CZ296356B6

CZ296356B6 - Zpusob prípravy purinové nukleosidové slouceniny

Info

Publication number: CZ296356B6
Application number: CZ0241998A
Authority: CZ
Inventors: Mikami@Yoichi; Matsumoto@Seiichiro; Yoshinaka@Shinjhi; Sunaga@Yonosuke; Hasegawa@Ayumi
Original assignee: Yuki Gosei Kogyo Co., Ltd, A Japanese Corporation
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2006-02-15
Also published as: DE69813410D1; JPH1146790A; CZ241998A3; CN1114698C; JP3864357B2; DE69813410T2; US6017736A; EP0896065A1; CN1207417A; EP0896065B1

Abstract

Zpusob prípravy purinové nukleosidové slouceniny,zahrnující stupen podrobení pyrimidinové nukleosidové slouceniny a purinové báze výmenné reakci báze ve vodném roztoku obsahujícím fosforecnanové ionty v prítomnosti purinové nukleosidové fosforylázya pirimidinové nukleosidové fosforylázy, pri nemzse pyrimidinová báze vytvorená touto reakcí prevede mikroorganizmem nebo enzymem odvozeným z tohotomikroorganizmu na slouceninu neschopnou pusobit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy. Mikrooganizmus je zvolen ze skupiny sestávající z rodu Arthrobactor, rodu Bacillus, rodu Pseudomonas a roku Rhodococcus; a enzymem je uracilthymindehydrogenáza adihydrouracildehydrogenáza.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu přípravy purinové nukleosidové sloučeniny s vysokým výtěžkem za použití výměnné reakce báze nukleové kyseliny, která se provádí v přítomnosti enzymu, a mikroorganizmů produkujících enzymy, použitých pro přípravu purinové nukleosidové sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Je znám způsob přípravy nukleosidové sloučeniny za pomoci výměnné rekce báze nukleové kyseliny, prováděné v přítomnosti enzymu. Při této známé metodě se však uskutečňuje rovnováha mezi výchozími látkami a reakčními produkty, která vede k tomu, že se nedosáhne zvýšení výtěžku. Pro překonání této obtíže zveřejnění japonského patentu (Kokai) číslo 4-197193 uvádí výměnnou reakci báze mezi inosinem nebo 2'-deoxyinosidem (zde označovaným jako „deoxyinosin“) fosfátu v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy (EC2.4.2.2) a pak se hypoxanthin vytvořený touto výměnnou reakcí převede na kyselinu močovou pomocí xanthinoxidázy tak, že se zvýší výtěžek reakce. Při tomto způsobu, protože kyselina močová nemůže působit jako substrát nukleosidové fosforylázy, reakce probíhá jednosměrně k vytvoření pyrimidinového nukleosidu.

Avšak JP 4-197193 zmíněný výše, který je usměrněn na způsob účinné přípravy pyrimidinového nukleosidu pomocí inosinu nebo deoxyinosinu a pyrimidinové báze jako výchozích látek, neuvádí způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny za použití pyrimidinovénukleosidové sloučeniny a purinové báze jako výchozích materiálů, které jsou snadno dostupné při nízkých nákladech. Tam, kde se použije pyrimidinová nukleosidová sloučenina jako výchozí látka, je nutné přidat enzym sloužící k rozkladu pyrimidinové báze, vytvořené výměnnou reakcí bází do reakčního systému, aby se vychýlila rovnováha a zvýšil reakční výtěžek.

Avšak příprava nebo izolace enzymu z přírodního produktu ve vysoce aktivním stavu nebyla dosud zmíněna. Jinými slovy způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny za vysokého výtěžku při použití pyrimidinové nukleosidové sloučeniny jako výchozí látky dosud nebyl zjištěn. Přirozeně to má vysokou důležitost pro vývoj způsobu přípravy purinové nukleosidové sloučeniny, která je stabilní při vysokém výtěžku.

Podstata vynálezu

Za těchto okolností původci vynálezu provedli rozsáhlý výzkum mikroorganizmů produkujících enzymy účinné pro přeměnu pyrimidinové báze, získané při výměnné reakci mezi pyrimidinovou nukleosidovou sloučeninu a purinovou bází, na sloučeninu nezpůsobilou působit jako substrát pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy a zjistili, že mikroorganizmy, které náležející k druhům Arthobactor species, Bacillus species, Pseudomonas species nebo rhodococcus species jsou schopny produkovat takových enzymů umožňujících dospět k vynálezu.

Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu je vytvořen způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny s vysokým výtěžkem, který zahrnuje stupeň podrobení pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze výměnné reakci báze ve vodném roztoku obsahujícím fosfátové ionty v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, přičemž pyrimidinová báze vytvořená reakcí se převede mikroorganizmem nebo enzymem odvozeným z tohoto mikroorganizmu na sloučeninu nezpůsobilou působit jako substrát pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy, přičemž mikroorganizmus se

-1 CZ 296356 B6 zvolí z množiny sestávající z rodu Arthobactor, rodu Bacillus, rodu Pseudomonas a rodu Rhodococcus; a enzym je uricilthymindehydrogenáza a dihydrouracildehydrogenáza.

Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu je vytvořen mikroorganizmus schopný produkce uricilthymindehydrogenázy a dihydrouracildehydrogenázy, přičemž tento mikroorganismus je vybrán ze skupiny zahrnující Arthrobactor species, YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megatearium YGK 252 (FERM BP-5908) a Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909).

Způsob tohoto vynálezu pro přípravu purinové nukleosidové sloučeniny využitím výměnné reakce báze nukleové kyseliny umožňuje přípravu purinové nukleosidové sloučeniny s vysokým výtěžkem a s vysokou stabilitou za použití startovacích látek pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze, která jsou snadno dostupné při nízkých nákladech.

Další cíle a výhody tohoto vynálezu budou dále uvedeny v popisu, který následuje a zčásti budou zřejmé z tohoto popisu nebo mohou být zjištěny při provádění tohoto vynálezu. Tyto cíle a výhody tohoto vynálezu mohou být realizovány a získány pomocí prostředků a kombinací, na které je dále příslušně poukázáno.

Přehled obrázků na výkrese

Přiložené výkresy, které jsou začleněny a tvoří část tohoto popisu, zobrazují nyní výhodná provedení vynálezu a spolu s obecným popisem uvedeným výše a detailním popisem výhodných provedení uvedeným dále, slouží k vysvětlení principů tohoto vynálezu.

