CN101044122A - 制备1,3－二氧戊环核苷的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供制备对映体纯的β－D－二氧戊环核苷的方法。具体地，描述了适合大规模开发的(－)－DAPD的新的合成法。在本发明的一个实施方案中提供制备基本纯的β－D或β－L－1，3－二氧戊环核苷的方法，包含a)制备或得到酯化的2，2－二烷氧基乙醇；b)以乙醇酸使酯化的2，2－二烷氧基乙醇环化得到1，3－二氧戊环内酯；c)拆分1，3－二氧戊环内酯得到基本纯的D－或L－内酯；d)有选择地还原和活化D－或L－手性内酯得到基本纯的D－或L－1，3－二氧戊环；e)使D－或L－1，3－二氧戊环偶合至活化的和/或保护的嘌呤或嘧啶碱上；和f)任选纯化核苷得到基本纯的保护的β－D或β－L－1，3－二氧戊环核苷。

Description

制备1，3-二氧戊环核苷的方法

                  在先申请的参考

本申请要求于2004年2月3日提交的美国临时申请60/541,545的优先权，题目为“制备1，3-二氧戊环核苷的方法”的。

                      发明领域

本申请提供制备对映体纯的β-D-二氧戊环核苷的方法。具体地说，描述了适合大规模开发的(-)-DAPD的新的合成法。

                      发明背景

AIDS，获得性免疫缺陷综合征，是一种触及全球各个部分的灾难性疾病。最近的估计全世界有4000万人患AIDS，每年约有500万个新感染病例。全球年死亡数仍然超过300万人。另一种引起人类严重健康问题的病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。HBV是仅次于烟草的第二位的致人癌症的病因。一些估计认为全球感染HBV的人数高达20亿人，等于全球人口的三分之一，其中约有4亿为慢性感染者。

许多2′，3′-二脱氧核苷被发现是具有抗HIV和/或乙型肝炎病毒的有效的抗病毒剂。通过细胞激酶对5′-三磷酸盐的细胞磷酸化后，这些合成的核苷被整合进生长的病毒DNA链中，由于缺乏3′-羟基基团，引起链的终止。它们还可抑制病毒酶逆转录酶。

在其中核苷的3′-碳被杂原子取代的核苷衍生物的合成中也有重要意义。3TC和其5-氟胞嘧啶类似物(FTC)两者均表现出抗HIV和HBV的活性(Furman等，Antimic.Ag.Chemo.，1992，2686-2692；和Cheng等，J.Biol.Chem.，1992，267(20)，13938-13942)。

外消旋的氧硫杂环戊烷核苷BCH-189具有有效的抗HIV复制的活性的发现促使Chu等合成手性的产物(+)-和(-)-BCH-189(Belleau等，5th International Conference on AIDS，Montreal，Canada，June 4-9，1989，#T.C.O.1；Chu等Tetr.Lett.，1991，32，3791)。后一化合物，拉米呋啶(Lamivudine)，另外也已知为3TC或epivir(益平维)，目前正用于临床治疗HIV感染和HBV感染。5-氟胞嘧啶氧硫杂环戊烷类似物(FTC)的(-)对映体，显著有效对抗HIV(Choi，W.et al.，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，9377；Schinazi，R.F.等，Antimic.Ag.Chemo.1992，2423；美国专利号5,204,4665、5,210,085、5,914,331和5,639,814)。

上述的1，3-氧硫杂环戊烷核苷通过使甲硅烷基化的嘌呤或嘧啶碱与1，3-氧硫杂环戊烷中间体缩合制得。美国专利号5,204,466公开了使用氯化锡作为Lewis酸，实质上是提供完全的β-立体选择性，使甲硅烷基化的嘧啶与1，3-氧硫杂环戊烷缩合的方法。许多美国专利描述用于制备1，3-氧硫杂环戊烷核苷的方法，即存在硅碱化的Lewis酸时，经由以保护的甲硅烷基化的碱与1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸酯缩合，随后还原该酯为相应的羟甲基以得到终产物(见美国专利号5,663,320、5,693,787、5,696,254、5,744,596、5,756,706和5,864,164)。另外，这些专利包含使用相应的1，3-二氧戊环中间体，以相似的方式合成1，3-二氧戊环核苷的一般的公开。

美国专利号5,272,151公开了使用2-O-保护的-5-O-酰化了的-1，3-氧硫杂环戊烷，在钛催化剂的存在下通过与甲硅烷基化的嘌呤或嘧啶碱缩合制备核苷的方法。美国专利号6,215,004公开了用于生产1，3-氧硫杂环戊烷核苷的方法，该方法包括在没有Lewis酸催化剂时使甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶与2-O-保护的-甲基-5-氯-1，3-氧硫杂环戊烷缩合。在这些案例中，1，3-氧硫杂环戊烷环以下列途径之一制备：(i)在对甲苯磺酸的存在下，使衍生自乙醛酸或乙醇酸的醛与巯基乙酸在甲苯反应生成5-氧代-1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸；(ii)回流下，于甲苯中以2-巯基乙醛缩二乙醇使无水乙醛酸环化生成5-乙氧基-1，3-氧硫杂环戊烷内酯；(iii)使巯基乙醛(二聚物形式)与乙醛酸酯缩合，生成5-羟基-1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸酯或(iv)使酸基乙醛与2，5-二羟基-1，4-二噻烷，2-巯基乙醛的二聚物形式偶合形成2-(酸基)甲基-5-羟基-1，3-氧硫杂环戊烷。在该方法中，内酯、5-氧代化合物必须被还原成相应的内半缩醛。2-羧酸或其酯还必须被还原为相应的2-羟基甲基衍生物与硼烷-甲基硫(methylsulfide)的混合物。

关键的中间体，醛，可使用几种方法制备：(i)使1，4-二-O-苯甲酰基间-赤藻糖醇、1，6-二-O-苯甲酰D-甘露醇或1，5-二-O-苯甲酰-D-阿糖醇的四乙酸酯氧化；(ii)制备单酰化的乙二醇，随后氧化成醛；(iii)使2-氯乙醇酰化，随后经二甲基亚砜氧化；(v)使四乙酸酯氧化；(vi)对烯丙基或3-甲基-2-丁烯-1-醇酰化产物进行臭氧分解；(vii)以及最近，通过使2-丁烯-1，4-二醇酰化，随后进行臭氧分解。还有，美国专利号6,215,004公开了通过使2，2-二乙氧基乙醇酰化制备酸基乙醛缩二乙醇的方法。

Norbeck，D.W.等(Tet.Lett.，1989，30，6263)报告了导致有关C4′原子的非对映异构体的外消旋的混合物的(±)-1-(2β，4β)-2-(羟基甲基)-4-二氧戊环基-胸腺嘧啶的合成。该产物的X射线晶体学分析显示二氧戊环的环一般在核苷酸中发现采用₃T₄构象，伴有O3′原子在内位(endoposition)，其与在AZT、AZDU、ddA、ddC和3′-去氧-3′-氟胸苷中发现的扭曲的₃E构象有很大不同，所有这些均表现在体外有效对抗HIV的潜力。

二氧戊环核苷的抗病毒活性启示Chu等合成一系列类似物，以寻找潜在的抗病毒剂和/或抗癌剂。例如，有报道9-(β-D羟基甲基-1，3-二氧戊环基)氨基嘌呤(β-D-DAPD)和其代谢物9-(β-D羟基甲基-1，3-二氧戊环基)鸟嘌呤(β-D-DXG)具有有效对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的潜力和选择性(Rajagopalan et al.，AntiviralChem.Chemother.，1996，7(2)，65-70)。(-)-DAPD是HIV在体外和体内的以及HBV在体外复制的潜在的和选择性的抑制剂(Furman等Drugsof the Future 2000，25(5)，454-461)。类似地，1-(β-L羟基甲基-1，3-二氧戊环基)-胸腺嘧啶(二氧戊环-T)(Norbeck et al.，Tet.Let.，1989，30，6263-66)具有抗HIV和抗HBV活性。1-(β-L羟基甲基3-二氧戊环基)-胞嘧啶(β-L-OddC)被发现对人前列腺以及肾癌具有潜在的抗肿瘤活性(Kadhim et al.，Can.Cancer Res.，57(21)，4803-10，1997)。(-)-(2′S，4′R)-1′-[2′-(羟基-甲基)-1′，3′-二氧戊环-4′-基]-5-碘尿嘧啶)L-IOddU最近在临床前和临床研究中被评价其作为抗病毒剂或抗癌剂的价值(见Kim等，J.Med.Chem.1993，36，519-528和其引用的参考文献；Corbett，&Rublein，Curr.Opin.Investig Drugs 2001，2，348-353；Gu等，Antimicrob.Agents Chemother.1999，43，2376-2382；Mewshaw等，J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.2002，29，11-20)。

Belleau等的US 5,041,449和US 5,270,315披露一组外消旋的2-取代的-4-取代的-1，3-二氧戊环。参考文献中的表1显示用于两个外消旋的1，3-二氧戊环核苷——具有胞嘧啶碱的外消旋反式(α)1，3-二氧戊环核苷(化合物XII)和具有腺嘌呤碱的外消旋顺式(β)1，3-二氧戊环核苷(化合物XIV)的数据(也见于IAF BioChem International的EP 0337 713)。

1989年6月，Belleau等报告了合成在3′-位置上含氧或硫的胞嘧啶核苷的方法(Belleau，B.等Fifth International Conference on AIDS，Montreal；International Development Research Center：Ottawa，Ontario，1989；T.C.O.1.)。二氧戊环的环通过使RCO₂CH₂CHO与丙三醇缩合制备。该合成产生有关核苷的C4′碳的非对映异构体的外消旋的混合物。如流程图1中所述合成外消旋DAPD。

                         流程1

Belleau等使丙三醇与氯乙醛反应生成二氧戊环中间体。在以苯甲酸盐置换氯之后，伯醇被氧化为羧酸并以间氯过苯甲酸经Baeyer-Villiger重排，得到相应的外消旋的二氧戊环苯甲酸酯。然后使该化合物与2-氨基-6-氯嘌呤偶合，并在压力下将所得的核苷中间体与氨反应，得到外消旋的DAPD。(±)-二氧戊环-T也以由Choi等(Choi等，J.Am.Chem.Soc.1991，113，9377-9378和美国专利号5,852,027)所述的类似方式合成。

如以上讨论的，在1989年后期，Norbeck等发表了一篇描述也具有体外抗HIV活性的外消旋的顺式-1，3-二氧戊环胸苷的合成的文章(Norbeck等Tet.Let.1989，30(46)，6263-6266)。从苄氧基醛缩二甲醇和(±)甲基甘油酸酯共五步合成所述产物，得到79％得率的1∶1非对映异构体混合物。如与Belleau合成一起，Norbeck合成产生关于核苷的C4′碳的非对映异构体的外消旋混合物。见流程2。

                       流程2

同样的外消旋二氧戊环乙酸酯中间体由Liotta等从顺式-2-丁烯-1，4-二醇开始合成(Choi等J.Am.Chem.Soc.1991，113(24)，9377-0379和Wilson等Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3(2)，169-174)。见流程3。

                       流程3

如流程3中所示，这些方法的缺点是它们包含不稳定的醛的合成和困难的氧化步骤。

Chu和Schinazi的US 5,179,104公开了经由立体有择合成获得对映体纯的β-D-1，3-二氧戊环核苷方法(也见相关的美国专利号5,925,643、5,767,122、5,444,063、5,684,010、5,834,474和5,830,898)。

BioChem Pharma的EP 0 515 156公开使用立体选择性合成得到1，3-二氧戊环核苷的对映体的方法，该方法包括以甲硅烷基Lewis酸与共价键结合于手性辅助剂的1，3-二氧戊环中间体缩合(也见相关的美国专利号5,753,706和5,744,596)。

Chu等发表了从1，6-脱水甘露糖立体有择地合成β-D-1，3-二氧戊环核苷(Chu等Tet.Let.，1991，32，3791-3794)。大约与此同时，Thomas和Surber发表文章描述如下：(i)彻底检索手性色谱的文献没有显示任何核苷分离的实例以及(ii)他们的论文披露了通过手性高效液相色谱首次分离核苷的对映体。拆分的核苷不是1，3-二氧戊环核苷，所尝试的手性柱的五分之四不起作用(Thomas等，J Chromat.，1991，586，265-270)。

Kim等(Kim等J.Med.Chem.1993，36(1)，30-37)随后发表论文公开从1，6-脱水-D-甘露糖不对称合成1，3-二氧戊环嘧啶核苷的β-D和α-D对映体。(-)-DAPD的合成被描述为从1，6-脱水-D-甘露糖起始的十三个步骤的方法，包括经九步使1，6-脱水-D-甘露糖转化为手性的乙酸酯(流程4)。

                       流程4

在Vorbruggen条件下使乙酸酯偶合以及几次纯化和去保护步骤后，得到适度收率的(-)-DAPD。此方法费时、困难并且包含复杂的氧化步骤。

1992年，Belleau等(Belleau等Tet.Let.1992，33，6949-6952)发表了使用L-抗坏血酸作为手性辅助剂经八步法合成对映体纯的2′，3′-二脱氧-3-氧杂胞嘧啶立体异构体。L-抗坏血酸被用于产生一批可分离的非对映异构体。四乙酸铅的应用使得该方法不适合于按比例放大(scale-up)。1992年，Kim等也发表论文公开从1，6-脱水-L-β-古洛吡喃糖(gulopyranose)获得(-)-L-β-二氧戊环-C和(+)-L-β-二氧戊环-T的方法(Kim等，Tet.Let.1992，32(46)，5899-6902)。

在US 5,276,151中，Liotta和Shinazi发现外消旋的2-O-保护的-5-O-酰化了的-1，3-二氧戊环在含钛的Lewis酸的存在下可与嘌呤或嘧啶碱基偶合，主要产生外消旋的β-异构体(又见WO 92/14729)。

Jin等(Jin等Tet.Asym.1993，4(2)，211-214)公开Lewis酸催化剂在1，3-二氧戊环核苷的制备中起重要作用。在使对映体纯的2′-去氧-3′-氧杂核苷与甲硅烷基化的N-乙酰胞嘧啶偶合中，TiCl₄和SnCl₄促进伴有外消旋化的二氧戊环核苷的形成。应用Lewis酸三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯、三甲基甲硅烷基碘和TiCl₂(Oi-Pr)₂以低的非立体选择性提供对映体纯的胞嘧啶二氧戊环核苷。

Evans等(Tet.Asym.1993，4，2319-2322)报告了二氧戊环核苷的不对称合成。在1，2-二甲氧基乙烷中的SnCl₂的存在下，使D-甘露醇与BnOCH₂CH-(OCH₃)₂反应，随后经RuCl₃/NaOCl氧化生成顺式-和反式-二氧戊环-4-羧酸，后者然后经脱羧、偶合和去保护反应转化为D-和L-二氧戊环核苷。对这些羧酸的可选途径是通过BnOCH₂CH-(OCH₃)₂与L-抗坏血酸的反应，这也报告于该文中。手性的羧酸也可通过使商业上可获得的2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-(S)-羧酸与保护的羟基-乙醛的衍生物诸如苯甲酰氧基乙醛在酸性条件下反应制备(见美国专利号5,922,867和6,358,963)。

Siddiqui等公开了顺式-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环可使用腺苷脱氨酶有选择地脱氨(Siddiqui等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3(8)，1543-1546)。

虽然二氧戊环核苷的合成可能使用在文献中描述的方法，此化学方法并不适合于大规模的(-)-DAPD合成。见Chu等Tet.Let.1991，32，3791-3794；Siddiqui等Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3，1543-1546；Kim等Tet.Let.1992，46，6899-6902)。

Mansour等的US 5,763,606描述了用于通过使甲硅烷基化的嘌呤或嘧啶碱与双环中间体偶合主要生产纯的1，3-氧硫杂环戊烷和1，3-二氧戊环核苷的方法(又见WO 94/29301)。

Painter等的US 6,215,004公开了在Lewis酸诸如乙醚合三氟化硼的存在下，通过使乙醇酸与式(R¹O)₂CHR的乙缩醛；式(R²O)(HO)CHR的半缩醛；或其混合物反应，用于制备2-[R¹C(O)OCH₂]-1，3-二氧戊环基-5-酮的方法，其中R为-(CH₂-O-C(O)R¹)，且R¹和R²独立为烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烷芳基、烷基杂芳基或烷基杂环基或芳烷基(又见WO 00/09494)。

均为BioChem Pharma的WO 00/47759和WO 01/58894公开了在与嘌呤或嘧啶碱偶合之前，从在C4′位具有COOR部分的二氧戊环类似物的端基异构体的混合物中分离β和α端基异构体的方法。用于拆分二氧戊环类似物主要获得具有L-构型的二氧戊环的该方法，包括酶，即水解酶的使用。

Shire BioChem有限公司的WO 03/062229公开了通过加入Lewis酸、甲硅烷基化剂和非甲硅烷基化的嘌呤或嘧啶碱至二氧戊环的用于生产二氧戊环核苷类似物的单个反应容器法。该出版物还描述存在DIB和I2时，使用适合的能源，使在溶剂中的二氧戊环化合物反应来生产二氧戊环化合物的方法。

