CN1424337A - 在侧链具有取代或未取代的（苯基甲基）硫烷基结构的单元的新聚羟基链烷酸酯及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种聚羟基链烷酸酯，其包括下述化学式(1)所示的单元：其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1－8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同。还提供了一种生产聚羟基链烷酸酯的方法。

Description

在侧链具有取代或未取代的(苯基甲基)硫烷基 结构的单元的新聚羟基链烷酸酯及其制备方法
发明背景
发明领域
本发明涉及一种具有新的结构单元的聚羟基链烷酸酯(下文也简称为“PHA”)及其制备方法。本发明尤其涉及一种新的可生物降解的PHA，包括3-羟基链烷酸单元，该单元在其侧链的末端具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基；并且涉及用能够生产PHA并将其积聚在细胞内的微生物由在侧链末端有取代或未取代的(苯基甲基)硫烷基的链烷酸制备PHAs的方法。
相关背景技术
已有报道，许多微生物可生产聚-3-羟基丁酸酯(下文也简称为“PHB”)或其它PHA并将其积聚在细胞中(“Biodegradable Plastics Handbook”，Biodegradable Plastics Society Ed.，NTS，178-197页(1995))。这些聚合物可用于各种产品的生产，例如，与常规的塑料进行熔融加工，但是不象许多常规的合成聚合物化合物，这些聚合物不在自然环境中导致污染，因为它们是可生物降解的，即，在自然界中通过微生物将它们完全降解。另外，它们具有好的生物相容性，预期它们可在医学领域中用作软材料。
已知微生物的PHAs具有不同的组分和/或结构，这取决于例如微生物的种类、培养基的组分和培养条件。因此，已经研究对组分和结构进行控制以提高PHA的物理特性。
(1)首先，下述文献报道了或公开了通过聚合相对简单的单体单元——诸如3-羟基丁酸(下文简称3HB)——合成PHA。
例如，已知Alcaligenes eutrophus H16(ATCC No.17699)和其突变体以各种成分比例生产3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯(下文简称3HV)的共聚物(日本专利公开No.6-15604和日本专利公开No.7-14352和8-19227.)。
日本专利No.2642937公开了通过将无环的脂肪族烃化合物作为底物提供给Pseudomonas oleovorans(ATCC No.29347)生产3-羟基链烷酸C6-C12酯单体单元的PHA。
日本专利申请延迟公开No.5-7492公开了用微生物——诸如Methylobacterium sp.，Paracoccus sp.，Alcaligenes sp.和Pseudomonassp.——与C3-C7伯醇接触生产3HB和3HV共聚物的方法。
日本专利申请延迟公开No.5-93049和日本专利申请延迟公开No.7-265065公开了将Aeromonas caviae与作为底物的油酸或橄榄油培养生产3HB和3-羟基己酸酯的双成分共聚物。
日本专利申请延迟公开No.9-191893公开了Comamonans acidovorans IFO13852在作为底物的葡糖酸和1，4-丁二醇存在下培养时生产含有3HB和4-羟基丁酸酯作为单体单元的聚酯。
上述PHAs是包括具有烷基作为侧链的单体单元的“常规的PHAs”，其通过微生物经烃类等的β-氧化或经糖类合成的脂肪酸合成。
(2)但是，当考虑微生物PHAs的更广泛的应用时，认为“非常规的PHAs”——即，侧链上具有烷基之外的取代基的PHAs——非常有用，例如作为功能聚合物。某类微生物已知用于生产这类“非常规的PHA”，已经进行了努力用这种方法以提高微生物PHA的物理性能。
取代基的例子包括不饱和烃类、酯基、氰基、卤代烃、环氧化物和那些含有芳环或环类的。其中，已经积极研究了具有芳环的PHAs。
例如，Makromol.Chem.，191，1957-1965(1990)、Macromolecules，24，5256-5260(1001)和Chirality，3，492-494(1991)报道了Pseudomonasoleovorans生产含有3-羟基-5-苯基戊酸酯(下文缩写为3HPV)作为单体单元的PHAs，观察到的在PHA的物理性质方面的变化大概是由于3HPV的存在。
对于在侧链上有取代基的PHAs，最近已经积极开发了那些在侧链上具有苯氧基的。
已经报道了Pseudomonas oleovorans从11-苯氧基十一酸生成由3-羟基-5-苯氧基戊酸酯和3-羟基-9-苯氧基壬酸酯单体单元形成的PHA(Macromol.Chem.Phys.，195，1665-1672(1994))。
Macromolecules，29，3432-3435(1996)报道了通过使用Pseudomonasoleovorans从6-苯氧基己酸生产具有3-羟基-4-苯氧基丁酸酯和3-羟基-6-苯氧基己酸酯单体单元的PHA；从8-苯氧基辛酸生产具有3-羟基-4-苯氧基丁酸酯、3-羟基-6-苯氧基己酸酯、3-羟基-4-苯氧基丁酸酯、3-羟基-6-苯氧基己酸酯和3-羟基-8-苯氧基辛酸酯单体单元的PHA；以及从11-羟基十-酸生产具有3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-7-苯氧基庚酸单元的PHA。
Can.J.Microbiol.，41，32-43(1995)报道了通过Pseudomonas oleovoransATCC 29347或Pseudomonas putida KT 2422使用辛酸和6-(4-氰基苯氧基)己酸或6-(对硝基苯氧基)己酸作为底物生产含有3-羟基-6-(4-氰基苯氧基)己酸或3-羟基-6-(4-硝基苯氧基)己酸作为单体单元的PHA。
对于非常规PHAs的生成，Macromolecules，32，8315-8318(1999)报道了那些在侧链具有硫化物(-S-)形式的硫原子的PHAs的生成，其中Pseudomonasputida 27N01使用辛酸和11-(苯基硫烷基)十一酸作为底物生产含有3-羟基-5-(苯基硫烷基)戊酸和3-羟基-7-(苯基硫烷基)庚酸作为单体单元的PHAs。在这种情况下，Pseudomonas putida 27N01在仅含有辛酸作为生长底物的培养基中预培养，然后转移到仅含有11-(苯基硫烷基)十一酸作为底物的培养基中。
还有Polymer Preprints，Japan Vol.49，No.5，1034(2000)报道了使用Pseudomonas putida 27N01和11-[(苯基甲基)硫烷基]庚酸作为底物生产含有3-羟基-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸和3-羟基-7-[(苯基甲基)硫烷基]庚酸两种单体单元的PHAs。在这种情况下，Pseudomonasputida 27N01在仅含有辛酸作为生长底物的培养基中预培养，然后转移到仅含有11-[(苯基甲基)硫烷基]十一酸作为底物的培养基中。
在非常规PHAs中，关于含有3-羟基-ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸单元的PHAs，上述文献仅报道了这类PHAs的生物合成。另外，可得到的生产方法是有限的。因此，得到的聚合物在类型、纯度和产率方面不足。在上述生产含有3-羟基-ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸单元的PHAs的方法中，通过在仅含有具有长碳链的ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸作为底物的培养基中培养微生物进行聚合物的生产，其中ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸还用作生长底物。因此，难于控制聚合物的结构。
PHAs含有取代的3-羟基-ω-{[(取代的苯基)甲基]硫烷基}链烷酸单元，该单元有取代基，诸如在侧链的末端在(苯基甲基)硫烷基的苯环上的各种官能团，这些PHAs是有新的功能性的PHAs，并且预计这类PHAs的物理性能有所改进。这类PHAs的应用将扩展到常规PHA尚未适用的新领域。因此，需要开发生产这类PHAs的有效方法。
发明概述
通过本发明人对解决上述问题的集中研究，完成了该发明。
本发明的一个目的是提供一种新的PHA及其制备方法，其中PHA包括新的单元，该单元在其取代的或未取代的侧链中具有(苯基甲基)硫烷基结构。
根据本发明的第一个方面，提供了一种聚羟基链烷酸酯，其包括下述化学式(1)所示的单元：
Figure A0216061700211
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同，条件是聚羟基链烷酸酯不由下述化学式(2)和(3)所示的两种单元组成：
根据本发明的另一个方面，提供一种生产包括化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤：其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数。
附图简述
图1表示实施例1得到的聚羟基链烷酸酯的1H NMR谱。
图2表示实施例1得到的聚羟基链烷酸酯的13C NMR谱。
图3表示实施例10得到的聚羟基链烷酸酯的1H NMR谱。
