KR101157468B1 - 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법 - Google Patents

1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101157468B1
KR101157468B1 KR1020067017856A KR20067017856A KR101157468B1 KR 101157468 B1 KR101157468 B1 KR 101157468B1 KR 1020067017856 A KR1020067017856 A KR 1020067017856A KR 20067017856 A KR20067017856 A KR 20067017856A KR 101157468 B1 KR101157468 B1 KR 101157468B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dioxolane
formula
compound
substantially pure
lactone
Prior art date
Application number
KR1020067017856A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070085075A (ko
Inventor
마르코스 스즈나이드만
죠지 알. 파인트
다르릴 지. 클리어리
메르릭 알. 알몬드
아미르 피스얀
Original Assignee
에모리 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에모리 유니버시티 filed Critical 에모리 유니버시티
Publication of KR20070085075A publication Critical patent/KR20070085075A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101157468B1 publication Critical patent/KR101157468B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings
    • C07D317/32—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D317/34—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 거울상 이성질체적으로 순수한 β-D-디옥솔란 뉴클레오시드를 제조하기 위한 과정을 제공한다. 특히, 대규모 전개에 적합한, (-)-DAPD의 신규 합성이 바람직하다. 일 구현예에서, 본 발명은 a) 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올을 제조하거나 수득하고; b) 글리콜산으로 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올을 고리화시켜 1,3-디옥솔란 락톤을 수득하며; c) 1,3-디옥솔란 락톤을 용해시켜 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하고; d) D- 또는 L-키랄성 락톤을 선별적으로 환원시키고 활성화시켜 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 수득하며; e) D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 활성화된 및/또는 보호된 퓨린 또는 피리미딘 염기에 연결하고; f) 뉴클레오시드를 임의로 정제하여 실질적으로 순수한 보호된 β-D 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하는 것을 포함하는, 실질적으로 순수한 β-D 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 제조방법을 제공한다.

Description

1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법{Method to Manufacture 1,3-Dioxolane Nucleosides}
선출원에 대한 참조
본 출원은 2004년 2월 3일 출원된 "1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법"이란 명칭의 미국 가출원 60/541,545에 대한 우선권을 주장한다.
본 출원은 거울상 이성질체적으로 순수한 β-D-디옥솔란 뉴클레오시드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 대규모 개발에 적합한, (-)-DAPD의 신규 합성이 기재된다.
AIDS, 후천성 면역결핍증은 세계적인 규모에 도달한 비극적인 질환이다. 현재, 전세계적으로 대략 4천만 인구가 AIDS에 걸려있으며, 약 5백만 인구가 매년 새롭게 감염되고 있다. 전세계적으로, 매년 사망자수는 여전히 3백만명 이상이다. 심각한 인간 건강문제를 야기하는 다른 바이러스는 B형 간염 바이러스 (HBV)이다. HBV는 인간암의 원인으로 담배에 버금가는 것이다. 몇몇 평가에 따르면, 만성적으 로 감염된 대략 4천만명과 함께, 전세계적으로 2백만명 정도에서 전세계 인구의 3분의 1까지로 높게 다수의 사람이 HBV에 감염되어 있다.
다수의 2',3'-디데옥시뉴클레오시드는 HIV 및/또는 B형 간염 바이러스에 대한 중요한 항바이러스제인 것으로 밝혀졌다. 세포성 카이네이즈에 의한 5'-트리포스페이트로의 세포성 인산화반응 후에, 상기 합성 뉴클레오시드는 바이러스성 DNA의 성장 나선 (growing strand)으로 삽입되어, 3'-하이드록실 그룹의 부재로 인한 사슬형성 종결 (chain termination)을 야기한다.
뉴클레오시드의 3'-탄소가 이종원자 (heteroatom)로 치환되는 뉴클레오시드 유도체의 합성에도 관심이 있다. 3TC 및 그의 5-플루오로시토신 유사체 (FTC) 모두 HIV 및 HBV에 반하는 활성을 나타낸다 (Furman, et al., Antimic. Ag Chemo., 1992, 2686-2692; 및 Cheng, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267 (20), 13938-13942).
라세미 옥사티오란 뉴클레오시드 BCH-189가 HIV의 복제에 반하는 활성을 가지고 있다는 발견은 Chu 등으로 하여금 키랄성 산물 (+)- 및 (-)-BCH-189를 합성하게 독려하였다 (Belleau, et al., 5th International Conference on AIDS, Montreal, Canada, June 4-9, 1989, #T.C.O. 1; Chu, et al. Tetr . Lett ., 1991, 32, 3791). 달리 3TC 또는 에피비르로 알려진, 후자 화합물, 라미부딘은 현재 HIV 감염 및 HBV 감염 모두의 치료에 있어서 임상적으로 사용되고 있다. 5-플루오로시토신 옥사티오란 유사체 (FTC)의 (-) 거울상 이성질체는 특히 HIV에 반하는활성을 가지고 있다 (Choi, W. et al., J. Am . Chem . Soc ., 1991, 113, 9377; Schinazi, R.F., et al., Antimic . Ag . Chemo . 1992, 2423; 미국 특허번호 5,204,4665; 5,210,085; 5,914,331; 및 5,639,814).
상기 기재된 1,3-옥사티오란 뉴클레오시드는 1,3-옥사티오란 중간체로 실릴레이트된 퓨린 또는 피리미딘 염기의 축합반응에 의해 제조된다. 미국 특허번호 5,204,466는 실질적으로 완벽한 β-입체 선택성을 제공하는, 루이스 산 (Lewis acid)으로 염화주석 (tin chloride)을 사용하여 실릴레이트된 피리미딘으로 1,3-옥사티오란을 축합하는 방법을 기재하고 있다. 다수의 미국특허는 실리콘-기반 루이스 산의 존재하에, 보호된 실릴레이트화 염기를 이용한 1,3-옥사티오란-2-카르복시산 에스테르를 축합시키고, 에스테르를 해당하는 하이드록시메틸 그룹으로 환원시켜, 최종산물을 수득함으로써, 1,3-옥사티오란 뉴클레오시드를 제조하는 방법에 관하여 기재하고 있다 (미국 특허번호 5,663,320; 5,693,787; 5,696,254; 5,744,596; 5,756,706 및 5,864,164 참조). 또한, 상기 특허는 해당하는 1,3-디옥솔란 중간체를 사용하는 유사한 방식으로 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 합성을 위한 일반적인 상세한 설명을 함유하고 있다.
미국 특허번호 5,272,151은 티타늄 촉매의 존재 하에, 실릴레이트된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 이용한 축합반응을 통해 뉴클레오시드를 제조하기 위하여, 2-O-보호-5-0-아실화-1,3-옥사티오란을 사용하는 방법을 기재하고 있다. 미국 특허번호 6,215,004는 루이스 산 촉매없이, 실릴레이트된 5-플루오로시토신을 이용하여 2-O-보호-메틸-5-클로로-1,3-옥사티오란을 축합시키는 것을 포함하는 1,3-옥사티오란 뉴클레오시드의 제조방법에 관해 기재하고 있다. 이러한 경우, 1,3-옥사티오란 링은 하기 방법 중 하나에서 제조된다: (i) p-톨루엔술폰산의 존재 하에, 톨루엔에 든 머캅토아세트산을 이용하여 글리옥실레이트 또는 글리콜산에서 유도된 알데하이드의 반응에 의해 5-옥소-1,3-옥사티오란-2-카르복시산을 제공하는 것; (ii) 톨루엔에서 환류시키면서 2-머캅토아세트알데하이드 디에틸아세탈 (diethylacetal)을 이용한 무수물 글리옥실레이트의 결정화를 통해 5-에톡시-1,3-옥사티오란 락톤을 제공하는 것; (iii) 머캅토아세트알데하이드 (이량체 형태)를 이용한 글리옥실산 에스테르의 축합반응을 통해 5-하이드록시-1,3-옥사티오란-2-카르복시릭 에스테르를 제공하는 것; 또는 (iv) 2-머캅토아세트알데하이드의 이량체 형태, 2,5-디하이드록시-1,4-디티안을 이용하여 아실옥시아세트알데하이드를 커플링시켜, 2-(아일옥시)메틸-5-하이드록시-1,3-옥사티오란을 형성하는 것. 락톤, 5-옥소 화합물은 상기 과정동안 해당하는 락톨로 환원되어야 한다. 또한, 2-카르복시산 또는 그의 에스테르는 보란-메틸설파이드 복합체를 이용하여 해당하는 2-하이드록시메틸 유도체로 환원되어야 한다.
중요한 중간체, 알데하이드는 여러가지 방법에 의해 제조될 수 있다: (i) 1,4-디-O-벤조일 메소-에리스리톨, 1,6-디-O-벤조일 D-만니톨 또는 1,5-디-O-벤조일-D-아라비톨의 납 테트라아세테이트 산화 (lead tetraacetate oxidation); (ii) 모노아실레이트화 에틸렌 글리콜의 제조 이후 알데하이드로의 산화; (iii) 에틸렌 클로로하이드린의 아실화 이후 디메틸설폭사이드 산화; (v) 납 테트라아세테이트 산화; (vi) 알릴 또는 3-메틸-2-부텐-1-올 아실레이트의 가오존 분해; (vii) 그리고 더욱 최근에, 2-부텐-1,4-디올의 아실화 이후 가오존 분해. 또한, 미국 특허번호 6,215,004는 2,2-디에톡시에탄올의 아실화에 의한 아실옥시아세트알데하이드 디에틸아세탈의 제조방법을 기재하고 있다.
Norbeck, D. W. 등은 (±)-1-(2β,4β)-2-(하이드록시메틸)-4-디옥소라닐-티민의 합성에 의해 C4' 원자에 대한 부분입체 이성질체의 라세미 혼합물이 생성된다는 것을 보고하였다 (Norbeck, D. W., et al. Tet. Lett., 1989, 30, 6263). 산물의 X-레이 결정 분석 결과, 디옥솔란 링이 내향 위치 (endo position)에서 O3' 원자와 함께, 리보뉴클레오시드에서 보편적으로 관찰되는 3T4 형태를 채택한다는 것을 발견하였으며, 이는 HIV에 반하는 잠재적인 in vitro 활성을 나타내는, AZT, AZDU, ddA, ddC, 및 3'-데옥시-3'-플루오로티미딘에서 발견되는 변형된 3E 형태와는 명확하게 다른 것이다.
디옥솔란 뉴클레오시드의 항바이러스성 활성은 잠재적인 항바이러스제 및/또는 항암제를 찾기 위하여, 일련의 유사체를 합성하도록 Chu 등을 독려하였다. 예를 들어, 9-(β-D 하이드록시메틸-1,3-디옥소라닐) 아미노퓨린(β-D-DAPD), 및 그의 대사물질 9-(β-D 하이드록시메틸-1,3-디옥소라닐)-구아닌 (β-D-DXG)은 인체 면역 결핍 바이러스 (HIV) 및 B형 간염 바이러스 (HBV)에 반하는, 잠재적이며 선별적인 활성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다 (Rajagopalan et al., Antiviral Chem. Chemother., 1996, 7 (2), 65-70). (-)-DAPD는 in vitro 및 in vivo 에서 HIV의 잠재적이며 선별적인 억제제이고, in vitro 에서 HBV 복제의 잠재적이며 선별적인 억제제이다 (Furman, et al. Drugs of the Future 2000, 25 (5), 454-461). 유사하게, 1-(β-L 하이드록시메틸-1,3-디옥소라닐)-티민 (디옥솔란-T) (Norbeck et al., Tet. Let., 1989, 30, 6263-66)은 항-HIV 및 항-HBV 활성을 가지고 있다. 1-(β-L 하이드록시메틸 3-디옥소라닐)-사이티딘 (β-L-OddC)은 인간 전립샘 뿐만 아니라 신장암종 (renal carcinoma)에 대하여 잠재적인 항-종양 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다 (Kadhim et al., Can. Cancer Res., 57 (21), 4803-10, 1997). (-)-(2'S,4'R)-1'-[2'-(하이드록시-메틸)-1',3'-디옥솔란-4'-일]-5-아이오도우라실) L-IOddU는 최근 항바이러스제 또는 항암제로서 그의 가치를 평가하기 위한 임상전 및 임상 연구에 이용되고 있다 (Kim, et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 519-528 및 그의 참고문헌; Corbett, & Rublein, Curr. Opzn. Investig Drugs 2001, 2, 348-353; Gu, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43, 2376-2382; Mewshaw, et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2002, 29, 11-20).
Belleau 등의 US 5,270,315 및 US 5,041,449는 라세미 2-치환-4-치환-1,3-디옥솔란의 일반적인 그룹을 기재하고 있다. 참고문헌의 표 1은 2개의 라세미 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 - 시토신 염기를 가진 라세미 트랜스 (α) 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 (화합물 XII) 및 아데닌 염기를 가진 라세미 시스 (β) 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 (화합물 XIV)에 대한 데이타를 나타낸 것이다 (IAF BioChem International의 EP 0 337 713 참고).
1989년 6월, Belleau 등은 3'-위치에서 산소 및 황을 함유한 사이티딘 뉴클레오시드의 합성 방법을 보고하였다 (Belleau, B., et al. Fifth International Conference on AIDS, Montreal; International Development Research Centre: Ottawa, Ontario, 1989; T.C.O.1.). 디옥솔란 링은 글리세린을 이용한 RCO2CH2CHO의 축합반응에 의해 제조된다. 상기 합성에 의해 뉴클레오시드의 C4' 탄소에 대한 부분입체 이성질체의 라세미 혼합물이 생성된다. 라세미 DAPD는 도식 1에 나타난 바와 같이 합성되었다.
Figure 112006063532414-pct00001
도식 1
Belleau 등은 글리세롤과 클로로아세트알데하이드를 반응시켜, 디옥솔란 중간체를 생성시켰다. 벤조산 염을 이용한 클로린 치환 이후, 카르복시산으로의 1차 알코올의 산화 및 m-클로로페르벤조산을 이용한 바이엘-빌리거 자리옮김 (rearrangement)에 의해 해당하는 라세미 디옥솔란 벤조에이트가 수득되었다. 그런 다음, 2-아미노-6-클로로퓨린을 이용하여 상기 화합물을 냉각시키고, 그 결과 생성된 뉴클레오시드 중간체를 압력하에 암모니아와 반응시켜 라세미 DAPD를 수득하였다. 또한, (±)-디옥솔란-T는 Choi 등에 의한 방법과 유사하게 합성되었다 (Choi, etal., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 9377-9378 및 미국 특허번호 5,852,027).
상기 기재된 바와 같이, 1989년 후반에, Norbeck 등은 in vitro 항-HIV 활성을 가지는 라세미 시스-1,3-디옥솔란티미딘의 합성을 기재한 논문을 발표하였다 (Norbeck, et al. Tet . Let . 1989, 30 (46), 6263-6266). 상기 산물은 벤질옥시알데하이드 디메틸아세탈 및 (±)-메틸 글리세레이트로부터 5단계에 걸쳐 합성되어, 79% 수율의 1:1 부분입체 이성질체 혼합물을 제공하였다. Belleau 합성과 함께, Norbeck 합성에 의해 뉴클레오시드의 C4' 탄소에 대한 부분입체 이성질체의 라세미 혼합물이 생성된다. 도식 2 참고.
Figure 112006063532414-pct00002
도식 2
동일한 라세미 디옥솔란 아세테이트 중간체는 시스-2-부텐-1,4-디올로부터 시작하여 Liotta 등의 방법에 의해 합성되었다 (Choi, et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113 (24), 9377-0379; 및 Wilson, et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3 (2), 169-174). 도식 3 참고.
Figure 112006063532414-pct00003
도식 3
도식 3에 나타난, 상기 과정의 단점은 불안정한 알데하이드의 합성 및 어려운 산화 단계에 관여한다는 것이다.
Chu 및 Schinazi의 US 5,179,104는 입체 특이적 합성을 통하여 거울상 이성질체적으로 순수한 β-D-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하는 방법에 관하여 기재하고 있다 (관련된 미국 특허번호 5,925,643; 5,767,122; 5,444,063; 5,684,010; 5,834,474; 및 5,830,898 참고).
BioChem Pharma의 EP 0 515 156은 실릴 루이스 산을 이용하여 키랄 보조물에 공유결합시킨 1,3-디옥솔란 중간체를 축합시키는 것을 포함하는 입체 선택성 합성 을 이용하여 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 거울상 이성질체를 수득하는 방법을 기재하고 있다 (관련된 미국 특허번호 5,753,706 및 5,744,596 참고).
Chu 등은 1,6-안하이드로만노오스로부터 β-D-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 입체 특이적으로 합성시키는 것을 발표하였다 (Chu, et al. Bet . Let ., 1991, 32,3791-3794). 비슷한 시기에, Thomas 및 Surber는 (i) 키랄성 크로마토그래피을 조사한 결과 뉴클레오시드 분리에 대한 어떠한 예시도 밝혀내지 못했으며, (ii) 그들의 논문이 키랄성 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 뉴클레오시드의 거울상 이성질체를 처음으로 분리한 것임을 기재한 논문을 발표하였다. 분석된 뉴클레오시드는 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드가 아니며, 시도된 5개의 키랄성 컬럼 중 4개는 작동하지 않았다 (Thomas, et al., J Chromat ., 1991, 586, 265-270).
Kim 등은 그 후에, 1,6-안하이드로-D-만노오스에서 시작하는 1,3-디옥솔란 피리미딘 뉴클레오시드의 β-D 및 α-D 거울상 이성질체의 비대칭 합성을 기재한 논문을 발표하였다 (Kim, et al. J. Med . Chem . 1993, 36 (1), 30-37). (-)-DAPD의 합성은 1,6-안하이드로-D-만노오스가 키랄성 아세테이트로 전환되는 9 단계를 포함하여, 1,6-안하이드로-D-만노오스로부터 시작하는 13 단계로 기재되었다 (도식 4).
Figure 112010006056316-pct00116
도식 4
보르브루겐 환경 하에서 아세테이트의 커플링 및 여러 정제 및 탈보호 단계 이후에, 적당한 수율로 (-)-DAPD를 수득하였다. 상기 과정은 시간 소모적이며, 어렵고, 복잡한 산화 단계가 관여한다.