3′-氧杂-取代的2′，3′-二脱氧核苷类似物(″二氧戊环核苷类似物″)的立体化学在其生物学活性中可起重要的作用。核苷中的核糖的C1′位是手性中心，因为此碳结合四个不同的部分。同样地，在核苷的C4′有光学活性中心。

如下所示，1，3-二氧戊环核苷的手性碳(指定的嘌呤或嘧啶碱和CH₂OH)上的取代基相对于二氧戊环的环系统可或者为顺式(在同一侧)或者为反式(在对侧)。为一致性的目的，当甲氧基部分或碱部分被另一个取代基取代时使用同样的立体化学的名称。顺式和反式外消旋物两者组成一对光学异构体。因此，每个化合物有四个单个的光学异构体。此四个光学异构体由以下构型表示(当确定二氧戊环部分于水平面方向时，则-O-CH₂-部分在前面)：(1)顺式，两个基团均“朝上”，其为β-顺式构型(称为β-D)；(2)顺式，两个基团均“朝下”，其为相反的β-顺式构型(称为β-L)；(3)具有C4′取代基“朝上”和C1′取代基“朝下”的反式；和(4)具有C4′取代基“朝下”和C1′取代基“朝上”的反式。两个顺式对映体一起被称为β-对映体的外消旋混合物以及两个反式对映体被称为α-对映体的外消旋混合物。通常，分离或另外获得顺式-构型的单个的对映体是困难的。顺式-1，3-二氧戊环核苷的四种可能的立体异构体用图表示如下：

因为二氧戊环核苷的立体异构体通常具有不同的生物学活性和毒性，获得纯的有治疗活性的异构体变得至关重要。常常，一种立体异构体被认为比其他异构体更具活性。

Chu等开发了分别用于合成D-和L-二氧戊环核苷的从D-甘露糖和从L-古洛糖内酯不对称合成二氧戊环核苷的方法(美国专利号5,767,122、5,792,773)。然而，这些方法包含了许多步骤并且大多数的中间体需要经硅胶柱色谱法纯化(见Kim et al.J.Med.Chem.1993，36，519-528)。

为制备足够大量的二氧戊环核苷药物用于临床试验，使用手性2-酸基甲基-5-氧代-1，3-二氧戊环作为关键的中间体。在BF₃的存在下，用乙醇酸将ROCH₂CHO或其醛缩醇环化，随后经手性树脂进行柱分离或经酶拆分(为昂贵和困难的技术)制备该中间体。

因此，一直有对成本-效益的和具立体选择性的方法生产生物学活性的二氧戊环核苷异构体的需求。

本发明的目的是提供新的和有成本-效益的方法，以合成对映体纯的二氧戊环核苷。

                     发明概述

本发明包括从便宜的前体有效合成1，3-二氧戊环核苷的途径，如需要时任选引入官能团。所述方法允许立体选择性制备这些化合物的生物学活性异构体。

在本发明的一个实施方案中，提供了制备基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷，诸如β-D-DAPD的方法，其包括：

a)制备或得到式(Ia)或(Ib)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇；

其中：

每个R¹独立为烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烷芳基、烷基杂芳基或烷基杂环基或芳烷基；以及

R²为任何适合的可离去基团，这样(1)它可在合成结束时很容易被除去，(2)它具有低分子量以避免在过程中携带大的质量，(3)它是商业上可获得的并且是便宜的，(4)其相应的酯在还原性乙酰化条件下是稳定的，(5)髓后的内酯是可分解的，和(6)偶合后，相应的端基异构体易于优先使用结晶法(如异丁酰或对甲氧基苯甲酰)分离；

然后，

b)用乙醇酸使式(Ia)或(Ib)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇环化，优选在Lewis酸，诸如BF₃·Et₂O的存在下，得到式(II)1，3-二氧戊环内酯

然后，

c)拆分式(II)的1，3-二氧戊环内酯，得到基本纯的D-或L-内酯；然后，

d)用还原剂，诸如LiAlH(OtBu)₃选择性地还原和活化基本纯的D-或L-手性内酯，得到基本纯的式(III)D-或L-1，3-二氧戊环：

其中：

L是适合的离去基团，例如，O-酰基如OAc、卤素(F、Br、Cl或I)、甲磺酰氧基(Omesylates，OMs)和甲苯甲酰氧基(OToluate，OTs)等；

然后，

e)使基本纯的式(III)D-或L-1，3-二氧戊环与活化的和/或保护的嘌呤或嘧啶碱或其衍生物，诸如活化的2，6-二氯嘌呤偶合，得到基本纯的保护的式(IV)D-或L-1，3-二氧戊环核苷的α∶β混合物：

其中：

B是嘌呤或嘧啶碱或其衍生物；

然后，

f)纯化基本纯的保护的式(IV)D-或L-1，3-二氧戊环核苷的α∶β混合物，得到基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷；然后

g)如果必要，使基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷去保护，得到基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷。

在本发明的一个实施方案中，式(Ia)的酯化2，2-二烷氧基乙醇被水解为相应的式(Ib)醛。在特别的实施方案中，当R²为对甲氧基苯甲酰基时，式(Ia)的酯化2，2-二烷氧基乙醇被水解为相应的式(Ib)醛。

在本发明的另一个实施方案中，式(Ia)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇不水解为相应的式(Ib)醛。在特别的实施方案中，当R²为异丁酰基时，式(Ia)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇被水解为相应的式(Ib)醛。

在本发明的一个实施方案中，式(II)的1，3-二氧戊环内酯的拆分得到基本纯的D-或L-内酯是使用手性色谱法完成的。在本发明的可选的实施方案中，式(II)1，3-二氧戊环内酯的拆分得到基本纯的D-或L-内酯是使用酶拆分法完成的。

                     流程5

因此，本发明的方法可用于制备式A至D的化合物：

及其药学上可接受的盐或酯，其中：

R独立为H、卤素(F、Cl、Br、I)、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂、C₁-C₄低级烷基、CH₃、CH＝CH₂、N₃C＝CH₂、CO₂H、CO₂R′、CONH₂、CONHR′、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CF₃、CH₂CH₂F、CH＝CHCO₂H、CH＝CHCO₂R′、CH＝CHCl、CH＝CHBr或CH＝CHI；

每个R′独立为C₁-C₄低级烷基；

Z为或者CH或者C-X；和

每个X和Y独立为H、卤素(F、Cl、Br、I)、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂或CH₃。

在本发明的特别的实施方案中，提供了制备基本纯的β-D-DAPD的方法。见流程6。

                     流程6

                    图的详述

图1是本发明化合物的典型色谱图。图1A是丁酸酯内酯(化合物1)的典型色谱图。图1B是丁酸酯乙酸乙酯(化合物3)的典型色谱图。图1C是对甲氧基苯甲酰基内酯(化合物11)的典型色谱图。图1D是使用优化的SFC方法的对甲氧基苯甲酰基内酯(化合物11)的典型色谱图。图1E是苯甲酰基内酯(化合物12)的典型色谱图。图IF是使用优化的SFC方法的苯甲酰基内酯(化合物12)的典型色谱图。图1G-1J是异丁酸酯内酯(化合物13)的典型色谱图。图1K是叔丁基-二苯基-甲硅烷基醚内酯(化合物4)的典型色谱图。图1L是采用优化的方法的叔丁基-二苯基-甲硅烷基醚内酯(化合物4)的典型色谱图。图1M是DAPD的典型色谱图。图1N是使用优化的SFC方法的DAPD的典型色谱图。

图2是叔丁基-二苯基-甲硅烷基醚内酯(化合物4)的理论相位图(theoretical phase diagram)的图示。

图3是某些微生物酶对本发明化合物的特殊对映体的选择性的图示。图3A和3B描绘丁酸酯内酯(化合物1)抗多种微生物酶的筛选的结果。图3C描绘对甲氧基苯甲酰基内酯(化合物11)抗多种微生物酶的筛选的结果。图3D描绘苯甲酰基内酯(化合物12)抗多种微生物酶的筛选的结果。图3E描绘异丁酸酯内酯(化合物13)抗多种微生物酶的筛选的结果。

图4是使用不同的浓度、缓冲液、pH范围和温度的异丁酸酯内酯(化合物13)的微生物拆分物抗微生物酶CMC 103669和CMC103661的图示。

图5是拆分的异丁酸酯内酯(化合物13)的400MHz ¹H NMR谱。

                     发明详述

本发明包括从便宜的前体有效合成1，3-二氧戊环核苷的途径，如需要时任选引入官能团。所述方法可立体选择性制备这些化合物的生物学活性异构体。

在本发明的一个实施方案中，提供了制备基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷，诸如β-D-DAPD的方法，该方法包括：

a)制备或得到式(Ia)或(Ib)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇；

其中：

每个R¹独立为烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烷芳基、烷基杂芳基或烷基杂环基或芳烷基；以及

R²为任何适合的可离去基团，这样(1)它可在合成结束时很容易被除去，(2)它具有低分子量以避免在过程中携带大的质量，(3)它是商业上可获得的并且是便宜的，(4)其相应的酯在还原性乙酰化条件下是稳定的，(5)髓后的内酯是可拆分的，和(6)偶合后，相应的端基异构体易于优先使用结晶法(如异丁酰或对甲氧基苯甲酰)分离；

然后，

b)用乙醇酸使式(Ia)或(Ib)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇环化，优选在Lewis酸，诸如BF₃·Et₂O的存在下，得到式(II)1，3-二氧戊环内酯

然后，

c)拆分式(II)1，3-二氧戊环内酯，得到基本纯的D-或L-内酯；然后，

d)用还原剂，诸如LiAlH(OtBu)₃选择性地还原和活化基本纯的D-或L-手性内酯，得到基本纯的式(III)D-或L-1，3-二氧戊环：

其中：

L是适合的离去基团，例如，O-酰基如OAc、卤素(F、Br、Cl或I)、OMs、OTs等；

然后，

e)使基本纯的式(III)D-或L-1，3-二氧戊环与活化的和/或保护的嘌呤或嘧啶碱或其衍生物，诸如活化的2，6-二氯嘌呤偶合，得到基本纯的保护的式(IV)D-或L-1，3-二氧戊环核苷的α∶β混合物：

其中：

B是嘌呤或嘧啶碱或其衍生物；

然后，

f)纯化基本纯的保护的式(IV)D-或L-1，3-二氧戊环核苷的α∶β混合物，得到基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷；然后

g)如果必要，使基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷去保护，得到基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷。

在本发明的一个实施方案中，式(Ia)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇水解为相应的式(Ib)醛。在特别的实施方案中，当R²为对甲氧基苯甲酰基时，式(Ia)的酯化的2，2-二烷氧基乙醇被水解为相应的式(Ib)醛。

在本发明的一个实施方案中，式(II)1，3-二氧戊环内酯的拆分得到基本纯的D-或L-内酯是使用手性色谱法完成的。在本发明的可选的实施方案中，式(II)1，3-二氧戊环内酯的拆分得到基本纯的D-或L-内酯是使用酶拆分法完成的。

因此，本发明的方法可用于制备式A至D的化合物：

及其药学上可接受的盐或酯，其中：

R独立为H、卤素(F、Cl、Br、I)、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂、C₁-C₄低级烷基、CH₃、CH＝CH₂、N₃C＝CH₂、CO₂H、CO₂R′、CONH₂、CONHR′、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CF₃、CH₂CH₂F、CH＝CHCO₂H、CH＝CHCO₂R′、CH＝CHCl、CH＝CHBr或CH＝CHI；

每个R′独立为C₁-C₄低级烷基；

Z为或者CH或者C-X；和

每个X和Y独立为H、卤素(F、Cl、Br、I)、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂或CH₃。

                       流程5

在此，本发明的方法可用于制备式A至D化合物：

及其药学上可接受的盐或酯，其中：

R独立为H、卤素(F、Cl、Br、I)、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂、C₁-C₄低级烷基、CH₃、CH＝CH₂、N₃C＝CH₂、CO₂H、CO₂R′、CONH₂、CONHR′、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CF₃、CH₂CH₂F、CH＝CHCO₂H、CH＝CHCO₂R′、CH＝CHCl、CH＝CHBr或CH＝CHI；

每个R′独立为C₁-C₄低级烷基；

Z为或者CH之一或者C-X；和

每个X和Y独立为H、卤素(F、Cl、Br、I)、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂或CH₃。

在本发明的特别的实施方案中，提供了制备基本纯的β-D-DAPD的方法。见流程6。

                       流程6

在一个实施方案中，本发明提供用于拆分可为合成1，3-二氧戊环核苷的中间体的化合物，诸如1-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环(DAPD)的方法。

在一个实施方案中，本发明提供如流程7中所示的用于DAPD中间体的合成的生物催化方法。

            流程7：制备DAPD的示例性途径

在本发明的一个实施方案中，式(II)1，3-二氧戊环内酯是仲丁酸酯(sec-butanoate ester)(化合物13)。

在本发明的一个实施方案中，如果丁酸酯内酯(以下结构的化合物1)的(S)-对映体是所需的，

                       化合物1

则PPL用于手性拆分。如在实施例中所述，PPL被确定为最具选择性的酶(22％得率，98％ee)，且被发现在所有可市售获得的酶和200个微生物酶的全部商品酶筛选中只留下(S)-丁酸酯异构体。

虽然在一般的实施方案中，可用到任何有效的酶，但如在实施例中所描述的，脂肪酶PS、固定化脂肪酶假单胞菌属(Pseudomonas)和脂肪酶M被鉴定为选择性的使(R)-丁酸酯异构体留下的酶。已发现脂肪酶PS为具有必需的对映异构优先的有效的酶，以22％得率获得95％ee(R)-化合物1。因此，在本发明的一个可选的实施方案中，如果想要(R)-对映体，则使用脂肪酶PS、固定化脂肪酶假单胞菌属或脂肪酶M进行手性拆分。在一个特别的实施方案中，所述酶是脂肪酶PS。

虽然本发明并不局限于用于拆分的特殊条件，但在一个实施方案中，用于拆分的温度约为0℃。在另一个实施方案中，该温度介于-5℃与10℃，或-2℃与+5℃或约-1℃至约1℃之间。在另一个实施方案中，底物的量约为100g/L。底物的量可有变化，例如从5至500、20至200、50至150、约60、70、80、90、100、110、120、130、140或更多g/L的缓冲液或g/L的总反应体积。在一个实施方案中，缓冲液为1∶1的可约为pH 6的甲苯缓冲液。在具体的实施方案中，用于拆分的条件可为0℃、100g/L底物的1∶1甲苯pH 6缓冲液。如在实施例中所述，这些条件得到22％，95％ee(R)-化合物1(E＝5.3)。条件也可在用于有效拆分的实验参数内稍微变化。

拆分化合物的微生物株可变化。在一个实施方案中，所述株来自不动杆菌(Acinetobacter)菌种。微生物筛选确定以80％ee得到(R)-丁酸酯的2株(不动杆菌和琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii))。为了确定对丁酸酯的有效拆分，筛选了所有可用到的商品酶和200个微生物酶。微生物筛选显示2个以80％ee得到(R)-丁酸酯的有希望的菌株(CMC 3419、不动杆菌和CMC 3606、琼氏不动杆菌)。

在一个实施方案中，当需要拆分如下结构的丁酸酯乙酸酯(化合物3)时，

                       化合物3

所使用的酶是脂肪酶PS。对化合物3的全部商品酶的筛选显示多数选择性的酶在乙酸酯处拆分且并不需要丁酸酯中心。然而脂肪酶PS、脂肪酶MY和脂肪酶AY具有适度的选择性，留下(R)-酯异构体。这些酶与那些用于化合物1的酶有相似的选择性。进一步研究显示，脂肪酶PS最具选择性(有效的E＝3.7)。类似地，与以脂肪酶PS拆分化合物1具可比较的选择性。

在本发明的一个实施方案中，拆分步骤发生在合成的早期阶段，即内酯阶段。

在一个实施方案中，当需要拆分对甲氧基-苯甲酰基内酯的(S)-对映体，4-氧代-[1，3]二氧戊环-2-基甲基4′-甲氧基苯甲酸酯(化合物11)时

                       化合物11

则使用Chirazyme-L2拆分此内酯。为了确定对化合物11的有效拆分，筛选大范围的商品酶和微生物酶。Chirazyme-L2被鉴定为最具选择性的酶，以39％得率得到残留的酯，＞98％ee的(S)-对映体。

在另一个实施方案中，当需要拆分苯甲酰基内酯，4-氧代-[1，3]二氧戊环-2-基甲基苯甲酸酯(化合物12)时

                       化合物12

可使用的酶为Chirazyme-L2。对苯甲酰基内酯(化合物12)进行商品酶(十种酶)的筛选。在筛选中，Chirazyme-L2和酸性蛋白酶-DS被鉴定为有效的拆分剂。Chirazyme-L2在化合物11和12的拆分中具有可比较的选择性。对化合物12的有限的商品酶筛选发现Chirazyme-L2也是最有效的酶。

