체의 제작은, 종래 방법에 따라 행할 수 있다. scl-PHA합성효소유전자의 클로닝에 관해서는, 이제까지 알칼리게네스 유트로퍼스의 PHB신타제유전자(phbC)에 의해 행해져 있다. 또, 본 발명자들은, 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KK01균주(FERM BP-4235)의 phbC에 대해서 클로닝을 완료하고 있고, 또, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64균주(FERM BP-6933)의 phbC에 대해서 클로닝을 완료하고 있다. 형질전환체는 이 phbC를 함유하는 벡터를 숙주에 도입함으로써 제작할 수 있다. phbC를 함유하는 벡터는, 예를 들면, 플라스미드벡터, 페이지벡터 등에 phbC를 도입함으로써 얻어질 수 있다. 숙주로서는, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli)이 빈번하게 이용된다.

이상 열거한 바와 같은 scl-PHA생산균은, 단독으로 혹은 필요에 따라서 2종이상 조합해서 사용해도 된다.

본 발명에 이용되는 이들 미생물을 배양하는 배지로서는, 각종 미생물의 증식에 필요한 성분, 예를 들면, 탄소원, 질소원, 인원, 기타 무기염 및 필요에 따라서 기타 유기성분 등을 함유하는 배지를 적절하게 선택해서 이용한다. 예를 들면, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치는 것이 아닌 한, 일반적인 천연배지(육즙배지, 효모엑스 등)나, 영양원을 첨가한 합성배지 등, 어느 종류의 배지도 이용할 수 있다.

미생물의 배양은, 액체배양, 고체배양 등 해당 미생물이 증식하여, scl-PHA합성효소를 생산하는 배양방법이라면 어느 배양방법도 이용하는 것이 가능하다. 또, 배치(bactch)배양, 패드배치배양, 반연속배양, 연속배양 등의 종류도 문제없다. 액체배치배양의 형태로서는, 진탕플라스크에 의해서 진탕시켜서 효소를 공급하는 방법, 쟈(jar)발효기에 의한 교반통기방식의 효소공급방법이 있다. 또, 이들 공정을 복수단계 접속한 다단방식을 채용해도 된다.

배양온도로서는, 사용하는 균체가 양호하게 증식가능한 온도라면 되고, 예를 들면, 14 내지 40℃, 바람직하게는, 20 내지 37℃정도가 적당하다.

또, scl-PHA합성효소유전자를 도입한 형질전환체를 이용한 경우, 대장균 등의 세포를 숙주로 해서 얻어진 형질전환체라면, 배지 및 배양방법은 상기와 마찬가지이어도 되나, 발현벡터 등에 의해 내성을 부여한 균주에 관해서는, 필요에 따라서 배지에 카나마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다. 또, 발현벡터에 있어서 유도성의 프로모터를 이용하고 있는 경우에는, 배양시에 해당 프로모터에 대응하는 유도물질을 배지에 첨가해서 발현을 촉지시켜도 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈라토피라노사이드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌-아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

배양한 scl-PHA생산균으로부터의 scl-PHA합성효소의 추출은, 배양액을 프렌치프레스, 초음파분쇄, 동결융해 등에 의해서 파쇄하는 방법이나, 황산암모늄 등의 염의 첨가에 의해 단백질합성을 침전, 회수하는 염석 등의 방법에 의해 행해도 된다. 또, 원심분리에 의해서 배양액으로부터 균체를 분리회수한 수 추출해도 된다.

scl-PHA합성효소는, 정제를 행하는 것이 바람직하나, 정제를 행하지 않은 미처리의 효소의 상태로 이용해도 된다. 단, 미처리의 효소를 이용한 경우, 코어표면에 scl-PHA합성효소이외의 단백질 등의 균체성분이 고정화되므로, 코어표면에 고정화되는 scl-PHA합성효소의 밀도가 낮아지는 점, 또 균체성분중의 프로테아제 등에 의해서 scl-PHA합성효소활성이 저하하는 점 등을 고려할 필요가 있다.

scl-PHA합성효소의 분리 및 정제방법으로서는, 예를 들면, 누클레아제 등의 분해효소를 이용해서 핵산성분을 저분자화한 후, 이온크로마토그래피, 흡착크로마토그래피, 어피니티(affinity)크로마토그래피, 등전점분획법, 밀도구배원심법, 전기영동법, 분자체법, 2상분리법 등의 방법을 단독으로 혹은 조합해서 행해도 된다.

특히, 유전자재조합단백질은, N말단이나 C말단에 히스티딘잔기 등의 태그(tag)를 지닌 융합단백질의 형태로 발현시켜, 이 태그를 개재해서 친화성 수지에 결합시킴으로써, 보다 간편하게 정제하는 것이 가능하다. 융합단백질로부터 목적의 단백질을 분리하기 위해서는, 트롬빈, 혈액응고인자 Xa 등의 프로테아제에 의해 절단하거나; 혹은, 발현벡터로서 pTYB1(New Englan Biolab사 제품)과 같은 인테인을 함유할 경우에는, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 등으로 환원조건하에 절단한다. 어피니티크로마토그래피에 의해 정제를 가능하게 하는 융합단백질에는, 히스티딘태그외에 글루타티온 S-트란스퍼라제(GST), 키틴결합도메인(CBD), 말토즈결합단백질(MBP), 티오레독신(TRX) 등도 공지이다. GST융합단백질은, GST친화성레진에 의해 정제하는 것이 가능하다. 또, scl-PHA합성효소에는 필요에 따라, 금속염, 글리세린, 디티오트레이톨, EDTA, 소혈청알부민(BSA) 등의 안정화제 혹은 활성화제 등을 적절하게 첨가해서 이용하는 것이 가능하다.

scl-PHA합성효소의 활성측정은, 종래 공지의 각종 방법을 이용하는 것이 가능하나, 예를 들면, (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종이 scl-PHA합성효소의 촉매작용에 의해 중합해서 scl-PHA로 되는 과정에서 방출되는 CoA를, 5,5'-디티오-비스-(2-니트로벤조산)으로 발현시키서 측정하는 방법을 이용하는 것이 가능하다.

scl-PHA합성효소를 코어에 고정화시키는 방법에 관해서는, 코어재료의 종류나 구조, 제작한 캡슐구조체의 사용형태 등에 따라서 어떠한 방법을 이용해도 되나, 특히 이온흡착이나 소수성 흡착을 이용한 고정화 방법이 간편하다.

scl-PHA합성효소 등의 효소단백질은, 아미노산이 다수 결합한 폴리펩티드이며, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴산, 글루다민산 등의 유리의 이온성 기를 지닌 아미노산에 의해서 이온흡착체로서의 성질을 나타내고, 또, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린 등의 유리의 소수성 기를 지닌 아미노산에 의해서, 또, 유기고분자라고 하는 점에서 소수성 흡착체로서의 성질을 지니고 있다. 따라서, 정도의 차는 있으나, 이온성이나 소수성 혹은 이온성, 소수성의 양쪽의 성질을 지닌 고체에 흡착하는 것이 가능하다.

주로 이온흡착에 의해서 scl-PHA합성효소를 고정화하는 코어재료로서는, 이온성 작용기를 표면에 발현하고 있는 것이면 되고, 예를 들면, 카올리나이트, 벤토나이트, 탤크, 운모 등의 점토광물, 알루미나, 이산화티탄 등의 금속산화물; 실리카겔, 하이드록시아파타이트, 인산칼슘 등의 불활성 무기염; 이들 점토광물이나 금속산화물, 또는 불용성 무기염을 주요성분으로 하고 있는 무기안료; 이온교환수지, 키토산, 폴리아미노폴리스티렌 등의 이온성 작용기를 지닌 유기폴리머를 들 수 있다.

또, 주로 소수성 흡착에 의해서 scl-PHA합성효소를 고정화하는 코어재료로서는, 코어표면이 비극성이면 되고, 예를 들면, 스티렌계 폴리머, 아크릴계 폴리머, 메타크릴계 폴리머, 비닐에스테르류, 비닐계 폴리머 등의 이온성 작용기를 표면에 발현하고 있지 않거나, 혹은 소수성 작용기를 표면에 발현하고 있는 많은 유기폴리머; 방향고리를 복수개 지닌 아조안료나 축합다고리의 프탈로시안계 안료, 안트라퀴논계 안료 등의 유기안료; 카본블랙 등을 들 수 있다.

이온흡착 혹은 소수성 흡착에 의한 scl-PHA합성효소의 고정화는, 효소와 코어를 소정의 용액중에서 함께 혼합함으로써 달성된다. 이 때, 코어의 표면에 균등하게 scl-PHA합성효소가 흡착되도록 반응용기를 적당한 강도로 진탕시키는 것이 바람직하다.

또, 용액의 pH나 염농도, 온도 등의 조건을 적당하게 선택함으로써, 코어와 scl-PHA합성효소의 이온흡착성, 소수성 흡착성을 어느 정도 제어하는 것이 가능하다. 그 때문에, scl-PHA합성효소의 활성이 허용되는 범위내에서 용액의 조정을 행하는 것이 바람직하다.

또한, 미리 전기영동이나 젖음각 등을 측정해서, 코어나 scl-PHA합성효소의하전상태나 소수성을 조사함으로써, 흡착에 적합한 용액조건을 설정하는 것이 가능하다.

또, 직접 코어상의 scl-PHA합성효소의 흡착량을 측정해서 용액조건을 결정해도 된다. 흡착량의 측정은, 예를 들면, 코어함유 용액에 기지량의 scl-PHA합성효소를 첨가하고, 흡착반응을 행한 후에 용액중의 scl-PHA합성효소의 탈착농도를 측정하고, 그 농도차를 취하는 방법을 이용해도 된다.

이온흡착이나 소수성 흡착에 의해서 scl-PHA합성효소를 고정화하기 어려운 코어의 경우에는, 조작의 용이성이나 효소의 활성손실가능성을 고려하면, 공유결합에 의해 코어에 효소를 결합시켜도 된다. 공유결합방법으로서는, 예를 들면, 방향족 아미노기를 지닌 코어를 디아조화하고, 이것에 효소를 디아조커플링하는 방법; 카르복실기, 아미노기를 지닌 코어와 효소사이에 펩티드결합을 형성시키는 방법; 할로겐기를 지닌 코어재료와 효소의 아미노기간에 알킬화하는 방법; 브롬화시안으로 활성화한 다당류 코어와 효소의 아미노기를 반응시키는 방법; 코어의 아미노기와 효소의 아미노기를 가교시키는 방법; 알데하이드기 또는 케톤기를 지닌 화합물과 이소시아니드화합물의 존재하, 카르복실기 또는 아미노기를 지닌 코어와 효소를 반응시키는 방법; 디술피드기를 지닌 코어와 효소의 티올기와의 사이에서 교환반응시키는 방법 등이 있다.

