JPH1146790A - プリンヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵素による核酸塩基の交換反応を利用して高
収率でかつ安定的にプリンヌクレオシド化合物を得る方
法を提供すること、及びウラシルチミンデヒドロゲナー
ゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微
生物を提供すること。 【解決手段】 ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン
塩基とをリン酸イオンを含む水溶液中において、ピリミ
ジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼにより塩基交換させる反応において、
生成するピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由来す
る酵素によりピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及
びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得な
い化合物に変換することにより、プリンヌクレオシド化
合物を得る。更に、本発明は、上記作用を有する新規微
生物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素による核酸塩
基の交換反応を利用してプリンヌクレオシド化合物を高
収率で製造する方法及び該製造に利用しうる酵素を産生
する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、酵素による核酸塩基の交換反応を
利用してヌクレオシド化合物を製造する方法が提案され
ているが、原料系と生成系の間に反応の平衡状態が生
じ、これが収率の向上しない原因となっていた。この対
策として、特開平４−１９７１９３号公報に、プリンヌ
クレオシドであるイノシン又は２’−デオキシイノシン
（以下、デオキシイノシンという）とピリミジン塩基と
をリン酸塩の水溶液中、プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ（ＥＣ２．４．２．１）及びピリミジンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）により塩基を
交換反応させ、この交換反応により生成したヒポキサン
チンをキサンチンオキシダーゼにより尿酸に変化させる
ことにより、反応収率を向上させる方法が開示されてい
る。この場合、尿酸はこれらヌクレオシドホスホリラー
ゼの基質にはなり得ないので、反応はピリミジンヌクレ
オシドを生成する方向に一方的に進行する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、該公報
に開示された方法は、原料としてイノシン又はデオキシ
イノシン及びピリミジン塩基を用いて、効率よくピリミ
ジンヌクレオシドを製造する方法であり、より安価で入
手しやすいピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基
を原料とするプリンヌクレオシド化合物の製造方法では
ない。ピリミジンヌクレオシド化合物を原料とする場合
は、塩基交換反応により生成するピリミジン塩基を分解
する酵素を反応系に加えることが平衡をずらし反応効率
を向上させるために必須であるが、該酵素を天然物から
活性の高い状態で製造したり、単離した事例は今まで報
告されていなかった。すなわち、ピリミジンヌクレオシ
ド化合物を原料とするプリンヌクレオシド化合物の高収
率の製造方法は見い出されていなかった。したがって、
安定に高収率でプリンヌクレオシド化合物を製造する方
法が強く望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の問題
点を解決すべく、ピリミジンヌクレオシド化合物とプリ
ン塩基との交換反応の際に生じるピリミジン塩基をピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼの基質となり得ない化合物へ変換す
る酵素を産生する微生物を鋭意探索した結果、アルスロ
バクター属、バチルス属、シュードモナス属、又はロド
コッカス属に属する微生物が該酵素を産生しうることを
見出し、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明の第一は、ピリミジンヌ
クレオシド化合物とプリン塩基とを、リン酸イオンを含
む水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより塩
基交換させる反応において、生成するピリミジン塩基を
微生物又は該微生物に由来する酵素によりピリミジンヌ
クレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホス
ホリラーゼの基質になり得ない化合物に変換することを
特徴とするプリンヌクレオシド化合物の高収率製造法で
ある。

【０００６】また、本発明の第二は、ウラシルチミンデ
ヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ
を産生する微生物であって、アルスロバクター・スピー
シーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０
７）、バチルス・メガテリウムＹＧＫ ２５２（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５９０８）及びシュードモナス・スピーシー
ズ ＹＧＫ ４４３ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）よ
りなる群から選択される微生物である。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。まず、第一の発明について説明する。第一の発明
は、ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基とを、
リン酸イオンを含む水溶液中において、ピリミジンヌク
レオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼにより塩基交換させる反応において、生成する
ピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由来する酵素に
よりピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合物
に変換することを特徴とするプリンヌクレオシド化合物
の製造方法である。 ＜原料＞本発明の原料として用いられるピリミジンヌク
レオシド化合物は、ピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼの作用を受け、生成したピリミジン塩基が使用する
分解酵素の作用を受けるものであれば、天然型、非天然
型を問わず、特に制限されない。例えば、ウリジン、デ
オキシウリジン、５−メチルウリジン、チミジンが挙げ
られ、その他の非天然型ピリミジンヌクレオシド及び非
天然型デオキシピリミジンヌクレオシドも含まれる。

【０００８】本発明に用いられるプリン塩基は、プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼの作用を受けるものであれ
ば特に制限されない。例えば、アデニン、グアニン、ヒ
ポキサンチンなどの天然型プリン塩基、ベンズイミダゾ
ール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンなど
のアミノ化プリン、２−クロロプリン、６−クロロプリ
ン、２，６−ジクロロプリン、２−アミノ−６−クロロ
プリンなどのハロゲン化プリン、及び６−メルカプトプ
リン、６−メチルチオプリンなどのチオ化プリンなどの
非天然型プリン塩基が挙げられる。 ＜微生物及び酵素＞本発明に用いられるプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリ
ラーゼは、原理的にはいかなる起源のものでも構わな
い。