在另一个实施方案中，当需要拆分异丁酸酯(iso-butryl)内酯的(R)-对映体，4-氧代-[1，3]二氧戊环-2-基-甲基-2′-甲基丙酸酯(化合物13)时

                       化合物13

可使用的酶为Chirazyme-L2。对化合物13进行完全的商品酶和微生物酶的筛选。Chirazyme-L2再次被鉴定为最具选择性的酶。通过化学相关性分析其构型被定为(R)-对映体。在MTBE-缓冲液中的最初的研究得到残留酯得率为28％、92％ee。

用于化合物13的全部的商品酶筛选显示Chirazyme-L2、脂肪酶PS、酸性蛋白酶DS和Chirazyme-L9具有适度的选择性，留下(R)-对映体作为残留的酯。全部的微生物筛选确定对任一的对映体有选择性的株。一种微生物，CMC 103869，通过于10℃下拆分，得到＞95％ee的内酯。

在一个实施方案中，化合物13(异丁酸酯内酯)为底物。在另一个实施方案中，底物是提供给较简单的下游化学反应，如简单的纯化技术的物质。Chirazyme-L2为可用于拆分的酶。在一个实施方案中，Chirazyme-L2可得到残留的酯的(R)-构型。

该反应是在MTBE-缓冲液、甲苯-缓冲液和2-丙醇-水系统中研究的。MTBE和甲苯系统遇到了稳定性和选择性问题。可是在2-丙醇-水中的结果却是很好的，从30g投入的外消旋物中得到94％ee的化合物13，得率为38％。因此，在一个实施方案中，拆分在2-丙醇-水中进行。

优化的研究在进行中。方法通过使用单相的醇-水系统作为溶剂和使用Kugelrohr蒸馏纯化产物而改进。因此，在一个实施方案中，该方法包括单相的醇-水系统和蒸馏。

以Chirazyme-L2对化合物13的生物拆分的放大规模最多至30g于200gL^-1的2-丙醇∶水(9∶1)中，并以38％得率、94％ee和90％的化学纯得到4-氧代-[1，3]二氧戊环-2-基-甲基-2′-甲基-丙酸酯。见流程8。

     流程8：确定的用于对化合物13生物拆分的条件

与此对照的是，以下结构的叔丁基-二苯基-甲硅烷基醚内酯(化合物4)：

                       化合物4

被确定为真正的外消旋物。构建用于该化合物的相位图，其于77.5％ee时显示为低共熔的。

用几种酶筛选外消旋的顺式-DAPD，所述酶已知的在丁酸乙烯基酯存在下具有酰化作用的活性，但发现它们产生非立体选择性反应。PeptiCLEC-BL和脂肪酶AY产生快速反应得到所需的外消旋的丁酸酯，从而可用于区域选择性地和温和地将酯置于氧上。在一个实施方案中，使用PeptiCLEC-BL。在分离实施方案中，使用脂肪酶AY。

          1-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环(DAPD)

定义

在此所使用的术语“基本纯的”、“基本无”、“基本缺乏”或“分离的”，指的是核苷组合物包括至少85、至少90、至少95％或至少99％至100％重量的的该核苷的指定对映体。在一个实施方案中，该方法产生基本无相反构型的对映体的化合物。

在此所使用的术语烷基，除非另外特别指明，指的是饱和的直链的、支链的或环状的、C₁至C₁₀的伯、仲或叔烃，具体包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。术语包括被取代的和未被取代的两种烷基。具有这样烷基的部分可被选自羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根(phosphonate)取代，或者未经保护或者如需要时被保护，如本领域专业技术人员已知的那样，例如，在Greene等的 Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中所讲述的，其通过引用结合于本文。

在此所使用的术语低级烷基，且除非另外特别指明，指的是C₁至C₄的饱和的直链的、支链的或如果适合的话，环状的(例如环丙基)烷基，包括被取代的和未被取代的两种形式。除非在本申请中另有特别所指，当烷基是适合的部分时，低级烷基是优选的。同样地，当烷基或低级烷基是适合的部分时，未被取代的烷基或低级烷基是优选的。

在此所使用的术语芳基，且除非另外特别指明，指的是苯基、联苯基或萘基。术语包括被取代的和未取代的两个部分。芳基可被选自溴、氯、氟、碘、羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根的一个或多个部分取代，或者未经保护或者如需要时被保护，如本领域专业技术人员已知的，例如，在Greene等的 Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中所讲述的。

术语烷芳基或烷基芳基指的是具有芳基取代基的烷基。术语芳烷基或芳基烷基指的是具有烷基取代基的芳基。

在此所使用的术语卤素，包括溴、氯、氟和碘。

在此所使用的术语杂原子，指的是氧、硫、氮和磷。

术语酰基指的是羧酸酯，其中的酯基团的非羰基部分是选自直链的、支链的或环状的烷基或低级烷基、包括甲氧基甲基的烷氧基烷基、包括苄基的芳烷基、诸如苯氧基甲基的芳氧基烷基、包括由卤素、C₁至C₄烷基或C₁至C₄烷氧基任选取代的苯基的芳基、诸如包括甲基磺酰基的烷基或芳烷基磺酰基的磺酸酯、单、二或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代的苄基、三烷基甲硅烷基(如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最佳包含苯基。术语“低级酰基”指的是其中的非羰基部分是低级烷基的酰基。

在此所使用的术语“保护的”，除非另有定义，指的是为了避免其进一步反应或为了其他目的而加在氧、氮或磷原子之上的基团。大量不同的氧和氮保护基团为有机合成领域技术人员所已知。

术语嘌呤或嘧啶碱包括，但不限于腺嘌呤、N⁶-烷基-嘌呤、N⁶-酰基嘌呤(其中酰基为C(O)(烷基、芳基、烷基芳基或芳烷基)、N⁶-苄基嘌呤、N⁶-卤代嘌呤、N⁶-乙烯基嘌呤、N⁶-炔基嘌呤、N⁶-酰基嘌呤、N⁶-羟基烷基嘌呤、N⁶-硫代烷基嘌呤、N²-烷基嘌呤、N²-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、包括6-氮杂-胞嘧啶的6-氮杂嘧啶、2-和/或4-巯基-嘧啶、尿嘧啶、包括5-氟尿嘧啶的5-卤代尿嘧啶、C⁵-烷基嘧啶、C⁵-苄基-嘧啶、C⁵-卤代嘧啶、C⁵-乙烯基嘧啶、C⁵-炔基嘧啶、C⁵-酰基嘧啶、C⁵-羟基烷基嘌呤、C⁵-酰氨基-嘧啶、C⁵-氰基嘧啶、C⁵-硝基-嘧啶、C⁵-氨基嘧啶、N²-烷基-嘌呤、N²-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮杂胞嘧啶核苷基(azacytidinyl)、5-氮杂-尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并-吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基。嘌呤碱包括，但不限于鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、任选在6位上具有包括氨基或羰基的取代基的2-(Br、F、Cl或I)-嘌呤和任选在2位上具有包括氨基或羰基的取代基的6-(Br、Cl或I)-嘌呤。当需要或想要时，碱上的氧和氮官能团可被保护。适合的保护基团为本领域技术人员所熟悉，它们包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基、烷基和酰基诸如乙酰基和丙酰基、甲烷磺酰基和对甲苯磺酰基。

在此所使用的术语杂芳基或杂芳族化合物，指的是在芳环中包含至少一个硫、氧、氮或磷的芳族化合物。术语杂环基指的是在环中含至少一个诸如氧、硫、氮或磷的杂原子的非芳族的环状基团。杂芳基和杂环基的非限制性实例包括呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，4-噻二唑基、异唑基、吡咯基、喹唑啉基、肉啉基、酞嗪基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、唑、异唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪，和蝶啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1，2，3-二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、oxaziranes、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞嘧啶核苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N⁶-烷基嘌呤、N⁶-苄基嘌呤、N⁶-卤代嘌呤、N⁶-乙烯基嘌呤、N⁶-炔基(acetylenic)嘌呤、N⁶-酰基嘌呤、N⁶-羟基烷基嘌呤、N⁶-硫代烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N⁵-烷基嘧啶、N⁵-苄基嘧啶、N⁵-卤代嘧啶、N⁵-乙烯基嘧啶、N⁵-炔基嘧啶、N⁵-酰基嘧啶、N⁵-羟基烷基嘌呤和N⁶-硫代烷基嘌呤以及异唑基。杂芳基可如上述的芳基那样被任选取代。杂环基或杂芳基可被选自卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰氨基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基的一个或多个取代基任选取代。需要时，杂芳芳族化合物可部分或全部被氢化。作为非限制性的实例，二氢吡啶可用来替代吡啶。当需要或想要时，杂环基或杂芳基上的氧和氮官能团可被保护。适合的保护基团为本领域技术人员所熟悉，它们包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基-二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、酰基诸如乙酰基和丙酰基、甲烷磺酰基和对甲苯磺酰基。

这些嘌呤或嘧啶碱、杂芳芳族化合物或杂环可被烷基或芳环所取代，通过单键或双键结合或稠合进杂环系统。嘌呤碱、嘧啶碱、杂芳芳族化合物和杂环可通过任何可利用的原子，包括环氮和环碳(产生C-核苷)与糖部分结合。

通篇所用到的缩写包括ee：相对于起始原料(s)或产物(p)的对映体过量度；c：转化；和E：对映体选择性常数。

方法步骤的详述

                         流程9

起先，用相应的酰基氯使2，2-二烷氧基-乙醇(1)以定量的得率酯化。在异丁酸(2a)酯的情况下，在Lewis酸(BF₃·Et₂O)在存在下，用乙醇酸将其环化为相应的二氧戊环内酯(3a)，得率80％。然而，在同样的条件下，对甲氧基苯甲酸酯(2b)以低的得率和纯度得到相应的内酯。在经历一个其中缩醛被首先水解为相应的醛(2c)的两步程序后得到更好的结果，然后使其经历同样的环化条件，以80％得率得到固体的相应的内酯(3b)。通过手性色谱法拆分所述内酯。以LiAlH(OtBu)₃选择性还原手性内酯(4a和4b)并且随后以乙酸酐处理，经快速柱色谱法纯化后，以适当的得率获得相应的乙酸酯(5a和5b)。于Vobruggen条件下，与2，6-二氯嘌呤偶合得到相应的核苷(6a和6b)的α∶β端基异构体的粗混合物。异丁酸酯先经柱色谱法纯化，然后从MeOH中结晶，以24％的得率得到纯的β端基异构体(7a)。对甲氧基苯甲酸酯核苷不需要层析，通过从MeOH中结晶纯化，以46％的得率得到纯的β端基异构体(7b)。在两步程序中，通过以叠氮化钠处理和然后的氢化，氯被氨基置换。相应的中间体(9a和9b)被分离和充分描述。于回流的MeOH中，用正丁基胺移去保护基团，分别以93％和90％的得率得到(-)-DAPD(10)。

从相应的手性内酯(5a和5b)开始的全部的总得率：对于异丁酸酯为11.4％和对于对甲氧基苯甲酸酯为22.2％。

                       实施例

通过使用带有数码温度计的Melt-Temp II仪器，在开放的玻璃毛细管中测定熔点。用Varian XL-400光谱仪于400MHz记录¹H-NMR光谱。除非另行指明，于40℃，使用Buchi回旋蒸发器，于减低的压力下进行蒸发。溶液经无水Na₂SO₄干燥。在以硅胶60F₂₅₄(E.Merck，Darmstad)预涂布的玻璃板(0.25mm)上进行TLC。用硅胶60(230-400目，E.Merck，Darmstad)实施快速柱色谱法。由Atlantic Microlab(Atlanta，GA)进行元素分析。由Analytical Instrument Group Inc.(Raleigh，NC)施行高分辨质谱(HRMS)。

气相色谱分析：通过将每1mg的样品溶解于1ml THF或其他适合的溶剂中制备样本。使用1μl注射体积。使用Hewlett Packard部件号19091J-413的30m HP-5(交联的5％PH ME硅氧烷)毛细管柱分离样本。进口温度设定在200℃，炉温如下：35℃1分钟，以12.5℃/分钟升温至250℃，在250℃维持1.8分钟。火焰离子检测器温度设定在250℃。载体气体为氮，设定正常流速为8.0ml/分钟。

HPLC分析：

方法A：柱：Chiralpak AD-RH，150×4.6mm。流动相：甲醇。梯度：等度(Isocratic)。流速：0.5ml/min.。运行时间：30min.。检测：于280nm UV。

方法B：柱：Aquasil C18，150×4.6mm。流动相：溶剂A：乙腈，溶剂B：50mmol NH₄OAc、0.1％AcOH的水溶液。梯度：时间：0min.，A：1％、B：99％；时间：17min.，A：50％、B：50％，然后等度。流速：1.0ml/min。运行时间：30min.。检测：于290nm UV。

方法C：柱：Chiralpak AD，250×4.6mm。流动相：甲醇。梯度：等度。流速：0.8ml/min.。运行时间：20min.。检测：于254nm UV。

                       实施例1

异丁酸2，2-二甲氧基-乙酯(2a)。

4-甲氧基-苯甲酸2，2-二乙氧基-乙酯(2b)。

于0℃，向充分搅拌的2，2-二乙氧基或2，2-二甲氧基-乙醇(1，100mmol)、DMAP(61mg，0.5mmol)和Et₃N(16ml，11.64g，115mmol)的EtOAc或叔丁基甲醚(50ml)溶液中缓慢加入相应的酰基氯(105mmol)。于室温下搅拌16h后，该反应混合物以EtOAc(50ml)稀释，并继而以(c)NaHCO₃(2×100ml)、盐水(2×100ml)洗涤，干燥、过滤和蒸发得到：

不用进行任何进一步纯化即用于下一步骤的黄色液体样的异丁酸2，2-二甲氧基-乙酯(2a，99％)。

                                     GC(R_t＝5.24min.，98％)；¹H-NMR(CDCl₃)δ：4.57(1H，t，J＝5.2，(MeO)₂CHCH₂-)，4.11(2H，d，J＝5.2，(MeO)₂CHCH₂-)，3.40(6H，s，CH₃O-)，2.60(1H，m，OCOCH(CH₃)₂)，1.54(6H，d，J＝6.8，OCOCH(CH₃)₂).

不用进行任何进一步纯化即用于下一步骤的浆状的4-甲氧基苯甲酸2，2-二乙氧基-乙酯(2b，100％)。

                                                   GC(R_t＝13.7min，99％)；¹H-NMR(CDCl₃)δ：7.98(2H，d，J＝9.0，ArH)，6.89(2H，d，J＝9.0，ArH)，4.79(1H，t，J＝5.6，(EtO)₂CHCH₂-)，4.28(2H，d，J＝5.6，(EtO)₂CHCH₂-)，3.82(3H，s，CH₃O-)，3.73(2H，m，CH₃CH₂O-)，3.59(2H，m，CH₃CH₂O-)，1.22(6H，t，J＝6.9，CH₃CH₂O-).

                       实施例2

异丁酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2-基甲酯(3a)。

于0℃，向充分搅拌的相应的乙缩醛(2a，30mmol)和α-乙醇酸(3.42g，45mmol)的乙腈(30ml)溶液中缓慢加入BF₃·EtO₂(6.38g，5.70ml，45mmol)。将该溶液放置室温下搅拌过夜。将溶液在EtOAc(150ml)和(c)NaHCO₃(150ml)之间分配。该有机溶液以(c)NaHCO₃(150ml)、盐水(2×150ml)顺序洗涤，干燥、过滤和蒸发得到：

无色浆状的异丁酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2-基甲酯(3a，80％)。

GC(R_t＝7.89min.，95％)；¹H-NMR(CDCl₃)δ：5.83(1H，s，H-2)，4.35-4.20(4H，m，H-5，H-5’和-CH₂OCO-)，2.62(1H，m，(CH₃)₂CHCOO-)，1.19(6H，d，J＝7.0，(CH₃)₂CHCOO-).

计算C₈H₁₃O₅(M+1)⁺的质量：189.0763。实测值：(H.R.F.A.B.M.S.)：189.0763。

                       实施例3

4-甲氧基苯甲酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2-基甲酯(3b)。

用TFA(16.7g，11.3ml，140mmol)和水(7.5g，7.5ml，28mmol)处理4-甲氧基苯甲酸2，2-二乙氧基-乙酯(2b，7.5g，28mmol)的Cl₂CH₂(75ml)溶液。于室温下搅拌该均匀的溶液3.5小时直至GC显示反应完全。于40℃、真空下浓缩该溶液，然后用己烷稀释，于真空中浓缩数次以除去痕量的TFA。分离出4-甲氧基苯甲酸2-氧代-乙酸乙酯(2c，5.9g，28mmol，100％)，为无定形白色样固体产物，其不经任何进一步纯化用于下一步骤

                              GC(R_t＝11.0min，95％)；¹H-NMR(CDCl₃)δ：9.72(1H，s，HCO-)，8.06(2H，d，J＝8.8，ArH)，6.95(2H，d，J＝8.8，ArH)，4.87(2H，s，HCOCH₂O-)，3.87(3H，s，OCH₃).