또, scl-PHA합성효소를 리간드가 도입된 코어에 어피니티흡착에 의해서 고정화해도 된다. 이 경우, 리간드로서 scl-PHA합성효소의 효소활성을 유지하면서 어피니티흡착을 행하는 것이면, 어느 것도 선택할 수 있다. 또한, scl-PHA합성효소에 단백질 등의 다른 생체고분자를 결합시키고, 결합한 생체고분자를 어피니티흡착함으로써 scl-PHA합성효소를 고정화해도 된다. scl-PHA합성효소와 생체고분자와의 결합은 유전자재조합 등에 의해서 행해도 되고, 화학적으로 행해도 된다. 예를 들면, 실시예에 후술하는 바와 같이, 형질전환체에 의해서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)를 scl-PHA합성효소에 융합하고, 글루타티온 S-트랜스퍼라제의 리간드인 글루타티온을 도입한 세파로스(sepharose)에 융합단백질을 어피니티흡착하고, 고정화하는 것이 가능하다.

코어에 고정화하는 효소의 양은, 캡슐구조체의 피복외피로서 형성시키는 층두께나 코어의 표면적에 따라서 적절하게 설정하면 되나, 1분간 1μmol의 CoA를 방출시키는 효소량을 1단위(U)로 한 경우, 10U로부터 1,000U, 바람직하게는, 50U 내지 500U의 범위내로 설정하는 것이 좋다.

상기 방법에 의해 제작된 고정화효소는, 그대로 사용하는 것이 가능하나, 또 동결건조 등을 실시한 후에 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법에 이용하는 코어로서는, 전술한 방법 등에 따라서 scl-PHA합성효소를 고정화시키는 것이 가능한 것이면, 어느 것이라도 되고, 유기고분자화합물이나 무기계 고형물로부터 적절하게 선택해서 이용하는 것이 가능하다. 또, 단독으로 혹은 복수종 혼합해서 사용해도 된다.

본 발명에서는, 캡슐구조체를, 유기용매를 사용하지 않고, 수중에서 제조하므로, 친수성의 무기안료 등, 유기용매에는 분산성이 나쁘지만, 수성 용매에는 분산성이 좋은 재료도 코어로서 이용하는 것이 가능하다. 또, 유기용매중에 용해될수 있는 재료도 코어로서 사용하는 것이 가능하다.

또, 본 발명에 있어서는, scl-PHA로 구성되는 캡슐외피의 생분해성 기능을 보다 효과적으로 하기 위하여, 코어재료로서 생분해성 플라스틱재료를 사용하는 것도 바람직하다. 생분해성 플라스틱재료로서는, 미생물에 의해서 생산된 scl-PHA를 이용해도 되고, 또는, "에코스타", "에코스타플러스"(상품명: 하기와라코교사 제품); "바이오폴"(상품명: I.C.I.저팬사 제품); "아지코트"(상품명: 아지노모토사 제품); "플락셀", "폴리카프로락톤"(상품명: 다이셀화학사 제품); "쇼렉스", "바이오노레"(BIONORE)(상품명: 쇼와덴코사 제품); "락티"(LACTY)(상품명: 시마즈사 제품); "레이시아"(RAYCIA)(상품명: 미쯔이카가쿠사 제품) 등의 시판의 생분해성 플라스틱재료를 사용해도 된다.

또, 코어재료로서, 안료가 본 발명에서 효과적으로 이용된다. 유용한 안료로서는, 공지의 유기 및 무기안료를 들 수 있다. 흑색계의 안료로서는, 카본블랙, 사삼산화철 등의 무기계 안료; 시아닌블랙 등의 유기계 안료 등을 들 수 있다. 백색계의 안료로서는, 아연화, 산화티탄, 안티몬백, 황화아연 등을 들 수 있다. 황색계 안료로서는, 크롬옐로, 카드뮴옐로, 황색산화철, 티탄옐로 등을 들 수 있다. 또, 안료로서는, 한자(Hansa)옐로 G(C.I. No. 피그먼트옐로 1(이하, "C.I. No"는 생략함), 한자옐로 10G(피그먼트옐로 3), 한자옐로 RN(피그먼트옐로 65), 한자브릴리언트옐로 5GX(피그먼트옐로 74), 한자브릴리언트옐로 10GX(피그먼트옐로 98), 퍼머넌트옐로 FGL(피그먼트옐로 97), 시뮬라레이크패스트옐로 6G(피그먼트옐로 133), 리오놀옐로 K-2R(피그먼트옐로 169) 등의 난용성 금속염(아조레이크)인아세토아세트산 아닐리드계 모노아조안료;

디스아조옐로 G(피그먼트옐로 12), 디아조옐로 GR(피그먼트옐로 13), 디아조옐로 5G(피그먼트옐로 14), 디아조옐로 8G(피그먼트옐로 17), 디아조옐로 R(피그먼트옐로 55), 퍼머넌트옐로 HR(피그먼트옐로 83) 등의 아세토아세트산 아닐리드디아조안료;

크로모프탈옐로 3G(피그먼트옐로 93), 크로모프탈옐로 6G(피그먼트옐로 94), 크로모프탈옐로 GR(피그먼트옐로 95) 등의 축합아조안료;

호스타펌옐로 H3G(피그먼트옐로 154), 호스타펌옐로 H4G(피그먼트옐로 151), 호스타펌옐로 H2G(피그먼트옐로 120), 호스타펌옐로 H6G(피그먼트옐로 175), 호스타펌옐로 HLR(피그먼트옐로 156) 등의 벤즈이미다졸론계 모노아조안료;

이르가진옐로 3RLTN(피그먼트옐로 110), 이르가진옐로 2RLT, 이르가진옐로 2GLT(피그먼트옐로 109), 파스토겐슈퍼옐로 GROH(피그먼트옐로 137), 파스토겐슈퍼옐로 GRO(피그먼트옐로 110), 선드린옐로 6GL(피그먼트옐로 173) 등의 이소인돌리논계 안료;

플라반트론(피그먼트옐로 24), 안트라밀리미딘(피그먼트옐로 108), 프탈로일아미드계 안트라퀴닌(피그먼트옐로 123), 헤리오파스토옐로 E3R(피그먼트옐로 99) 트렌계 안료;

아조계 니켈착제안료(피그먼트그린 10), 니트로조계 니켈착제안료(피그먼트옐로 153), 아조메틴계 구리착체안료(피그먼트옐로 117) 등의 금속착체안료;

프탈이미도퀴노프탈론안료(피그먼트옐로 138) 등의 퀴노프탈론계 안료 등을 들 수있다. 마젠타계 안료로서는, 카드륨레드, 레드산화철, 주색안료(vermilion), 연단, 안티몬레드 등을 들 수 있다. 안료로서는, 또한, 브릴리언트카민 6B(피그먼트레드 57:1), 레이크레드(피그먼트레드 53:1), 퍼머넌트레드 F5R(피그먼트레드 48), 리톨레드(피그먼트레드 49), 페르시안오렌지(피그먼트오렌지 17), 쿠로세이오렌지(피그먼트오렌지 18), 헬리오오렌지 TD(피그먼트오렌지 19), 피그먼트스칼렛(피그먼트레드 60:1), 브릴리언트스칼렛 G(피그먼트 64:1), 헬리오레드 RMT(피그먼트레드 51), 보르드(bordeaux) 10B(피그먼트레드 63), 헬리오보르드 BL(피그먼트레드 54) 등의 아조레이크계 안료를 들 수 있다. 또, 불용성 아조계 안료(모노아조, 디아조, 축합아조)로서는, 파라레드(피그먼트레드 1), 레이크레드 4R(피그먼트레드 3), 퍼머넌트오렌지(피그먼트오렌지 5), 퍼머넌트 FR2(피그먼트레드 2), 퍼머넌트레드 FRLL(피그먼트레드 9), 퍼머넌트레드 FGR(피그먼트레드 112), 브릴리언트카민 BS(피그먼트레드 114), 퍼머넌트카민 FB(피그먼트레드 5), P.V.카민 HR(피그먼트레드 150), 퍼머넌트카민 FBB(피그먼트레드 146), 노바펌레드 F3RK-F5RK(피그먼트레드 170), 노바펌레드 HFG(피그먼트오렌지 38), 노바펌레드 HF4B(피그먼트레드 187), 노바펌오렌지 HL.HL-70(피그먼트오렌지 36), P.V.카민 HF4C(피그먼트레드 185), 호스타밤브라운 HFR(피그먼트브라운 25), 발칸오렌지(피그먼트오렌지 16), 피라졸론오렌지(피그먼트오렌지 13), 피라졸론레드(피그먼트레드 38) 등을 들 수 있다. 축합아조계 안료로서는, 크로모프탈오렌지 4R(피그먼트오렌지 31), 크로모프탈스칼렛 R(피그먼트레드 166), 크로모프탈레드 BR(피그먼트레드 144) 등을 들 수 있다. 축합 다고리계 안료로서는, 피란트론오렌지(피그먼트오렌지 40), 안트란트론오렌지(피그먼트오렌지 168), 디안트라퀴노닐레드(피그먼트레드 177) 등의 안트라퀴논계 안료를 들 수 있다. 티오인디고계 안료로서는, 티오인디고마젠타(피그먼트바이올렛 38), 티오인디고바이올렛(피그먼트바이올렛 36), 티오인디고레드(피그먼트레드 88) 등을 들 수 있다. 페리논계 안료로서는, 페리논오렌지(피그먼트오렌지 43) 등을 들 수 있다. 페릴렌계 안료로서는, 페릴렌레드(피그먼트레드 190), 페릴렌베르밀리온(피그먼트레드 123), 페릴렌말룬(피그먼트레드 179), 페릴렌스칼렛(피그먼트레드 149), 페릴렌레드(피그먼트레드 178) 등을 들 수 있다. 퀴나크리돈계 안료로서는, 퀴나크리돈레드(피그먼트바이올렛 19), 퀴나크리돈계 마젠타(피그먼트레드 122), 퀴나크리돈말룬(피그먼트레드 206), 퀴나크리돈스칼렛(피그먼트레드 207) 등을 들 수 있다. 축합 다고리계 안료로서는, 또, 피로콜린안료, 적색 플루오루빈계 안료, 염색용 레이크계 안료(수용성 염료+침전제→레이크화 고착) 등을 들 수 있다.