【０００９】本発明で用いられる、ピリミジン塩基を分
解する微生物由来の酵素としては、塩基交換反応により
生成したピリミジン塩基をピリミジンヌクレオシドホス
ホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基
質になり得ない化合物に変換する酵素であれば、特に制
限されない。例えば、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１．２．９９．１）、ジヒドロウラシルデヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ１．３．１．１）などが挙げられる。特
に、後述する本発明の微生物により産生される酵素、及
びロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、
又はロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１
から産生される酵素が好ましい。

【００１０】本明細書において、微生物又は該微生物に
由来する酵素によりとは、微生物を含有する懸濁液（菌
体懸濁液）、又は該微生物から産生される酵素を用いて
ピリミジン塩基の分解反応を行うことを意味する。即
ち、本発明は、微生物を含有する菌体懸濁液そのものを
用いてピリミジン塩基の分解反応を行ってもよく、また
微生物から産生される酵素を取り出して該反応を行って
もよい。 ＜リボース−１−リン酸の安定剤＞本発明において、ピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼとプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼによる塩基交換反応は中間体として
リボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン
酸の糖誘導体を経由する。これら中間体は本来不安定で
あり、放置すると経時的にリボース又はデオキシリボー
スのような糖とリン酸イオンに分解するが、反応系中に
ホスファターゼが存在すると、中間体の加水分解はさら
に加速される。中間体の分解生成物であるリボース又は
デオキシリボースのような糖はこれらヌクレオシドホス
ホリラーゼの基質とはならないため、プリンヌクレオシ
ド又はデオキシプリンヌクレオシドの生成量は減少す
る。そこで、これらプリンヌクレオシド化合物の生成効
率を上げるために、リボース−１−リン酸又はデオキシ
リボース−１−リン酸のような糖誘導体を安定化し、ホ
スファターゼの活性を阻害する物質を鋭意探索した。そ
の結果、ある種の錯体形成化合物の組み合わせが有効で
あることを見い出した。

【００１１】すなわち、グリシン、イミノ二酢酸、ニト
リロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（略称ＥＤＴ
Ａ）、エチレングリコール（２−アミノエチルエーテ
ル）四酢酸（略称ＥＧＴＡ）及びこれらの塩からなる群
より選択される少なくとも１種以上の化合物とほう酸又
はその塩との組み合わせが有効であることを見い出し
た。特に、ホウ酸とエチレンジアミン四酢酸の組み合わ
せが著しい効果を示す。 ＜反応条件と分離・精製＞次に、反応条件について記
す。本発明において、原料のピリミジンヌクレオシド化
合物の初期濃度は５〜３００ｍＭであり、好ましくは１
０〜５０ｍＭである。プリン塩基は一般に難溶性である
が、初期添加量が全て溶解すると仮定して表記すると、
初期濃度は５〜３００ｍＭであり、好ましくは１０〜５
０ｍＭである。リン酸イオンの初期濃度は１〜２０ｍＭ
であれば十分である。また、ヌクレオシドとプリン塩基
は通常は同一の初期濃度で用いる。一般にリン酸イオン
に対するヌクレオシドの濃度比は大きい方が目的物のプ
リンヌクレオシド化合物の収率は増大する。

【００１２】また、安定剤として使用する錯体形成化合
物において、ホウ酸又はその塩の使用量は、５〜２００
mMであり、好ましくは５０〜１００mMであり、組み合わ
せの一方であるＥＤＴＡ又はその塩などの使用量は２〜
１２mMであり、好ましくは４〜６mMである。

【００１３】反応液のｐＨは６．５〜１０．５であり、
好ましくは７．０〜８．０である。反応温度は３５〜６
０℃であり、好ましくは３５〜４５℃である。なお、反
応液からの生成物の採取は、晶析やクロマトグラフィー
などにより行うことができる。

【００１４】以下に本発明の製造方法の原理を説明す
る。 ＜本発明の原理・理論＞ （１）本発明の第一段階では、リン酸イオンの存在下
で、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより、ピ
リミジンヌクレオシド化合物とリン酸イオンから、ピリ
ミジン塩基とリボース−１−リン酸又は２−デオキシリ
ボース−１−リン酸のような糖の１位にリン酸イオンの
結合した糖誘導体（以下、単に糖誘導体という。）が生
成する。

【００１５】（２）次に、第二段階として、生成した糖
誘導体が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、
プリン塩基と置換反応を行う。これにより、糖誘導体と
プリン塩基との反応からプリンヌクレオシド化合物とリ
ン酸イオンが生成する。

【００１６】（１）と（２）の反応を整理すると、ピリ
ミジンヌクレオシドとプリン塩基を用いてプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホス
ホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、ピリミジン塩
基とプリンヌクレオシド化合物が生成する。