1992년, Belleau 등은 키랄 보조물로 L-아스코르브산을 이용하는 8 단계 과정을 통한 거울상 이성질체적으로 순수한 2',3'-디데옥시-3-옥사사이티딘 입체 이성질체의 합성을 발표하였다 (Belleau, et al. Tet. Let. 1992, 33, 6949-6952). L-아스코르브산은 분리될 수 있는 한 세트의 부분입체 이성질체를 제조하기 위하여 사용되었다. 납 테트라아세테이트의 사용은 상기 과정을 대규모화에 부적합하게 만든다. 1992년, Kim 등은 1,6-안하이드로-L-β-굴로피라노오스로부터 (-)-L-β-디옥솔란-C 및 (+)-L-β-디옥솔란-T를 수득하는 방법을 기재한 논문을 발표하였다 (Kim, et al., Tet. Let. 1992, 32 (46), 5899-6902).
US 5,276,151에서, Liotta 및 Shinazi는 라세미 2-O-보호-5-O-아실레이트화-1,3-디옥솔란이 티타늄-함유 루이스 산의 존재 하에 퓨린 또는 피리미딘 염기와 커플링하여, 우세하게 라세미 이성질체를 생성할 수 있다는 것을 발견하였다 (WO 92/14729 참고).
Jin 등은 루이스 산 촉매가 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 제조에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 규명하였다 (Jin, et al. Tet . Asym . 1993, 4 (2), 211-214). TiCl4 및 SnCl4는 실릴레이트된 N-아세틸시토신을 이용한 거울상 이성질체적으로 순수한 2'-데옥시-3'-옥사리보시드의 커플리에서 라세미화 반응을 이용한 디옥솔란 뉴클레오시드의 형성을 촉진한다. 루이스 산 트리메틸실릴트리플레이트, 트리메틸실릴 아이오다이드, 및 TiCl2(Oi-Pr)2의 사용은 거울상 이성질체적으로 순수한 시토신 디옥솔란 뉴클레오시드가 낮은 부분입체 (이성질) 선택성을 가지게 한다.
디옥솔란 뉴클레오시드의 비대칭 합성은 Evans 등에 의해 보고되었다 (Tet. Asym. 1993, 4, 2319-2322). 1,2-디메톡시에탄에 든 SnCl2의 존재 하에 BnOCH2CH-(OCH3)2와 D-만니톨을 반응시킨 후의 RuCl3/NaOCl 산화는 시스- 및 트랜스-디옥솔란-4-카르복시산을 생성하며, 이는 그 다음에 탈카르복시화 반응, 커플링 반응 및 탈보호 반응에 의해 D- 및 L-디옥솔란 뉴클레오시드로 전환되었다. L-아스코르브산을 이용한 BnOCH2CH(OCH3)2의 반응에 의한 상기 카르복시산에 대한 택일적인 루트는 논문 상에도 보고되어 있다. 또한, 키랄성 카르복시산은 산성 조건 하에서, 벤조일옥시아세트알데하이드와 같은 하이드록시-아세트알데하이드의 보호된 유도체와 상용화된 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-(S)-카르복시산을 반응시킴으로써 제조할 수 있다 (미국 특허번호 5,922,867 및 6,358,963 참고).
Siddiqui 등은 시스-2,6-디아미노퓨린 디옥솔란이 아데노신 디아미네이즈에 의해 선별적으로 탈아민화될 수 있다는 것을 밝혔다 (Siddiqui, et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3 (8), 1543-1546).
참고문헌에 기재된 과정을 이용하여 디옥솔란 뉴클레오시드의 합성이 가능한 반면, 대규모로 (-)-DAPD를 합성하는데는 화학을 적용시킬 수 없다. 하기 참고문헌을 참고한다: Chu, et al. Tet. Let. 1991,32, 3791-3794; Siddiqui, et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 1543-1546; Kim, et al. Tet. Let. 1992, 46, 6899-6902.
Mansour 등의 US 5,763,606은 바이사이클릭 중간체를 이용하는 실릴레이트된 퓨린 또는 피리미딘 염기의 커플링을 통해, 순수한 1,3-옥사티오란 및 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 우세적으로 제조하는 방법을 기재하고 있다 (WO 94/29301 참고).
Painter 등의 US 6,215,004는 글리콜산을 화학식 (RlO)2CHR의 아세탈; 화학식 (R2O)(HO)CHR의 헤미아세탈; 또는 그의 혼합물과 반응시켜, 2-[R1C(O)OCH2]-1,3- 디옥소라닐-5-원을 제조하는 방법에 대하여 기재하고 있는 것으로, 여기서, R은 -(CH2-O-C(O)R1)이고, Rl 및 R2는 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트와 같은 루이스 산의 존재 하에, 독립적으로 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 알카릴, 알킬헤테로아릴, 또는 알킬헤테로사이클릭, 또는 아랄킬이다 (WO 00/09494 참고).
BioChem Pharma의 WO 00/47759 및 WO 01/58894는 퓨린 또는 피리미딘 염기로 커플링하기 전에, C4' 위치에서 COOR 모이어티를 이용하여 디옥솔란 유사체의 아노머 혼합물로부터 β 및 α 아노머를 분리하는 과정을 기재하고 있다. 우세한-L-배열 (configuration)을 가지는 디옥솔란을 수득하기 위하여 디옥솔란 유도체를 분석하는 과정은 소위 가수분해효소라고 불리우는 효소를 사용한다.
Shire BioChem Inc.의 WO 03/062229는 디옥솔란에 루이스 산, 실릴화제 및 비-실릴레이트된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 첨가하여 디옥솔란 뉴클레오시드 유사체를 제조하는 단일 반응조 과정을 기재하고 있다. 상기 공개본은 또한, 적합한 에너지원을 사용하여, DIB 및 I2의 존재 하에서 용매에 든 디옥솔란 화합물을 반응시켜 디옥솔란 화합물을 제공하는 과정을 기재하고 있다.
3'-옥사-치환 2',3'-디데옥시뉴클레오시드 유사체 ("디옥솔란 뉴클레오시드 유사체")의 입체 화학은 그의 생물학적 활성에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 탄소가 4개의 다른 모이어티에 부착되어 있으므로, 뉴클레오시드에서 리보오스의 Cl' 위치는 키랄 중심이다. 마찬가지로, 뉴클레오시드의 C4'에 광학적 활성 중심 이 있다.
Figure 112006063532414-pct00005
하기 나타난 바와 같이, 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 키랄성 탄소 (특정화된 퓨린 또는 피리미딘 염기 및 CH20H) 상의 치환기는 디옥솔란 링 시스템에 대하여 시스 (동일한 측에서) 또는 트랜스 (반대 측에서)일 수 있다. 일관성의 목적을 위하여, 메톡시 모이어티 또는 염기 모이어티가 다른 기환기 그룹으로 치화될 때, 동일한 입체 화학적 명칭 (designation)이 사용된다. 시스 및 트랜스 라세미체 모두는 한 쌍의 광학 이성질체로 구성된다. 그러므로, 각 화합물은 4개의 개별적인 광학 이성질체를 가진다. 4개의 광학 이성질체는 하기 배열로 표시된다 (-O-CH2-모이어티가 전방에 존재하도록, 디옥솔란 모이어티가 수평면으로 향할 때): (1) β-시스 배열 (β-D로 언급됨)인, 모든 그룹 "업 (up)"을 가진, 시스; (2) 정반대의 β-시스 배열 (β-L로 언급됨)인, 모든 그룹 "다운 (down)"을 가진, 시스; (3) C4' 치환기 "업" 및 C1' 치환기 "다운"을 가진 트랜스; 및 (4) C4' 치환기 "다운" 및 C1' 치환기 "업"을 가진 트랜스. 2개의 시스 거울상 이성질체는 함께 β-거울상 이성질체의 라세미 혼합물로 언급되고, 2개의 트랜스 거울상 이성질체는 α-거울상 이성질체의 라세미 혼합물로 언급된다. 일반적으로, 시스-배열 각각의 거울상 이성질체를 분리하거나 다른 방법으로 수득하기는 어렵다. 시스-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 4개의 가능한 입체 이성질체는 다음과 같이 표시된다:
Figure 112006063532414-pct00006
디옥솔란 뉴클레오시드의 입체 이성질체는 대개 다른 생물학적 활성 및 독성을 가지고 있으므로, 순수하게 치료학적으로 활성인 이성질체를 수득하는 것은 중요하게 되었다. 종종, 하나의 입체 이성질체는 다른 것보다 더욱 활성인 것으로 간주되기도 한다.
Chu 등은 각각 D- 및 L-디옥솔란 뉴클레오시드를 위하여 D-만노오스 및 L-굴로닉 락톤으로부터 디옥솔란 뉴클레오시드의 비대칭 합성을 위한 방법을 개발하였다 (미국 특허번호 5,767,122, 5,792,773). 그러나, 상기 과정은 많은 단계가 관여하고, 대부분의 중간체는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 필요가 있다 (Kim et al. J. Med . Chem. 1993, 36, 519-528).
임상시험을 위한 디옥솔란 뉴클레오시드 약물 물질을 충분하게 대량으로 제조하기 위하여, 키랄성 2-아실옥시메틸-5-옥소-1,3-디옥솔란은 중요한 중간체로 사용되어 왔다. 이는 BF3의 존재 하에서 글리콜산으로 ROCH2CHO 또는 그의 아세탈을 재결정화시킨 다음, 값비싸고 어려운 기술은 효소 분리 (enzymatic resolution) 또는 키랄성 수지 상에서의 컬럼 분리를 수행하여 제조하였다.
그러므로, 디옥솔란 뉴클레오시드의 생물학적 활성 이성질체를 제조하기 위한 비용-효율적이며 입체 선택성 과정에 대한 필요가 남아있다.
본 발명의 목적은 거울상 이성질체적으로 순수한 디옥솔란 뉴클레오시드를 합성하기 위한 신규하면서 비용상 효율적인 과정을 제공하는데 있다.
본 발명은 요구되는 기능성 (functionality)을 도입하는 옵션과 함께, 값비싸지 않은 전구체로부터 시작되는 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드에 대한 능률적인 합성 루트를 포함한다. 상기 과정은 상기 화합물의 생물학적으로 활성인 이성질체의 입체 선택성 제조를 가능하게 한다.
본 발명의 일 구현예에서,
a) 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올을 제조하거나 수득하고;
Figure 112006063532414-pct00007
또는
Figure 112006063532414-pct00008
상기 식에 있어서, 각 R1은 독립적으로 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 알카릴, 알킬헤테로아릴, 또는 알킬헤테로사이클릭, 또는 아랄킬이고;
R2는 (1) 합성의 끝에서 쉽게 제거될 수 있고, (2) 과정 동안 큰 질량을 옮기는 것을 피하는 저분자량을 가지고 있으며, (3) 상용화되고 값비싸지 않고, (4) 해당하는 에스테르가 환원성 아세틸화 조건 하에서 안정적이며, (5) 수반되는 락톤이 용해가능하고, (6) 연결된 다음, 해당하는 아노머가 선택적으로 결정화 (예를 들어, 이소-부티릴 또는 p-메톡시 벤조일)에 의해 용이하게 분리되는, 어느 적합한 제거가능한 기이며;
그런 다음,
b) 바람직하게 BF3·Et20와 같은 루이스 산의 존재 하에서, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올을 글리콜산으로 고리화시켜, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 수득하고;
Figure 112006063532414-pct00009
그런 다음,
c) 화학식 (Il)의 1,3-디옥솔란 락톤을 용해시켜 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하고; 그런 다음,
d) LiAlH(OtBu)3와 같은 환원제를 사용하여 선별적으로 환원시키고, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-키랄성 락톤을 활성화시켜서, 화학식 (III)의 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 수득하고:
Figure 112006063532414-pct00010
상기 식에서:
L은 OAc, 할로겐 (F, Br, Cl 또는 I), O메실레이트 (OMs) 및 O톨루에이트 (OTs), 또는 그 등가물과 같은 0-아실처럼 적합한 이탈기이고;
그런 다음,
e) 화학식 (III)의 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 활성화된 2,6-디클로로퓨린처럼 활성화된 및/또는 보호된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체에 커플링시켜, 화학식 (IV)의 실질적으로 순수한 보호된 D- 또는 L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 α:β 혼합물을 수득하고:
Figure 112006063532414-pct00011
상기 식에 있어서:
B는 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체이고;
그런 다음,
f) 화학식 (IV)의 실질적으로 순수한 보호된 D- 또는 L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 α:β 혼합물을 정제하여, 실질적으로 순수한 보호된 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하고; 그런 다음,
g) 필요하다면, 실질적으로 순수한 보호된 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 탈보호하여, 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하는 것을 포함하는, β-D-DAPD처럼 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해된다. 특정 구현예에서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 R2가 p-메톡시 벤조일인 경우 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해되지 않는다. 특정 구현예에서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 R2가 이소-부티릴인 경우 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하기 위하여, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 분리하는 것은 키랄성 크로마토그래피를 이용하여 수행된다. 본 발명의 택일적인 구현예에서, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하기 위하여, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 분리하는 것은 효소 분리를 이용하여 수행된다.
Figure 112010006056316-pct00117
도식 5
그러므로, 본 발명의 과정은 화학식 A 내지 D의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 에스테르를 제조하는데 사용될 수 있다:
Figure 112006063532414-pct00013
Figure 112006063532414-pct00014
상기 식에서:
R은 독립적으로 H, 할로겐 (F, Cl, Br, I), OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, Cl-C4의 저급 알킬, CH3, CH=CH2, N3C=CH2, C02H, CO2R', CONH2, CONHR', CH20H, CH2CH20H, CF3, CH2CH2F, CH=CHC02H, CH=CHCO2R', CH=CHCl, CH=CHBr, 또는 CH=CHI이고;
각 R'는 독립적으로 C1-C4의 저급 알킬이며;
Z는 CH 또는 C-X 중 하나이고;
각 X 및 Y는 독립적으로 H, 할로겐 (F, Cl, Br, I), OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, 또는 CH3이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 실질적으로 순수한 β-D-DAPD를 제조하기 위한 방법이 제공된다. 도식 6 참고.
Figure 112010006056316-pct00118
도식 6
본 발명은 요구되는 기능성을 도입하는 옵션과 함께, 값비싸지 않은 전구체로부터 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드로의 능률적인 합성 루트를 포함한다. 이러한 과정은 상기 화합물의 생물학적으로 활성인 이성질체의 입체 선택성 제조를 가능하게 한다.
본 발명의 일 구현예에서,
a) 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올을 제조하거나 수득하고;
Figure 112006063532414-pct00016
또는
Figure 112006063532414-pct00017
상기 식에 있어서:
각 Rl은 독립적으로 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 알카릴, 알킬헤테로아릴, 또는 알킬헤테로사이클릭, 또는 아랄킬이고;
R2는 (1) 합성의 끝에서 쉽게 제거될 수 있고, (2) 과정 동안 큰 질량을 옮기는 것을 피하는 저분자량을 가지고 있으며, (3) 상용화되고 값비싸지 않고, (4) 해당하는 에스테르가 환원성 아세틸화 조건 하에서 안정적이며, (5) 수반되는 락톤이 용해가능하고, (6) 연결된 다음, 해당하는 아노머가 선택적으로 결정화 (예를 들어, 이소-부티릴 또는 p-메톡시 벤조일)에 의해 용이하게 분리되는, 어느 적합한 제거가능한 기이며;
그런 다음,
b) 바람직하게 BF3·Et20와 같은 루이스 산의 존재 하에서, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올을 글리콜산으로 고리화시켜, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 수득하고;
Figure 112006063532414-pct00018
그런 다음,
c) 화학식 (Il)의 1,3-디옥솔란 락톤을 용해시켜 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하고; 그런 다음,
d) LiAlH(OtBu)3와 같은 환원제를 사용하여 선별적으로 환원시키고, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-키랄성 락톤을 활성화시켜서, 화학식 (III)의 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 수득하고:
Figure 112006063532414-pct00019
상기 식에서:
L은 OAc, 할로겐 (F, Br, Cl 또는 I), O메실레이트 (OMs) 및 O톨루에이트 (OTs), 또는 그 등가물과 같은 0-아실처럼 적합한 이탈기이고;
그런 다음,
e) 화학식 (III)의 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 활성화된 2,6-디클로로퓨린처럼 활성화된 및/또는 보호된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체에 커플링시켜, 화학식 (IV)의 실질적으로 순수한 보호된 D- 또는 L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 α:β 혼합물을 수득하고:
Figure 112006063532414-pct00020
상기 식에 있어서:
B는 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체이고;
그런 다음,
f) 화학식 (IV)의 실질적으로 순수한 보호된 D- 또는 L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 α:β 혼합물을 정제하여, 실질적으로 순수한 보호된 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하고; 그런 다음,
g) 필요하다면, 실질적으로 순수한 보호된 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 탈보호하여, 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하는 것을 포함하는, β-D-DAPD처럼 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해된다. 특정 구현예에서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 R2가 p-메톡시 벤조일인 경우 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해된다.
본 발명의 일 구현예에서, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하기 위하여, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 분리하는 것은 키랄성 크로마토그래피를 이용하여 수행된다. 본 발명의 택일적인 구현예에서, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하기 위하여, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 분리하는 것은 효소 분리를 이용하여 수행된다.
그러므로, 본 발명의 과정은 화학식 A 내지 D의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 에스테르를 제조하는데 사용될 수 있다:
Figure 112006063532414-pct00021
Figure 112006063532414-pct00022
상기 식에서:
R은 독립적으로 H, 할로겐 (F, Cl, Br, I), OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, Cl-C4의 저급 알킬, CH3, CH=CH2, N3C=CH2, C02H, CO2R', CONH2, CONHR', CH20H, CH2CH20H, CF3, CH2CH2F, CH=CHC02H, CH=CHCO2R', CH=CHCl, CH=CHBr, 또는 CH=CHI이고;
각 R'는 독립적으로 C1-C4의 저급 알킬이며;
Z는 CH 또는 C-X 중 하나이고;
각 X 및 Y는 독립적으로 H, 할로겐 (F, Cl, Br, I), OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, 또는 CH3이다.