시안계 안료로서는, 군청, 인디고블루, 코발트블루, 셀라안블루 등의 무기계 안료를 들 수 있고, 또, 프탈로시아닌계 안료로서는, 파스토겐블루 BB(피그먼트블루 15), 스미톤시아닌블루 HB(피그먼트블루 15), 시아닌블루 5020(피그먼트블루 15:1), 스미카프린트시아닌블루 GN-O(피그먼트블루 15), 패스트스카이블루 A-612(피그먼트블루 17), 시아닌그린 GB(피그먼트그린 7), 시아닌그린 S537-2Y(피그먼트그린 36), 스미톤패스트바이올렛 RL(피그먼트바이올렛 23) 등을 들 수 있다. 트렌계 안료로서는, 인단트론블루(PB-60P, PB-22, PB-21, PB-64), 메틸바이올렛포스포몰리브데이트레이크(PV-3, 염기성 염료레이크안료) 등을 들 수 있다. 체질안료로서는, 바라이트분말, 탄산바륨분말, 클레이, 실리카, 화이트카본, 탤크, 알루미나화이트 등을 들 수 있다. 상기 안료의 표면에 수지를 코팅해서 얻은 가공안료도 마찬가지로 사용가능하다.

또, 본 발명의 캡슐구조체를 이용한 전자사진용 캡슐토너는, 코어재료로서, 종래의 토너입자나, 종래 토너로서 사용되는 재료로부터 형성된 입자를 지니는 것이 가능하다.

본 발명의 토너를 제조하는 재료로서는, 바인더수지, 착색제, 하전제어제, 자성 재료 등을 들 수 있다.

토너재조시에 사용되는 통상의 바인더수지라면 본 발명에 제한없이 사용가능하다. 바인더수지로서는, 스티렌계 폴리머, 폴리에스테르계 폴리머, 에폭시계 폴리머, 폴리올레핀계 폴리머, 폴리우레탄계 폴리머 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 혹은 2종이상 조합해서 사용해도 된다. 스티렌계 폴리머로서는, 스티렌과 (메타)아크릴산 에스테르와의 공중합체 및 이들과 공중합가능한 기타 단량체와의 공중합체; 스티렌과 디엔계 단량체(부타디엔, 이소프렌 등)와의 공중합체 및 이들과 공중합가능한 기타 단량체의 공중합체 등을 들 수 있다. 폴리에스테르계 폴리머로서는, 방향족 디카르복시산과 방향족 디올의 알킬렌옥사이드부가물과의 중축합물 등을 들 수 있다. 에폭시계 폴리머로서는 방향족 디올과 에피클로로히드린과의 반응물 및 이들의 변성물 등을 들 수 있다. 폴리올레핀계 폴리머로서는, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 이들과 기타 공중합가능한 단량체와의 공중합체사슬 등을 들 수 있다. 폴리우레탄계 폴리머로서는 방향족 디이소시아네이트와 방향족 디올의 알킬렌옥사이드부가물과의 중부가물 등을 들 수 있다.

이 바인더수지를 제조하는 방법으로서는, 종래 토너의 제조방법으로서 알려져 있던 방법을 이용해도 되고, 폴리머의 파쇄법, 현탁중합법, 유화중합법, 분산중합법 등의 중합법을 이용하는 것도 가능하다. 또, 중합방법에 따라서 가교제, 중합개시제를 이용하는 것도 가능하다.

착색제, 하전제어제, 자성재료 등은, 바인더수지의 제조시에 첨가해도, 또, 바인더수지를 제조한 후에 팽윤, 혹은 기계적 주입법 등에 의해 도입해도 된다.

착색제로서는, 통상, 토너를 제조할 때 이용되는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있고, 특히 한정되지 않는다. 그중, 안료로서는, 예를 들면, 전술한 것을 이용하는 것이 가능하다. 또, 바인더수지를 이용할 경우에는, 착색제로서 염료를 이용하는 것이 가능하다. 이용가능한 염료로서는, 예를 들면, 미쯔비시카세이사 제품인 다이아레진 옐로-3G, 옐로-F, 옐로-H2G, 옐로-HG, 옐로-HC, 옐로-HL, 오렌지-HS, 오렌지-G, 레드-GG, 레드-S, 레드-HS, 레드-A, 레드-K, 레드-H5B, 바이올렛-D, 블루-J, 블루-G, 블루-N, 블루-K, 블루-P, 블루-H3G, 블루-4G, 그린-C, 브라운-A; 호도가야카가쿠사 제품인 딥블루 SOT염료 옐로-1, 옐로-3, 옐로-4, 오렌지-1, 오렌지-2, 오렌지-3, 스칼렛-1, 레드-1, 레드-2, 레드-3, 브라운-2, 블루-1, 블루-2, 바이올렛-1, 그린-1, 그린-2, 그린-3, 블랙-1, 블랙-4, 블랙-6, 블랙-8; 바스프사 제품인 수단염료 옐로-146, 옐로-150, 오렌지-220, 레드-290, 레드-380, 레드-460, 블루-670; 오리엔트카가쿠사 제품인 오일블랙, 오일칼라 옐로-3G, 옐로-GG-S, 옐로-#105, 오렌지-PS, 오렌지-PR, 오렌지-#201, 스칼렛-#308, 레드-5B, 브라운-GR, 브라운-#416, 그린-BG, 그린-#502, 블루-BOS, 블루-IIN, 블랙-HBB, 블랙-#803, 블랙-EB, 블랙-EX; 스미토모카가쿠사 제품인 스미플라스트 블루-GP, 블루-OR, 레드-FB, 레드-3B, 옐로-FL7G, 옐로-GC; 닛뽄 카야쿠사 제품인 카야론, 폴리에스테르블랙 EX-SF300, 카야셋 레드 B, 블루 A-2R 등을 들 수 있다.

상기 염료 및 안료는, 단독으로 사용해도, 혼합해서 사용해도 되고, 또, 환경보전이나 인체에 대한 안전성 등을 고려한 경우에는, 각종 식용색소를 바람직하게 사용하는 것이 가능하다.

상기 착색제의 캡슐화 토너중의 함유량은, 소망으로 하는 착색효과 등에 따라서 넓게 선택하는 것이 가능하나, 통상, 바인더수지 100질량부에 대해서, 0.1질량부 내지 15질량부정도이면 되고, 보다 바람직하게는, 1.0질량부 내지 10질량부정도이면 된다. 여기서, 착색제의 함유량이 0.1질량부미만이면, 토너로서의 은폐력부족으로 되고, OHP(오버허드프로젝터)용의 OHP시트에 대해서는, 15질량부를 초과한 경우에는, 착색제의 종류에 따라서는 해당 시트를 투과하는 광의 선명성이 열화되게 된다.

하전제어제로서는, 통상 토너의 제조에 사용되고 있는 것이면, 양하전제어제 혹은 음하전제어제의 어느 것이라도 사용할 수 있고, 특히 한정되지 않는다. 하전제어제로서는, 예를 들면, 니그로신계 염료, 트리페닐메탄계 염료, 4급 암모늄염, 아민계화합물, 이민계 화합물, 살리실산 혹은 알킬살리실산의 금속화합물, 금속함유 모노아조계 염료, 카르복실기 혹은 술폭실기를 함유하는 화합물, 니트로푸민 등의 휴민산 및 휴민염류 등을 들 수 있다.

상기 하전제어제의 캡술토너중의 함유량은, 통상, 바인더수지 100질량부에 대해서 0.1 내지 50질량%, 바람직하게는, 0.3 내지 30질량부이다. 여기서, 하전제어제의 함유량이 0.1질량%미만이면, 대전량이 불충분한 반면, 50질량%를 초과하면 토너의 대전안정성이 악화된다.

본 발명의 캡슐토너는, 자성 재료를 코어에 함유시켜 자성 토너로 해도 된다. 이런 유형의 자성 재료에는, 착색재의 역할을 겸비시키는 것도 가능하다. 이 때 사용되는 자성 재료로서는, 마그네타이트, 헤마타이트, 페라이트와 같은 산화철; 철, 코발트, 니켈과 같은 금속 또는 이들 금속과 알루미늄, 코발트, 구리, 납, 마그네슘, 주석, 아연, 안티몬, 베릴륨, 비스무트, 카드뮴, 칼슘, 망간, 셀렌, 티탄, 텅스텐, 바나듐과 같은 금속과의 합금 및 그 혼합물을 들 수 있다. 이들 자성재료의 평균입자직경은, 바람직하게는, 2㎛이하, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.5㎛정도인 것이 바람직하다.

상기 자성 재료의 캡슐토너중의 함유량은, 통상, 바인더수지 100질량부에 대해 20 내지 200질량부, 특히 바람직하게는, 바인더수지 100질량부에 대해서 40 내지 150중량부로 하는 것이 바람직하다.

이상이, 본 발명의 캡슐구조체의 코어를, 캡슐토너로서 사용할 경우의 예시이나, 상기 캡슐토너의 코어는 scl-PHA로 캡슐화되므로, 캡슐토너의 코어의 유리전이온도(Tg)로서는, 통상, 저온정착성 토너에 대해서 요구되는 40 내지 75℃의 범위일 필요는 없으나, 예를 들면, 20 내지 40℃, 또는 75 내지 120℃의 범위라도 유효하게 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 캡슐구조체의 코어의 입자직경으로서는, 특히 한정되지 않지만, 0.01㎛이상이 캡슐구조체의 작성상 바람직하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 입자직경의 상한은 특히 없으나, 입자표면에 scl-PHA합성효소를 균등하게 흡착시키는 점에서, 1㎜정도까지가 바람직하다.

캡슐토너로서 사용할 경우, 고화질화를 달성하기 위해서는, 중량평균입자직경이 3㎛ 내지 8㎛의 범위내인 것이 바람직하다. 또, 캡슐토너의 중량평균입자직경은 3 내지 10㎛의 범위인 것이 바람직하다. 즉, 중량평균입자직경이 3㎛미만인 캡슐토너에서는, 전사효율의 저하가 발생하여, 감광부재 위에 전사잔류토너가 많이 남기 쉬우므로, 화상의 흐림, 전사불량에 의거한 화상의 불균일의 원인으로 되기 쉬워, 바람직하지 않다. 한편, 캡슐토너의 중량평균입자직경이 10㎛를 넘는 경우에는, 문자나 라인화상의 비산이 발생하기 쉽다.

본 발명의 캡슐구조체의 제조방법에서는, 코어의 입자직경이 균일하면, 캡슐구조체의 입자직경도 비교적 균일하게 하는 것이 가능하나, 역으로 입자직경이나 형상이 균일한 토너도 거의 균일하게 캡슐화 하는 것이 가능하므로, 코어의 입자직경이나 형상의 균일성은 문제없다.

코어의 입자직경이나 입자직경분포의 측정은, 예를 들면, 콜터카운터(TA-II형) 또는 콜터멀티사이저(콜터사 제품) 등을 이용해서 행하면 된다.

통상, 수성 용매중에서 본 발명의 것과 같이 마이크로캡슐을 제조할 경우, 코어가 유기안료 등 소수성 코어재료이면, 캡슐형성시에 코어가 응집한다고 하는문제가 생기나, 본 발명의 방법에서는, scl-PHA합성효소를 고체입자에 흡착시키므로, 효소단백질의 이온성 작용기에 의한 전기적 반발력 및/또는 입체반발력에 따라서 소수성의 고체입자를 수성 용매중에 어느 정도 분산시키는 것이 가능하고, 소수성 코어의 캡슐화를 비교적 용이하게 하는 것이 가능하다.