Obr. 1 je graf ukazující časové změny v koncentraci každé ze složek reakčního systému v příkladu 1 obsahujícím roztok uracilthyminového rozkladového enzymu, a obr. 2 je graf ukazující časové změny v koncentraci každé ze složek reakčního systému v příkladu 1, který neobsahuje roztok uracilthyminového rozkladového enzymu.

Detailní popis vynálezu

První aspekt tohoto vynálezu je směrován na způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny zahrnující stupeň podrobení pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze výměnné reakci báze ve vodném roztoku obsahujícím fosfátové ionty v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, přičemž pyrimidinová báze vytvořená při reakci se převede pomocí mikroorganizmu nebo enzymu odvozeného z tohoto mikroorganizmu na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy.

Startovací látky

Pyrimidinová nukleosidová sloučenina použitá jako startovací látka je buď přírodního typu, nebo nepřírodního typu a není zvlášť omezena, pokud tato sloučenina akceptuje působení pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a vytvořená pyrimidinová báze akceptuje působení použitého rozkladového enzymu. Například pyrimidinová nukleosidová sloučenina zahrnuje uridin, deoxyuridin, 5-methyluridin a thymidin a také je možné použít nepřírodního typu pyrimidinového nukleosidu a nepřírodního deoxypyrimidinového nukleosidu.

Purinová báze použitá v tomto vynálezu není zvlášť omezena pokud tato báze akceptuje působení purinové nukleosidové fosforylázy a zahrnuje například přírodní purinové báze jako je adenin, guanin a hypoxanthin, a nepřírodní puriny zahrnující benzimidazol, aminované puriny jako je 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin, halogenované puriny jako je 2-chlorpurin, 6-chlorpurin,

-2CZ 290350 B6

2,6-dichlorpurin a 2-amino-6-chlorpurin, a thionované puriny jako je 6-merkaptopurin a 6-methylthiopurin.

Mikroorganizmy a enzymy

V principu purinová nukleosidová fosforyláza a pyrimidinová nukleosidová fosforyláza, které jsou použity v tomto vynálezu, mohou být jakéhokoli původu.

Enzymy odvozené z mikroorganizmů, které jsou použity v tomto vynálezu pro rozklad pyrimidinové báze nejsou zvláště omezeny, pokud tyto enzymy umožňují konverzi pyrimidinové báze vytvořené výměnnou reakcí báze na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy a zahrnují například uracilthymindehydrogenázu (EC1.2.99.1) a dihydrouracyl dehydrogenázu (EC1.3.1.1.). Zvlášť je žádoucí použít enzymy vytvořené z mikroorganizmů specifikovaných dále a z Rhodococcus erythropolis JCM 3132 nebo Rhodococcus erythropolis JCM 3191.

Jak je zde použito „pomocí mikroorganizmů nebo enzymů odvozených z mikroorganizmů“ znamená provádění při rozkladové reakci pyrimidinové báze pomocí suspenze mikroorganizmů (to je bakteriální suspenze), nebo enzymů produkovaných z mikroorganizmů.

V souhlase s tím v tomto vynálezu mohou být použity suspenze obsahující mikroorganizmy nebo enzymy produkované z těchto mikroorganizmů pro rozkladovou reakci pyrimidinové báze.

Jinými slovy, bakteriální suspenze samotná obsahující mikroorganizmy může být použita pro rozkladovou reakci pyrimidinové báze. Alternativně enzymy produkované ze suspendovaných mikroorganizmů mohou být použity pro rozkladovou reakci pyrimidinové báze.

Stabilizátor ribóza-1-fosfátu

Při výměnné reakci báze tohoto vynálezu, která se provádí v přítomnosti pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy, cukerné deriváty ribóza-l-fosfátu nebo deoxyribóza-1-fosfátu se produkují jako meziprodukty. Tyto meziprodukty jsou nestabilní. Když se ponechají stát, tyto meziprodukty se rozloží během doby na cukr jako je ribóza nebo deoxyribóza a fosfátové ionty. Jestliže fosfatáza je přítomna v reakčním systému, hydrolýza meziproduktů se dále urychlí.

Mělo by být poznamenáno, že cukr jako je ribóza nebo deoxyribóza vytvořený rozkladem meziproduktů nepůsobí jako substrát nukleosidové fosforylázy, což vede ke snížené tvorbě purinového nukleosidu nebo deoxypurinového nukleosidu. Aby se zvýšila tvorba účinku těchto purinových nukleosidových sloučenin, původci vynálezu provedli rozsáhlý výzkum ve snaze najít látku účinnou pro stabilizaci cukerného derivátu jako je ribóza-1-fosfát nebo deoxyribóza-l-fosfát a také účinnou pro inhibici aktivity fosfatázy, přičemž nalezli kombinaci některých druhů komplexotvomých sloučenin, která je účinná pro stabilizaci cukerného derivátu a pro inhibici aktivity fosfatázy.

Konkrétně vynálezci zjistili, že je účinné použít alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující glycin, iminodioctovou kyselinu, nitroltrioctovou kyselinu, ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA), ethylenglykol-(2-aminoethylether)tetraoctovou kyselinu (EGTA) a jejich soli v kombinaci s kyselinou boritou nebo její solí. Zejména se prominentní účinek vytvoří kombinací kyseliny borité a ethylendiaminotetraoctové kyseliny.

Reakční podmínky a izolační rafinace

Pokud jde o reakční podmínky, počáteční koncentrace pyrimidinové nukleosidové sloučeniny použité jako startovací látky v tomto vynálezu, by měla být 5 až 300 mM, výhodně 10 až 50 mM.

-3 CZ 296356 B6

Na druhé straně počáteční koncentrace purinové báze, která má obecně nízkou rozpustnost, by měla být 5 až 300 mM, výhodně 10 až 50 mM, přičemž se počítá, že všechna purinová báze, která je zpočátku přidána, bude rozpuštěna. Pro počáteční koncentraci fosfátových iontů dostačuje, aby byla 1 až 20 mM. Obecně nukleosid a purinová báze jsou uspořádány ve stejné počáteční koncentraci.

Také výtěžek produktové purinové nukleosidové sloučeniny se zvýší obecně se zvýšením poměru koncentrace nukleosidu k fosfátovým iontům.

Když se přichází ke komplexotvomým sloučeninám použitým jako stabilizátor, množství kyseliny borité nebo její soli by mělo být 5 až 200 mM, výhodně 50 až 100 mM. Na druhé straně množství protějšku kombinace, například EDTA nebo její soli, by mělo být 2 až 12 mM, výhodně 4 až 6 mM.

Hodnota pH reakčního systému by měla být 6,5 až 10,5, výhodně 7,0 až 8,0. Reakční teplota by měla být 35 až 60 °C, výhodně 35 až 45 °C.