Figure 112010006056316-pct00119
도식 5
그러므로, 본 발명의 과정은 화학식 A 내지 D의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 에스테르를 제조하는데 사용될 수 있다:
Figure 112006063532414-pct00024
Figure 112006063532414-pct00025
R은 독립적으로 H, 할로겐 (F, Cl, Br, I), OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, Cl-C4의 저급 알킬, CH3, CH=CH2, N3C=CH2, C02H, CO2R', CONH2, CONHR', CH20H, CH2CH2OH, CF3, CH2CH2F, CH=CHC02H, CH=CHCO2R', CH=CHCl, CH=CHBr, 또는 CH=CHI이고;
각 R'는 독립적으로 Cl-C4의 저급 알킬이며;
Z는 CH 또는 C-X이고;
각 X 및 Y는 독립적으로 H, 할로겐 (F,Cl, Br, I), OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, 또는 CH3이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 실질적으로 순수한 β-D-DAPD를 제조하기 위한 과정이 제공된다. 도식 6 참고.
Figure 112010006056316-pct00120
도식 6
일 구현예에서, 본 발명은 1-β-D-2,6-디아미노퓨린 디옥솔란 (DAPD)과 같은 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 합성에서 중간체일 수 있는 화합물의 분리를 위한 과정을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 도식 7에 나타난 바와 같이 DAPD 중간체의 합성을 위한 생촉매 방법 (biocatalytic method)을 제공한다.
Figure 112006063532414-pct00027
도식 7: DAPD에 대한 전형적인 루트
본 발명의 일 구현예에서, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤은 sec-부타노에이트 에스테르 (화합물 13)이다.
본 발명의 일 구현예에서, 부티레이트 에스테르 락톤의 (S)-거울상 이성질체 (하기 구조의 화합물 1)가 바람직하다면, PPL이 키랄성 분리를 위해 사용된다.
Figure 112006063532414-pct00028
화합물 1
실시예에 기재된 바와 같이, PPL은 가장 선별적인 효소 (22% 수율, 98% ee)로 확인되었고, 모든 상용화된 효소 및 200 미생물 효소의 전체 상용화 효소 스크린에 (S)-부티레이트 에스테르 이성질체를 남기는 것으로 밝혀졌다.
일반적인 구현예에서, 어느 효과적인 효소가 사용될 수 있다면, 리파아제 PS, 고정된 리파아제 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 리파아제 M은 실시예에 기재된 대로, (R)-부티레이트 에스테르 이성질체를 남기는 선별적인 효소로 확인되었다. 리파아제 PS는 요구되는 거울상 이성질체 우선성 (enantio-preference)을 가지며, 95% ee (R)-화합물 1의 22% 수율을 제공하는 능률적인 효소로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 택일적인 일 구현예에서, (R)-거울상 이성질체가 바람직하다면, 리파아제 PS, 고정된 리파아제 슈도모나스 또는 리파아제 M이 키랄성 분리를 위해 사용된다. 일 특정 구현예에서, 효소는 리파아제 PS이다.
본 발명이 분리를 위한 특정 조건에 얽매이지 않는다 할지라도, 일 구현예에서, 분리를 위한 온도는 약 0℃이다. 다른 구현예에서, 온도는 -5℃ 내지 10℃, 또는 -2℃ 내지 +5℃ 또는 약 -1℃ 내지 약 1℃이다. 다른 구현예에서, 기질의 양은 약 100 g/L이다. 기질의 양은 다양할 수 있는데, 예를 들어, 전체 반응 부피 또는 버퍼의 5 내지 500, 20 내지 200, 50 내지 150, 약 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 그 이상의 g/L 이다. 일 구현예에서, 버퍼는 약 pH 6일 수 있는 1:1 톨루엔 버퍼이다. 특정 구현예에서, 분리를 위한 조건은 0℃, 1:1 톨루엔 pH 6 버퍼 내의 100g/L 기질일 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이, 이러한 조건은 22%, 95% ee (R)-화합물 1 (E=5.3)을 산출한다. 조건은 또한, 능률적인 분리를 위하여 실험적인 매개변수 내에서 매우 약하게 다양해질 수 있다.
화합물을 용해하는 미생물 균주는 다양할 수 있다. 일 구현예에서, 균주는 아시네토박터 종 유래이다: 미생물 스크린은 80% ee로 (R)-부티레이트를 제공하는 2개의 균주 (아시네토박터 및 아시네토박터 주니)를 확인하였다. 모든 상용화된 효소 및 200 미생물 효소는 부티레이트 에스테르의 능률적인 분리를 확인하기 위하여 스크리닝되었다. 미생물 스크린은 80% ee로 (R)-부티레이트를 제공하는 2개의 가능성있는 균주 (CMC 3419, 아시네토박터 및 CMC 3606, 아시네토박터 주니)를 규명하였다.
일 구현예에서, 하기 구조의 부티레이트 에스테르 아세테이트 (화합물 3)의 분리가 바람직하다면, 사용된 효소는 리파아제 PS이다.
Figure 112006063532414-pct00029
화합물 3
화합물 3의 전체 상용화된 효소 스크린은 선별적인 효소의 대부분이 아세테이트에서 용해된다는 것을 밝혔고, 부티레이트 중심을 필요로 하지 않는다. 그러나, 리파아제 PS, 리파아제 MY 및 리파아제 AY는 온화한 선택성을 가졌으며, (R)-에스테르 이성질체를 남겼다. 이러한 효소는 화합물 1에 대한 것과 비슷한 선택성을 가졌다. 더욱 연구하여, 리파아제 PS가 가장 선별적이라는 것을 규명하였다 (효과적인 E=3.7). 유사하게, 이는 리파아제 PS를 이용한 화합물 1의 분리에 필적하는 선택성이다.
본 발명의 일 구현예에서, 분리 단계는 합성의 초기 단계, 예를 들어 락톤 단계에 일어난다.
일 구현예에서, p-메톡시-벤조일 락톤의 (S)-거울상 이성질체, 4-옥소- [1,3]디옥솔란-2-일메틸 4'-메톡시벤조에이트 (화합물 11)가 분리되는 것이 바람직하다면, 키라자임-L2이 락톤의 분리를 위해 사용된다.
Figure 112006063532414-pct00030
화합물 11
다양한 범위의 상업화 및 미생물 효소가 화합물 11의 능률적인 분리를 확인하기 위하여 스크리닝되었다. 키라자임-L2는 39% 수율, (S)-거울상 이성질체의 > 98% ee로 잔류 에스테르를 제공하는, 가장 선별적인 효소로 확인되었다.
다른 구현예에서, 벤조일 락톤, 4-옥소-[1,3] 디옥솔란-2-일메틸 벤조에이트 (화합물 12)의 분리가 바람직할 경우, 사용된 효소는 키라자임-L2일 수 있다.
Figure 112006063532414-pct00031
화합물 12
상용화 효소 스크린 (10개의 효소)는 벤조일 락톤 (화합물 12)을 위한 것으로 사용된다. 키라자임-L2 및 산 프로테아제-DS는 스크린에서 잠재적인 분할제 (resolving agent)로 확인되었다. 키라자임-L2은 화합물 11 및 12의 분리를 위하여 유사한 선택성을 제공한다. 화합물 12를 위하여 제한된 상용화 효소 스크린은 키라자임-L2가 가장 능률적인 효소임을 다시 확인하였다.
다른 구현예에서, 이소-부트릴 락톤의 예 (yhe) (R)-거울상 이성질체, 4-옥소-[1,3]디옥솔란-2-일-메틸-2'-메틸프로파노에이트 (화합물 13)의 분리가 바람직할 때, 사용된 효소는 키라자임-L2일 수 있다.
Figure 112006063532414-pct00032
화합물 13
완벽한 상용화 및 미생물 효소 스크린이 화합물 13에 대하여 수행되었다. 키라자임-L2가 가장 선별적인 효소임이 재입증되었다. 화학적 상관관계에 의해 배열이 (R)-거울상 이성질체인 것으로 밝혀졌다. MTBE-버퍼에서 초기 연구는 28% 수율, 92% ee로 잔류 에스테르를 제공하였다.
화합물 13에 대한 전체 상용화된 효소 스크린은 키라자임-L2, 리파아제 PS, 산 프로테아제 DS 및 키라자임-L9이 온화한 선택성을 가지고, 잔류 에스테르로 (R)-거울상 이성질체를 남긴다는 것을 밝혔다. 전체 미생물 스크린은 어느 거울상 이성질체에 대해 선별적인 균주를 동정하였다. 한 미생물, CMC 103869는 10℃에서 분리를 수행하여 > 95% ee 락톤을 제공하였다.
일 구현예에서, 화합물 13 (이소-부트릴 락톤)는 기질이였다. 다른 구현예에서, 기질은 예를 들어, 간단한 정제 기술과 같은, 간단한 다운스트림 화학 (downstream chemistry)을 제공하는 것이다. 키라자임-L2는 분리를 위해 사용된 효소일 수 있다. 일 구현예에서, 키라자임-L2는 잔류 에스테르의 (R)-배열을 제공할 수 있다.
MTBE-버퍼, 톨루엔-버퍼 및 2-프로판올-물 시스템에서 반응이 연구되었다. 안정성 및 선택성 문제가 MTBE 및 톨루엔 시스템과 상충되었다. 그러나, 2-프로판올-물에서의 결과는 뛰어났으며, 라세미체의 30 g 투입으로부터 94% ee의 38% 수율로 화합물 13을 제공하였다. 그러므로, 일 구현예에서, 분리는 2-프로판올-물에서 수행된다.
최적화 연구가 시작되었다. 과정은 산물을 정제하기 위하여 쿠겔로흐 (Kugelrohr) 증류를 사용하고 용매로 단상의 알코올-물 시스템을 사용하여 개선되었다. 그러므로, 일 구현예에서, 과정은 단상의 알코올- 물 시스템 및 증류를 포함하다.
키라자임-L2를 사용한 화합물 13의 생분리 (bioresolution)는 2-프로판올:물 (9:1)에서 200 gL- l 로 30 g까지 규모가 커졌으며, 38% 수율, 94% ee 및 90% 화학적 순도로 4-옥소-[1,3]디옥솔란-2-일-메틸-2'-메틸-프로파노에이트를 제공하였다. 도식 8 참고.
Figure 112006063532414-pct00033
도식 8: 화합물 13의 생분리를 위해 확인된 조건
대조적으로, 하기 구조의 t-부틸-디페닐 실릴 에테르 락톤 (화합물 4)이 참된 라세미체로 결정되었다.
Figure 112006063532414-pct00034
화합물 4
상기 화합물을 위한 상평형 그림 (phase diagram)은 77.5% ee로 있는 공융 혼합물 (eutectic)을 밝히는 것으로 구성되었다.
라세미 시스-DAPD는 비닐 부티레이트의 존재 하에서, 그의 아실화 활성에 대하여 공지된 여러 가지의 효소를 사용하여 스크리닝되었지만, 비-입체 선택성 반응을 제공하는 것으로 밝혀졌다. PeptiCLEC-BL 및 리파아제 AY는 바람직한 라세미 부티레이트에 빠른 반응을 제공하여, 위치 선택적으로 그리고 부드럽게 에스테르를 산소에 두기에 유용할 수 있다. 일 구현예에서, PeptiCLEC-BL가 사용된다. 개별적인 구현예에서, 리파아제 AY가 사용된다.
Figure 112006063532414-pct00035
1-β-D-2,6-디아미노퓨린 디옥솔란 (DAPD)
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한", "실질적으로 ~이 없는", "~의 부재 하에 실질적으로" 또는 "분리된"이라는 개념은 지시된 뉴클레오시드의 지시된 거울상 이성질체의 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95 중량%, 또는 적어도 99 중량% 내지 100 중량%를 포함하는 뉴클레오시드 조성물을 언급한다. 일 구현예에서, 과정은 상반되는 배열의 거울상 이성질체가 실질적으로 없는 화합물을 제공한다.
달리 특정화되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 알킬이란 개념은 포화된 곧은, 가지가 있는, 또는 사이클릭, Cl 내지 Cl0의 1차, 2차, 또는 3차 탄화수소로 언급되고, 특히, 메틸, 트리플루오로메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 사이클로헥실메틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 및 2,3-디메틸부틸을 포함한다. 상기 개념은 포화된 및 불포화된 알킬기 모두를 포함한다.
치환될 수 있는 알킬기를 가진 모이어티는 순전히 참고문헌으로 본 명세서에 기재된, Greene 등의 참고문헌에 기재된 것처럼, 해당분야에 숙련된 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 필요에 따라 비보호되거나 또는 보호된, 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 나이트로, 시아노, 술폰산, 설페이트, 포스폰산 (phosphonic acid), 포스페이트, 또는 포스포네이트로 구성된 그룹 중에서 선택된다 (Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991).
달리 특정화되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 바와 같이 저급 알킬이란 개념은 포화된 및 불포화된 형태 모두를 포함하는, 포화된 곧은, 가지가 있는, 또는 적합하다면, 사이클릭 (예를 들어, 사이클로프로필) 알킬기인 Cl 내지 C4를 언급한다. 본 출원에서 달리 특별하게 언급되지 않는다면, 저급 알킬이 바람직하다. 유사하게, 알킬 또는 저급 알킬이 적합한 모이어티인 경우, 비치환된 알킬 또는 저급 알킬이 바람직하다.
달리 특정화되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 바와 같이 아릴이란 개념은 페닐, 비페닐, 또는 나프틸을 언급한다. 상기 개념은 포화된 및 불포화된 모이어티 모두를 포함한다. 아릴기는 순전히 참고문헌으로 본 명세서에 기재된, Greene 등의 참고문헌에 기재된 것처럼, 해당분야에 숙련된 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 필요에 따라 비보호되거나 또는 보호된, 브로모, 클로로, 플루오로, 아이오도, 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 나이트로, 시아노, 술폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 또는 포스포네이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 모이어티에 의해 치환될 수 있다 (Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991).
알카릴 또는 알킬아릴이란 개념은 아릴 치환기를 가진 알킬기를 언급한다.
아랄킬 또는 아릴알킬이란 개념은 알킬 치환기를 가진 아릴기를 언급한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 할로란 개념은 브로모, 클로로, 플루오로, 및 아이오도를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 이종원자란 개념은 산소, 황, 질소, 및 인을 언급한다.
아실이란 개념은 에스테르기의 비-카르복실 모이어티가 곧은, 가지가 있는, 또는 사이클릭 알킬 또는 저급 알킬, 메톡시메틸을 포함하는 알콕시알킬, 벤질을 포함하는 아랄킬, 페녹시메틸과 같은 아릴옥시알킬, 할로겐, Cl 내지 C4 알킬 또는 Cl 내지 C4 알콕시에 의해 임의로 치환된 페닐을 포함하는 아릴, 메탄설포닐, 모노, 디 또는 트리포스페이트 에스테르, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질, 트리알킬실릴 (예를 들어, 디메틸-t-부틸실릴) 또는 디페닐메틸실릴을 포함하는 알킬 또는 아랄킬 설포닐과 같은 설포네이트 에스테르 중에서 선택되는, 카르복시산 에스테르를 언급한다. 에스테르에 있는 아릴기는 최적으로 페닐기를 포함한다. "저급 아실"이란 개념은 비-카르복실 모이어티가 저급 알킬인 아실기를 언급한다.
본 명세서에 사용된 바와 같고 달리 정의되지 않는다면, "보호된"이란 개념은 그의 추가 반응을 방지하기 위하여 또는 다른 목적을 위하여 산소, 질소, 또는 인 원자에 첨가되는 기를 언급한다. 광범위하게 다양한 산소 및 질소 보호기는 유기 합성의 분야에서 숙련된 기술을 가진 자에게 공지된 것이다.
퓨린 또는 피리미딘 염기란 개념은 아데닌, N6-알킬-퓨린, N6-아실퓨린 (아실이 C(O)(알킬, 아릴, 알킬아릴, 또는 아릴알킬)인 경우), N6-벤질퓨린, N6-할로퓨린, N6-비닐퓨린, N6-아세틸레닉 퓨린, N6-아실 퓨린, N6-하이드록시알킬 퓨린, N6-티오알킬 퓨린, N2-알킬퓨린, N2-알킬-6-티오퓨린, 티민, 시토신, 5-플루오로-시토신, 5-메틸시토신, 6-아자-시토신을 포함하는 6-아자피리미딘, 2- 및/또는 4-머캅토-피리미딘, 우라실, 5-플루오로우라실을 포함하는 5-할로우라실, C5-알킬피리미딘, C5-벤질-피리미딘, C5-할로피리미딘, C5-비닐피리미딘, C5-아세틸레닉 피리미딘, C5-아실 피리미딘, C5-하이드록시알킬 퓨린, C5-아미노피리미딘, N2-알킬-퓨린, N2-알킬-6-티오퓨린, 5-아자사이티디닐, 5-아자-우라실, 트리아졸로피리디닐, 이미다졸로-피리디닐, 피롤로피리미디닐, 및 피라졸로피리미디닐을 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다. 퓨린 염기는 구아닌, 아데닌, 하이폭산틴, 2,6-디아미노퓨린, 6-위치에서 아미노 또는 카르보닐 기를 포함하는 치환기를 임의로 가지는 2-(Br, Fl, Cl 또는 I)-퓨린, 및 2-위치에서 아미노 또는 카르보닐 기를 포함하는 치환기를 임의로 가지는 6-(Br, Cl 또는 I)-퓨린을 포함하나, 그에 국한되는 것은 아니다. 염기 상에서 기능성 산소 또는 질소 기는 필요한 만큼, 또는 바람직한 만큼 보호될 수 있다. 적합한 보호기는 해당분야에 숙련된 기술을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 트리메틸실릴, 디메틸헥실실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리틸, 알킬기 및 아세틸 및 프로피오닐, 메탄설포닐, 및 p-톨루엔설포닐과 같은 아실기를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 헤테로아릴 또는 헤테로방향족이란 개념은 방향족 링에서 적어도 하나의 황, 산소, 질소 또는 인을 포함하는 방향족을 언급한다. 헤테로사이클릭이란 개념은 링에서 산소, 황, 질소 또는 인과 같은 적어도 하나의 이종원자를 가지는 비방향족 사이클릭 기를 언급한다. 헤테로아릴 및 헤테로사이클릭 기의 비제한적인 예시는 퓨릴, 퓨라닐, 피리딜, 피리미딜, 티에닐, 이소티아졸릴, 이미나졸릴, 테트라졸릴, 피라지닐, 벤조퓨라닐, 벤조티오페닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조퓨릴, 피라졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 퓨리닐, 카르바졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소-티아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 이소옥사졸릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 산티닐, 하이폭산티닐, 티오펜, 퓨란, 피롤, 이소피롤, 피라졸, 이미다졸, 1,2,3-트리아졸, 1,2,4-트리아졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 피리미딘 또는 피리다진, 및 프테리디닐, 아지리딘, 티아졸, 이소티아졸, 1,2,3-옥사디아졸, 티아진, 피리딘, 피라진, 피페라진, 피롤리딘, 옥사지란, 페나진, 페노티아진, 몰포리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피라지닐, 퀴녹사리닐, 산티닐, 하이폭산티닐, 프테리디닐, 5-아자사이티디닐, 5-아자우라실릴, 트리아졸로피리디닐, 이미다졸로피리디닐, 피롤로피리미디닐, 피라졸로피리미디닐, 아데닌, N6-알킬퓨린, N6-벤질퓨린, N6-할로퓨린, N6-비니퓨린, N6-아세틸레닉 퓨린, N6-아실 퓨린, N6-하이드록시알킬 퓨린, N6-티오알킬 퓨린, 티민, 시토신, 6-아자피리미딘, 2-머캅토피리미딘, 우라실, N5-알킬피리미딘, N5-벤질피리미딘, N5-할로피리미딘, N5-비닐피리미딘, N5-아세틸레닉 피리미딘, N5-아실 피리미딘, N5-하이드록시알킬 퓨린, 및 N6-티오알킬 퓨린, 및 이속사졸릴을 포함한다. 헤테로방향족 기는 상기 기재된 바와 같이 아릴에 대해 임의로 치환될 수 있다. 헤테로사이클릭 또는 헤테로방향족 기는할로겐, 할로알킬, 알킬, 알콕시, 하이드록시, 카르복실 유도체, 아미도, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다. 헤테로방향족은 바람직한 대로 부분적으로 또는 총체적으로 수소화될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 디하이드로피리딘이 피리딘 대신에 사용될 수 있다. 헤테로사이클릭 또는 헤테로아릴기에서 기능성 산소 및 질소 기는 필요한 만큼, 또는 바람직한 만큼 보호될 수 있다. 적합한 보호기는 해당분야에 숙련된 기술을 가진 자에게 공지되어 있는 것으로, 트리메틸실릴, 디메틸헥실실릴, t-부틸디메틸실릴, 및 t-부틸-디페닐실릴, 트리틸 또는 치환된 트리틸, 알킬기, 아세틸 및 프로피오닐과 같은 아실기, 메탄설포닐, 및 p-톨루에닐설포닐을 포함한다.