于0℃，向充分搅拌的粗醛(2c，5.9g，28mmol)和α-乙醇酸(5.2g，68mmol)的DME(100ml)溶液中缓慢加入BF₃·EtO₂(12.3g，11.0ml，85mmol)。将该溶液放置室温下搅拌过夜。将溶液在EtOAc(150ml)和(c)NaHCO₃(150ml)之间分配。该有机溶液用(c)NaHCO₃(150ml)、盐水(2×150ml)顺序洗涤，干燥、过滤和蒸发得到浆液。以DME(15ml)处理该浆液，沉淀出固体。搅拌30分钟后，过滤掉固体得到白色粒状固体样4-甲氧基苯甲酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2-基甲酯(3b，5.7g，23mmol，80％)；

                                               GC(R_t＝14.7min，99％)；mp：61-63℃；¹H-NMR(CDCl₃)δ：7.97(2H，d，J＝9.2，ArH)，6.91(2H，d，J＝9.2，ArH)，5.95(1H，t，J＝3.0，H-2)，4.57(1H，dd，J＝3.0和J＝12.6，-CH₂OCO-)，4.50(1H，dd，J＝3.0和J＝12.6，-CH₂OCO-)，4.41(1H，d，J＝15.0，H-5)，4.31(1H，d，J＝15.0，H-5)，3.87(3H，s，OCH₃).

C₁₂H₁₂O₆的计算值，C，57.14；H，4.80。实测值：C，57.40；H，4.93。

                       实施例4

异丁酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(4a)。

用手性色谱法¹³拆分外消旋的异丁酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2-基甲酯(3a)，得到相应于每个对映体的两个部分。此两个部分均为无色的浆液。第一部分相应于R对映体(4a，异丁酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯)；HPLC(方法A，R_t＝7.80min.，100％)；[α]_D ²⁰＝20.20°(c 0.25，MeOH)。第二部分相应于S对映体(异丁酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2(S)-基甲酯)；HPLC(方法A，R_t＝9.30min.，100％)；[α]_D ²⁰＝-14.40°(c 0.25，MeOH)。

                       实施例5

4-甲氧基苯甲酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(4b)。

用手性色谱法⁷拆分外消旋的4-甲氧基苯甲酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2-基甲酯(3b)，得到相应于每个对映体的两个部分。此两个部分均为白色固体。第一部分相应于R对映体(4b，4-甲氧基苯甲酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯)；mp：76-78℃；HPLC(方法A，R_t＝13.59min.，99％)；[α]_D ²⁰＝12.20°(c 0.25，MeOH)。第二部分相应于S对映体(4-甲氧基苯甲酸4-氧代-[1，3]-二氧戊环-2(S)-基甲酯)；mp：76-78℃；HPLC(方法A，R_t＝20.76min.，99％)；[α]_D ²⁰＝-13.50°(c 0.25，MeOH)。

                       实施例6

异丁酸4-乙酸基-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(5a)。

4-甲氧基苯甲酸4-乙酸基-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(5b)。

于-10℃，在超过20分钟的时间内，向充分搅拌的相应的内酯(4a或4b，15mmol)的无水THF(45ml)溶液中缓慢加入1.0MLiAlH(OtBu)₃的THF(19.5ml，19.5mmol)溶液，温度维持在-15℃和-10℃之间。随后溶液经GC监测反应并于室温下搅拌30分钟(起始原料完全消失)。将该溶液重新冷却至-10℃并一次加入DMAP(0.92g，7.50mmol)，随后逐滴加入Ac₂O(15.3g，14.20ml，150mmol)。于-15℃继续搅拌反应物1h，然后于室温下过夜。将溶液冷却至-15℃，用MeOH(40ml)猝灭。于室温下搅拌20分钟后，反应物于真空中浓缩得到红色浆液，经快速柱色谱法(250g二氧化硅，己烷∶EtOAc 3∶1)纯化得到：

黄色浆液状异丁酸4-乙酸基-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(5a，61％)。¹H-NMR(CDCl₃)显示几乎是1∶1的端基异构体混合物，相应于H-4α和H-4β，δ：6.40(d，J＝3.8)和6.37(d，J＝3.8)；相应于H-2α和H-2β，5.41(t，J＝3.7)和5.32(t，J＝3.7)。

黄色浆液状4-甲氧基苯甲酸4-乙酸基-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(5b，61％)。¹H-NMR(CDCl₃)显示几乎是1∶1的端基异构体混合物，相应于H-4α和H-4β，δ：6.44(dd，J＝2.1和J＝4.2)和6.37(d，J＝4.0)；相应于H-2α和H-2β，5.54(t，J＝3.6)和5.45(t，J＝4.0)。

                       实施例7

异丁酸4(R)-(2，6-二氯-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(7a)。

4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二氯-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(7b)

将2，6-二氯嘌呤(1.27g，6.73mmol)、硫酸铵(38mg，0.29mmol)和1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(8.45g，11.04ml，52.3mmol)的悬浮液于回流下加热2.5hs。使所得的溶液冷却至室温，由此沉淀出稠厚的固体。通过加入无水二氯甲烷(14.9ml)使该固体物再溶解。然后将溶液冷却至-10℃，在超过20分钟的时间内缓慢加入相应的乙酸酯(5a或5b，8.6mmol)的无水二氯甲烷(10ml)溶液，温度维持在-10℃和-5℃之间。然后，在超过20分钟的时间内缓慢加入TMSOTf(2.5g，2.08ml，10.4mmol)。反应物于室温下在搅拌下放置过夜。用二氯甲烷(120ml)稀释该溶液，用水(150ml)猝灭。分离有机层，用水(150ml)、(c)NaHCO₃(2×150ml)、水(2×150ml)顺序洗涤，干燥、过滤和蒸发得到浆液(粗品6a)或黄色固体(粗品6b)。

粗6a经柱色谱法(己烷∶AcOEt 4∶1)进一步纯化得到如依据¹H-NMR的β∶α端基异构体的混合物为1.2∶1的6a。使该混合物从MeOH(10ml)中缓慢结晶，得到白色固体样的并且以β端基异构体为特征的异丁酸4(R)-(2，6-二氯-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(7a，24％)；

                            mp：145-147℃；[α]_D ²⁰＝-47.67°(c 0.25，MeOH)；¹H-NMR(CDCl₃)δ：8.52(1H，s，H-8)，6.55(1H，d，J＝4.9，H-4)，5.34(1H，t，J＝5.7，H-2)，4.58-4.30(4H，m，-CH₂COO-，H-5和H-5’)，2.61(1H，m，(CH₃)₂CHCOO-)，1.19(3H，d，J＝6.8，(CH₃)₂CHCOO-)，1.14(3H，d，J＝6.8，(CH₃)₂CHCOO-).

C₁₃H₁₄Cl₂N₄O₄的计算值：C，43.23；H，3.91；N，15.51。实测值：C，43.39；H，3.91；N，15.58。

用热己烷首先洗涤粗品6b得到黄色固体样4-甲氧基-苯甲酸4-(2，6-二氯-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(6b)。¹H-NMR表明为β∶α端基异构体的2∶1的混合物。使该混合物从MeOH(100ml)中缓慢结晶，得到黄色固体样并且以β端基异构体为特征的4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二氯-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(7b，46％)；mp：154-156℃；HPLC(方法B，R_t＝20.73min.)；

                                                       [α]_D ²⁰＝-53.80°(c0.25，MeOH)；¹H-NMR(Cl₃CD)δ：8.41(1H，s，H-8)，7.91(2H，d，J＝8.5，ArH)，6.92(2H，d，J＝8.5，ArH)，6.53(1H，d，J＝4.8，H-4)，5.44(1H，bs，H-2)，4.70-4.30(4H，m，H-5，H-5’和-CH₂OCO-)，3.85(3H，s，OCH₃).

C₁₇H₁₅C_l2N₄O₅(M+1)⁺的计算的质量：425.0419。实测值(H.R.F.A.B.M.S.)：425.0420。

                       实施例8

异丁酸4(R)-(2，6-二叠氮基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(8a)。

4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二叠氮基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(8b)。

向充分搅拌的相应的二氯嘌呤核苷(7a或7b，2.9mmol)的干DMF(13.5ml)溶液中加入NaN₃(390mg，6.0mmol)。搅拌下将该反应混合物置于室温下4h。通过C盐过滤该混合物得到的溶液为：

异丁酸4(R)-(2，6-二叠氮基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(8a)或4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二叠氮基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(8b)的DMF(70ml)溶液，不用进行任何进一步纯化即用于下一步骤。

                       实施例9

异丁酸4(R)-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(9a)。

4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(9b)。

于室温下，在10％Pd/C(200mg)的存在下，使得自从前述反应(8a或8b)的溶液氢化(Parr仪器，50psi)过夜。使该混合物通过C盐过滤，以外加的DMF洗涤滤饼。

在8a的情况下，使溶液浓缩至干，经柱色谱法(Cl₃CH∶MeOH 9∶1)纯化，得到白色固体，使其从异丙醇中结晶，得到白色固体样异丁酸4(R)-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(9a，84％经用于在共结晶的一个分子的2-丙醇的存在下修正后)；mp：143-145℃；[α]_D ²⁰＝-56.45°(c 0.25，MeOH)；¹H-NMR(CDCl₃)δ：7.84(1H，s，H-8)，6.33(1H，dd，J＝1和J＝5.1，H-4)，5.29(3H，t，J＝3.2，H-2和NH₂)，4.70(2H，bs，NH₂)，4.50(1H，dd，J＝1和J＝9.0，H-5)，4.33(2H，d，J＝3.2，-CH₂COO-)，4.23(1H，dd，J＝5.1和J＝9.0，H-5′)，2.60(1H，m，(CH₃)₂CHCOO-)，1.18(3H，d，J＝6.2，(CH₃)₂CHCOO-)，1.14(3H，d，J＝7.2，(CH₃)₂CHCOO-)。

C₁₃H₁₈N₆O₄·2-丙醇的计算值：C，50.25；H，6.85；N，21.98。实测值：C，50.16；H，6.84；N，21.92。

在8b的情况下，于60℃下、真空中使溶液浓缩至最终体积15ml。用水(150ml)稀释溶液，几分钟后产生固体沉淀物。过滤该产物，用水洗涤，于50℃真空中干燥过夜，得到无定形的固体样4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(9b，88％)；HPLC(方法B，R_t＝15.41min.)；

           [α]_D ²⁰＝-95.75°(c 0.25，MeOH)；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：7.82(2H，d，J＝8.8，ArH)，7.80(1H，s，H-8)，7.02(2H，d，J＝8.8，ArH)，6.77(2H，bs，NH₂)，6.23(1H，dd，J＝5.5和J＝1.6，H-4)，5.85(2H，bs，NH₂)，5.36(1H，t，J＝3.3，H-2)，4.65(1H，dd，J＝9.4和J＝1.6，H-5)，4.46(2H，d，J＝3.4，-CH₂OCO-)，4.26(1H，dd，J＝9.4和J＝5.5，H-5’)，3.84(3H，s，OCH₃).

C₁₇H₁₉N₆O₅的计算的质量：387.1417。实测值(H.R.F.A.B.M.S.)：387.1417。

                       实施例10

4(R)-[-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基]-甲醇，得自9a的[10，(-)-DAPD]。

于回流下，使异丁酸4(R)-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(9a，100mg，0.31mmol)和正丁胺(0.45g，0.62ml，6.2mmol)的MeOH(10ml)溶液加热4hs。将该反应物冷却至室温并于真空中浓缩得到固体，用叔丁基甲基醚将固体研磨、过滤得到固体，从EtOH∶水(1∶4.5ml)中结晶得到白色固体样(-)-DAPD(10，75mg，0.29mmol，93％)；mp：237-239℃(lit.²mp：236-237℃)；HPLC(方法C，R_t＝8.7min.，(-)-DAPD的可信的样本显示R_t＝8.7min.，(+)-DAPD的样本显示R_t＝6.0min.)；

                                                                        DAPD；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：7.80(1H，s，H-8)，6.74(2H，bs，NH₂)，6.20(1H，d，J＝5.5，H-4)，5.84(2H，bs，NH₂)，5.16(1H，t，J＝6.3，OH)，5.03(1H，t，J＝2.9，H-2)，4.42(1H，d，J＝9.7，H-5)，4.18(1H，dd，J＝9.7和J＝5.5，H-5’)，3.58(2H，dd，J＝6.3和J＝2.9，-CH₂OH).

C₉H₁₂N₆O₃的计算值：C，42.86；H，4.80；N，33.32。实测值：C，42.88；H，4.79；N，33.32。

                       实施例11

4(R)-[-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基]-甲醇，得自9b的[10，(-)-DAPD]。

于回流下，使4-甲氧基苯甲酸4(R)-(2，6-二氨基-嘌呤-9-基)-[1，3]-二氧戊环-2(R)-基甲酯(9b，1.0g，2.6mmol)和正丁胺(3.7g，5.0ml，50mmol)的MeOH(25ml)悬浮液加热4个小时。于真空中浓缩该反应物得到黄色固体，于室温下将该固体悬浮于Cl₃CH中，过滤，得到白色固体样(-)DAPD(10，590mg，2.3mmol，90％)。与以上得到的(-)-DAPD样品具有同样的物理特性。

                       实施例12

对映异构选择性常数的测定

样品水解反应的对映异构选择性可用E值表示(C.S Chen，C.J.Sih，Y.Fujimoto和G.Girdaukus，J.Am.Chem.Soc.，1982，104，7294)。这用数字表示出对于两个对映体的催化剂的特征性常数的比率。E值提供催化剂选择性的直接比较的可能，即使反应已经发生不同的转化。

为了计算E值，剩余的起始原料和/或水解产物的转化的程度和光学纯度是需要的。如果ee_s和ee_p两者均已知，则可用方程式1计算出转化值(c)。如果仅知道ee_s或ee_p，在水解终止时确定的c，可用于计算E(方程式2)。

方程式1：

$c=\frac{{\mathrm{ee}}_s}{{\mathrm{ee}}_s+{\mathrm{ee}}_p}$

方程式2：

$E=\frac{\ln \left[(1-c)(1-{\mathrm{ee}}_s)\right]}{\ln \left[(1-c)(1+e{e}_s)\right]}=\frac{\ln [1-c(1+{\mathrm{ee}}_p)}{\ln [1-c(1-{\mathrm{ee}}_p)}$

缩写：

ee＝对于起始原料(s)或产物(p)的对映体过量

c＝转化

E＝对映异构选择性常数

                       实施例13

                       化合物1

用于化合物1的分析方法的开发

对于化合物1必需手性测定。由使用Chirasil DEX CB柱的手性GC达到基线分离。见图1A。

GC条件：

柱：Chirasil DEX CB

尺寸：25m×0.25mm

温度进程：140℃，10分钟，然后以15℃/min至200℃

载气：氦@20psi

检测：FID@200℃

保留时间：1-7.46min(R)-对映体

          2-7.70min(S)-对映体

对化合物1的酶的筛选

脂肪酶：向每支闪烁瓶中加入50μL化合物1、MTBE(5mL)和50mM KH₂PO₄，pH 7(5mL)，随后加入25mg酶。将瓶于设置为30℃的培养箱振摇。周期性地等量移开，通过TLC(50％EtOAc/庚烷)和手性GC检测。

蛋白酶和酯酶：如上，只是反应溶剂是5mL，50mM KH₂PO₄，pH 7或8不含MTBE。酸性蛋白酶反应在pH 3下使用0.1M乳酸溶液[胃蛋白酶，酸性蛋白酶A(Newlase A)，和酸性蛋白酶II(Newlase II)]进行。

在一些情况下，25mg，50％wt.的酶产生非常快速的反应并因此在进行有意义的检测之前达到100％转化。在这些情况下，反应在适当量的酶的存在下再次进行以产生合理比率的反应(通常为5％wt.)。需要较小的负荷的酶为Chirazyme-L2、-E1和-E2、所有的CLECs、胆碱酯酶、假丝酵母酯酶(Altus)、PPL、脂肪酶PS和脂肪酶AK。

两组条件用于外消旋的化合物1的筛选，依赖于所使用的酶是否是脂肪酶或蛋白酶/酯酶。对于脂肪酶催化的水解反应，反应溶剂为1∶1MTBE∶50mM的pH 7的磷酸钾缓冲液。对于蛋白酶和酯酶-催化的水解反应，反应在不含不溶混的有机共溶剂的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7或8(或对于酸蛋白酶pH 3))中进行。反应在30℃的振摇浴中进行，随后经TLC，ee_g值由GC分析测定(Chirasil Dex-CB柱)。

得自丁酸酯的水解的醇产物似乎不稳定，因为在反应中在TLC上产生几个新斑点。因而对可能的产物没有进行手性检测、大约的转化由TLC分析评价。

筛选的结果示于下表。表1显示在丁酸酯的手性分析中有选择地留在峰1的酶，而表2显示在丁酸酯的手性分析中有选择地留在峰2的酶。值得注意的是，看来有非常多的酶对化合物1的水解没有立体选择性，这表示在此反应条件下底物是不稳定的。当进行不含酶的对照反应时，水解仍然发生。对底物的稳定性的进一步的研究描述于本文中。