图4表示实施例19得到的PHA的1H NMR谱。
图5表示实施例19得到的PHA的13C NMR谱。
图6表示实施例29得到的PHA的1H NMR谱。
优选实施方案的详述
本发明的新的聚羟基链烷酸酯在羟基链烷酸单元的侧链上有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基结构。该结构提供了与已知微生物生成的聚羟基链烷酸酯显著不同的物理和化学性质。
本发明的新的聚羟基链烷酸酯可通过下述步骤制备：在培养基中培养生产PHA的微生物，培养基含有生长底物和作为原料的取代的或未取代的ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸；回收聚羟基链烷酸酯，其含有在侧链末端具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基的单元，在培养步骤期间在微生物中累积生产了聚羟基链烷酸酯。在微生物的PHAs中，在所有3-羟基链烷酸单元中，包括化学式(1)所示的那些，在3位的碳是不对称碳，其绝对构型为R，显示出其生物可降解性。
在上述通式(1)和(10)中，在苯环上的取代基R中，卤原子的例子包括氟、氯和溴。
下文更详细地描述本发明。生产PHA的微生物
在本发明的生产PHAs的方法中，可使用任何微生物生产化学式(1)所示的在侧链末端具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基的单元的PHA(下文称为目标PHA)，只要在含有相应的化学式(10)所示ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸作为源化合物的培养基中培养时，其能够生产目标PHA并在细胞中累积。例如微生物可以是那些属于Pseudomonas属具有生产PHA能力的。
适合的Pseudomonas属微生物的例子包括下述三种菌株：Pseudomonascichorii YN2(FERM BP-7375)，Pseudomonas cichorii H45(FERM BP-7374)，和Pseudomonas jessenii P161(FERM BP-7376)。这三种微生物首先作为国家保藏有被申请人保藏，并根据布达佩斯条约以上述登记号进行了国际保藏，保藏单位是International Patent Organism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，IndependentAdministrative Institution，Ministry of Economy，Trade and Industry 1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305 JAPAN(前NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology(NIBH)of the Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of Economy，Trade andIndustry)。它们还在日本专利申请No.11-371863(日本专利申请延迟公开No.2001-178484)中作为新的能生产PHAs的菌株描述。
菌株YN2、H45和P161的细菌学性质给出如下。<菌株YN2的细菌学性质>(1)形态学性质细胞的形状和大小：棒状，0.8μm×1.5-2.0μm细胞多形性：阴性移动性：可动芽胞形成：阴性革兰氏染色：阴性菌落性状：环状；完整，光滑边界；低凸面；光滑表面；平滑；透明(2)生理学性质过氧化氢酶：阳性氧化酶：阳性O/F试验：氧化(非发酵的)硝酸盐还原：阴性吲哚生成：阳性从葡萄糖生成酸：阴性精氨酸二水解酶：阴性脲酶：阴性七叶苷水解：阴性明胶水解：阴性β-半乳糖苷酶：阴性在King’s B琼脂上产生荧光颜料：阳性在4％NaCl下生长：阳性(微弱生长)聚β-羟基丁酸酯累积：阴性(*)吐温80水解：阳性(*)在营养琼脂上培养的菌落用苏丹黑染色用于测定。(3)底物吸收葡萄糖：阳性L-阿拉伯糖：阳性D-甘露糖：阴性D-甘露糖醇：阴性N-乙酰基-D-葡糖胺：阴性麦芽糖：阴性葡糖酸钾：阳性正癸酸盐：阳性己二酸盐：阴性dl-苹果酸盐：阳性柠檬酸钠：阳性乙酸苯酯：阳性<菌株H45的细菌学性质>(1)形态学性质细胞的形状和大小：棒状，0.8μm×1.0-1.2μm细胞多形性：阴性移动性：可动芽胞形成：阴性革兰氏染色：阴性菌落性状：环状；完整，光滑边界；低凸面；光滑表面；平滑；奶油色(2)生理学性质过氧化氢酶：阳性氧化酶：阳性O/F试验：氧化硝酸盐还原：阴性吲哚生成：阴性从葡萄糖生成酸：阴性精氨酸二水解酶：阴性脲酶：阴性七叶苷水解：阴性明胶水解：阴性β-半乳糖苷酶：阴性在King’s B琼脂上产生荧光颜料：阳性在4％NaCl下生长：阴性聚β-羟基丁酸酯累积：阴性(3)底物吸收葡萄糖：阳性L-阿拉伯糖：阴性D-甘露糖：阳性D-甘露糖醇：阳性N-乙酰基-D-葡糖胺：阳性麦芽糖：阴性葡糖酸钾：阳性正癸酸盐：阳性己二酸盐：阴性dl-苹果酸盐：阳性柠檬酸钠：阳性乙酸苯酯：阳性<菌株P161的细菌学性质>(1)形态学性质细胞的形状和大小：球状，φ0.6μm，棒状，0.6μm×1.5-2.0μm细胞多形性：伸长形式移动性：可动芽胞形成：阴性革兰氏染色：阴性菌落性状：环状；完整，光滑边界；低凸面；光滑表面；浅黄色(2)生理学性质过氧化氢酶：阳性氧化酶：阳性O/F试验：氧化硝酸盐还原：阳性吲哚生成：阴性从葡萄糖生成酸：阴性精氨酸二水解酶：阳性脲酶：阴性七叶苷水解：阴性明胶水解：阴性β-半乳糖苷酶：阴性在King’s B琼脂上产生荧光颜料：阳性(3)底物吸收葡萄糖：阳性L-阿拉伯糖：阳性D-甘露糖：阳性D-甘露糖醇：阳性N-乙酰基-D-葡糖胺：阳性麦芽糖：阴性葡糖酸钾：阳性正癸酸盐：阳性己二酸盐：阴性dl-苹果酸盐：阳性柠檬酸钠：阳性乙酸苯酯：阳性培养
根据本发明的PHA生产方法，在培养基中培养上述能够生产PHA的微生物，所述的培养基含有作为原料的上述化学式(10)表示的ω-[(苯基甲基)硫烷基]链烷酸，通过在细胞中累积生产化学式(1)所示的PHA，其在侧链的末端含有具有取代的或未取代的(苯基甲基)硫烷基的3-羟基链烷酸酯单元。
对于在本发明中使用的微生物的普通培养，例如，为了制备原菌种，或为了得到细胞或在PHA生产中保持要求的活性，选择培养基使其含有增殖所用微生物需要的成分。例如，可使用任何一种已知的培养基，诸如典型的天然培养基(例如，营养肉汤、酵母提取物)和补充了营养物的合成培养基，只要培养基不对微生物的生长和生存有不利影响。根据使用的微生物适当地选择培养条件，诸如温度、通气和振摇。
为了使用上述生产PHA的微生物生产目标PHA，可使用无机培养基，其含有至少一种微生物需要的生长底物和上述化学式(10)所示的化合物，该化合物相应于PHA生产中作为原料的单体单元。希望上述化学式(10)所示化合物的含量为每培养基的0.01-1(w/v)％，更优选0.02-0.2％。化学式(10)表示的化合物并不总是具有良好的水溶性。但是，由于本发明引入的微生物，悬浮液不会带来麻烦。
化学式(10)表示的原料化合物在一些情况下可以作为在诸如1-十六碳烯或正十六碳烯的溶剂中的溶液或悬浮液加入以改进分散性。在这种情况下，相对于培养基溶液，溶剂的浓度要求等于或小于3％(v/v)。
优选独立地将用于微生物增殖的生长基质加入到培养基中。作为生长基质，可使用营养素，诸如酵母提取物、聚蛋白胨和肉提取物。可基于对所用菌株作为基质的有用性从糖类、三羧酸循环产生的有机酸类、三羧酸循环后的一步或两步生化反应生成的有机酸类或其盐、氨基酸类或其盐类、C4-C12直链烷酸或其盐中选择生长底物。
一种或多种糖类可适当地选自醛糖，诸如甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖；糖醇，诸如甘油、赤藓醇和木糖醇；醛糖酸，诸如葡糖酸；糖醛酸，诸如葡糖醛酸和半乳糖醛酸；和二糖，诸如麦芽糖、蔗糖和乳糖。
作为有机酸或其盐，一种或多种化合物可适当地选自丙酮酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和其盐。
作为氨基酸或其盐，一种或多种化合物可适当地选自谷氨酸、天门冬氨酸和其盐。
其中优选聚蛋白胨和糖类。优选的糖类包括至少一种选自葡萄糖、果糖和甘露糖。优选在培养基中基质的含量为0.1-5％(w/v)，更优选0.2-2％。
有时，当微生物充分生长并随后转移到氮源——诸如氯化铵——有限的并且加入了作为PHA底物的化合物的培养基时，提高了微生物PHA生产能力。例如，可使用多步骤途径，在不同的培养条件下连续进行两步或多个步骤。
更具体的，微生物在含有化学式(10)表示的化合物和聚蛋白胨的培养基中生长直至从对数生长后期到稳定期(步骤1-1)，然后使用例如离心法收集。接着，在步骤1培养的微生物再在含有化学式(10)表示的化合物和上述有机酸或其盐的培养基中培养(优选无氮源)(步骤1-2)。或者，微生物在含有化学式(10)表示的化合物和上述糖的培养基中培养直至从对数生长后期到稳定期(步骤1-3)，然后用例如离心法收集。接着，在步骤1培养的微生物进一步在含有化学式(10)表示的化合物和上述糖的培养基中培养(优选无氮源)(步骤1-4)。在这个两步培养过程的第一步中，细胞进行增殖，同时从上述通式(10)表示的原料化合物生产目标PHA。在第二步，充分增殖的细胞在不含氮源的培养基中继续PHA生产，增加细胞中累积的PHA的量。
培养温度是上述菌株可充分增殖的温度。例如，培养温度可以是15℃-40℃，优选20℃-35℃，更优选20℃-30℃。