그러나, 코어에 효소를 고정화하는 단계에서는, 코어를 어느 정도 분산시키는 것이 바람직하다. 그 때, 계면활성제 등을 이용하지 않고 캡슐을 제조할 수 있다고 하는 본 발명의 장점을 활용하므로, 교반이나 초음파처리 등의 기계적인 분산수법을 이용하는 것이 바람직하나, 용도적으로 문제없으면, 효소활성에 영향을 미치지 않는 조성 및 농도의, 종래 공지의 계면활성제를 이용해서 코어를 분산시켜도 문제없다.

코어에 고정화된 상기 scl-PHA합성효소에 의해서 scl-PHA의 합성을 행하기 위한 모노머로서, (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 또는 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA를 사용한다. (R)-3-하이드록시부티릴 CoA는 시그마알드리치저팬사 등에서 시판되고 있어 입수할 수 있다. 상기 모노머는, 효소를 이용한in-vivo합성법, 미생물이나 식물 등의 생물체를 이용한in-vivo합성법, 화학적 합성법 등을 이용해서 합성할 수 있다. 예를 들면, 효소합성법은 해당 기질의 합성에 일반적으로 이용되고 있는 방법이며, 3-하이드록시아실CoA는, 시판의 아실CoA신타제(아실CoA리가제, E.C.6.2.1.4)를 이용해서 하기 반응식:

아실CoA신타제

3-하이드록시알칸산 + CoA →3-하이드록시아실 CoA

을 통한 효소합성법(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997); Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 37-43(2000) 등)에 의해 합성하는 것이 가능하다.

본 발명에서는, 상기 scl-PHA합성효소를 고정화한 코어를 분산한 수계 반응액에 (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 또는 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종을 첨가하고, 반응조건을 조정함으로써 상기 하이드록시알칸산을 중합함으로써, 코어를 scl-PHA로 피복해서, scl-PHA를 외피로 한 캡슐구조체를 형성한다.

상기 반응용의 수계 반응액은, scl-PHA합성효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 조건으로 조정된 것이면, 어느 것을 이용해도 되나, 예를 들면, 통상, pH 5.5 내지 pH 9.0, 바람직하게는, pH 7.0 내지 pH 8.5로 되도록 제조한다. 단, 사용하는 scl-PHA합성효소의 최적 pH나 pH안정성에 따라서는, 상기 범위이외의 조건을 설정해도 상관없다.

완충액의 종류는, 사용하는 scl-PHA합성효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 것이면, 설정하는 pH영역에 따라서 적절하게 선택하게 이용하는 것이 가능하나, 일반의 생화학반응에 이용되는 완충액, 예를 들면, 아세트산버퍼, 인산버퍼, 인산칼륨버퍼, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS)버퍼, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS)버퍼, 트리스염산버퍼, 글리신버퍼, 2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산(CHES)버퍼 등을 이용해도 된다. 완충액의 농도도, 사용하는 scl-PHA합성효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 것이면 특히 한정되는 것은 아니나, 통상 5.0mM 내지 1.0mM, 바람직하게는, 0.1mM 내지 0.2mM의 농도인 것을 사용해도 된다.반응온도도, 사용하는 scl-PHA합성효소에 따라서, 적절하게 설정하면 되나, 통상, 4 내지 50℃, 바람직하게는, 20℃ 내지 40℃로 설정하면 된다. 단, 사용하는 scl-PHA합성효소의 최적온도나 내열성에 따라서는, 상기 범위이외에 조건을 설정해도 된다. 반응시간은, 사용하는 scl-PHA합성효소의 안정성 등에도 의하나, 통상, 1분간 내지 24시간, 바람직하게는, 30분간 내지 3시간의 범위내에서 적절하게 선택해서 설정한다. 반응액중의 (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종의 농도(2종이상의 경우는 그들의 합계)는, 사용하는 scl-PHA합성효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 범위내에서 적절하게 설정하나, 통상, 0.1mM 내지 1.0M, 바람직하게는, 0.2mM 내지 0.2M의 범위내에서 설정해도 된다. 또, 반응액중에 있어서의 (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종의 농도가 높은 경우, 일반적으로 반응계의 pH가 저하하는 경향이 있으므로, (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종의 농도를 높게 설정할 경우에는, 상기 완충액농도도 높게 설정하는 것이 바람직하다.

상기 캡슐구조체제조시에 있어서는, 코어의 표면에 고정화되어 있는 scl-PHA합성효소에 (R)-3-하이드록시프로피오닐 CoA, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA의 적어도 1종이 균등하게 공급되는 것이 바람직하므로, 반응용기를 적당한 강도로 진탕하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해서 얻어진 상기 캡슐구조체가 scl-PHA로 피복되어 있는 것을확인하는 방법으로서, 예를 들면, 가스크로마토그래피 등에 의한 조성분석과 전자현미경 등에 의한 형태관찰을 조합시킨 방법이나; 비행시간형 2차이온질량분석장치(TOF-SIMS)와 이온스퍼터링기술을 이용해서, 각 구성층의 매스스펙트럼으로부터 구조를 판정하는 방법 등을 이용하는 것이 가능하다. 그러나, 또 직접적이고 간편한 확인방법으로서, 본 발명자들에 의해서 새롭게 개발된, 나일블루 A염색과 형광현미경을 조합시킨 방법이 있다. 본 발명자들은, scl-PHA합성효소에 의해in vitro에서 scl-PHA의 합성을 확인하는 간단한 방법을 예의 연구한 결과, 나일블루 A가in vitro에서 scl-PHA합성을 판정하는 데 유용하다는 것을 발견하였다. 나일블루 A는, scl-PHA에 특이적으로 결합해서 형광을 방출한다. 이 나일블루 A는,in vivo에서의 scl-PHA의 간편한 판별에 이용되는 것으로 보고되어 있다(Appl. Environ. Microbiol., 44, 238-241(1982)). 본 발명자들은, 이 나일블루 A가in vitro에서의 scl-PHA합성의 확인에도 유용하다는 것을 발견하였다. 이 확인방법에 있어서는, 나일블루 A용액을 scl-PHA를 함유하는 반응액에 소정 농도로 혼합하고, 얻어진 혼합물을, 소정 파장의 여기광을 조사하면서 형광현미경으로 관찰하여, 합성된 scl-PHA만으로부터 방출된 형광을 검출하여,in vitro에서의 scl-PHA합성을 간편하게 판정하는 것이 가능하다. 사용한 코어가 상기 조건하에서 형광을 발하는 성질을 지닌 것이 아닌 한, 상기 방법을 본 발명의 구조체의 제조에 응용함으로써, 코어의 표면을 피복한 scl-PHA를 직접적으로 관찰하여 평가하는 것이 가능하다.

상기 캡슐구조체의 scl-PHA외피의 두께는, 반응시간, 3HB-CoA농도, 효소농도, 온도 등의 반응조건을 변화시킴으로써 0.01 내지 10㎛의 범위내에서 어느 정도 제어하는 것이 가능하다. 또, 전자사진용 캡슐토너의 경우, 0.1㎛미만의 경우는 정착성이 나쁘고, 2㎛를 초과하면 오프셋이 발생하기 쉬워진다고 하는 문제때문에, scl-PHA외피의 두께는 0.1 내지 2㎛정도로 하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 캡슐구조체의 제조방법에서는, 동일 분산액중의 코어에 피복되는 scl-PHA외피의 막두께를 어느 정도 균일하게 하는 것이 가능하므로, 코어의 입자직경을 미리 조정함으로써, 캡슐구조체의 입자직경을 어느 정도 균일하게 하는 것이 가능하다. 역으로 입자직경이나 형상이 불균일한 코어도, 어느 정도 균일한 두께의 외피로 피복하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 캡슐구조체에서는, scl-PHA외피층을 코어의 표면에 직접 형성하는 것이 가능하므로, 캡슐구조체중의 코어의 밀도를 높게 하는 것이 가능하다. 이 코어의 밀도는, 코어의 입자직경과 scl-PHA외피의 층두께에 따라서 제한되나, 10 내지 95체적%의 범위내에서 제어하는 것이 가능하고, 목적에 따라서 설정하면 된다.

scl-PHA외피의 층두께는, 캡슐구조체를 에폭시수지로 고형화한 후, 초박편으로 절단하고, 4산화루테늄, 4산화오스뮴 등에 의해 염색한 후, 투과형 전자현미경에 의해 관찰함으로써; 혹은 콜터카운터멀티사이저(콜터사 제품) 등의 입자직경측정장치를 이용해서, 캡슐화전후의 코어의 입자직경의 차를 측정함으로써 구할 수 있다.

본 발명의 캡슐구조체에서는, 외피를 구성하는 scl-PHA의 분자량은, 반응시간, 3HB-CoA농도, 효소농도, 온도 등의 반응조건을 변화시킴으로써, Mn(수평균분자량)(폴리스티렌환산)을 1,000 내지 10,000,000정도의 범위내에서 제어하는 것이 가능하다. 예를 들면, 전자사진용 캡슐토너로서 사용할 경우에는, 3,000 내지 1,00,000정도로 하는 것이 가능하다.

이 분자량의 제어에 의해서 어느 정도 캡슐외피의 scl-PHA의 유리전이온도를 제어하는 것이 가능하다. 전자사진용 캡슐토너로서 사용할 경우, 유리전이온도가 45℃미만이면, 보존시에 토너의 융착이나 블로킹이 생기기 쉽고, 75℃를 초과하면 저온에서의 정착성이 열화되게 되므로, 캡슐외피의 scl-PHA의 유리전이온도는 45 내지 75℃의 범위, 바람직하게는, 50 내지 70℃의 범위로 되도록 설정하는 것이 바람직하다.

scl-PHA의 분자량은, 코어가 클로로포름에 용해되지 않는 것이 전제로 되나, 예를 들면, 캡슐구조체외피의 scl-PHA를 클로로포름에 용해하여, GPC(겔투과크로마토그래피)에 의해 측정하면 된다.

유리전이온도의 측정은, 예를 들면, 퍼킨엘머사 제품의 DSC-7과 같은 고정밀도의 내열식 입력보상형의 시차주사열량계를 사용해서 ASTM D 3418-82에 준해서 측정을 행하면 된다.

본 발명의 캡슐구조체의 외피를 구성하는 scl-PHA는 생분해성의 기능을 지니므로, 적당한 코어를 선택함으로써, 생물에 대해서 안전하고, 환경에 폐기해도 오염을 일으키지 않는다. 또, 자연계 혹은 생체내에 있어서, 캡슐외피가 서서히 분해하므로, 서방성 기능을 발현하는 것이 가능하여, 농약이나 의약제제 등의 용도에유용하다.