表1：在丁酸酯ee的分析中有选择地留在峰1的酶

酶	时间	ees	大致的转化率
				假单胞菌属SAWA固定化脂肪酶	6h	92％	＞50％
O/N	-	无S.M.
			脂肪酶M		6h	26％
O/N	91％	～75％
				脂肪酶PS	1h	17％
3.75h	89％	＞50％
			5h		-	无S.M.
脂肪酶F1 Biocon.	6h	13％
			O/N	88％	＞75％
	脂肪酶AK	2.75h				32％
5h			64％
		O/N			64％	＞50％
Chirazyme-L9			1h	10％
	5h	64％			＞50％
			O/N	-		无S.M.
	ChiroCLEC-PC	10min			2％
1h			46％	＞50％
		脂肪酶MY			6h	11％
O/N	33％		＞75％
				脂肪酶DS	6h	2％
O/N	28％
			假丝酵母酯酶(Altus)		10min	27％	＞50％
1h	-	无S.M.
				蛋白酶B	O/N	26％
脂肪酶F-DS	6h	22％
				O/N	-	无S.M.
	Newlase F	6h	4％
O/N				20％

脂肪酶F	6h	20％
				O/N	-	无S.M.
	Alcalase	1h	8％
5h				13％
		O/N	18％			～50％
脂肪酶R				6h	9％
	O/N	17％

表1：在丁酸酯ee的分析中有选择地留在峰2的酶

酶	时间	ees	大约的转化率
				PPL	5h	92％
O/N	96％	＞50％
			脂肪酶G		6h	3％
O/N	41％	＞50％
				PLE，技术级	1h	35％	＞50％
Chirazyme-E1	30min	13％
				1h	21％	＞50％
	Chirazyme-L2	1h	8％
1.75h				22％	＞50％

α-胰凝乳蛋白酶与化合物1没有反应。

下列酶与化合物1(＜10％ee_s)产生无选择性的反应：脂肪酶AY、脂肪酶A″Amano″6、脂肪酶A″Amano″12、脂肪酶N conc、脂肪酶AP6、Sigma CCL、小麦胚芽脂肪酶、Chirazyme-L5、ChiroCLEC-CR、蛋白酶M、肽酶R、酸性蛋白酶A、酸性蛋白酶II、酸性蛋白酶DS、蛋白酶A-DS、蛋白酶N、蛋白酶A2G、蛋白酶NL、蛋白酶DS、蛋白酶S、蛋白酶P″Amano″6、Prozyme 6、Proleather、菠罗蛋白酶-F、木瓜蛋白酶W-40(Amano)、木瓜蛋白酶(Sigma)、蛋白酶X、蛋白酶XXXI、Savinase、Esperase、胃蛋白酶、ChiroCLEC-BL、酮洛芬酯酶和Chirazyme-E2。

                   实施例14

化合物1的PPL拆分的按比例放大

为了测定哪个是(R)-异构体，大量拆分的化合物1使用从在之前列出的筛选的酶中的最有希望的酶拆分，并在整个中间体的合成顺序中采用，其中经手性检测的异构体洗脱次序是已知的。筛选出的最有希望的酶为PPL(猪的胰脂肪酶，Sigma)，因而这个反应按比例放大至50g外消旋的底物输入(流程10)。

                 由碱摄取，68％转化

             流程10：化合物1的大规模PPL拆分

进行了最小限度的反应条件优化，除了增加底物浓度至50g/L外(作为试验，进行5g底物的反应是成功的)。此50g反应物于30℃用5％wt PPL启动，随着反应进行加入3M NaOH以试图保持pH于7。然而，反应进行的非常迅速，25分钟后冷却至15℃且保持在pH 6。

特别地，于30℃，向2L的夹套容器中加入MTBE(500mL)、50mM KH₂PO₄，pH 7(500mL)和外消旋的化合物1(49.75g，0.265mol，TP-0257/98/D)。往搅拌的混合物(pH 7)中加入PPL(2.5g，5wt％)，然后加入3M NaOH保持以pH为pH 6。由于反应快速，25min后将容器冷却至15℃，反应在此温度进行。在等量移去MTBE的时间间隔测量ee_s，并用更多的MTBE稀释，干燥(MgSO₄)，经手性GC分析。1h 10min后ee_s已经达到98％，对反应物后处理。混合物经C盐过滤，用MTBE(200mL)洗涤C盐。分离该混合物，保留有机层。

水相用MTBE(500mL)再提取。合并MTBE提取物，干燥(MgSO₄)，于真空中蒸发得到22g的粗黄色油。经硅胶快速柱色谱法法(20％EtOAc∶80％庚烷)纯化该粗产物得到非常浅的黄色油样的9.55g(S)-化合物1，经GC-MS测得98％ee，95％纯。也得到另外的1.5g的纯度较低物质。合并的得率为22％。

GC-MS(CPSi18CB/MS，30m×0.25mm，60℃持续5min，10℃/min直至300℃)13.98min，M＝173(M⁺-CH₃)，经峰面积算得纯度为95％。

¹H NMR(200MHz，CDCl₃)δ5.85(t，1H，CH-O)，4.35(m，4H，2xCH₂O)，2.35(t，2H，CH₂)，1.7(六重峰，2H，CH₂)，0.95(t，3H，CH₃)。

在时间间隔测量ee_s(在ee分析中的峰2)。

             表3：化合物1的PPL拆分

时间	用碱摄取的转化	实际pH	ees
				5min	28％	6.5	-
10min	57％	6.5	53％
				55min	63％	6.0	89％
1h 10min	68％	6.0	98％

反应在1h 10min后完成，并经硅胶柱色谱法纯化分离的拆分的化合物1。得到9.55g，纯度95％，98％ee酯，以及1.5g的较低纯度的酯(总得率22％)。主要批次的酯(9.55g)中的杂质是丁酸。该物质在整个中间体的合成顺序中出现，其中经手性检测的异构体洗脱次序是已知的，经测定为(S)-化合物1。为了得到(R)-异构体，需要在化合物1手性检测中有选择地留在峰1的酶。

                   实施例15

生成(R)-化合物1的商品酶拆分的优化

如从表1中可见，最初的筛选显示SAWA固定化脂肪酶、脂肪酶M、脂肪酶PS和F1 Biocon.脂肪酶为有效得到(R)-化合物1的潜在侯选酶。拆分按比例放大以测定他们的选择性(F1 Biocon.脂肪酶不再是商业上可获得的)。

将酶加入到2-5g的酯的15-20mL各溶剂和缓冲液(0.2NKH₂PO₄)中。加入氢氧化钠溶液以控制pH。后处理程序为过滤(C盐)、提取(MTBE)、用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤、干燥(MgSO₄)并浓缩。经手性GC(Chirasil Dex CB)分析。研究的变量为酶、溶剂pH和温度(见表4)。

用在pH 7磷酸盐缓冲液中的脂肪酶PS、脂肪酶M和SAWA固定化假单胞菌属脂肪酶进行的最初的试验，得到留下对映体过量90％的底物，但是(R)-化合物1的回收低(＜5％)。在不存在酶(条目20和21)的标准反应条件下，于pH 7和pH 6研究丁酸酯的稳定性。于pH 7，消耗有重要意义的碱以保持pH，处理和分离后仅50％的(1)在3.5h后被拆分。在pH 6时稳定性明显较好。可能的分解模式为打开内酯-缩醛，生成醛和乙醇酸(流程11)。

          流程11：化合物1的可能分解途径

条目	酶	共溶剂	pH	温度/℃	mmol碱∶SM	S.M.ee/％	得率S.M.％	E(i)	备注
										1	脂肪酶PS	MTBE	6-7	20	20∶28	＞95	0	-	10％酶，可忽略的S.M.，17min
2	脂肪酶PS	MTBE	7	20	33∶27	＞95	0	-	可忽略的S.M.，2h
										3	脂肪酶PS	MTBE	6	20	13∶12	90	6.2	1.9
4	脂肪酶PS	MTBE	7	10	28∶26	＞95	0	-	可忽略的S.M.，2.5h
										5	脂肪酶PS	MTBE	5-7	10	10∶13	82	0	-	可忽略的S.M.，4.5h
6	脂肪酶PS	庚烷	6-7	0	8∶17	88	NI	-	1M缓冲液
										7	脂肪酶PS	庚烷	6	0	10∶24	88	14	3.1
8	脂肪酶PS	甲苯	6	0	10∶19	54	45	4.3
										9	脂肪酶PS	MEK	6	0	2∶20	19	70	3.1
10	脂肪酶PS	THF	6	0	4∶19	36	46	2.6
										11	脂肪酶PS	DCM	6	0	4∶19	12	68	1.9
12	脂肪酶PS	二烷	6	0	6∶18	50	22	1.9
										13	SAWA	MTBE	6	20	8.6∶15	81	21	3.3
14	SAWA	MTBE-EtOH		20	-	0	NI	-	无水，外消旋的
										15	SAWA	甲苯	6	0	13∶19	37	41	2.4
16	脂肪酶M	MTBE	6	20	20∶15	-	0	-	无S.M.20h
										17	脂肪酶M	MTBE	7	0-5	28∶27	83	NI	-	1M缓冲液
18	脂肪酶M	甲苯	6	0	14∶19	39	42	2.5
										19	CLEC-PC	MTBE	6	20	-	-	0	-	无S.M.残留
20	无	MTBE	7	20	9∶9	-	48	-	3.5h，S.M.分解
										21	无	MTBE	6	20	无碱	-	NI	-	2h，无碱消耗

(i)对映异构选择性常数—见实施例12

                                                              表4：化合物1的拆分的优化

两个其他的对照显示98％ee的起始酯不被于pH 6或pH 7的反应条件外消旋化。进一步的测试反应显示于pH 6，0℃下，在24小时后，100g/L底物的2∶1甲苯∶1M缓冲液，大于90％得率的起始原料被回收并没有对映体过量的损失。因而外消旋转化和底物稳定性在这些反应条件下不成问题。

考虑这些结果，所有进一步的酶反应在pH 6进行。研究得来的最好的结果示于条目7、8、9和13。最有希望的酶拆分是用脂肪酶PS的甲苯/pH 6缓冲液进行，产生的E值为4.3。此将得到得率为17％的95％ee。用脂肪酶PS的拆分还在此中的实施例中研究。用于优化研究的变量为浓度、溶剂：缓冲液体积比例、酶负荷、添加剂和温度。

最优的条件定为0℃，100g/L底物的1∶1甲苯∶磷酸钾缓冲液(pH6)，其产生95％ee、22％得率的(R)-化合物1。在200g/L底物浓度下，以17％的得率得到95％ee(R)-化合物1。

                   实施例16

微生物酶筛选

从约200株(使用新的96-孔板法)的筛选中，鉴定出留下化合物1的(R)-异构体的7个阳性株(峰1)。只要它们使酯水解并产生＞10％ee的残留底物，则这些酶被分类为阳性的，因而具有产生高ee酯的潜力。

筛选在含20g/l酯的0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 6.0)中，于25℃下进行约16h。结果描述于图5A和5B中。

使从最初筛选的7个阳性株(峰1)生长在有TSB(胰化蛋白胨大豆肉汤)烧瓶中，获取细胞糊。将这些细胞糊再悬浮于10％w/v的0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄、pH 6.0+20g/L酯中，且于25℃，在闪烁瓶(于每瓶1.0mL)中振摇最多至92小时。结果示于表5。

                                      表5：阳性微生物株的进一步研究

序号	CMC号	名称	时间/h	峰1	峰2	ees
							1	3127	液化沙雷氏菌(Serratialiquifaciens)	17.75	13291	10863	10.1％
24	71866	67553	3.1％
				47
92
				2	3322	皮氏产碱菌(P.alcaligenes)				17.75
24
							47
3	3373	不动杆菌株(Acinetobacter sp)	1775								67157	64051	2.4％
				24	9827	8169	9.2％
			47
				92
			4					3418	未鉴定的菌	17.75	14606	9430	21.5％
24	11627	8948		13.0％
					47
92
					5	3419	不动杆菌			17.75	69727	30271	39.5％
24	55222	22993	41.2％
				47				18804	2077	80.1％
92
				6				3606	琼氏不动杆菌	17.75	114861	14557	77.5％
24	93782	23728	59.6％
					47	45250	6326			75.5％
92	7789	880	79.7％
					7	3635	未鉴定的菌			17.75	26812	23798	6.0％
24	6685	4022	24.9％
				47				2134	1139	30.4％
92
				8				空白	无酶	17.75	254977	256011	0.2％
24	215295	216508	0.3％
					47	86300	85001			0.8％
92	20053	19960	0.2％

来自对照的结果显示酯在25℃超过24小时是不稳定的。在17和92小时的峰面积之间减少了97％的峰面积大小。这就清楚地解释了为什么所有的样品峰面积表现出显著地下降。对这些株再筛选，CMC 3606(琼氏不动杆菌)和CMC 3419(不动杆菌)显示好的对映体选择性(对于峰1为80％ee)。将这两株再生长[CMC 3606在烧瓶中(因其最初为未经鉴定的细菌)和CMC 3419在发酵容器中]准备用于进一步的评价。对于CMC 3322(皮氏产碱菌(P.alcaligenes))17小时后没有可检测到的酯。这可能是由于pH的变化(随着细胞溶解)或来自酯酶的高活性。

                   实施例17

                   化合物3

用于化合物3的分析方法的开发

开发手性GC检测以分离化合物3的四个可能的非对映异构体。检测条件的细节设定如下。

GC条件：

柱：Chiraldex GTA

尺寸：30m×0.25mm

温度进程：100℃，20分钟，然后以2℃/min至160℃

载气：氦@14psi

检测：FID@200℃

保留时间：1-41.74分钟    2-41.96分钟

          3-43.07分钟    4-43.82分钟

起始酯的手性GC-MS在15.98和16.27min分别以1∶1.4的比率得到两个峰(非对映异构体)。见图1B。对四个手性GC ee/de检测峰和GC-MS峰的比较显示峰1和2是对映体和峰3和4是在ee/de检测中的对映体。

酶筛选，化合物3

脂肪酶：向每个闪烁瓶中加入50μL化合物3(TP-0259/98/A)、MTBE(5mL)和50mM KH₂PO₄，pH 7(5mL)，随后加入20mg酶。将瓶于设定为30℃的培养箱中振摇，随着周期性地等量移去，用TLC(50％EtOAc/庚烷)和手性GC检测。

蛋白酶和酯酶：如上，不同的是反应溶剂为5mL、50mMKH₂PO₄，pH 7或8不含MTBE。于pH 3下，使用0.1M乳酸溶液[胃蛋白酶，酸性蛋白酶A(Newlase A)和酸性蛋白酶II(Newlase II)]进行酸性蛋白酶反应。

就某些酶而言，已知它们对这些底物非常有活性，在有合适量的酶时进行反应，得到合理比例的反应物，通常10-15wt％。所需的这些减轻负荷的酶为Chirazyme-L2、-E1和-E2、所有CLECs、胆碱酯酶和假丝酵母酯酶(Altus)。

外消旋的化合物3被筛选用于有商业上可获得的脂肪酶、蛋白酶和酯酶的酶水解。所有脂肪酶反应是在50μL化合物3、5mLMTBE、5mL pH 7磷酸盐缓冲液和50％wt.酶(除了Chirazyme-E1、Chirazyme-E2、Chirazyme-L2、假丝酵母酯酶、胆碱酯酶和CLECs，10％wt.)的存在下进行的。没有MTBE时进行酯酶和蛋白酶反应。反应物随后经TLC和手性GC检测。

于乙酸酯中心的立体化学不是重要的，因为其置于大批活性DAPD的合成的后期。这样，关于丁酸酯中心的拆分是值得的。然而，最初并不知道哪个峰对应于哪个异构体。不含酶的对照翻译显示在此反应条件下底物是稳定的。来自用于化合物3的拆分的筛选结果示于表6-11。

                                表6：化合物3的酶筛选-对于峰1/3的酶选择性

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									肽酶R	3.5h	32.0	27.5	40.0	0.5	8％98％	13	～20％
O/N	68.5	0.0	31.5	0.0	99％99％	13	～50％
								蛋白酶M		1.25h	31.0	20.0	37.0	12.0	22％51％	13	＜20％
6.5h	58.5	2.0	39.5	0.0	93％99％	13	～50％
									酸性蛋白酶A(NewlaseA)	4h	36.5	3	60.5	0	85％99％	13	～50％

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									蛋白酶B	7h	17.5	12.5	62.5	7.5	17％79％	13	～50％
24h	31	0	69	0	99％99％	13	＞80％
								ChirazymeL2		45min	28.0	21.0	35.5	16.0	14％38％	13	～30％
1.75	39.0	15.5	41.0	4.5	43％80％	13	～50％
									蛋白酶A	3.5h	40.5	20.5	28.5	10.5	33％46％	13	40-50％
6.5h	51.5	18.0	26.5	4.0	48％74％	13	～60％
								蛋白酶A2G		3.5h	40.0	23.5	22.5	16.5	26％15％	13	～50％
O/N	70.5	5.0	15.0	10.0	87％20％	13	＞75％
									酮洛芬酯酶	3.5h	8.5	1.5	56.0	40.0	70％17％	13	～60％
6.5h	9.0	2.0	56.0	40.0	64％17％	13	～60％
								蛋白酶N		1.25h	22.5	18.0	31.0	28.5	11％4％	13	10-20％.
6.5h	24.0	17.5	33.0	25.5	16％13％	13	10-20％
									PPL	3.5h	34.0	25.5	20.0	20.0	14％Rac	13/4	10-20％
6.5h	43.5	26.0	16.0	14.0	25％7％	13	～60％