可通过任何适合的培养技术进行培养，诸如液体或固体培养，由此可增殖上述微生物以生成聚羟基链烷酸酯。另外，不限制培养的类型，只要适当地提供氧气。例子包括分批培养、补料分批培养、半连续培养和连续培养。在液态分批培养中，在振荡摇瓶内容物的同时可提供氧气。或者，用发酵罐通过搅动换气供氧。
作为用于上述培养过程的无机培养基，可使用任何含有增殖微生物所需的成分——诸如磷源(例如，磷酸盐)和氮源(例如铵盐、硝酸盐)的培养基。例如可使用MSB培养基和M9培养基。
用于本发明方法的无机培养基(M9)的组成如下：(M9培养基)
Na2HPO4    6.2g
KH2PO4     3.0g
NaCl         0.5g
NH4Cl       1.0g(在1升培养基中；pH7.0)
为了确保良好的增殖和聚羟基链烷酸酯的生产能力，需要向上述无机培养基中加入下述痕量成分溶液，其用量为约0.3％(v/v)。(痕量成分溶液)
次氮基三乙酸；1.5g；MgSO4；3.0g；
MnSO4：0.5g；NaCl：1.0g；FeSO4：0.1g；
CaCl2：0.1g；CoCl2：0.1g；ZnSO4：0.1g；
CuSO4：0.1g；AlK(SO4)2：0.1g；
  H3BO3：0.1g；Na2MoO4：0.1g；NiCl2：0.1g(1升溶液；pH7.0)PHA回收
在本发明中使用的微生物在细胞中产生并积累目标PHA。因此，在本发明生产PHA的方法中，在培养后提供一个从细胞回收目标PHA的步骤。
为了从细胞回收PHA，使用溶剂萃取技术，其中可溶化了的聚羟基链烷酸酯与不溶性的细胞成分分离。标准的氯仿萃取技术是最方便和简单的，但是可使用除了氯仿以外的溶剂，诸如二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃、乙腈和丙酮。
在难于使用有机溶剂的环境下，聚羟基链烷酸酯以外的菌株成分用例如诸如SDS的表面活性剂、诸如溶菌酶的酶或EDTA处理除去并除去细胞内成分，仅回收聚羟基链烷酸酯。或者，可使用细胞破裂处理，诸如超声波破裂、均化破裂、加压破裂、用玻璃珠破裂、研磨、磨碎和冻熔，分离和回收细胞中积累的聚羟基链烷酸酯。
应当理解培养本发明的微生物、通过本发明的微生物生成聚羟基链烷酸酯和在细胞内积累聚羟基链烷酸酯以及从细胞回收聚羟基链烷酸酯不限于上述技术和工艺。
根据本发明的方法通过微生物生产的聚羟基链烷酸酯除了化学式(1)表示的单元，可包括化学式(4)表示的3-羟基链烷酸单元或化学式(5)表示的3-羟基链-5-烯酸单元，它们是通过脂肪酸合成体系通过将增殖底物加入到培养基中生物合成的。在所含的全部3-羟基链烷酸单元的3位的碳是不对称碳，它们的绝对构型是R，显示出它们的生物可降解性。在化学式(1)表示的单元中存在的(苯基甲基)硫烷基和在其苯环上存在的各种取代基，为聚合物提供了新的物理和化学性质。这类聚合物有望在物理性质上有所改进。聚合物可扩展到过去没有应用过的领域。
实施例
本发明下面参照实施例进行具体描述，但不限于这些实施例。在下述实施例中，除非另有说明，百分比以重量计。
实施例1
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。之后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到159mg聚羟基链烷酸酯。
在下述条件下对聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。<波谱仪>FT-NMR：Bruker DPX 400，进行1H-NMR的频率400MHz和进行13C的频率100MHz。<条件>
核种类：1H，13C
溶剂：CDCl3
温度：室温
图1和2分别表示聚羟基链烷酸酯的1H-NMR谱和13C-NMR谱。其鉴定结果如下表1和2所示。
                             表1化学位移(ppm)            积分            裂分形式          鉴定1.83                   2H              qurt               d12.36-2.54              4H              m                  b1，c13.67                   2H              s                  f15.20                   1H              quint              c17.20                   1H              m                  j17.25-7.28              4H              m                  h1，11&i1，k1
                           表2
       化学位移(ppm)                  鉴定
           26.6                       d1
           33.0                       e1
           35.9                       f1
           38.6                       b1
           69.7                       c1
           126.9                      j1
           128.4                      h，l
           128.8                      i，k
           138.0                      g1
           168.9                      a1
如表1和2清楚地表示，确认聚羟基链烷酸酯是下述化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸--的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有85.9摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
通过凝胶渗透色谱法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H(商标名)，溶剂；氯仿，聚苯乙烯等价)测定聚羟基链烷酸酯的分子量。结果，Mn是14400，Mw是56700。
实施例2
Pseudomonas cichorii H45接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸但无氮源(NH4Cl)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到138mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有95.2摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
实施例3
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸但无氮源(NH4Cl)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养47小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到164mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有96.7摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。实施例4
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到161mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有83.8摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
实施例5
Pseudomonas cichorii H45接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到113mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有96.2摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
实施例6
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到126mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有89.8摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
实施例7
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.1％壬酸和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到90mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有29.2摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
