KR20040103810A - 폴리히드록시알카노에이트의 제조에 이용되는 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 의하면, 예를 들면, 하기 식(1)로 표시되는 모노머유닛 조성을 가지는 폴리히드록시알카노에이트를 제조하는 데 이용되는 미생물, 구체적으로는, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91균주(FERM BP-7373)가 제공된다:

A_mB_(1-m)(1)

[식중, A는 하기 식(2)로 표시되고, B는 하기 식(3) 또는 하기 식(4)로 표시되는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개이상이고, m은 0.01이상 1미만임]

(상기 식 중에서, n은 0∼10의 정수이고, k는 3 또는 5이고, R은 하기 식(5) 내지 하기 식(7)로 표시되는 기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개이상의 기임)

(상기 식(5)중에서, R1은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, q는 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 식(6)중에서, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇으로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R은 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 식(7)중에서, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, s는 1∼8의 정수로부터 선택됨).

Description

폴리히드록시알카노에이트의 제조에 이용되는 미생물{MICROORGANISMS USED FOR PRODUCTION OF POLYHYDROXYALKANOATE}

본 발명은 신규한 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 제조에 이용되는 미생물에 관한 것이다.

석유로부터 유래된 합성고분자는 오랜동안 플라스틱 등으로서 사용되어 왔다. 근년에, 사용된 플라스틱의 처리가 심각한 사회문제의 하나로 대두되고 있다. 이들 합성고분자는 분해되기 어려운 장점을 가지고 있어 금속이나 유리재료 대신에 사용되어 왔다. 그러나, 대량소비 및 대량폐기시에 이와 같이 분해되기 어려운 특징으로 인해 폐기물 처리시설물에 축적되거나, 또는 이들을 소각할 때에 이산화탄소의 배출이 증가되어 다이옥신과 내분비방해물 등의 해로운 물질이 발생되어 환경을 오염시킨다. 한편, 폴리-3-히드록시낙산으로 대표되는 미생물에 의해 생성된 폴리히드록시알칸산(PHA)(이제부터는 "미생물생산 폴리에스테르"로 칭함)은 종래의 플라스틱과 마찬가지로, 용융가공 등으로 다양한 종류의 제품을 생산하는 데 이용될 수 있고, 또는 석유로부터 유래된 합성중합체와는 달리 유기체에 의해 분해될 수 있다. 따라서, 미생물생산 폴리에스테르는 생분해되어, 폐기된 경우 자연계의 물질순환에 편입되고, 또한 다수의 종래의 합성고분자 화합물과 달리 자연환경에 잔류하는 오염을 일으키지 않는다. 더욱이, 미생물생산 폴리에스테르는, 소각처리가 요구되지 않으므로, 공기 오염과 지구온난화를 방지하는 관점에서 또한 효과적이다. 따라서, 미생물생산 폴리에스테르는 환경보존이 가능한 플라스틱으로서 사용될 수 있다. 또한, 미생물생산 폴리에스테르를 의료용 연질재료에 응용하는 것이 고려중에 있다(일본국 특개평 5-159호, 일본국 특개평 6-169980호, 일본국 특개평 6-199988호, 일본국 특개평 6-225921호 등).

지금까지, 각종 미생물이, PHB 또는 기타 히드록시알칸산을 생산하여 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있다(생분해성 플라스틱 연구회에서 편집하고 1995년에 NTS 주식회사에서 발행된 "생분해성 플라스틱 핸드북"의 178페이지 내지 197페이지).

이러한 미생물생산 PHA는, 그 생산에 이용되는 미생물의 종류, 배지조성 및 배양조건 등에 의해 다양한 조성과 구조를 가지는 것이 알려져 있고, 또한 지금까지, PHA의 특성의 개선의 관점에서 이들 조성과 구조의 제어에 관한 연구가 행해져왔다.

예를들면, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus) H16(ATCC No. 17699)과 이것의 돌연변이의 균주는 배양시의 탄소원에 따라서 다양한 조성비로 3-히드록시낙산(3HB)과 3-히드록시길초산(3HV)과의 중합체를 생산하는 것이 보고되어 있다(일본국 특공평 6-15604호, 일본국 특공평 7-14352호, 일본국 특공평 8-19227호 등).

일본국 특개평 5-74492호에는, 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 파라코쿠스 속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)을 3 내지 7개의 탄소를 가지는 1차 알코올과 접촉시킴으로써 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.

일본국 특개평 5-93049호 및 일본국 특개평 7-265065호에는, 올레인산이나 올리브유를 탄소원으로서 사용하여 아에로모나스 캐비애(Aeromonas caviae)를 배양함으로써 3HB와 3-히드록시헥산산(3HHx)과의 2성분 공중합체가 생산되는 것이 개시되어있다.

일본국 특개평 9-191893호에는, 코마모나스 액시도보란스 IFO 13852균주(Comamonas acidovoransIFO 13852)가 글루콘산과 1,4-부탄디올을 탄소원으로서 이용한 배양에 의해 4-히드록시낙산과 3HB를 모노머유닛으로서 지니는 폴리에스테르를 생산하는 것에 대하여 개시되어 있다.

또한, 최근에는, 대략 12개까지의 탄소를 가지는 중간사슬길이(medium-chain-length: mcl)의 3-히드록시알칸산(3HA)으로 이루어진 PHA에 관한 연구가 활발하다. 합성경로는 대체로 두가지 유형으로 분류될 수 있고, 이들의 구체예를 하기 (1) 및 (2)에 나타낸다.

(1) β산화를 이용한 합성

슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347에 탄소원으로서 지방족 탄화수소를 제공함으로써 6 내지 12개의 탄소를 가지는 3-히드록시알카노에이트의 모노머유닛을 가지는 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다.

또한, 1992년에 발행된 Appl. Environ. Microbiol.의 746, 58(2)에는, 슈도모나스 레지노보란스(Pseudomonas resinovorans)가 단일의 탄소원으로서 옥탄산을 사용하여, 모노머유닛으로서 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산 및 3-히드록시데칸산을 1:15:75:9의 비율로 가지는 폴리에스테르를 생산하고, 또한 단일의 탄소원으로서 헥산산을 사용하여, 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산 및 3-히드록시데칸산(양비 8:62:23:7)을 모노머유닛으로서 지니는 폴리에스테르를 생산하는 것이 보고되어 있다. 여기서, 출발 지방산의 사슬길이보다도 긴 사슬길이를 가지는 3HA 모노머유닛은 다음의 (2)에서 설명할 지방산 합성 경로를 통해 제조되는 것으로 가정한다.

(2) 지방산합성경로를 이용한 합성

1994년에 발행된 인터내셔널 저널 바이올러지 매크로몰리큘(Int. J. Biol. Macromol.) 16(3), 119에는, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 61-3 균주가, 단일의 탄소원으로서 글루콘산나트륨을 사용하여, 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산, 3-히드록시도데칸산 등의 3-히드록시알칸산 및 3-히드록시-5-시스-데센산, 3-히드록시-5-시스-도데센산 등의 3-히드록시알켄산으로 이루어진 폴리에스테르를 생산하는 것이 보고되어 있다.

그런데, 통상, PHA의 생합성은, 세포내의 다양한 대사경로의 중간체로서 생기는 "D-3-히드록시아실-CoA"를 기질로서 사용하는 PHA 신타아제(합성효소)에 의해 행해진다.

여기서, "CoA"는 "보조효소 A"를 의미한다. 또한 상기 (1)의 종래기술에 개재되어 있는 바와 같이, PHA의 생합성은 옥탄산과 노난산 등의 지방산을 탄소원으로서 이용하는 경우에 출발물질인 "β 산화 사이클"에서 발생하는 "D-3-히드록시아실-CoA"에 의해 행해진다.

"β 산화 사이클"을 경유해서 PHA가 합성되는 반응을 이하 표시한다.

한편, 상기 (2)의 종래기술에서 설명한 바와 같이 글루코스 등의 당류를 사용하여 PHA를 생합성하는 경우에, "지방산 합성경로"에서 생기는 "D-3-히드록시아실-ACP"로부터 변환된 "D-3-히드록시아실-CoA"를 출발물질로 해서 생합성이 행해진다.

여기서, "ACP"는 "아실운반체 단백질(acyl carrier protein)"을 의미한다.

그런데, 이전에 설명한 바와 같이, 상기한 (1), (2)의 양자에서 합성된 PHA는 측쇄에 알킬기를 가지는 모노머유닛으로 이루어진 PHA이다. 그러나, 이와 같은 미생물생산 PHA의 보다 넓은 범위의 응용, 예를들면 기능성 폴리머로서의 응용을 고려한 경우, 다양한 치환기(예를 들면 페닐기)를 측쇄에 도입한 PHA는 상당히 유용할 것으로 기대된다. 이와 같은 PHA의 합성에 관련하여, β산화를 사용한 합성에 대해서는, 예를들면 1991년에 발행된 Macromolecules, 24의 5256 내지 5260페이지에, 측쇄에 아릴기 등을 도입한 PHA에 관한 보고가 있다. 구체적으로는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가, 5-페닐길초산과 노난산(몰비는 2:1이고 전체농도는 10mmol/ℓ임)을 기질로 사용하여, 3-히드록시길초산, 3-히드록시헵탄산, 3-히드록시노난산, 3-히드록시운데칸산 및 3-히드록시-5-페닐길초산(양비가 0.6:16.0:41.1:1.7:40.6임)을 유닛으로 하는 폴리에스테르를, 배양액 1ℓ당 160mg(균체질량에 대한 건조중량비가 31.6%임) 생산하고, 또한 5-페닐길초산과 옥탄산(몰비는 1:1이고 전체농도는 10mmol/ℓ임)을 사용하여, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산 및 3-히드록시-5-페닐길초산(양비가 7.3:64.5:3.9:24.3임)을 유닛으로 하는 폴리에스테르를, 배양액 1ℓ당 200mg(균체질량에 대한 건조무게의 비율이 39.2%임) 생산한다.

이 보고에 있어서의 PHA는, 노난산과 옥탄산이 사용되는 사실 때문에 주로β산화경로를 거쳐 합성되고 있는 것으로 여겨진다.

상기한 바와 같이, 미생물생산 PHA에 있어서는, 다양한 종류의 조성/구조를 가진 PHA는, 생산시에 사용하는 미생물의 종류, 배지의 조성, 배양조건을 변경함으로써 얻을 수 있지만, 미생물생산 PHA를 플라스틱으로서 응용하는 것을 고려하면, 특성의 관점에서 볼 때 상기 PHA는 아직 충분하다고는 말할 수 없다.

미생물생산 PHA의 유용성의 범위를 보다 확장하기 위해서, 그 특성을 개선하는 것을 보다 폭넓게 고려하는 것이 중요하고, 또한 이를 위해, 보다 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA의 제조방법 및 바람직한 PHA를 효율적으로 생산하게 하는 미생물의 연구 및 개발이 필수적이다.

한편, 이전에 설명한 바와 같이 측쇄에 치환기를 도입한 타입의 PHA는, 도입한 치환기를 소망으로 하는 특성에 따라서 선택함으로써, 도입한 치환기 특성 등으로부터 초래되는 매우 유용한 기능성 및 특성을 가지는 "기능성 폴리머(Functional polymer)"로서 PHA를 개발하는 것을 기대할 수 있고, 또한 그와 같은 기능성과 생분해성을 양립가능하게 하는 우수한 PHA와, 그 PHA의 제조방법 및 바람직한 PHA를 효율적으로 생성할 수 있는 미생물에 대한 연구 및 개발이 또한 중요한 도전이 될 수 있다.

이러한 치환기를 측쇄에 도입한 PHA의 다른 예로서는, 상기한 페닐기 및 페녹시기를 측쇄에 가지는 PHA를 들 수 있다.

페닐기의 다른 예에 대해서는, 1996년에 발행된 Macromolecules, 29권, 1762 내지 1766페이지에, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가, 5-(4-톨릴)길초산(5-(4-메틸페닐)길초산)을 기질로서 함유하는 배지에서의 배양에 의해, 3-히드록시-5-(4-톨릴)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.

또한, 1999년에 발행된 Macromolecules, 32권, 2889 내지 2895페이지에, 슈도모나스 올레오보란스가, 5-(2,4-디니트로페닐)길초산을 기질로서 함유하는 배지에서의 배양에 의해 3-히드록시-5-(2,4-디니트로페닐)길초산 및 3-히드록시-5-(4-니트로페닐)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.

또한, 페녹시기의 일례에 대해서는, 1994년에 발행된 Macromol, Chem. Phys., 195권, 1665 내지 1672페이지에, 슈도모나스 올레오보란스가, 11-페녹시운데칸산으로부터 3-히드록시-5-페녹시길초산과 3-히드록시-9-페녹시노난산을 유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.

또한, 1996년에 발행된 Macromolecules, 29권, 3432 내지 3435페이지에는, 슈도모나스 올레오보란스를 이용해서, 6-페녹시헥산으로부터 3-히드록시-4-페녹시낙산 및 3-히드록시-6-페녹시헥산산을 유닛으로서 함유하는 PHA와, 8-페녹시옥탄산으로부터 3-히드록시-4-페녹시낙산, 3-히드록시-6-페녹시헥산산 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산을 유닛으로서 함유하는 PHA 및 11-페녹시운데칸산으로부터 3-히드록시-5-페녹시길초산 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산을 유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 이 보고에 있어서의 폴리머의 수율을 발췌하면 다음 표 1과 같다.

탄소원(알카노에이트)	균체의 건조중량(㎎/ℓ)	폴리머의 건조중량(㎎/ℓ)	수율(%)
6-페녹시헥산산	950	100	10.5
8-페녹시옥탄산	820	90	11
11-페녹시운데칸산	150	15	10

또한, 1995년에 발행된 Can. J. Microbiol., 41권, 32 내지 43페이지에는, 슈도모나스 올레오보란스 ATCC 29347 및 슈도모나스 푸티다 KT 2442를 이용해서, 옥탄산과 p-시아노페녹시헥산산 또는 p-니트로페녹시헥산산을 기질로 해서, 3-히드록시-p-시아노페녹시헥산산 또는 3-히드록시-p-니트로페녹시헥산산을 모노머 유닛으로서 함유하는 PHA의 생산에 성공하고 있다.

일본국 특허번호 제 2989175호에는, 3-히드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트(3H5(MFP)P)유닛 또는 히드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트(3H5(DFP)P)유닛으로 이루어진 호모폴리머 및 3H5(MFP)P유닛 또는 3H5(DFP)P유닛을 함유하는 폴리머와; 이들 폴리머를 합성하는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 및 슈도모나스 속(Pseudomonasspecies)을 사용하여 상기한 폴리머를 생산하는 방법 등에 대해서 기재되어 있다.

이들의 생산은 이하에 설명하는 바와 같이 "2단계 배양"에 의해 행해지고 있다.

배양시간 : 제 1단계, 24시간; 제 2단계, 96시간

각 단계에서의 기질(substrate)과 얻어진 폴리머를 이하에 표시한다.

(1) 얻어진 폴리머 : 3H5(MFP)P 호모폴리머

제 1단계의 기질 : 시트르산, 이스트엑기스

제 2단계의 기질 : 모노플루오로페녹시운데칸산

(2) 얻어진 폴리머 : 3H5(DFP)P호모폴리머

제 1단계의 기질 : 시트르산, 이스트엑기스

제 2단계의 기질 : 디플루오로페녹시운데칸산

(3) 얻어진 폴리머 : 3H5(MFP)P 코폴리머

제 1단계의 기질 : 옥탄산 또는 노난산, 이스트엑기스

제 2단계의 기질 : 모노플루오로페녹시운데칸산

(4) 합성 폴리머 : 3H5(DFP)P 코폴리머

제 1단계의 기질 :옥탄산 또는 노난산, 이스트엑기스

제 2단계의 기질 : 디플루오로페녹시운데칸산

그 효과로서는, 치환기를 가지는 중간사슬길이의 지방산을 자화(資化)해서, 측쇄의 말단이 1개 내지 2개의 불소원자로 치환된 페녹시기를 가지는 폴리머를 합성하는 것이 가능하고, 높은 융점과 양호한 가공성을 유지하면서 입체규칙성 및 발수성을 제공할 수 있다.

또한, 모노머유닛에 사이클로헥실기를 함유하는 PHA는, 통상의 지방족의 히드록시알칸산을 유닛으로서 함유하는 PHA와는 상이한 고분자특성을 나타내는 것이 기대되고 있고, 슈도모나스 올레오보란스를 사용한 생산의 예가 보고되어 있다(Macromolecules., 30권, 1611 내지 1615페이지(1997)).

이 보고에 의하면, 노난산(NA)과 사이클로헥실낙산(CHBA) 또는 사이클로헥실길초산(CHVA)이 공존하는 배지중 슈도모나스 올레오보란스를 배양하면, 노난산으로부터 생성되는 유닛과 사이클로헥실기를 함유하는 유닛으로 이루어진 PHA가 얻어지고 있다(각각의 비율은 알려지지 않음).

그 수율에 대해서는, CHBA에 대해서, 기질농도 총량 20mmol/ℓ의 조건에서 CHBA와 NA의 양비를 변화시켜, 표 2에 표시한 바와 같은 결과를 얻은 것으로 보고되어 있다.

NA:CHBA	CDW	PDW	수율	유닛
5:5	756.0	89.1	11.8	NA, CHBA
1:9	132.8	19.3	14.5	NA, CHBA

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)

PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

그러나, 이 예에서는, 배양용액당 폴리머의 수율이 충분하지 않고, 또한 얻어진 PHA 자체도, 그 모노머유닛중에는 지방족의 히드록시알칸산이 공존하고 있다.

이와 같이, 다양한 치환기를 측쇄에 도입한 PHA를 생산하고자 할 경우, 이전에 설명한 슈도모나스 올레오보란스의 보고예 등에서 알 수 있는 바와 같이, 도입하고자 하는 치환기를 가지는 알카노에이트는, 폴리머 원료로서 이용할 뿐만 아니라 증식용 탄소원으로서 이용하는 방법이 사용되고 있다.

그러나, 도입하고자 하는 치환기를 가지는 알카노에이트를 폴리머 원료로서 뿐만 아니라 증식용 탄소원으로서 이용하는 방법에 대해서는, 해당 알카노에이트의β산화에 의한 아세틸-CoA의 생성에 의거한 에너지원의 공급이 기대되고 있고, 또한 이 방법에서는 어느 정도의 사슬길이를 가지는 기질만이 β산화에 의해 아세틸-CoA를 생성할 수 있고, 따라서 PHA의 기질로서 사용될 수 있는 알카노에이트가 한정되어 버린다고 하는 중대한 문제가 있다. 또한, 일반적으로, β산화에 의해 메틸렌사슬이 2개씩 차례차례로 감소되는 사슬길이를 가진 기질이 새로 생성되고, 또한 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 합성된 PHA는, 사슬길이가 메틸렌사슬이 2개씩 다른 모노머유닛으로 이루어진 공중합체로 되는 일이 많다. 상기 설명한 보고예에서는, 기질인 8-페녹시옥탄산으로부터 유래되는 3-히드록시-8-페녹시옥탄산과, 대사산물로부터 유래되는 부산물인 3-히드록시-6-페녹시헥산산 및 3-히드록시-4-페녹시낙산 등의 3종류의 모노머유닛으로 이루어진 공중합체가 생산된다. 이와 관련하여, 단일의 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 얻고자 할 경우, 이 방법을 사용하기가 대단히 어렵다. 또한, β산화에 의한 아세틸-CoA의 생성에 의거한 에너지원의 공급을 전제로 하는 방법에서는, 미생물의 증식이 느리고, 또한 PHA의 합성에 많은 시간이 요구되고, 또한 합성된 PHA의 수율이 대체로 낮다고 하는 주된 문제가 있다.

이 때문에, 도입하고자 하는 치환기를 가지는 알카노에이트 이외에, 증식용 탄소원으로서 옥탄산과 노난산 등의 중간사슬길이의 지방산이 사용되는 배지에서 미생물을 배양한 후에, PHA를 추출하는 방법이 효과적인 것으로 여겨져, 일반적으로 이용되고 있다.

그러나, 본 발명자들의 연구에 의하면, 옥탄산과 노난산 등의 중간사슬길이의 지방산을 증식용 탄소원으로서 사용하여 β산화경로를 거쳐서 합성된 PHA는, 그 순도가 낮고, 50%이상의 폴리머는 탄소원(예를 들면, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시노난산 등)으로부터 유래되는 mcl-3HA모노머유닛으로 이루어진다. 이들 mcl-3HA유닛에 의해, 단일구성성분인 경우 실온에서 폴리머는 점착성으로 되고, 또한 이들이 다량으로 본 발명의 PHA에 공존하는 경우, 폴리머의 유리전이온도(Tg)는 상당히 낮아진다. 따라서, 실온에서 딱딱한 폴리머를 얻기 위해서는, mcl-3HA모노머유닛이 공존(즉, 혼재)하는 것은 바람직하지 않다. 또한, 이와 같은 헤테로한 측쇄구조는, 상기 측쇄구조로부터 유래하는 분자내 혹은 분자간의 상호 작용을 방해하여 결정성과 배향성에 상당한 영향을 끼친다. 폴리머의 물성을 개선하고 기능성을 부여하는데 있어서, 이들 mcl-3HA모노머유닛의 공존이 큰 문제를 야기한다. 이 문제를 해결하는 수단은, 특정한 치환기만을 가지는 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 얻기 위하여, 증식용 탄소원으로부터 유래되는 mcl-3HA모노머유닛 등의 "목적외"의 모노머유닛을 분리/제거하는 정제공정을 포함하여야 한다. 그러나, 조작이 복잡하고 또한 수율의 상당한 저하도 회피할 수 없는 문제점이 있다. 목적의 모노머유닛과 목적외의 모노머유닛이 공중합체를 형성하고 있을 경우, 목적외의 모노머유닛만을 제거하는 것이 매우 어렵다고 하는 보다 심각한 문제가 있다. 특히, 불포화 탄화수소로부터 얻어지는 기, 에스테르기, 아릴기, 시안기, 니트로기, 할로겐화 탄화수소로부터 얻어지는 기, 에폭시드를 가진 기 등을 측쇄구조로서 도입한 모노머유닛을 함유하는 PHA를 합성하는 것을 목적으로 하는 경우에는, mcl-3HA모노머유닛은, 목적의 모노머유닛과 공중합체를 대개 형성하는 일이 많으므로, PHA를 합성한 후에 mcl-3HA모노머유닛을 제거하는 것은 극히 어렵다.

본 발명은, 상기한 문제점을 해결하고, 또한 디바이스재료나 의료재료 등으로서 유용한 치환기를 측쇄에 가진 다양한 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA 를 고순도로 또한 효율적으로 합성하는 것이 가능한 균주(strain)를 제공하는 데 있다.

도 1은 실시예 1에서 합성된 3HFPV의 핵자기공명스펙트럼의 측정결과를 도시한 차트

도 2는 실시예 6에서 얻어진 PHA의¹H 핵자기공명스펙트럼의 측정결과를 도시한 차트

도 3은 실시예 6에서 얻어진 PHA의¹³C 핵자기공명스펙트럼의 측정결과를 도시한 차트

도 4는 실시예 7에서 얻어진 5-(4-플루오로페녹시)길초산의 핵자기공명스펙트럼의 측정결과를 도시한 차트

도 5는 실시예 8에서 얻어진 PHA를 구성하는 모노머유닛의 메틸에스테르화 화합물에 대한 GC-MS의 토탈 이온 크로마토그래피(TIC)를 도시한 차트

도 6A 및 도 6B는 실시예 8에서 얻어진 PHA를 구성하는 모노머유닛의 메틸에스테르화 화합물에 대한 TIC상의 피크의 질량스펙트럼을 도시한 차트.