这些结果显示肽酶R、蛋白酶M和酸性蛋白酶A(Newlase A)对于峰1和3具有非常的选择性；同时，蛋白酶B、Chirazyme-L2和蛋白酶A对于峰1和3具有适度的选择性。

              表7：化合物3的酶筛选—对于峰1/4的酶选择性

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									PLE	1.25h	35.0	19.0	11.5	35.0	30％50％	14	～50％
6.5h	70.0	10.0	0.0	20.0	75％99％	14	＞80％
								Chirazyme-E1		15min	33.0	19.0	17.0	31.0	27％29％	14	～50％
45min	52.0	12.0	8.0	28.0	63％56％	14	～80％
									Chirazyme-E2	1.25h	46.5	20.0	11.0	22.0	40％33％	14	～60％
3.5h	54.5	19.5	8.5	17.5	47％26％	14	＞80％
								PLAP		24h	32.5	24.5	9.5	33.5	14％56％	14	＞50％

这样，PLE和Chirazyme-E1对于峰1和4具有适度的选择性。

                            表8：化合物3的酶筛选—对于峰1的酶选择性

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									木瓜蛋白酶(Sigma)	7h	64.5	19	16.5	0	54％100％	13	～50％
24h	93.5	5	1.5	0	90％	1	＞50％
								蛋白酶PAmano 6		1h	44	23.5	14	18.5	30％14％	14	～50％
4h	84.5	15.5	0	0	69％	1	＞80％
									Prozyme 6	1h	44	26	12	18	26％20％	14	～50％
4h	78	22	0	0	56％	1	＞80％

这些结果显示木瓜蛋白酶表现出对峰1非常好的选择性。

                          表9：化合物3的酶筛选-对于峰2/3的酶选择性

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									脂肪酶AK	3.5h	22.0	52.5	24.0	2.0	41％85％	23	～20％
6.5h	14.0	73.5	12.5	0.0	68％99％	23	～60％
								脂肪酶MY		1.25h	19.0	31.5	36.0	13.5	25％45％	23	30-40％
6.5h	8.5	76.0	15.5	0.0	80％99％	23	＞80％
									脂肪酶AY	3.5h	20.5	39.5	32.5	7.5	32％63％	23	10-20％
6.5h	17.5	56.0	25.0	1.5	52％89％	23	～50％
								CCL		3.5h	20.5	27.5	32.5	19.0	15％26％	23	10-20％
	6.5h	20.5	33.5	33.0	13.0	24％43％	23		30-40％
								酸性蛋白酶A		6.5h	21.5	24.0	29.0	25.5	5％6％	23	～30％
O/N	22.5	36.0	25.0	16.0	23％22％	23	～50％
									蛋白酶NL	7h	22	24	33	21	Rac22％	2/13	＜50％
24h	23.5	29.5	35.5	11.5	11％51％	23	～50％

这些结果显示脂肪酶AK、脂肪酶MY和脂肪酶AY对峰2和3具有适度的选择性。

                       表10：化合物3的酶筛选—对于峰2/4的酶选择性

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									蛋白酶XXXI	4h	25.5	29.5	19	26	7％16％	24	～50％
24h	31	46	7.5	15.5	19％34％	24	＞50％
								Proleather		4h	25.5	30.5	18.5	25.5	9％16％	24	～50％

这样，没有酶对于峰2和4选择性地产生特别高的对映体过量。

                       表11：化合物3的酶筛选—对于峰2的酶选择性

酶	时间	峰1	峰2	峰3	峰4	ee	峰	经TLC测得的转化率
									脂肪酶PS	3.5h	18.5	65.5	3.5	12.5	56％56％	24	～40％
6.5h	7.5	89.0	0.0	3.5	84％	2	＞80％
								ChirazymeL5		1h	25	33	27	15	14％29％	23	～50％
4h	20	80	0	0	60％	2	＞80％
									ChirazymeL9	3.5h	34.0	40.0	5.5	21.0	8％58％	24	～50％
6.5h	38.0	57.0	0.0	5.5	20％	2	＞80％

这些结果显示脂肪酶PS对峰2具有适度的选择性。

没有发现与α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶GC、脂肪酶PGE、脂肪酶N conc、脂肪酶G、脂肪酶R、脂肪酶M、脂肪酶A″Amano″12、脂肪酶AU miles 1988、脂肪酶F1 Biocon.、小麦胚芽脂肪酶、木瓜蛋白酶W-40、蛋白酶S、蛋白酶X和胃蛋白酶的反应。

产生非选择性的水解的酶是酸性蛋白酶II(Newlase II)、菠罗蛋白酶F、Alcalase、Savinase、Esperase、ChiroCLEC-BL、胰岛素、ChiroCLEC-PC、SAWA固定化假单胞菌脂肪酶和脂肪酶F。来自Altus的假丝酵母酯酶引起太快的反应以至于没能收集任何对映体过量的数据。

此筛选完成后，通过使来自PPL拆分的(S)-化合物1还原制备拆分的化合物3的样品。这在生成峰1和4的ee/de检测中进行。因为PPL拆分生成(S)-化合物1，峰2和3需要化合物3的拆分。筛选得来的结果显示拆分化合物3的酶的大多数在乙酸酯中心，不在需要的丁酸酯中心。然而脂肪酶AK、脂肪酶MY、脂肪酶AY和脂肪酶PS以适度的选择性产生所需的峰。

进一步研究了用脂肪酶PS和脂肪酶MY拆分化合物3(脂肪酶AK已经由Amano中止)。产物的规模生产和分离是需要的，以确定拆分是否有效(见表12)。脂肪酶PS在甲苯中得到39％得率的回收的起始原料，伴有有效的58％的ee和3.7的有效的E(这样得到对存在于混合物中的正确的(R)-丁酸酯的量的测量)。这些选择性并不比所得到的用脂肪酶PS对于化合物1(E＝5.3)的好。再有，由于在一个实施方案中，拆分步骤在反应程序的较早期，以下的实施例集中在优化化合物1的拆分。

                                   表12：化合物3的拆分的进一步研究

规模/g	浓度g/l溶剂	酶wt％	峰1	峰2	峰3	峰4	得率S.M.	有效的ee S.M	有效的E
										1.4	50MTBE	PS，3	23	45	13	19	52％	16％	1.6
1.3	50甲苯	PS，6	15	65	14	6	39％	58％	3.7
										1.3	50MTBE	MY，5	23	45	13	19	52％	16％	1.6
1.2	50甲苯	MY，4	22	28	35	15	42％	26％	1.8

条件：20℃，1∶1溶剂：pH 7缓冲液

                   实施例18

                   化合物11

用于化合物11的分析方法的开发

对于化合物11需要手性测定。由使用Chiralpak AS柱的手性HPLC达到基线分离。见图1C。

HPLC条件：

柱：Chiralpak AS

尺寸：250mm×4.6mm

流动相：1∶1 IPA∶EtOH

流速：0.6ml/min

检测：UV 254nm

温度：室温

保留时间：峰1-11.96分钟    峰2-13.17分钟

由于此化合物正在经历微生物筛选(＞400个样品)以及商品酶筛选，少于5分钟(sub 5minute)的运行时间是必需的。前一检测采用SFC条件，其中这些条件可以达到。见图1D。

SFC条件：

柱：Chiralpak AS

尺寸：250mm×4.6mm

流动相：95％CO₂∶EtOH

流速：3.0ml/min，3000psi

检测：UV 254nm

温度：35℃

保留时间：峰1-2.88分钟    峰2-3.95分钟

用于化合物11的酶筛选

脂肪酶：在闪烁瓶中，将40μL化合物11、MTBE(5mL)、50mMKH₂PO₄，pH 6(5mL)和～10mg酶于30℃的培养箱中振摇。周期性地移去等量部分，用TLC(50％EtOAc/庚烷)和手性HPLC检测。

蛋白酶和酯酶：如上，但没有MTBE。

取决于所用的酶是脂肪酶或蛋白酶/酯酶，应用两组条件筛选化合物11，外消旋的甲氧基苯甲酸酯。对于脂肪酶催化的水解反应，反应溶剂为1∶1甲基叔丁基醚(MTBE)∶50mM于pH 6的磷酸钾缓冲液。对于蛋白酶和酯酶催化的水解反应，反应在不含不溶混的有机共溶剂的磷酸盐缓冲液中进行。于30℃，反应在振摇器中的闪烁瓶中进行，随后经薄层色谱(TLC)。经HPLC分析(Chiralpak AS)测定残留的底物的对映体过量(ee_s值)。从上述的实施例中已知由这些酯的水解的醇产物是不稳定的。这样，对于可能的产物没有进行手性分析，不能计算转化，故需要注意的是，通过TLC分析是否仍然存在任何底物。

筛选得来的结果示于下表中。表13显示在手性HPLC分析中有选择地留下相应于峰1的对映体的酶的结果，和误差！未发现参照源(Error！Reference source not found.)。选择性对于峰2的酶的结果。

        表13：在HPLC分析中有选择地留在峰1的酶

酶	时间	ees/％	备注
				脂肪酶M脂肪酶PSChirazyme-L9脂肪酶MY脂肪酶DS脂肪酶F-DS脂肪酶FChirazyme-L2脂肪酶AY	72hrs2周72hrs2周72hrs2周72hrs2周72hrs2周72hrs2周72hrs2周18hrs2周72hrs2周	242972219567212566528037681001003169	峰1底物存在峰2底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在

脂肪酶A″Amano″12脂肪酶N cone脂肪酶AP6Sigma CCL酸性蛋白酶A酸性蛋白酶DS

72hrs2周72hrs2周72hrs2周72hrs2周48hrs2周48hrs2周

164533461743206224766692

峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在峰1底物存在

     表14：在HPLC分析中有选择地留在峰2的酶

酶	时间	ees/％	备注
				脂肪酶PS	72hrs2周	722	峰2底物存在

下列酶是非选择性的(＜20％ee_s任一峰)：SAWA固定化脂肪酶、Chiroclec-PC、蛋白酶B、Newlase F、Alcalase、脂肪酶R、PPL、脂肪酶G、PLE、Chirazyme-E1、Chirazyme-L5、ChiroCLEC-CR、蛋白酶M、肽酶R、酸性蛋白酶A-DS、蛋白酶N、蛋白酶A2G、蛋白酶NL、蛋白酶DS、蛋白酶S、蛋白酶P″Amano″6、Prozyme 6、Proleather、菠罗蛋白酶-F、木瓜蛋白酶W-40(Amano)、木瓜蛋白酶(Sigma)、蛋白酶X、蛋白酶XXXI、Savinase、Esperase、胃蛋白酶、ChiroCLEC-BL、胆碱酯酶、Chirazyme-E2和α-胰凝乳蛋白酶。

                    实施例19

化合物11的Chirazyme-L2拆分的按比例放大

在化合物11的拆分的最初的研究中，不知道对映体与在手性HPLC分析的峰如何关联。为了测定绝对构型，在贯穿整个合成DAPD中间体的过程取样，其构型可以确定。得自筛选的最有希望的酶之一是Chirazyme-L2；因而为了制备样品(流程12)，按比例放大该反应。底物浓度增加至20g/L，且酶负荷减少，但不同的是过程的优化是最小。于30℃，输入1g外消旋物、5wt.％Chirazyme-L2并将pH保持在5和6之间，以＞98％ee和好的纯度得到0.321g(32％)的酯。

          流程12：化合物11拆分的按比例放大

再使该反应进一步按比例放大至10g；3.5h后，以39％的得率，＞99％ee得到白色固体样3.9g的化合物11。此经测定为不想要的(S)-对映体。因此，所需的(R)-对映体必须与手性HPLC分析中的峰2相对应。

为此，于30℃，向500mL的夹套容器中装填MTBE(250mL)、外消旋的化合物11(10.00g，39.7mmol，TP-43/100)和50mMKH₂PO₄，pH 6(250mL)。搅拌中将Chirazyme-L2(500mg，5wt.％)加入该混合物中。通过加入2N NaOH使pH保持在pH 5和6之间。3.5小时后，碱的摄取已经停止，混合物通过C盐^过滤、分离。用MTBE(2×200mL)萃取水相，合并有机层，用2N NaOH(200mL)、亚硫酸钠(200mL)、2N HCl(200mL)洗涤，干燥(MgSO₄)。于真空中浓缩得到白色固体样化合物11。得率3.89g、39％；ee＞99％；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)与结构相一致。

                    实施例20

化合物11的脂肪酶PS拆分的按比例放大

从最初的筛选中，仅脂肪酶PS为生成所需的化合物11的(R)-对映体(见误差！未发现参照源(Error！Reference source not found.))的侯选酶。为了确定其选择性，将该拆分按比例放大至2g。在约50％转化时，残留的酯的对映体过量仅8％。酶明显地对于可行的过程没有显著的选择性。

于30℃，向100mL的夹套容器中装填MTBE(25mL)、外消旋的化合物11(2.00g，7.94mmol，TP-43/100)和50mM KH₂PO₄，pH 6(25mL)。搅拌中将脂肪酶-PS(100mg，5wt.％)加入该混合物中。通过加入2N NaOH使pH保持在pH 5和6之间。在约50％转化(通过碱的摄取)后，等量取样，经分析为8％ee。再经24小时后检测不到底物。

                    实施例21

微生物酶筛选

制备96孔培养板的一般方法。

使用2.2mL 96孔深孔板。将1.0mL消毒的用于细菌的TSB(胰化蛋白胨大豆肉汤，Oxoid CM129)或用于酵母的YM(酵母霉菌肉汤，Oxoid CM920B)加入到每个瓶中，用培养物的储备液接种。将此板25℃下振摇≥48小时。经离心(于4℃，1000g，10分钟)收集细胞沉淀，弃去上清液。将细胞沉淀贮藏于-20℃直至筛选时备用。

96孔深孔培养板对化合物11的筛选。

在丙酮中制备200g/L化合物11的储备液。将450μL 0.1M Tris-HCl+0.1％吐温80，pH 7.0和50μL化合物1的储备液加入到96孔深孔培养板的每个孔中。将这些板于25℃振摇≥72小时。样品萃取入MTBE中，经手性HPLC检测。

针对一组细菌和酵母进行筛选。使这些细菌和酵母生长于96孔深孔板中，经离心收集其细胞沉淀。这样能使所述沉淀再悬浮于含有用于筛选的底物的缓冲液中。将该板于25℃振摇≥72小时。样品萃取入MTBE中，经手性HPLC检测。筛选得来的结果概述于图3C中。在此检测中鉴定几个样品对留下的相应于峰1的对映体具选择性，然而仅几株以低ee得到所需的对映体(峰2)。这可能是由于野生型微生物中表达的酶的水平低，因此转化率低。还必须注意的是，所使用的高通量手性HPLC方法仅可得到近似值。最佳结果整理于表15中。

                        表15：化合物11的微生物筛选

CMC号	株	底物ees/％	选择性*
				103522103978103947103826103397103308103115103188103126	未鉴定的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarunm)食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)假单胞菌(Pseudomonas sp.)Phaftia rhodogyma红球菌(Rhodococcus sp.)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)肠杆菌(Enterobactericae sp.)	231211101063615844	峰2峰2峰2峰2峰2峰1峰1峰1峰1

                  ^*在HPLC色谱法中的残留酯的主峰

选择有选择地生成峰2的五个株和生成峰1的三个株进行进一步的试验，以确认来自最初的筛选的结果；结果示于表16。仅CMC103522，从初步筛选中得到的对于峰2的最佳的侯选者，经确认其对峰2的选择性(≤10％ee)。

                 表16：化合物1的微生物筛选

CMC号	株	底物ees/％	选择性*
				103115103126103188103397103522103826103947103978	红球菌肠杆菌恶臭假单胞菌假单胞菌未鉴定的地衣芽孢杆菌食酸丛毛单胞菌植物乳酸杆菌	52519422	峰1峰1峰1峰1峰2峰1峰1峰1

             ^*在HPLC色谱法中的残留酯的主峰

                      实施例22

                      化合物12

用于化合物12的分析方法的开发

手性分析也需要用于化合物12。见图1E。检测条件的细节如下：

HPLC条件：

柱：Chiralpak AS

尺寸：250mm×4.6mm

流动相：1∶1 IPA∶EtOH

流速：0.8ml/min

检测：UV 254nm

温度：室温

保留时间：峰1-6.91分钟    峰2-7.66分钟

将此分析再次经SFC以达到少于5分钟的运行时间，以使大量的微生物筛选样品在尽可能短的时间内被分析。见图1F。

SFC条件：

柱：Chiralpak AS

尺寸：250mm×4.6mm

流动相：95％CO₂∶EtOH

流速：3.0ml/min，3000psi

检测：UV 254nm

温度：35℃

保留时间：峰1-3.06分钟    峰2-3.81分钟

酶筛选。

在96孔培养板上筛选化合物12。化合物12的筛选方法基于开发用于化合物11的筛选方法，但仅限于10个酶。应用两组条件，这取决于酶是脂肪酶或是蛋白酶/酯酶。对于脂肪酶催化的水解反应，反应溶剂为1∶1 MTBE∶50mM的磷酸钾缓冲液(pH 6)。对于蛋白酶和酯酶催化的水解反应，反应在不含不溶混的有机共溶剂的磷酸盐缓冲液中进行。在所有反应中，所使用的底物的量为40mg。反应在30℃的振摇浴器中进行，经HPLC分析(Chiralpak AS)测定对映体过量值。三个阳性结果概述于表17中。