Vytvořený produkt může být izolován z reakční směsi pomocí například krystalizace nebo chromatografíe.

Princip a teorie tohoto vynálezu

1. V prvním stadiu tohoto vynálezu reakce mezi pyrimidinovou nukleosidovou sloučeninou a fosfátovým iontem se provádí v přítomnosti fosfátového iontu a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, čímž se vytvoří pyrimidinová báze a cukerný derivát, ve kterém se fosfátový iont váže k 1-poloze cukru, jako je ribóza-1 -fosfát nebo 2-deoxyribóza-l-fosfát.

2. V druhém stadiu se substituční reakce provádí mezi cukerné deriváty vytvořeným v prvním stadiu a purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy tak, že se vytvoří purinová nukleosidová sloučenina a fosfátový ion.

Při aranžování stadia 1 a 2 se výměnná reakce báze provádí mezi pyrimidinovým nukleosidem a purinovou bází v prvním a druhém stadiu v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, takže se vytvoří pyrimidinová fáze a purinová nukleosidová sloučenina.

3. V tomto vynálezu reakční systém obsahuje enzym sloužící ke konverzi pyrimidinové báze na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy. Alternativně reakční systém obsahuje mikroorganizmy produkující příslušný enzym. Je žádoucí použít v tomto vynálezu mikroorganizmy produkující enzym jako je uracilthymindehydrogenáza nebo dihydrouracildehydrogenáza, i když mikroorganizmy použité v tomto vynálezu nejsou zvlášť omezeny.

V předloženém vynálezu příslušný enzym nebo mikroorganizmy produkující enzym jsou přítomny v reakčním systému společně s akceptorem elektronu tak, že se převede pyrimidinová báze na sloučeninu schopnou působit jako substrát pro pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu a purinovou nukleosidovou fosforylázu. V případě, kde se použije bakteriální suspenze při reakci, akceptor elektronu nemusí být přidán do reakčního systému, poněvadž akceptor elektronu je obsažen v bakteriích.

Mělo by být poznamenáno, že převedená pyrimidinová báze, která je neschopna působit jako substráty pro purinovou nukleosidovou fosforylázu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu, není zahrnuta ve výměnné reakci substrátu a tedy je vyloučena z reakčního systému. Následkem toho je rovnováha reakce posunuta směrem na stranu, na které se vytvoří produktová purinová nukleosidová sloučenina, což umožňuje získat požadovaný produkt ve vysokém výtěžku.

4. Dále je možné pro reakční systém, aby obsahoval enzym sloužící dalšímu rozkladu převedené sloučeniny, když je to nutné, jak je to popsáno dále ve spojení s výhodným provedením.

Výhodné provedení

Při výhodném provedení tohoto vynálezu se uridin nebo 2'-deoxyuridin (zde označovaný jako „deoxyuridin“) použije jako startovací látka pyrimidinové nukleosidové sloučeniny. Purinová báze se použije jako báze nukleové kyseliny. Dále purinová nukleosidová fosforyláza, pyrimidinová nukleosidová fosfatáza a uralcilthymindehydrogenáza (EC 1.2.99.1), se použijí jako enzymy.

(1) V prvním stadiu se reakce mezi uridinem nebo deoxyuridinem a fosfátovými ionty provádí v přítomnosti fosfátových iontů a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy tak, že se vytvoří uráčil a ribóza-l-fosfát nebo 2-deoxyribóza-l-fosfát (dále zde označovaný jako „deoxyribóza-l-fosfát“).

(2) V druhém stadiu se substituční reakce mezi vytvořeným ribóza-l-fosfátem nebo deoxyribóza-l-fosfátem a purinovou bází provádí v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy. Purinový nukleosid a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi ribóza-l-fosfátem a purinovou bází. Na druhé straně 2'-deoxypurinový nukleosid (zde dále označovaný jako „deoxypurinový nukleosid“) a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi deoxyribózou-l-fosfátem a purinovou bází.

Jinými slovy v prvním a druhém stadiu, které jsou výše popsány, se výměnné reakce bází provádějí mezi iridinem nebo deoxyuridinem a purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy tak, že se vytvoří uráčil a purinový nukleosid nebo deoxypurinový nukleosid.

(3) Umožněním, aby uracilthymindehydrogenáza samotná nebo jak uracilthymindehydrogenáza akceptor elektronu (oxidační typ) jako je NAD, byly přítomny v reakčním systému, uráčil vytvořený rozkladem uridinu nebo deoxyuridinu se nevratně převede na kyselinu barbiturovou. Protože vytvořená kyselina barbiturová nemůže působit jako substráty purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, není kyselina barbiturová zahrnuta ve výměnné reakci a je vyloučena z reakčního systému.

Následkem toho se rovnováha reakce posune směrem na stranu na které se tvoří požadovaný produkt purinové nukleosidové sloučeniny, což umožňuje získat požadovaný produkt ve vysokém výtěžku.

(4) Dále umožněním, aby barbituráza (EC 3.5.2.1) byla přítomna v reakčním systému, kyselina barbiturová se rozloží na močovinu a malonovou kyselinu. Následkem toho se výměnná reakce podporuje v přítomnosti uracilthymindehydrogenázy.

Například kde se získá 2'-deoxyguanosin (zde dále označovaný jako „deoxyguanosin“) jako produktová purinová nukleosidová sloučenina ze startovacích látek deoxyuridinu jako pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a guaninu jako purinové báze, přičemž reakce se provádí následovně:

-5CZ 296356 B6

Guanin

2-DeoxyribosAfosfát

2’-Deoxyguanosin

V reakčním schématu uvedeném výše zkratky PYNP, PUNP a Pi představuje popořadě pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu, purinovou nukleosidovou fosforylázu a fosfátové ionty.

Z prvního a druhého stadia (1) a (2) popsaných dříve, se stanoví reakční schéma uvedené dále:

2’-Deoxyuridin<

2’-Deoxyguanosin

Uráčil

V tomto reakčním schématu uvedené výše zkratky PYNP a PUNP představují popořadě pyrimidinovou nukleosidovou a purinovou nukleosidovou fosforylázu jako v dříve popsaném reakčním schématu.

-6CZ. ZV0J30 t5O

Akceptor elektronu + H₂O

Uráčil

Uracilthymindehydrogenasa

⁺ Akceptor elektronu

Kyselina barbiturová

Barbiturasa o —-------- II

Z^C\ h₂n nh₂

COOH I ch₂

I

COOH kyselina barbiturová močovina kyselina malonová

Při výhodném provedení tohoto vynálezu se uridin nebo deoxyuridin použije jako pyrimidinová nukleosidová sloučenina. Také purinová báze se použije jako báze nukleové kyseliny.) Dále purinová nukleosidová fosforyláza, pyrimidinová nukleosidová fosforyláza a dihydrouracildehydrogenáza (EC 1.3.1.1) se použijí jako enzymy.