实施例8
Pseudomonas cichoriiYN2接种到200ml含有0.5％酵母提取物、0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到103mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有96.0摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
实施例9
Pseudomonas cichoriiYN2接种到200ml含有0.5％谷氨酸钠和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到87mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例1相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(16)表示的，其含有作为单体单元的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有86.4摩尔％的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯。
表3表示实施例1-9中细胞的干重、聚合物的干重、聚合物与细胞干重之比和在得到的聚合物中3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯(缩写为“3HBzyTV”)单元的量(摩尔％)。
                           表3
         细胞干重       聚合物干重        聚合物重量/     3HBzyTV
         (mg/L)           (mg/l)          细胞重量(％)    单元mol％实施例1       1070            795             74.3             85.9实施例2       875             690             78.9             95.2实施例3       1015            820             80.8             96.7实施例4       1070            805             75.2             83.8实施例5       710             565             79.6             96.2实施例6       940             630             67.0             89.8实施例7       705             450             63.8             29.2实施例8       815             515             63.2             96.0实施例9       995             435             43.7             86.4
实施例10
生产含3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％酵母提取物和0.1％4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到39mg聚羟基链烷酸酯。
通过凝胶渗透色谱法(GPC；TOSOH HLC-8220(商标名)，柱；TOSOH TSK-GELSuperHM-H(商标名)，溶剂；氯仿，聚苯乙烯等价物)测定得到的PHA的分子量。结果，数均分子量Mn是44500，重均分子量Mw是106800。
为了确定得到的PHA的结构，在下述条件下对PHA进行NMR分析。<光谱仪>FT-NMR：Bruker DPX 400，进行1H-NMR频率400MHz。<条件>
核种类：1H
溶剂：CDCl3参照：在毛细管中的TMS/CDCl3温度：室温图3表示测得的1H-NMR谱，其鉴定结果如下表4所示。
                       表4化学位移(ppm)     积分        裂分形式        鉴定2.48-2.71         4H            m            B5，d53.68            2H            m            e55.27            1H            m            c57.18            1H            m            i57.25            4H            m            g5，k5，h5，j5
表4中所示的结果证实该聚羟基链烷酸酯是含有作为单体单元的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯和相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯。更具体地，PHA具有下述化学式(17)表示的结构：
Figure A0216061700381
1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有85.4摩尔％的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯。
实施例11
Pseudomonas cichoriiYN2接种到200ml含有0.1％壬酸和0.1％4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到68mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(17)表示的，其含有3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元和其它相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸或3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明聚羟基链烷酸酯含有27.7摩尔％的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯。
实施例12
Pseudomonas cichoriiYN2接种到200ml含有0.5％谷氨酸钠和0.1％4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到72mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(17)表示的。该聚羟基链烷酸酯含有3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元和其它具有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯的单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有50.3摩尔％的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元。
实施例13
Pseudomonas cichoriiYN2接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到148mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(17)表示的聚羟基链烷酸酯。该聚羟基链烷酸酯含有3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元和其它具有4-12个碳原子诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有66.7摩尔％的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元。
实施例14
Pseudomonas cichoriiH45接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到20mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(17)表示的。该聚羟基链烷酸酯含有3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元和其它相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有57.2摩尔％的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单元。
实施例15
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到64mg聚羟基链烷酸酯。