이러한 퓨린 또는 피리미딘 염기, 헤테로방향족 및 헤테로사이클은 단일 또는 이중 결합을 통해 헤테로 사이클 링 시스템에 결합하거나, 그에 접합된 알킬기 또는 방향족 링에 의해 치환될 수 있다. 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 헤테로방향족, 또는 헤테로사이클은 링 질소 및 링 탄소 (C-뉴클레오시드 생성)을 포함하는, 어느 사용가능한 원자를 통해 당 모이어티에 결합할 수 있다.
사용된 약어는 ee: 시작 물질 (s) 또는 산물 (p)에 대한 거울상 이성질체 과량; c: 전환; 및 E: 거울상 이성질 선택도 (enantioselectivity constant)를 포함한다.
공정 단계의 상세한 설명
Figure 112006063532414-pct00036
도식 9
최초에, 2,2-디알콕시-에탄올 (1)은 정량적인 수율로 해당하는 산 클로라이드에 의해 에스테르화되었다. 이소-부티릴 (2a) 에스테르의 경우, 해당하는 디옥솔란 락톤 (3a)으로의 결정화는 루이스 산 (BF3·Et2O)의 존재 하에 80%의 수율로 글리콜산에 의해 영향을 받았다. 그러나, 동일한 조건 하에서, p-메톡시 벤조에이트 에스테르 (2b)는 낮은 수율 및 순도로 해당하는 락톤을 제공하였다. 보다 우수한 결과는 아세탈이 처음에 해당하는 알데하이드 (2c)로 가수분해되고, 그런 다음 이것이 유사한 결정화 조건에서 수율 80%로 고형물인 해당하는 락톤 (3b)을 수득하는 2 단계 과정에서 성취되었다. 락톤은 키랄성 크로마토그래피13에 의해 평가되었다. LiAlH(OtBu)3 및 그 후의 아세트산 무수물 처리에 의한 키랄성 락톤 (4a 및 4b)의 선택적인 환원은 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제 다음에, 적당한 수율로 해당하는 아세테이트 (5a 및 5b)를 제공하였다. 보브루겐 조건 하에서, 2,6-디클로로퓨린을 이용한 커플링은 해당하는 뉴클레오시드 (6a 및 6b)의 α:β 아노머의 가공하지 않은 혼합물을 제공하였다. 이소-부티레이트 에스테르는 처음에 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되고, MeOH로부터 결정화되어, 24% 수율로 순수한 β 아노머 (7a)를 제공하였다. p-메톡시 벤조에이트 에스테르 뉴클레오시드는 크로마토그래피를 필요로 하지 않으며, MeOH로부터 결정화되어, 46% 수율로 순수한 β 아노머 (7a)를 제공하였다. 클로린은 소디움 아자이드로 처리한 다음 수소화시키는 2-단계 과정에서 아미노기로 치환되었다. 해당하는 중간체 (9a 및 9b)는 분리되고 완전하게 기술되었다. 보호기의 제거는 MeOH를 환류시키면서 n-부틸아민을 사용하여 수행되었고, 각각 93% 및 90% 수율로 (-)-DAPD (10)를 제공하였다.
해당하는 키랄성 락톤 (5a 및 5b)으로부터 총 수율은 다음과 같다: 이소-부티레이트에 대하여 11.4%, 및 p-메톡시 벤조에이트에 대하여 22.2 %.
도 1A는 부틸 에스테르 락톤 (화합물 1)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1B는 부틸 에스테르 아세테이트 (화합물 3)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1C는 p-메톡시벤조일 락톤 (화합물 11)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1D는 최적화된 SFC 방법을 사용하여 p-메톡시벤조일 락톤 (화합물 11)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1E는 벤조일 락톤 (화합물 12)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 IF는 최적화된 SFC 방법을 사용하여 벤조일 락톤 (화합물 12)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1G 내지 1J는 이소-부틸 에스테르 락톤 (화합물 13)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1K는 t-부틸-디페닐-실릴 에테르 락톤 (화합물 4)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1L은 최적화된 방법을 사용하여 t-부틸-디페닐-실릴 에테르 락톤 (화합물 4)에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 1M은 DAPD에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 IN은 최적화된 SFC 방법을 사용하여 DAPD에 대한 전형적인 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 t-부틸-디페닐-실릴 에테르 락톤 (화합물 4)에 대한 이론적인 상평형 그림을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 화합물의 특정 거울상 이성질체에 대한 특정 미생물 효소의 선택성을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 3A 및 3B는 다양한 미생물 효소에 대한 부틸 에스테르 락톤 (화합물 1)의 스크린에 의한 결과를 나타낸 것이다. 도 3C는 다양한 미생물 효소에 대한 p-메톡시벤조일 락톤 (화합물 11)의 스크린에 의한 결과를 나타낸 것이다. 도 3D는 다양한 미생물 효소에 대한 벤조일 락톤 (화합물 12)의 스크린에 의한 결과를 나타낸 것이다. 도 3E는 다양한 미생물 효소에 대한 이소-부틸 에스테르 락톤 (화합물 13)의 스크린에 의한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 농도, 버퍼, pH 범위 및 온도를 사용하여 미생물 효소 CMC 103669 및 CMC 103661에 대한 이소-부틸 에스테르 락톤 (화합물 13)의 미생물 분리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5는 용해된 이소-부틸 에스테르 락톤 (화합물 13)에 대한 400 MHz 1H NMR 스펙트럼이다.
융해점은 디지탈 온도계가 장착된 Melt-Temp II 장치를 사용하여 오픈 유리 모세관 (open glass capillaries) 내에서 결정하였다. lH-NMR 스펙트럼은 바리안 XL-400 분광계를 사용하여 400 MHz에서 기록되었다. 달리 언급되지 않는다면, 증발은 40℃에서 부치 회전식 증발기를 사용하여 감소된 압력 하에서 수행하였다. 용액은 무수물 Na2S04에서 건조되었다. TLC는 실리카 겔 60F254 (E. Merck, Darmstad)을 사용하여 미리 코팅된 유리 플레이트 (0.25 mm)에서 수행하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피는 실리카 겔 60 (230-400 메쉬, E. Merck, Darmstad)을 사용하여 수행하였다. 기본적인 분석은 Atlantic Microlab (Atlanta, GA)에 의해 수행되었다. 고해상도 질량 스펙트럼 (high resolution mass spectra: HRMS)은 Analytical Instrument Group Inc. (Raleigh, NC)에 의해 수행되었다.
가스 크로마토그래피 분석: 샘플은 1 ml THF 또는 다른 적합한 용매 당 1 mg 샘플을 용해시켜 제조하였다. 1 ㎕ 주입 부피가 사용되었다.
샘플은 30m HP-5 (가교 5% PH ME 실록산) 모세관 컬럼, Hewlett Packard part #19091J-413을 사용하여 분리하였다. 도입 온도는 200℃로 세팅하고, 오븐 온도는 다음과 같다: 1분 동안 35℃, 12.5℃/분으로 250℃까지 상승, 1.8 분 동안 250℃ 유지. 불꽃 이온화 검출기 온도는 250℃로 세팅하였다. 운반체 가스는 8.0 분의 명목 흐름 (nominal flow)으로 세팅된 질소였다.
HPLC 분석:
방법 A: 컬럼: Chiralpak AD-RH, 150 x 4.6 mm. 이동상: 메탄올. 기울기: 등용매 (isocratic). 유속 (flow rate): 0.5 ㎖/분. 실행 시간: 30 분. 검출: 280 nm에서 UV.
방법 B: 컬럼: Aquasil C18, 150 x 4.6 mm. 이동상: 용매 A: 아세토니트릴, 용매 B: 50 mmol NH40Ac, 물에 든 0.1% AcOH. 기울기: 시간: 0분., A: 1%, B: 99%; 시간: 17분., A: 50%, B: 50%, 그 후, 등용매. 유속: 1.0 ㎖/분. 실행 시간: 30 분. 검출: 290 nm에서 UV.
방법 C: 컬럼: Chiralpak AD, 250 x 4.6 mm. 이동상: 메탄올. 기울기: 등용매. 유속: 0.8 ㎖/분. 실행 시간: 20 분. 검출: 254 nm에서 UV.
실시예 1
이소부티르산 2,2- 디메톡시 -에틸 에스테르 (2a).
4- 메톡시 -벤조산 2,2- 디에톡시 -에틸 에스테르 (2b).
0℃에서, EtOAc 또는 tert-부틸메틸 에테르 (50 ml)에 든 Et3N (16 ml, 11.64 g, 115 mmol), DMAP (61 mg, 0.5 mmol), 및 2,2-디에톡시 또는 2,2-디메톡시-에탄올 (1,100 mmol)의 잘 교반된 용액에 해당하는 산 클로라이드 (105 mmol)를 천천히 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반시킨 다음, 반응 혼합물을 EtOAc (50 ml)으로 희석하고, (c) NaHCO3 (2 x 100 ml), 브린 (2 x 100 ml)을 사용하여 순차적으로 세정하고, 건조하여 여과하고, 증발시켜 노란색 액체 형태로 이소부티르산 2,2-디메톡시-에틸 에스테르 (2a, 99%)를 수득하였으며, 이는 다음 단계에서 다른 추가 정제없이 사용하였다. GC (Rt = 5.24 분., 98%); 1H-NMR (CDC13) δ: 4.57 (1H, t, J = 5.2, (MeO)2CHCH2-), 4.11 (2H, d, J = 5.2, (MeO)2CHCH2-), 3.40 (6H, s, CH30-), 2.60 (1H, m, OCOCH(CH3)2), 1.54 (6H, d, J = 6.8, OCOCH(CH3)2).
다음 단계에서 다른 추가 정제없이 사용되는 시럽 형태의 4-메톡시벤조산 2,2-디에톡시-에틸 에스테르 (2b, 100%). GC (Rt = 13.7 분, 99%); lH-NMR (CDCl3) δ: 7.98 (2H, d, J = 9.0, ArH), 6.89 (2H, d, J = 9.0, ArH), 4.79 (1H, t, J = 5.6, (EtO)2CHCH2-), 4.28 (2H, d, J = 5.6, (EtO)2CHCH2-), 3.82 (3H, s, CH30-), 3.73 (2H, m, CH3CH2O-), 3.59 (2H, m, CH3CH20-), 1.22 (6H, t, J = 6.9, CH3CH20-).
실시예 2
이소부티르산4 -옥소-[1,3]- 디옥솔란 -2-일 메틸 에스테르 (3a).
0℃에서, 아세토니트릴 (30 ml)에 든 α-하이드록시 아세트산 (3.42 g, 45 mmol) 및 해당하는 아세탈 (2a, 30 mmol)의 잘 교반시킨 용액에 BF3·EtO2 (6.38 g, 5.70 ml, 45 mmol)을 천천히 첨가하였다. 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반시켰다. 용액은 EtOAc (150 ml)과 (c) NaHCO3 (150 ml) 사이에 분배되었다. 유기 용액을 (c) NaHCO3 (150 ml), 브린 (2 x 150 ml)을 사용하여 유기 용액을 순차적으로 세정하고, 건조시켜 여과한 다음 증발시켜 무색의 시럽으로 이소부티르산4-옥소- [1,3]-디옥솔란-2-일 메틸 에스테르 (3a, 80%)을 수득하였다. GC (Rt = 7.89 분., 95%); 1H-NMR (CDC13) δ: 5.83 (1H, s, H-2), 4.35-4.20 (4H, m, H-5, H-5' 및 -CH20CO-), 2.62 (1H, m, (CH3)2CHCOO-), 1.19 (6H, d, J = 7.0, (CH3)2CHCOO-).
C8Hl3O5 (M + 1)+에 대해 계산된 질량: 189.0763. 실험치: (H.R.F.A.B.M.S.): 189.0763.
실시예 3
4- 메톡시벤조산4 -옥소-[1,3]- 디옥솔란 -2-일 메틸 에스테르 (3b).
C12CH2 (75 ml)에 든 4-메톡시벤조산 2,2-디에톡시-에틸 에스테르 (2b, 7.5 g, 28 mmol)의 용액을 TFA (16.7 g, 11. 3 ml, 140 mmol) 및 물 (7.5 g, 7.5 ml, 28 mmol)로 처리하였다. GC가 완전한 반응을 나타낼 때까지, 균질한 용액을 실온에서 3.5시간 동안 교반시켰다. 상기 용액을 40℃ 진공 상태에서 농축시킨 다음, 진공 상태에서 여러 차례 농축시켜 TFA의 흔적을 제거하였다. 산물, 4-메톡시벤조산 2-옥소-에틸 에스테르 (2c, 5.9 g, 28 mmol, 100%)는 비결정질의 흰색 고형물로 분리되어, 다음 단계에서 다른 추가 정제없이 사용되었다. GC (Rt = 11.0 분, 95%); 1H-NMR (CDCl3) δ: 9.72 (1H, s, HCO-), 8.06 (2H, d, J = 8.8, ArH), 6.95 (2H, d, J = 8.8, ArH), 4.87 (2H, s, HCOCH2O-), 3.87 (3H, s, OCH3).
0℃에서, DME (100 ml)에 든 α-하이드록시 아세트산 (5.2 g, 68 mmol) 및 정제하지 않은 알데하이드 (2c, 5.9 g, 28 mmol)의 잘 교반시킨 용액에 BF3·EtO2 (12.3 g, 11.0 ml, 85 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반시켰다. 용액은 EtOAc (150 ml)와 (c) NaHCO3 (150 ml) 사이에 분배되었다. (c) NaHCO3 (150 ml), 브린 (2 x 150 ml)을 사용하여 유기 용액을 순차적으로 세정하고, 건조시켜 여과한 다음, 증발시켜 시럽을 수득하였다. 시럽을 DME (15 ml)로 처리하고, 고형물을 침전시켰다. 30분 동안 교반시킨 다음, 고형물을 여과하여 흰색의 과립 고형물 형태로 4-메톡시벤조산 4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2-일 메틸 에스테르 (3b, 5.7 g, 23 mmol, 80%)를 수득하였다: GC (Rt = 14.7 분, 99%); mp: 61-63℃; 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.97 (2H, d, J = 9.2, ArH), 6.91 (2H, d, J = 9.2, ArH), 5.95 (1H, t, J = 3.0, H-2), 4.57 (1H, dd, J = 3.0 및 J = 12.6, -CH20CO-), 4.50 (1H, dd, J = 3.0 및 J = 12.6, -CH2OCO-), 4.41 (1H, d, J = 15.0, H-5), 4.31 (1H, d, J = 15.0, H-5), 3.87 (3H, s, OCH3).
Cl2H12O6에 대한 계산치, C, 57.14; H, 4.80. 실험치: C, 57.40; H, 4.93.
실시예 4
이소부티르산4 -옥소-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르 (4a).
라세미 이소부티르산 4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2-일 메틸 에스테르 (3a)를 키랄성크로마토그래피13로 분석하여, 각 거울상 이성질체에 해당하는 두 개의 분획을 수득하였다. 두 분획은 무색의 시럽이였다. 첫 번째 분획은 R 거울상 이성질체 (4a, 이소부티르산4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르)에 해당하는 것이었다: HPLC (방법 A, Rt = 7.80 분, 100%); [α]D 20 = 20.200 (c 0.25, MeOH). 두 번째 분획은 S 거울상 이성질체 (이소부티르산4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2(S)-일 메틸 에스테르)에 해당하는 것이었다; HPLC (방법 A, Rt = 9.30 분, 100%); [α]D 20 = -14.400 (c 0.25, MeOH).
실시예 5
4- 메톡시벤조산4 -옥소-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르 (4b).
라세미 4-메톡시벤조산4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2-일 메틸 에스테르 (3b)를 키랄성 크로마토그래피7로 분석하여, 각각의 거울상 이성질체에 해당하는 2개의 분획을 수득하였다. 두번째 분획은 흰색의 고형물이였다. 첫번째 분획은 R 거울상 이성질체 (4b, 4-메톡시벤조산4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르)에 에 해당하는 것이었다; mp: 76-78℃ ; HPLC (방법 A, Rt = 13.59 분, 99%); [α]D 20 = 12.200 (c 0.25, MeOH). 두번째 분획은 S 거울상 이성질체 (4-메톡시벤조산4-옥소-[1,3]-디옥솔란-2(S)-일 메틸 에스테르)에 해당하는 것이었다; mp:76-78℃; HPLC (방법 A, Rt = 20.76 분, 99%); [α]D 20 = -13.500 (c 0.25, MeOH).