(1) Reakce mezi uridinem nebo deoxyuridinem a fosfátovými ionty se provádí v přítomnosti pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, čímž se vytvoří uráčil a ribóza-1-fosfát nebo deoxyribóza-l-fosfát.

(2) Pak ribóza-1-fosfát nebo deoxyribóza-1-fosfát takto vytvořené se podrobí substituční reakci s purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy. V tomto případě purinové nukleosidové a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi ribóza-l-fosfátem a purinovou bází. Podobně deoxypurinové nukleosidové a fosfátové ionty se vytvoří reakcí mezi deoxyribóza-1fosfátem a purinovou bází.

Tam, kde se reakce (1) a (2) uvedené výše uskutečňují společně, může být řečeno, že výměnné reakce bází se provádějí mezi uridinem nebo deoxyuridinem a purinovou bází v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, čímž se vytvoří purinový nukleosid nebo deoxypurinový nukleosid a uráčil.

(3) Umožněním, aby dihydrouracyldehydrogenáza samotná nebo jak dihydrouracildehydrogenáza, tak akceptor elektronu (redukční typ) jako je NADH byly přítomny v reakčním systému, uráčil vytvořený rozkladem uridinu nebo deoxyuridinu se nevratně převede na dihydrouracil. Takto vytvořený dihydrouracil, který nemůže působit jako substráty pro purinovou nukleosido vou fosforylázu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu, není zahrnut ve výměnné reakci substrátu a tak je vyloučen z reakčního systému. Následkem toho se rovnováha reakce posune na stranu, na které se vytvoří požadovaný produkt purinové nukleosidové sloučeniny, což umožňuje získat požadovaný produkt kvantitativně.

(4) Dále se dihydrouracil rozkládá na N-karbamoyl-betaalanin přítomností dihydropyrimidinázy (EC 3.5.2.2). Jako následek se podpoří reakce dihydrouracildehydrogenázy.

Tam, kde se například získá 2'-deoxyadenosin (zde dále označovaný jako „deoxyadenosin“) jako požadovaná purinová nukleosidová sloučenina z deoxyuridinu, který je pyrimidinovou nukleosidovou sloučeninou použitou jako jedna ze startovacích látek a adeninu, který je použitou purinovou bází jako druhý startovací materiál, reakce se provádí následovně:

*-Deoxyuridin

2-Deoxy r ibosa. ¹ fosfát

Uráčil

Adenin

PUNP

2-Deoxyribosa1- fosfát

Pí

2’-Deoxyadenosin

Zkratky PYNP, PUNP a Pi uvedené ve výše uvedeném reakčním schématu mají dříve definovaný 15 význam.

Reakční schéma uvedené dále je stanoveno z odstavců (1) a (2) uvedených výše:

-8ΙΉΜ B6

PUNP PYNP

Adenin 2' -Deoxyuridin

2'-Deoxyadenosin

Uráčil

Zkratky PYNP a PUNP uvedené v tomto reakčním schématu mají dříve uvedený význam.

O

H

Uráčil + akceptor elektronu

Dihydrouracil dehydrogenasi

+ akceptor elektronu

Dihydrouracil

O

Anh ^L _tA₀ ^{+ Hj0}

Dihydropyrimidinasi

------------------------->.

O

H₂N-C-NH-CH₂-CH_z-COOH

Dihydrouracil N-karbamoyl-P-alanin

Druhý aspekt tohoto vynálezu je směrován k mikroorganizmům produkujícím uracilthyminde5 hydrogenázu nebo dihydrouracildehydrogenázu. Tyto mikroorganizmy jsou vybrány ze skupiny zahrnující Arthrobacton species YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908) a Pseudomonas species IGK 443 (FERM BP-5909).

Mikroorganizmy produkující enzymy a jejich identifikace

Vynálezci zjistili, že alespoň jeden ze série enzymů sloužících k přeměně pyrimidinové báze na sloučeniny neschopné působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové

-9CZ 296356 B6 nukleosidové fosforylázy je produkován mikroorganizmy. Konkrétně u těchto mikroorganizmů bylo zjištěno, že produkují alespoň jeden enzym vybraný ze skupiny zahrnující (1) uracilthymindehydrogenázu, (2) dihydrouracildehydrogenázu, (3) uracilthymindehydrogenázu a barbiturázu (EC3.5.2.1) a (4) dihydrouracildehydrogenázu a dihydropyrimidinázu (EC3.5.2.2).

Kultivační podmínky a příprava enzymů

Tyto mikroorganizmy dobře rostou v běžném kultivačním médiu bakterií a vytvářejí požadované enzymy. Pro zvýšení aktivity enzymů je účinné přidat pyrimidinovou bázi do kultivačního prostředí.

Kultivované kmeny mohou být použity jako takové jako surový enzym. Je také možné získat surový enzym běžnou metodou pro využití v tomto vynálezu.

Arthrobacter species YGK 222 (FERM BP-5907),

Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908),

Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909),

Rhodococcus erythropolis JCM 3132,

Rhodococcus erythropolis JCM 3191.

Symbol „JCM“ znamená, že kmeny jsou uloženy v Japonské sbírce mikroorganizmů v Institutu fyzikálního a chemického výzkumu (Rikagatu Kenkyusho). Tyto kmeny jsou získatelné z Japonské sbírky mikroorganizmů uvedené výše.

Ostatní kmeny to je YGK 222 (FERM BP-5907), YGK 252 (FERM BP-5908), YGK 443 (FERM BP-5909), jsou uloženy v Národním institutu biovědy a humánní technologie, Agentura průmyslové vědy a technologie. Tyto mikroorganizmy YGK 222 (FERM BP-5907), YGK 252 (FERM BP-5908), YGK 443 (FERM BP-5909) byly uloženy 11. dubna 1997 podle Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganizmů pro účely patentového řízení. Tyto mikroorganizmy jsou uloženy pod depozitními čísly uvedenými v závorkách.

Bakteriální vlastnosti těchto uložených kmenů byly studovány podle „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology č. 8 (1975)“, „Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology č. 1 (1984) a č. 2 (1986)“, čímž se získaly výsledky uvedené níže. Experimenty byly prováděny způsobem popsaným v „Classification and Identifícation of Microorganisms“ sestavené Takei Hasegovou, revidované vydání, publikované Gakkai Shuppan Center, 1985. Tyto údaje jsou zde začleněny formou odkazu.