在与实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(17)表示的。该聚羟基链烷酸酯含有3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元和其它相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有31.6摩尔％的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单体单元。
表5表示实施例10-15中细胞的干重、聚合物的干重、聚合物与细胞干重之比和在得到的聚合物中3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯(缩写为“3HBzyTB”单元)的量(摩尔％)。
                             表5
          细胞干重        聚合物干重      聚合物重量/       3HBzyTV
          (mg/L)          (mg/l)          细胞重量(％)      单元mol％实施例10       1040              195              18.8              85.4实施例11       655               340              51.9              27.7实施例12       955               360              37.7              50.3实施例13       1370              740              54.0              66.7实施例14       580               100              17.2              57.2实施例15       915               320              35.0              31.6生产含3-羟基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法
实施例16
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到96mg聚羟基链烷酸酯。
在与前述实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(18)表示的。该聚羟基链烷酸酯包括3-羟基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯单体单元和其它相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有41.0摩尔％的3-羟基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯单体单元。
通过凝胶渗透色谱法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H，溶剂；氯仿，聚苯乙烯等价物)测定得到的聚羟基链烷酸酯的分子量。结果，Mn是21500，Mw是83200。
实施例17
Pseudomonas cichorii H45接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到82mg聚羟基链烷酸酯。
在与前述实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(18)表示的。该聚羟基链烷酸酯包括3-羟基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯单体单元和其它相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有56.2摩尔％的3-羟基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯单体单元。
实施例18
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到75mg聚羟基链烷酸酯。
在与前述实施例10相同的条件下对得到的聚羟基链烷酸酯进行NMR分析。结果显示该聚羟基链烷酸酯是化学式(18)表示的。该聚羟基链烷酸酯包括3-羟基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯单体单元和其它相应于有4-12个碳原子的饱和/不饱和脂肪酸——诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸——的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。1H-NMR谱的积分表明得到的聚羟基链烷酸酯含有38.8摩尔％的3-羟基-5-[[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基]戊酸酯单体单元。
表6表示实施例16-18中细胞的干重、聚合物的干重、聚合物与细胞干重之比和在得到的聚合物中3-羟基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯(缩写为“3HMBzyTV”)的量(摩尔％)。
                           表6
           细胞干重        聚合物干重        聚合物重量/      3HBzyTV
           (mg/L)          (mg/l)            细胞重量(％)     单元mol％实施例16         805              481               59.8             41.0实施例17         625              408               65.3             56.2实施例18         710              377               53.1             38.8
实施例19
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到106mg聚羟基链烷酸酯。
通过凝胶渗透色谱法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H，溶剂；氯仿，聚苯乙烯等价物)测定得到的PHA的平均分子量。结果，数均分子量Mn是32000，重均分子量Mw是96000。
为了确定得到的PHA的结构，在下述条件下对PHA进行NMR分析。<光谱仪>FT-NMR：Bruker DPX 400，1H-NMR频率400MHz 13C频率100MHz。<条件>
核种类：1H，13C
溶剂：CDCl3
温度：室温
图4表示测定的1H-NMR谱。其鉴定结果如下表7所示。图5表示测定的13C-NMR谱。其鉴定结果如下表8所示。
                               表7化学位移(ppm)            积分             裂分形式           鉴定1.83                   2H               qurt               d12.35-2.58                4H               m                  b1.e13.64                   2H               s                  f15.20                   1H               m                  c16.92-6.98                2H               m                  j1，k17.23-7.26                2H               m                  h1，l1
                             表8
           化学位移(ppm)                   鉴定
           26.7                             d1
           33.2                             e1
           35.3                             f1
           38.6                             b1
           69.7                             c1
       115.1&115.4                          i1，k1
       130.3&130.3                          h1，l1
           133.7                            g1
       160.6&163.0                          i1
           168.9                            a1
如表7和8中的结果所示，PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。更具体地，该PHA具有下述化学式(19)表示的结构：
Figure A0216061700461