도 7A 및 도 7B는 실시예 8에서 얻어진 PHA를 구성하는 모노머유닛의 메틸에스테르화 화합물에 대한 TIC상의 피크의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 8은 실시예 9에서 얻어진 PHA를 구성하는 모노머유닛의 메틸에스테르화 화합물에 대한 TIC를 도시한 차트

도 9는 실시예 10에서 얻어진 PHA를 구성하는 모노머유닛의 메틸에스테르화 화합물에 대한 TIC를 도시한 차트

도 10은 실시예 11에서 얻어진 PHA를 구성하는 모노머유닛의 메틸에스테르화 화합물에 대한 TIC를 도시한 차트

도 11A는 5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산의 토탈 이온 크로마토그래피(TIC)를 도시한 차트

도 11B는 도 11A의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 12A 및 도 12B는 실시예 14에서 얻어진 PHA 공중합체의 메틸화 화합물의 분석 결과를 도시한 차트로서, 도 12A는 PHA 공중합체의 메틸화 화합물의 토탈 이온 크로마토그래피(TIC)를 도시한 차트이고, 도 12B는 TIC상의 목적유닛인 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 함유하는 피크(36.5분 부근)에 대한 질량 스펙트럼을 도시한 차트

도 13A 및 도 13B는 실시예 15에서 얻어진 PHA 공중합체의 메틸화 화합물의 분석 결과를 도시한 차트로서, 도 13A는 PHA공중합체의 메틸화 화합물의 토탈 이온 크로마토그래피(TIC)를 도시한 차트, 도 13B는 TIC상의 목적유닛인 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 함유하는 피크(36.5분 부근)에 대한 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 14는 실시예 30에서 얻어진 PHA의¹H-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 15는 실시예 34에서 얻어진 PHA의¹H-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 16은 4-(4-플루오로페녹시)낙산의¹H-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 17은 4-(4-플루오로페녹시)낙산의¹³C-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 18은 실시예 41에서 YN2균주의 배양균체로부터 회수한 PHA의 메탄올리시스 후에 측정된 GC-MS스펙트럼데이터를 도시한 차트

도 19는 실시예 41에서 YN2균주의 배양균체로부터 회수한 PHA의¹H-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 20은 4-(3-플루오로페녹시)낙산의¹H-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 21은 4-(3-플루오로페녹시)낙산의¹³C-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 22는 실시예 47에서 YN2균주의 배양된 균체로부터 회수한 PHA에 대해 메탄올리시스후에 측정한 GC-MS 스펙트럼을 도시한 차트

도 23은 실시예 47에서 YN2균주의 배양 균체로부터 회수한 PHA의¹H-NMR스펙트럼을 도시한 차트

도 24는 실시예 53에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량 스펙트럼을 도시한 차트

도 25는 실시예 53에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 메틸 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 26은 실시예 54에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 27은 실시예 54에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 28은 실시예 55에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 29는 실시예 55에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 30은 실시예 55에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(3HFPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 31은 실시예 56에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 32는 실시예 56에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 33은 실시예 56에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 34는 실시예 57에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 35는 실시예 57에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 36은 실시예 57에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 37은 실시예 57에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(3HFPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 38은 실시예 58에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 39는 실시예 58에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 40은 실시예 58에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 41은 실시예 58에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 42는 실시예 58에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 43은 실시예 58에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 44는 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 45는 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 46은 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 47은 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 48은 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 49는 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 50은 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 51은 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 52는 실시예 59에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 53은 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 54는 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 55는 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 56은 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 57은 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 58은 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데센산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 59는 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 60은 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 61은 실시예 60에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 62는 실시예 61에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 63은 실시예 61에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-4-페녹시 낙산(3HPxB) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 64는 실시예 61에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 65는 실시예 61에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 66은 실시예 62에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 67은 실시예 62에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 68은 실시예 62에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 69는 실시예 62에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 70은 실시예 63에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 71은 실시예 63에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 72는 실시예 63에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 73은 실시예 63에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 74는 실시예 63에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 75는 실시예 63에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 76은 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 77은 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 78은 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 79는 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 80은 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 81은 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데센산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 82는 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 83은 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 84는 실시예 64에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 85는 실시예 65에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 86은 실시예 65에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 87은 실시예 65에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 88은 실시예 65에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 89는 실시예 65에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 90은 실시예 66에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 91은 실시예 66에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 92는 실시예 66에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 93은 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 94는 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 95는 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 96은 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 97은 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 98은 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데센산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 99는 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 100은 실시예 67에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 101은 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 102는 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 103은 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 104는 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 105는 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데센산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 106은 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 107은 실시예 68에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 108은 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 109는 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 110은 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 111은 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 112는 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 113은 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데센산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 114은 실시예 69에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 115는 실시예 70에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 116은 실시예 70에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 117은 실시예 70에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 118은 실시예 70에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 119는 실시예 70에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시도데센산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 120은 실시예 70에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 121은 실시예 71에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 122는 실시예 71에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 123은 실시예 71에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 124은 실시예 72에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 125는 실시예 72에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 126은 실시예 73에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시낙산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 127은 실시예 73에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 128은 실시예 73에서 GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시데칸산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트

도 129는 실시예 73에서 GC-MS측정으로부터 얻은 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한 차트.

본 발명의 한 측면에 의하면, 신규한 박테리아균주인 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91균주(FERM BP-7373)를 제공한다.

참고로, 본 발명에 의하면, 신규한 박테리아균주인 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161균주(FERM BP-7376)를 제공한다.

참고로, 본 발명에 의하면, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45균주(FERM BP-7374)를 제공한다.

참고로, 본 발명에 의하면, 신규한 박테리아균주인 슈도모나스 치코리이 YN2균주(FERM BP-7375)를 제공한다.

참고로, 본 발명에 의하면, 하기 식(1)로 표시되는 모노머유닛조성을 가지는 폴리히드록시알카노에이트가 제공된다:

A_mB_(1-m)(1)

[식중, A는 하기 식(2)로 표시되고, B는 하기 식(3) 또는 하기 식(4)로 표시되는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상이고, m은 0.01이상 1미만임]

(상기 식중, n는 0∼10의 정수이고, k는 3 또는 5이고, R은 하기 식(5) 내지 하기 식(7)로 표시되는 기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 기임)

(상기 식(5)중, R1은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, q는 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 식(6)중, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R은 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 식(7)중, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, s는 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 일반식(2)에서 R로서 1종의 기를 선택할 때에는,

상기 식(5)에서, R1=H이고 q=2인 기, R1=H이고 q=3인 기, R1=-NO₂이고 q=2인 기,

상기 식(6)에서, R2=할로겐원자이고 r=2인 기[단, 상기 B로서 상기 식(3) 또는 상기 식(4)로부터 2성분이 선택되는 경우에 한함], R2=-CN이고 r=3인 기, R2=-NO₂이고 r=3인 기,

상기 식(7)에서 R3=H이고 s=1인 기, R3=H이고 s=2인 기

는, 선택기로부터 제외되고,

상기 일반식(2)에서 R로서 2종의 기를 선택할 때에는,

상기 식(6)에서, R2=할로겐원자이고 r=2인 기 및 R2=할로겐원자이고 r=4인 기의 2종의 기의 조합[단, 상기 B로서 상기 식(3) 또는 상기 식(4)로부터 2성분이 선택되는 경우에 한함]은 선택기로부터 제외됨).

또, 참고로, 본 발명의 한측면에 따르면, 하기 식(21):

의 5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 제공한다.

참고로, 다른 측면에 따르면, 모노머유닛이 하기 식(1)로 표시되는 폴리히드록시알카노에이트를, 알카노에이트를 함유하는 배지에서 해당 알카노에이트로부터 합성할 수 있는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다:

A_mB_(1-m)(1)

[식중, A는 하기 식(2)로 표시되고, B는 하기 식(3) 또는 하기 식(4)로 표시되는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상이고, m은 0.01이상 1미만임]

(상기 식중, n는 0∼10의 정수이고, k는 3 또는 5이고, R은 하기 식(5) 내지 하기 식(7)로 표시되는 기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 기임)

(상기 식(5)중에서, R1은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, q는 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 식(6)중에서, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R은 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 식(7)중에서, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, s는 1∼8의 정수로부터 선택되고;

상기 일반식(2)에서 R로서 1종의 기를 선택할 때에는,

상기 식(5)에서, R1=H이고, q=2인 기, R1=H이고 q=3인 기, R1=-NO₂이고 q=2인 기, 상기 식(6)에서, R2=할로겐원자이고, r=2인 기, R2=-CN이고 r=3인 기, R2=-NO₂이고 r=3인 기, 상기 식(7)에서 R3=H이고, s=1인 기, R3=H이고, s=2인 기는, 선택기로부터 제외되고;

상기 일반식(2)에서 R로서 2종의 기를 선택할 때에는,

상기 식(6)에서, R2=할로겐원자이고, r=2인 기

는 선택기로부터 제외됨).

또다른 측면에 따르면, 알카노에이트와 당류를 함유하는 배지에서 알카노에이트를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 알카노에이트와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 알카노에이트를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.

또다른 측면에 의하면, 알카노에이트와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 알카노에이트를 이용하여 폴리히드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.

또다른 측면에 따르면, 알카노에이트와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계와, 알카노에이트와 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소원을 제한한 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법을 제공한다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 신규한 폴리히드록시알카노에이트와, 그 원료로 되는 신규한 치환 알칸산 및 해당 신규한 폴리히드록시알카노에이트를 생산해서 그 균체내에 축적하는 능력을 지닌 신규한 미생물, 및 이와 같은 미생물을 사용하여 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 방법을 제공한다. 이들에 의하면, 기능성 폴리머로도 유용한 각종 작용기를 도입한 폴리히드록시알카노에이트가 고순도로 또한 상당히 효율적으로 제조될 수 있고, 따라서 디바이스재료 및 의료용 재료 등의 각 분야에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명자들은, 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 특히, 디바이스재료나 의료용 재료로서 유용한, 치환 또는 미치환의 페녹시기, 페닐기 및 사이클로헥실기를 측쇄에 가지는 PHA를 개발할 목적으로, PHA를 생산하여 균체내에 축적할 수 있는 능력을 지닌 신규의 미생물의 탐색과, 이 신규의 미생물을 사용하여 소망의 PHA를 제조하는 방법에 대해 예의연구를 행한 결과 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 미생물에 의해 생산된 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(1)로 표시되는 모노머유닛조성을 지닌 것을 특징으로 한다:

A_mB_(1-m)(1)

[식중, A는 하기 식(2)로 표시되고, B는 하기 식(3) 또는 식(4)로 나타내는 모노머유닛으로부터 선택된 적어도 한개 이상의 모노머유닛이고, m은 0.01 이상 1미만임]

(상기 식중, n는 0 내지 10이고, k는 3 또는 5이고, 또한 R은 식(5) 내지 식(7)로 표시된 군으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 기임)

(식(5)에서, R1은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로부터 선택된 기이고, q는 1 내지 8의 정수로부터 선택되고,

식(6)에서, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로부터 선택된 기이고, R은 1 내지 8의 정수로부터 선택되고,

식(7)에서, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로부터 선택된 기이고, s는 1 내지 8의 정수로부터 선택되고;

여기서, 식(2)에서 R로서,

1종의 기를 선택할 때에는,

식(5)에서, R1=H, q=2인 기, R1=H, q=3인 기, R1=-NO₂, q=2인 기,

또한 식(6)에서 R2=할로겐 원자, r=2(단, 상기한 B로서 식(3) 또는 식(4)로부터 2개의 성분을 선택한 경우에만 한함)인 기, R2=-CN, r=3인 기, R2=-NO₂, r=3인 기,

또한 식(7)에서 R3=H, s=1인 기, R3=H, s=2인 기

는 상기 선택으로부터 제외하고,

또한, 2종의 기를 선택할 때에는,

식(6)에서 R2=할로겐원자, r=2인 기 및 R2=할로겐원자, r=4인 기의 두 종류의 조합(단, 상기 B로서 식(3) 또는 식(4)로부터 단일의 성분을 선택한 경우에만 한함)은 상기 선택으로부터 제외됨).

여기서, 본 발명의 미생물에 의해 생산된 폴리히드록시알카노에이트는, 식(2)로 표시되는 2종류 이상의 모노머유닛을 포함할 수 있지만, 필요로 하는 폴리머의 기능성과 물성을 고려해서, 적정한 수의 모노머유닛을 함유하도록 설계되는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 5종류정도까지의 알카노에이트를 소망의 모노머유닛의 원료로서 사용하면, 그 일부로부터 상기 설명한 바와 같이 β산화에 의해 사슬길이가 메틸렌유닛 2개분만큼 짧아진 "부차적인" 기질이 새로이 생성된다. 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 10종류정도까지의 식(2)로 표시되는 모노머유닛이 PHA에 포함되게 되어, 본 발명의 목적을 충분히 달성할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기능성과 물성을 미세하게 제어하기를 원하는 경우, 보다 많은 종의 모노머유닛을 가진 구성으로 하는 것도 가능하다.

또한, R1, R2 및 R3의 치환된 위치에 대해서는, 오르토, 메타 또는 파라위치 중 어느 하나에 있어서도, R3이 사이클로헥실기인 경우의 제 1위치에 있어서도, 대응하는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 합성이 가능하지만, 임의의 이성질체에 대해서도 기능성과 물성에 상당한 차이가 없는 경우, 수율의 관점 또는 중합체에서 포획되기 쉬운 관점에서 볼 때 메타 또는 파라위치에 치환체를 포함하도록 배양하는 것이 유리하다.

또한, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 하기 식(1)로 표시되는 모노머유닛조성을 가지는 폴리히드록시알카노에이트의 미생물에 의한 제조방법에 있어서, 미생물은 알카노에이트와 함께 배양되고, 또한 폴리히드록시알카노에이트는, 미생물의 균체로부터 폴리히드록시알카노에이트를 추출함으로써, 하기 식(1)로 표시되는 모노머유닛조성을 가지는 폴리히드록시알카노에이트를 얻는 것을 특징으로 한다:

A_mB_(1-m)(1)

[식중, A는 하기 식(2)로 나타내고, B는 하기 식(3) 또는 식(4)로 나타내는 모노머유닛으로부터 선택된 적어도 1개 이상이고, 또한 m은 0.01이상 1미만임].

(식중, n는 0 내지 10이고, k는 3 또는 5이고, R은 하기 식(5) 내지 식(7)로 표시되는 기로부터 선택된 적어도 1개 이상의 기임)

(식(5)에서, R1은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로부터 선택된 기이고, 또한 q는 1 내지 8의 정수로부터 선택되고;

식(6)에서, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로부터 선택된 기이고, r은 1 내지 8의 정수로부터 선택되고;

식(7)에서, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇로부터 선택된 기이고, s는 1 내지 8의 정수로부터 선택되고;

식(2)에서 R로서,

1종류의 기가 선택될 때에는,

식(5)에서, R1=H, q=2인 기, R1=H, q=3인 기, R1=-NO₂, q=2인 기,

식(6)에서 R2=할로겐원자, r=2인 기, R2=-CN, r=3인 기, R2=-NO₂, r=3인 기와,

식(7)에서 R3=H, s=1인 기, R3=H, s=2인 기 등은

상기 선택으로부터 제외되고;

또한 2종류의 기가 선택될 때에는,

R6에서, R2=할로겐원자, r=2 및 4인 두 종류의 조합은 상기 선택으로부터 제외됨)

여기서, 본 발명의 미생물에 의해 제조되는 폴리히드록시알카노에이트는, 식(2)로 표시되는 두종류 이상의 모노머유닛이어도 되지만, 필요로 하는 폴리머의 기능성과 물성을 고려해서 적정한 수의 모노머유닛이 포함되도록 합성하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 5종류정도까지의 알카노에이트를 소망의 기질의 원료로서 사용하면, 그 일부로부터 상기 설명한 바와 같이 β산화에 의해 사슬길이가 메틸렌유닛 2개분만큼 짧아진 "부차적인" 기질이 새로이 생성된다. 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 10종류정도까지의 식(2)로 표시되는 모노머유닛은 PHA에 포함되게 되어, 본 발명의 목적을 충분히 달성할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기능성과 물성을 미세하게 제어하기를 원하는 경우, 보다 많은 종의 모노머유닛을 포함하도록 배양하는 것도 가능하다.

또한, R1, R2 및 R3의 치환위치에 대해서는, 오르토, 메타 또는 파라위치 중 어느 하나에 있어서도, 또한, R3이 사이클로헥실기인 경우의 제 1위치에 있어서도,대응하는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 합성이 가능하지만, 임의의 이성질체에 대해서도 기능성과 물성에 상당한 차이가 없는 경우, 수율의 관점 또는 중합체에서 포획되기 쉬운 관점에서 볼 때 메타 또는 파라위치에 치환체를 포함하도록 배양하는 것이 유리하다.

또한, 본 발명자들은, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적은 혹은 혼재가 없는 소망의 PHA를 얻는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, PHA의 원료가 되는 알카노에이트와 당류를 단일의 탄소원으로 함유한 배지에서 미생물을 배양할 때에, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 거의 없는 혹은 혼재가 없는 PHA를 생산하는 것이 가능하게 되어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 제조방법은, 하기 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알케노에이트의 미생물에 의한 제조방법에 있어서, 하기 일반식(22)로 표시되는 알카노에이트로부터 하기 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을, 단일의 탄소원으로서 하기 식(22)의 알카노에이트와 당류를 함유하는 배지에 배양하는 공정을 가지는 것을 특징으로 한다:

(상기 식중, R은 하기 식(24)로 표시되는 기로부터 선택된 적어도 한 개 이상의 기이고, R'는 상기 식(22)에서 선택된 기, 해당 선택된 기에서 t-2인 기, 선택된 기에서 t-4인 기, 선택된 기에서 t-6인 기중 적어도 1개이상의 기이다. 여기서, t-2,t-4 및 t-6은 1이상의 정수만을 취할 수 있다)

(상기 식중, R4는 포화 또는 불포화 페닐기와, 포화 또는 불포화 페녹시기 및 포화 또는 불포화 사이클로헥실기를 나타내고, t는 독립적으로 1 내지 8의 범위내의 정수를 나타냄).

여기서, 식(22)로 표시되는 알카노에이트는, 배양시에 1종류이상 사용될 수 있지만, 필요로 하는 폴리머의 기능성과 물성을 고려해서 적정한 수를 이용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 5종류정도까지의 식(22)로 표시되는 알카노에이트를 원료로서 사용하면, 그 일부로부터 상기 설명한 바와 같이 β산화에 의해 사슬길이가 메틸렌유닛 2개분만큼 짧아진 "부차적인" 기질이 새로이 생성된다. 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 10종류정도까지의, 예를 들면 식(2)로 표시되는 모노머유닛이 PHA에 포함되게 되어, 본 발명의 목적을 충분히 달성할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기능성과 물성을 미세하게 제어하기를 원하는 경우, 보다 많은 종의 모노머유닛을 이용하는 것도 가능하다.

상기한 R4의 기에서의 치환기로서는, 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇등을 들 수 있다. R4의 치환위치에 대해서는, 오르토, 메타 또는 파라위치 중 임의의 위치에 있어서도, 또한, 사이클로헥실기인 경우의 제 1위치에 있어서도, 대응하는 모노머유닛으로 이루어진 폴리히드록시알카노에이트를 얻을 수 있지만, 임의의 이성체에 대해서 기능성과 물성이 상당히 차이가 없는 경우, 메타 또는 파라위치에서의 치환기는 수율의 관점 또는 폴리머에서 포획되는 용이성의 관점에서 적절하게 사용될 수 있다.

또한, 당분류에 대해서는, 예를 들면 글루코스, 과당, 만노스 등을 적절하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명자들은, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적은 혹은 혼재가 없는 소망의 PHA를 얻는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, PHA의 원료가 되는 알카노에이트와 폴리펩톤을 단일의 탄소원으로서 함유하는 배지에서 미생물을 배양할 때에, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 거의 없는 혹은 혼재가 없는 PHA를 생산하는 것이 가능하게 되어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 제조방법은, 하기 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 미생물에 의한 제조방법에 있어서, 하기 식(22)로 표시되는 알카노에이트로부터 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을, 단일의 탄소원으로서 알카노에이트와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 가지는 것을 특징으로 한다:

(상기 식중, R은 하기 식(24)로 표시되는 적어도 1개 이상의 기이고, 또한 R'는 상기 식(22)에서 선택된 기, 해당 선택된 기에서 t-2인 기, 선택된 기에서 t-4인 기,선택된 기에서 t-6인 기로부터 선택되는 적어도 1개이상의 기이다. 여기서, t-2, t-4, t-6은 1이상의 정수만을 취할 수 있다)

(상기 식중, R4는 포화 또는 불포화 페닐기, 포화 또는 불포화 페녹시기 및 포화 또는 불포화 사이클로헥실기이고, t는 독립적으로 각각 1 내지 8의 범위내의 정수를 나타냄).

여기서, 식(22)로 표시되는 알카노에이트는 배양시에 1종이상 사용될 수 있지만, 필요로 하는 폴리머의 기능성과 물성을 고려해서, 적정한 수를 이용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 5종류정도까지의 식(22)로 표시되는 알카노에이트를 소망의 모노머용의 원료로서 사용하면, 그 일부로부터 상기 설명한 바와 같이 β산화에 의해 사슬길이가 메틸렌유닛 2개분만큼 짧아진 "부차적인" 기질이 새로이 생성된다. 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 10종류정도까지의, 예를 들면 식(2)로 표시되는 모노머유닛이 PHA에 포함되게 되어, 본 발명의 목적을 충분히 달성할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기능성과 물성을 미세하게 제어하기를 원하는 경우, 보다 많은 종의 모노머유닛을 이용하는 것도 가능하다.

상기한 R4의 기에서의 치환기로서는, 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇등을 포함한다. R4의 치환위치에 대해서는, 오르토, 메타 또는 파라위치 중 임의의 위치에 있어서도, 또한, 사이클로헥실기인 경우에 제 1위치에 있어서도, 대응하는 모노머유닛으로 이루어진 폴리히드록시알카노에이트를 얻을 수 있지만, 임의의 이성체에 대해 기능성과 물성에 상당한 차이가 없는 경우, 메타 또는 파라위치에서의 치환기는 수율의 관점 또는 폴리머에서 포획되는 용이성의 관점에서 적절하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명자들은, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적은 혹은 혼재가 없는 소망의 PHA를 얻는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, PHA의 원료가 되는 알카노에이트에 더해서, TCA사이클에 관여하는 유기산만을 단독의 탄소원으로서 함유하는 배지에서 미생물을 배양할 때에, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 거의 없는 혹은 혼재가 없는 PHA를 생산하는 것이 가능하다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 생산방법은, 하기 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 미생물에 의한 제조방법에 있어서, 하기 식(22)로 표시되는 알카노에이트로부터 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 합성가능한 미생물을, 하기 식(22)로 표시되는 알카노에이트와, 해당 식(22)로 표시되는 알카노에이트이외의 탄소원으로서 TCA사이클에 관여하는 유기산만을 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 가지는 것으로 특징으로 한다:

(상기 식중, R은 하기 식(24)로 표시되는 적어도 1개 이상의 기이고, 또한 R'는 상기 식(22)에서 선택된 기, 해당 선택된 기에서 t-2인 기, 선택된 기에서 t-4인 기, 선택된 기에서 t-6인 기로부터 선택되는 적어도 1개이상의 기이다. 여기서, t-2, t-4, t-6은 1이상의 정수만을 취할 수 있다)

(상기 식중, R4는, 포화 또는 불포화 페닐기, 포화 또는 불포화 페녹시기, 또는 포화 또는 불포화 사이클로 헥실기이고, t는 독립적으로 1 내지 8의 정수를 나타냄).