또, 본 발명의 캡슐구조체의 외피를 구성하는 scl-PHA는 R체만으로 이루어진 아이소택틱한 폴리머이므로, 광학재료로서의 용도에도 이용하는 것이 가능하다.

본 발명의 캡슐구조체는, 상기 방법에 의해 제조되나, 계면활성제를 사용하지 않고 제조하는 것이 가능하므로, 계면활성제에 의한 오염이 없는 캡슐구조체로서 사용가능하다. 또, 3HB-CoA나 완충액에 유래하는 염에 의한 캡슐구조체의 오염은 극히 미량이어서, 생물적으로는 무해하고, 또, 용이하게 세정할 수 있기 때문에, 캡슐의 사용목적에 영향을 미치는 일은 거의 없다.

또, 본 발명의 제조방법은, 효소반응만을 이용한 것이므로, 온도 등의 반응조건이 온화하고, 유화나 현탁을 위한 고속교반 등을 필요로 하지 않고, 또 코어에 효소와 모노머를 가하는 것뿐이라고 하는, 극히 간편한 제조프로세스로 행하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 제조방법은, 유기용매를 사용하지 않으므로, 유기용매를 사용할 때에 필요로 하는 고밀도의 밀폐용기, 배기장치, 고도의 폐액처리 등이 불필요하게 되어, 비용도 억제되고, 대규모화가 용이하여 인체나 환경에의 부하도 적다고 하는 특징을 지닌다.

본 발명의 제조방법에 의해서 얻어진 캡슐구조체는 반응액 그대로 분산체로서 이용하는 것이 가능하고, 온화한 원심분리나 흡인여과 등에 의해 캡슐구조체를 회수한 후, 별도의 수용액에 분산시켜서 사용하는 것도 가능하다. 또, 회수한 캡슐구조체를 scl-PHA불용성의 유기용매에 분산시키거나, 용매치환을 행하여 scl-PHA불용성의 유기용매에 분산시켜 용제분산체로서 이용하는 것도 가능하다. 또, 상기 방법을 이용해서, 캡슐구조체를 세정하는 것도 가능하다.

분말형태의 캡슐구조체를 얻기 위해서는, 입자직경이 큰 경우에는 온화한 원심분리나 흡인여과 등에 의해 습윤덩어리를 얻은 후, 감압건조나 제트밀 등으로 건조를 행하고, 또는, 입자직경이 적은 경우에는, 분무건조법 등에 의해 건조를 행하면 된다.

균일한 입자크기를 지닌 코어를 이용함으로써, 캡슐구조체입자의 직경을 균일화할 수 있으나, 보다 균일한 입자크기를 얻기 위해서는, 캡슐구조체입자의 제조후에 더욱 분급을 행해도 된다.

또, 상기 캡슐구조체에 목적에 따라서 첨가물을 조합시키거나, 각종 2차가공이나 화학수식 등의 처리를 실시해서 사용하는 것도 가능하다.

예를 들면, 전자사진용 캡슐토너로서의 용도를 위해서는, 유동성, 대전성, 현상성, 내구성을 향상할 목적으로 각종 외부첨가제를 사용하는 것이 가능하다. 이 때 사용하는 외부첨가제로서는, 통상 토너에 사용되고 있는 종래 공지의 어느 외부첨가제도 이용가능하다. 구체적으로는, 예를 들면, 실리카, 산화티탄, 알루미나 등의 미분말을 들 수 있다. 그리고, 예를 들면, 실리카이면, BET표면적이 30㎡/g이상, 특히 300㎡/g이상인 것이 양호한 결과를 부여한다. 이 경우의 실리카미세분말의 첨가량으로서는, 바람직하게는, 캡슐토너 100질량부에 대해서, 0.01 내지 8질량부, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5질량부의 범위이다. 이 때에 사용하는 실리카미세분말로서는, 실리콘와니스, 각종 변성 와니스, 실리콘오일, 각종 변성 실리콘오일, 실란커플링제, 작용기를 지닌 실란커플링제, 그 외의 유기규소화합물과 같은 처리제에 의해 전처리된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 처리제는 2종이상 혼합해서 사용해도 된다.

또, 본 발명의 전자사진용 캡슐토너의 현상성 및 내구성을 향상시키기 위해서, 산화아연, 산화알루미늄, 산화코발트, 이산화망간, 티탄산 스트론튬, 티탄산 마그네슘과 같은 무기분말을 첨가하는 것도 바람직하다.

또한, 본 발명의 전자사진용 캡슐토너에, 하기 열거한 바와 같은 윤활제분말을 첨가해도 된다. 예를 들면, 테플론, 폴리불화비닐리덴과 같은 불소수지; 불화카본과 같은 불소화합물; 스테아르산아연과 같은 지방산금속염; 지방산, 지방산에스테르와 같은 지방산유도체; 황화몰리브덴 등을 들 수 있다.

본 발명의 전자사진용 캡슐토너는, 단독으로 비자성 1성분현상제로서 사용되거나, 자성 캐리어와 함께 자성 2성분현상제를 구성하거나 하는 비자성 토너나, 단독으로 자성 1성분토너로서 사용되는 자성 토너 등의, 종래 널리 알려진 여러 가지의 토너에 적용할 수 있다. 여기서 2성분 현상방법에 사용하는 경우의 캐리어로서는, 종래 알려져 있는 것을 어느 것이라도 사용할 수 있고, 구체적으로는, 표면산화 또는 미산화의 철, 니켈, 코발트, 망간, 크롬, 희토류와 같은 금속; 이들 금속의 합금; 또는 이들 금속의 산화물을 들 수 있고, 이 캐리어의 평균입자크기는 20 내지 300㎛의 범위로 한다. 또, 본 발명에 있어서의 캐리어는, 상기한 캐리어입자의 표면이, 스티렌계 수지, 아크릴계 수지, 실리콘계 수지, 불소계 수지, 폴리에스테르수지와 같은 물질에 의해서 일부 혹은 전체가 피복되어 있는 것인 것이 바람직하다. 또, 본 발명을 이용해서 캐리어입자를 scl-PHA로 피복해도 된다.

또, 본 발명의 캡슐구조체 및 그 이용방법 그리고 그 제조방법은, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이하에 설명하는 실시예는 본 발명의 최량의 실시형태의 일례이나, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다. 또, 실시예중에서 사용하는 "부"는 모두 "질량부"를 의미한다.

<PHB합성효소생산능을 지닌 형질전환체의 제작>

TB64균주를 100㎖의 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑스, 0.5%염화나트륨, pH 7.4)에서, 30℃, 하룻밤 배양후, 마머의 방법(Marmru's method)에 의해 염색체 DNA를 회수하였다. 얻어진 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI로 부분분해하였다. 벡터는 pUC18을 사용하고, 제한효소 BamHI로 절단하고, 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권, 572면, 1989년; Cold Spring Harbor Laboratory출판)한 후, DNA라이게이션키트 Ver.II(타카라슈조사 제품)를 이용해서 염색체 DNA의 Sau3AI부분분회절편과 연결하였다. 다음에, 이 연결 DNA절편을 이용해서 대장균(Escherichia coli) HB101균주를 형질전환하여, TB64균주의 염색체 DNA라이브러리를 제작하였다.

다음에, TB64균주의 PHB합성효소군유전자를 함유하는 DNA절편을 얻기 위한 표현형 스크리닝을 행하였다. 선택배지에는 2%글루코스를 함유하는 LB배지를 이용하고, 한천평판배지상의 콜로니가 적당한 크기로 생육한 시점에서 수단블랙 B용액을 분무하여, UV광 조사에 의해 형광을 발하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니로부터 알칼리법에 의해 플라스미드를 회수함으로써 PHB합성효소군 유전자를 함유하는 DNA절편을 얻는 것이 가능하였다.

여기서 얻어진 유전자단편을 불화합성 그룹인 IncP, IncQ 혹은 IncW의 어느 것에도 속하지 않는 숙주역복제영역을 함유하는 벡터 pBBR122(Mo Bi Tec)에 재조합하고, 이 재조합플라스미드를 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 TB64ml균주(PHB합성능결손균주)에 엘렉트로포레이션(electroporation)법에 의해 형질전환한 바, TB64ml균주의 PHB합성능이 복구되어, 상보성을 나타내었다.

이 PHB합성효소군의 유전자를 함유하는 단편에 대해서 상거(Sanger)법에 의해 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 지닌 PHB합성효소유전자가 해당 단편중에 존재하는 것이 확인되었다.

다음에, 서열번호 2로 표시되는 PHB합성효소유전자의 개시코돈근방의 염기서열을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 설계 및 합성하고(아머샴 파마시아 바이오텍사), 이 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 이용해서 PCR을 행하여, PHB합성효소유전자를 함유하는 단편을 증폭하였다(LA-PCR키트; 타카라슈조사 제품).

다음에, 이와 같이 해서 얻어진 PCR증폭단편에 대해서 제한효소 BamHI를 이용해서 완전분해하여, 발현벡터 pUC18의 제한효소 BamHI로 절단 및 탈인산화 처리(Molecular Cloning, 1권, 572면, 1989년; Cold Spring Harbor Laboratory출판)한 것에, DNA라이게이션키트 Ver. II(타카라슈조사 제품)를 이용해서 연결하였다.

얻어진 재조합플라스미드로 대장균을 염화칼슘법에 의해 형질전환하고(타카라슈조사), 얻어진 재조합플라스미드로부터 재조합플라스미드 pTB64-phb를 회수하였다.

얻어진 재조합플라스미드로 대장균을 염화칼슘법(타카라슈조사)에 의해 형질전환하여 pTB64-phb재조합균주를 얻었다.

<GST융합 PHB합성효소생산능을 지닌 형질전환체의 제작>

pTB64-phb재조합균주를 LB배지 200㎖에 식균하고, 37℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 12시간배양후, 배양액 200㎖를 글루코스 2%를 함유하는 LB배지 200㎖에 첨가하고(합계 400㎖), 37℃, 125스트로크/분에서 12시간 진탕배양하였다. 이와 같이 해서 얻어진 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 상법에 따라서 플라스미드DNA를 회수하였다.

pTB64-phb에 대해서, 상류측 프라이머로 되는, 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3) 및 하류측 프라이머로 되는 올리고뉴클로오타이드(서열번호 4)를 각각 설계 및 합성하였다(아머샴 파마시아 바이오텍사). 이 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, pTB64-phb를 템플레이트로 해서 PCR를 행하여, 상류에 BamHI제한부위, 하류에 XhoI제한부위를 지닌 PHB합성효소유전자의 전체 길이를 증폭하였다(LA-PCR키트: 타카라슈조사).