1H-NMR谱的积分表明得到的PHA含有76.7摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例20
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.1％壬酸和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到89mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有27.0摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例21
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％酵母提取物(DIFCO)和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到69mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有76.7摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例22
Pseudomonas cichoriiYN2接种到200ml含有0.5％谷氨酸钠和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30C培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到68mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有90.3摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例23
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到164mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有85.9摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例24
Pseudomonas cichorii H45接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到138mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有90.7摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例25
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到138mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有88.5摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例26
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％丙酮酸钠和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到125mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有89.5摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例27
Pseudomonas cichorii H45接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％丙酮酸钠和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到154mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有97.9摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
实施例28
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％丙酮酸钠和0.1％5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到158mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例19的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(19)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有91.6摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单体单元。
表9表示实施例19-28中细胞的干重、聚合物的干重、聚合物与细胞干重之比和在得到的PHA聚合物中3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单元(缩写为“3HFBzyTV”)的量(摩尔％)。
                                 表9
           细胞干重          聚合物干重       聚合物重量/       3HBzyTV
           (mg/L)            (mg/l)           细胞重量(％)      单元mol％实施例19        945                  530             56.1             76.7实施例20        680                  445             65.4             27.0实施例21        915                  345             37.7             76.7实施例22        740                  340             45.9             90.3实施例23        1120                 820             73.2             85.9实施例24        940                  690             73.4             90.7实施例25        955                  690             72.3             88.5实施例26        1015                 625             61.6             89.5实施例27        1125                 770             68.4             97.9实施例28        1215                 790             65.0             91.6生产含3-羟基-4-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}丁酸单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法
实施例29
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％酵母提取物(DIFCO)和0.1％4-[[(4-氟苯基)甲基]硫烷基]丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到41mg聚羟基链烷酸酯。
通过凝胶渗透色谱法(GPC；TOSOH HLC-8220，柱；TOSOH TSK-GEL SuperHM-H，溶剂；氯仿，聚苯乙烯等价物)测定得到的PHA的平均分子量。结果，数均分子量Mn是15300，重均分子量Mw是37100。
为了确定得到的PHA的结构，在下述条件下对PHA进行NMR分析。<光谱仪>FT-NMR：Bruker DPX 400，1H-NMR频率400MHz。<条件>
核种类：1H
溶剂：CDCl3
参照：在毛细管中的TMS/CDCl3
温度：室温
图6表示测得的1H-NMR谱，其鉴定结果如下表10所示。
                          表10化学位移(ppm)          积分          裂分形式          鉴定2.40-2.72              4H               m               b1，d13.65                 2H               m               e15.27                 1H               m               c16.95                 2H               m               h1，j17.23                 2H               m               g1，k1