여기서, 식(22)로 표시되는 알카노에이트는 배양시에 1종 이상 사용될 수 있지만, 필요로 하는 폴리머의 기능성과 물성을 고려해서, 적정한 수를 이용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 5종류정도까지의 식(22)로 표시되는 알카노에이트를 원료로서 사용하면, 그 일부로부터 상기 설명한 바와 같이 β산화에 의해 사슬길이가 메틸렌유닛 2개분만큼 짧아진 "부차적인" 기질이 새로이 생성된다. 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 10종류정도까지의, 예를 들면 식(2)로 표시되는 모노머유닛이 PHA에 포함되게 되어, 본 발명의 목적을 충분히 달성할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기능성과 물성을 미세하게 제어하기를 원하는 경우, 보다 많은 종의 모노머유닛을 이용하는 것도 가능하다.

상기한 R4의 기에서의 치환기로서는, 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅및 -C₃F₇등을 들 수 있다. R4의 치환위치에 대해서는, 오르토, 메타 또는 파라위치 중 임의의 위치에 있어서도, 사이클로헥실기인 경우에 제 1위치에 있어서도, 대응하는모노머유닛으로 이루어진 폴리히드록시알카노에이트를 얻을 수 있지만, 임의의 이성체에 대해 기능성과 물성에 상당한 차이가 없는 경우, 메타 또는 파라위치에서의 치환기는 수율의 관점 또는 폴리머에서 포획되는 용이성의 관점에서 적절하게 사용될 수 있다.

또한, TCA사이클에 관여하는 유기산으로서는, TCA사이클 자체에 존재하는 유기산, 예를 들면 시트르산, 숙신산, 푸마르산, 말산 및 이들의 염 등이 적합하게 사용될 수 있고 또한, TCA사이클에 대해 주요융제(main flux)상에 존재하는 유기산, 예를 들면 유산(乳酸), 피루브산 및 이들의 염 등이 적합하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명자들은, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적은 혹은 혼재가 없는 소망의 PHA를 효율적으로 얻는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, PHA의 원료가 되는 알카노에이트와 폴리펩톤만을 단독의 탄소원으로서 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계와, 알카노에이트와 피루브산 또는 이들의 염을 단독의 탄소원으로서 함유하지만 질소원을 제한한 배지에서 미생물을 배양하는 단계의 적어도 2단계로 미생물을 배양할 때에, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 거의 없는 혹은 혼재가 없는 소망의 PHA를 생산하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 생산방법은, 하기 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 미생물에 의한 제조방법에 있어서, 하기 화학식(22)로 표시되는 알카노에이트로부터 하기 식(23)으로 표시되는 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 합성하는 미생물을, 적어도 2개의 단계, 즉, 탄소원으로서 하기 식(22)로 표시되는알카노에이트와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 배양하는 공정과, 그 후에, 단독의 탄소원으로서 식(22)로 표시되는 알카노에이트와 피루브산 또는 이들의 염을 함유하지만 질소원을 제한한 배지에서 배양하는 공정을 가지는 것으로 특징으로 한다:

(상기 식중, R은 하기 식(24)로 표시되는 적어도 1개 이상의 기이고, 또한 R'는 상기 식(22)에서 선택된 기, 해당 선택된 기에서 t-2인 기, 선택된 기에서 t-4인 기, 선택된 기에서 t-6인 기로부터 선택되는 적어도 1개이상의 기이다. 여기서, t-2, t-4, t-6은 1이상의 정수만을 취할 수 있다)

(상기 식중, R4는, 포화 또는 불포화 페닐기, 포화 또는 불포화 페녹시기, 또는 포화 또는 불포화 사이클로 헥실기이고, t는 독립적으로 1 내지 8의 정수를 나타냄).

여기서, 식(22)로 표시되는 알카노에이트는 배양시에 1종이상 사용될 수 있지만, 필요로 하는 폴리머의 기능성과 물성을 고려해서, 적정한 수를 이용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 5종류정도까지의 식(22)로 표시되는 알카노에이트를 원료로서 사용하면, 그 일부로부터 상기 설명한 바와 같이 β산화에 의해 사슬길이가 메틸렌유닛 2개분만큼 짧아진 "부차적인" 기질이 새로이 생성된다. 이들이 PHA의 모노머유닛으로서 포획되므로, 10종류정도까지의, 예를 들면 식(2)로 표시되는 모노머유닛이 PHA에 포함되게 되어, 본 발명의 목적을 충분히 달성할 수 있을것으로 기대된다. 또한, 기능성과 물성을 미세하게 제어하기를 원하는 경우, 보다 많은 종의 모노머유닛을 이용하는 것도 가능하다.

상기한 R4의 기에서의 치환기로서는, 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, -C₃F₇등을 들 수 있다. R4의 치환위치에 대해서는, 오르토, 메타 또는 파라위치중 임의의 위치에 있어서도, 또한, 사이클로헥실기인 경우에 제 1위치에 있어서도, 대응하는 모노머유닛으로 이루어진 폴리히드록시알카노에이트를 얻을 수 있지만, 임의의 이성체에 대해 기능성과 물성에 상당한 차이가 없는 경우, 메타 또는 파라위치에서의 치환기는 수율의 관점 또는 폴리머에서 사용되는 포획되는 용이성의 관점에서 적절하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 관한 신규한 균주는, 하기 식(22)로 표시되는 알카노에이트에서 하기 식(23)으로 표시되는 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트의 합성계를 가지는 것을 특징으로 한다:

(상기 식중, R은 하기 식(24)로 표시되는 적어도 1개 이상의 기이고, 또한 R'는 상기 식(22)에서 선택된 기, 해당 선택된 기에서 t-2인 기, 선택된 기에서 t-4인 기, 선택된 기에서 t-6인 기로부터 선택된 적어도 1개이상의 기이다. 여기서, t-2, t-4, t-6은 1이상의 정수만을 취할 수 있다)

(상기 식중, R4는, 포화 또는 불포화 페닐기, 포화 또는 불포화 페녹시기, 또는 포화 또는 불포화 사이클로 헥실기이고, t는 독립적으로 1 내지 8의 정수를 나타냄).

상기한 R4기의 치환기로서는, 할로겐원자, -CN, -NO₂, -CF₃, -C₂F₅, -C₂F₇등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 신규한 폴리히드록시알카노에이트에 대하여 설명한다.

본 발명의 미생물에 의해 제조된 신규한 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(8):

로 표시되는 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(9):

로 표시되는 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 본 발명의 미생물을 사용하여 신규한 PHA를 생성할 때의 원료기질은, 하기 화학식(21):

로 표시되는 5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산이며, 이 원료 기질 자체도 신규한 화합물이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(10):

으로 표시되는 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(11):

로 표시되는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(12):

로 표시되는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(13):

으로 표시되는 3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(14):

로 표시되는 3-히드록시-4-페녹시낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다. 여기서, 식(14)의 3-히드록시-4-페녹시낙산이외의 모노머유닛으로서, 하기 식(3) 또는 식(4)로 표시되는 모노머유닛을 적어도 1종이상 함유한다:

(식중, n는 0 내지 10임) (식중, k는 3 또는 5임).

또한, 폴리히드록시알카노에이트는 하기 식(15):

로 표시되는 3-히드록시-5-페녹시길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다. 여기서, 식(15)의 3-히드록시-5-페녹시길초산을 제외한 모노머 유닛으로서, 하기 식(3) 또는 식(4)의 적어도 하나 이상의 모노머 유닛을 함유한다:

(식중, n는 0 내지 10임) (식중, k는 3 또는 5임)

또한, 폴리히드록시알카노에이트는 하기 식(16):

으로 표시되는 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다. 여기서, 식(16)의 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산이외의 모노머유닛으로서, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(3) 또는 식(4)로 표시되는 모노머유닛을 적어도 1개이상 함유하고, 또, 모노머유닛이 3성분계인 것을 제외한다:

(식중, n은 0 내지 10임) (식중, k는 3 또는 5임)

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(8) 및 식(16):

으로 표시되는 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(15) 및 식(17):

로 표시되는 3-히드록시-5-페녹시길초산 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다. 여기서, 상기 식(15) 및 식(17)의 3-히드록시-5-페녹시길초산과 3-히드록시-7-페녹시헵탄산이외의 모노머유닛으로서는, 하기 식(3) 또는 식(4)로 표시되는 모노머유닛을 적어도 1종 이상 함유한다:

(식중, n는 0 내지 10임) (식중, k는 3 또는 5임).

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(14), 식(18) 및 식(19):

로 표시되는 3-히드록시-4-페녹시낙산, 3-히드록시-6-페녹시헥산산 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산을 모노머유닛으로서 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다.

여기서, 식(14), 식(18) 및 식(19)의 3-히드록시-4-페녹시낙산, 3-히드록시-6-페녹시헥산산 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산을 제외한 모노머 유닛으로서는, 하기 식(3) 또는 식(4)로 표시되는 모노머유닛을 적어도 1종이상 함유한다:

(식중, n는 0 내지 10임) (식중, k는 3 또는 5임)

또한, 폴리히드록시알카노에이트는, 하기 식(15), 식(17) 및 식(20):

으로 표시되는 3-히드록시-5-페녹시길초산, 3-히드록시-7-페녹시헵탄산 및 3-히드록시-9-페녹시노난산을 모노머유닛으로 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이다. 여기서, 상기 식(15), 식(17) 및 식(20)의 3-히드록시-5-페녹시길초산, 3-히드록시-7-페녹시헵탄산 및 3-히드록시-9-페녹시노난산이외의 모노머유닛으로서는, 하기식(3) 또는 식(4)로 표시되는 모노머유닛을 적어도 1종이상 함유한다:

(식중, n는 0 내지 10임) (식중, k는 3 또는 5임).

이하, 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법에 대하여 설명한다.

본 발명자들은, 하기 식(25)의 5-(4-플루오로페닐)길초산(FPVA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(8)의 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(25)의 FPVA를 함유하는 배지에서, FPVA를 사용하여, 상기 식(8)의 3HFPV의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은 식(25)의 FPVA와 당류를 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 것으로 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(25)의 FPVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(25)의 FPVA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(25)의 FPVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(25)의 FPVA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것으로 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(21)의 5-(4-트리플루오메틸페닐)길초산(CF₃PVA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(9)의 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산(3HCF₃PV)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(21)의 CF₃PVA를 함유하는 배지에서, CF₃PVA로부터 상기 식(9)의 3HCF₃PV의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(21)의 CF₃PVA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(21)의 CF₃PVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(21)의 CF₃PVA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(21)의 CF₃PVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(21)의 CF₃PVA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계로 행하는 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명자들은, 하기 식(26)의 4-(4-니트로페녹시)낙산(NO₂PxBA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(10)의 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산(3HNO₂PxB)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 신규의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(26)의 NO₂PxBA를 함유하는 배지에서, NO₂PxBA를 이용해서, 상기 식(10)으로 표시되는 3HNO₂PxB의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(26)의 NO₂PxBA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(26)의 NO₂PxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 식(26)의 NO₂PxBA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(26)의 NO₂PxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(26)의 NO₂PxBA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계로 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(27)의 4-(4-시아노페녹시)낙산(CNPxBA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(11)의 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산(3HCNPxB)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(27)의 CNPxBA를 함유하는 배지에서, CNPxBA로부터 상기 식(11)으로 표시되는 3HCNPxB의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(27)의 CNPxBA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(27)의 CNPxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(27)의 CNPxBA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(27)의 CNPxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(27)의 CNPxBA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(28)의 4-(4-플루오로페녹시)낙산(FPxBA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(12)의 3-히드록시-4-(4-플루오로 페녹시)낙산(3HFPxB)의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(28)의 FPxBA를 함유하는 배지에서, FPxVA를 이용해서 상기 식(12)의 3HFPxV의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(28)의 FPxBA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(28)의 FPxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(28)의 FPxBA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(28)의 FPxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(28)의 FPxBA와 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계로 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(29)의 4-(3-플루오로페녹시)낙산(mFPxBA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(13)의 3-히드록시-4-(3-플루오로 페녹시)낙산(3HmFPxB)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(29)의 mFPxBA를 함유하는 배지에서, mFPxBA를 이용해서 상기 식(13)의 3HmFPxB의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(29)의 mFPxBA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(29)의 mFPxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(29)의 mFPxBA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(29)의 mFPxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(29)의 mFPxBA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(31)의 5-페닐길초산(PVA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(30)의 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(31)의 PVA와 당류를 함유하는 배지에서, PVA를 이용해서, 상기 식(30)의 3HPV의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(31)의 PVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(31)의 PVA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(31)의 PVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(31)의 PVA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(33)의 6-페닐헥산산(PHxA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(32)의 3-히드록시-6-페닐헥산산(3HPHx)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(33)의 PHxA와 당류를 함유하는 배지에서, PHxA를 이용해서, 상기 식(32)의 3HPHx의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(33)의 PHxA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(33)의 PHxA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(33)의 PHxA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(33)의 PHxA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(34)의 4-페녹시낙산(PxBA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(14)의 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(34)의 PxBA를 함유하는 배지에서, PxBA를 이용해서, 상기 식(14)의 3HPxB의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(34)의 PxBA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(34)의 PxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 식(34)의 PxBA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(34)의 PxBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계와, 이어서, 상기 식(34)의 PxBA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(35)의 5-페녹시길초산(PxVA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(15)의 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(35)의 PxVA를 함유하는 배지에서, PxVA를 이용해서 상기 식(15)의 3HPxV의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(35)의 PxVA와 당류를 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(35)의 PxVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(35)의 PxVA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(35)의 PxVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(35)의 PxVA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(36)의 5-(4-플루오로페녹시)길초산(FPxVA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써 식(16)의 3-히드록시-5-(4-플루오로 페녹시)길초산(3HFPxV)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

.

즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(36)의 FPxVA와 당류를 함유하는 배지에서, FPxVA를 이용해서 상기 식(16)의 3HFPxV의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(36)의 FPxVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(36)의 FPxVA와 TCA 사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(36)의 FPxVA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(36)의 FPxVA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(38)의 4-시클로헥실낙산(CHBA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(37)의 3-히드록시-4-시클로헥실낙산(3HCHB)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

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즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 하기 식(38)의 CHBA와 당류를 함유하는 배지에서, CHBA를 이용해서 상기 식(37)의 3HCHB의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(38)의 CHBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(38)의 CHBA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(38)의 CHBA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(38)의 CHBA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(25)의 5-(4-플루오로페닐)길초산(FPVA) 및 하기 식(36)의 5-(4-플루오로페녹시)길초산(FPxVA)을 각각 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(8)의 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV) 및 하기 식(16)의 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(3HFPxV)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

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즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(25)의 FPVA 및 상기 식(36)의 FPxVA와 당류를 함유하는 배지에서, FPVA 및 FPxVA를 이용해서 상기 식(8)의 3HFPV 및 상기 식(16)의 3HFPxV의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(25)의 FPVA 및 식(36)의 FPxVA 및 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(25)의 FPVA 및 식(36)의 FPxVA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(25)의 FPVA 및 식(36)의 FPxVA 및 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(25)의 FPVA 및 상기 식(36)의 FPxVA와 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(39)의 7-페녹시헵탄산(PxHpA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(15)의 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 및 하기 식(17)의 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

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즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기 식(39)의 PxHpA 및 당류를 함유하는 배지에서, PxHpA를 이용해서 상기 식(15)의 3HPxV 및 식(17)의 3HPxHp의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 지닌 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(39)의 PxHpA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(39)의 PxHpA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(39)의 PxHpA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(39)의 PxHpA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(40)의 8-페녹시옥탄산(PxOA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(14)의 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB), 하기 식(18)의 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 및 하기 (19)의 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO)의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

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즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 상기식(40)의 PxOA와 당류를 함유하는 배지에서, PxOA를 이용해서, 상기 식(14)의 3HPxB, 상기 식(18)의 3HPxHx 및 상기 식(19)의 3HPxO의 모노머 유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(40)의 PxOA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(40)의 PxOA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(40)의 PxOA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 상기 식(40)의 PxOA 및 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은, 하기 식(41)의 11-페녹시운데칸산(PxUDA)을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 하기 식(15)의 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV), 하기 식(17)의 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 및 하기 식(20)의 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN)의 모노머유닛을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 미생물을 얻는데 성공하였다:

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즉, 본 발명의 미생물에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 제조방법은, 하기 식(41)의 PxUDA 및 당류를 함유하는 배지에서, PxUDA를 이용해서 하기 식(15)의 3HPxV, 하기 식(17)의 3HPxHp 및 하기 식(20)의 3HPxHN의 모노머유닛을 폴리히드록시알카노에이트를 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(41)의 PxUDA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(41)의 PxUDA와 TCA사이클에 관여하는 유기산을 함유하는 배지에서 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 또다른 제조방법은, 미생물의 배양을, 상기 식(41)의 PxUDA와 폴리펩톤을 함유하는 배지에서 행하는 단계와, 이어서, 상기 식(41)의 PxUDA와 피루브산 또는 그 염을 함유하지만 질소를 제한한 배지에서 행하는 단계의 적어도 2단계에 의해 행하는 것을 특징으로 한다.

상기 폴리히드록시알카노에이트의 생산에 적절하게 사용가능한 미생물에는, 본원 발명의 신규의 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichoriiYN2, FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이 H45균주(Pseudomonas cichoriiH45, FERM BP-7374), 슈도모나스 푸티다 P91균주(Pseudomonas putidaP91, FERM BP-7373) 및 슈도모나스 젯세니이 P161균주(Pseudomonas jesseniiP161, PERM BP-7376)의 4종의 신규한 균주가 포함된다.

본 발명의 미생물에 의해 제조된 PHA는, 디바이스 재료 및 의료용 재료로서 유용한 치환기를 측쇄에 지닌 다양한 구조를 구비한 모노머 유닛의 PHA이고, 보다 구체적으로는, 상기한 바와 같은 치환 또는 무치환의 페녹시기, 페닐기 및 사이클로헥실기를 측쇄 위에 가지는 PHA이다. 또한 본 발명의 미생물에 의한 PHA의 제조방법은, 미생물을 이용함으로써 고순도로 또한 고수율로 소망의 PHA를 생산할 수 있다. 또한 본 발명은 고순도로 PHA를 충분히 합성할 수 있는 균주를 제공할 수 있다. 본 발명의 미생물에 의한 PHA는, 일반적으로, R형태만으로 구성되고, 또한 아이소택틱 폴리머(isotactic polymer)이다.

〈당류 및 TCA사이클에 관여하는 유기산: 종래 기술과의 차이점〉

본 발명의 미생물에 의한 PHA를 생산하는 한가지 방법은, 미생물을 배양할 때에, 배지에 소망의 모노머 유닛 도입용의 알카노에이트 이외에, 탄소원으로서 당류 또는 TCA사이클에 관여하는 유기산만을 첨가함으로써, 미생물이 생산·축적하는 PHA에 있어서, 목적으로 하는 모노머 유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하는, 혹은 목적으로 하는 모노머 유닛만으로 하는 점을 특징으로 한다. 이 특정의 모노머 유닛의 우선화를 촉진하는 효과는, 배지중에 해당 알카노에이트 이외의 탄소원으로서 당류 혹은 TCA사이클에 관여하는 유기산만을 첨가함으로써 달성된다.

즉, 본 발명자들은, 당류 혹은 TCA사이클에 관여하는 유기산을 공존기질로 해서, 소망으로 하는 모노머 유닛 도입용의 알카노에이트와 함께 배양시킨 바, 노난산 또는 옥탄산 등의 mcl-알카노에이트를 공존기질로서 이용하는 종래기술에 비해서, 목적으로 하는 PHA가 특히 우수한 수율과 순도로 얻어지는 것을 발견하였고, 또한, 이와 같은 효과가, 미생물의 에너지원과 탄소원인 아세틸-CoA를 β산화에 관계없는 방법에 의해 생성하는 것이 가능한 배양방법에 의해 얻어지는 것을 발견하여, 본 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 미생물에 의한 PHA의 제조방법에서는, 글루코스, 과당, 만노스 등의 당류화합물은, 미생물의 증식기질로서 이용되게 되어, 생산된 PHA는 당류에 공존시키고 있는 소망으로 하는 모노머 유닛 도입용의 알카노에이트로 이루어지고, 따라서 글루코스 등의 당류로부터 유래되는 모노머 유닛이 전혀 함유되어 있지 않거나 극히 소량밖에 함유하지 않는다. 이와 같은 관점에서, 본 발명의 방법은, 글루코스 등의 당류 자체가 PHA에 도입되는 모노머유닛의 원료기질로서 이용되는 PHA에 의한 미생물의 종래의 생산방법과는 구조와 효과가 본질적으로 다르다.

〈폴리펩톤: 종래기술과의 차이점〉

본 발명의 미생물에 의한 PHA를 생산하는 한 방법은, 미생물을 배양할 때에, 배지에 소망으로 하는 모노머 유닛 도입용의 알카노에이트 이외에, 탄소원으로서 폴리펩톤만을 첨가함으로써, 미생물이 생산·축적하는 PHA에 있어서, 목적으로 하는 모노머 유닛의 함유율을 현저하게 높은 것으로 하는, 혹은 목적으로 하는 모노머 유닛만을 가지게 하는 점을 특징으로 한다. 이 특정의 모노머유닛의 우선화를 촉진하는 효과는, 배지중에 해당 알카노에이트이외의 탄소원으로서 폴리펩톤만을 첨가함으로써 달성된다.

또, PHA에 의한 미생물의 생산시에 폴리펩톤을 이용하는 예로서, 일본국 특개평 5-49487호, 5-64591호, 5-214081호, 6-145311호, 6-284892호, 7-48438호, 8-89264호, 9-191893호 및 11-32789호에는, PHA를 미생물에 의해 생산할 때에, 배지중에 폴리펩톤을 함유시키고 있는 것이 개시되어 있으나, 이들은 모두 예비배양시, 즉, 균체를 단순히 증식시키는 단계에서 폴리펩톤을 이용하고 있어, 예비 배양시 PHA의 모노머유닛으로 되는 기질은 함유하지 않는다. 또한, 균체에 PHA를 생산시키는 단계에서 폴리펩톤을 이용한 예는 없다. 이에 대해서, 본 발명은 소망으로 하는 모노머유닛도입용의 알카노에이트와 해당 알카노에이트 이외의 탄소원으로서 폴리펩톤만을 공존시킴으로써, 증식과 함께 PHA의 생산·축적을 행하는 것이며, 상기 미생물에 의한 폴리펩톤을 이용한 제조방법은, 종래의 폴리펩톤을 이용하는 예와는 구조와 효과가 전혀 다르다. 더욱이, 본 발명의 효과인 특정한 모노머유닛의 우선화에 대한 언급이 없고, 또한, 본 발명에서와 같이 미생물에 의해 생산된 PHA의 화합물에서 페녹시기, 페닐기 및 사이클로헥실기를 치환기로 가지는 특정한 모노머유닛의 우선화라고 하는 효과는 나타나 있지 않다.

이하, 본 발명의 PHA, 제조방법 및 미생물에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

〈PHA모노머유닛의 공급계〉

우선, 목적으로 하는 PHA에 혼재하고 있는 mcl-3HA모노머유닛을 공급하는 경로 중 하나인 "지방산 합성 경로"에 대하여 상세하게 설명한다.

글루코스 등의 당류를 기질로 한 경우, 세포성분에서 필요한 알카노에이트는, 당류로부터 "해당계(Glycolytic pathway)"를 경유하여 생산된 아세틸-CoA를 출발물질로 사용하는 "지방산 합성 경로"로부터 생합성된다.