【００１７】（３）次に、本発明では、反応系に、ピリ
ミジン塩基をピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及
びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得な
い化合物に変換する酵素又はこれらを産生する微生物を
含有する。本発明では、ウラシルチミンデヒドロゲナー
ゼ、又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼのような酵
素又はこれらを産生する微生物を用いることが好ましい
が、これに限定されない。本発明の製造方法では、上記
酵素又はこれらを産生する微生物と、電子受容体を共存
させることにより、ピリミジ塩基を、ピリミジンヌクレ
オシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼの基質となり得ない化合物に変換する。なお、菌
体懸濁液を反応系に用いる際は、菌体内に電子受容体が
含まれているため、電子受容体を反応系にあえて加えな
くてもよい。変換されたピリミジン塩基は、プリンヌク
レオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホ
スホリラーゼの基質にはなり得ないので、基質の交換反
応には関与せず反応系から除外される。これにより、反
応の平衡を目的物のプリンヌクレオシド化合物が生成す
る側へ移動させ、目的物が高収率で得られる。

【００１８】（４）さらに、必要な場合には、以下の好
ましい態様で具体的に説明するように、変換された化合
物を更に分解する酵素が含まれていてもよい。次に、本
発明の製造方法を具体例で説明する。

【００１９】本発明の好ましい態様では、原料のピリミ
ジンヌクレオシド化合物としてウリジン又は２’−デオ
キシウリジン（以下、デオキシウリジンという）を、核
酸塩基としてプリン塩基を、酵素としてプリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ及びウラシルチミンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．
２．９９．１）を用いる。

【００２０】（１）まず、第一段階として、リン酸イオ
ンの存在下で、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
により、ウリジン又はデオキシウリジンとリン酸イオン
から、ウラシルとリボース−１−リン酸又は２−デオキ
シリボース−１−リン酸（以下、デオキシリボース−１
−リン酸という）が生成する。

【００２１】（２）次に、第二段階として、生成したリ
ボース−１−リン酸又はデオキシリボース−１−リン酸
が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、プリン
塩基と置換反応を行う。これにより、リボース−１−リ
ン酸とプリン塩基との反応からプリンヌクレオシドとリ
ン酸イオンが生成し、デオキシリボース−１−リン酸と
プリン塩基との反応からは２’−デオキシプリンヌクレ
オシド（以下、デオキシプリンヌクレオシドという）と
リン酸イオンが生成する。

【００２２】（１）と（２）の反応を整理すると、ウリ
ジン又はデオキシウリジンとプリン塩基を用いてプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシ
ドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、ウラシ
ルとプリンヌクレオシド又はデオキシプリンヌクレオシ
ドが生成する。

【００２３】（３）反応系にウラシルチミンデヒドロゲ
ナーゼ、又はウラシルチミンデヒドロゲナーゼとＮＡＤ
などの電子受容体（酸化型）を共存させることにより、
ウリジン又はデオキシウリジンの分解で生成したウラシ
ルは不可逆的にバルビツール酸となる。生成したバルビ
ツール酸は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基質にはなり得
ないので、基質の交換反応には関与せず反応系から除外
される。これにより、反応の平衡を目的物のプリンヌク
レオシド化合物が生成する側へ移動させ、目的物が高収
率で得られる。

【００２４】（４）さらに、反応系にバルビツラーゼ
（ＥＣ３．５．２．１）を存在させることによりバルビ
ツール酸が尿素とマロン酸に分解される。これにより、
ウラシルチミンデヒドロゲナーゼによる変換反応が促進
される。

【００２５】例えば、出発原料のピリミジンヌクレオシ
ド化合物としてデオキシウリジンを、プリン塩基として
グアニンを用いて、目的物のプリンヌクレオシド化合物
として２’−デオキシグアノシン（以下、デオキシグア
ノシンという）を得る場合は次のようになる。

【００２６】

【化１】

【００２７】但し、ＰＹＮＰはピリミジンヌクレオシド
ホスホリラーゼを表し、ＰＵＮＰはプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼを表し、Ｐｉはリン酸イオンを表す。
（１）と（２）から次式が成り立つ。

【００２８】

【化２】 但し、ＰＹＮＰ及びＰＵＮＰは先に定義したとおりであ
る。

【００２９】

【化３】

【００３０】

【化４】

【００３１】本発明の他の好ましい態様では、ピリミジ
ンヌクレオシド化合物としてウリジン又はデオキシウリ
ジン、核酸塩基としてプリン塩基を、酵素としてプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシド
ホスホリラーゼ及びジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１．３．１．１）を用いる。

【００３２】（１）ピリミジンヌクレオシドホスホリラ
ーゼにより、ウリジン又はデオキシウリジンとリン酸イ
オンから、ウラシルとリボース−１−リン酸又はデオキ
シリボース−１−リン酸が生成する。

【００３３】（２）次に、生成したリボース−１−リン
酸又はデオキシリボース−１−リン酸が、プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼにより、プリン塩基と置換反応を
行う。これにより、リボース−１−リン酸とプリン塩基
との反応からプリンヌクレオシドとリン酸イオンが生成
し、デオキシリボース−１−リン酸とプリン塩基との反
応からはデオキシプリンヌクレオシドとリン酸イオンが
生成する。