실시예 6
이소부티르산 4- 아세트옥시 -[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르(5a).
4- 메톡시벤조산 4- 아세트옥시 -[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르 (5b).
-10℃에서, THF (19.5 ml, 19.5 mmol)에 든 LiAlH (OtBu)3의 1.0 M 용액을 건성 THF (45 ml)에 든 해당하는 락톤 (4a 또는 4b, 15 mmol)의 잘 교반시킨 용액에 20분의 시간 동안 내내 천천히 첨가하고, 온도는 -15℃ 내지 -10℃로 유지하였다. 반응 후 GC를 수행하고, 30분 동안 실온에서 교반시켰다 (시작물질이 완전히 사라짐). 용액을 다시 -10℃로 냉각시키고, DMAP (0.92 g, 7.50 mmol)를 일부분으로 첨가한 다음, Ac20 (15.3 g, 14.20 ml, 150 mmol)를 한방울씩 첨가하였다. 반응물을 -15℃에서 1시간 동안 더 교반시키고, 실온에서 하룻밤 동안 교반시켰다. 용액을 -15℃로 냉각시키고, MeOH (40 ml)를 사용하여 퀀칭시켰다. 실온에서 20분 동안 교반시킨 다음, 반응물을 진공상태에서 빨간색 시럽으로 농축하고, 상기 시럽을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (250 g 실리카, 헥산:EtOAc 3:1), 이소부티르산 4-아세트옥시-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (5a, 61%)를 노란색 시럽으로 수득하였다: 1H-NMR (CDCl3)는 거의 아노머의 1:1 혼합물을 나타냄, δ: H-4α 및 H-4β에 해당하는 6.40 (d, J = 3.8) 및 6.37 (d, J = 3.8); H-2α 및 H-2β에 해당하는 5.41 (t, J = 3.7) 및 5.32 (t, J = 3.7).
노란색 시럽 형태의 4-메톡시벤조산4-아세트옥시-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르(5b, 61%). 1H-NMR (CDCl3)는 거의 아노머의 1:1 혼합물을 나타냄, δ: H-4α 및 H-4β에 해당하는 6.44 (dd, J = 2.1 및 J = 4.2) 및 6.37 (d, J = 4.0); H-2α 및 H-2β에 해당하는 5.54 (t,J = 3.6) 및 5.45 (t, J = 4.0).
실시예 7
이소부티르산 4(R)-(2,6- 디클로로 - 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메 틸 에스테르 (7a).
4- 메톡시벤조산 4(R)-(2,6- 디클로로 - 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르 (7b).
2,6-디클로로퓨린 (1.27 g, 6.73 mmol), 암모늄 설페이트 (38 mg, 0.29 mmol) 및 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔 (8.45 g, 11.04 ml, 52.3 mmol)의 서스펜션을 2.5시간 동안 환류시키면서 가열하였다. 생성된 용액을 두꺼운 고형물이 침전하는 주변 온도로 냉각시켰다. 건식 디클로로메탄 (14.9 ml)을 첨가하여 고형물을 다시 용해시켰다. 그런 다음, 용액을 -10℃로 냉각시키고, -10℃ 내지 -5℃를 유지하면서, 건식 디클로로메탄 (10 ml)에 든 해당하는 아세테이트 (5a 또는 5b, 8.6 mmol)의 용액을 20분 동안 내내 천천히 첨가하였다. 그리고 나서, TMSOTf (2.5 g, 2.08 ml, 10.4 mmol)을 20분 동안 내내 천천히 첨가하였다. 반응액을 실온에서 하룻밤 동안 교반시켰다. 용액을 디클로로메탄 (120 ml)으로 희석하고, 물 (150 ml)로 퀀칭하였다. 유기층을 분리하고, 물 (150 ml), (c) NaHCO3 (2 x 150 ml)를 사용하여 순차적으로 세정한 다음, 건조시켜 여과하고, 증발시켜 노란색 고 형물 (가공하지 않은 6b) 형태로 시럽 (가공하지 않은 6a)을 수득하였다.
가공하지 않은 6a를 컬럼 크로마토그래피 (헥산:AcOEt 4:1)로 추가 정제하여, 1H-NMR에 따라, 아노머의 β:α 1.2:1 혼합물 형태로 6a를 수득하였다. 혼합물을 MeOH (10 ml)로부터 결정화하여, 흰색의 고형물 형태로 이소부티르산 4(R)-(2,6-디클로로-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (7a, 24%)를 수득하고, β 아노머로 간주하였다; mp: 145-147℃; [α]D 20= -47.670 (c 0.25,MeOH); 1H-NMR (CDCl3) δ: 8.52 (1H, s, H-8), 6.55 (1H, d, J = 4.9, H-4), 5.34 (1H, t, J = 5.7, H-2), 4.58-4.30 (4H, m, -CH2COO-, H-5 및 H-5'), 2.61 (1H, m, (CH3)2CHCOO-), 1.19 (3H, d, J = 6.8, (CH3)2CHCOO-), 1.14 (3H, d, J = 6.8, (CH3)2CHCOO-).
Cl3H14Cl2N4O4에 대한 계산치, C, 43.23; H, 3.91; N, 15.51. 실험치: C, 43.39; H, 3.91; N, 15.58.
가공하지 않은 6b를 뜨거운 헥산으로 세정하여, 노란색 고형물 형태로 4-메톡시-벤조산 4-(2,6-디클로로-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (6b)를 수득하였다. 1H-NMR은 β:α 아노머의 2:1 혼합물을 나타내었다. 상기 혼합물을 MeOH (100 ml)로부터 천천히 결정화시켜, 노란색 고형물 형태로 4-메톡시벤조산 4(R)-(2,6-디클로로-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (7b, 46%)를 수득하고, β 아노머로 간주하였다; mp: 154 - 156℃; HPLC (방법 B, Rt = 20.73 분); [α]D 20 = -53.800 (c 0.25, MeOH); 1H-NMR (Cl3CD) δ: 8.41 (1H, s, H-8), 7.91 (2H, d, J = 8.5, ArH), 6.92 (2H, d, J = 8.5, ArH), 6.53 (1H, d, J = 4.8, H-4), 5.44 (1H, bs, H-2), 4.70 - 4.30 (4H, m, H-5, H-5' 및 -CH2OCO-), 3.85 (3H, s, OCH3).
C17H15Cl2N4O5에 대해 계산된 질량 (M + 1)+: 425.0419. 실험치: (H.R.F.A.B.M.S.): 425.0420.
실시예 8
이소부티르산 4(R)-(2,6- 디아자이도 - 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -(2)R-일 메틸 에스테르 (8a).
4- 메톡시벤조산 4(R)-(2,6-디아자이도- 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르 (8b).
건식 DMF (13.5 ml)에 든 해당하는 디클로로퓨린 뉴클레오시드 (7a 또는 7b, 2.9 mmol)의 잘 교반시킨 용액에 NaN3 (390 mg, 6.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반시키면서 4시간 동안 실온에 두었다. 혼합물을 셀라이트 (Celite)로 여과하여, 다음 단계에서 다른 추가 정제없이 사용되는, DMF (70 ml)에 든 이소부티르산 4(R)-(2,6-디아자이도-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (8a) 또는 4-메톡시벤조산 4(R)-(2,6-디아자이도-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (8b)의 용액을 수득하였다.
실시예 9
이소부티르산 4(R)-(2,6- 디아미노 - 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일 메틸 에스테르 (9a).
4-메톡시벤조산 4(R)-(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (9b).
이전 반응 (8a 또는 8b)에서 유래한 용액을 10% Pd/C (200 mg)의 존재하에 하룻밤 동안 실온에서 수소화시켰다 (Parr 장치, 50 psi). 셀라이트를 통해 혼합물을 여과하고, 필터 케이크 (filter cake)를 여분의 DMF로 세정하였다.
8a의 경우, 건조상태까지 용액을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (Cl3CH:MeOH 9:1)로 정제하여, 흰색의 고형물을 수득하고, 이를 이소-프로판올로부터 결정화시켜 흰색의 고형물 형태로 이소부티르산 4(R)-(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (9a, 공동으로 결정화시키는 2-프로판올 1 분자의 존재를 위하여 보정한 다음 84%)를 수득하였다; mp: 143 - 145℃; [α]D 20 = -56.45 (c 0.25, MeOH); 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.84 (1H, s, H-8), 6.33 (1H, dd, J = 1 및 J = 5.1, H-4), 5.29 (3H, t, J = 3.2, H-2 및 NH2), 4.70 (2H, bs, NH2), 4.50 (1H, dd, J = 1 및 J = 9.0, H-5), 4.33 (2H, d, J = 3.2, -CH2COO-), 4.23 (1H, dd, J = 6.2, (CH3)2CHCOO-), 1.14 (3H, d, J = 7.2, (CH3)2CHCOO-).
C13H18N6O4·2-프로판올에 대해 계산된 질량: C, 50.25,; H, 6.85; N, 21.98. 실험치: C, 50.16; H, 6.84; N, 21.92.
8b의 경우, 60℃ 진공상태에서 최종부피가 15 ml이 되도록 용액을 농축시켰다. 용액을 물 (150 ml)로 희석하고, 몇 분 후 고형물이 침전하였다. 산물을 여과하고, 물로 세정한 다음, 50℃ 진공 상태에서 하룻밤 동안 건조시켜, 비결정질의 고형물 형태로 4-메톡시벤조산 4(R)-(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (9b, 88%)를 수득하였다; HPLC (방법 B, Rt = 15.41 분); [α]D 20= -95.75 (c 0.25, MeOH); 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.82 (2H, d, J = 8.8, ArH), 7.80 (1H, s, H-8), 7.02 (2H, d, J = 8.8, ArH), 6.77 (2H, bs, NH2), 6.23 (1H, dd, J = 5.5 및 J = 1.6, H-4), 5.85 (2H, bs, NH2), 5.36 (1H, t, J = 3.3, H-2), 4.65 (1H, dd, J = 9.4 및 J = 1.6, H-5), 4.46 (2H, d, J = 3.4, -CH2OCO-), 4.26 (1H, dd, J = 9.4 및 J = 5.5, H-5'), 3.84 (3H, s, OCH3).
Cl7H19N6O5에 대해 계산된 질량: 387.1417. 실험치: (H. R. F. A. B. M. S.): 387.1417.
실시예 10
4(R)-[-(2,6- 디아미노 - 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일]-메탄올, 9a로부터의 [10, (-)- DAPD ].
MeOH (10 ml)에 든 n-부틸아민 (0.45 g, 0.62 ml, 6.2 mmol)과 이소부티르산 4(R)-(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (9a, 100 mg, 0.31 mmol)의 용액을 환류시키면서 4시간 동안 가열하였다. 반응물을 주위 온도로 냉각시키고, 진공 상태에서 농축하여, tert-부틸 메틸 에테르로 분쇄된 고형물을 수득하고, EtOH: 물 (1: 4.5 ml)로부터 결정화된 고형물을 수득하고, 흰색의 고형물 형태로 (-)-DAPD (10, 75 mg, 0.29 mmol, 93%)를 수득하였다; mp: 237 - 239℃ (lit.2 mp: 236 - 237℃); HPLC (방법 C, Rt = 8.7 분, (-)-DAPD의 확실한 샘플은 Rt = 8.7 분을 나타내고, (+) DAPD의 샘플은 Rt = 6.0 분을 나타냄); DAPD; 1H-NMR (DMSO-d 6) δ: 7.80 (1H, s, H-8), 6.74 (2H, bs, NH2), 6.20 (1H, d, J = 5.5, H-4), 5.84 (2H, bs, NH2), 5.16 (1H, t, J = 6.3, OH), 5.03 (1H, t, J = 2.9, H-2), 4.42 (1H, d, J = 9.7, H-5), 4.18 (1H, dd,J = 9.7 및 J = 5.5, H-5'), 3.58 (2H, dd, J = 6.3 및 J = 2.9, -CH2OH).
C9H12N603에 대한 계산치: C, 42.86; H, 4.80; N, 33.32. 실험치: C, 42.88; H, 4.79; N, 33.32.
실시예 11
4(R)-[-(2,6- 디아미노 - 푸린 -9-일)-[1,3]- 디옥솔란 -2(R)-일]-메탄올, 9b로 부터의 [10, (-)- DAPD ].
MeOH (25 ml)에 든 n-부틸아민 (3.7 g, 5.0 ml, 50 mmol) 및 4-메톡시벤조산 4(R)-(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일 메틸 에스테르 (9b, 1.0 g, 2.6 mmol)의 서스펜션을 4시간 동안 환류시키면서 가열하였다. 반응물을 진공 상태에서 농축하여 노란색의 고형물을 수득하고, 이를 실온에서 C13CH에 현탁하고 여과하여, 흰색의 고형물 형태로 (-) DAPD (10, 590 mg, 2.3 mmol, 90%)를 수득하였다. 물리적 성질은 상기 수득된 (-)-DAPD의 샘플과 동일하였다.
실시예 12
거울상 이성질 선택도의 결정
간단한 가수분해 반응의 거울상 이성질체 선택성은 E 수치에 의해 특징지어질 수 있다 (C.S Chen, C. J. Sih, Y. Fujimoto 및 G. Girdaukus, J. Am . Chem . Soc., 1982, 104, 7294). 이는 2개의 거울상 이성질체에 대한 촉매의 특이성 상수 (specificity constant)의 비율을 수적으로 나타낸 것이다. E 수치는 반응이 다른 전환까지 갔다할지라도, 촉매 선택성의 직접적인 비교를 가능하게 한다.
E 수치를 산정하기 위하여, 전환의 범위 및 잔존하는 시작 물질 및/또는 가수분해 산물의 광학적 순도가 필요하다. ees 및 eep 모두가 알려진 것이라면, 반응식 1을 사용하여 전환 (c)를 계산할 수 있다. ees 또는 eep만 알려진 것이라면, 가수분해의 종결시 결정된 c는 E를 계산하기 위하여 사용될 수 있다 (반응식 2).
반응식 1:
Figure 112010006056316-pct00121
반응식 2:
Figure 112010006056316-pct00122
약어:
ee = 시작 물질 (s) 또는 산물 (p)에 대한 거울상 이성질체 초과량 (excess)
c = 전환
E = 거울상 이성질 선택도
실시예 13
Figure 112006063532414-pct00039
화합물 1
화합물 1에 대한 분석적 전개
화합물 1에 대한 키랄성 분석이 요구되었다. Chirasil DEX CB 컬럼을 사용하는 키랄성 GC를 수행하여 기준선 (baseline) 분리를 수행하였다. 도 1A 참고.
GC 조건:
컬럼: Chirasil DEX CB
치수: 25m x 0.25mm
온도 프로그램: 10분 동안 140℃ 그 다음 15℃/분 으로 200℃까지
운반체 가스: 헬륨 @ 20 psi
검출: FID @ 200℃
보유 시간: 1 내지 7.46 분 (R)-거울상 이성질체
2 내지 7.70 분 (S)-거울상 이성질체
화합물 1에 대한 효소 스크리닝
리파아제: 각 신틸레이션 유리병에 화합물 1 50 ㎕, MTBE (5 mL) 및 50 mM KH2P04, pH 7 (5 mL)를 첨가한 다음, 효소 25 ㎎을 첨가하였다. 유리병을 30℃로 세팅된 배양기에 넣고 흔들어 주었다. 분취량 (aliquot)을 주기적으로 제거하고, TLC (50% EtOAc/헵탄) 및 키랄성 GC를 수행하여 분석하였다.
프로테아제 및 에스테라아제: 상기 기재된 바와 같이, 반응물을 제외하고, 용매는 MTBE가 없는 5 mL, 50 mM KH2PO4, pH 7 또는 8이었다. 0.1 M 젖산 용액 [펩신, 산 프로테아제 A (뉴라아제 A), 및 산 프로테아제 II (뉴라아제 II)]을 사용하여 pH 3에서 산 프로테아제 반응을 수행하였다.
몇몇 경우에서, 효소의 50 wt.%, 25 ㎎은 매우 빠른 반응을 제공하여, 의미있는 분석을 수행하기 전에 100% 전환이 달성되었다. 상기 경우에서, 반응은 적합한 양의 효소를 사용하여 다시 수행되어, 적합한 속도의 반을 제공하였다 (보통 5 wt.%). 보다 적은 부하 (loading)를 필요로 한 효소는 키라자임-L2, -E1 및 -E2, 모든 CLECs, 콜린 에스테라아제, 칸디다 에스테라아제 (Altus), PPL, 리파아제 PS 및 리파아제 AK이었다.
사용된 효소가 리파아제 또는 프로테아제/에스테라아제인가에 따라, 라세미 화합물 1을 스크리닝하기 위하여 두 세트의 조건이 사용되었다. 리파아제-촉진 가수분해의 경우, 반응 용매는 1:1 MTBE:50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼 pH 7이었다. 프로테아제 및 에스테라아제-촉진 가수분해의 경우, 반응을 혼합할 수 없는 유기 공용매가 없는 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼, pH 7 또는 8 (또는 산 프로테아제에 대해서는 pH 3)에서 수행하였다. 30℃ 교반기 배스 (incubator bath)에서 반응을 수행한 다음, TLC를 수행하였고, GC 분석 (Chirasil Dex-CB 컬럼)에 의해 ees 수치를 결정하였다.
TLC 상의 몇몇 새로운 점 (spot)은 반응 동안 생성되므로, 부티레이트 에스테르의 가수분해로 인한 알코올 산물은 불안정한 것으로 나타난다. 그러므로, 가능한 산물에 대한 키랄성 분석없이, TLC 분석으로부터 대략적인 전환을 판단하였다.
스크린의 결과는 하기 표와 같이 나타내었다. 표 1은 부티레이트 키랄성 분석에서 선별적으로 피크 1을 남기는 효소를 나타내고 있는 반면에, 표 2는 부티레이트 키랄성 분석에서 선별적으로 피크 2를 남기는 효소를 나타내고 있다.
화합물 1의 비-입체 선택성 가수분해를 제공하는 다수의 효소가 존재하는 것으로 보이는 것이 주목할 만하며, 이는 기질이 상기 반응 조건 하에서 불안정하다 는 것을 알려준다. 효소를 함유하지 않고 대조군 반응이 수행될 때, 가수분해는 여전히 발생하였다. 기질의 안정성에 대한 추가적인 연구가 본 명세서에 기재되어 있다.