              表17：化合物2的商品酶筛选

酶	时间	底物ees/％	备注
				Chirazyme-L2酸性蛋白酶DSChirazyme-L9	20hrs1周20hrs1周20hrs1周	9510047-825	峰2底物存在峰2无底物峰2底物存在

下列酶对化合物2产生较少选择性拆分(＜20％ee_s)：脂肪酶F-DS、脂肪酶PS、脂肪酶DS、脂肪酶AY、脂肪酶F、酸性蛋白酶A和脂肪酶N Cone。

样品经手性HPLC检测；结果概述于图3D中。如可从图3D中发现，微生物株被鉴定对两个对映体均具选择性。因有转化，真实的选择性未知。当Chirazyme-L2被鉴定为用于在HPLC分析中留下相应于峰2的对映体的优良酶时，在此局限的筛选中没有鉴定出留下峰1的酶。不知道在手性分析中对于化合物2而言哪个峰对应于所需要的(R)-对映体。

                    实施例23

                    化合物13

构型的化学确定法

作为确定在GC色谱法中的哪个峰对应于所需的对映体的有用的方法，可以设想真实可信的样品可由甲硅烷基醚制得。使富含对映体的甲硅烷基醚与2-甲基丙酰氯在四氢呋喃(THF)和氯化四丁基铵(TBAF)一起加热(见流程13)。

           流程13：化合物13的构型的确定

目的是使甲硅烷基醚裂解并在原位用酰基氯捕获所产生的醇。虽然中间体醇是不稳定的，如果仅小部分与酰基氯反应快于分解，则已知构型的酯将会产生。由于手性检测是GC方法，灵敏度高，可检测到微小的数量。从(R)-甲硅烷基醚开始，在针对产物的GC色谱中观察到峰，峰1在两种情况下放大。掺加(Spiking)外消旋物的样品证实该峰与所需的酯相对应。在两种情况下观察到对映体过量有轻微的损失，可能是由于介质的酸性和设想为母体乙醇中间体的潜在的不稳定性。起始甲硅烷基醚的绝对构型已知为所需的(R)-构型。在对正丁酸酯的GC分析中产生峰1的对映体也已知是所需的对映体。因此，(R)-甲硅烷基醚与2-甲基丙酰氯的反应将生成所需的化合物13的对映体，此与在GC分析中的峰1相对应。由于甲硅烷基醚的其他的对映体也可获得，为进一步确认，其也被证实在与2-甲基丙酰氯的反应中得到峰2对映体。

从对映体的甲硅烷基醚制备酯的实验方法

于氮气下，将150mg的甲硅烷基醚、0.5mL的酰基氯和0.4mL的TBAF(1M的THF)在5mL THF中的混合物加热至回流3-4小时。TLC显示形成少量的产物。等量取样，经过硅胶塞并用手性GC分析。

                    实施例24

用于化合物13的分析方法的开发

开发手性GC分析以分离化合物13的对映体。见图1G。检测条件的细节如下：

GC条件：

柱：Chirasil DEX CB

尺寸：25m×0.25mm

温度程序：140℃，8分钟，然后以15℃/min至200℃

载气：氦@20psi

检测：FID@200℃

保留时间：峰1-6.5分钟    峰2-6.8分钟

另外，开发了手性GC分析以测定化合物13的纯度。见图1H。检测条件的细节如下：

GC条件：

柱：J&W Scientific DB5

尺寸：15m×0.25mm

薄膜厚度：0.25μm

温度程序：140℃，5分钟，然后以10℃/min至200℃

载气：氦@12psi

检测：FID@200℃

保留时间：化合物3-17.80分钟

酶筛选

正丁酸酯的稳定性被测定为显著更好是在pH 6。因此对于仲丁酸酯、化合物13的筛选，应用类似的条件。对于用商业上可获得的脂肪酶、蛋白酶和酯酶的酶促水解，筛选外消旋的化合物13。所有脂肪酶反应均在40μL化合物13、5mL MTBE、5mL pH 6磷酸盐缓冲液和20wt.％酶的存在下进行。酯酶和蛋白酶反应在没有MTBE的存在下进行。该混合物于30℃的培养箱中振摇并用TLC和手性GC监测。醇产物，如其他的酯一样，如前所述是不稳定的。因此没有对产物的手性分析是可能的并且不能计算转化率。对于该筛选，应注意的是经TLC分析任何底物是否还仍存在。筛选得来的最佳结果示于下表18。

                  表18：化合物13的商品酶筛选

酶	时间	底物ees/％	备注
				Chirazyme-L2脂肪酶F-DS酸性蛋白酶DS脂肪酶PSChirazyme L9酸性蛋白酶A脂肪酶M蛋白酶M蛋白酶P″Amano″6	1hr5hrs1hr1周24hrs120hrs5hrs24hrs24hrs120hrs24hrs120hrs24hrs1周5hrs1周24hrs1周	81-104649-44-42-23-283019302133	峰1无足够的底物残留峰1底物存在峰1无足够的底物残留峰1无足够的底物残留峰1无足够的底物残留峰1无底物峰1底物存在峰1少量底物存在峰1少量底物存在

下列酶与化合物13产生少选择性的反应(＜20％ee_s)：脂肪酶DS、脂肪酶AY、脂肪酶F、脂肪酶N Cone、SAWA固定化脂肪酶、Chiroclec-PC、脂肪酶MY、蛋白酶B、Newlase F、Alcalase、脂肪酶R、PPL、脂肪酶G、PLE、Chirazyme-E1、脂肪酶A″Amano″6、脂肪酶A″Amano″12、脂肪酶AP6、Sigma CCL、Chirazyme-L5、ChiroCLEC-CR、肽酶R、酸性蛋白酶A-DS、蛋白酶N、蛋白酶A2G、蛋白酶NL、蛋白酶DS、蛋白酶S、Prozyme 6、Proleather、菠罗蛋白酶-F、木瓜蛋白酶W-40(Amano)、木瓜蛋白酶(Sigma)、蛋白酶X、蛋白酶XXXI、Savinase、Esperase、胃蛋白酶、ChiroCLEC-BL、Chirazyme-E2和α-胰凝乳蛋白酶。

从表19可以看到在手性GC分析中所有酶选择性地留下峰1，所幸的是相应于所需的对映体。筛选的酶中没有对峰2的选择性。选择四个酶以较低的负荷进行再筛选，其结果可见于表中。这些中最有希望的酶是Chirazyme-L2，于5.5小时以90％ee残留的酯。

        表19：对化合物3的峰1选择性酶的再筛选

酶	时间	ees/％	备注
				Chirazyme-L2脂肪酶PS酸性蛋白酶DSChirazyme-L9	1hr5.5hrs16hrs24hrs24hrs48hrs48hrs72hrs	219065-42472164	峰1底物存在峰1无底物峰1少量底物残留峰1底物存在

                    实施例25

化合物13的Chirazyme-L2拆分的按比例放大。

使Chirazyme-L2拆分按比例放大至1g、30mg的酶和每个25mL的pH 6磷酸盐缓冲液和MTBE。反应物经处理后得到无色油状的0.212g，21％Th的化合物13。¹H NMR频谱显示存在显著量的从底物中一直带来的杂质。

在6g的规模上，使用同样的条件，于20℃得到淡黄色油状1.52g、25％Th的88％ee拆分的化合物3。¹H NMR还表示存在某些杂质。在较低温度，0℃时选择性有所改善。从5.25g的外消旋物开始，经4.5小时后，拆分反应得到1.48g、28％Th的92％ee化合物3。经确认其构型为需要的(R)-对映体。

最初，生物拆分在适度的浓度，20g/L下进行。为了研究增大的体积效能的作用，拆分在1g规模下，于50r/L、0℃在pH 6磷酸盐缓冲液和MTBE中重复。4.5hrs后，生物转化得到淡黄色油状0.44g、92％ee的44％Th的物质。由此推断在选择性没有明显损失下可改善体积效能。

从这些过程中得到的产物纯度是低的。几种杂质是从外消旋物中一直带来的。对于适度的选择性的生物拆分，可任选增加转化以得到高的残留酯的对映体纯度。流程14中所示的杂质之一，羟基乙醛的2-甲基丙酸酯存在于外消旋物中。然而还不清楚其是否也如以下概述的那样，产生于生物拆分中。

                  流程14：杂质的形成

为了确定在生物转化中是否有任何额外的醛产生，使用经蒸馏的不含醛的内酯在同样的规模(1g)上重复拆分反应。该反应得到0.29g(29％)的93％ee产物。¹H NMR频谱显示存在醛；显然该物质是在反应过程中或后处理时产生的。

变换溶剂为甲苯导致较慢的、但更多选择性的拆分。在1g规模上，以50g/L，22.5小时处理反应得到0.30g、30％得率的＞99％ee酯。将浓度进一步提高至200g/L，于0℃，使用4g的外消旋物，在各10mL的pH 6的磷酸盐缓冲液和甲苯中。此过程是高容量效应的(highly volume efficient)，没有遇到问题。17小时后，生物转化得到1.11g、28％的95％ee产物。

几个反应在稍大的规模(2-10g)上使用不同的酶负荷和反应时间进行；结果总结于下表10中。反应速率完全不可预测。几个因素可能与此有关，包括具有不同杂质纯度特性(profiles)的不同批次的外消旋物和与双相的溶剂-固定化酶系统混合的差异。由于杂质是从外消旋物一直带过来的，所以得率可能会被误解。已发现在此规模上，硫代硫酸盐、碳酸氢盐和酸性洗涤剂并不显著降低醛杂质的量。后处理程序需要某种净化，但是在此阶段所希望的是在拆分后将适合的洗涤和Kugelrohr蒸馏(有刻度的刮板式薄膜(wiped-film on scale))的组合将是有效的。此后在更大规模上研究。所有这些生物转化所用到的甲苯缓冲液双相系统在200g/L。

              表10：化合物3的Chirazyme-L2拆分

条目	酶负荷/wt.％	规模/g	时间/小时	得率％	ee/％
						12345	1222.510	4821010	1121647154	19222920未测得	987393＞9996

该过程按比例放大至30g，于0℃使用10wt.％的酶200g/L。经Kugelrohr蒸馏后，回收4.2g的＞95％ee的酯。

如在较早时所讨论的，外消旋物的纯度对于生物转化后可得到的质量和得率至关重要。此外，难以确定具有精确转化的拆分的真实的选择性。这是从对映体过量数据中难以获得的，因为生物拆分的产物不能被分离；可利用的惟一信息是残留的底物的对映体过量。选择性的概念来自酯的得率，但如同被杂质污染一样，准确性存在怀疑。

当考虑最终的过程时，使用粗外消旋物和生物拆分后纯化，如经刮板式薄膜蒸馏可能是有利的。然而，杂质可能抑制酶。研究一种这样的使用非常粗的底物的方法的可能性；在生物拆分中，使用含约1g的底物的含DME的外消旋物、水和其他杂质的混合物。在生物转化中没有消耗碱，所以加入额外的酶。16小时后移去等分试样并发现为外消旋物。这些结果将提示酶被存在于混合物中的杂质“杀灭”。因此，在一个实施方案中，底物的纯化优选先于生物拆分。

                      实施例26

在2-丙醇-水中的生物转化

如在较早时所提到的，底物的稳定性是个潜在的问题。不能排除其中内酯对乙醇酸的和羟基乙醛的2-甲基丙酸酯开放的背景程序(流程15)。

                 流程15：内酯的开环

酶对化合物13的作用模式还不清楚。生物拆分后可检测的惟一产物是羟基乙醛的2-甲基丙酸酯和乙醇酸。然而对于脂肪酶的通常的作用模式是水解酯；这将生成内酯和2-甲基丙酸(流程16)。该内酯醇产物未能检测，因为分解为乙醇酸和羟基乙醛。如果这个机制是正确的话，则酯化的醛必须来自羟基乙醛与2-甲基丙酸的反应。备选的机制是该酶可直接作用以打开内酯而不先裂解酯。此内酯环被打开的作用模式已在对肝酯酶中观察到(例如见：E.Fouque和G.Rousseau synthesis 1989，661；和P.Barton和M.I.Page J.Chem.Soc.，Perkin Trans.2，1993，2317)，但在此情况下或许是不太可能的。

              流程16：可能的反应机制

生物转化中的添加剂的应用已被广泛报道用于增强选择性，但是他们的对于对映体过量的作用常常不可预测。例如见：T.V.Hansen，V.Waagen，V.Partali，H.W.Anthonsen和T.Anthonsen，TetrahedronAsymmetry 1995，6，499；G.Duan和J.Y.Chen，Bioteclnology Letters1994，16，1065；N.W.Boaz和R.L.Zimmerman，Tetrahedron Asymmetry1994，5，153以及K.Faber，G Ottolina和S.Riva，Biocatalysis 1993，8，91。作用模式也常不清楚；添加剂可能用作相转移催化剂，用作酶改性剂，或用作对水的备选品或用作亲核试剂。在(-)-2′，3′-二脱氧-5-氟代-3′-硫代胞嘧啶(thiacytidine)(FTC，也已知为Coviracil^TM和恩曲他滨)的拆分中，发现醇∶水混合物对于正常的双相系统或主要为水的系统是好的备选品。可以预想，这在化合物13的拆分中，对于酶的选择性和底物的稳定性两者可能也是有效的。这个假设经用1g的化合物13，与3wt.％的酶，100gL^-1在8∶22-丙醇∶水溶剂系统中进行检验。47小时后反应得到0.47g、47％Th的＞98％ee物质。

2-丙醇-水中的最初的结果看上去非常好，尽管水和醛可有助于得率。在大规模上，加上蒸馏纯化产物得到更有意义的结果。使用刮板薄膜蒸馏蒸馏外消旋物。条件为30g的外消旋物在9∶1的2-丙醇(IPA)-水(200gL^-1)，酶负荷为5wt.％。10小时后过滤此反应物并于真空中还原。测得对映体过量为94％。将该物质分成两批以研究纯化方法。于133℃/1.3托下使用Kugelrohr仪器蒸馏第一份得到两个所需的部分：

部分1：10.8g，含61％醛、31％的化合物3和未测得量的乙醇酸。于80℃/4-5托下进一步蒸馏以除去醛，水洗得到4.4g的化合物3，90％纯的物质(含4％d醛)。

部分2：2.7g不含醛但含显著量的乙醇酸和化合物3。水洗后，得到91％纯(经GC)的1.8g的化合物3。

在于140℃/1.6托下蒸馏之前生成粗物质的第二份水洗物，随后于60℃/1.6托下除去醛，得到89％纯度的5.2g物质，含6％醛。

因此总共生成11.4g的90％纯度的2-甲基丙酸酯，94％ee，相应于非常好的38％的总得率。此方法明显优于用甲苯∶缓冲液的方法，再优化可提供有效的路径以生成光学纯的内酯。

                      实施例27

实验性—在2-丙醇∶水中用Chirazyme-L2对30g化合物13拆分

于0℃，向500mL夹套容器内装填2-丙醇(135mL)、水(15mL)，和外消旋的化合物13(30g，DB/1005/85/1)。搅拌该混合物并加入Chirazyme-L2(1.5g，5wt.％)至该混合物中。在等量移开溶液的间隔测量ee_s，用乙酸乙酯萃取，干燥(MgSO₄)，用手性GC分析。10h后，ee_g为93％。在将混合物经C盐过滤后不久，于真空中浓缩得到淡黄色油状32.1g的粗化合物3。然后将所述油溶解于甲苯中，浓缩(2×250mL)，以共沸法除去任何水。粗得率为29.4g、98％；ee 94％。

将所述油分成两份。第一份使用Kugelrohr仪器于133℃/1.3托下蒸馏，共得到三个部分。部分1(主要为挥发性的)含10.8g的61％醛、31％内酯和8％其他杂质。部分2含2.7g的被显著量的乙醇酸污染的内酯。部分3含黄色低挥发性杂质。将部分2溶解于甲苯(200mL)中，用水(200mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，于真空中浓缩得到1.8g的化合物13，为经GC测得91％纯度的无色油(没有发现醛)。然后通过于80℃/4-5托进行Kugelrohr蒸馏将部分1中的大部分醛除去，得到作为残留物的6.1g的含约12％醛和未测得量的乙醇酸的内酯。然后将此物质溶解于甲苯(200mL)中，用水(200mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，于真空中浓缩得到无色油样4.4g的纯度为90％的化合物3，经GC测定4％的醛。

将第二份物质溶解于甲苯(200mL)中，用水(200mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，于真空中浓缩。然后于140℃/1.6托下，用Kugelrohr仪器蒸馏所得的油，除去低挥发性杂质，然后于60℃/1.3托下再蒸馏以除去任何残留的醛。从此蒸馏中回收的物质经GC测定为5.15g的89％纯度，6％醛。