【００３４】（１）と（２）の反応を整理すると、ウリ
ジン又はデオキシウリジンとプリン塩基を用いてプリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ及びピリミジンヌクレオシ
ドホスホリラーゼにより、塩基交換反応を行い、プリン
ヌクレオシド又はデオキシプリンヌクレオシドとウラシ
ルが生成する。

【００３５】（３）反応系にジヒドロウラシルデヒドロ
ゲナーゼ、又はジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼとＮ
ＡＤＨなどの電子受容体（還元型）とを共存させること
により、ウリジン又はデオキシウリジンの分解で生成し
たウラシルは不可逆的にジヒドロウラシルとなる。生成
したジヒドロウラシルは、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの基
質にはなり得ないので、基質の交換反応には関与せず反
応系から除外される。これにより、反応の平衡を目的物
のプリンヌクレオシド化合物が生成する側へ移動させ、
目的物が定量的に得られる。

【００３６】（４）さらに、反応系にジヒドロピリミジ
ナーゼ（ＥＣ３．５．２．２）が存在することによりジ
ヒドロウラシルがＮ−カルバモイル−β−アラニンに分
解される。これにより、ジヒドロウラシルデヒドロゲナ
ーゼの反応が促進される。

【００３７】例えば、出発原料のピリミジンヌクレオシ
ド化合物としてデオキシウリジンを、プリン塩基として
アデニンを用いて、目的物のプリンヌクレオシド化合物
として２’−デオキシアデノシン（以下、デオキシアデ
ノシンという）を得る場合は次のようになる。

【００３８】

【化５】 但し、ＰＹＮＰ、ＰＵＮＰ及びＰｉは先に定義したとお
りである。（１）と（２）から次式が成り立つ。

【００３９】

【化６】 但し、ＰＹＮＰ及びＰＵＮＰは先に定義したとおりであ
る。

【００４０】

【化７】

【００４１】

【化８】

【００４２】次に、第二の発明について説明する。第二
の発明は、ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジヒド
ロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微生物であっ
て、アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリウ
ム ＹＧＫ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）及びシ
ュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ ４４３ （ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５９０９）よりなる群から選択される微生
物である。 ＜酵素生産微生物及びその同定＞本発明者はピリミジン
塩基をピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり得ない化合
物に変換する一連の酵素の一つ又はそれ以上を、次の微
生物が生産することを見出した。

【００４３】すなわち、これら微生物は、（１）ウラシ
ルチミンデヒドロゲナーゼ、（２）ジヒドロウラシルデ
ヒドロゲナーゼ、（３）ウラシルチミンデヒドロゲナー
ゼとバルビツラーゼ（ＥＣ３．５．２．１）、及び
（４）ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼとジヒドロピ
リミジナーゼ（ＥＣ３．５．２．２）の群より選ばれる
少なくとも一種以上の酵素を産生する。 ＜培養条件と酵素の調製＞これら微生物は通常の細菌用
培地によく生育し、該酵素を生産するが、培地にピリミ
ジン塩基を添加することは、酵素活性を高めるうえで有
効である。

【００４４】培養した菌体はそのまま粗酵素として利用
することが可能であるが、常法により粗酵素を得てこれ
を用いることもできる。 アルスロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ｓｐ．） ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５９０７） バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ） ＹＧＫ ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
９０８） シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ．） ＹＧＫ４４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０
９） ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ） ＪＣＭ ３１３２ ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ） ＪＣＭ ３１９１ ＪＣＭは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株で
あることを示す。その他の菌株は、通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄
託されている。これら寄託菌株の菌学的性質を、バージ
ェイス・マニュアル・オブ・デターミナティブ・バクテ
リオロジー第８版（１９７５年）、バージェイズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第
１巻（１９８４年）及び第２巻（１９８６年）に準じて
検討した結果は次のようである。なお、実験は主として
長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」（学会
出版センター、１９８５年）記載の方法により行った。

【００４５】アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ
２２２ １．形態的性質 （１）細胞の大きさ： ０．５〜０．７×１．０〜５．
０μｍの桿菌 （２）グラム染色性： 陽性 （３）細胞の多形性： 生活環に伴う球菌〜桿菌の顕著
な多形性が見られる。 （４）運動性：有り（酵母エキス加肉汁液体培地で５〜
２４時間培養に運動性が見られる） （５）鞭毛の着生状態：有り、１〜２本の側毛 （６）胞子の有無： 無し （７）抗酸性： 無し ２．培養的性質 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で乳白
色、半透明、表面がザラザラの円形、波状のコロニ−を
形成する。 （２）肉汁寒天斜面培養：淡黄色、半透明で培地全体に
拡がり生育は良好である。 （３）肉汁液体培養：生育が遅い。酵母エキスを添加し
た振とう培養で良好な生育が見られる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 表面のみわずかに液化
する。 （５）リトマスミルク： 変化しない ３．生理学的性質 （１）硝酸塩の還元 陰性 （２）脱窒反応 陰性 （３）ＭＲテスト 陰性 （４）ＶＰテスト 陰性 （５）インドールの生成 陰性 （６）硫化水素の生成 陰性 （７）クエン酸の利用 ・クリステンセン培地 陰性 ・コーザーの培地 陰性 （８）無機窒素源の利用 ・硝酸塩 陽性 ・アンモニウム塩 陰性 （９）色素の生成 無し （10）ウレアーゼ 陰性 （11）オキシダーゼ 陰性 （12）カタラーゼ 陽性 （13）生育の範囲 ・ｐＨ域 ５．５〜９．５ ・温度域 １９〜３８℃ （14）酸素に対する態度 好気性 （15）Ｏ−Ｆテスト ・グルコ−ス 変化無し ・サッカロ−ス 変化無し （16）各種炭素源の利用 ・Ｌ−アラビノ−ス ± ・Ｄ−キシロ−ス ＋ ・Ｄ−グルコ−ス ＋ ・Ｄ−マンノ−ス ＋ ・Ｄ−フラクト−ス ＋ ・Ｄ−ガラクト−ス ＋ ・マルトース ＋ ・スクロース ＋ ・ラクトース − ・トレハロ−ス ＋ ・Ｄ−ソルビトール ＋ ・Ｄ−マンニトール ＋ ・イノシトール ＋ ・グリセリン − ・デンプン − ４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による） Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝６９．６ 以上の菌学的性質に基づき、本菌株はアルスロバクター
属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｓｐ．）に属すること
が判明した。