Figure 112010006056316-pct00123
Figure 112006063532414-pct00041
Figure 112010006056316-pct00124
α-키모트립신은 화합물 1을 이용하는 어떠한 반응도 제공하지 않았다.
하기 효소는 화합물 1을 사용하는 비선택적인 반응을 제공하였다 (< 10% ees): 리파아제 AY, 리파아제 A "아마노" 6, 리파아제 A "아마노" 12, 리파아제 N conc, 리파아제 AP6, 시그마 CCL, 맥아 리파아제, 키라자임-L5, ChiroCLEC-CR, 프로테아제 M, 펩티다아제 R, 산 프로테아제 A, 산 프로테아제 II, 산 프로테아제 DS, 프로테아제 A-DS, 프로테아제 N, 프로테아제 A2G, 프로테아제 NL, 프로테아제 DS, 프로테아제 S, 프로테아제 P "아마노" 6, 프로자임 6, 프로리더 (Proleather), 브로멜라인-F, 파파인 W-40 (아마노), 파파인 (시그마), 프로테아제 X, 프로테아제 XXXI, 사비나아제, 에스퍼라아제, 펩신, 키로CLEC-BL, 케토프로펜 에스테라아제 및 키라자임-E2.
실시예 14
화합물 1의 PPL 분리의 확대
어느 것이 (R)-이성질체인지를 결정하기 위하여, 상기 기재된 스크린으로부터 가장 가능성 있는 효소를 사용하여 용해된 화합물 1의 양을 분석하고, 키랄성 분석에 의한 이성질체 용출 순서가 공지된 경우, 중간체까지 합성 순서를 진행시켰다. 스크린으로부터 가장 가능성 있는 효소는 PPL (돼지 췌장의 리파아제, 시그마)이므로, 상기 반응은 50 g 라세미 기질 입력까지 확대되었다 (도식 10).
Figure 112006063532414-pct00043
도식 10: 화합물 1의 대규모 PPL 분리
기질 농도를 50 g/L으로 증가시킨 것과는 무관하게 (5 g 기질 상의 반응을 시험삼아 성공적으로 수행함), 반응 조건의 최소 최적화를 수행하였다. pH 7에서 반응을 유지하도록 진행하면서, 0℃에서 5 wt.% PPL을 사용하여 50 g 반응을 시작하였다. 그러나, 반응은 매우 빨리 진행되어, 25분 후 15℃까지 냉각되고, pH는 pH 6을 유지하였다.
특히, 30℃에서 자켓티드 베슬 (jacketed vessel)에 MTBE (500 mL), 50 mM KH2PO4, pH 7 (500 mL) 및 라세미 화합물 1 (49.75 g, 0.265 mol, TP-0257/98/D)을 첨가하였다. 교반시킨 혼합물 (pH 7)에 PPL (2.5 g, 5 wt%)을 첨가한 다음, 3M NaOH를 첨가하여 pH를 pH 6으로 유지하였다. 반응의 속도로 인하여, 25분 후 베슬은 15℃로 냉각되고 반응은 상기 온도에서 진행된다. MTBE의 분취량을 제거하고, 더 많은 MTBE로 희석하여, 건조한 다음 (MgS04), 키랄성 GC로 분석하여, 기간 간격 (time interval)에 ees를 측정하였다. 1시간 10분 후, ees는 98%에 도달하였고, 반응이 완결되었다. 셀라이트를 통해 혼합물을 여과하고, 셀라이트를 MTBE (200 mL)로 세정하였다. 혼합물은 분리되고, 유기층은 유지되었다.
그런 다음, MTBE (500 mL)를 사용하여 수성 (aqueous)을 다시 추출하였다. MTBE 추출을 화합시키고, 건조한 다음 (MgSO4), 진공 상태에서 증발시켜서 가공하지 않은 노란색의 오일 22 g를 수득하였다. 실리카 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (20% EtOAc: 80% 헵탄)를 통해 가공하지 않은 산물을 정제하여, 매우 연한 노란색 오일 형태로 (S)-화합물 1 9.55 g (98% ee, GC-MS에 의한 순도 95%)를 수득하였다. 추가로 덜 순수한 물질 1.5 g도 수득되었다. 조합된 수율은 22% 였다.
GC-MS (CPSil8 CB/MS, 30 m x 0.25 mm, 5분 동안 60℃, 300℃까지 10℃/분) 13.98 분, M = 173 (M+-CH3), 피크 영역에 의한 순수함 95%.
1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 5.85 (t, 1H, CH-O), 4.35 (m, 4H, 2 x CH20), 2.35 (t, 2H, CH2), 1.7 (육중항 (sextet), 2H, CH2), 0.95 (t, 3H, CH3).
ees는 시간 간격으로 측정하였다 (ee 분석에서 피크 2).
반응은 1시간 10분 뒤 종결되었고, 분리된 분석 화합물 1은 실리카 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 이는 덜 순수한 에스테르 (총 수율 22%)와 함께, 95% 순수한, 98% ee 에스테르 9.55g을 제공하였다. 에스테르 (9.55g)의 주요 배치 (batch)에서 불순물은 부티르산이었다. 이 물질은 키랄성 분석에 의한 이성질체 용출 순서가 공지된 경우 중간체까지 합성 순서를 진행하게 되며, (S)-화합물 1인 것으로 결정되었다. (R)-이성질체를 수득하기 위하여, 화합물 1 키랄성 분석에서 피크 1을 선별적으로 남기는 효소가 요구되었다.
실시예 15
( R )-화합물 1을 제공하는 상업화 효소 분리의 최적화
표 1에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 초기 스크린은 능률적으로 (R)-화합물 1을 제공하는 잠재적인 후보물질로 SAWA 고정된 리파아제, 리파아제 M, 리파아제 PS 및 F1 바이오콘. 리파아제를 제시하였다. 그들의 선택성을 결정하기 위하여 분리를 대규모화하였다 (F1 바이오콘. 리파아제는 더 이상 상용화되지 않음).
각 용매 및 버퍼 (0.2 N KH2PO4) 15-20 ㎖에 든 에스테르 2-5 g에 효소를 첨가하였다. pH를 조절하기 위하여 소디움 하이드록사이드 용액을 첨가하였다. 완료된 과정은 여과하고 (셀라이트), 추출하며 (MTBE), 포화된 수성 소디움 바이카르보네이트로 세정하고, 건조하여 (MgS04), 농축하는 것이었다. 분석은 키랄성 GC (Chirasil Dex CB)에 의해 수행되었다. 연구된 변수는 효소, 용매, pH 및 온도이었다 (표 4 참고).
pH 7 포스페이트 버퍼에 든 리파아제 PS, 리파아제 M 및 SAWA 고정된 슈도모나스 리파아제를 이용한 초기 시도는 잔존하는 기질이 90%의 거울상 이성질체 과량을 가지게 하였으나, (R)-화합물 1의 회수는 낮았다 (< 5%). 부티레이트의 안전성은 효소가 없는 표준 반응 조건 하의 pH 7 및 pH 6에서 연구되었다 (엔트리 20 및 21). pH 7에서, 중요한 염기는 소모되어 pH를 유지하고, 완료 (work-up) 및 분리 이후, (1)의 50% 만이 3.5시간 뒤에 회수되었다. 안정성은 pH 6에서 현저하게 좋아졌다. 가능하다면, 파괴 (breakdown) 모드는 알데하이드 및 글리콜산 (도식 11)을 제공하는 락톤-아세탈의 개시 (opening)이다.
Figure 112006063532414-pct00045
도식 11: 화합물 1의 가능한 분해 경로
Figure 112006063532414-pct00046
2개의 다른 대조군은 시작하는 98% ee의 에스테르가 pH 6 또는 pH 7에서 반응 조건에 의해 라세미화되지 않는다는 것을 보여주었다. 추가적인 테스트 반응은 24시간 후, 0℃, 2:1 톨루엔:l M 버퍼에 든 100 g/L 기질, pH 6에서, 90% 보다 큰 수율의 시작물질이 거울상 이성질체 과량의 손실없이 회수되었다는 것을 보여주었다. 그러므로, 이러한 반응 조건 하에, 라세미화 반응 및 기질 안정성은 문제되지 않는다.
상기 결과를 유념하면서, 모든 다른 효소 반응을 pH 6에서 수행하였다. 연구로부터의 최상의 결과는 엔트리 7, 8, 9 및 13에 나타나 있다. 가장 가능성 있는 효소 분리는 톨루엔/pH 6 버퍼에 든 리파아제 PS를 이용한 것으로, 4.3의 E 수치를 나타내었다. 이는 95% ee로 17%의 수율을 제공할 수 있다. 리파아제 PS를 이용한 분리는 본 명세서의 실시예에서 더욱 연구되었다. 최적화를 위해 연구된 변수는 농도, 용매:버퍼 부피 비율, 효소 부하, 첨가물 및 온도였다
최적 조건은 0℃, 95% ee를 제공하는 1:1 톨루엔:포타슘 포스페이트 버퍼 (pH 6)에 든 100 g/L 기질, 22% 수율의 (R)-화합물 1로 결정되었다.
200 g/L 기질 농도에서, 95% ee (R)-화합물 1은 17% 수율로 수득되었다.
실시예 16
미생물 효소 스크린
대략 200 균주의 스크린 (새로운 96-웰 플레이트 방법 사용)으로부터, 양성반응을 나타내는 7개가 화합물 1의 (R)-이성질체를 남기는 것으로 확인되었다 (피크 1). 이들은 에스테르를 가수분해하고, > 10% ee의 잔존하는 기질을 제공하여, 높은 ee 에스테르를 생산하는 잠재력을 가진, 양성반응 균주로 분류되었다.
스크린은 25℃에서 대략 16시간 동안, 20 g/l 에스테르를 가진 0.1M Na2HP04/NaH2PO4, pH 6.0에서 수행되었다. 이 결과는 도 5A 및 5B에 도시되어 있다.
1차 스크린으로부터 얻은 7개의 양성반응 균주 (피크 1)를 TSB (트립톤 소야 배양액) 플라스크에서 배양하고, 세포 페스트 (cell paste)를 회수하였다. 이를 0.1 M Na2HP04/NaH2P04, pH 6.0 + 20 g/L 에스테르에서 10% w/v으로 현탁시키고, 신틸레이션 유리병 (유리병 당 1.0 mL)에 넣고 25℃에서 92시간까지 흔들어 주었다. 그 결과는 표 5에 나타난 바와 같다.
Figure 112006063532414-pct00047
Figure 112010006056316-pct00125
대조군으로부터의 결과는 에스테르가 25℃동안 내내 안정하지는 않다는 것을 보여준다. 17 및 92 시간에서 피크 영역 사이의 피크 영역 크기에 있어서 97%의 감소가 있다. 이는 왜 모든 샘플 피크 영역이 극적인 감소를 보이는지를 명백하게 설명하는 것이다. 다시 스크린된 균주 중 CMC 3606(아시네토박터 주니) 및 CMC 3419 (아시네토박터)는 좋은 거울상 이성질체 선택성을 나타내었다 (피크 1에 대한 80% ee). 이 후의 연구를 위하여 이들 두 균주를 다시 배양하였다 [플라스크에서 CMC 3606 (근복적으로 미확인된 박테리아이므로) 및 발효조에서 CMC 3419]. CMC 3322 (P. 스알칼리게네스)의 경우, 17시간 후에 에스테르가 검출되지 않았다. 이는 아마도 pH 상의 이동 (세포 파쇄와 함께) 또는 높은 에스테라아제 활성으로 인한 것일 것이다.
실시예 17
Figure 112006063532414-pct00049
화합물 3
화합물 3에 대한 분석적 전개
4개의 가능한 화합물 3의 부분입체 이성질체를 분리하기 위하여 키랄성 GC 분석이 전개되었다. 분석 조건에 대한 자세한 사항은 하기 기재된 바와 같다.
GC 조건:
컬럼: Chiraldex GTA
치수: 30m x 0.25mm
온도 프로그램: 20 분동안 100℃ 그 후에 2℃/분으로 160℃까지
운반체 가스: 헬륨 @ 14 psi
검출: FID @ 200℃
보유 시간: 1-41.74 분 2-41.96 분
3-43.07 분 4-43.82 분
시작 에스테르의 키랄성 GC-MS는 각각 1:1.4의 비율로 15.98 및 16.27 분에서 2개의 피크를 제공하였다 (부분입체 이성질체). 도 1B 참고. 4개의 키랄성 GC ee/de 분석 피크 및 GC-MS 피크의 비교는 ee/de 분석에서 피크 1 및 2가 거울상 이성질체이고, 피크 3 및 4는 거울상 이성질체라는 것을 나타낸다.
효소 스크린, 화합물 3
리파아제 : 각각의 신틸레이션 유리병에 50 ㎕ 화합물 3 (TP-0259/98/A), MTBE (5 mL) 및 50 mM KH2P04, pH 7 (5 mL)를 첨가한 다음, 20 mg 효소를 첨가하였다. 30℃로 세팅된 배양기에서 유리병을 흔들어 주면서, 분취량을 주기적으로 제거하여 TLC (50% EtOAc/헵탄) 및 키랄성 GC로 분석하였다.
프로테아제 및 에스테라아제: 상기 기재된 바와 같이, 반응액을 제외하고, 용매는 MTBE가 없는 5 mL, 50 mM KH2PO4, pH 7 또는 8이었다. pH 3에서 0.1 M 젖산 용액 [펩신, 산 프로테아제 A (뉴라아제 A), 및 산 프로테아제 II (뉴라아제II)]을 사용하여 산 프로테아제 반응을 수행하였다.
이러한 기질에 대해 매우 활성인 것으로 알려진 몇몇 효소의 경우, 반응은 대개 10-15 wt%의 적합한 반응 속도를 제공하는, 적절한 양의 효소를 사용하여 수행되었다. 이와 같이 감소된 부하를 요구하는 효소는 키라자임-L2, -E1 및 -E2, 모든 CLECs, 콜린 에스테라아제 및 칸디다 에스테라아제 (Altus)이었다.
라세미 화합물 3은 상용화된 리파아제, 프로테아제 및 에스테라아제을 사용하는 효소 가수분해를 위하여 스크린되었다. 모든 리파아제 반응은 50 ㎕ 화합물 3, 5 mL MTBE, 5 mL pH 7 포스페이트 버퍼 및 50 wt.% 효소 (키라자임-E1, 키라자임-E2, 키라자임-L2, 칸디다 에스테라아제, 콜린 에스테라아제 및 CLECs, 10 wt.% 제외)의 존재하에 수행되었다. 에스테라아제 및 프로테아제 반응은 MTBE 없이 수행되었다. 반응 후 TLC 및 키랄성 GC가 수행되었다.
아세테이트 중심에서 입체 화학은 벌크 (bulk) 활성 DAPD의 합성에서 나중으로 정해져 있으므로, 그다지 중요한 것이 아니다. 그러므로, 부티레이트 중심에 관하여 분석하는 것이 바람직하다. 그러나, 어느 피크가 어느 이성질체에 해당하는지는 초기에 알려져 있지 않았다. 효소를 함유하지 않은 대조군 반응은 반응 조건 하에서 기질이 안정적이었다는 것을 보여주었다. 화합물 3의 분리를 위한 스크린으로부터의 결과는 표 6 내지 11에 나타낸 바와 같다.
Figure 112006063532414-pct00050
Figure 112006063532414-pct00051
이들 결과는 프로테아제 B, 키라자임-L2, 및 프로테아제 A가 피크 1 및 3에 대하여 적절한 선택성을 가지고 있는 반면에, 펩티다아제 R, 프로테아제 M 및 산 프로테아제 A (뉴라아제 A)가 피크 1 및 3에 대하여 우수한 선택성을 가지고 있다는 것을 보여준다.
Figure 112006063532414-pct00052
그러므로, PLE 및 키라자임-El은 피크 1 및 4에 대하여 적절하게 선별적이다.
Figure 112006063532414-pct00053
이들 결과는 파파인이 피크 1에 대하여 매우 좋은 선택성을 나타낸다는 것을 보여준다.
Figure 112006063532414-pct00054
Figure 112006063532414-pct00055
이들 결과는 리파아제 AK, 리파아제 MY 및 리파아제 AY는 피크 2 및 3에 대해 적절하게 선별적이라는 것을 나타낸다.
Figure 112006063532414-pct00056
그러므로, 피크 2 및 4에 대해 선별적인 어떠한 효소도 특히 높은 거울상 이성질체 과량을 제공하지 않는다.
Figure 112006063532414-pct00057
이들 결과는 리파아제 PS가 피크 2에 대해 적절하게 선별적이라는 것을 나타낸다.
α-키모트립신, 리파아제 GC, 리파아제 PGE, 리파아제 N conc, 리파아제 G, 리파아제 R, 리파아제 M, 리파아제 A "아마노" 12, 리파아제 AU 마일즈 1988, 리파아제 F1 바이오콘., 맥아 리파아제, 파파인 W-40, 프로테아제 S, 프로테아제 X 및 펩신을 이용해서는 어떠한 반응도 관찰되지 않았다.
비선택적 가수분해를 제공하는 효소는 너무 빨라서 어떠한 거울상 이성질체 과량 데이타도 모을 수 없는 반응을 제공하는 산 프로테아제 II (뉴라아제II), 브로멜라인 F, 알카라아제, 사비나아제, 에스퍼라아제, ChiroCLEC-BL, 트립신, ChiroCLEC-PC, SAWA 고정된 슈도모나스 리파아제 및 리파아제 F. 칸디다 에스테라아제 (Altus)이었다.
이 스크린이 완료된 다음, 분석된 화합물 3의 샘플은 PPL 분리에서의 (S)-화합물 1 환원에 의해 제조되었다. 이를 이용하여 피크 1 및 4를 제공하는 ee/de 분석을 수행하였다. PPL 분리가 (S)-화합물 1을 제공하므로, 피크 2 및 3은 화합물 3의 분리를 위한 요구되었다. 스크린에 의한 결과는 대부분의 효소가 화합물 3을 아세테이트 중심에서 용해시키나, 부티레이트 중심을 필요로 하는 것은 아니라는 것을 나타내었다. 그러나 리파아제 AK, 리파아제 MY, 리파아제 AY 및 리파아제 PS는 적절한 선택성과 함께 요구되는 피크를 제공한다.