如表10中的结果所示，目标PHA包括3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯或3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元。更具体地，该PHA具有下述化学式(20)表示的结构：
Figure A0216061700521
1H-NMR谱的积分表明得到的PHA含有89.8摩尔％的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元。实施例30
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.1％壬酸和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到45mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例29的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯或3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(20)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有10.6摩尔％的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元。
实施例31
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％谷氨酸钠和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干，称量。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到11mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例29的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯或3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(20)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有84.1摩尔％的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元。
实施例32
Pseudomonas cichorii YN2接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％4-{[4-(氟甲基)苯基]甲基}硫烷基]丁酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干，称量干细胞的重量。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到153mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例29的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯或3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(20)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有68.5摩尔％的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元。
实施例33
Pseudomonas cichorii H45接种到200ml含有0.5％聚蛋白胨(Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％丙酮酸钠和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到38mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例29的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯或3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(20)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有43.1摩尔％的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元。
实施例34
Pseudomonas jessenii P161接种到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的M9培养基，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，再悬浮到200ml含有0.5％D-葡萄糖和0.1％4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸但无氮源(NHCl4)的M9培养基中，在125次/分钟的振摇下，在30℃培养48小时。然后，离心收集细胞，用冷甲醇洗涤1次，冻干。称量冻干细胞的重量(细胞干重)。
冻干颗粒悬浮在20ml氯仿中，在60℃搅拌20小时，萃取聚羟基链烷酸酯。用孔尺寸为0.45μm的膜过滤器过滤萃取物，用旋转蒸发器浓缩。浓缩的溶液用冷甲醇沉淀。回收沉淀并真空干燥，得到47mg聚羟基链烷酸酯。
在如实施例29的条件下对得到的PHA进行NMR分析和平均分子量的测定。NMR分析结果显示该实施例中的PHA包括3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元和其它有4-12个碳原子的诸如3-羟基丁酸酯或3-羟基戊酸酯的3-羟基链烷酸酯和/或3-羟基链烯酸酯单体单元，证实其具有化学式(20)表示的结构。1H-NMR谱的积分表明该实施例的PHA含有48.7摩尔％的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单体单元。
表11表示实施例29-34中细胞的干重、聚合物的干重、聚合物与细胞干重之比和在得到的PHA聚合物中3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单元(缩写为“3HFBzyTB”)的量(摩尔％)。
                               表11
            细胞干重        聚合物干重        聚合物重量/     3HBzyTV
             (mg/L)         (mg/l)            细胞重量(％)    单元mol％实施例29           975             205            21.0             89.8实施例30           515             225            43.7             10.6实施例31           955             55             5.8              84.1实施例32           1365            765            56.0             68.5实施例33           515             190            30.1             43.1实施例34           780             235            36.9             48.7

Claims (37)

1、一种聚羟基链烷酸酯，其包括下述化学式(1)所示的单元：
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同，条件是聚羟基链烷酸酯不由下述化学式(2)和(3)所示的两种单元组成：
2、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯进一步包括一种或多种选自下述化学式(4)和(5)的单元：
其中y是0-8的整数，z是3或5的整数。
3、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯包括下述化学式(2)表示的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯单元。
4、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯包括下述化学式(6)表示的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单元。
5、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯包括下述化学式(7)表示的3-羟基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单元。
6、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯包括下述化学式(8)表示的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单元。