【００４６】バチルス・メガテリウム ＹＧＫ ２５２ １．形態的性質 （１）細胞の大きさ： １．６×４．０〜９．０μｍの
桿菌 （２）グラム染色性： 陽性 （３）細胞の多形性： 無し （４）運動性： 有り （５）鞭毛の着生状態：有り、周毛 （６）胞子の有無： 有り、胞子嚢は膨らまない、胞
子の形は楕円形 （７）抗酸性： 無し ２．培養的性質 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で乳白
色、不透明、表面がザラザラな円形波状のコロニ−を形
成する。 （２）肉汁寒天斜面培地：淡黄色、不透明で表面が乾き
気味、周辺がギザギザとしてストロ−クに沿って良好に
生育する。 （３）肉汁液体培地： 生育が遅く、酵母エキスを加え
ると生育が良好になる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 表面のみ液化する。 （５）リトマスミルク： やや酸性となり、凝固が見ら
れる。 ３．生理学的性質 （１）硝酸塩の還元 陽性 （２）脱窒反応 陽性 （３）ＭＲテスト 陽性 （４）ＶＰテスト 陰性 （５）インドールの生成 陰性 （６）硫化水素の生成 陰性 （７）クエン酸の利用 ・クリステンセン培地 陽性 ・コーザーの培地 陽性 （８）無機窒素源の利用 ・硝酸塩 陽性 ・アンモニウム塩 陽性 （９）色素の生成 無し （10）ウレアーゼ 陽性 （11）オキシダーゼ 陽性 （12）カタラーゼ 陽性 （13）生育の範囲 ・ｐＨ域 ５．５〜１０．
５ ・温度域 １０〜４３℃ （14）酸素に対する態度 好気性 （15）Ｏ−Ｆテスト ・グルコ−ス 変化無し ・サッカロ−ス 変化無し （16）各種炭素源の利用 ・Ｌ−アラビノ−ス − ・Ｄ−キシロ−ス − ・Ｄ−グルコ−ス − ・Ｄ−マンノ−ス − ・Ｄ−フラクト−ス − ・Ｄ−ガラクト−ス − ・マルトース − ・スクロース − ・ラクトース − ・トレハロ−ス − ・Ｄ−ソルビット − ・Ｄ−マンニット − ・イノシット − ・グリセリン − ・デンプン ＋ ４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による） Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝３４．７ 以上の菌学的性質に基づき、本菌株はバチルス・メガテ
リウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で
あることが判明した。

【００４７】シュ−ドモナス・スピ−シ−ズ ＹＧＫ
４４３ １．形態的性質 （１）細胞の大きさ： ０．４〜０．６×０．６〜２．
４μｍの桿菌 （２）グラム染色性： 陰性 （３）細胞の多形性： 無し （４）運動性： 有り （５）鞭毛の着生状態：有り、４〜５本の極鞭毛 （６）胞子の有無： 無し （７）抗酸性： 陰性 ２．培養的性質 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で乳白
色、半透明、表面が滑らかな円形のコロニ−を形成す
る。 （２）肉汁寒天斜面培養：乳白色、半透明で光沢があ
り、生育はストロ−クに沿って良好に生育する。 （３）肉汁液体培養： 振とう培養で良好な生育が見ら
れる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 変化無し （５）リトマスミルク： アルカリ性、ペプトン化しな
い。 ３．生理学的性質 （１）硝酸塩の還元 陽性 （２）脱窒反応 陰性 （３）ＭＲテスト 陰性 （４）ＶＰテスト 陰性 （５）インドールの生成 陰性 （６）硫化水素の生成 陰性 （７）クエン酸の利用 ・クリステンセン培地 陽性 ・コーザーの培地 陽性 （８）無機窒素源の利用 ・硝酸塩 陽性 ・アンモニウム塩 陽性 （９）蛍光性色素の生成 無し （10）ウレアーゼ 陽性 （11）オキシダーゼ 陽性 （12）カタラーゼ 陽性 （13）生育の範囲 ・ｐＨ域 ４．２〜１０．
５ ・温度域 １７〜４３℃ （14）酸素に対する態度 好気性 （15）Ｏ−Ｆテスト ・グルコ−ス Ｏ（酸化的） ・サッカロ−ス 変化無し （16）アルギニンの分解 陰性 （17）各種炭素源の利用 ・Ｌ−アラビノ−ス ＋ ・Ｄ−キシロ−ス ＋ ・Ｄ−グルコ−ス ＋ ・Ｄ−マンノ−ス ＋ ・Ｄ−フラクト−ス ＋ ・Ｄ−ガラクト−ス ＋ ・マルトース ＋ ・スクロース ＋ ・ラクトース − ・トレハロ−ス ＋ ・Ｄ−ソルビット − ・Ｄ−マンニット ＋ ・イノシット ＋ ・グリセリン ＋ ・デンプン − ４．ＧＣ含量（ＨＰＬＣ法による） Ｇ＋Ｃ（ｍｏｌ％）＝６２．３ 以上の菌学的性質に基づき、本菌株はシュードモナス属
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．）に属することが判
明した。