Arthobactor species YGK 222

1. Morfologické vlastnosti (1) Rozměr buňky: tyčinka o rozměru 0,5 až 0,7krát 1,0 až 5,0mikrometru (2) Gramův kmen: pozitivní (3) Polymorfismus buňky: je rozpoznán nápadný polymorfismus koku až tyčinky doprovázející růstový cyklus (4) Pohyblivost: pohyblivost je rozpoznávána při kultivaci po dobu 5 až 24 hodin v kapalném kultivačním médiu připraveném přídavkem bujónu do kvasinkového extraktu (5) Adherentní stav bičíku: 1 až 2stranný bičík (6) Spora: žádná (7) Odolnost vůči kyselinám: žádná

CZ, ZV0J30 tso

2. Kultivační vlastnosti (1) Kultivace na bujónové agarové plotně: kruhová vlnitá kolonie, která je mléčně bílá, průsvitná a má drsný povrch, se vytvoří při kultivaci při 30 °C po dobu 24 hodin (2) Bujónová agarová šikmá kultivace: bleděžluté a průsvitné mikroorganizmy rostou dobře po celém kultivačním médiu (3) Bujónová kapalná kultivace: růstová rychlost je nízká. Dobrý růst byl zjištěn v třepavé kultuře mající přidaný kvasinkový extrakt (4) Bujónová želatinová očkovaná kultura: povrchová oblast samotná je mírně ztekucená (5) Lakmusové mléko: žádná změna

3. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce nitrátu: negativní (2) Denitrifikační reakce: negativní (3) MR test: negativní (4) VP test: negativní (5) Tvorba indolu: negativní (6) Tvorba hydrogensulfídu: negativní (7) Využití kyseliny citrónové: Christensen agar: negativní Koser medium: negativní (8) Využití zdroje anorganického dusíku: nitrát: pozitivní amonná sůl: negativní (9) Chromogeneze: žádná (10) Ureáza: negativní (11) Oxidáza: negativní (12) Kataláza: pozitivní (13) Oblast růstu:

pH rozmezí: 5,5 až 9,5 teplotní rozmezí: 19 až 38 °C (14) Vztah k volnému kyslíku: aerobní (15)O-Ftest:

glukóza: žádná změna sacharóza: žádná změna (16) Využití různých zdrojů uhlíku

	L-arabinóza	±
	D-xylóza	+
	D-glukóza	+
40	D-mannóza	+
	D-fřuktóza	+
	D-galaktóza	+
	maltóza	+
	sacharóza	+
45	laktóza	—

- 11 CZ 296356 B6 trehalóza +

D-sorbitol + D-mannitol + inositol + glycerin škrob -

4. GC obsah (HPLC metodou):

G + C (molámí %) = 69,6

Mikroorganizmy byly vyčištěny, aby náležely k Arthrobactor species na základě bakteriologických vlastností uvedených výše.

Bacillus megaterium YGK 252

1. Morfologické vlastnosti (1) Rozměr buňky: tyčinky o rozměrech 1,6krát 4,0 až 9,9 mikrometrů (2) Gramův kmen: pozitivní (3) Polymorfismus buňky: žádný (4) Pohyblivost: rozpoznána (5) Adherentní stav bičíku: rozpoznán, peritrichální bičík (6) Spora: sporangia nejsou zduřená, spora je elipsoidální (7) Odolnost vůči kyselině: žádná

2. Kultivační vlastnosti (1) Bujónová agarová plotnová kultivace: kruhová vlnitá kolonie, která je mléčně bílá a opakní a má drsný povrh, je vytvořena při kultivaci při 30 °C po dobu 24 hodin.

(2) Bujónová agarová šikmá kultivace: bleděžluté a opakní mikroorganizmy, mající mírně suchý povrch a drsný okraj, rostou dobře podél rýhy (3) Bujónová kapalná kultivace: růstová rychlost je nízká. Dobrý růst je zjištěn, když se přidá kvasinkový extrakt.

(4) Bujónová želatinová očkovaná kultura: povrchová oblast samotná je mírně ztekucená (5) Lakmusové mléko: mírná kyselost a koagulace je zjištěna

3. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce nitrátu: pozitivní (2) Denitrifikační reakce: pozitivní (3) MR test: pozitivní (4) VP test: negativní (5) Tvorba indolu: negativní (6) Tvorba hydrogensulfídu: negativní (7) Využití kyseliny citrónové: Christensen agar: pozitivní Koser medium: pozitivní (8) Využití zdroje anorganického dusíku nitrát: pozitivní amonná sůl: pozitivní (9) Chromogeneze: žádná (10) Urease: pozitivní (11) Oxidáza: pozitivní (12) Kataláza: pozitivní (13) Oblast růstu pH oblast: 5,5 až 10,5 oblast teplot: 10 až 43 °C (14) Vztah k volnému kyslíku: aerobní (15) 0-Ftest glukóza: žádná změna sacharóza: žádná změna (16) Využití různých zdrojů uhlíku

L-arabinóza D-xylóza D-glukóza D-mannóza D-fruktóza D-galaktóza maltóza sacharóza laktóza trehalóza D-sorbitol D-mannitol inositol glycerin škrob +

4. GC obsah (HPLC metodou):

G + C (mobilní %) = 34,7

Mikroorganizmus byl vyčištěn, aby náležel k Bacillus megaterium na základě bakteriologických vlastností uvedených výše.

Pseudomonas species YGK 443

1. Morfologické vlastnosti (1) Rozměr buňky: tyčinky o rozměrech 0,4 až 0,6 krát 0,6 až 2,4 mikrometru (2) Gramův kmen: negativní (3) Polymorfismus buňky: žádný (4) Pohyblivost: rozpoznána (5) Adherentní stav bičíku: 4 až 5 polárních bičíků bylo zjištěno (6) Spora: žádný (7) Odolnost vůči kyselině: negativní

2. Kultivační vlastnosti

- 13CZ 296356 B6 (1) Bujónová agarová plotnová kultivace: kruhová vlnitá kolonie, která je mléčně bílá a má hladký povrch se vytvoří při kultivaci při 30 °C po dobu 24 hodin.