지방산합성에는, 신규의 합성경로와 카본사슬연장경로가 있고, 이하 이들에 대해서 설명한다.

1) 신규의 합성경로(De novo Synthesis Pathway)

이 경로는 아세틸-CoA카르복실라제(EC 6.4.1.2)와 지방산 합성효소(EC. 2.3.1.85)의 2개의 효소에 의해 촉매된다. 또, 아세틸-CoA카르복실라제는, 비오틴을 개재해서, 최종적으로 이하의 반응을 촉매하여, 아세틸-CoA로부터 말로닐-CoA를 생성하는 효소이며, 이 반응은 다음과 같다.

아세틸-CoA+ATP+HCO₃ ^-↔말로닐-CoA+ADP+Pi

또한, 지방산 합성효소는, 전이-탈탄소-환원-탈수-환원의 반응사이클을 촉매하는 효소이며, 전체 반응은 다음과 같이 표시된다.

아세틸-CoA + n 말로닐-CoA + 2n NADPH + 2n H⁺⇒

CH₃(CH₂)_2nCOOH + n CO₂+ 2n NADP⁺+ (n-1) CoA

반응생산물은 효소의 종류에 따라 유리산, CoA 유도체, 또는 ACP유도체로 된다.

여기서, 아세틸 CoA와 말로닐-CoA는, 각각 이하의 화학식(42) 및 (43)으로 표시된다:

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또한, Co-A는, 보조효소A의 약칭이며, 이하의 화학식(44)로 표시된다:

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이 반응경로중, 이하 설명하는 루트에 의해, PHA 생합성용의 모노머 기질로되는 "D-3-히드록시아실-ACP"가 중간체로서 공급된다. 또한, 이하의 반응식에 나타낸 바와 같이, 경로는, 탄소를 2개씩 부가하면서 최종적으로는 팔미트산까지 연장되므로, PHA생합성용의 모노머 기질로서는, "D-3-히드록시부틸-ACP"로부터 "D-3-히드록시팔미틸-ACP"까지 짝수개의 탄소를 가지는 7개의 "D-3-히드록시아실-ACP"가 공급되게 된다:

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2) 탄소사슬연장경로

이 경로는, 크게, 말로닐-CoA가 아실-ACP에 부가되어, 최종적으로 탄소사슬이 2개 연장된 아실-ACP(및 CO₂)로 되는 경로(경로 A라 함)와, 아실-CoA에 아세틸-CoA가 부가되어, 최종적으로 탄소사슬이 2개 연장된 아실-CoA로 되는 경로(경로 B라 칭함)의 2개의 경로로 분리된다. 이하에 각각의 경로에 대해서 설명한다.

-경로 A

R-CO-ACP+말로닐-ACP→

R-CO-CH₂-CO-ACP+CO₂

R-CO-CH₂-CO-ACP→

R-CHOH-CH₂-CO-ACP→

R-CH=CH-CO-ACP→

R-CH₂-CH₂-CO-ACP

-경로 B

R-CO-CoA+아세틸-CoA→ R-CO-CH₂-CO-CoA

R-CO-CH₂-CO-CoA→ R-CHOH-CH₂-CO-CoA→

R-CH=CH-CO-CoA→ R-CH₂-CH_2-CO-CoA

경로 A 또는 B의 어느 것도, 중간체로서 "D-3-히드록시아실 CoA" 혹은 "D-3-히드록시아실-ACP"가 생산되고, 또한, "D-3-히드록시아실-CoA"는 그대로 PAH합성의 모노머 기질로서 이용되는 반면에, "D-3-히드록시아실-ACP"는 ACP-CoA전이효소에 의해 "D-3-히드록시아실-CoA"로 변환된 후에, PHA합성용의 모노머 기질로서 이용되는 것으로 여겨진다.

글루코스 등의 당류를 기질로 이용한 경우에, 미생물세포중에는 상기한 바와 같은 "해당계"와 "지방산 합성경로"를 통하여 mcl-3HA 모노머 유닛이 생산되는 것으로 여겨진다. 또, TCA사이클에 관여하는 유기산을 기질로서 사용하는 경우에, 피루브산으로부터는 피루브산디하이드로지나제에 의해 직접 아세틸-CoA가 생성된다.TCA사이클상의 유기산으로부터는, 예를 들면, 말산으로부터는 말산디하이드로지나제에 의해 피루브산이 생성되고, 또, 상기한 반응에 의해 아세틸-CoA가 생성된다. 옥살로아세트산으로부터는 포스포에놀피루브산 카르복시키나제에 의해 포스포에놀피루브산이 생성되고, 포스포에놀피루브산이 피루브산키나아제에 의해 촉매되어 피루브산이 생성되고, 또한, 상기한 반응에 의해 아세틸-CoA가 생성된다. 이들 반응에 의해 생성된 아세틸-CoA가 "지방산 합성경로"를 경유하여 mcl-3HA모노머유닛이 생산되는 것으로 여겨진다.

이들의 경우에, 옥탄산, 노난산 등의 mcl-알카노에이트 또는 말단에 직쇄 지방족 알킬이외의 다른 작용기가 부가된 5-페닐길초산, 5-(4-플루오로페닐)길초산, 6-페닐헥산산, 4-페녹시낙산, 및 4-사이클로헥실낙산 등의 알카노에이트는, CoA-리가제(EC 6.2.1.3 등)에 의해 CoA유도체로 변환된 후, β산화계를 담당하는 효소군에 의해 직접적으로 PHA생합성용 모노머 기질로 되는 "D-3-히드록시아실-CoA"로 변환되는 것으로 여겨진다.

요컨데, 당류 혹은 TCA사이클에 관여하는 유기산으로부터 생성된 mcl-3HA모노머유닛은 상당히 많은 효소반응단계를 거쳐서(즉, 간접적으로) 생성되지만, mcl-알카노에이트는 직접적으로 mcl-3HA 모노머유닛이 생산되게 된다.

여기서, 미생물의 증식을 담당하는 아세틸-CoA의 생성에 대해서 설명한다. 목적으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트 이외에 mcl-알카노에이트를 공존시키는 방법에서는, 이들 알카노에이트가 β-산화계를 경유하여 아세틸-CoA를 생성한다. 일반적으로, 부피가 큰 치환기를 가지는 알카노에이트(페닐기, 페녹시기, 사이클로헥실기 등의 치환기를 가지는 알카노에이트)에 비해서, mcl-알카노에이트는, β-산화계의 효소군과의 기질친화성이 우수한 것으로 여겨지고, 따라서 아세틸-CoA는 mcl-알카노에이트와의 공존에 의해 효과적으로 생성된다. 이 때문에, 아세틸-CoA를 에너지원 및 탄소원으로서 사용하는 미생물 증식에는 유리하다.

그러나, β-산화계를 경유하는 mcl-알카노에이트가 직접적으로 PHA의 모노머유닛으로 변환되므로, 생산되는 PHA는, 목적으로 하는 모노머유닛이외에 mcl-3HA 모노머유닛의 혼재가 많은 것으로 되어 버리는 것이 중대한 문제이다.

상기 문제를 해결하기 위해서는, mcl-알카노에이트이외에, 효과적으로 아세틸-CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 공급할 수 있는 바와 같은 기질을 선택하여, 목적으로 하는 알카노에이트와 공존시키는 방법이 바람직하다. 상기한 바와 같이, 아세틸 CoA는 지방산합성경로를 경유함으로써 PHA의 모노머유닛으로 될 수 있지만, mcl-알카노에이트에 비해서 보다 다단계의 반응을 경유할 필요가 있는 간접적인 것이다. 따라서, 아세틸 CoA를 얻을 수 있는 기질농도 등의 배양조건을 적절하게 선택함으로써, 실질적으로는 mcl-3HA의 혼재가 없는 혹은 혼재가 적은 PHA의 제조방법의 실현이 가능하다.

또한, 제 1단계에서는 미생물의 증식만을 목적으로 배양하고, 제 2단계에서는 탄소원으로서 목적으로 하는 알카노에이트만을 배지에 첨가하는 제조방법이 일반적으로 사용되고 있다. 이 경우에, 해당 알카노에이트를 아실-CoA로 변환하는 베타 산화계의 초기효소인 아실-CoA리가제가 ATP를 요구한다. 따라서, 본 발명자들의 연구에 의하면, 제 2단계에 있어서도 미생물이 에너지원으로서 이용할 수 있는기질을 공존시키는 제조방법이 보다 효과적이라는 결과를 얻어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 의한 방법에서 아실CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 효과적으로 공급할 수 있는 기질로서는, 예를 들면, 글리세르알데히드, 에리트로즈, 아라비노즈, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 등의 알도스, 글리세롤, 에리트리톨, 크실리톨 등의 알디톨, 글루콘산 등의 알돈산, 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산, 말토스, 슈크로스, 갈락토스를 포함하는 이당류 등의 당류외에, 유산(乳酸), 피루브산, 말산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산 및 이들의 염 등의 TCA사이클에 관여하는 유기산; 또한 폴리펩톤, 비프엑기스, 카사민산 등의 천연물로부터 유래된 배지용 성분 등의 β산화계를 경유하지 않고 아실-CoA 또는 에너지원 및 탄소원을 공급할 수 있는 화합물이면, 어떠한 화합물이라도 이용할 수 있고, 이용되는 균주에 대한 기질로서의 유용성에서 적절하게 선택할 수 있다. 또한, mcl-3HA의 혼입이 적은 조합이라면, 2종 이상의 화합물을 선택해서 이용하는 것도 가능하다.

<미생물>

본 발명의 배경기술에서 언급한 바와 같이, 예를 들면, 3-히드록시-4-페녹시낙산, 3-히드록시-5-플루오로페녹시길초산, 3-히드록시-6-시아노페녹시헥산산, 3-히드록시-6-니트로페녹시헥산산, 3-히드록시-7-플루오로페녹시헵탄산의 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산하여, 균체내에 축적하는 미생물의 보고예로서, 문헌 「Macromolecules, 29권 3432 내지 3435페이지(1996년)」, 문헌 「Can. J. Microbiol., 41권, 32 내지 43페이지(1995년)」, 일본국 특허 제 2989175호 등에기재된 슈도모나스 올레오보란스 및 슈도모나스 푸티다 등이 보고되어 있다. 그러나, 불소기, 시아노기, 니트로기 등의 치환기를 가지는 3-히드록시-4-페녹시낙산의 모노머유닛을 함유하는 PHA를 균체내에 생성하여 축적하는 미생물에 대한 보고는 없었다. 또, 「Macromolecules, 32권 2889 내지 2895페이지(1999년)」에는, 슈도모나스 올레오보란스가, 5-(2,4-디니트로페닐)길초산과 노난산을 기질로서 함유하는 배지에서의 배양에 의해서, 3-히드록시-5-(2,4-디니트로페닐)길초산 및 3-히드록시-5-(4-니트로페닐)길초산의 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어있다. 그러나, 불소기, 트리플루오로메틸기 등의 치환기를 가지는 3-히드록시-페닐알카노에이트를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 세포내에서 생성하여 축적하는 미생물에 대한 보고는 없었다. 따라서, 본 발명은 이들 신규한 모노머유닛을 PHA에 도입할 수 있는 미생물을 발견함으로써 달성되었다.

본 발명의 신규한 미생물은, 알카노에이트를 기질로서 이용해서, 해당 알카노에이트로부터 유래된 신규한 모노머유닛을 함유하는 PHA를 생산해서, 균체내에 축적한다고 하는 종래 알려져 있지 않은 능력을 지닌 미생물이다. 이와 같은 신규한 효소반응성을 나타내는 미생물은, 본 발명자들의 탐색에 의해 발견된 것이다. 즉, 본 발명의 신규한 미생물은, 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichoriiYN2, FERM BP-7375), 슈도모나스 치코리이 H45균주(Pseuodmonas cichoriiH45 FERM BP-7374), 슈도모나스 푸티다 P91균주(Pseudomonas putidaFERM BP-7373), 및 슈도모나스 젯세니이 P161균주(Pseudomonas jesseniiP161 FERM BP-7376)이다. 또, 이들 미생물 이외에도, 해당 알카노에이트를 기질로 한 배양에 의해서, 예를 들면, 슈도모나스속에 속하는 세균의 스크리닝을 행함으로써, 본 발명에 의한 PHA의 제조방법에 이용할 수 있는 미생물을 얻는 것도 가능하다.

이하에, YN2균주, H45균주, P91균주 및 P161균주에 대하여 상세하게 설명한다.

<YN2균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형태와 크기 : 간상균, 0.8㎛ × (1.5 내지 20)㎛

세포의 다형성 : 없음

운동성 : 없음

포자형성 : 음성

그램염색성 : 음성

콜로니형상 : 원형, 전체 주변이 매끄러움, 저 볼록형상, 평활한 표면,

광택, 반투명

(2) 생리학적 성질

카탈라제 : 양성

옥시다제 : 양성

O/F 시험 : 산화형(비발효성)

질산염의 환원 : 음성

인돌의 생성 : 양성

글루코스 산성화 : 음성

아르기닌 디하이드롤라제 : 음성

우레아제 : 음성

에스쿨린 가수분해 : 음성

젤라틴 가수분해 : 음성

B-갈락토시다제 : 음성

King's B 한천에서의 형광색소생산 : 양성

4% NaCl에서의 생육 : 양성(약한 생육)

폴리-β-히드록시낙산의 축적 : 음성(*)

Tween 80의 가수분해 : 양성

(*) 영향한천상에서 배양한 콜로니를 수단블랙으로 염색해서 판정.

(3) 기질동화능

글루코스 : 양성

L-아라비노스 : 양성

D-만노스 : 음성

D-만니톨 : 음성

N-아세틸-D-글루코사민 : 음성

말토스 : 음성

글루콘산 칼륨 : 양성

n-카프르산 : 양성

아디프산 : 음성

dl-말산 : 양성

시트르산 나트륨 ; 양성

아세트산 페닐 : 양성

<H45균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형태와 크기 : 간상균, 0.8㎛ × (1.0 내지 1.2)㎛

세포의 다형성 : 없음

운동성 : 있음

포자형성 : 없음

그램염색성 : 음성

콜로니 형상 : 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저 볼록형상,

평활한 표면, 광택, 크램색

(2) 생리학적 성질

카탈라제 : 양성

옥시다제 : 양성

O/F 시험 : 산화형

질산염의 환원 : 음성

인돌의 생성 : 음성

글루코스 산성화 : 음성

아르기닌 디하이드롤라제 : 음성

우레아제 : 음성

에스쿨린 가수분해 : 음성

젤라틴 가수분해 : 음성

β-갈락토시다제 : 음성

King's B 한천에서의 형광색소생산 : 양성

4% NaCl에서의 생육 : 음성

폴리-β-히드록시 낙산의 축적 : 음성

(3) 기질동화능

글루코스 : 양성

L-아라비노스 : 음성

D-만노스 : 양성

D-만니톨 : 양성

N-아세틸-D-글루코사민 : 양성

말토스 : 음성

글루콘산 칼륨 : 양성

n-카프르산 : 양성

아디프산 : 음성

dl-말산 : 양성

시트르산 나트륨 : 양성

아세트산 페닐 : 양성

<P91균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형태와 크기 : 간상균, 0.6㎛ × 1.5㎛

세포의 다형성 : 없음

운동성 : 있음

포자형성 : 없음

그램염색성 : 음성

콜로니 형상 : 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저 볼록형상,

평활한 표면, 광택, 크림색

(2) 생리학적 성질

카탈라제 : 양성

옥시다제 : 양성

O/F 시험 : 산화형

질산염의 환원 : 음성

인돌의 생성 : 음성

글루코스 산성화 : 음성

아르기닌 디하이드롤라제 : 양성

우레아제 : 음성

에스쿨린 가수분해 : 음성

젤라틴 가수분해 : 음성

β-갈락토시다제 : 음성

King's B 한천에서의 형광색소생산 : 양성

(3) 기질동화능

글루코스 : 양성

L-아라비노스 : 음성

D-만노스 : 음성

D-만니톨 : 음성

N-아세틸-D-글루코사민 : 음성

말토스 : 음성

글루콘산 칼륨 : 양성

n-카프르산 : 양성

아디프산 : 음성

dl-말산 : 양성

시트르산 나트륨 : 양성

아세트산 페닐 : 양성

<P161균주의 균학적 성질>

(1) 형태학적 성질

세포의 형태와 크기 : 구형상, 직경 0.6㎛ 또는

간상, 0.6㎛ × (1.5 ~ 2.0)㎛

세포의 다형성 : 신장형

운동성 : 있음

포자형성 : 없음

그램염색성 : 음성

콜로니 형상 : 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저 볼록형상,

평활한 표면, 담황색

(2) 생리학적 성질

카탈라제 : 양성

옥시다제 : 양성

O/F 시험 : 산화형

질산염의 환원 : 양성

인돌의 생성 : 음성

글루코스 산성화 : 음성

아르기닌 디하이드롤라제 : 양성

우레아제 : 음성

에스쿨린 가수분해 : 음성

젤라틴 가수분해 : 음성

β-갈락토시다제 : 음성

King's B 한천에서의 형광색소생산 : 양성

(3) 기질동화능

글루코스 : 양성

L-아라비노스 : 양성

D-만노스 : 양성

D-만니톨 : 양성

N-아세틸-D-글루코사민 : 양성

말토스 : 음성

글루콘산 칼륨 : 양성

n-카프르산 : 양성

아디프산 : 음성

dl-말산 : 양성

시트르산 나트륨 : 양성

아세트산 페닐 : 양성

이상의 균학적 성질로부터, 문헌 「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.1(1984)」및 「Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed.(1994)」에 의거해서 검토한 바, YN2 균주 및 H45균주는, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)에 속하고, P91균주는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas Putida)에 속하는 것으로 판명되었다. 따라서, 이들 균주를, 각각 슈도모나스 치코리이(Psedomonas cichorii) YN2균주, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45균주, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91균주로서 명명하였다.

한편, P161균주는 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)에 속하는 것으로 판명되었지만, 그 균학적 성질로부터 분류학상의 위치를 확정하는데는 이르지 못했다. 그래서, 유전적 성질에 의거하여 분류하기 위해서, P161균주의 16S rRNA의 염기서열을 판정하여(서열번호 : 1), 공지의 슈도모나스속 미생물의 16S rRNA 염기서열과의 상동성을 조사하였다. 그 결과, P161균주와 슈도모나스 젯세니이 사이에서 DNA 서열의 상동성이 극히 높은 것으로 판명되었다. 또한, 문헌 「System. Appl. Microbiol., 20, 137-149(1997)」 및 「System. Appl. Microbiol., 22, 45-58(1999)」에 기재된 슈도모나스 젯세니이의 균학적 성질과, P161균주의 균학적 성질사이에 높은 유사성도 인정되었다. 이상의 결과로부터, P161균주는 슈도모나스 젯세니이 P161균주에 속하는 것이 타당하다고 판단되었기 때문에, P161균주를 슈도모나스 젯세니이 P161균주로 명명하였다.

YN2균주는 기탁번호 「FERM BP-7375」로서, H45균주는 기탁번호 「FERM BP-7374」로서, P91균주는 기탁번호 「FERM BP-7373」으로서, P161균주는 기탁번호 「FERM BP-7376」으로서, 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(특허미생물기탁센타)에 각각 기탁되어 있다.

<배양 : 일반>

이들 미생물을 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트와 본 발명에 의한 증식용 기질을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 목적으로 하는 PHA를 생산할 수 있다. 이와 같은 PHA는 일반적으로 R형체만으로 구성되고, 아이소택틱 폴리머이다.

본 발명에 의한 PHA의 생산방법에 이용되는 미생물의 통상의 배양, 예를들면 보존균주의 작성, 균의 수나 활성상태를 확보하기 위한 배양 등에 대해서는, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 끼치지 않는 경우, 일반적인 천연배지나 영양원을 첨가한 합성배지 등 어떤 종류의 배지도 사용할 수 있다. 온도, 통기, 교반등의 배양조건은 이용되는 미생물에 따라서 적절하게 선택한다.

미생물을 이용하여 PHA를 생산·축적시키는 경우에는, PHA생산용 배지로서, 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 함유하는 무기배지 등이 이용될 수 있다.

상기 배양방법에 이용되는 무기 배지로서는, 인원(예를 들면, 인산염 등), 질소원(예를들면, 암모늄염, 질산염) 등, 미생물이 증식해서 얻어진 성분을 함유하는 한, 어떠한 배지를 사용하여도 된다. 이와 같은 무기염 배지로서는 예를들면 MSB배지, E배지(J. Biol. Chem., 218, 97-106(1956)), M9배지 등을 열거할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 사용되는 M9배지의 조성은 이하와 같다.

Na₂HPO₄: 6.2 g

KH₂PO₄: 3.0 g

NaCl : 0.5 g

HH₄Cl : 1.0 g

(배지 1 리터당 pH 7.0)

배양조건으로서는, 예를들면 15~40℃, 바람직하게는 20~35℃에서 호기조건하에서 진탕배양이나 교반배양을 들 수 있다.

배양공정은, 배치식(batch type), 유동배치식, 반연속 배양, 연속매양, 리액터형식 배양 등, 통상의 미생물의 배양에 이용되는 어떠한 방법도 이용할 수 있고, 이들 공정을 복수단 접속한 다단 처리를 채용해도 된다.

이하, 증식기질 각각에 대해서, 구체적인 배양공정을 설명한다.

<배양 : mcl-알카노에이트>

예를들면, 2단계의 배양공정을 포함하는 방법으로서는, 제 1단계에서는, 증식용 기질로서, 옥탄산이나 노난산 등의 탄소수 6 ~ 12의 제 1알카노에이트를 0.1중량% 내지 0.2중량%정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 제 2 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도를 함유한 무기배지 등에서 대수증식후기로부터 정상기의 시점까지 배양하고, 제 2단계에서는, 제 1단계에서 배양을 종료한 후의 균체를 원심분리 등으로 회수한 후, 제 2알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도 함유하지만 질소원이 존재하지 않는 무기배지에서 더욱 배양하고, 배양종료후에, 균체를 회수하여 소망의 PHA를 추출하는 방법이 있다.

또한, 예를들면 옥탄산이나 노난산 등의 탄소수 6 ~ 12의 제 1알카노에이트를 0.1중량% 내지 0.2중량%정도 및 소망으로 하는 모노머유닛도입용의 제 2알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도 공급해서 배양하고, 대수 증식 후기로부터 정상기의 시점에서 균체를 회수하여 소망의 PHA를 추출하는 방법이 있다.

여기서, 증식용 기질로서 mcl-알카노에이트를 배지에 첨가하는 방법에는, 취득한 PHA는, 증식용 기질로서 첨가한 mcl-알카노에이트로부터 유래되는 모노머유닛이 다량으로 혼재하고 있는 PHA로 되어있다. 이와 같은 PHA는 일반적으로 R형체만으로 구성되고, 아이소택틱 폴리머이다.

<배양: 당류>

예를들면, 2단계의 배양공정을 포함하는 방법으로서는, 제 1단계에서는, 증식용 기질로서 당류(예를들면, 글루코스, 만노스, 프럭토스 등)를 0.1중량% 내지 2.0중량% 정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량% 정도 함유한 무기배지 등에서 대수증식후기로부터 정상기의 시점까지 배양하고, 제 2단계에서는, 제 1단계에서의 배양을 종료한 후의 균체를 원심분리기 등으로 회수한 후, 증식용 기질로서 당류(예를들면, 글루코스, 만노스, 프럭토스 등)를 0.1중량% 내지 2.0중량%정도, 당해 알카노에이트를 0.01중량%로부터 0.5중량%정도 함유하지만 질소원이 존재하지 않은 무기배지에서 더욱 배양하고, 또한 배양종료후, 균체를 회수하여 소망의 PHA를 추출하는 방법이 있다.