리파아제 PS 및 리파아제 MY를 이용한 화합물 3의 분리가 더 연구되었다 (리파아제 AK는 아마노에 의해 중지됨). 분리가 능률적이었다면, 산물의 스케일-업 (Scale up) 및 분리가 결정될 필요가 있었다 (표 12 참고). 톨루엔에 든 리파아제 PS는 58%의 효과적인 ee 및 3.7의 효과적인 E를 가지는 시작 물질을 39% 수율로 회수하였다 (이는 혼합물에 존재하는 정확한 (R)-부티레이트의 양의 측도 (measure)를 제공함). 이러한 선택성은 리파아제 PS를 사용하여 화합물 1에 대하여 수득된 것이나 다름없다, E=5.3. 더욱이, 일 구현예에서, 분리 단계는 반응 순서에서 초기에 있으므로, 하기 실시예는 화합물 1의 분리를 최적화하는데 집중되어 있다.
Figure 112010006056316-pct00126
Figure 112006063532414-pct00059
실시예 18
Figure 112006063532414-pct00060
화합물 11
화합물 11에 대한 분석적 전개
화합물 11에 대한 키랄성 분석이 요구되었다. 기준선 분리는 Chiralpak AS 컬럼을 사용하는 키랄성 HPLC에 의해 수행되었다. 도 1C 참고.
HPLC 조건:
컬럼: Chiralpak AS
치수: 250 mm x 4.6 mm
이동상: 1:1 IPA:EtOH
유속: 0.6 ㎖/분
검출: UV 254 nm
온도: 주변 온도
보유 시간: 피크 1 - 11.96 분 피크 2 - 13.17 분
이러한 화합물은 상업화 효소 스크린뿐만 아니라, 미생물 스크린 ( > 400 샘플)을 겪으므로, 5분 아래의 실행 시간이 요구되었다. 이것이 달성된 경우, 이전의 분석이 SFC에 적용되었다. 도 1D 참고.
SFC 조건:
컬럼: Chiralpak AS
치수: 250 mm x 4.6 mm
이동상: 95% C02:EtOH
유속: 3.0 ㎖/분, 3000 psi
검출: UV 254 nm
온도: 35℃
보유 시간: 피크 1 - 2.88 분 피크 2 - 3.95 분
화합물 11에 대한 효소 스크린
리파아제: 신틸레이션 유리병에 40 ㎕ 화합물 11, MTBE (5 mL), 50 mM KH2PO4, pH 6 (5 mL), 및 ~10 mg 효소를 넣고, 30℃ 배양기에서 흔들어 주었다. 분취량을 주기적으로 제거하여 TLC (50% EtOAc/헵탄) 및 키랄성 HPLC로 분석하였다.
프로테아제 및 에스테라아제: 상기 기재한 바와 같으나, MTBE는 없음.
사용된 효소가 리파아제 또는 프로테아제/에스테라아제인가에 따라, 두 세트의 조건이 화합물 11, 라세미 메톡시벤조에이트 에스테르를 스크린하기 위해 사용되었다. 리파아제-촉매 가수분해의 경우, 반응 용매는 pH 6의 1:1 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE):50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼이었다. 프로테아제 및 에스테라아제-촉매 가수분해의 경우, 반응은 혼합할 수 없는 유기 공용매가 없는 포스페이트 버퍼에서 수행되었다. 30℃ 배양기 내의 신틸레이션 유리병에서 반응을 수행한 다음, 박막 크로마토그래피 (TLC)를 수행하였다. 잔존하는 기질의 거울상 이성질체 과량 (ees 수치)은 HPLC 분석 (Chiralpak AS)에 의해 결정되었다. 이러한 에스테르의 가수분해로 인한 알코올 산물은 상기 실시예에서 불안정한 것으로 알려져 있었다. 그러므로, 가능한 산물에 대한 키랄성 분석이 없다면, 전환은 산정될 수 없으므로, TLC 분석에 의해 어떠한 기질이 여전히 존재하는 것으로 기록되었다.
스크린의 결과는 하기 표에 나타낸 바와 같다. 표 13은 키랄성 HPLC 분석에서 피크 1에 해당하는 거울상 이성질체를 선별적으로 남기는 효소에 대한 결과가 및 에러 ! 참고문헌은 피크 2에 대해 선별적인 효소에 대한 결과에 근거하지 않는다는 것을 보여주고 있다.
HPLC 분석에서 피크 1을 선별적으로 남기는 효소
효소 시간 ees/% 비고
리파아제 M 72시간 24 피크 1
2주 29 기질 존재
리파아제 PS 72시간 7 피크 2
2주 22 기질 존재
키라자임-L9 72시간 19 피크 1
2주 56 기질 존재
리파아제 MY 72시간 7 피크 1
2주 21 기질 존재
리파아제 DS 72시간 25 피크 1
2주 66 기질 존재
리파아제 F-DS 72시간 52 피크 1
2주 80 기질 존재
리파아제 F 72시간 37 피크 1
2주 68 기질 존재
키라자임-L2 18시간 100 피크 1
2주 100 기질 존재
리파아제 AY 72시간 31 피크 1
2주 69 기질 존재
리파아제 A "아마노" 12 72시간 16 피크 1
2주 45 기질 존재
리파아제 N 콘 72시간 33 피크 1
2주 46 기질 존재
리파아제 AP6 72시간 17 피크 1
2주 43 기질 존재
시그마 CCL 72시간 20 피크 1
2주 62 기질 존재
산 프로테아제 A 48시간 24 피크 1
2주 76 기질 존재
산 프로테아제 DS 48시간 66 피크 1
2주 92 기질 존재
HPLC 분석에서 피크 2를 선별적으로 남기는 효소
효소 시간 ees/% 비고
리파아제 PS 72시간 7 피크 2
2주 22 기질 존재
하기 효소는 비선택적이다 (< 20% ees, 어느 피크에서든): SAWA 고정된 리파아제; Chiroclec-PC; 프로테아제 B; 뉴라아제 F; 알카라아제; 리파아제 R; PPL; 리파아제 G; PLE; 키라자임-E1; 키라자임-L5; ChiroCLEC-CR; 프로테아제 M; 펩티다아제 R; 산 프로테아제 A-DS; 프로테아제 N; 프로테아제 A2G; 프로테아제 NL; 프로테아제 DS; 프로테아제 S; 프로테아제 P "아마노" 6; 프로자임 6; 프로리더; 브로멜라인-F; 파파인 W-40 (아마노); 파파인 (시그마); 프로테아제 X; 프로테아제 XXXI; 사비나아제; 에스퍼라아제; 펩신; ChiroCLEC-BL; 콜린 에스테라아제; 키라자임-E2; 및 α-키모트립신.
실시예 19
화합물 11 키라자임 - L2 분리의 스케일-업
화합물 11 분리의 초기 연구 동안, 키랄성 HPLC 분석에서 거울상 이성질체가 어떻게 피크와 관련되는지는 알려져 있지 않았다. 절대적인 배열을 결정하기 위하여, 배열이 결정된 DAPD 중간체까지 샘플을 전체 합성 순서에 따라 진행시켰다. 스크린으로부터 가장 가능성 있는 효소 중 하나는 키라자임-L2이었다; 그러므로, 상기 반응은 샘플을 제조하기 위하여 규모가 확대되었다. 기질 농도는 20 g/L까지 증가되었고, 효소 부하는 감소되었지만, 다른 과정의 최적화는 최소화되었다. pH를 5 내지 6으로 유지하면서 30℃에서 5 wt.% 키라자임-L2, 라세미체 1 g을 주입하면서, > 98% ee 및 우수한 순도로 에스테르 0.321g (32%)을 수득하였다.
Figure 112006063532414-pct00061
도식 12: 화합물 11 분리의 스케일-업
반응은 10 g까지 더 규모가 확대되었다; 3.5시간 후에, 화합물 11 3.9 g을 흰색의 고형물 형태로 39% 수율, > 99% ee로 수득하였다. 이는 바람직하지 않은 (S)-거울상 이성질체인 것으로 밝혀졌다. 그 결과, 바람직한 (R)-거울상 이성질체는 키랄성 HPLC 분석에서 피크 2에 해당해야만 했다.
그러므로, 30℃에서 500 mL 자켓티드 베슬을 MTBE (250 mL), 라세미 화합물 11 (10.00 g, 39.7 mmol, TP-43/100) 및 50 mM KH2PO4, pH 6 (250 mL)으로 채웠다. 교반시키면서 상기 혼합물에 키라자임-L2 (500 mg, 5 wt.%)를 첨가하였다. 2N NaOH를 첨가하여 pH를 pH 5 내지 6으로 유지하였다. 3.5시간 후에, 염기 흡입을 중단시키고, 셀라이트®를 통해 혼합물을 여과하고 분리하였다. 수성층을 MTBE (2 x 200 mL)으로 추출하고, 유기층을 회합한 다음, 2N NaOH (200 mL), 소디움 설파이트 (200 mL), 2N HCl (200 mL)로 세정하고, 건조시켰다 (MgS04).
진공 상태에서의 농축을 통해 흰색의 고형물 형태로 화합물 11을 수득하였다. 수율 3.89 g, 39%; ee > 99%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 구조와 일치.
실시예 20
화합물 11의 리파아제 PS 분리의 스케일-업
초기 스크린에 의해, 리파아제 PS만이 화합물 11의 바람직한 (R)-거울상 이성질체를 제공하는 후보자였다 (에러!참고문헌 근원 (Error! Reference source)은 발견되지 않음). 상기 분리는 그의 선택성을 결정하기 위하여 2 g까지 규모가 증대되었다. 대략 50% 전환에서, 잔존하는 에스테르의 거울상 이성질체 과량은 겨우 8%였다. 효소는 명확하게 다양한 과정을 위해 충분히 선별적이지는 않았다.
30℃에서 100 mL 자켓티드 베슬을 MTBE (25 mL), 라세미 화합물 11 (2.00 g, 7.94 mmol, TP-43/100) 및 50 mM KH2PO4, pH 6 (25 mL)로 채웠다. 교반시키면서 리파아제-PS (100 mg, 5 wt.%)를 혼합물에 첨가하였다. 2N NaOH를 첨가하여 pH를 pH 5 내지 6으로 유지하였다. 대략 50% 전환 (염기 흡입에 의함)에서, 분취량을 채취하여, 8% ee인 것으로 분석하였다. 추가 24시간 후, 기질은 검출되지 않았다.
실시예 21
미생물 효소 스크린
96 웰 배양 플레이트를 준비하기 위한 일반적인 과정.
2.2 mL 96 딥 웰 플레이트을 사용하였다. 박테리아를 위한 무균 TSB (트립톤 소야 배양액, 옥소이드 CM129) 또는 효모를 위한 무균 YM (효모 몰드 배양액, 옥소이드 CM920B) 1.0 mL을 각 유리병에 첨가하고, 배양체의 원균 (stock)을 접종하였다. 플레이트를 25℃에서 48시간 이상 동안 흔들어 주었다. 세포 펠렛을 원심분리 (4℃, 1000 g, 10분)로 회수하고, 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛은 스크리닝에 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
화합물 11에서 96 딥 웰 배양 플레이트 스크리닝.
화합물 11의 200 g/L 원액 (stock solution)을 아세톤에 제조하였다. 450 ㎕ 0.1M Tris-HCl + 0.1% Tween 80, pH 7.0 및 50 ㎕ 화합물 1 원액을 96 딥 웰 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 25℃에서 72시간 이상동안 이 플레이트를 흔들어 주었다. 샘플을 MTBE로 추출하고, 키랄성 HPLC로 분석하였다.
박테리아 및 효모의 범위에 대하여 스크린을 수행하였다. 이를 96 딥 웰 플레이트에서 배양한 다음, 그들의 세포 펠렛을 원리분리로 회수하였다. 이는 펠렛이 스크린을 위해 기질과 함께 버퍼에 재현탁될 수 있게 한다. 25℃에서 72시간 이상 동안 플레이트를 흔들어 주었다. 샘플을 MTBE로 추출하고, 키랄성 HPLC로 분석하였다. 스크린으로부터의 결과는 도 3C에 정리한 바와 같다. 몇몇 히트 (hit)는 분석에서 피크 1에 해당하는 거울상 이성질체를 남기는 것에 대하여 선별적인 것으로 확인되었지만, 몇몇 균주만이 낮은 ee로 바람직한 거울상 이성질체 (피크 2)를 제공하였다. 이는 야생형 미생물에서 발현되는 효소의 레벨이 낮아서, 전환 역시 낮기 때문인 것으로 추측된다. 사용된 고속 (high throughput) 키랄성 HPLC 방법이 대략적인 수치를 제공할 뿐이라는 것을 명심해야 할 것이다. 가장 좋은 결과는 표 15에서 대조된다.
Figure 112010006056316-pct00127
선별적으로 피크 2를 제공하는 5개의 균주와 피크 1을 제공하는 3개의 균주를 추가 실험을 위해 선별하고, 초기 스크린으로부터 상기 결과를 검증하였다; 그 결과는 표 16에 나타낸 바와 같다. 1차 스크린으로부터 피크 2에 대한 최상의 후보자인, CMC 103522 만이 ≤ 10% ee 피크 2에서 그의 선택성을 확인하였다.
Figure 112006063532414-pct00063
실시예 22
Figure 112006063532414-pct00064
화합물 12
화합물 12에 대한 분석적 전개
화합물 12에 대한 키랄성 분석이 요구되었다. 도 1E 참고. 분석 조건에 대한 세부사항은 하기 기재된 바와 같다:
HPLC 조건:
컬럼: Chiralpak AS
치수: 250 mm x 4.6 mm
이동상: 1:1 IPA:EtOH
유속: 0.8 ㎖/분
검출: UV 254 nm
온도: 주변 온도
보유 시간: 피크 1 - 6.91 분 피크 2 - 7.66 분
다시 이 분석은 SFC에 대해 행해져서, 다수의 미생물 스크린 샘플이 가능한 한 짧은 시간 내에 분석될 수 있도록 5분 이하의 실행 시간을 가능하게 한다. 도 IF 참고.
SFC 조건:
컬럼: Chiralpak AS
치수: 250 mm x 4.6 mm
이동상: 95% C02 : EtOH
유속: 3.0 ㎖/분, 3000 psi
검출: UV 254 nm
온도: 35℃
보유 시간: 피크 1- 3.06 분 피크 2 - 3.81 분
효소 스크린.
화합물 12를 96 웰 배양 플레이트에 대하여 스크린하였다. 화합물 12에 대한 스크린은 화합물 11에 대해 전개된 것에 준한 것이지만, 10개의 효소에만 한정된 것은 아니다. 효소가 리파아제 또는 프로테아제/에스테라아제 인가에 따라 2 세트의 조건이 사용되었다. 리파아제-촉진 가수분해의 경우, 반응 용매는 pH 6의 1:1 MTBE:50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼이었다. 프로테아제 및 에스테라아제-촉진 가수분해의 경우, 반응은 혼합할 수 없는 유기 공용매가 없는 포스페이트 버퍼에서 수행되었다. 모든 반응에서, 사용된 기질의 양은 40 mg이었다. 반응은 30℃ 교반기 배스에서 수행되었고, 거울상 이성질체 과량 수치는 HPLC 분석 (Chiralpak AS)에 의해 결정되었다. 3개의 양성 결과는 표 17에 정리한 바와 같다.
Figure 112006063532414-pct00065
하기 효소는 화합물 화합물 2에 덜 선별적인 분리를 제공한다 (< 20% ees): 리파아제 F-DS; 리파아제 PS; 리파아제 DS; 리파아제 AY; 리파아제 F; 산 프로테아제 A; 및 리파아제 N 콘.
샘플을 키랄성 HPLC로 분석하였다; 그 결과는 도 3D에 정리한 바와 같다. 도 3D에서 볼 수 있는 바와 같이, 미생물 균주는 모든 거울상 이성질체에 대하여 선별적인 것으로 확인되었다. 전환, 즉 참된 선택성은 밝혀져 있지 않다. 키라자임-L2가 HPLC 분석에서 피크 2에 해당하는 거울상 이성질체를 남기는 우수한 효소로 확인된 반면, 이런 제한된 스크린에서 피크 1을 남기는 효소는 어느 것도 확인되지 않았다. 화합물 2에 대한 키랄성 분석에서 피크가 요구된 (R)-거울상 이성질체에 해당한다는 것은 밝혀져 있지 않다.
실시예 23
Figure 112006063532414-pct00066
화합물 13
배열의 화학적 결정 (determination)
GC 크로마토그램의 어느 피크가 바람직한 거울상 이성질체에 해당하는지를 결정하는 방법으로, 진짜 샘플은 실릴 에테르로부터 제조될 수 있다고 가정할 수 있다. 거울상 이성질체적으로 풍부한 실릴 에테르를 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF)을 가진 테트라하이드로퓨란 (THF)에 든 2-메틸프로파노일 클로라이드를 사용하여 가열하였다 (도식 13 참고).
Figure 112006063532414-pct00067
도식 13: 화합물 13에 대한 배열 결정
실릴 에테르를 절단하고, 생성된 알코올을 in situ 상에서 산 클로라이드으로 포착하는 것이 목적이었다. 중간체 알코올이 불안정하다 할지라도, 작은 분획만이 분해되기 보다는 산 클로라이드와 빨리 반응한다면, 그 후에 공지된 배열의 에스테르는 생성될 수 있다. 키랄성 분석은 GC 방법이므로, 민감도는 높으며, 미량 (minute quantity)이 검출될 수 있다. (R)-실릴 에테르에서 시작하여, 양자의 경우 피크 1에서 증가된, 산물에 대한 GC 크로마토그램에서 피크가 관찰되었다. 라세미체를 가진 샘플을 스파이킹 (Spiking)하는 것은 피크가 바람직한 에스테르에 해당한다는 것을 확인시켜 주었다. 아마도 중간체인 것으로 추측되는 어미 알코올 (parent alcohol)의 잠재적인 불안정성 및 매질의 산도 때문에, 거울상 이성질체 과량에서 약간의 손실은 양자의 경우 모두에서 관찰되었다. 시작하는 실릴 에테르의 절대 배열은 바람직한 (R)-배열인 것으로 알려져 있다. 또한, n-부타노에이트 에스테르에 대한 GC 분석에서 피크 1을 제공하는 거울상 이성질체는 요구되는 거울상 이성질체인 것으로 알려져 있다. 그러므로, (R)-실릴 에테르와 2-메틸프로파노일 클로라이드의 반응은 화합물 13의 요구되는 거울상 이성질체를 제공할 것이고, 이는 GC 분석에서 피크 1에 해당할 것이다. 실릴 에테르의 다른 거울상 이성질체가 사용될 수 있으므로, 부가적인 확인을 위하여, 2-메틸프로파노일 클로라이드를 이용하는 반응에서 피크 2가 거울상 이성질체를 제공한다는 것을 확인하였다.