(2) Bujónová agarová šikmá kultivace: bleděžluté průsvitné a lesklé mikroorganizmy rostou dobře podél rýhy (3) Bujónová kapalná kultivace: dobrý růst je zjištěn při třepání kultury (4) Bujónová želatinová očkovaná kultura: žádná změna (5) Lakmusové mléko: alkalické a nepeptonizované

3. Fyziologické vlastnosti (1) Redukce nitrátu: pozitivní (2) Denitrifikační reakce: negativní (3) MR test: negativní (4) VP test: negativní (5) Tvorba indolu: negativní (6) Tvorba hydrogensulfidu: negativní (7) Využití kyseliny citrónové Christensen agar: pozitivní Koser medium: pozitivní (8) Využití zdroje anorganického dusíku nitrát: pozitivní amonná sůl: pozitivní (9) Flurescentní chromogeneze: žádná (10) Ureáza: pozitivní (11) Oxidáza: pozitivní (12) Kataláza: pozitivní (13) Oblast růstu pH oblast: 4,2 až 10,5 teplotní oblast: 17 až 43 °C (14) Vztah k volnému kyslíku: aerobní (15) O-F test glukóza: O (oxidační) sacharóza: žádná změna (16) Rozklad argininu: negativní (17) Využití různých zdrojů uhlíku

L-arabinóza +
D-xylóza	+
D-glukóza	+
D-mannóza	+
D-fruktóza	+
D-galaktóza	+
maltóza	+
sacharóza	+
laktóza	—
trehalóza	+
D-sorbitol	—

cz. zyojso ho

D-mannitol + inositol+ glycerin+ škrob-

4. GC obsah (HPLC metodou):

G + C (molámí %) = 62,3

Mikroorganizmus byl vyčištěn, aby náležel k Pseudomonas species na základě bakteriologických vlastností uvedených výše.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález je popsán detailněji s odkazem na přípravné příklady, experimenty a příklady, které následují.

Přípravný příklad 1

Příprava bakteriální suspenze obsahující purinovou nukleosidovou fosforylázu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu

Bacillus stearothermofílus JTS 859 (FERM P-9666), který je bakterií produkující purinovou nukleosidovou fosforylázu (PUNP) a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu (PYNP) byl kultivován následovně.

Pro kultivaci bakterií bylo použito kultivační médium o pH hodnotě 6,2 a obsahující 10 g baktotriptonu, 5 g kvasnicového extraktu, 3 g glukosy, 3 g stolní soli, 1 g inosinu a 1 1 vody. Do 1,5 1 kultivačního média bylo přidáno 3 x 10⁷ spor Bacillus stearothermophilus JTS 859 (FERM P-9666) pro kultivaci při cirkulaci vzduchu vvm a kultivační teplotě 65 °C a pH hodnotě 6,0 až 6,4 za použití 3 litrové fermentační nádoby vybavené horními a spodními míchacími lopatkami, z nichž každý má průměr 70 mm. Během kultivace se míchací lopatky otáčely rychlostí 500 otáček/min. Po skončení kultivace byly bakterie centrifugálně sdruženy (10 000 g), 4 °C, 15 minut).

g vlhkých bakterií takto získaných bylo suspendováno ve 30 ml lOmM roztoku fosforečnanu draselného (pH 7), takže se připraví bakteriální suspenze obsahující purinovou nukleosidovou fosforylázu a pyrimidinovou nukleosidovou fosforylázu (zde dále označovanou jako „PUNP.PYNP enzymový roztok“).

Přípravný příklad 2

Příprava bakteriální suspenze mající rozkladovou aktivitu pro uráčil a thymin

Bakteriální suspenze Arthrobactor species YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908), Pseudomonas species YGK 443 (FERM BP-5909), Rhodococcus erythropolis JCM 3132 nebo Rhodococcus erythropolis JCM 3191, přičemž každý má rozkladovou aktivitou pro uráčil a thymin, byla připravena následovně.

Pro kultivaci bakterií bylo použito kultivační médium mající hodnotu pH 7,0 a sestávající ze 2 g uracilu, 1 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 3 g hydrogenfosforečnanu dvoj draselného, 6 g kvasnicového extraktu a 1 1 vody. Kultivační médium bylo dále do 21itrové Erlenmeyerovy baňky a inokulováno 3.10⁷ bakterií nebo spor výše zmíněných mikroorganizmů. Za těchto podmínek byla kultivace prováděna po dobu 15 hodin při 35 °C, přičemž se Erlenmeyerova baňka otáčela rychlostí 200 otáček za minutu.

- 15 CZ 296356 B6

Po skončení kultivace byla bakterie centrifugálně sdruženy (10 000 G, 4 °C, 15 minut), a vlhké bakterie takto získané byla suspendovány v 6 ml pufrovaného roztoku (pH 7) obsahujícího 10 mM fosforečnanu draselného tak, aby se připravila bakteriální suspenze (zde dále označovaná jako „roztok enzymu rozkládající uráčil.thymin“).

Experiment 1

Produkce enzymu z mikroorganizmů rozkládajícího uráčil a thymin ml reakčního roztoku obsahujícího buď 50 mM uracilu, nebo 50 mM thyminu, 100 mM fosforečnanového pufrového roztoku (pH 7), a 0,05 ml některého enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin odvozeného od kmenů připravených v přípravném příkladu 2 bylo ponecháno reagovat při 35 °C po dobu 15 minut a rozkladová aktivita pro thymin a uráčil v reakčním roztoku byla měřena vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií.

Tabulka 1 ukazuje výsledky. Rozkladová aktivita U uvedená v tabulce 1 značí množství enzymové aktivity vyžadované pro rozklad 1 mikromolu substrátu (uracilu nebo thyminu) za minutu při 35 °C.

Tabulka 1

Kmen	Rozkladová aktivita (U/vlhké bakterie g)
	uráčil	thymin
Arthrobactor species YGK 222	36,4	14,5
Bacillus megaterium YGK 252	5,8	2,1
Pseudomonas species YGK 443	2,2	1,4
Rhodococcus erythropolis JCM 3132	10,6	4,2
Rhodococcus erythropolis JCM 3191	7,8	3,2

Experiment 2

Produkce enzymu bakterie produkující enzym rozkládající uracil.thymin ml reakčního roztoku obsahujícího 50 mM uracilu, 100 mM fosforečnanového roztoku (pH 7) a 0,05 ml kteréhokoli z enzymových roztoků rozkládajících uracil.thymin odvozeného z kmenů připravených v přípravném příkladu 2 bylo ponecháno reagovat při 35 °C po dobu 15 až 30 minut. Přítomnost uracilthymindehydrogenázy, barbiturázy, dihydrouracildehydrogenázy a dihydropyrimidinázy stejně jako tvorba a mizení kyseliny barbiturové a dihydrouracilu bylo detekováno sledováním pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie.

Tabulka 2 ukazuje výsledky. Symboly „+“ a v tabule 2 popořadě označují, že enzym byl detekován nebo nedetekován.