또한, 증식용 기질로서 당류(예를들면, 글루코스, 만노스, 프럭토스 등)를 0.1중량% 내지 2.0중량%정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도 공급하여 배양하고, 대수증식 후기로부터 정상기의 시점에서 균체를 회수해서 소망의 PHA를 추출하는 방법도 있다.

이 경우에, 배지에 첨가하는 당류(예를들면, 글루코스, 만노스, 프럭토스 등)의 농도는, 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트의 종류, 미생물의속 종, 균체밀도 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도로 선택해서 첨가해도 된다. 한편, 원료로 되는 알카노에이트의 농도도 미생물의 속종, 균체밀도 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 일반적으로 배지중의 함유율을 0.01중량% 내지 0.5중량% 정도로 선택해서 첨가해도 된다. 따라서, 당류(예를들면, 글루코스, 만노스, 프럭토스 등)와 당해 알카노에이트를 함유한 배지에서 미생물을 배양함으로써, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적거나 혹은 전혀 없는 소망의 PHA가 생산·축적된다. 이와 같은 PHA는 일반적으로 R 형체만으로 구성되고, 아이소택틱 폴리머이다.

<배양: 폴리펩톤>

예를들면, 2단계의 배양공정을 포함하는 방법으로서는, 제 1단계에서는, 증식용 기질로서 폴리펩톤을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도 함유한 무기배지 등에서 대수증식 후기로부터 정상기의 시점까지 배양하고, 제 2단계에서는, 제 1단계에서의 배양을 종료한 후의 균체를 원심분리기 등으로 회수한 후, 당해 알카노에이트를 0.01중량%로부터 0.5중량%정도 함유하지만 질소원이 존재하지 않은 무기배지에서 더욱 배양하고, 또한 배양종료후, 균체를 회수하여 소망의 PHA를 추출하는 방법이 있다.

또한, 폴리펩톤을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도 공급하여 배양하고, 대수증식 후기로부터 정상기의 시점에서 균체를 회수해서 소망의 PHA를 추출하는 방법도있다.

이 경우에, 배지에 첨가하는 폴리펩톤의 농도는, 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트의 종류, 미생물의 속종, 균체밀도, 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도로 선택하여 첨가해도 된다. 또, 폴리펩톤은 미생물의 배양 등에 범용되는 시판의 폴리펩톤의 어느 것에 대해서도 적합하게 이용하는 것이 가능하다. 한편, 원료로 되는 알카노에이트의 농도도, 미생물의 속종, 균체밀도 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.01중량% 내지 0.5중량%정도로 선택해서 첨가해도 된다. 이와 같이, 폴리펩톤과 알카노에이트를 함유하는 배지에서 미생물을 배양함으로써, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적거나 혹은 전혀 없는 소망의 PHA가 생산·축적될 수 있다. 이와 같은 PHA는, 일반적으로 R형체만으로 구성되고, 아이소택틱 폴리머이다.

<배양: TCA사이클에 관여하는 유기산>

예를들면, 2단계의 배양공정을 포함하는 방법으로서는, 제 1단계에서는, 증식용 기질로서 TCA사이클에 관여하는 유기산(예를들면, 유산, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산, 말산 등 및 이들의 염)을 0.1중량% 내지 2.0중량% 정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량%정도 함유한 무기배지 등에서 대수증식후기로부터 정상기의 시점까지 배양하고, 제 2단계에서는, 제 1단계에서의 배양을 종료한 후의 균체를 원심분리기 등으로 회수한 후, 증식용 기질로서 TCA사이클에 관여하는 유기산(예를들면, 유산, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산, 말산 등 및 이들의 염)을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도, 당해 알카노에이트를 0.01중량%로부터 0.5중량%정도를 함유하지만 질소원이 존재하지 않은 무기배지에서 더욱 배양하고, 또한, 배양종료후, 균체를 회수하여 소망의 PHA를 추출하는 방법이 있다.

또한, TCA에 사이클에 관여하는 유기산(예를들면, 유산, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산, 말산 등 및 이들의 염)을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량% 정도를 공급하여 배양하고, 대수증식 후기로부터 정상기의 시점에서 균체를 회수해서 소망의 PHA를 추출하는 방법도 있다.

이 경우에, 배지에 첨가하는 TCA 사이클에 관여하는 유기산(예를들면, 유산, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산, 말산등 및 이들의 염)의 농도는 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트의 종류, 미생물의 속종, 균체밀도, 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도로 선택하여 첨가해도 된다. 한편, 원료로 되는 알카노에이트의 농도도 미생물의 속종, 균체밀도 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택되지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.01중량% 내지 0.5중량%정도로 선택해서 첨가해도 된다. 따라서, TCA 사이클에 관여하는 유기산(예를들면, 유산, 피루브산, 시트르산, 숙신산, 푸마르산, 말산 등 및 이들의 염)과 당해 알카노에이트를 포함한 배지에서 미생물을 배양함으로써, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적거나 전혀 없는 소망의 PHA를 생산·축적한다. 이와 같은 PHA는, 일반적으로 R형체만으로 구성되고, 아이소택틱폴리머이다.

<배양: 폴리펩톤 + 피루브산 혹은 그 염>

예를들면, 2단계의 배양공정을 포함하는 방법으로서는, 제 1단계에서는, 증식용 기질로서 폴리펩톤을 0.1중량% 내지 2.0중량% 정도 및 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량% 정도 포함한 무기배지 등에서 대수증식후기로부터 정상기의 시점까지 배양하고, 제 2단계에서는, 제 1단계에서의 배양을 종료한 후의 균체를 원심분리기 등으로 회수한 후, 증식용 기질로서 피루브산 혹은 그 염을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도, 당해 알카노에이트를 0.01중량% 내지 0.5중량% 정도를 함유하지만 질소원이 존재하지 않은 무기배지에서 더욱 배양하고, 또한 배양종료후, 균체를 회수하여 소망의 PHA를 추출하는 방법이 있다.

이 경우에, 배지에 첨가하는 폴리펩톤의 농도 및 피루브산 혹은 그 염의 농도는, 소망으로 하는 모노머유닛 도입용의 알카노에이트의 종류, 미생물의 속종, 균체밀도, 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.1중량% 내지 2.0중량%정도로 선택하여 첨가해도 된다. 한편, 원료로 되는 알카노에이트의 농도도 미생물의 속종, 균체밀도 또는 배양방법에 따라서 적절하게 선택하지만, 통상, 배지중의 함유율을 0.01중량% 내지 0.5중량%정도로 선택해서 첨가해도 된다. 따라서, 폴리펩톤과 알카노에이트를 함유하는 배지 및 피루브산 혹은 그 염과 알카노에이트를 함유하는 배지를 이용하여 2단계에서 미생물을 배양함으로써, 목적외의 모노머유닛의 혼재가 적거나 혹은 전혀 없는 소망의 PHA를 생산·축적할 수 있다. 이와 같은 PHA는, 일반적으로 R형체만으로 구성되고, 아니소택틱한 폴리머이다.

<PHA의 회수>

본 발명에 의한 방법에서 균체로부터 PHA를 회수하는 것에 대해서는, 통상 행하고 있는 클로로포름 등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하지만, 유기용매를 사용하는 것이 어려운 환경에서는, SDS 등의 세제에 의한 처리, 리소자임 등의 효소에 의한 처리, EDTA, 차아염소산 나트륨, 암모니아 등의 약제에 의한 처리 등에 의해 PHA이외의 균체성분을 제거하여, PHA를 회수하는 방법을 이용할 수 있다.

<분자량>

상기 방법을 이용함으로써, 본 발명의 PHA를 얻을 수 있다. 이 PHA의 수평균분자량은 폴리머로서 안정한 물성, 예를들면, 폴리머를 구성하는 모노머유닛에 의해 규정되는 유리전이온도, 연화점, 융점, 결정성, 배향성 등을 일정하게 하기 위해서는, 적어도 10,000정도 이상인 것이 바람직하다. 본 발명에 의한 PHA의 수평균분자량은 대략 20,000이상이고, 따라서 폴리머로서 안정한 물성의 발현을 충분히 기대할 수 있다. 한편, 용해조작 등의 처리의 간편성으로부터, PHA의 수평균분자량은 200,000정도까지 바람직하고, 또한 100,000이하로 하는 것이 더욱 바람직하다. 상기한 바와 같이, 이와 같은 PHA는, 일반적으로 R형체만으로 구성되고, 아이소택틱 폴리머이다.

미생물의 배양, 미생물에 의한 PHA의 생산과 균체내의 축적 또한 균체로부터 PHA의 회수는 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다. 예를들면, 본 발명에 의한 PHA의 생산방법에 이용되는 미생물은 상기 4종의 균주 이외에도, 이들의 4종의 균주와마찬가지로 본 발명에 의한 PHA를 생산하는 생산능을 가지는 미생물을 이용할 수 있다.

이들 PHA는, 예를들면, 일반적인 플라스틱이 이용되는 용도외에, 디바이스재료나 의료용 재료 등에 유용한 것으로 여겨진다. 특히 치환기로서, 불소원자, 트리플루오로메틸기 등을 도입한 것은, 생체적합성이 우수한 것으로 예상되고, 따라서, 의료용도에의 응용이 기대된다. 또한, 불소원자, 트리플루오로메틸기 등을 함유하는 것에 기인하여 발수효과를 가지는 것이 예측되고, 다양한 분야에서 발수처리에 응용하는 것도 고려할 수 있다. 특히, 지방족 폴리에스테르인 것에 의한 생분해성을 이용한 일시적인 발수처리 등에 응용하는 것도 고려할 수 있다.

(실시예)

(실시예 1)

우선, 문헌 「Macromolecules, 29, 1762-1766(1996) 및 27, 45-49(1994)」에 기재된 방법에 따라서, 그리냐드반응(Grignard reaction)에 의해 기질인 FPVA를 합성하였다. 즉, 5-브로모길초산을 무수 테트라히드로푸란(THF)에 용해시키고, -20℃, 아르곤 분위기 하에서 30mol/ℓ 메틸 마그네슘 클로라이드 THF용액을 적하하면서 첨가하였다. 약 15분간 교반한 후, 1-브로모-4-플루오로 벤젠과 마그네슘의 THF용액을 더욱 적하하고 0.1mol/ℓ Li₂CuCl₄의 THF용액을 첨가하였다(온도는 -20℃로 유지). 이 반응액을 실온까지 복귀하고, 또한 하룻밤동안 교반하였다. 다음에, 용액을 빙냉한 20% 황산수용액에 따라넣고 교반하였다. 수층(水層)을 채취하여 식염으로 포화하고, 에테르로 추출하였다. 또한, 50g의 수산화칼륨을 첨가한 100㎖의 탈이온수에 의해 상기 추출액을 추출한 후, 20%황산수용액에 의해 산성화하여 침전부분을 회수하였다.

이 침전부분을, 핵자기공명장치(FT-NMR : Bruker DPX 400)를 사용하여, 이하의 조건으로 분석하였다. 측정 핵종:¹H,¹³C, 사용용매: 중클로로포름(TMS를 함유). 그 결과를 도 1 및 표 3에 표시한다.

화학적 이동(ppm)	타입	위치
1.672.392.626.977.1210.7	mtttt브로드(broad)	c, dbeh, jg, kCOOH

(실시예 2)

노난산 0.1% 및 FPVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, FPVA 0.2%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또한 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 여과액을 회전 증발기로 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켰다. 다음에, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법(常法)에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 4에 표시한다.

슈도모나스 치코리이 H45균주

균체(건조중량) 750mg/ℓ폴리머(건조중량) 400mg/ℓ폴리머(건조중량)/균체(건조중량) 53%

모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산 0%3-히드록시길초산 0%3-히드록시헥산산 0%3-히드록시헵탄산 13%3-히드록시옥탄산 3%3-히드록시노난산 37%3-히드록시데칸산 0%3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 47%

(실시예 3)

노난산 0.1% 및 FPVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, FPVA 0.2%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또한 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시켰다. 다음에, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 5에 표시한다.

슈도모나스 치코리이 YN2균주

균체(건조중량) 850mg/ℓ폴리머(건조중량) 420mg/ℓ폴리머(건조중량)/균체(건조중량) 49%

모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산 1%3-히드록시길초산 1%3-히드록시헥산산 0%3-히드록시헵탄산 15%3-히드록시옥탄산 2%3-히드록시노난산 68%3-히드록시데칸산 0%3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 13%

(실시예 4)

노난산 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P91균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 노난산 0.1% 및 FPVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕 배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 여과액을 회전 증발기로 농축하였고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켰다. 다음에, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후에, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI방법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과는 표 6에 표시한다.

슈도모나스 푸티다 P91균주

균체(건조중량) 670mg/ℓ폴리머(건조중량) 51mg/ℓ폴리머(건조중량)/균체(건조중량) 8%

모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산 0%3-히드록시길초산 1%3-히드록시헥산산 0%3-히드록시헵탄산 11%3-히드록시옥탄산 2%3-히드록시노난산 34%3-히드록시데칸산 0%3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 52%

(실시예 5)

노난산 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P161균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 노난산 0.1% 및 FPVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕 배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 여과액을 회전증발기로 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 다음에, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후에, 가스크로마토그래피 질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 7에 표시한다.

슈도모나스 젯세니이 P161균주

균체(건조중량) 1200mg/ℓ폴리머(건조중량) 640mg/ℓ폴리머(건조중량)/균체(건조중량) 53%

모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산 1%3-히드록시길초산 1%3-히드록시헥산산 0%3-히드록시헵탄산 17%3-히드록시옥탄산 3%3-히드록시노난산 45%3-히드록시데칸산 0%3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 33%

(실시예 6)

H45균주로부터 유래된 PHA 100mg을 클로로포름 1㎖에 용해하였고, 다음에 n-헥산을 흐려질 때까지(백탁할 때까지) 첨가하였다. 이것을 원심분리하여 침전부분을 회수해서 진공건조하였다. 이것을 다시 클로로포름 1㎖에 용해하고, n-헥산을 첨가하고, 침전부분을 회수하는 조작을 3회 반복하였다.

얻어진 침전부분을, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)로 분석하여, PHA 모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 8에 표시한 바와 같이, 침전부분은 3HFPV모노머유닛을 유일의 모노머유닛으로 하는 PHA였다.

정제된 PHA

모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산 0%3-히드록시길초산 0%3-히드록시헥산산 0%3-히드록시헵탄산 0%3-히드록시옥탄산 0%3-히드록시노난산 0%3-히드록시데칸산 0%3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 100%

또한, 핵자기공명장치(FT-NMR: Bruker DPX400)를 이용하여, 이하의 조건에서 분석하였다. 측정핵종 :¹H,¹³C, 사용용매: 중클로로포름(TMS를 함유함). 그 결과를 도 2, 표 9, 도 3 및 표 10에 표시한다.

(¹H스펙트럼의 측정결과) 공명주파수: 100㎒

δ치(ppm)	귀속
0.9~1.7	브로드피크→불순물
1.8~1.9	m: 2H, -CH2→d
2.4~2.6	m: 4H, -CH2×2→b, e
5.2~5.3	m: 1H, -OCH→c
6.9~7.0	t: 2H, F기의 오르토위치의 프로톤→h, j
7.1	t: 2H, F기의 파라위치의 프로톤→g, k
7.3	s: 용매(CDCl3)

m: 다중항, t: 3중항 s: 1중항

(¹³C스펙트럼의 측정결과) 공명주파수: 100㎒

δ치(ppm)	귀속
31.0	-CH2→d
35.9	-CH2→e
39.4	-CH2→b
70.5	-CH →c
77.1~77.7	용매(CDCl3)
115.5, 115.7	F기의 오르토위치의 -CH→h, j
130.0	F기의 메타위치의 -CH→g, k
136.8	F기의 파라위치의 -C→f
160.5, 163.0	F치환위치의 -C→i
169.6	카르보닐기 -C=O→a

(실시예 7)

(FPxVA의 합성)

3개의 입구를 지닌 둥근 바닥 플라스크에, 240㎖의 탈수아세톤을 넣은 후에, 요드화 나트륨(0.06몰), 탄산칼슘(0.11몰) 및 4-플루오로페놀(0.07몰)을 첨가하여 충분히 교반하였다. 그 용액중에 5-브로모길초산 에틸에스테르(0.06몰)를 질소분위기에서 적하하고, 60±5℃에서 환류하고, 24시간동안 반응시켰다. 반응종료후, 반응액을 증발기로 농축건조시키고, 염화메틸렌에 재용해하고, 물을 첨가해서 분리하였다. 유기층을 무수황산마그네슘으로 탈수하고, 증류기로 농축건조하였다.

얻어진 반응물에, 열 메탄올을 첨가하여 용해시키고, 용액을 서서히 냉각하여 재침전시켜, 5-(4-플루오로페녹시)길초산 에틸에스테르를 얻었다. 이 때, 5-브로모길초산 에틸에스테르에 대한 수율은, 68몰%였다.

얻어진 반응물(에스테르)을 5중량%로 되로록 에탄올-물(9:1(v/v))에 용해시키고, 10배몰량의 수산화칼륨을 첨가하고, 0 ~ 4℃에서 4시간동안 반응시켜서 에스테르를 가수분해하였다.

이 반응용액을 10배량의 0.1몰/ℓ 염산수용액에 따라넣고, 침전물을 여과에의해 회수하였다. 회수한 침전물(반응물)은 실온에서 36시간동안 감압건조하였다. 얻어진 건조물을 소량의 열에탄올에 용해시키고, 용액을 서서히 냉각하여 재침전시켜서 실온에서 24시간동안 감압건조하여, 목적의 화합물인 5-(4-플루오로페녹시)길초산을 얻었다. 5-브로모 길초산 에틸에스테르에 대한 상기 화합물의 수율은 49몰%였다.

얻어진 화합물을 이하의 조건에서 NMR분석을 행하였다.

<사용용기>

FT-NMR : Bruker DPX400

¹H 공명주파수 :400㎒

<측정조건>

측정핵종 :¹H

사용용매 : CDCl₃

기준 : 캐필러리 봉입 TMS/CDCl₃

측정온도 : 실온

스펙트럼차트를 도 4에 표시하고, 동정결과를 표 11에 표시한다.

¹H-NMR스펙트럼동정결과(도 4참조)

화학적 이동(ppm)	적분치(H)	타입	동정결과
1.85	4	m	c, d
2.46	2	t	b
3.95	2	t	e
6.83	2	m	h, j
6.97	2	t	g, k
10.15		브로드	OH

m: 다중항, t: 3중항 s: 1중항

이상의 결과로부터, 확실히 소망의 FPxVA가 합성되어 있는 것이 확인되었다.

(실시예 8)

(P91균주에 의한 PHA의 제조)

노난산 0.1중량% 및 FPxVA 0.1중량%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P91균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 노난산 0.1중량% 및 FPxVA 0.1중량%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 칭량한 후, 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물만을 회수하고, 진공건조하여 PHA를 얻고 칭량하였다. 수율을 표 12에 표시한다.

(각 미생물 및 제조한 PHA의 수율)

	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	PDW/CDW(%)
P91균주(실시예 8)	650	50	7.7
YN2균주 1(실시예 9)	1250	755	60.4
P161균주(실시예 10)	1150	680	59.1
H45균주(실시예 11)	1150	600	52.2
YN2균주 2(실시예 12)	500	240	48.0

얻어진 PHA를 겔투과 크로마토그래피(GPC, 토소 HCL-8020, 컬럼: 폴리머 레보러토리 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 분자량을 측정하였다. 분자량을 표 13에 표시한다.

(각 미생물이 제조한 PHA의 분자량)

	Mn(×104)	MW(×105)	Mw/Mn
P91균주(실시예 8)	5.1	1.0	2.0
YN2균주 1(실시예 9)	8.8	2.4	2.7
P161균주(실시예 10)	6.8	1.8	2.7
H45균주(실시예 11)	8.8	2.2	2.5
YN2균주 2(실시예 120	5.7	1.4	2.5

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, GC-MS에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. TIC 및 각 피크의 질량스펙트럼을 도 5 내지 도 7A 및 도 7B에 표시한다. 피크(1)은 3-히드록시헵탄산 메틸에스테르, 피크(2)는 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 피크(3)은 3-히드록시노난산 메틸에스테르, 피크(4)는 3-히드록시-4-(-4-플루오로페녹시) 길초산 메틸에스테르의 피크인 것이 표시되어 있다.

이상의 결과에 의해, 얻어진 폴리머는, 3-히드록시헵탄산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시노난산 및 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산의 유닛을 함유하는 PHA인 것을 알 수 있다.

(실시예 9)

(YN2균주에 의한 PHA의 제조(1))

실시예 8의 P91균주를 YN2균주로 대치한 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일한 방법에 의해 PHA를 제조하고, 각 분석을 행하였다. 수율을 표 12에, 분자량을 표 13에, GC-MS의 TIC를 도 8에 표시한다. 피크(1)은 3-히드록시헵탄산 메틸에스테르, 피크(2)는 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 피크(3)은 3-히드록시노난산 메틸에스테르, 피크(4)는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산 메틸에스테르의 피크인 것을 표시하였다.

이상의 결과에 의해, 얻어진 폴리머는, 3-히드록시헵탄산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시노난산 및 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산의 유닛을 함유하는 PHA인 것을 알 수 있다.

(실시예 10)

(P161균주에 의한 PHA의 제조)

실시예 8의 P91균주를 P161균주로 대치한 것을 제외하고는, 실시예 8에 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 PHA를 제조하였고, 각 분석을 행하였다. 수율을 표 12에 표시하고, 분자량을 표 13에 표시하고, GC-MS의 TIC를 도 9에 표시한다. 피크(1)은 3-히드록시헵탄산 메틸에스테르, 피크(2)는 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 피크(3)은 3-히드록시노난산 메틸에스테르, 피크(4)는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산 메틸에스테르의 피크인 것이 표시되었다.

이상의 결과에 의해, 얻어진 폴리머는, 3-히드록시헵탄산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시노난산 및 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산의 유닛을 함유하는 PHA인 것을 알 수 있다.

(실시예 11)

(H45균주에 의한 PHA의 제조)

실시예 8의 P91균주를 H45균주로 대치한 것을 제외하고는, 실시예 8에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 PHA를 제조하였고, 또한 각 분석을 행하였다. 수율을 표 12에 표시하고, 분자량을 표 13에 표시하고, GC-MS의 TIC를 도 10에 표시한다. 피크(1)은 3-히드록시헵탄산 메틸에스테르, 피크(2)는 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 피크(3)은 3-히드록시노난산 메틸에스테르, 피크(4)는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산 메틸에스테르의 피크인 것이 표시되었다.

이상의 결과에 의해, 얻어진 폴리머는, 3-히드록시헵탄산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시노난산 및 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산의 유닛을 함유하는 PHA인 것을 알 수 있다.

(실시예 12)

(YN2균주에 의한 PHA의 제조(2))

헥산산 0.1중량% 및 FPxVA 0.1중량%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 72시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 헥산산 0.1중량% 및 FPxVA 0.1중량%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 30시간 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 동결걸조하였다.

실시예 8에서 설명한 것과 동일한 방법으로 PHA를 추출하고, 각 분석을 행하였다. 수율을 표 12에 표시하고, 분자량을 표 13에 표시한다. GC-MS분석의 결과로부터, 본 방법으로 얻어진 PHA는 이하와 같은 조성을 가진 것을 알 수 있었다.

3-히드록시낙산 : 8.1%

3-히드록시헥산산 : 51.2%

3-히드록시옥탄산 : 1.3%

3-히드록시데칸산 : 7.0%

3-히드록시도데칸산 : 10.6%

미동정물질 : 9.9%

3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산 : 11.9%

이상의 결과에 의해, 얻어진 폴리머는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)길초산의 유닛을 함유하는 PHA인 것을 알 수 있다.