【００４８】

【実施例】以下、製造例、実験例、実施例により本発明
を更に詳細に説明する。 製造例１ プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミ
ジンヌクレオシドホスホリラーゼを含む菌体懸濁液の調
製 プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下、ＰＵＮＰと
いう）とピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（以
下、ＰＹＮＰという）の生産菌であるバチルス・ステア
ロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＪＴＳ ８５９（ＦＥＲＭ
Ｐ−９６６６）を、次の手順で培養した。

【００４９】菌の培養には、バクトトリプトン１０ｇ、
イーストエキス５ｇ、グルコース３ｇ、食塩３ｇ、イノ
シン１ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ６．２の培地を用い
た。この培地１．５Ｌにバチルス・ステアロサーモフィ
ルス ＪＴＳ ８５９（ＦＥＲＭ Ｐ−９６６６）の胞
子３×１０7 個を添加し、撹拌翼（直径７０ｍｍ、上下
各１枚）を有する３Ｌ容ジャーファーメンターを用い、
撹拌翼を５００ｒｐｍで回転させつつ、通気量１ｖｖ
ｍ、培養温度６５℃、ｐＨ６．０〜６．４で５時間培養
した。

【００５０】培養終了後、菌体を遠心分離（１０，００
０Ｇ、４℃、１５分）により集め、得られた湿菌体２０
ｇを１０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７）３０ｍｌに
懸濁したものをプリンヌクレオシドホスホリラーゼとピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼを含む菌体懸濁液
（以下、ＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液という）とした。 製造例２ ウラシル及びチミン分解活性を有する菌体懸
濁液の調製 ウラシル及びチミン分解活性を有するアルスロバクター
・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
９０７）、バチルス・メガテリウム ＹＧＫ２５２（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５９０８）、シュードモナス・スピーシ
ーズ ＹＧＫ４４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）、ロ
ドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、又は
ロドコッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１の菌
体懸濁液を次の手順で調製した。

【００５１】菌の培養には、ウラシル２ｇ、リン酸二水
素カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム３ｇ、酵母エキ
ス６ｇ及び水１ＬよりなるｐＨ７．０の培地を用いた。
この培地各５００ｍｌを入れた２Ｌ容の三角フラスコに
上記の微生物の菌体又は胞子をそれぞれ３×１０7 個づ
つ接種し、２００ｒｐｍで回転させつつ、温度３５℃で
１５時間培養した。

【００５２】培養終了後、菌体を遠心分離（１０，００
０Ｇ、４℃、１５分）により集め、得られた湿菌体を１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）６ｍｌに懸濁し
たものを、菌体懸濁液（以下、ウラシル・チミン分解酵
素液という）とした。 実験例１ 微生物によるウラシル及びチミン分解酵素の
生産 ５０ｍＭウラシル又は５０ｍＭチミンのいずれか一方、
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）及び製造例２で調製
した各菌株由来のウラシル・チミン分解酵素液のいずれ
か一つを０．０５ｍｌ含む全量１ｍｌの反応液を、３５
℃で１５分間反応させ、反応液中のウラシル及びチミン
分解活性を高速液体クロマトグラフィーで定量分析し
た。その結果を表１に示す。なお、ここで分解活性Ｕ
は、３５℃において、１分間当たり１μｍｏｌの基質
（ウラシル又はチミン）を分解する酵素活性の量であ
る。

【００５３】

【表１】 実験例２ ウラシル・チミン分解酵素生産菌の生産酵素 ５０ｍＭウラシル、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）
及び製造例２で調製した各菌株由来のウラシル・チミン
分解酵素液のいずれか一つを０．０５ｍｌ含む全量１ｍ
ｌの反応液を、３５℃で１５〜３０分反応させた。反応
液中のウラシルチミンデヒドロゲナーゼ、バルビツラー
ゼ、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ及びジヒドロピ
リミジナーゼの存在を、バルビツール酸及びジヒドロウ
ラシルの生成と消失を高速液体クロマトグラフィーで追
跡することにより検出した。その結果を表２に示す。＋
は酵素の検出を表し、−は検出できなかったことを表
す。