Mělo by se poznamenat, že kde například aktivita dihydropyrimidinázy je vyšší než aktivita dihydrouralcildehydrogenázy, vytvořený produkt dihydrouracil není detekován. Z toho vyplývá, že symbol v tabulce 2 nutně nepopírá stoprocentně přítomnost příslušného enzymu.

Tabulka 2

Kmen č.	Detekce každého enzymu
uracilthyminde hydrogenáza	barbituráza dihydrouracildehydrogenáza	dihydropyrimidiná- za
YGK 222	+	+	—	—
YGK 443	+	+	+	-1-
YGK 252	+	+	+	+
JCM 3132	+	+	—	—
JCM 3191	+	+	-	-

- 16Příklad 1

Příprava purinového nukleosidu pomocí PUNP.PYNP enzymového roztoku a enzymového roztoku a enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin

100 ml vodného roztoku (pH 7) obsahujícího 20 mM thymidinu, 20 mM guaninu, 1,25 mM fosforečnanu draselného, 2 ml PUNP PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1, 0,5 ml enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin odvozeného z Arthrobactor species YGK 222, který byl připraven v přípravném příkladu 2, 100 mM kyselina borité a 4 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny bylo ponecháno reagovat při 35 °C po dobu 110 hodin tak, že se měří koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi. Obr. 1 ukazuje výsledky.

Další experiment byl prováděn podobně s výjimkou toho, že enzymový roztok rozkládající uracil.thymin nebyl přidán do reakčního roztoku, takže směsí koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi. Tabulka 2 ukazuje výsledky.

V každém obr. 1 a 2 je thymidin označen bílými čtverci a deoxyguanosin je označen černými kosočtverci. Dále thymin a 5-methylbarbiturová kyselina jsou označeny popořadě červenými trojúhelníky a bílými trojúhelníky.

Obr. 1 ukazuje tvorbu 5-methylbarbiturové kyseliny. Protože kyselina se rozkládá jakmile se objeví, osvětluje to, že uracilthymindehydrogenázaa barbiturázajsou přítomny v enzymu rozkládajícím uracil.thymin. V případě obr. 1 thymidin zmizel v podstatě úplně, ačkoli startovací látka guanin byl nalezen, že zůstává jenom mírně.

Deoxyguanosin byl vytvořen v množství 14,9 mM (výtěžek 75%).

Ve srovnání s obr. 2 pokrývajícím případ, kde enzymový roztok rozkládající uracil.thymin nebyl přítomen, obr. 1 dokládá, že požadovaný produkt deoxyguanosin byl vytvořen ve velmi velkém množství.

Příklady 2 až 11

Příprava purinových nukleosidů pomocí různých startovacích látkových nukleosidů a různých startovacích látkových purinových bází.

Reakce byla prováděna při 35 °C po dobu 90 hodin za stejných podmínek jako v příkladu 1, s výjimkou toho, že byly použity pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové bázeuvedené v tabulce 3. Koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi byly měřeny s výsledky uvedenými v tabulce 3.

Tabulka 3 také ukazuje srovnávací příklady. Tyto srovnávací příklady byly stejné jako samotné příklady s výjimkou toho, že 0,5 ml destilované vody bylo přidáno do reakčního systému místo roztoku enzymů rozkládajících uracil.thymin použitého v příkladech. Jak je zřejmé z tabulky 3, výtěžek purinové nukleosidové sloučeniny se zvýší přídavkem enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin. Zejména výtěžky guanosinu adeoxyguanosinu byly značně zvýšeny přídavkem enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin.

- 17CZ 296356 B6

Tabulka 3

	Suroviny	Vytvořená purinová	Vytvoř, množství mM
Př.	pyrimidinová	purinová báze	nukleosidová	enzym rozkládající
	nukleosidová		sloučenina	uráčil thymin
	sloučenina			přítomen	nepřítomen
2	thymidin	adenin	deoxyadenosin	17,7	8,8
3	thymidin	hypoxanthin	deoxyinosin	16,4	12,4
4	thymidin	benzimidazol	benzimidazoldeoxyribosid	17,7	15,7
5	deoxyuridin	adenin	deoxyadenosin	16,6	8,8
6	deoxysuridin	adenin	deoxyguanosin	15,4	2,2
7	deoxyuridin	hypoxanthin	deoxyinosin	15,9	11,7
8	deoxyuridin	benzimidazol	benzimidazoldeoxyribosid	17,2	13,9
9	uridin	adenin	adenosin	12,9	3,7
10	uridin	guanidin	guanosin	13,4	2,2
11	uridin	hypoxanthin	inosin	16,2	11,2

Příklad 12

Účinek enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin, odvozeného od kteréhokoli z kmenů, na tvorbu purinové nukleosidové sloučeniny

Bylo připraveno 100 ml roztoku (pH 7) obsahující 20 mM thymidinu, 20 mM guaninu, 1,25 mM fosforečnanu draselného, 2 ml PUNP.PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1, 0,5 ml enzymového roztoku rozkládajícího uráčil thymin odvozeného z kteréhokoli kmene, který byl připraven v přípravném příkladu 2, 100 mM kyseliny borité a 4 mM ethylendiamintetraoctové kyseliny. V tomto příkladu byly také prováděny srovnávací příklady stejným způsobem s výjimkou toho, že bylo přidáno 0,5 ml destilované vody do reakčního systému místo použitého enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin.

Reakční systém byl podroben reakci při 35 °C po dobu 100 hodin tak, že se měřily koncentrace substrátů a produktů obsažených v reakční směsi. Tabulka 4 ukazuje výsledky.

Enzymový roztok rozkládající uracil.thymin odvozený z jakéhokoli z kmenů byl zjištěn, že je účinný pro zvýšení výtěžku produktu deoxyguanosinu.

Tabulka 4

Kmen	Tvorba deoxyguanosinu (mM)
Enzymový roztok rozkládající uracil.thymin
přítomen	nepřítomen
Arthrobactor species YGK 222	12,4	2,4
Bacillus megaterium YGK 252	3,2	2,4
Pseudomonas species YGK 443	2,7	2,4
Rhodococcus erythropolis JCM 3132	5,3	2,4
Rhodococcus erythropolis JCM 3191	4,6	2,4

Příklad 13

Stabilizace meziproduktu (ribózy-fosfát) a inhibice rozkladu fosfatázou ml vodného roztoku (pH 7) obsahující 5 mM ribóza-1-fosfátu, stabilizátor uvedený v tabulce 5 (4 mM EDTA a 100 mM každého ze stabilizátorů bylo použito), 0,02 ml PUNP.PYNP enzymového roztoku připraveného v přípravném příkladu 1 a 0,01 ml enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin odvozeného z Arthrobactor species YGK 222, který byl připraven v přípravném

-18CZ 29()356 B6 příkladu 2, byly podrobeny reakci při 35 °C po dobu 72 h. Přítomnost ribóza-l-fosfátu a ribózy vznikající z rozkladu ribóza-l-fosfátu v reakční směsi byla zkoušena tenkovrstvou chromatografií, jejíž výsledky jsou uvedeny v tabulce 5. Zkoušení bylo prováděno způsobem popsaným Ishii aj. v „Agric. Biol. Chem., 53(12), 3209-3218 (1989)“, což je zde začleněno formou odkazu.