(실시예 13)

(TFMPVA의 합성)

우선, 문헌 「Macromolecules, 29, 1762-1766(1996) 및 동 27, 45-49(1994)」에서 설명한 방법에 따라서, 그리냐드 반응에 의해 기질인 TFMPVA를 합성하였다. 즉, 5-브로모길초산을 무수테트라히드로푸란(THF)에 용해시켜서, -20℃, 아르곤분위기하에서 3mol/ℓ 메틸마그네슘 클로라이드 THF용액을 적하하면서 첨가하였다. 약 15분간 교반한 후, 1-브로모-4-트리플루오로메틸벤젠과 마그네슘의 THF용액을또 적하하고, 0.1mol/ℓ Li₂CuCl₂의 THF용액을 첨가하였다(온도는 -20℃로 유지되었음). 반응액을 실온까지 복구하고, 또 하룻밤동안 교반하였다. 다음에, 용액을 빙냉한 20%황산수용액에 따라넣고 교반하였다. 수층을 채취하여 식염으로 포화하고, 에테르를 추출하였다. 또한, 추출액을 50g의 수산화칼륨을 첨가한 100㎖의 탈이온수에서 추출한 후, 20%황산수용액으로 산성화하여 침전부분을 회수하였다.

회수한 화합물을 상법에 의해 메틸에스테르화하고, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 GC-MS QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(30m×0.32mm×0.5㎛)(J&W회사제))로 분석하였다. TIC(토탈이온 크로마토그램) 및 질량 스펙트럼을 도 11(A) 및 도 11(B)에 도시한다. 이 결과에 의해, 목적으로 하는 TFMPVA가 합성되어 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 14)

(H45균주에 의한 폴리머의 생산)

노난산 0.1중량% 및 TFMPVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, TFMPVA 0.2중량%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고 칭량하였다.

동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻고 칭량하였다. 수율을 표 14에 표시한다.

건조균체(㎎/ℓ)	건조 폴리머(㎎/ℓ)	수율(폴리머/균체, %)
850	110	12.9

얻어진 PHA의 분자량을, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사 HCL-8020, 컬럼: 폴리머레보러토리 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 결과, Mn=64,000, Mw=110,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법, 컬럼: DB-WAXETR(30m×0.32mm×0.5㎛))에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. TIC(total ion chromatogram) 및 목적유닛인 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 나타내는 피크(36.5분 부근)의 질량스펙트럼을 도 12(A) 및 도 12(B)에 각각 표시한다. PHA의 각 유닛의 TIC면적비를 표 15에 표시한다.

3-히드록시길초산 1.4%3-히드록시헵탄산 29.3%3-히드록시옥탄산 3.2%3-히드록시노난산 64.6%3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 1.5%

이상의 결과에 의하면, 본 발명의 일방법에 의해 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산되는 것을 알 수 있다.

(실시예 15)

(P91균주에 의한 폴리머의 생산)

노난산 0.1중량% 및 TFMPVA 0.1중량%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P91균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 30시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, TFMPVA 0.1중량% 및 노난산 0.05%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 30시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻고 칭량하였다. 수율을 표 16에 표시한다.

건조균체(㎎/ℓ)	건조 폴리머(㎎/ℓ)	수율(폴리머/균체, %)
720	29	4.0

얻어진 PHA의 분자량을, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사 HCL-8020, 컬럼: 폴리머레보러토리 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 결과, Mn=69,000, Mw=120,000이었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법, 컬럼: DB-WAXETR(30m × 0.32mm × 0.5㎛))에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. TIC 및 목적유닛인 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 나타내는 피크(36.5분 부근)의 질량스펙트럼을 도 13(A) 및 도 13(B)에 각각 표시한다. PHA의 각 유닛의 TIC면적비를 표 17에 표시한다.

3-히드록시길초산 0.6%3-히드록시헵탄산 21.5%3-히드록시옥탄산 4.0%3-히드록시노난산 70.5%3-히드록시데칸산 1.1%3-히드록시-5-(4-플루오로메틸페닐)길초산 2.3%

이상의 결과에 의하면, 본 발명의 일방법에 의해 3-히드록시-5-(4-트리플루오로메틸페닐)길초산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA가 생산되는 것을 알 수 있다.

(실시예 16)

D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 28시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 18에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PVA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3HPV의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	130094573%	100057057%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-5-페닐길초산	0%0%0%0%1%0%2%0%0%97%	1%1%0%14%2%70%0%0%0%12%

(실시예 17)

D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 19에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PVA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3HPV의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	75040053%	80038548%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-5-페닐길초산	0%0%0%0%0%0%0%0%0%100%	0%0%0%14%0%76%0%0%0%10%

(실시예 18)

D-만노스 0.5% 또는 D-프럭토스 0.5% 및 PVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. D-만노스계는 100시간, D-프럭토스계는 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-만노스0.5% 또는 D-프럭토스 0.5% 및 PVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 20에 표시한 바와 같이, D-만노스 및 D-프럭토스를 증식용 탄소원으로 배양한 경우에도 D-글루코스를 사용한 경우와 마찬가지로, PVA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3HPV의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻는 것이 가능하였다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	78045258%	76041855%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-5-페닐길초산	0%0%0%0%2%0%0%0%0%98%	0%0%0%0%1%0%1%0%0%98%

(실시예 19)

D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P161균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켰다. 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 21에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PVA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3HPV의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	115083072%	118075264%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-5-페닐길초산	0%0%0%0%1%0%3%0%0%96%	2%1%0%17%3%44%0%0%0%33%

(실시예 20)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 FPVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에서 YN2균주를 진탕배양하였다. 48시간후, 원심분리에 의해 균체를 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 FPVA 0.1%을 함유하지만 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 여과액을 회전증발기에 의해 농축하였다. 농축액을 냉메탄올중에 재침전시키고, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 22에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, FPVA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산의 비율이 높은 PHA가 고수율로 얻어졌다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	125090072%	92054359%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산	0%0%0%0%1%0%2%0%0%97%	0%0%0%11%0%80%0%0%0%9%

(실시예 21)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PHxA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P161균주를 진탕배양하였다. 48시간후, 원심분리에 의해 균체를 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PHxA 0.1%을 함유하지만 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하였다. 농축액을 냉메탄올중에 재침전시키고, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 23에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PHxA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3-히드록시-6-페닐헥산산의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	110014313%	90011913%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-6-페닐헥산산	2%0%1%0%1%0%0%0%0%96%	2%1%0%18%3%48%0%0%0%28%

(실시예 22)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 진탕배양하였다. 48시간후, 원심분리에 의해 균체를 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PxBA 0.1%을 함유하지만 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 40시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하였다. 농축액을 냉메탄올중에 재침전시키고, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 24에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PxBA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3-히드록시-4-페녹시낙산의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	68513720%	44026360%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-4-페녹시낙산	0%0%0%0%3%0%4%0%1%92%	0%1%1%30%4%62%1%0%1%0%

(실시예 23)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 48시간동안 진탕배양하였다. 원심분리에 의해 균체를 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PxBA 0.1%을 함유하지만 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 40시간동안 진탕배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하였다. 농축액을 냉메탄올중에 재침전시키고, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 25에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PxBA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3-히드록시-4-페녹시낙산의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	450184%	34021664%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-4-페녹시낙산	0%0%1%0%5%0%5%0%1%88%	0%1%0%28%4%67%0%0%0%0%

(실시예 24)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및PxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 P161균주를 48시간동안 진탕배양하였다. 원심분리에 의해 균체를 회수하고, D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 PxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)은 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 재차 30℃, 125스트로크/분에서 40시간동안 진탕배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하였다. 농축액을 냉메탄올중에 재침전시키고, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 26에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, PxBA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3-히드록시-4-페녹시낙산의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	600519%	40014436%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-4-페녹시낙산	3%0%1%0%9%0%11%0%0%76%	0%1%1%26%5%63%2%0%0%2%

(실시예 25)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5% 또는 n-노난산 0.1% 및 CHBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 40시간동안 진탕배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 28시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 여과액을 농축하였다. 농축액을 냉메탄올중에 재침전시켜, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 27에 표시한 바와 같이, D-글루코스를 증식용 탄소원으로서 사용함으로써, CHBA에 유래하는 소망의 모노머유닛인 3HCHB의 비율이 높은 PHA가 고수율로 얻어졌다.

증식용 탄소원	D-글루코스	n-노난산
균체건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량(mg/ℓ)폴리머건조중량/균체건조중량	115059051%	90042047%
모노머유닛조성(면적비)3-히드록시낙산3-히드록시길초산3-히드록시헥산산3-히드록시헵탄산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시운데칸3-히드록시도데칸산3-히드록시-5-페닐길초산	1%0%0%0%0%0%10%0%0%89%	0%0%0%13%5%69%0%0%0%13%

(실시예 26)

(YN2균주에 의한 폴리-3-히드록시-5-페닐길초산의 생산)

노난산(이하 "NA"로 기재함) 0.1%를 함유하는 M9 한천배지상의 YN2균주의 콜로니(colony)를, (1) 효모엑기스(DIFCO사, 이하 "YE"로 기재함) 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (2) 비프엑기스(DIFCO사, 이하 "BE"로 기재함) 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (3) 카사미노산(DIFCO사, 이하 "CA"로 기재함) 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (4) 폴리펩톤(와꼬준 야꾸사, 이하 "PP"로 기재함) 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지 등의 4종류의 배지(각 200㎖)에 각각 식균하고, 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 동결건조하였다.

이들 각각의 동결건조된 펠릿을 칭량한 후, 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 55℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 각각의 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인으로 여과한 후, 증발기에 의해 농축하였다. 농축액을 냉메탄올에서재침전시켜, 폴리머를 얻고, 이 폴리머를 실온에서 진공상태에서 건조시켜 칭량하였다. 수율을 표 28에 표시한다.

	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
(1) YE	1225	488	39.8
(2) BE	600	185	30.8
(3) CA	950	445	46.8
(4) PP	1200	755	62.9

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)

PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

이와 같이 해서 얻어진 PHA의 조성은 이하의 방법으로 분석하였다. 즉, 약 10mg의 PHA를 25㎖ 가지형 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖에 용해시키고, 3%황산을 함유하는 메탄올용액 2㎖를 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 환류하면서 3.5시간동안 가열반응시켰다. 반응종료후, 탈이온수 10㎖를 첨가하여 격렬하게 10분동안 진탕하였다. 2층으로 분리되었고, 그 중 하층의 클로로포름층을 취해서, 황산마그네슘으로 탈수하고, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사, 0.32mm×30m), EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, PHA모노머유닛으로서는 96%가 3-히드록시-5-페닐길초산이고, 4%가 3-히드록시낙산의 유닛이었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 한 실시예에 의해 3-히드록시-5-페닐길초산유닛을 상당히 높은 비율로 함유하는 PHA가 고수율로 얻어지는 것을 알 수 있다.

(실시예 27)

(YN2균주에 의한 폴리-3-히드록시-4-사이클로헥실낙산의 생산)

NA 0.1%를 함유하는 M9 한천배지상의 YN2균주의 콜로니를, (1) YE 0.5% 및 4-사이클로헥실낙산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (2) PP 0.5% 및 4-사이클로헥실낙산 0.1%를 함유하는 M9액체배지 등의 2종류의 배지(각 200㎖)에 각각 식균하고, 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 각각의 배지로부터 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 동결건조하였다.

이들 각각의 배지로부터의 동결건조된 펠릿을 칭량한 후, 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 55℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 각각의 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인으로 여과한 후, 증발기에 의해 농축하였다. 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 폴리머를 얻고, 이 폴리머를 실온에서 진공상태에서 건조시켜 칭량하였다. 수율을 표 29에 표시한다.

	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
(1) YE	1100	225	20.5
(2) PP	1200	850	70.8

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)

PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

이와 같이 해서 얻어진 PHA의 조성을 실시예 26과 마찬가지 방법으로 분석하였다. 그 결과, PHA모노머유닛으로서는, 97%가 3-히드록시-4-사이클로헥실낙산이고, 3%가 3-히드록시낙산의 유닛이었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 한 실시예에 의해 3-히드록시-4-사이클로헥실낙산유닛을 상당히 높은 비율로 함유하는 PHA가 고수율로 얻어지는 것을 알 수 있다.

(실시예 28)

(YN2균주에 의한 폴리-3-히드록시-5-페녹시길초산의 생산)

NA 0.1%를 함유하는 M9 한천배지상에 배양된 YN2균주의 콜로니를, (1) YE 0.5% 및 5-페녹시길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (2) PP 0.5% 및 5-페녹시길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지 등의 2종류의 배지(각 200㎖)에 각각 식균하고, 30℃에서 26시간동안 배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 각각의 배지로부터 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 동결건조하였다.

이들 각각의 배지에서의 동결건조된 펠릿을 칭량한 후, 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 55℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 각각의 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인으로 여과한 후, 증발기에 의해 농축하였다. 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 폴리머를 얻고, 이 폴리머를 실온에서 진공상태에서 건조시켜 칭량하였다. 수율을 표 30에 표시한다.

	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
(1) YE	1050	205	19.5
(4) PP	1000	345	34.5

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)

PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

이와 같이 해서 얻어진 PHA의 조성은 실시예 26과 마찬가지의 방법으로 분석하였다. 그 결과, PHA모노머유닛으로서는 95%가 3-히드록시-5-페녹시길초산이고, 5%가 3-히드록시낙산의 유닛이었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 한 실시예에 의해 3-히드록시-5-페녹시길초산유닛을 상당히 높은 비율로 함유하는 PHA가 고수율로 얻어지는 것을 알 수 있다.

(실시예 29)

(H45균주에 의한 폴리-3-히드록시-5-페닐길초산의 생산)

NA 0.1%를 함유하는 M9 한천배지상에 성장한 H45균주의 콜로니를, (1) YE 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (2) 글루타민산나트륨(기시다 가가꾸사, 이하 "SG"로 기재함) 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (3) CA 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (4) PP 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지 등의 4종류의 배지(각 200㎖)에 각각 식균하고, 30℃에서 28시간동안 배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 각각의 배지에서 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 동결건조하였다.

각각의 배지에서의 동결건조된 펠릿을 칭량한 후, 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 55℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 각각의 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인으로 여과한 후, 증발기에 의해 농축하였다. 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 폴리머를 얻고, 이 폴리머를 실온에서 진공상태에서 건조시켜 칭량하였다. 수율을 표 31에 표시한다.

	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
(1) YE	750	220	29.3
(2) SG	700	260	37.1
(3) CA	900	340	37.7
(4) PP	1100	450	40.9

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)

PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

이와 같이 해서 얻어진 PHA의 조성을 실시예 26과 마찬가지의 방법으로 분석하였다. 그 결과, PHA는 거의 3-히드록시-5-페닐길초산의 호모폴리머였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 한 실시예에 의해 3-히드록시-5-페닐길초산유닛을 상당히 높은 비율로 함유하는 PHA가 고수율로 얻어지는 것을 알 수 있다.

(실시예 30)

(P161균주에 의한 폴리-3-히드록시-5-페닐길초산의 생산)

NA 0.1%를 함유하는 M9 한천배지상에 성장한 P161균주의 콜로니를, (1) YE 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (2) SG 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (3) BE 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지, (4) PP 0.5% 및 5-페닐길초산 0.1%를 함유하는 M9액체배지 등의 4종류의 배지(각 200㎖)에 각각 식균하고, 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 각 배지로부터 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이들 각각의 배지에서의 동결건조된 펠릿을 칭량한 후, 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 55℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 각각의 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인으로 여과한 후, 증발기에 의해 농축하였다. 농축액을냉메탄올에서 재침전시켜, 폴리머를 얻고, 이 폴리머를 실온에서 진공상태에서 건조시켜 칭량하였다. 수율을 표 32에 표시한다.

	CDW(㎎/ℓ)	PDW(㎎/ℓ)	수율(%)
(1) YE	950	325	34.2
(2) SG	750	240	32.0
(3) BE	450	130	28.9
(4) PP	1000	450	45.0

CDW: 균체의 건조중량(㎎/ℓ)

PDW: 폴리머의 건조중량(㎎/ℓ),

수율: PDW/CDW(%)

이와 같이 해서 얻어진 PHA의 조성을 실시예 26의 방법과 마찬가지로 분석하였다. 그 결과, PHA모노머유닛으로서는 97%가 3-히드록시-5-페닐길초산의 유닛이고, 3%가 3-히드록시낙산의 유닛이었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 한 실시예에 의해 3-히드록시-5-페닐길초산유닛을 상당히 높은 비율로 함유하는 PHA가 고수율로 얻어지는 것을 알 수 있다.

(실시예 31)

30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2균주를 72시간동안 진탕배양하고, 해당 균배양액 2㎖를, 또, D-글루코스 0.5% 및 NO₂PxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 옮겨, 30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 72시간동안 더욱 진탕배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 NO₂PxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분의 조건하에서 48시간동안 진탕배양하였다. 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하였다. 농축액을 냉메탄올에서 재침전시키고, 침전물만을 회수해서 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA를 다음 조건하에서 NMR로 분석하였다.

<측정기기>

FT-NMR : Bruker DPX400

공명주파수 :¹H=400㎒

<측정조건>

측정핵종 :¹H

측정용매 : CDCl₃

기준 : 캐필러리에 밀봉된 TMS/CDCl₃

온도 : 실온

도 14는¹H-NMR스펙트럼패턴을 도시하고, 표 33은 그 패턴의 동정결과를 나타내고, 표 34는 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산의 모노머유닛의 조성을 나타낸다. 표 33에 표시한 바와 같이, 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는, 하기 화학식(45)로 표시되는 PHA이다.

¹H-NMR스펙트럼동정결과(도 14참조)

화학적 이동(ppm)	동정결과
2.80	b1
4.24	d1
5.50	c1
7.00	f1, j1
8.20	g1, l1

균체건조중량 280mg/ℓ폴리머건조중량 30mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 10.7%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HNO2PxB 3.3몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 9.3%3-히드록시헥산산 2.0%3-히드록시옥탄산 12.2%3-히드록시데칸산 47.9%3-히드록시도데칸산 15.7%3-히드록시도데센산 12.9%

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산이외의 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 34에 표시하였다.

또, 이 PHA의 분자량을 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사 HLC-8020, 컬럼: 폴리머레보러토리의 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌으로 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=81,900, Mw=226,200이었다.

(실시예 32)

D-글루코스 0.5% 및 NO₂PxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 45시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 NO₂PxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 다음에, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올로 재침전시키고, 재차 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 실시예 31에서 표시한 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 35에 표시한 바와 같이, 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 35에 표시하였다.

균체건조중량 250mg/ℓ폴리머건조중량 30mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 12.0%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HNO2PxB 4.3몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 1.3%3-히드록시헥산산 0.0%3-히드록시옥탄산 12.6%3-히드록시데칸산 38.8%3-히드록시도데칸산 22.7%3-히드록시도데센산 24.6%

(실시예 33)

폴리펩톤 0.5% 및 NO₂PxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 21시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 NO₂PxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한다음에, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올로 재침전시키고, 재차 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 실시예 31에서 표시한 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 36에 표시한 바와 같이 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-니트로페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 36에 표시하였다.

균체건조중량 785mg/ℓ폴리머건조중량 55mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 7.0%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HNO2PxB 3.8몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 2.9%3-히드록시헥산산 1.5%3-히드록시옥탄산 12.1%3-히드록시데칸산 40.0%3-히드록시도데칸산 14.7%3-히드록시도데센산 28.8%

(실시예 34)

우선, D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 이어서, 해당 균배양액 2㎖를, D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.5%를 함유하는 M9배지 200㎖에 첨가하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 47시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 다음에, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시키고, 침전물만을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA를 다음 조건하에서 NMR로 분석하였다.

<측정기기>

FT-NMR : Bruker DPX400

공명주파수 :¹H=400㎒

<측정조건>

측정핵종 :¹H

측정용매 : CDCl₃

기준 : 캐필러리에 밀봉된 TMS/CDCl₃

측정온도 : 실온

도 15는¹H-NMR스펙트럼을 도시하고, 표 37은 이들의 귀속결과를 나타내고,표 38은 PHA에 함유되는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산의 모노머유닛의 비율을 각각 나타낸다. 표 37에 도시한 바와 같이, 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는, 하기 화학식(46)으로 표시되는 PHA인 것이 확인되었다.

¹H-NMR스펙트럼동정결과(도 15참조)

화학적 이동(ppm)	동정결과
2.79	b1
4.18	d1
5.51	c1
6.98	f1, j1
7.58	g1, l1

슈도모나스 치코리이 YN2균주에 의한 PHA생산

균체건조중량 900mg/ℓ폴리머건조중량 180mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 20.0%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HCNPxBA 4.1몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 9.3%3-히드록시헥산산 2.0%3-히드록시옥탄산 12.2%3-히드록시데칸산 47.9%3-히드록시도데칸산 15.7%3-히드록시도데센산 12.9%

또한, 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 또한, 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 38에 표시하였다.

또한, 상기 PHA의 분자량을 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사 HLC-8020, 컬럼: 폴리머레보러토리의 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌으로 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=58,200, Mw=108,100이었다.

(실시예 35)

우선, D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 해당 균배양액 2㎖를, D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.5%를 함유하는 M9배지 200㎖에 첨가하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 47시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시키고, 침전물만을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 실시예 34에 나타낸 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 39에 표시한 바와 같이 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는 종래의 방법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 39에 표시하였다.

슈도모나스 치코리이 H45균주에 의한 PHA생산

균체건조중량 775mg/ℓ폴리머건조중량 150mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 19.4%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HCNPxBA 3.2몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 70.5%3-히드록시헥산산 1.0%3-히드록시옥탄산 10.3%3-히드록시데칸산 13.4%3-히드록시도데칸산 2.3%3-히드록시도데센산 2.6%

(실시예 36)

D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 다음에, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올로 재침전시키고, 재차 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 실시예 34에서 표시한 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 40에 표시한 바와 같이 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 40에 표시하였다.

슈도모나스 치코리이 YN2균주에 의한 PHA생산

균체건조중량 930mg/ℓ폴리머건조중량 280mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 21.5%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HCNPxBA 4.5몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 12.5%3-히드록시헥산산 2.0%3-히드록시옥탄산 12.2%3-히드록시데칸산 47.3%3-히드록시도데칸산 15.2%3-히드록시도데센산 10.8%

(실시예 37)

D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 다음에, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올로 재침전시키고, 재차 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 실시예 34에서 표시한 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 41에 표시한 바와 같이 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 41에 표시하였다.

슈도모나스 치코리이 H45균주에 의한 PHA생산

균체건조중량 750mg/ℓ폴리머건조중량 135mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 18.0%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HCNPxBA 4.4몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 25.0%3-히드록시헥산산 2.1%3-히드록시옥탄산 21.4%3-히드록시데칸산 37.3%3-히드록시도데칸산 6.0%3-히드록시도데센산 8.2%

(실시예 38)

폴리펩톤 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 23시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 다음에, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올로 재침전시키고, 재차 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 실시예 34에서 표시한 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 42에 표시한 바와 같이 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 42에 표시하였다.

슈도모나스 치코리이 YN2균주에 의한 PHA생산

균체건조중량 1030mg/ℓ폴리머건조중량 130mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 12.6%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HCNPxBA 7.2몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 7.3%3-히드록시헥산산 1.9%3-히드록시옥탄산 14.3%3-히드록시데칸산 48.2%3-히드록시도데칸산 12.8%3-히드록시도데센산 15.5%

(실시예 39)

폴리펩톤 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 23시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 CNPxBA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 다음에, 회전증발기로 여과액을 농축하고, 농축액을 냉메탄올로 재침전시키고, 재차 침전물만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 실시예 34에서 표시한 조건하에서 NMR분석을 행하였다. 그 결과, 표 43에 표시한 바와 같이, 해당 PHA는 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 확인되었다.