【００５４】この場合、例えば、ジヒドロピリミジナー
ゼの活性がジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼの活性よ
り強ければ、生成物ジヒドロウラシルは検出されない。
したがって、表２の−印は必ずしも該酵素の存在を１０
０％否定するものではない。

【００５５】

【表２】 実施例１ ＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液とウラシル・チミ
ン分解酵素液によるプリンヌクレオシドの製造 ２０ｍＭチミジン、２０ｍＭグアニン、１．２５ｍＭリ
ン酸カリウム、製造例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ
酵素液２ｍｌ、製造例２で調製したアルスロバクター・
スピーシーズ ＹＧＫ ２２２由来のウラシル・チミン
分解酵素液０．５ｍｌ、１００ｍＭホウ酸と４ｍＭのエ
チレンジアミン四酢酸を含む、全量１００ｍｌの水溶液
（ｐＨ７）を、３５℃で１１０時間反応させ、反応液中
に含まれる基質及び生成物の濃度を測定した。その結果
を図１に示す。

【００５６】また、ウラシル・チミン分解酵素液を添加
しないこと以外は、全て上記と同一の条件で反応を行
い、反応液中に含まれる基質及び生成物の濃度を測定し
た。その結果を図２に示す。

【００５７】図１及び図２において、白抜きの四角はチ
ミジン、黒塗りの菱形はデオキシグアノシン、黒塗りの
三角はチミン、白抜きの三角は５−メチルバルビツール
酸を表す。

【００５８】図１では、５−メチルバルビツール酸の生
成が認められ、更にこの酸が分解消失することから、こ
のウラシル・チミン分解酵素液中には少なくともウラシ
ルチミンデヒドロゲナーゼ及びバルビツラーゼが存在す
ることが判明した。この場合（図１）では、原料のグア
ニンは微かに残存が認められたが、チミジンはほぼ消失
した。デオキシグアノシンは１４．９ｍＭ（収率７５
％）生成した。ウラシル・チミン分解酵素液が存在しな
い場合（図２）と比較すると、目的物のデオキシグアノ
シンの生成量が非常に高いことが分かる。 実施例２〜１１ 種々の原料ヌクレオシドと種々の原料
プリン塩基を用いたプリンヌクレオシドの製造 表３に示すピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基
を用いた以外は、実施例１と同様の条件で３５℃で、９
０時間反応させた。反応液中に含まれる基質及び生成物
の濃度を定量した結果を表３に示す。なお、ウラシル・
チミン分解酵素液の代わりに蒸留水０．５ｍｌを加えた
以外は上記と同様の条件で反応させたものを対照とし
た。ウラシル・チミン分解酵素液の添加により、プリン
ヌクレオシド化合物の収率が向上し、特にその効果はグ
アノシン及びデオキシグアノシンの生成において顕著で
あった。

【００５９】

【表３】 実施例１２ 各菌株由来ウラシル・チミン分解酵素液の
プリンヌクレオシド化合物生成に対する効果 ２０ｍＭチミジン、２０ｍＭグアニン、１．２５ｍＭリ
ン酸カリウム、製造例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ
酵素液２ｍｌ、製造例２で調製した各菌株由来のウラシ
ル・チミン分解酵素液０．５ｍｌ、１００ｍＭホウ酸と
４ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む、全量１００ｍｌ
の溶液（ｐＨ７）を調製した。なお、ウラシル・チミン
分解酵素液の代わりに蒸留水０．５ｍｌを加えた以外は
上記と同様の条件で反応させたものを対照とした。

【００６０】これらの液を３５℃で１００時間反応さ
せ、反応液中に含まれる基質及び生成物の濃度を測定し
た。その結果を表４に示す。いずれの菌株由来のウラシ
ル・チミン分解酵素液もデオキシグアノシン生成の効率
を高めることが確認された。

【００６１】

【表４】 実施例１３ 反応中間体（リボース−１−リン酸）の安
定化とホスファターゼによる分解の阻害 ５ｍＭリボース−１−リン酸、表５に示す安定剤（ＥＤ
ＴＡは４ｍＭ、その他は１００ｍＭ濃度で使用）、製造
例１で調製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液０．０２ｍ
ｌ、製造例２で調製したアルスロバクター・スピーシー
ズ ＹＧＫ ２２２由来のウラシル・チミン分解酵素液
０．０１ｍｌを含む、全量１ｍｌの水溶液（ｐＨ７）
を、３５℃で７２時間反応させ、反応液中に含まれるリ
ボース−１−リン酸と分解生成物のリボースを薄層クロ
マトグラフィーにより測定した結果を表５に示す。測定
法はＩｓｈｉｉらの方法（Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈ
ｅｍ.,５３（１２）、３２０９〜３２１８（１９８
９））によった。なお、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸（以下、トリスという）１００ｍＭを加
え両酵素液を加えない以外は上記と同様に調製した液を
トリス（対照）とした。なお、表中の＋はリボース−１
−リン酸の分解ありを、−は分解なしを表す。