정제한 PCR증폭산물을 BamHI 및 XhoI에 의해 소화하고, 플라스미드 pGEX-6P-1(아머샴 파마시아 바이오텍사)에 대응하는 부위에 삽입하였다. 이들 벡터를 이용해서 대장균(JM109)을 형전전환하고, 발현용 균주를 얻었다. 균주의 확인은, Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systerms, Promega사 제품)를 이용해서 대량으로 제조한 플라스미드 DNA를 BamHI 및 XhoI로 처리해서 얻어진 DNA단편의 동정에 의해 행하였다.

<PHB합성효소의 제조>

얻어진 발현용 균주를 앰피실린(100㎍/ℓ)을 함유하는 2×YT배지(폴리펩톤 16g/ℓ, 효모엑스 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, pH 7.0) 100㎖에서 하룻밤 배양하였다.

이것을 암피실린(100㎍/ℓ)을 함유하는 2×YT배지(폴리펩톤 16g/ℓ, 효모엑스 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, pH 7.0) 10ℓ에 첨가하고, 30℃에서 3시간 배양하였다. 그 후, 여기에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종농도 1mM로 되도록 첨가하고, 30℃에서 3시간 배양하였다.

이 배양액을 4℃, 8000g에서 10분간 원심처리하고, 상청액을 제거한 후, 균체펠릿을 4℃의 PBS용액 500㎖에 재현탁하였다. 이 균액을 미리 4℃로 냉각되어 있는 용기에 각 회 40㎖씩 주입하여, 프렌치프레스에 의해서 2200㎏/㎠로 가압하면서 점차로 노즐로부터 균액을 해방함으로써, 균체파쇄처리를 행하였다. 균체파쇄액을 4℃, 8000g에서 10분간 원심처리한 후, 상청액을 회수하였다. 이 상청액을 0.45㎛의 필터로 여과하고, 고형의 오염물을 제거하였다. 상청액중에는, 목적으로 하는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)가 융합된 PHB합성효소가 존재하는 것을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.

다음에, 이 GST융합 PHB합성효소를 글루타티온 세파로스 4B(아머샴 파마시아바이오텍사)로 정제하였다. 글루타티온 세파로스 4B의 75%슬러리 6.65㎖를 4℃, 500g으로 5분간 원심처리하고, 상청액을 제거한 후, 4℃의 PBS용액 200㎖에 재현탁하고, 또, 4℃, 500g으로 5분간 원심처리하고, 상청액을 제거하였다. 얻어진 고형물을 4℃의 PBS용액 5㎖에 재현탁하여, 글루타티온 세파로스 4B의 50%슬러리를 제조하였다.

이 글루타티온 세파로스 4B의 50%슬러리 10㎖에, 상기 제조한 상청액 전체량을 첨가하고, 서서히 진탕해서 어피니티흡착에 의해 글루타티온 세파로스 4B에 상청액중의 목적으로 하는 융합단백질을 흡착시켰다. 그 후, 혼합물을 4℃, 500g에서 5분간 원심처리하고, 상청액을 제거한 후, 고형물을 4℃의 PBS용액 5㎖에 재현탁하였다. 상청액을 마찬가지로 원심처리하고, 상청액을 제거하였다. 얻어진 GST융합PHB합성효소를 고정화한 글루타티온 세파로스 4B를 고정화효소(1)로서 사용하였다.

그 후, PBS용액에의 재현탁과 원심처리를 2회 반복해서 세정한 후, 최후로 5℃의 클리베이지완충액(트리스-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM, 디티오트레이톨 1mM, pH 7) 5㎖에 현탁하였다. 이것에 4%의 프레시션 프로테아제(PreScission Protease: 아머샴 파마시아 바이오텍사)의 클리베이지완충액 0.5㎖를 첨가하고, 5℃에서 4시간 서서히 진탕하였다. 이것을 4℃, 500g에서 5분간 원심처리하고, 상청액을 회수하였다. 다음에, 상기와 마찬가지로 조정한 글루타티온 세파로스 4B의 50% 슬러리 1㎖를, 4℃, 500g으로 5분간 원심처리하고, 상청액을 제거한 후의 글루타티온 세파로스 4B에 앞서 회수한 상청액을 첨가하고, 서서히 교반해서 상청액중에 잔류한 프레시션 프로테아제를 글루타티온 세파로스 4B에 흡착시켰다. 이어서, 4℃, 500g으로 5분간 원심처리하고, 상청액을 회수하였다. 이 상청액은 SDS-PAGE에 의해, 싱글밴드를 나타내어, 정제되어 있는 것을 확인하였다.

또, 함유하는 PHB합성효소활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 먼저, 소혈정 알부민(시그마사 제품)을 0.1M트리스염산완충액(pH 8.0)에 3.0㎎/㎖ 용해시킨 용액 100㎕를 효소용액 100㎕에 첨가해서 혼합하고, 30℃에서 1분간 프리베이킹하였다. 이것에, 3-하이드록시부티릴 CoA를 0.1M트리스염산완충액(pH 8.0)에 3.0mM용해시킨 용액 100㎕를 첨가해서 혼합하고, 30℃에서 1 내지 30분간 잉큐베이트한 후, 트리클로로아세트산을 0.1M트리스염산완충액(pH 8.0)에 10㎎/㎖ 용해시킨 용액 300㎕를 첨가해서 반응을 정지시켰다. 반응정지한 후의 이 용액을 원심분리(15,000×g, 10분간)하고, 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)을 0.1M트리스염산완충액(pH 8.0)에 2.0mM용해시킨 용액 500㎕에 첨가하고, 30℃에서 10분간 잉큐베이트한 후, 412nm의 흡광도를 측정하였다. 그리고, 1분간 1μmol의 CoA를 방출시키는 효소량을 1단위(U)로 하고, 효소활성을 계산하였다. 그 결과, 비(比)활성으로서 7.5U/㎖가 얻어졌다. 이 액을, 라이호겔(Raiho gel)을 첨가해서 한외여과농축하여, 10U/㎖로 한 것을 "정제효소액(1)"로 하였다.

<PHB합성효소를 함유하는 조제의(crude) 효소액의 조제방법>

KK01균주 및 TL2균주를, 효모엑스 0.5% 및 미네랄용액(하기 참조) 0.3%를 함유한 M9배지(하기 조성) 10ℓ에서 30℃, 24시간 배양하고, 회수한 배양액을 4℃, 8000g으로 10분간 원심처리하고, 상청액을 제거한 후, 균체펠릿을 4℃의 PBS용액500㎖에 재현탁하였다. 이 균액을 미리 4℃로 냉각시켜 둔 용기에 각회 40㎖씩 주입하고, 프렌치프레스에 의해서 2200㎏/㎠로 가압하면서 점차로 노즐로부터 균액을 해방함으로써, 균체파쇄처리를 행하였다. 얻어진 균체파쇄액을 4℃, 8000g에서 10분간 원심처리한 후, 상청액을 회수하였다. 이 상청액을 0.45㎛의 필터로 여과하고, 고형의 오염물을 제거하고, 함유하는 PHB합성효소활성을 전술한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 비활성으로서 KK01균주로부터는 1.6U/㎖, TL2균주로부터는 1/2U/㎖가 얻어졌다. 이 액을, 라이호겔을 첨가해서 한외여과농축하여, 10U/㎖로 한 조제의 효소액을, KK01균주유래의 것은 "조제의 효소액(1)", TL2균주유래의 것은 "조제의 효소액(2)"로 하였다.

(M9배지)

Na₂HPO₄6.2g

KH₂PO₄3.0g

NaCl 0.5g

NH₄Cl 1.0g

(배지 1ℓ중; pH 7.0)

(미네랄용액)

니트릴로트리아세트산 1.5g

MgSO₄3.0g

MnSO₄0.5g

NaCl 1.0g

FeSO₄0.1g

CaCl₂0.1g

CoCl₂0.1g

ZnSO₄0.1g

CuSO₄0.1g

AlK(SO₄)₂0.1g

H₃BO₃0.1g

Na₂MoO₄0.1g

NiCl₂0.1g

(용액 1리터중, pH 7.0)

<실시예 1>

GST융합 PHB합성효소를 고정화한 글루타티온 세파로스 4B를 코어로 한 본 발명의 캡슐구조체를 하기 방법으로 제조하였다.

고정화효소(1) 1질량부를 0.1M인산완충액(pH 7.0) 48질량부에 현탁하고, 3-하이드록시부티릴 CoA(시그마 알드리치 저팬사 제품) 1질량부 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2시간 서서히 진탕하였다.

상기 반응액 10㎕를 슬라이드글래스상에 채취하고, 1%나일블루 A 수용액 10㎕를 첨가하고, 슬라이드글래스상에서 혼합한 후, 커버글래스를 올려 놓고, 형광현미경(330 내지 380nm 여기필터, 420nm롱패스흡수필터, 니콘사 제품)관찰을 행하였다. 그 결과, 글루타티온 세파로스 4B표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 해당 글루타티온 세파로스 4B는 PHB에 의해 표면이 피복되어 있는 것을 알 수 있었다.

대조로서, 0.1M인산완충액(pH 7.0) 90질량부에 글루타티온 세파로스 4B 10질량부를 첨가하고, 30℃에서 2.5시간 서서히 진탕한 후, 마찬가지로 나일블루 A로 염색해서 형광현미경관찰을 행하였다. 그 결과, 글루타티온 세파로스 4B표면은 형광을 발하지 않았다.

또, 상기 PHB피복입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 진공건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 외피를 이루는 PHB를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과하고, 회전식 증발기로 감압농축한 후, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피로 모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 이 추출물은 3-하이드록시부티르산유닛으로 이루어진 PHB인 것으로 확인되었다.

또한, 해당 PHB의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC: 토소 HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 결과, Mn = 34,000, Mw = 54,000이었다.

<실시예 2>

정제된 PHB합성효소를 이용해서, 알루미나를 코어재료로 한 본 발명의 캡슐구조체를 하기 방법으로 제조하였다.

정제 효소액(1) 10질량부에 알루미나입자(입자직경: 0.12 내지 135㎛) 및 PBS 39질량부를 첨가하고, 30℃에서 30분간 서서히 진탕해서 PHB합성효소를 알루미나표면에 흡착시켰다. 이 알루미나입자를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 침전을 PBS용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)해서 고정화 효소를 얻었다.

상기 고정화 효소를 0.1M인산완충액(pH 7.0) 48질량부에 현탁하고, 3-하이드록시부티릴 CoA(시그마 알드리치 저팬사 제품) 1질량부 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2시간 서서히 진탕하였다.

상기 반응액 10㎕를 슬라이드글래스상에 채취하고, 1%나일블루 A 수용액 10㎕를 첨가하고, 슬라이드글래스상에서 혼합한 후, 커버글래스를 올려 놓고, 형광현미경(330 내지 380nm 여기필터, 420nm롱패스흡수필터, 니콘사 제품)관찰을 행하였다. 그 결과, 알루미나입자표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 해당 알루미나입자표면은 PHB에 의해 표면이 피복되어 있는 것을 알 수 있었다.