또한, 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하고, 3-히드록시-4-(4-시아노페녹시)낙산 이외의 모노머유닛의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 43에 표시하였다.

슈도모나스 치코리이 H45균주에 의한 PHA생산

균체건조중량 695mg/ℓ폴리머건조중량 55mg/ℓ폴리머건조중량/균체건조중량 7.9%

NMR에 의한 모노머유닛의 비율(몰비)PHA에 함유되는 3HCNPxBA 2.6몰%

지방산유래 모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산 2.3%3-히드록시헥산산 1.7%3-히드록시옥탄산 19.5%3-히드록시데칸산 52.1%3-히드록시도데칸산 10.3%3-히드록시도데센산 14.1%

(실시예 40)

(4-(4-플루오로페녹시)낙산의 합성)

신규화합물인 4-(4-플루오로페녹시)낙산을 이하에 기재된 합성법에 의해 조제하였다.

4개의 입구를 구비한 둥근 바닥 플라스크에 240㎖의 탈수아세톤을 넣고, 탄산칼륨 15.2g(0.11몰)을 첨가하고, 질소분위기에서 교반하였다. 이 용액에 요드화나트륨 9.0g(0.06몰), 4-플루오로페놀 7.9g(0.07몰)을 첨가해서, 실온, 질소분위기에서 교반하였다. 이어서, 4-브로모낙산에틸 11.7g(0.06몰)을 첨가해서, 65℃, 24시간 동안 가열환류하였다.

상기 반응종료후, 용매 아세톤을 회전 증발기에 의해 제거하고, 잔사를 클로로포름에 재용해하였다. 물을 가해서, 상분리하고, 유기층을 분취하였다. 이 유기층을 무수 황산마그네슘으로 탈수한 후, 클로로포름을 회전증발기로 제거하였다. 다음에, 진공펌프로 건조하여 조제의 4-(4-플루오로페녹시)낙산에틸 14.0g(가스크로마토그래피-질량분석장치: GC-MS 시마쯔 QP-5050, EI법에 의한 GC-MS피크순도 65. 2%)을 얻었다. 얻어진 조제의 4-(4-플루오로페녹시)낙산에틸은, 정제하지 않고 다음의 에스테르 가수분해반응에 이용하였다.

얻어진 조제물 4-(4-플루오로페녹시)낙산에틸을 에탄올-물(1:9(v/v))혼합액 300㎖에 용해하고, 대략 10배 몰당량의 수산화칼륨을 첨가하여 빙냉하(0∼4℃에서) 4시간동안 반응시켰다. 이 반응액을 0.1mol/ℓ 염산수용액 3ℓ 중에 따라넣어 침전화하였다. 침전물을 여과 ·분리하고, 진공펌프로 건조하여 조제의 4-(4-플루오로페녹시)낙산을 얻었다.

얻어진 조제의 4-(4-플루오로페녹시)낙산(침전물)을, 소량의 열메탄올에 용해하고, 서서히 냉각하여 재결정하였다. 여과된 재결정물을 진공펌프에 의해 건조하여 목적화합물인 4-(4-플루오로페녹시)낙산을 얻었다. 이 일련의 공정에서, 원료인 4-브로모낙산에틸을 기준으로 해서, 얻어진 4-(4-플루오로페녹시)낙산의 수율은 52.7%였다.

얻어진 화합물이, 목적의 4-(4-플루오로페녹시)낙산인 것을 검증하기 위하여, 이하의 측정기기로 다음의 측정조건하에서 NMR분석을 행하여 구조의 동정을 행하였다.

〈측정기기〉

FT-NMR : Bruker DPX 400

〈측정조건〉

공명주파수 :¹H 400㎒

¹³C 100㎒

측정핵종 :¹H,¹³C

사용용매 : CDCl₃

기준 : 캐필러리 봉입 TMS/CDCl₃

측정온도 : 실온

측정된¹H-NMR스펙트럼차트,¹³C-NMR스펙트럼차트를 각각 도 16, 도 17에 표시한다. 표 44, 표 45에, 도 16, 도 17에 표시한 NMR스펙트럼에 대한 각 신호의 해석결과(귀속)를 표시한다. 이 해석결과(귀속)에 의해, 얻어진 화합물은, 목적의 4-(4-플루오로페녹시)낙산인 것이 확인되었다.

¹H-NMR스펙트럼측정결과(도 16참조)

화학적 이동(ppm)	적분치	타입	동정결과
2.11	2H	quint	CH2c
2.59	2H	t	CH2b
3.97	2H	t	CH2d
6.82	2H	m	g,i
6.95	2H	m	f,j
8.00~13.00	1H	브로드	OH

¹³C-NMR스펙트럼측정결과(도 17참조)

화학적 이동(ppm)	타입	동정결과
24.21	s	CH2c
30.39	s	CH2b
66.96	s	CH2d
115.23 & 115.31	d	f, j 또는 g, i
115.56 & 115.79	d	f, j 또는 g, i
154.70 & 154.71	d	e
155.97 & 158.33	d	h
179.40	s	C=O a

(실시예 41)

우선, D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM BP-7375)를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 72시간 진탕배양하고, 다음에, 해당 균배양액 2㎖를, D-글루코스 0.5% 및pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지(무기 질소원인 NH₄Cl을 함유하지 않음) 200㎖에 첨가하고, 계속해서, 125스크로크/분에서 진탕 배양하였다. 45시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 46시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전 증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 채침전하고, 침전물만을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 도 18은, 측정된 GC-MS스펙트럼데이터를 표시하고, 상부차트는 GC 스펙트럼을 나타내고 하부차트는 GC 스펙트럼상의 주 피크에 대한 MS 스펙트럼을 표시한다. 그 결과로부터, 얻어진 PHA는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산(3HpFPxB)을 모노머유닛의 주성분으로서 함유하고, 그 이외에 6종의 모노머유닛을 소량 함유하고, 다음의 화학식(47)으로 표시 가능한 PHA인 것으로 판명되었다.

또한, 이 PHA의 분자량을 겔투과 크로마토그래피(GPC, 토소사 HLC-8020, 컬럼: 폴리머레보러토리의 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

표 46에, 동정결과, 평균분자량 및 동결건조펠릿과 회수폴리머의 수량과 수율을 표시한다. 얻어진 PHA는 3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산(3HpFPxB)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 판명되었다. 또한, 추출된 PHA는 3HpFPxB유닛을 주성분으로 하지만, 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산, 3-히드록시도데칸산, 3-히드록시도데센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 모노머유닛으로서 함유하는 혼합물인 것으로 여겨진다. 평가된 분자량은, 수평균분자량이 Mn= 42,400인 반면, 중량평균분자량이 Mw= 90,600이었다.

YN2균주에 의한 3HpFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	885mg/ℓ
폴리머건조중량	220mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	24.9%
폴리머분자량	Mn=42,400, Mw=90,600
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	1.8%
3-히드록시헥산산	1.0%
3-히드록시옥탄산	5.4%
3-히드록시데칸산	10.4%
3-히드록시도데칸산	2.9%
3-히드록시도데센산	5.9%
3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산	72.6%

또한, 이 PHA에 대해서 실시예 40에 기재된 것과 동일한 측정장치와 동일한 측정조건으로 NMR 분석을 행하였다. 측정된¹H-NMR스펙트럼차트를 도 19에 표시한다. 표 47에, 도 19에 표시된 NMR스펙트럼의 주요피크의 각 신호에 대한 해석결과(귀속)를 표시한다. 이 해석결과(귀속)에 의해서, 얻어진 PHA는 3HpFPxB 유닛을 주성분으로 하는 것이 확인되었다.

¹H-NMR스펙트럼측정결과(도 19참조)

화학적 이동(ppm)	동정결과
2.76	2H, CH2b1
3.95~4.06	2H, CH2d1
5.46	1H, CH c1
6.71~6.90	4H, -C6H4- f1, g1, i1, ji

(실시예 42)

D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주(Pseudomonas cichorii H45; FERM BP-7374)를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 72시간 동안 진탕배양하였다. 다음에, 이 균배양액 2㎖를, D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖로 옮기고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 45시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 46시간후에 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서, 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전 증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에서 재침전시키고, 침전물만을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 해석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 48에, 동정결과 및 동결건조펠릿, 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HpFPxB를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다. 추출된 PHA는 3HpFPxB 유닛을 주성분으로 하고, 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산, 3-히드록시도데칸산, 3-히드록시도데센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 성분을 함유하는 혼합물인 것으로 여겨진다.

H45균주에 의한 3HpFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	640mg/ℓ
폴리머건조중량	90mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	14.0%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	4.6%
3-히드록시헥산산	2.0%
3-히드록시옥탄산	15.2%
3-히드록시데칸산	19.8%
3-히드록시도데칸산	4.0%
3-히드록시도데센산	7.4%
3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산	74.0%

(실시예 43)

D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스크로크/분에서 진탕배양하였다. 96시간 후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시키고, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 49에, 동정결과, 동결건조펠릿, 회수 폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HpFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.

YN2균주에 의한 3HpFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	780mg/ℓ
폴리머건조중량	200mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	25.6%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	0.3%
3-히드록시헥산산	0.8%
3-히드록시옥탄산	3.9%
3-히드록시데칸산	6.7%
3-히드록시도데칸산	2.1%
3-히드록시도데센산	3.7%
3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산	82.5%

(실시예 44)

D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45 균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 96시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 50에, 동정결과, 동결건조펠릿, 회수 폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HpFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.

H45균주에 의한 3HpFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	590mg/ℓ
폴리머건조중량	45mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	7.6%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	0.2%
3-히드록시헥산산	1.9%
3-히드록시옥탄산	11.9%
3-히드록시데칸산	12.1%
3-히드록시도데칸산	2.2%
3-히드록시도데센산	5.0%
3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산	66.7%

(실시예 45)

폴리펩톤 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에서 재침전시키고, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피 질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 51에, 동정결과, 동결건조펠릿, 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HpFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 판명되었다.

YN2균주에 의한 3HpFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	960mg/ℓ
폴리머건조중량	155mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	16.1%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	0.5%
3-히드록시헥산산	1.0%
3-히드록시옥탄산	8.9%
3-히드록시데칸산	23.4%
3-히드록시도데칸산	7.0%
3-히드록시도데센산	14.2%
3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산	45.0%

(실시예 46)

폴리펩톤 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45 균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 pFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 침전물만을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 52에, 동정결과 및, 동결건조펠릿, 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HpFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.

H45균주에 의한 3HpFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	545mg/ℓ
폴리머건조중량	30mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	5.5%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	2.3%
3-히드록시헥산산	1.6%
3-히드록시옥탄산	15.6%
3-히드록시데칸산	36.9%
3-히드록시도데칸산	8.7%
3-히드록시도데센산	12.9%
3-히드록시-4-(4-플루오로페녹시)낙산	22.0%

(실시예 47)

(4-(3-플루오로페녹시)낙산의 합성)

신규화합물인 4-(3-플루오로페녹시)낙산을 이하에 기재된 합성방법에 의해 조제하였다.

4개의 입구를 지닌 둥근 바닥 플라스크에 240㎖의 탈수아세톤을 따라 넣고, 탄산칼륨 15. 2g(0.11mol)을 첨가하고, 질소분위기에서 교반하였다. 이 용액에 요드화나트륨 9.0g(0.06몰), 3-플루오로페놀 7.9g(0.07몰)을 첨가해서, 실온, 질소분위기에서 충분히 교반하였다. 이어서, 4-브로모낙산에틸 11.7g(0.06몰)을 첨가해서, 65℃, 24시간 동안 가열환류하였다.

상기 반응 종료후, 용매 아세톤을 회전증발기에 의해 증류제거하고, 잔사를 클로로포름에 재용해하였다. 물을 가해서 상분리하고, 유기층을 분취하였다. 이 유기층을 무수 황산마그네슘으로 탈수한 후, 클로로포름을 회전증발기로 제거하였다. 다음에, 진공펌프로 건조하여 조제의 4-(3-플루오로페녹시)낙산에틸 14.0g(가스크로마토그래피-질량분석장치: GC-MS 시마쯔 QP-5050, EI법에 의한 GC-MS 피크순도 87.9%)을 얻었다. 이와 같이 해서 얻어진 조제의 4-(3-플루오로페녹시)낙산에틸은, 정제하지 않고 다음의 에스테르 가수분해반응에 이용하였다.

이와 같이 해서 얻어진 조제물인 에스테르 3.0g을 에탄올-물(1: 9(v/v))혼합액 100㎖에 용해하고, 대략 10배 몰당량의 수산화칼륨을 첨가하여 실온에서 4시간동안 반응시켰다. 이 반응액은 0.1mol/ℓ 염산수용액 약 200㎖중에 따라 넣어 침전화하였다. 침전물을 여과 ·분리하고, 진공펌프로 건조하여 조제의 4-(3-플루오로페녹시)낙산을 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 조제의 4-(3-플루오로페녹시)낙산(침전물)을, 소량의 열 메탄올에 용해하고, 서서히 냉각하여 재결정하였다. 여과된 재결정물을 진공펌프에 의해 건조하여 4-(3-플루오로페녹시)낙산을 얻었다.

에테르조제물 3.0g으로부터 얻어진 4-(3-플루오로페녹시)낙산의 수량은 2.4g이었다. 따라서, 이 공정전체에서, 원료인 4-브로모낙산에틸을 기준으로 해서 얻은 4-(3-플루오로페녹시)낙산의 수율은 93.2%였다.

얻어진 화합물이 목적의 4-(3-플루오로페녹시)낙산인 것을 검증하기 위하여, 이하의 측정기기로 다음의 측정조건하에서 NMR 분석을 행하여 구조의 동정을 행하였다.

〈측정기기〉

FT-NMR : Bruker DPX 400

〈측정조건〉

공명주파수 :¹H 400㎒

¹³C 100㎒

측정핵종 :¹H,¹³C

사용용매 : CDCl₃

기준 : 캐필러리 봉입 TMS/CDCl₃

측정온도 : 실온

측정된¹H-NMR스펙트럼,¹³C-NMR스펙트럼을 각각 도 20, 도 21에 표시한다. 표 53, 표 54에 도 20, 도 21에 표시한 NMR스펙트럼에 대한 각 신호의 해석결과(귀속)를 표시한다. 이 해석결과(귀속)에 의해, 얻어진 화합물은 목적의 4-(3-플루오로페녹시)낙산인 것을 확인하였다.

¹H-NMR스펙트럼측정결과(도 20 참조)

화학적 이동(ppm)	적분치	타입	동정결과
2.11	2H	d, quint	CH2c
2.59	2H	t	CH2b
3.97	2H	t	CH2d
6.62	3H	m	h,i,j
7.21	1H	m	f
10.62	1H	브로드	OH

¹³C-NMR스펙트럼측정결과(도 21 참조)

화학적 이동(ppm)	타입	동정결과
24.1	s	CH2c
30.34	s	CH2b
66.62	s	CH2d
101.23 & 102.19	d	f
107.39 & 107.60	d	h
110.08 & 110.11	d	j
130.04 & 130.14	d	i
159.92 & 160.03	d	e
162.29 & 164.73	d	g
179.19	s	C=O a

(실시예 48)

우선, D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주(Pseudomonas cichorii YN2; FERM BP-7375)를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하고, 이어서, 해당 균배양액 2㎖를, D-글루코스 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 옮기고, 계속해서 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 45시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 mFPxBA0.1%를 함유하지만 무기 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 47시간후에, 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 도 22는 측정된 GC-MS 스펙트럼데이터를 표시하고, 도 22의 상부차트는 GC스펙트럼을 나타내고, 하부차트는 GC스펙트럼상의 주 피크에 대한 MS스펙트럼을 표시한다. 그 결과로부터, 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산(3HmFPxB)을 모노머유닛의 주성분으로서 함유하고, 그 이외에 6종의 모노머유닛을 소량 함유하고, 다음의 화학식(48)로표시가능한 PHA인 것으로 판명되었다.

또한, PHA의 분자량을 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사 HLC-8020, 컬럼: 폴리머레보러토리의 PLgel·MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

표 55에, 동정결과, 평균분자량 및 동결건조펠릿과 회수폴리머의 수량과 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산(3HmFPxB)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것이 판명되었다. 또한 추출된 PHA는 3HmFPxB유닛을 주성분으로 하고, 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산, 3-히드록시도데칸산, 3-히드록시도데센산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 모노머유닛으로서 함유하는 혼합물인 것으로 여겨진다. 평가된 분자량은, 수평균분자량이 Mn= 34,500인 반면, 중량평균분자량이 Mn= 75,200이었다.

YN2균주에 의한 3HmFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	745mg/ℓ
폴리머건조중량	80mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	10.7%
폴리머분자량	Mn=34,500, Mw=75,200
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	1.2%
3-히드록시헥산산	1.0%
3-히드록시옥탄산	6.5%
3-히드록시데칸산	9.5%
3-히드록시도데칸산	3.5%
3-히드록시도데센산	5.9%
3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산	72.5%

또한, 이 PHA에 대해서, 실시예 47에 기재된 것과 동일한 측정장치와 동일한 측정조건으로 NMR분석을 행하였다. 측정된¹H-NMR스펙트럼은 도 23에 표시한다. 표 56에, 도 23에 표시된 NMR스펙트럼의 주요피크의 각 신호에 대한 해석결과(귀속)를 표시한다. 이 해석결과(귀속)에 의해서, 얻어진 PHA는 3HmFPxB유닛을 주성분으로 하는 것이 확인되었다.

¹H-NMR스펙트럼측정결과(도 23 참조)

화학적 이동(ppm)	동정결과
2.75	2H, CH2b1
4.00	2H, CH2d1
5.48	1H, CH c1
6.52~6.62	3H, h1, i1, ji
7.26	3H, f1

(실시예 49)

D-글루코스 0.5%를 함유하는 M9배지 10㎖에 슈도모나스 치코리이 H45균주(Pseudomonas cichorii H45 ; FERM BP-7374)를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 72시간동안 진탕배양하였다. 이어서, 해당 균배양액 2㎖를, D-글루코스 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖로 옮기고, 또, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 45시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지에 재현탁하고, 또, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 47시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량 분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 57에, 동정결과 및 동결건조펠릿, 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HmFPxB를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다. 또, 추출된 PHA는 3HmFPxB유닛을 주성분으로 하고, 3-히드록시낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데칸산, 3-히드록시도데칸산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 성분을 모노머유닛으로서 함유하는 혼합물인 것으로 여겨진다.

H45균주에 의한 3HmFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	630mg/ℓ
폴리머건조중량	45mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	7.1%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	3.7%
3-히드록시헥산산	2.2%
3-히드록시옥탄산	21.0%
3-히드록시데칸산	29.2%
3-히드록시도데칸산	8.2%
3-히드록시도데센산	10.1%
3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산	25.6%

(실시예 50)

D-글루코스 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45 균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 96시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 재침전시켜, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 58에, 동정결과 및 동결건조펠릿과 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HmFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA인 것으로 판명되었다.

H45균주에 의한 3HmFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	515mg/ℓ
폴리머건조중량	40mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	7.8%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	3.0%
3-히드록시헥산산	2.0%
3-히드록시옥탄산	16.8%
3-히드록시데칸산	16.8%
3-히드록시도데칸산	4.7%
3-히드록시도데센산	7.4%
3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산	49.3%

(실시예 51)

폴리펩톤 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 침전시키고, 침전물을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 59에, 동정결과 및 동결건조펠릿과 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 3HmFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA이다.

YN2균주에 의한 3HmFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	900mg/ℓ
폴리머건조중량	90mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	10.0%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	20.1%
3-히드록시헥산산	1.5%
3-히드록시옥탄산	9.8%
3-히드록시데칸산	15.5%
3-히드록시도데칸산	5.5%
3-히드록시도데센산	9.7%
3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산	37.9%

(실시예 52)

폴리펩톤 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 H45 균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간 후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 피루브산나트륨 0.5% 및 mFPxBA 0.1%를 함유하지만 무기질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁하고, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한후, 회전증발기에 의해 농축하고, 농축액을 냉메탄올에서 침전시켜, 침전물만을 회수하고, 진공상태에서 건조하여 PHA를 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 PHA는, 메탄올리시스를 행한 후, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 표 60에, 동정결과 및 동결건조펠릿과 회수폴리머의 수량, 수율을 표시한다. 이와 같이 해서 얻어진 PHA는 3HmFPxB를 주된 모노머유닛으로서 함유하는 PHA이다.

H45균주에 의한 3HmFPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산

균체건조중량	565mg/ℓ
폴리머건조중량	25mg/ℓ
폴리머건조중량/균체건조중량	4.4%
모노머유닛조성(면적비)
3-히드록시낙산	4.2%
3-히드록시헥산산	1.9%
3-히드록시옥탄산	17.8%
3-히드록시데칸산	38.0%
3-히드록시도데칸산	9.5%
3-히드록시도데센산	13.8%
3-히드록시-4-(3-플루오로페녹시)낙산	14.8%

(실시예 53)

〈YN2균주에 의한 HFPxV유닛을 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계 배양)〉

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 5-(4-플루오로페녹시)길초산(FPxVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 27시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하여 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛ ; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 분자량 및 모노머유닛의 분석결과를 표 61에 표시한다. 모노머유닛의 비율은 GC-MS 토탈이온 크로마토그램(TIC)의 면적비로부터 계산하였다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 24 및 도 25에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	665
폴리머건조중량(mg/ℓ)	105
수평균분자량(Mn)×104	1.6
중량평균분자량(Mw)×104	3.7
3-히드록시낙산(%)	75.2
3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(%)	24.8

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 5-(4-플루오로페녹시)길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 54)

〈YN2 균주에 의한 HFPV를 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계 배양)〉

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 5-(4-플루오로페녹시)길초산(FPVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 27시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하여 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel· MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 동안 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 분자량 및 모노머유닛의 분석결과를 표 62에 표시한다. 모노머유닛의 비율은 GC-MS 토탈이온 크로마토그램(TIC)의 면적비로부터 계산하였다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 26 및 도 27에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1120
폴리머건조중량(mg/ℓ)	625
수평균분자량(Mn)×104	4.8
중량평균분자량(Mw)×104	9.9
3-히드록시낙산(%)	17.4
3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(%)	82.6

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 5-(4-플루오로페닐)길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산 유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 55)

〈YN2 균주에 의한 HFPxV를 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)〉

글루코스 0.5% 및 5-(4-플루오로페녹시)길초산(FPxVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 FPxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 62시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물만을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻었다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 동안 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 분자량 및 모노머유닛의 분석결과를 표 63에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 28 내지 도 30에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	835
폴리머건조중량(mg/ℓ)	395
수평균분자량(Mn)×104	5.2
중량평균분자량(Mw)×104	14.9
3-히드록시옥탄산(%)	10.6
3-히드록시데칸산(%)	9.5
3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(%)	79.9

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 5-(4-플루오로페녹시)길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(3HFPxV) 유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있었다.