Figure A0216061700051
7、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯包括下述化学式(9)表示的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单元。
8、根据权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中聚羟基链烷酸酯具有5000-300000范围内的数均分子量。
9、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
Figure A0216061700061
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
Figure A0216061700062
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数。
10、根据权利要求9的方法，其中聚羟基链烷酸酯进一步包括一种或多种选自下述化学式(4)和(5)的单元：
Figure A0216061700071
其中y是0-8的整数，z是3或5的整数。
11、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
Figure A0216061700072
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数，
其中培养基进一步含有聚蛋白胨。
12、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
Figure A0216061700082
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
Figure A0216061700083
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数，
其中培养基进一步含有酵母提取物。
13、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
Figure A0216061700092
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，4”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数，
其中培养基进一步含有糖类。
14、根据权利要求13的方法，其中糖类是一种或多种选自甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、甘油、赤藓醇、木糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、麦芽糖、蔗糖和乳糖的化合物。
15、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数，
其中培养基进一步含有有机酸或其盐。
16、根据权利要求15的方法，其中有机酸或其盐是一种或多种选自丙酮酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和其盐的化合物。
17、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C3H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数，
其中培养基进一步含有氨基酸或其盐。
18、根据权利要求17的方法，其中氨基酸或其盐是一种或多种选自谷氨酸、天门冬氨酸和其盐的化合物。
19、一种生产包括下述化学式(1)所示单元的聚羟基链烷酸酯的方法，
其中R1是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NO2、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；x表示1-8的整数，在聚羟基链烷酸酯中彼此相同或不同；
该方法包括在含有下述化学式(10)所示的化合物的培养基中培养微生物的步骤，
Figure A0216061700122
其中R2是芳环的取代基，选自H、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH、(CH3)3C、卤原子、CN、NON、COOR’和SO2R”，其中R’选自H、Na、K、CH3和C2H5，R”选自OH、卤原子、ONa、OK、OCH3和OC2H5；k表示1-8的整数，
其中培养基进一步含有具有4-12个碳原子的直链链烷酸或其盐。
20、根据权利要求9的方法，其中微生物的培养包括两个或多个培养步骤。
21、根据权利要求20的方法，其中在第一个步骤之后的步骤中培养基不含氮源。
22、根据权利要求20的方法，其中培养步骤包括步骤：
(1-1)在含有至少一种化学式(10)表示的化合物和聚蛋白胨的培养基中培养微生物；
(1-2)在含有化学式(10)表示的化合物和有机酸或其盐的培养基中进一步培养来自步骤1-1的微生物。
23、根据权利要求22的方法，其中有机酸或其盐是一种或多种选自丙酮酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和其盐的化合物。
24、根据权利要求20的方法，其中培养步骤包括步骤：
(1-3)在含有至少一种化学式(10)表示的化合物和糖类的培养基中培养微生物，和
(1-4)在含有化学式(10)表示的化合物和糖类的培养基中进一步培养来自步骤1-3的微生物。
25、根据权利要求24的方法，其中糖类是一种或多种选自甘油醛、赤藓糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、甘油、赤藓醇、木糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、麦芽糖、蔗糖和乳糖的化合物。
26、根据权利要求9的方法，其中在含有下述化学式(11)表示的5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸的培养基中培养微生物，生产含有下述化学式(2)表示的3-羟基-5-[(苯基甲基)硫烷基]戊酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
Figure A0216061700131
27、根据权利要求9-17任一项的方法，其中在含有下述化学式(12)表示的4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸的培养基中培养微生物，生产含有下述化学式(6)表示的3-羟基-4-[(苯基甲基)硫烷基]丁酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
28、根据权利要求9的方法，其中在含有下述化学式(13)表示的5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸的培养基中培养微生物，生产含有下述化学式(7)表示的3-羟基-5-{[(4-甲基苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
29、根据权利要求9的方法，其中在含有下述化学式(14)表示的5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸的培养基中培养微生物，生产含有下述化学式(8)表示的3-羟基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}戊酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
30、根据权利要求9的方法，其中在含有下述化学式(15)表示的4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸的培养基中培养微生物，生产含有下述化学式(9)表示的3-羟基-4-{[(4-氟苯基)甲基]硫烷基}丁酸酯单元的聚羟基链烷酸酯。
31、根据权利要求9的方法，进一步包括将聚羟基链烷酸酯与培养步骤中培养的微生物的细胞分离的步骤。
32、根据权利要求31的方法，其中分离聚羟基链烷酸酯的步骤包括用溶剂处理以溶解并萃取在培养步骤培养的微生物的细胞中积累的聚羟基链烷酸酯。
33、根据权利要求32的方法，其中溶剂是一种或多种选自氯仿、二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃、乙腈和丙酮的溶剂。
34、根据权利要求31的方法，其中分离聚羟基链烷酸酯的步骤包括破裂微生物的细胞的步骤。
35、根据权利要求34的方法，其中细胞通过超声波破裂、均化破裂、加压破裂、用玻璃珠破裂、研磨、磨碎或冻熔破裂。
36、根据权利要求9的方法，其中微生物属于假单胞菌Pseudomonas属。
37、根据权利要求36的方法，其中属于假单胞菌Pseudomonas属的微生物选自Pseudomonas cichorii YN2(FERMBP-7375)、Pseudomonas cichorii H45(FERM BP-7374)和Pseudomonas jessenii P161(FERM BP-7376)。
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