【００６２】酵素液の添加なしのトリス（対照）では、
分解はさほど進行しないことから、酵素液の中にはホス
ファターゼが含まれていることが分かる。ホウ酸とＥＤ
ＴＡ添加液ではリボース−１−リン酸の分解が認められ
なかったことから、これら物質が酵素液中のホスファタ
ーゼ活性を阻害し、またリボース−１−リン酸の安定化
に寄与していることが分かる。

【００６３】

【表５】 実施例１４ デオキシグアノシンの生成に対する安定剤
の効果 ２０ｍＭチミジン、２０ｍＭグアニン、表６に示す安定
剤（表中における＊は４ｍＭ、その他は１００ｍＭ濃度
を表す）、１．２５ｍＭリン酸カリウム、製造例１で調
製したＰＵＮＰ・ＰＹＮＰ酵素液、製造例２で調製した
アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２２由来
のウラシル・チミン分解酵素液０．５ｍｌを含む、全量
１００ｍｌの水溶液（ｐＨ７）を、３５℃で９０時間反
応させた。反応液中に含まれるデオキシグアノシンの濃
度を定量した結果を表６に示す。これらの結果から、実
施例１３で見られたホウ酸とＥＤＴＡ類似の錯体形成化
合物との組み合わせが、リボース−１−リン酸の分解阻
害と安定化効果をもたらし、プリンヌクレオシド化合物
の生成効率を高めることが証明された。

【００６４】

【表６】

【００６５】

【発明の効果】本発明の核酸塩基の交換反応を利用した
プリンヌクレオシド化合物の製造方法により、安価で入
手しやすいピリミジンヌクレオシド化合物とプリン塩基
を原料として、プリンヌクレオシド化合物を高収率でか
つ安定的に製造することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるウラシル・チミン分解酵素液
を添加した反応液中の各成分の濃度の経時変化を示すグ
ラフである。

【図２】実施例１におけるウラシル・チミン分解酵素液
を添加しない反応液中の各成分の濃度の経時変化を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:11） (Ｃ１２Ｐ 19/40 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 19/40 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:11） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 須永 陽之助 東京都板橋区坂下３−37−１ 有機合成薬 品工業株式会社東京研究所内 (72)発明者 長谷川 綾美 東京都板橋区坂下３−37−１ 有機合成薬 品工業株式会社東京研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピリミジンヌクレオシド化合物とプリン
   塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ピリ
   ミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオ
   シドホスホリラーゼにより塩基交換させる反応におい
   て、生成するピリミジン塩基を微生物又は該微生物に由
   来する酵素によりピリミジンヌクレオシドホスホリラー
   ゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼの基質になり
   得ない化合物に変換することを特徴とするプリンヌクレ
   オシド化合物の製造方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載のプリンヌクレオシド化合
   物の製造方法において、塩基交換反応の際に生成する反
   応中間体であるリボース−１−リン酸又はデオキシリボ
   ース−１−リン酸の安定剤として、グリシン、イミノ二
   酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、エチ
   レングリコール（２−アミノエチルエーテル）四酢酸及
   びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種
   以上の化合物とホウ酸又はその塩とを加えることを特徴
   とするプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
3. 【請求項３】 微生物が、アルスロバクター属、バチル
   ス属、シュードモナス属及びロドコッカス属から選ばれ
   る微生物である請求項１又は２記載のプリンヌクレオシ
   ド化合物の製造方法。
4. 【請求項４】 ピリミジンヌクレオシド化合物が、ウリ
   ジン、デオキシウリジン、５−メチルウリジン及びチミ
   ジンからなる群より選択される化合物である請求項１又
   は２記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
5. 【請求項５】 プリン塩基が、アデニン、グアニン、ベ
   ンズイミダゾール、ハロゲン化プリン及びアミノ化プリ
   ンからなる群より選択される化合物である請求項１又は
   ２記載のプリンヌクレオシド化合物の製造方法。
6. 【請求項６】 微生物に由来する酵素が、ウラシルチミ
   ンデヒドロゲナーゼ又はジヒドロウラシルデヒドロゲナ
   ーゼである請求項１又は２記載のプリンヌクレオシド化
   合物の製造方法。
7. 【請求項７】 微生物が、アルスロバクター・スピーシ
   ーズ ＹＧＫ ２２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、
   バチルス・メガテリウム ＹＧＫ ２５２（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−５９０８）、シュードモナス・スピーシーズ Ｙ
   ＧＫ ４４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０９）、ロドコッ
   カス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１３２、又はロドコ
   ッカス・エリスロポリス ＪＣＭ ３１９１である請求
   項１、２又は３記載のプリンヌクレオシド化合物の製造
   方法。
8. 【請求項８】 ウラシルチミンデヒドロゲナーゼ又はジ
   ヒドロウラシルデヒドロゲナーゼを産生する微生物であ
   って、アルスロバクター・スピーシーズ ＹＧＫ ２２
   ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０７）、バチルス・メガテリ
   ウム ＹＧＫ２５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９０８）及び
   シュードモナス・スピーシーズ ＹＧＫ ４４３ （Ｆ
   ＥＲＭ ＢＰ−５９０９）よりなる群から選択される微
   生物。