(실시예 56)

〈YN2균주에 의한 HFPV를 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)〉

글루코스 0.5% 및 5-(4-플루오로페닐)길초산(FPVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 FPxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 62시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시키고, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻었다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel ·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DS-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 및 모노머유닛의 분석결과를 표 64에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 31 내지 도 33에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1450
폴리머건조중량(mg/ℓ)	1010
수평균분자량(Mn)×104	6.0
중량평균분자량(Mw)×104	14.8
3-히드록시옥탄산(%)	2.8
3-히드록시데칸산(%)	2.7
3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(%)	94.5

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 5-(4-플루오로페닐)길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV) 유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 57)

〈YN2균주에 의한 HFPV 유닛과 HFPxV 유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)〉

글루코스 0.5% 및 5-(4-플루오로페닐)길초산(FPVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 및 글루코스 0.5% 및 5-(4-플루오로페녹시)길초산(FPxVA) 0.1%를 함유하는 M9배지를 각각 준비하였다. YN2균주를 각각의 M9배지 200㎖에 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 94시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 이들의 두 배양균체를, 글루코스 0.5%, FPVA 0.1% 및 FPxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 함께 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 원심분리에 의해 균체를 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시키고, 침전물을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020;컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름 ;분자량: 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유가층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 및 모노머유닛의 분석결과를 표 65에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV) 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(3HFPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 34 내지 도 37에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1605
폴리머건조중량(mg/ℓ)	760
수평균분자량(Mn)×104	4.6
중량평균분자량(Mw)×104	12.6
3-히드록시옥탄산(%)	0.5
3-히드록시데칸산(%)	0.4
3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(%)	90.0
3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(%)	9.1

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 5-(4-플루오로페닐)길초산과 5-(4-플루오로페녹시)길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-(4-플루오로페닐)길초산(3HFPV)유닛 및 3-히드록시-5-(4-플루오로페녹시)길초산(3HFPxV) 유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 58)

〈YN2균주에 의한 HPxN 유닛과 HPxHp 유닛 및 HPxV 유닛을 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계 배양)〉

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 11-페녹시운데칸산(PxUDA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하여 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 아세톤에 현탁하고, 23℃에서 72시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 해당 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020;컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 및 모노머유닛의 분석결과를 표 66에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxHp) 메틸에스테르, 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르 및 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도 38 내지 도 43에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1200
폴리머건조중량(mg/ℓ)	500
수평균분자량(Mn)×104	2.2
중량평균분자량(Mw)×104	4.9
3-히드록시낙산(%)	3.4
3-히드록시옥탄산(%)	0.3
3-히드록시데칸산(%)	0.5
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	34.1
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	51.1
3-히드록시-9-페녹시노난산(%)	10.6

이 결과로부터, YN2 균주에 의해, 11-페녹시운데칸산을 기질로 해서, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV), 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 및 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN)의 3개의 유닛을 포함한 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 59)

〈YN2 균주에 의한 HPxN 유닛과 HPxHp 유닛 및 HPxV 유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)〉

글루코스 0.5% 및 11-페녹시운데칸산(PxUDA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후에,배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 PxUDA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고, 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 및 모노머유닛의 분석결과를 표 67에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시헥산산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르, 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르 및 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도 44 내지 도 52에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1305
폴리머건조중량(mg/ℓ)	765
수평균분자량(Mn)×104	5.0
중량평균분자량(Mw)×104	11.6
3-히드록시낙산(%)	0.1
3-히드록시헥산산(%)	0.3
3-히드록시옥탄산(%)	3.0
3-히드록시데칸산(%)	5.2
3-히드록시도데칸산(%)	1.6
3-히드록시도데센산(%)	2.0
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	40.7
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	40.4
3-히드록시-9-페녹시노난산(%)	6.7

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 11-페녹시운데칸산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV), 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 및 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN)의 3유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 60)

<H45균주에 의한 HPxN 유닛과 HPxHp 유닛 및 HPxV 유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)〉

글루코스 0.5% 및 11-페녹시운데칸산(PxUDA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 PxUDA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 68에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시헥산산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르,3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르, 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르, 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도 53 내지 도 61에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1085
폴리머건조중량(mg/ℓ)	585
수평균분자량(Mn)×104	4.0
중량평균분자량(Mw)×104	8.9
3-히드록시낙산(%)	0.4
3-히드록시헥산산(%)	0.3
3-히드록시옥탄산(%)	3.2
3-히드록시데칸산(%)	5.1
3-히드록시도데칸산(%)	1.1
3-히드록시도데센산(%)	0.9
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	43.0
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	43.9
3-히드록시-9-페녹시노난산(%)	2.1

이 결과로부터, H45균주에 의해, 11-페녹시운데칸산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV), 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 및 3-히드록시-9-페녹시노난산(3HPxN)의 3유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 61)

〈YN2 균주에 의한 HPxO유닛, HPxHx 유닛 및 HPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계 배양)〉

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 8-페녹시옥탄산(PxOA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은, 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 69에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르, 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르, 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도 62 내지 도 65에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1100
폴리머건조중량(mg/ℓ)	440
수평균분자량(Mn)×104	4.0
중량평균분자량(Mw)×104	7.4
3-히드록시낙산(%)	16.4
3-히드록시-4-페녹시낙산(%)	13.4
3-히드록시-6-페녹시헥산산(%)	67.9
3-히드록시-8-페녹시옥탄산(%)	2.3

이 결과로부터, YN2 균주에 의해, 8-페녹시운데칸산을 기질로 해서, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB), 3-히드록시-6-페녹시산헥산산(3HPxHx) 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HFPxO)의 3유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 62)

<H45균주에 의한 HPxO유닛, HPxHx유닛 및 HPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계배양)>

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 8-페녹시옥탄산(PxOA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 폴리머를 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020,컬럼: 폴리머래보러토리, PLgel·MIED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌환산분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAZETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 70에 표시한다. 또한, GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르, 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르, 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 66 내지 도 69에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	860
폴리머건조중량(mg/ℓ)	190
수평균분자량(Mn)×104	3.4
중량평균분자량(Mw)×104	6.8
3-히드록시낙산(%)	0.2
3-히드록시-4-페녹시낙산(%)	5.1
3-히드록시-6-페녹시헥산산(%)	82.9
3-히드록시-8-페녹시옥탄산(%)	11.8

이 결과로부터, H45균주에 의해 8-페녹시옥탄산을 기질로 해서, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB), 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO)의 3유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 63)

<YN2균주에 의한 HPxO유닛, HPxHx유닛 및 HPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)>

글루코스 0.5% 및 8-페녹시옥탄산(PxOA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 PxOA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이어서 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 71에 표시한다. GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르, 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도 70 내지 도 75에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1405
폴리머건조중량(mg/ℓ)	700
수평균분자량(Mn)×104	4.9
중량평균분자량(Mw)×104	10.7
3-히드록시낙산(%)	4.8
3-히드록시옥탄산(%)	1.2
3-히드록시데칸산(%)	0.5
3-히드록시-4-페녹시낙산(%)	7.8
3-히드록시-6-페녹시헥산산(%)	74.8
3-히드록시-8-페녹시옥탄산(%)	10.9

이 결과로부터, YN2균주에 의해 8-페녹시옥탄산을 기질로 해서 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB), 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO)의 3유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 64)

<H45균주에 의한 HPxO유닛, HPxHx유닛 및 HPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계 배양)>

글루코스 0.5% 및 8-페녹시옥탄산(PxOA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간 후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 PxOA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고, 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머래보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛: 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다, 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하여였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 모노머유닛의 분석결과를 표 72에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시헥산산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB) 메틸에스테르, 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 메틸에스테르 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도 76 내지 도 84에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1255
폴리머건조중량(mg/ℓ)	560
수평균분자량(Mn)×104	4.8
중량평균분자량(Mw)×104	9.7
3-히드록시낙산(%)	0.2
3-히드록시헥산산(%)	0.1
3-히드록시옥탄산(%)	0.9
3-히드록시데칸산(%)	0.9
3-히드록시도데칸산(%)	0.1
3-히드록시도데센산(%)	0.2
3-히드록시-4-페녹시낙산(%)	2.5
3-히드록시-6-페녹시헥산산(%)	82.8
3-히드록시-8-페녹시옥탄산(%)	12.3

이 결과로부터, H45균주에 의해, 8-페녹시옥탄산을 기질로 해서, 3-히드록시-4-페녹시낙산(3HPxB), 3-히드록시-6-페녹시헥산산(3HPxHx) 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산(3HPxO)의 3개의 모노머유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 65)

<YN2균주에 의한 HPxHp유닛 및 HPxV유닛을 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계배양)>

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 7-페녹시헵탄산(PxHpA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후에 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전 시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 래보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 라운드넥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여, PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 모노머유닛의 분석결과를 표 73에 표시한다. GC-MS에 의한 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을도 85 내지 도 89에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	995
폴리머건조중량(mg/ℓ)	505
수평균분자량(Mn)×104	4.6
중량평균분자량(Mw)×104	9.2
3-히드록시낙산(%)	1.4
3-히드록시옥탄산(%)	0.1
3-히드록시데칸산(%)	0.2
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	29.7
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	68.6

이 결과로부터, YN2균주에 의해 7-페녹시헵탄산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp)의 유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 66)

<H45 균주에 의한 HPxHp유닛 및 HPxV유닛을 함유하는 PHA의 생산(폴리펩톤을 사용하는 1단계배양)>

폴리펩톤(와코 준야쿠사제) 0.5% 및 7-페녹시헵탄산(PxHpA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하고, 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사 HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리: 폴리스티렌 환산분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 도 74는 균체 및 폴리머의 수율, 모노머유닛의 분석결과를 표시한다. 또한 도 90 내지 도 92는, GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	815
폴리머건조중량(mg/ℓ)	270
수평균분자량(Mn)×104	3.3
중량평균분자량(Mw)×104	6.4
3-히드록시낙산(%)	1.2
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	26.7
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	72.1

이 결과로부터, H45균주에 의해, 7-페녹시헵탄산을 기질로 해서, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp)의 2개의 유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 67)

<YN2균주에 의한 HPxHp유닛과 HPxV유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를사용하는 2단계 배양)>

글루코스 0.5% 및 7-페녹시헵탄산(PxHpA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간 후에 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 PxHpA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 더욱 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고, 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시긴동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍 직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다, 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 75에 표시한다. 또한, GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시헥산산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량 스펙트럼을 각각 도 93 내지 도 100에 표시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1520
폴리머건조중량(mg/ℓ)	860
수평균분자량(Mn)×104	6.1
중량평균분자량(Mw)×104	13.0
3-히드록시낙산(%)	0.1
3-히드록시헥산산(%)	0.4
3-히드록시옥탄산(%)	3.5
3-히드록시데칸산(%)	4.1
3-히드록시도데칸산(%)	1.1
3-히드록시도데센산(%)	3.1
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	55.0
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	32.7

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 7-페녹시헵탄산을 기질로 해서, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp)의 2개의 유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 68)

<H45균주에 의한 HPxHp유닛 및 HPxV유닛을 함유하는 PHA의 생산(글루코스를 사용하는 2단계배양)>

글루코스 0.5% 및 7-페녹시헵탄산(PxHpA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 64시간 후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 글루코스 0.5% 및 PxHpA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여, PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머 유닛의 분석결과를 표 76에 표시한다. GC-MS측정으로부터 얻어진 3-히드록시헥산산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 101 내지 도 107에 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1305
폴리머건조중량(mg/ℓ)	685
수평균분자량(Mn)×104	4.1
중량평균분자량(Mw)×104	8.8
3-히드록시헥산산(%)	0.1
3-히드록시옥탄산(%)	1.3
3-히드록시데칸산(%)	1.8
3-히드록시도데칸산(%)	0.4
3-히드록시도데센산(%)	0.6
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	36.1
3-히드록시-7-페녹시헵탄산(%)	59.7

이 결과로부터, H45균주에 의해 7-페녹시헵탄산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산(3HPxHp)의 2개의 유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 69)

<YN2균주에 의한 PHPxV유닛을 함유하는 PHA의 생산(말산나트륨을 사용하는 2단계배양)>

말산나트륨 0.5% 및 5-페녹시길초산(PxVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 60시간후에, 배양된 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 말산나트륨 0.5% 및 PxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조를 하고 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DE-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 77에 표시한다. 또한 GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시헥산산 메틸에테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 108 내지 도 114에 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	890
폴리머건조중량(mg/ℓ)	420
수평균분자량(Mn)×104	9.7
중량평균분자량(Mw)×104	29.7
3-히드록시낙산(%)	0.2
3-히드록시헥산산(%)	0.3
3-히드록시옥탄산(%)	2.4
3-히드록시데칸산(%)	3.3
3-히드록시도데칸산(%)	0.7
3-히드록시도데센산(%)	1.5
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	91.6

이 결과로부터, YN2균주에 의해, 5-페녹시길초산을 기질로 해서, 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV)유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 70)

<H45균주에 의한 HPxV 유닛을 함유하는 PHA의 생산(말산나트륨을 사용하는 2단계 배양)>

말산나트륨 0.5% 및 5-페녹시길초산(PxVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 H45균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 60시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 말산나트륨 0.5% 및 PxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고, 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올에 침천시켜,침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다,

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 래보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다, 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율, 및 모노머유닛의 분석결과를 표 78에 표시한다. 또한 GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시헥산산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데칸산 메틸에스테르, 3-히드록시도데센산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 메틸에스테르의 질량 스펙트럼을 도 115 내지 도 120에 각각 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	910
폴리머건조중량(mg/ℓ)	390
수평균분자량(Mn)×104	9.1
중량평균분자량(Mw)×104	21.4
3-히드록시헥산산(%)	0.2
3-히드록시옥탄산(%)	2.2
3-히드록시데칸산(%)	4.9
3-히드록시도데칸산(%)	0.8
3-히드록시도데센산(%)	1.5
3-히드록시-5-페녹시길초산(%)	90.4

이 결과로부터, H45균주에 의해 5-페녹시길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페녹시길초산(3HPxV) 유닛을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 71)

<YN2균주에 의한 HPV유닛을 함유하는 PHA의 생산(프럭토스를 사용한 2단계 배양)>

프럭토스 0.5% 및 5-페닐길초산(PVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 120시간후에 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 프럭토스 0.5% 및 PxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 50시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고, 칭량하였다.

이 동결건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머 유닛의 분석결과를 표 79에 표시한다. 또한 GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV) 메틸에스테르의 질량 스펙트럼을 각각 도 121 내 도 123에 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1400
폴리머건조중량(mg/ℓ)	935
수평균분자량(Mn)×104	6.2
중량평균분자량(Mw)×104	14.0
3-히드록시옥탄산(%)	0.6
3-히드록시데칸산(%)	0.7
3-히드록시-5-페닐길초산(%)	98.7

이 결과로부터, YN2균주에 의해 5-페닐길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV)유닛을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 72)

<YN2균주에 의한 HPV유닛을 함유하는 PHA의 생산(만노스를 사용하는 2단계배양)>

만노스 0.5% 및 5-페녹시길초산(PVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕 배양하였다. 43시간 후에, 균체를원심분리에 의해 회수하고, 만노스 0.5% 및 PxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕 배양하였다. 91시간 후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고 칭량하였다.

이 동결 건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에 침전시키고, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻고, 이것을 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 컬럼: 폴리머레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛; 용매: 클로로포름; 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머유닛의 분석결과를 표 80에 표시한다. GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 124 및 도 125에 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	1350
폴리머건조중량(mg/ℓ)	955
수평균분자량(Mn)×104	6.1
중량평균분자량(Mw)×104	13.8
3-히드록시옥탄산(%)	1.9
3-히드록시-5-페닐길초산(%)	98.1

이 결과로부터, YN2균주에 의해 5-페닐길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV)을 함유하는 PHA 코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 73)

<YN2균주에 의한 HPV유닛을 함유하는 PHA의 생산(유산(乳酸)나트륨을 사용하는 2단계 배양)>

유산(乳酸)나트륨 0.5% 및 5-페닐길초산(PVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 YN2균주를 식균하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 46시간 후에 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 유산나트륨 0.5% 및 PxVA 0.1%를 함유하지만 질소원(NH₄Cl)을 함유하지 않는 M9배지 200㎖에 재현탁한 다음에, 또 30℃, 125스트로크/분에서 진탕 배양하였다. 28시간 후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하여 동결건조하고, 칭량하였다.

이 동결 건조된 펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 24시간 동안 교반하여 폴리머를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후, 회전증발기를 사용하여 농축하고, 농축액을 냉메탄올에 침전시켜, 침전물을 회수해서 진공건조하여 폴리머를 얻은 다음에, 칭량하였다.

얻어진 폴리머의 분자량은, 겔투과 크로마토그래피(GPC: 토소사, HLC-8020; 폴리머 레보러토리, PLgel·MIXED-C·5㎛, 용매: 클로로포름, 분자량: 폴리스티렌 환산 분자량)에 의해 측정하였다.

얻어진 폴리머의 유닛조성은 이하의 방식으로 분석하였다. 즉, 폴리머 샘플 5mg을 25㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 클로로포름 2㎖ 및 황산을 3%(v/v) 함유하는 메탄올 2㎖를 첨가하였다. 혼합액을 100℃에서 3.5시간동안 환류하고, 또 물을 부가하여 분액하였다. 유기층을 가스 크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050, 컬럼: DB-WAXETR(J&W사제), EI법)로 분석하여 PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 균체 및 폴리머의 수율 및 모노머 유닛의 분석결과를 표 81에 표시한다. 또한, GC-MS측정에 의해 얻어진, 3-히드록시낙산 메틸에스테르, 3-히드록시옥탄산 메틸에스테르, 3-히드록시데칸산 메틸에스테르 및 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV) 메틸에스테르의 질량스펙트럼을 각각 도 126 내지 도 129에 도시한다.

균체건조중량(mg/ℓ)	2050
폴리머건조중량(mg/ℓ)	1310
수평균분자량(Mn)×104	6.3
중량평균분자량(Mw)×104	13.9
3-히드록시낙산(%)	7.5
3-히드록시옥탄산(%)	0.8
3-히드록시데칸산(%)	0.8
3-히드록시-5-페닐길초산(%)	90.6

이 결과로부터, YN2균주에 의해 5-페닐길초산을 기질로 해서 3-히드록시-5-페닐길초산(3HPV)을 함유하는 PHA코폴리머를 생산할 수 있는 것을 알 수 있다.

(실시예 74)

<YN2균주에 의한 HPxB유닛을 함유하는 PHA생산(말산 2나트륨을 사용하는 2단계 배양)>

말산 2나트륨·0.5수화물, L-글루탐산 나트륨·1수화물, D(+)-글루코스, n-노난산 또는 폴리펩톤(일본제약)중 어느 것 하나 0.5%와, 4-페녹시-n-낙산(PxBA) 0.1%를 각각 함유하는 5종류의 M9배지 200㎖에, 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 30℃에서 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해 회수하고, 냉메탄올로 한번 세정하고 진공건조하였다.

이들 5개의 펠릿을 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 20시간동안 60℃에서 교반하여 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 후, 각각의 추출액을 회전증발기로 농축하고, 농축액을 냉메탄올 중에서 재침전시켜, 각각의 침전물을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻어진 PHA는, 상법에 따라 메탄올리시스를 행한 후에, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050: EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 표 82에 표시한 바와 같이 말산 2나트륨을 증식용 탄소원으로서 배양한 경우에, 4-페녹시-n-낙산으로부터 유래하는 소망의 모노머 유닛인 3-히드록시-4-페녹시-3-낙산(3HPxB)유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻었다. 표 83에 말산 2나트륨을 이용해서 배양한 경우의 균체 및 폴리머 수량 및 폴리머의 조성을 표시한다.

YN2균주에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 생산

	폴리머수량(㎎/ℓ)	3-히드록시-4-페녹시-n-낙산유닛조성비*
말산 2나트륨	20	96.6%
L-글루타민산 나트륨	13	8.9%
D(+)-글루코스	8	98.4%
n-노난산	440	ND
폴리펩톤	17	43.5%

*GC-MS, TIC피크면적비, ND검출되지 않음

YN2균주에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 생산

균체건조중량(㎎/ℓ)	290
폴리머중량(㎎/ℓ)	20
모노머유닛조성(피크면적비)3-히드록시낙산3-히드록시헥산산3-히드록시옥탄산3-히드록시노난산3-히드록시데칸산3-히드록시도데칸산3-히드록시도데센산3-히드록시-4-페녹시-n-낙산	0.1%0.2%1.1%0.1%0.9%0.2%0.5%96.9%

(실시예 75)

<YN2균주에 의한 HPxB유닛을 함유하는 PHA의 생산(말산 2나트륨 2단계 배양: 대량배양)>

효모엑기스(오리엔탈 효모공업) 0.5%를 함유하는 M9배지 200㎖에 슈도모나스 치코리이 YN2균주를 식균하고, 종균배양으로서 30℃, 125스트로크/분에서 8시간 진탕배양하였다. 말산 2나트륨 0.5수화물 0.5% 및 4-페녹시-n-낙산 0.1%를 함유하는 M9배지 5ℓ를 함유하는 용량 10ℓ의 자퍼멘터(jar fermenter)에, 상기 종균체 50㎖를 접종하고, 30℃, 80회전/분, 통기량 2.5ℓ/분에서 통기교반 배양하였다. 39시간후에, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다. 이 펠릿을 약 1.7% 차아염소산 나트륨 수용액 120㎖에 현탁하고, 2시간동안 4℃에서 진탕하여 PHA를 추출하였다. 원심분리에 의해 PHA를 회수하고 건조하여, 배지액량 1ℓ당 56mg의 PHA를 얻었다.

얻어진 PHA는, 상법에 의해 메탄올리시스를 행한 후에, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마쯔 QP-5050; EI법)에 의해 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과, 4-페녹시-n-낙산으로부터 유래하는 소망의 모노머 유닛인 3-히드록시-4-페녹시-n-낙산 유닛의 조성비(GC-MS, 피크면적비)는 99.7%였다.

이상, 본 발명에 의하면, 신규한 폴리히드록시알카노에이트를 제조하는 데 이용되는 신규의 미생물이 제공되며, 해당 미생물은 상기 폴리히드록시알카노에이트를 생산하여 균체내에 축적하는 능력을 지닌다.

이러한 미생물을 이용해서 폴리하이드록시알카노에이트를 제조함으로써, 기능성 폴리머로서도 유용한 각종 작용기를 도입한 폴리히드록시알카노에이트를 극히 효율적으로, 또한 높은 순도로 제조할 수 있고, 디바이스 재료나 의료용 재료 등의 각 분야에서의 응용이 기대된다.

<110> CANON KABUSHIKIKAISHA <120> MICROORGANISMS USED FOR PRODUCTION OF POLYHYDROXYALKANOATE <150> JP1999-371863 <151> 1999-12-27 <150> JP2000-23078 <151> 2000-01-31 <150> JP2000-23080 <151> 2000-01-31 <150> JP2000-23083 <151> 2000-01-31 <150> JP2000-95011 <151> 2000-03-30 <150> JP2000-95012 <151> 2000-03-30 <150> JP2000-95013 <151> 2000-03-30 <150> JP2000-207089 <151> 2000-07-07 <150> JP2000-207091 <151> 2000-07-07 <150> JP2000-359789 <151> 2000-11-27 <160> 1 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 1501 <212> DNA <213> Pseudomonas jessenii 161 strain <400> 1 tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg atgacgggag cttgctcctg 60 aattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt 120 ctcgaaaggg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc 180 ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240 gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc 300 agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc 360 catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg 420 cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg 480 tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540 cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca 600 ttcaaaactg acaagctaga gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa 660 atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact gatactgaca 720 ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780 acgatgtcaa ctagccgttg ggagccttga gctcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt 840 tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac 960 atccaatgaa ctttccagag atggatgggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca 1020 tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct 1080 tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg 1140 gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc 1200 tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc acaaaaccga 1260 tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1320 gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380 gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt accacggtgt 1440 gattcatgac tggggtgaag tcgtaccaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca 1500 c 1501

Claims (1)

1. 폴리히드록시알카노에이트의 제조에 사용가능한 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91균주(FERM BP-7373).