대조로서, 0.1M인산완충액(pH 7.0) 49질량부에 알루미나입자 1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2.5시간 서서히 진탕한 후, 마찬가지로 나일블루 A로 염색해서 형광현미경관찰을 행하였다. 그 결과, 알루미나입자표면은 형광을 발하지 않았다.

또, 상기 PHB피복입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 진공건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 외피를 이루는 PHB를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과하고, 회전식 증발기에 의해 감압농축한 후, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피/질량분광분석(GC/MS, 시마즈QP-5050, EI법)하여, 모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 해당 추출물은, 3-하이드록시부티르산유닛으로 이루어진 PHB인 것으로 확인되었다.

또, 해당 PHB의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC: 토소HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 결과, Mn = 31,000, Mw = 50,000이었다.

<실시예 3>

PHB합성효소액을 함유하는 조제의 효소액을 이용해서, 알루미나를 코어재료로 한 본 발명의 캡슐구조체를 하기 방법으로 제조하였다.

조제의 효소액(1) 10질량부에 알루미나입자(입자직경: 0.12 내지 135㎛) 및 PBS 39질량부를 첨가하고, 30℃에서 30분간 서서히 진탕해서 PHB합성효소를 알루미나표면에 흡착시켰다. 이 알루미나입자를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 침전을 PBS용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)해서 고정화 효소를 얻었다.

상기 고정화 효소를 0.1M인산완충액(pH 7.0) 48질량부에 현탁하고, 3-하이드록시부티릴 CoA(시그마 알드리치 저팬사 제품) 1질량부 및 소혈청알부민(시그마사제품) 0.1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2시간 서서히 진탕하였다.

또, 상기 PHB피복입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 진공건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 외피를 이루는 PHB를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과하고, 회전식 증발기에 의해 감압농축한 후, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피/질량분광분석(GC/MS, 시마즈QP-5050, EI법)하여, 모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 해당 추출물은 3-하이드록시부티르산유닛으로 이루어진 PHB인 것으로 확인되었다.

또, 해당 PHB의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC: 토소HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 결과, Mn = 28,000, Mw = 45,000이었다.

<실시예 4>

조제의 효소액(2) 10질량부에 알루미나입자(입자직경: 0.12 내지 135㎛) 및 PBS 39질량부를 첨가하고, 30℃에서 30분간 서서히 진탕해서 PHB합성효소를 알루미나표면에 흡착시켰다. 이 알루미나입자를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하고, 침전을 PBS용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)해서 고정화 효소를 얻었다.

또, 상기 PHB피복입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 진공건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 외피를 이루는 PHB를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과하고, 회전식 증발기에 의해 감압농축한 후, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피/질량분광분석(GC/MS, 시마즈QP-5050, EI법)하여, 모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 이 추출물은, 3-하이드록시부티르산유닛으로 이루어진 PHB인 것으로 확인되었다.

또, 해당 PHB의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC: 토소HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보러터리 PLgel MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 결과, Mn = 29,000, Mw = 46,000이었다.

<실시예 5>

3ℓ의 4입구의 세퍼러블플라스크에, 환류냉각기, 온도계, 질소도입관 및 교반기를 부착하고, 이 플라스크속에 하기 조성으로 이루어진 혼합물을 투입하고, 고속교반장치 TK-호모믹서로 10,000rpm, 10분간 교반해서 입자를 형성하였다. 그 후, 회전수를 1,000rpm으로 감속하고, 질소가스에 의한 버블링을 충분히 행하였다. 다음에, 교반기 블레이드를 초승달형상의 블레이드로 변경하고, 서서히 교반함과 동시에 80℃로 가열된 오일욕중에서 16시간 중합하였다.

탈이온수1200부

폴리비닐알콜 15부

도데실황산나트륨 0.1부

스티렌모노머 75부

아크릴산 n-부틸 25부

디-t-부틸살리실산 크롬착체 5부

구리프탈로시아닌 5부

2,2-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) 6부

중합반응종료후, 반응플라스크를 실온으로 냉각하고, 분산액을 5회의 데칸테이션에 의해 세정하고, 여과, 수세, 건조해서, 청색의 분체인 코어입자(1)을 얻었다. 얻어진 코어입자를 콜터카운터멀티사이저(콜터카운터사 제품)를 이용해서 측정한 바, 중량평균입자직경으로 6.5㎛였다.

또, 이 코어입자(1)의 유리전이온도(Tg)를 시차주사열량계(퍼킨엘머사 제품인 DSC-7)에 의해서 측정한 바, 88.5℃였다.

이 코어입자(1)의 캡슐화는 다음과 같이 행하였다.

정제 효소액(1) 10질량부에 코어입자(1) 1질량부 및 PBS 39질량부를 첨가하고, 30℃에서 30분간 서서히 진탕하고, PHB합성효소를 코어입자표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하고, 침전을 PBS용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)해서 고정화 효소를 얻었다.

상기 고정화 효소를 0.1M인산완충액(pH 7.0) 49질량부에 현탁하고, 3-하이드록시부티릴 CoA(시그마 알드리치저팬사 제품) 1질량부 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2시간 서서히 진탕하였다.

반응종료후, 얻어진 입자를 여과에 의해 회수하여, 수세후, 40℃, 4시간 감압건조해서, 청색의 캡슐토너(1)을 얻었다. 이 캡슐토너(1)의 중량평균입자직경을 전술한 바와 마찬가지로 측정한 바, 7.1㎛였다.

또, 이 캡슐토너(1)의 유리전이온도(Tg)를 전술한 바와 마찬가지로 측정한 바, 70.8℃였다.

이 캡슐토너(1)를 광학현미경에 의해 관찰한 결과, 원활한 표면을 지닌 입자의 내부에 청색의 코어입자의 존재가 확인되었다.

또, 캡슐토너(1)를 도전성 테이프에 의해 알루미늄 시료대에 고정하고, 이온코터에 의해 금을 얇게 증착하였다. 주사형 전자현미경에 의해 고분자미립자의 형상을 관찰한 바, 표면이 평활한 캡슐외피에 의해서 코어입자(1)가 완전히 피복되어 있는 것으로 확인되었다.

또한, 캡슐토너(1)를 에폭시수지로 경화한 후, 미크로톰(microtome)에 의해 초박편으로 절단하고, 4산화오스뮴에 의해 염색한 후, 투과형 전자현미경에 의해, 확대배율 10,000 내지 100,000배로 관찰한 바, 1개의 코어와, 1개의 외피로 이루어진 2층구조를 지닌 캡슐구조가 관찰되었다. 그리고, 염색의 농도차로부터 외피의 두께를 구한 바, 평균 0.34㎛였다.

이 측정결과를 이용해서 캡슐토너(1)가 점유하는 청색코어입자(1)의 체적비율을 구한 바, 77%(V/V)였고, 캡슐구조체중에 고밀도로 착색제성분인 코어입자가 충전되어 있는 것을 알 수 있었다.

다음에, 캡슐토너(1) 10질량부에 대해서, 해쇄처리한 BET치 36㎡/g의 소수성 실리카 0.2부를 헨셸믹서로 혼합해서 토너조성물(1)로 하였다.

제작한 토너의 화상평가를 행하기 위해, 상기에서 얻어진 토너 6부에 대해서, 캐리어(평균입자직경이 35㎛인 페라이트코어에 실리콘수지를 코팅한 것) 94부를 폴리에틸렌병에 넣고, 텀블링믹서에 의해 혼합교반해서 2성분현상제(1)을 제작하였다. 그리고, 이 현상제를 캐논사제품인 풀칼라레이저카피어복사기 CLC-500의 개조기에 탑재하고, 23℃, 60%RH환경하, 초기 및 10,000장 복사후의 화상에 대해서 SEM으로 관찰하고, 화질의 평가 및 현상제의 열화상태의 평가를 행하였다.

화질의 평가로서는, 1화소내에서의 레이저의 펄스폭변조(PWM)에 의한 다치기록에 의해, 극소스폿의 재현성을 현미경관찰에 의해 평가하였다. 그 결과, 얻어진 화상은, 하프톤(half-tone)의 도트재현성이, 초기 및 10,000장 복사후에도 매우 양호하였고, 현상기 및 감광부재의 오염도 발생하지 않았다.

또, 토너의 내블로킹성의 평가를 행하기 위해, 50 내지 70℃까지 1℃ 간격으로 설정한 온도하에, 상기에서 얻어진 토너조성물(1)을 각각 3일간 방치한 후의 내블로킹성을 관찰하고, 각 토너조성물을 전술한 캐리어를 이용해서 마찬가지로 현상화해서 화상평가를 행하였다. 그리고, 하이라이트영역의 화상조도(roughness)가 변화하는 점을 내블로킹온도로 하였다. 그 결과, 토너조성물(1)의 내블로킹온도는 62℃로 높아, 내블로킹성이 우수한 것을 알 수 있었다.

토너의 정착성의 평가로서, CLC-500과 마찬가지 정착기구성을 지닌 별개의 정착기에 의한 정착시험을 행하였다. 정착시험의 방법으로서는, 폭 2㎝, 길이 10㎝의 단책(短冊)을 만들고, 그 위의 미정착화상을, 상부롤러의 온도를 모니터하면서 단책의 길이방향을 따라서 롤러를 통과시킴으로써 정착시켜, 얻어진 정착화상에대해서, 단책의 후부에 오프셋이 보이는 지의 여부로 정착성을 판단하였다. 그 결과, 정착개시온도가 97℃로 낮아, 저온정착성이 우수한 것을 알 수 있었다.

<비교예 1>

캡슐토너(1)대신에, 코어입자(1)을 캡슐화시키지 않고 그대로 토너조성물 및 2성분현상제로 사용해서 실시예 5와 마찬가지의 평가를 행하였다. 그 결과, 내블로킹온도는 74℃로 높았으나, 정착개시온도가 115℃로 높았다.

<실시예 6>

하기 조성의 혼합물을 150 내지 180℃로 조정된 혼련기에서 10분간 용융혼련처리하고, 냉각 및 고형화시켰다. 이어서, 이 고형물을 조분쇄기에 의해 대강 분쇄한 후, 제트밀로 미분쇄를 행하고, 또한, 기류식 분급기에 의해 분급해서, 흑색의 분체인 코어입자(2)를 얻었다.

폴리에스테르수지100부

카본블랙 6부

디-t-부틸살리실산크롬착체 5부

얻어진 코어입자(2)를, 콜터카운터멀티사이저(콜터카운터사 제품)를 이용해서 측정한 바, 중량평균입자직경이 4.3㎛였고, 이 코어입자(2)의 유리전이온도(Tg)를 시차주사열량계(퍼킨엘머사 제품인 DSC-7)에 의해서 측정한 바, 42.6℃였다.