Tabulka 5 také ukazuje kontrolu, která byla prováděna stejným způsobem s výjimkou, že 100 ml tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (zde označovaného jako „tris“) bylo přidáno do reakčního systému místo PUNP.PYNP enzymového roztoku a použitého enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin. Případně symbol „+“ uvedený v tabulce 5 označuje, že byl zjištěn 10 rozklad ribóza-l-fosfátu, přičemž symbol označuje, že rozklad nebyl zjištěn.

Při kontrole, to znamená „tris(kontrola)“, při které nebyl přidáván enzymový roztok, rozklad moc neprobíhal, což dokládá, že v enzymovém rozkladu byla obsažena fosfatáza. Na druhé straně rozklad ribóza-1-fosfát, nebyl zjištěn v případě použití jak kyseliny borité, tak EDTA, což 15 dokládá, že tyto stabilizátory slouží k inhibici aktivity fosfatázy obsažené v enzymovém roztoku a přispívá ke stabilizaci ribóza-l-fosfátu.

Tabulka 5

Stabilizátor	Rozklad ribóza-l-fosfátu
tris (kontrola)	+
tris	+
kyselina boritá	+
glycin	+
kyselina boridá + glycin	+
tris + EDTA	+
kyselina boritá + EDTA	—
glycin + EDTA	+
EDTA	+

Příklad 14

Účinek stabilizátor při tvorbě deoxyguanosinu

100 ml vodného roztoku (pH 7) obsahujícího 20 mM thymidinu, 20 mM guaninu, stabilizátor uvedený v tabulce 6, 2 ml PUNP.PYNP enzymového roztoku připraveného v příkladném příkla25 du 1 a 0,5 ml enzymového roztoku rozkládajícího uracil.thymin odvozeného do Arthobactor species YGK 222, který byl připraven v přípravném příkladu 2, byl podroben reakci při 35 °C po dobu 90 hodin. Množství stabilizátoru označovaného „x“ v tabulce 6 bylo 4 mM, množství jiného stabilizátoru bylo 100 mM.

Množství deoxyguanosinu obsaženého v reakční směsi bylo měřeno, přičemž výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Experimentální data dokládají, že kombinace kyseliny borité a komplexotvomé sloučeniny podobné EDTA, přičemž tato kombinace je také testována v příkladu 13, je účinná pro inhibici 35 rozkladu ribóza-l-fosfátu tak, že se stabilizuje ribóza-1-fosfát a tak se zvyšuje účinnost tvorby purinové nukleosidové sloučeniny.

- 19CZ 296356 B6

Tabulka 6

Stabilizátor	Tvorba deoxyguanosinu (mM)
tris (kontrola)	0
kyselina boritá	1,5
glycin	0
iminodioctová kyselina*	0
nitrilotrioctová kyselina*	0
EDTA*	0
EGTA*	0
tris+EDTA*	0
glycin+EDTA*	0,4
kyselina boritá+tris	2,0
kyselina boritá +glycin	4,7
kyselina boritá + iminodioctová kyselina*	4,9
kys. boritá + nitrolotrioctová kyselina*	11,6
kyselina boritá + EDTA*	12,7
kyselina boritá + EGTA*	9,6

Další výhody a modifikace jsou lehce zřejmé odborníkům v oboru. Tudíž vynález v tomto svém širším aspektu není omezen na konkrétní detaily a příkladná provedení, která jsou zde ukázána a popsána. V souhlase s tím mohou být provedeny různé modifikace bez odchýlení se od ducha nebo rozsahu obecného vynálezeckého konceptu jak je definován v připojených patentových nárocích a jejich ekvivalentech.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny, zahrnující stupeň podrobení pyrimidinové nukleosidové sloučeniny a purinové báze výměnné reakci báze ve vodném roztoku obsahujícím fosforečnanové ionty v přítomnosti purinové nukleosidové fosforylázy a pyrimidinové nukleosidové fosforylázy, vyznačený tím, že pyrimidinová báze vytvořená touto reakcí se převede mikroorganizmem nebo enzymem odvozeným z tohoto mikroorganizmu na sloučeninu neschopnou působit jako substráty pyrimidinové nukleosidové fosforylázy a purinové nukleosidové fosforylázy; přičemž mikroorganizmus se zvolí z množiny sestávající z rodu Arthobactor, rodu Bacillus, rodu Pseudomonas a rodu Rhodococcus', a enzymem je uracilthymindehydrogenáza a dihydrouracildehydrogenáza.

2. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1, vyznačený tím, že alespoň jedna sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující glycin, iminodioctovou kyselinu, nitriloctovou kyselinu, ethylendiamintetraoctovou kyselinu a ethylenglykol(2-aminoethylether)tetraoctovou kyselinu a kyselinu boritou nebo borát, se přidá jako stabilizátor ribóza-l-fosfátu nebo deoxyribóza-1-fosfátu, které se vytvoří jako meziprodukty při výměnné reakci báze.

3. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že se pyrimidinnukleosidová sloučenina vybere ze skupiny zahrnující uridin, deoxyuridin, 5-methyluridin a thymidin.

4. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že purinovou bází je sloučenina zvolená z množiny sestávající z adeninu, guaninu, benzimidazolu, halogenovaného purinu a aminovaného purinu.

-20CZ. ZV0J30 ΒΟ

5. Způsob přípravy purinové nukleosidové sloučeniny podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačený tím, že uvedeným mikroorganizmem je Arthrobactor sp. YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908), Pseudomonas sp. YGK 443 (FERM BP5909), Rhodococcus erythropolis JCM 3132 nebo Rhodococcus erythropolis JCM 3191.

6. Mikroorganizmus schopný produkovat uracilthymindehydrogenázu nebo dihydrouracildehydrogenázu vybraný ze skupiny zahrnující Arthrobactor druh YGK 222 (FERM BP-5907), Bacillus megaterium YGK 252 (FERM BP-5908) a Pseudomonas sp. YGK 443 (FERM BP-5909).