总得率：11.4g，38％；GC纯度：90％

                    实施例28

微生物酶筛选。

如对化合物11和12，在96孔培养板上筛选化合物13。经手性GC分析样品；必须注意的是所用的高通量的手性GC方法仅可得到近似值。筛选的结果以图3E表示。

大量的株显示对化合物13的活性，在GC色谱法中发现对于峰1和2两者均具选择性。那些生成对映体过量＞40％ee的株示于表21中。

                    表21：化合物13的微生物筛选

CMC号	株	底物ee/％	备注
				103127103869103355103032103063103071103095103134103146103188103322103419103422103423103669103777103780103405103785103869103331103587103774	液化沙雷氏菌未鉴定的未鉴定的地衣芽孢杆菌未鉴定的未鉴定的诺卡氏菌(Nocardia sp.)未鉴定的假单胞菌恶臭假单胞菌产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)不动杆菌未鉴定的未鉴定的未鉴定的未鉴定的链霉菌(Streptomyces sp.)未鉴定的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)未鉴定的皱落假丝酵母(Candida rugosa)葡萄球菌(Staphylococcus sp.)肉桂链轮丝菌属(Streptoverticilliumcinnamoneus)	4244544374755448464670817971515049628792406587	峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰2峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰1峰2

从初步筛选的结果中，将那些显示对峰1具最好的选择性和好的峰面积的株再筛选。将再次证实其活性的株示于表22中。

      表22：对化合物3的株的再筛选

CMC号	株	底物ee/％
			103063103127103373103419103552103606103635103661103777103869	未鉴定的液化沙雷氏菌不动杆菌不动杆菌未鉴定的琼氏不动杆菌未鉴定的S.cerevisiae未鉴定的未鉴定的	45414114312144471865

                    实施例29

针对CMC 103869 & 103661的生物转化的按比例放大。

从筛选中，选择两株用于按比例放大。它们是CMC 103869(未鉴定)和CMC 103661(S.cerevisiae)。使两者的培养液生长，并将收集的细胞糊于-20℃储藏。设定生物转化规模为30mL，使用pH和温度一起控制。最初的生物转化在0.1M Tris-HCl、pH 7中进行。观察到差的对映体过量和底物的稳定性，可能由于高的pH。降低pH至6部分提高选择性，但是底物稳定性仍然是个问题。将缓冲液改变为50mM KH₂PO₄，pH 6，进一步提高对映体过量。对两株结果概括于图4中。用CMC 103869对化合物13的拆分生成70％ee的残留的酯。采用CMC 103361的结果令人失望，因此弃用此株未进行进一步的研究。对于所有的生物转化，观察到残留的底物的损失，可能或者由于第二个酶或者底物于25℃时的差的稳定性。最终，通过将温度降低至10℃，选择性增加至≥95％ee，然而随着时间的推移仍有底物的总的损失。转化率和因此的绝对选择性未知。

使CMC 103869生长在TSB培养基和CMC 103661生长在烧瓶的YM培养基中。此两株均在25℃生长，经离心(4℃下2000g离心20分钟)收集细胞。将细胞糊储藏于-20℃。于温度和pH控制(用1N NaOH)下、在带有磁力搅拌器的200mL夹套容器中进行生物转化。将细胞糊再悬浮于10％w/v的或者0.1M Tris-HCl缓冲液(调节至所需的pH)或者50mM KH₂PO₄，pH 6的溶液中。将底物、缓冲液和细胞糊加入至该容器中，取样通过稀释到MTBE中用于手性GC分析。

                    实施例30

                    化合物4

用于化合物4的分析方法的开发

复制以产生拆分的用于手性分析HPLC的分析方法的条件显示于下列色谱图中：

HPLC条件：

柱：Chiralcel OJ

尺寸：250×4.6mm

流动相：85％庚烷

        15％EtOH

流速：1.0mL/min

检测：UV@254nm

保留时间：1-7.47分钟

          2-11.16分钟

在此分析条件下，对映体的峰形有点宽(图1K)，因而试图改善此分析。通过应用超临界液相色谱法(SFC)可实现这一点，在4分钟内两个异构体均产生完全拆分的尖峰。见图1L。

优化的SFC条件：

柱：Chiralcel OJ(250×4.6mm)

流动相：95％CO₂、5％MeOH

流速：3.0mL/min

压力：3000psi

柱温：35℃

保留时间：1-2.73分钟[(-)-对映体]

          2-3.28分钟[(+)-对映体]

化合物4的生物拆分

在化合物1的生物转化的研究期间，已经发现该物质易于受非酶促水解的影响。这可能是由于化合物1对于水解的高不稳定性和假定的内酯-醇产物的不稳定性所致，该生物转化的可能途径是在丁酸酯的皂化之前打开内酯。如果这是真的，那么酶促拆分化合物4应该是可能的。因此于20℃用在甲苯-pH 7缓冲液中的脂肪酶PS、PPL、M、MY和SAWA固定化脂肪酶测试化合物4的反应性。没有观察到反应(TLC，24个小时)。酶促反应大概是通过首先裂解丁酸酯，然后可能打开内酯来进行的。

外消旋混合物(Conglomerate)的研究

将外消旋物的IR光谱和化合物4的单一的对映体比较，发现是相似的，但不一样。

然后用差示扫描热量测定法(DSC)测定这些化合物的每个的熔点，发现得到外消旋物的熔点起点为91.7℃而(-)-对映体(98.7％ee)的为81.1℃。比较这些熔点显示外消旋物比单一的对映体具有较高的熔点。就化合物是外消旋混合物而言，外消旋物和单一对映体的IR光谱必须是一致的，且外消旋物的熔点在相位图上需要在最低点上。因此，该化合物显然不是外消旋混合物。

随后，构建对于化合物4的相位图。确定低共熔点(eutectic)的位置，在此点之上，该化合物的ee可通过结晶法增强对映体的纯度。这个相位图信息是通过分析10％ee增量的不同的对映体过量的样品的熔点(还是用DSC)得到的。这些样品最初通过使需要量的外消旋物和单一的对映体溶解于丙酮中并除去溶剂制备。此方法对于10％ee、80％ee和90％ee的样品是成功的，其DSC痕量仅含一个峰。然而，对于所有的其他样品，经DSC(可能是由于多形体)发现有两个峰。用于制备这些样品许多方法试图解决这个问题。这些方法包括熔化样品、使之溶解于丙酮中和于65℃加热O/N，熔化和于65℃加热过夜以及使用二氯甲烷作为溶剂；但是DSC仍然产生两个峰。因此经由此方法不能确定相位图/低共熔点。另外，因为化合物是非常易溶解的，仅1g的外消旋物和每个单一的对映体都是可获得的，所以排除溶解性研究。然而，因为外消旋物和单一的对映体样品经DSC仅给出一个峰，所以对于这些样品的熔点和焓值是可测定的。这允许在理论上构建相位图(J.Jacques，A.Collet和S.H.Wilden，Enantiomers，Racemates and Resolutions，New York：Wiley，1981)。

使用熔点和纯对映体的熔化的焓，使用Schroder-Van Laar方程式可计算纯对映体和对于纯外消旋化合物的低共熔点之间的液相线曲线：

$\ln x=\frac{{\mathrm{\ΔH}}_A^f}{R}(\frac{1}{T_A^f}-\frac{1}{T^f})$

摩尔分数；    0.9        T_f＝351.64K        78.64℃

              0.8        T_f＝346.60K        73.60℃

              0.7        T_f＝341.05K        68.05℃

              0.6        T_f＝334.86K        61.86℃

然后，使用下列方程式(Prigogine-Defay)可确定在此曲线下的由纯外消旋化合物组成的固体相的部分：

$\ln 4x(1-x)=\frac{2{\mathrm{\Δ}}_R^f}{R}(\frac{1}{T_R^f}-\frac{1}{T^f})$

摩尔分数；    0.9        T_f＝349.26K        76.26℃

              0.8        T_f＝360.81K        87.81℃

              0.7        T_f＝366.53K        93.53℃

              0.6        T_f＝369.41K        96.40℃

其中：

x＝熔点温度在T^f(K)的混合物的大多数丰富的对映体的摩尔分数(0.5≤x≤1)

R＝8.31(J.K^-1.mol^-1)。

然后将这两条曲线画在同一图上得到相位图。曲线经过的点为低共熔点，在该案中为77.5％ee。见图4。

                       实施例31

用于DAPD的分析方法的开发

为了分析DAPD的酶促酯化筛选，开发用于顺式-DAPD和其丁酸酯的手性分析方法。见图1M。

用于DAPD的SFC条件：

柱：Chiralpak AD

尺寸：250×4.6mm

流动相：70％CO₂、30％MeOH与0.1％TEA

流速：3.0mL/min

压力：3000psi

柱温：35℃

检测：UV@254nm

保留时间：1-3.57分钟

          2-5.64分钟

为了监测用于DAPD原料的生物转化的过程，以上分析被改良为包括DAPD和丁酸酯两者的基线拆分。见图1N。条件和色谱图如下：

用于DAPD和丁酸酯的SFC条件：

柱：Chiralpak AD

尺寸：250×4.6mm

流动相：80％CO₂、20％MeOH与0.1％TEA

流速：3.0mL/min

压力：3000psi

柱温：35℃

检测：UV@254nm

保留时间：1-4.49分钟    2-5.90分钟

          3-9.18分钟    4-11.0分钟

DAPD的酶促拆分

使用丁酸乙烯基酯进行目的在于通过酯基转移作用拆分顺式-DAPD的异构体的限制性酶筛选。基于已知的酯基转移作用活性选择酶。用于研究的溶剂为甲苯(不溶性底物)、DMF和吡啶(可溶性底物)。反应经TLC监测，对映体过量经超临界液相色谱法(SFC)(Chiralpak AD)测量。如所证实的，对映体过量也使用HPLC分析(100％MeOH，Chiralpak AD)测量，并与SFC结果一致。

对于每一种酶：向外消旋的顺式-DAPD(TP0041/97/D-1，10mg，0.04mmol)中加入溶剂(1mL)(甲苯，DMF或吡啶，见表13)、丁酸乙烯基酯(0.1mL，0.8mmol)，然后加入酶(5-10mg)。小瓶于30℃在培养箱中振摇，经等量移去50μL、以甲醇稀释，进行周期性地检测，经TLC(10∶1∶0.1 EtOAc∶MeOH∶H₂O)和手性分析。表23显示得到的结果。

                           表23：对于DAPD的酰化的酶促筛选

酶	溶剂	时间	ees	eep	备注
						Chirazyme-L2	甲苯	2h	4％	7％	1个产物(＜50％转化)
	20h	8％	10％	2个产物(～50％转化)
					Chirazyme-L9		甲苯	2h	rac	18％	1个产物(＜50％转化)
	20h	rac	10％	2个产物(～50％转化)
						脂肪酶AY	甲苯	2h	7％	3％	1个产物(～50％转化)
	20h	11％	6％	1个产物(＞50％转化)
					脂肪酶AK		甲苯	2h			无反应
	20h	rac	rac	1个产物(＜50％转化)
						脂肪酶PS	甲苯	2h	rac	12％	1个产物(＜50％转化)
	20h	rac	14％	1个产物(＜50％转化)
					Alcalase(固定化)		DMF	2h			无反应
	20h	9％	10％	1个产物(＜50％转化)
						枯草杆菌蛋白酶carlsberg型VII	DMF	2h			无反应
	20h	rac	rac	1个产物(＜50％转化)
					PeptiCLEC-BL		吡啶	2h	-	rac	1个产物(100％转化)
吡啶(比上面的酶少)	2h	rac	10％	1个产物(＜50％转化)
						PeptiCLEC-BL	甲苯	4h	rac	rac	1个产物(＜50％转化)
	24h	rac	12％	1个产物
					蛋白酶N		甲苯	24h			无反应
	DMF	24h	rac	11％		1个产物(＜50％转化)
					PLE		甲苯	24h			无反应
PPL	甲苯	24h				无反应

示于表23的结果显示，虽然发生DAPD的酯化作用，但其不是对映异构选择性的反应。TLC显示在某些情况下形成一种以上的产物。然而，对于PeptiCLEC-BL和脂肪酶AY，在快速反应中，只有所需的丁酸酯形成，因而这些将是具区域选择性的优良的酶并且温和地将酯置于氧上。

Claims (17)

1.一种制备基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷的方法，它包括：

a)得到酯化的式(Ia)或(Ib)的2，2-二烷氧基乙醇；

其中：

每个R¹独立为烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烷芳基、烷基杂芳基或烷基杂环基或芳烷基；和

R²为任何适合的可离去基团；

b)以乙醇酸使酯化的式(Ia)或(Ib)的2，2-二烷氧基乙醇环化得到式(II)1，3-二氧戊环内酯：

c)拆分式(II)的1，3-二氧戊环内酯得到基本纯的D-或L-内酯；

d)用还原剂选择性地还原和活化基本纯的D-或L-手性内酯，得到基本纯的式(III)的D-或L-1，3-二氧戊环：

其中L是适合的离去基团；

e)使基本纯的式(III)的D-或L-1，3-二氧戊环偶合至活化的和/或保护的嘌呤或嘧啶碱或其衍生物上，得到基本纯的保护的式(IV)的D-或L-1，3-二氧戊环核苷的α∶β混合物：

其中B是嘌呤或嘧啶碱或其衍生物；

f)任选纯化基本纯的保护的式(IV)的D-或L-1，3-二氧戊环核苷的α∶β混合物，得到基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷；和

g)任选使基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷去保护，得到基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷。

2.权利要求1的方法，其中所述基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷是β-D-DAPD。

3.权利要求1的方法，其中步骤(b)中存在Lewis酸。

4.权利要求3的方法，其中的Lewis酸是BF₃·Et₂O。

5.权利要求1的方法，其中在步骤(d)中的还原剂是LiAlH(OtBu)₃。

6.权利要求1的方法，其中适合的离去基团选自O-酰基、OAc、卤素、甲磺酰氧基和甲苯甲酰氧基。

7.权利要求1的方法，其中R²是异丁酰基或对甲氧基苯甲酰基。

8.权利要求1的方法，其中活化的和/或保护的嘌呤或嘧啶碱或其衍生物是活化的2，6-二氯嘌呤。

9.权利要求1的方法，其中所述基本纯的保护的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷被去保护。

10.权利要求1的方法，其中所述酯化的式(Ia)的2，2-二烷氧基乙醇被水解为相应的式(Ib)醛。

11.权利要求1的方法，其中当R²是对甲氧基苯甲酰基时，酯化的式(Ia)的2，2-二烷氧基乙醇被水解为相应的式(Ib)醛。

12.权利要求1的方法，其中所述酯化的式(Ia)2，2-二烷氧基乙醇不水解为相应的式(Ib)醛。

13.权利要求1的方法，其中当R²是异丁酰基时，酯化的式(Ia)2，2-二烷氧基乙醇不水解为相应的式(Ib)醛。

14.权利要求1的方法，其中式(II)1，3-二氧戊环内酯的拆分使用手性色谱法完成。

15.权利要求1的方法，其中式(II)1，3-二氧戊环内酯的拆分使用酶拆分法完成。

16.权利要求1的方法，其中所述基本纯的β-D-或β-L-1，3-二氧戊环核苷选自式A至D：

及其药学上可接受的盐或酯，其中：

R独立为H、卤素、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂、C₁-C₄低级烷基、CH₃、CH＝CH₂、N₃C＝CH₂、CO₂H、CO₂R′、CONH₂、CONHR′、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CF₃、CH₂CH₂F、CH＝CHCO₂H、CH＝CHCO₂R′、CH＝CHCl、CH＝CHBr或CH＝CHI；

每个R′独立为C₁-C₄低级烷基；

Z或者为CH或者为C-X；和

每个X和Y独立为H、卤素、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂或CH₃。

17.一种制备基本纯的β-D-DAPD的方法，它包括：

a)提供式(a)化合物：

其中每个R¹独立为烷基、芳基、杂芳基、杂环基、烷芳基、烷基杂芳基或烷基杂环基或芳烷基；

b)将式(a)化合物转化为式(b)化合物：

其中R独立为H、卤素、OH、OR′、OCH₃、SH、SR′、SCH₃、NH₂、NHR′、NR′₂、C₁-C₄低级烷基、CH₃、CH＝CH₂、N₃C＝CH₂、CO₂H、CO₂R′、CONH₂、CONHR′、CH₂OH、CH₂CH₂OH、CF₃、CH₂CH₂F、CH＝CHCO₂H、CH＝CHCO₂R′、CH＝CHCl、CH＝CHBr或CH＝CHI；

c)使式(b)化合物环化为外消旋的式(c)的1，3-二氧杂环戊烯酮内酯：

d)使式(c)化合物拆分为手性的式(d)二氧戊环内酯；

e)使手性的式(d)二氧戊环内酯乙酰化为手性的式(e)二氧戊环乙酸酯；和

f)使式(e)化合物偶合至活化的和/或保护的腺嘌呤碱上；和

g)任选使步骤(f)的化合物纯化和去保护，得到β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环。

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