이 코어입자(2)의 캡슐화는 다음과 같이 행하였다. 조제의 효소액(1) 10질량부에 코어입자(2) 1질량부 및 PBS 39질량부를 첨가하고, 30℃에서 30분간 서서히 진탕하고, PHB합성효소를 코어입자표면에 흡착시켰다. 해당 코어입자를원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하고, 침전을 PBS용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)해서 고정화 효소를 얻었다.

얻어진 고정화 효소를 0.1M인산완충액(pH 7.0) 49질량부에 현탁하고, 3-하이드록시부티릴 CoA(시그마 알드리치저팬사 제품) 1질량부 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2시간 서서히 진탕하였다. 반응종료후, 얻어진 입자를 여과에 의해 회수하여, 수세후, 40℃, 4시간 감압건조해서, 흑색의 캡슐토너(2)를 얻었다. 이 캡슐토너(2)의 중량평균입자직경을 전술한 바와 마찬가지로 측정한 바, 4.8㎛였다.

또, 이 캡슐토너(2)의 유리전이온도(Tg)를 전술한 바와 마찬가지로 측정한 바, 70.2℃였다.

이 캡슐토너(2)를 광학현미경에 의해 관찰한 결과, 평활한 표면을 지닌 입자의 내부에 흑색의 코어입자의 존재가 확인되었다.

또, 실시예 5와 마찬가지로 주사형 전자현미경에 의한 관찰을 행한 바, 표면이 평활한 캡슐외피에 의해서 코어입자(2)가 완전히 피복되어 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 캡슐은, 투과형 전자현미경에 의해, 1개의 코어와, 1개의 외피로 이루어진 2층구조를 지닌 것으로 확인되었다. 그리고, 염색의 농도차로부터 외피의 두께를 구한 바, 평균 0.26㎛였다.

이 측정결과를 이용해서, 캡슐토너(2)가 점유하는 흑색코어입자(2)의 체적비율을 구한 바, 73%(V/V)였고, 캡슐구조체중에 고밀도로 착색성분으로서 해당 코어입자가 존재하는 것을 알 수 있었다.

다음에, 실시예 5와 마찬가지로, 소수성 실리카의 첨가에 의해 토너조성물(2)를 제조하였다. 이 현상제(2)로 형성한 화질의 평가 및 현상제(2)의 열화상태의 평가를 행하였다. 그 결과, 얻어진 화상은, 하프톤의 도트재현성이, 초기 및 10,000장 복사후에도 매우 양호하였고, 현상기 및 감광부재의 오염도 발생하지 않았다. 또, 토너의 파손이나 분쇄도 전혀 없고, 캐리어표면에의 토너스펜트도 관찰되지 않았다.

또한, 실시예 5와 마찬가지로 토너의 내블로킹성의 평가를 행하였다. 그 결과, 토너조성물(2)의 내블로킹온도는 60℃로 높아, 내블로킹성이 우수한 것을 알 수 있었다.

또, 실시예 5와 마찬가지로 정착성의 평가를 행한 결과, 정착개시온도가 94℃로 낮아, 저온정착성이 우수한 것을 알 수 있었다.

<비교예 2>

캡슐토너(2)대신에, 코어입자(2)를 캡슐화시키지 않고 그대로 토너조성물 및 2성분현상제로 사용해서 실시예 5와 마찬가지의 평가를 행하였다. 그 결과, 정착개시온도가 92℃로 낮아, 저온정착성은 우수하였으나, 내블로킹온도는 51℃로 낮아, 내블로킹성이 열등한 것을 알 수 있었다.

<실시예 7>

하기 조성의 혼합물을 150 내지 180℃로 조정된 혼련기에서 10분간 용융혼련처리하고, 냉각 및 고형화시켰다. 이어서, 이 고형물을 조분쇄기에 의해 대강 분쇄한 후, 제트밀로 미분쇄를 행하고, 또한, 기류식 분급기에 의해 분급해서, 흑색의 분체인 코어입자(3)을 얻었다.

에폭시수지100부

C.I.피그먼트옐로 12 6부

디-t-부틸살리실산크롬착체 5부

얻어진 코어입자(3)을, 콜터카운터멀티사이저(콜터카운터사 제품)를 이용해서 측정한 바, 중량평균입자직경이 7.5㎛였고, 시차주사열량계(퍼킨엘머사 제품인 DSC-7)에 의해서 측정한 유리전이온도(Tg)는, 88.5℃였다.

이 코어입자(3)의 캡슐화는 다음과 같이 행하였다. 조제의 효소액(2) 10질량부에 코어입자(3) 1질량부 및 PBS 39질량부를 첨가하고, 30℃에서 30분간 서서히 진탕하고, PHB합성효소를 코어입자표면에 흡착시켰다. 해당 코어입자를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하고, 침전을 PBS용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)해서 고정화 효소를 얻었다.

상기 고정화 효소를 0.1M인산완충액(pH 7.0) 48질량부에 현탁하고, 3-하이드록시부티릴 CoA(시그마 알드리치저팬사 제품) 1질량부 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1질량부를 첨가하고, 30℃에서 2시간 서서히 진탕하였다. 반응종료후, 얻어진 입자를 여과에 의해 회수하여, 수세후, 40℃, 4시간 감압건조해서, 황색의 캡슐토너(3)을 얻었다. 이 캡슐토너(3)의 중량평균입자직경을 전술한 바와 마찬가지로 측정한 바, 8.4㎛였다. 또, 이 캡슐토너(3)의 유리전이온도(Tg)를 전술한 바와 마찬가지로 측정한 바, 70.8℃였다.

이 캡슐토너(2)의 입자를 광학현미경에 의해 관찰한 결과, 평활한 표면을 지닌 입자의 내부에 황색의 코어입자의 존재가 확인되었다.

또, 실시예 5와 마찬가지로 주사형 전자현미경에 의한 관찰을 행한 바, 표면이 평활한 캡슐외피에 의해서 코어입자(3)가 완전히 피복되어 있는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 캡슐은, 투과형 전자현미경에 의해, 1개의 코어와, 1개의 외피로 이루어진 2층구조를 지닌 것으로 확인되었다. 그리고, 염색의 농도차로부터 외피의 두께를 구한 바, 평균 0.47㎛였다.

이 측정결과를 이용해서, 캡슐토너(3)이 점유하는 황색코어입자(3)의 체적비율을 구한 바, 71%(V/V)였고, 캡슐구조체중에 고밀도로 착색성분으로서 해당 코어입자가 존재하는 것을 알 수 있었다.

다음에, 실시예 5와 마찬가지로, 소수성 실리카의 첨가에 의해 토너조성물(3)을 제조하고, 이로부터 2성분현상제(3)을 제조하였다. 이 현상제(3)으로 형성한 화질의 평가 및 현상제(3)의 열화상태의 평가를 행하였다. 그 결과, 얻어진 화상은, 하프톤의 도트재현성이, 초기 및 10,000장 복사후에도 매우 양호하였고, 현상기 및 감광부재의 오염도 발생하지 않았다. 또, 토너의 파손이나 분쇄도 전혀 없고, 캐리어표면에의 토너스펜트도 관찰되지 않았다.

또한, 실시예 5와 마찬가지로 토너의 내블로킹성의 평가를 행하였다. 그 결과, 토너조성물(3)의 내블로킹온도는 62℃로 높아, 내블로킹성이 우수한 것을 알 수 있었다.

또, 실시예 5와 마찬가지로 정착성의 평가를 행한 결과, 정착개시온도가 98℃로 낮아, 저온정착성이 우수한 것을 알 수 있었다.

<비교예 3>

캡슐토너(3)대신에 코어입자(3)을 캡슐화하지 않은 상태에서 토너조성물 및 2성분현상제로서 사용해서, 실시예 5와 마찬가지의 평가를 행한 결과 내블로킹온도는 77℃로 충분히 높았으나, 정착개시온도가 바람직하지 않게 119℃로 높았다.

이상, 본 발명에 의하면, 입상체의 재질의 제약이 없고, 입상체가 고밀도로 내포된 scl-PHA를 외피로 하는 입상 구조체를 제공하는 것이 가능해진다. 또, 본 발명에 의하면, 상기의 우수한 입상 구조체를, 계면활성제, 중합반응제 등에 의해서 오염되지 않고, 또, 유기용매를 사용하지 않는 간편한 제조방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 입상 구조체를 이용해서, 저온정착성과 내블로킹성을 발휘할 수 있는 전자사진용 토너를 제공할 수 있다. 나아가서는, 본 발명의 입상 구조체의 제조방법을 이용한, 상기 전자사진용 토너의 제조방법을 제공할 수 있다.

이상, 각종 실시예를 참조해서 본 발명을 상세히 설명하였으나, 본 발명으로부터 일탈하는 일없이 보다 폭넓은 양상으로 각종 변형과 수정이 가능함은 명백하므로, 본 발명은, 본 발명의 진의내에서 그러한 모든 변형과 수정을 망라하도록 첨부한 청구범위를 작성하였다.

(참고로 서열목록을 첨부한다)

Claims

3-하이드록시프로피온산, 3-하이드록시-n-부티르산 및 3-하이드록시-n-발레르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트로 적어도 일부가 피복된 입상체를 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
제 1항에 있어서, 상기 입상체가 착색제를 적어도 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
제 2항에 있어서, 상기 착색제가 안료를 적어도 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
제 1항에 있어서, 상기 입상체가 안료입자인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
3-하이드록시프로피온산, 3-하이드록시-n-부티르산 및 3-하이드록시-n-발레르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트로 적어도 일부가 피복된 입상체를 지닌 입상 구조체를 제조하는 방법에 있어서,

입상체를 수성 매체에 분산시키는 공정과;

상기 수성 매체에 분산된 입상체의 표면에 폴리하이드록시알카노에이트합성효소를 고정화하는 공정과;

3-하이드록시프로필오닐보조효소 A, 3-하이드록시부티릴보조효소 A 및 3-하이드록시발레릴보조효소 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 보조효소를 중합시킴으로써, 폴리하이드록시알카노에이트를 합성시켜, 해당 폴리하이드록시알카노에이트로 상기 입상체의 적어도 일부를 피복하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 입상체가 착색제를 적어도 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 착색제가 안료를 적어도 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 입상체가 안료입자인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트합성효소가, 해당 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 생산능을 지닌 미생물에 의해 생산되거나, 또는해당 생산능에 관여하는 유전자를 도입한 형질전환체에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 생산능을 지닌 미생물이, 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KK01(FERM BP-4235), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64(FERM BP-6933) 및 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) TL2(FERM BP-6913)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 미생물인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
제 1항에 의한 입상 구조체를 함유하는 것을 특징으로 하는 전자사진용 토너.
제 1항에 의한 입상 구조체로 이루어진 것을 특징으로 하는 전자사진용 토너.
제 5항에 의한 방법을 이용해서 입상 구조체를 제조하는 공정을 적어도 구비하는 것을 특징으로 하는 전자사진용 토너의 제조방법.