거울상 이성질체적 실릴 에테르로부터 에스테르를 제조하기 위한 실험적 과정
THF 5 mL에 든 150 mg의 실릴 에테르, 0.5 mL의 산 클로라이드 및 0.4 mL의 TBAF (THF에 든 1M)의 혼합물을 가열하여 3 내지 4 시간 동안 질소 하에서 환류시켰다. TLC 결과 소량의 산물이 형성되었음을 확인하였다. 분취량을 취하여, 실리카의 플러그 (plug)로 관통시킨 다음, 키랄성 GC로 분석하였다.
실시예 24
화합물 13에 대한 분석적 전개
키랄성 GC 분석을 전개하여 화합물 13의 거울상 이성질체를 분리하였다. 도 1G 참고. 자세한 분석 조건은 하기 기재한 바와 같다:
GC 조건:
컬럼: Chirasil DEX CB
치수: 25 m x 0.25 mm
온도 프로그램: 8분 동안 140℃ 그 후 15℃/분 으로 200℃까지
운반체 가스: 헬륨 @ 20 psi
검출: FID @ 200℃
보유 시간: 피크 1 - 6.5 분 피크 2 - 6.8 분
또한, 비키랄성 GC 분석을 전개하여 화합물 13의 순도를 결정하였다. 도 1H 참고. 자세한 분석 조건은 하기 기재된 바와 같다:
GC 조건:
컬럼: J & W Scientific DB5
치수: 15 m x 0.25 mm
필름 두께: 0.25 ㎛
온도 프로그램: 5분 동안 40℃ 그 후 10℃/분으로 200℃까지
운반체 가스: 헬륨 @ 12 psi
검출: FID @ 200℃
보유 시간: 화합물 3 - 17.80 분
효소 스크린
n-부타노에이트 에스테르의 안정성은 pH 6에서 두드러지게 우수한 것으로 결정되었다. 그러므로, sec-부타노에이트 에스테르, 화합물 13의 스크리닝을 위하여 유사한 조건이 사용되었다. 상용화된 리파아제, 프로테아제 및 에스테라아제를 사용하는 효소 가수분해를 위하여 라세미 화합물 13을 스크린하였다. 모든 리파아제 반응은 40 ㎕ 화합물 13, 5 mL MTBE, 5 mL pH 6 포스페이트 버퍼 및 20 wt. % 효소의 존재 하에 수행되었다. 에스테라아제 및 프로테아제 반응은 존재하는 MTBE없이 수행되었다. 혼합물을 30℃ 배양기에서 흔들어 주고, TLC 및 키랄성 GC로 모니터링하였다. 다른 에스테르처럼, 알코올 산물은 상기 기재한 바와 같이 불안정하다. 그러므로, 산물을 위한 어떠한 키랄성 분석도 가능하지 않으며, 전환은 산출될 수 없었다. 스크린에 있어서, 어떤 기질이 TLC 분석에 의해 여전히 존재했는지 여부가 주목할 만 하다. 스크린으로부터의 최상의 결과는 하기 표 18에 나타낸 바와 같다.
Figure 112006063532414-pct00068
하기 효소는 화합물 13에 덜 선별적인 반응을 제공하였다 (< 20% ees): 리파아제 DS; 리파아제 AY; 리파아제 F; 리파아제 N 콘; SAWA 고정된 리파아제; ChiroCLEC-PC; 리파아제 MY; 프로테아제 B; 뉴라아제 F; 알카라아제; 리파아제 R; PPL; 리파아제 G; PLE;키라자임-El ; 리파아제 A "아마노" 6; 리파아제 A "아마노" 12; 리파아제 AP6; 시그마 CCL; 키라자임-L5; ChiroCLEC-CR; 펩티다아제 R; 산 프로테아제 A-DS; 프로테아제 N; 프로테아제 A2G; 프로테아제 NL; 프로테아제 DS; 프로테아제 S; 프로자임 6; 프로리더; 브로멜라인- F; 파파인 W-40 (아마노); 파파인 (시그마) ; 프로테아제 X; 프로테아제 XXXI; 사비나아제; 에스퍼라아제; 펩신; ChiroCLEC-BL; 키라자임-E2 ; 및 α-키모트립신.
표 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 키랄성 GC 분석에서 피크 1을 선별적으로 남기는 모든 효소는 다행히 바람직한 거울상 이성질체에 해당하는 것으로 판단할 수 있다. 스크린된 효소 중 어느 것도 피크 2에 대해 선별적이지 않았다. 4개의 효소가 낮은 부하를 가진 채로 재-스크리닝을 위해 선택되었고, 그 결과는 표에서 볼 수 있는 바와 같다. 이들 중 가장 가능성 있는 것은 5.5 시간 후에 90% ee로 잔존하는 에스테르를 남기는 키라자임-L2이었다.
Figure 112006063532414-pct00069
실시예 25
화합물 13의 키라자임 - L2 분리의 스케일-업
키라자임-L2 분리를 1 g, 효소 30 mg 및 pH 6 포스페이트 버퍼 및 MTBE 각 25 mL까지 규모를 증가시켰다. 완료된 다음, 반응에 의해 무색의 오일 형태로 화합물 13의 21 %Th, 0.212 g을 수득하였다. 1H NMR 스펙트럼은 기질로부터 생성되는 상당한 양의 불순물이 존재한다는 것을 보여주었다.
6 g 스케일에서, 20℃에서 동일한 조건을 사용하였을 때, 수율은 연한 노란색 오일 형태로 분석된 화합물 3 88% ee의 25% Th, 1.52 g이었다. 1H NMR은 약간의 불순물이 존재했다는 것을 다시 확인시켰다. 선택성은 낮은 온도, 0℃에서 개선되었다. 라세미체 5.25 g으로부터 시작하여, 4.5 시간 후에 분리는 92% ee 화합물 3의 28% Th, 1.48 g를 생성하였다. 배열은 요구된 (R)-거울상 이성질체로 확인되었다.
초기에, 생분리는 적합한 농도, 20 g/L에서 수행되었다. 부피 효율을 증가시키는 것의 효과를 연구하기 위하여, 분리를 pH 6 포스페이트 버퍼 및 MTBE에서 50 g/L, 0℃로 1 g 스케일에서 반복하였다. 4.5 시간 이후, 생체내 변화는 92% ee로, 연한 노란색 오일 형태로 물질의 44% Th, 0.44 g을 산출하였다. 이로부터, 부피 효율은 선택성에서의 주목할만한 손실없이 개선될 수 있다는 것을 결론지을 수 있었다.
상기 과정에 의해 수득된 산물의 순도는 낮았다. 몇몇 불순물은 라세미체로부터 생성되었다. 적합한 선택성의 생분리를 위하여, 전환이 임의로 증가되어, 잔여 에스테르의 높은 순도의 거울상 이성질체를 수득할 수 있다.
불순물 중 하나, 도식 14에 나타낸 하이드록시아세트알데하이드의 2-메틸프로파노에이트 에스테르는 라세미체에 존재하였다. 그러나, 이것이 하기 요약된 바와 같이, 생분리에서도 생성된 것인지는 명확하지 않다.
Figure 112006063532414-pct00070
도식 14: 불순물의 형성
어떤 부가적인 알데하이드가 생체내 변화 동안 생성되는지 결정하기 위하여, 알데하이드를 함유하지 않은, 증류한 락톤을 사용하여 동일한 스케일 (1 g)로 분리를 반복하였다. 이 반응은 93% ee 산물의 29%, 0.29 g을 산출하였다. 1H NMR 스펙트럼은 알데하이드가 존재함을 보여주었다; 분명히, 이 물질은 반응 동안, 또는 종료 후 생성된다.
용매를 톨루엔으로 바꾸는 것은 느리지만, 선별적인 분리를 일어나게 한다. 50 g/L, 1 g 스케일에서, 반응은 22.5 시간 후에 종결되어, > 99% ee 에스테르의 30% 수율, 0.30 g을 산출하였다. 0℃에서, pH 6 포스페이트 버퍼 및 톨루엔 각 10 mL에서, 라세미체 4 g을 사용하여, 농도를 200 g/L으로 증가시켰다. 과정은 고도로 부피 능률적이며, 어떠한 문제도 발생하지 않았다. 17시간 후, 생체내 변화는 95% ee 산물의 28%, 1.11 g을 산출하였다.
효소 부하 및 반응 시간을 달리 사용하여, 좀 더 큰 규모 (2 내지 10 g)로 몇몇 반응을 수행하였다; 그 결과는 하기 표 20에 정리한 바와 같다. 반응의 속도는 전반적으로 예측할 수 없었다. 다른 불순물 프로파일을 가진 라세미체의 다른 배치와 이상의 용매-고정 효소 시스템의 혼합에 있어서의 차이점을 포함하는, 몇몇 요인이 이에 관여하는 것으로 추측되고 있다. 불순물이 라세미체로부터 생성될 수 있으므로 수율은 오해될 수 있다. 이런 규모에 의해, 티오설페이트, 바이카르보네이트 및 산성 세정이 알데하이드 불순물의 양을 현저하게 감소시키지 못하는 것이 밝혀졌다. 종료 과정은 약간의 정화 (clarification)를 필요로 하지만, 이 단계에서, 분리 후 적합한 세정 및 쿠겔로흐 증류 (규모상 와이프드-필름 (wiped-film))의 조합은 효과적일 수 있다. 이는 나중에 좀 더 큰 규모로 연구되었다. 이러한 모든 생체내 변화는 200 g/L에서 톨루엔-버퍼 이상의 시스템을 사용하였다.
Figure 112006063532414-pct00071
0℃, 200 g/L에서, 10 wt.% 효소를 사용하여 과정을 30 g까지 규모를 증가시켰다. 쿠겔로흐 증류 후, > 95% ee 에스테르의 4.2 g을 회수하였다.
상기 기재한 바와 같이, 라세미체의 순도는 생체내 변화 다음에 수득할 수 있는 수율 및 양에 있어서 매우 중요하다. 더욱이, 정확한 전환과 함께 분리의 참된 선택성을 결정하기는 어렵다. 생분리의 산물은 분리될 수 없기 때문에, 거울상 이성질체 과량 데이타로부터 사용할 수 없다; 사용할 수 있는 정보는 잔류 기질의 거울상 이성질체 과량이다. 선택성의 아이디어 (idea)는 에스테르의 수율로부터 얻을 수 있지만, 불순물로 인해 오염되므로, 정확성은 믿을 수 없다.
최종 과정을 고려할 때, 가공하지 않은 라세미체를 사용하고, 예를 들어, 와이프드-필름 증류에 의해 생분리 다음에 정제하는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 불순물은 효소를 억제할 수 있다. 거의 전혀 가공하지 않은 기질을 사용하는 과정의 가능성이 연구되었다; 대략 1 g의 기질을 함유하는, DME, 물 및 다른 불순물을 함유한 라세미체의 혼합물이 생분리에서 사용되었다. 생체내 변화 동안, 어떠한 염기도 소모되지 않았으므로, 부가적인 효소를 첨가하였다. 16시간 후에 분취량이 제거되고, 라세미로 밝혀졌다. 이러한 발견은 효소가 상기 혼합물에 존재하는 불순물에 의해 " 없어진 것으로(killed)" 추측하게 하였다.
그러므로, 일 구현예에서, 기질의 정제는 생분리 이전이 바람직하다.
실시예 26
2- 프로판올 -물에서의 생체내 변화
초기에 언급한 바와 같이, 기질의 안정성은 중요한 문제점이었다. 락톤이 글리콜산 및 하이드록시아세트알데하이드의 2-메틸프로파노에이트 에스테르에 오픈 (open)되는 배경 (background) 과정은 제외될 수 있다 (도식 15).
Figure 112006063532414-pct00072
도식 15: 락톤의 링-오프닝
화합물 13에 대한 효소의 활동 모드는 이미 알려져 있다. 생분리 이후에 검출되는 유일한 산물은 글리콜산 및 하이드록시아세트알데하이드의 2-메틸프로파노에이트 에스테르이다. 그러나, 리파아제에 대한 활동의 통상적인 모드는 에스테르를 가수분해하는 것이다; 이는 락톤 및 2-메틸프로피온산을 제공한다 (도식 16). 락톤 알코올 산물은 검출되지 않으며, 글리콜산 및 하이드록시아세트알데하이드로 분해된다. 이 기작이 정확하다면, 에스테르화된 알데하이드는 하이드록시아세트알데하이드와 2-메틸프로피온산의 반응으로부터 생성되어야 한다. 택일적인 기작은 효소가 에스테르의 첫 번째 절단없이 락톤을 오픈하기 위하여 직접적으로 작용할 수 있다. 락톤 링이 오픈되는 이러한 활동 모드는 간 에스테라아제에 대하여 관찰되지만 (예를 들어: E. Fouque and G. Rousseau Synthesis 1989, 661; 및 P. Barton and M.I. Page J. Chem . Soc ., Perkin Trans. 2, 1993, 2317 참고), 아마도 상기 경우에서 일어날 것 같지는 않다.
Figure 112006063532414-pct00073
도식 16: 가능한 반응 기작
생체내 변화에서 첨가물의 사용은 선택성을 증진시키는 것으로 널리 보고된 바 있으나, 거울상 이성질체 과량에 대한 그의 효과는 대개 예측할 수 없는 것이다. 예를 들어: T.V. Hansen, V. Waagen, V. Partali, H.W. Anthonsen and T. Anthonsen, Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 499; G. Duan and J.Y. Chen, Bioteclnology Letters 1994, 16, 1065; N.W. Boaz and R.L. Zimmerman, Tetrahedron Asymmetry 1994, 5, 153; and K. Faber, G Ottolina and S. Riva, Biocatalysis 1993, 8, 91. 활동 모드 역시 대개 불명료하다; 첨가물은 층 전이 촉매 (phase transfer catalyst), 효소 변형제로 작용할 수 있거나, 택일적으로 친핵제로서 물에 작용할 수 있다. (-)-2',3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아사이티딘 (FTC, Coviracil™ 및 엠트리시타빈으로도 알려져 있음)의 분리에 있어서, 알코올:물 혼합물은 정상적인 이상의 또는 주로 수성 시스템에 대하여 좋은 대안이었다는 것이 밝혀졌다. 이는 또한, 효소 선택성 및 기질 안정성 모두와 관련하여, 화합물 13의 분리에서 효과적일 수 있는 것으로 추측되었다. 이 가설은 8:2 2-프로판올:물 용매 시스템에서 100 gL-1로 3 wt.% 효소와 함께 화합물 13 1 g를 사용하여 테스트되었다. 47시간 후에, 반응은 > 98% ee 물질의 47% Th, 0.47 g을 산출하였다.
물 및 알데하이드가 수율을 지지할 수 있을지도 있으나, 2-프로판올-물에서의 초기 결과는 우수해 보였다. 더욱 의미있는 결과는 산물을 정제하기 위하여 증류를 사용한 좀 더 큰 규모에서 얻어졌다. 라세미체는 와이프 필름 증류에 의해 증류되었다. 조건은 5 wt.%의 효소 부하를 가진 200 gL-l에서, 9:1 2-프로판올 (IPA)-물에 든 라세미체 30 g이었다. 이 반응은 10시간 후에 여과되고, 진공상태에서 환원되었다. 거울상 이성질체 과량은 94%인 것으로 관찰되었다. 이 물질은 두 개의 배치로 나누어져 정제 방법을 연구하였다. 첫 번째 부분을 133℃/1.3 Torr에서 쿠겔로흐 장치를 통해 증류시켜, 요구되는 2개의 분획을 수득하였다:
분획 1: 알데하이드 61%, 화합물 3 31% 및 측정되지 않은 양의 글리콜산을 함유한 10.8 g. 80℃/4-5 Torr에서의 추가 증류를 통해 알데하이드를 제거하고, 물로 세정하여, 4% 알데하이드를 함유한 90% 순수한 물질 화합물 3 (4.4 g)을 수득하였다.
분획 2: 알데하이드는 없으나, 상당한 양의 글리콜산 및 화합물 3을 함유한 2.7 g. 물로 세정한 다음, GC에 의해 91% 순수한 화합물 3 (1.8 g)을 수득하였다.
가공하지 않은 물질의 두 번째 부분은 물로 세정된 다음, 140℃/1.6 Torr에서 증류하고, 60℃/1.6 Torr에서 알데하이드를 제거하여, 6% 알데하이드를 함유한 89% 순도의 물질 5.2 g을 수득하였다.
그러므로, 전체에서, 2-메틸프로파노에이트 에스테르 11.4 g은 뛰어난 38% 총 수율에 해당하는, 90% 순도, 94% ee로 생성되었다. 이러한 과정은 톨루엔:버퍼를 사용하고, 추가 최적화가 광학적으로 순수한 락톤에 대한 능률적인 루트를 제공할 수 있으면서, 명료하게 수행되었다.
실시예 27
2- 프로판올 :물에 든 키라자임 - L2 을 사용한 화합물 13 (30g)의 실험적-분리
0℃에서, 500 mL 자켓티드 베슬을 2-프로판올 (135 mL), 물 (15 mL), 및 라세미 화합물 13 (30 g, DB/1005/85/1)으로 채웠다. 혼합물을 교반시키고, 키라자임-L2 (1.5 g, 5 wt.%)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 용액의 분취량을 제거하고, 에틸 아세테이트로 추출하여, 건조한 다음 (MgS04), 키랄성 GC로 분석함으로써, 주기적으로 ees를 측정하였다. 10시간 후, eeg는 93%이었다. 간략하게, 셀라이트®를 통해 혼합물을 여과하고, 진공상태에서 농축한 다음, 연한 노란색 오일 형태로 가공하지 않은 화합물 3 (32.1 g)을 수득하였다. 그런 다음, 오일을 톨루엔에 용해시키고 농축하여 (2 x 250 mL), 어떤 물이든 공비적으로 (azeotropically) 제거하였다. 가공하지 않은 수율 29.4 g, 98%; ee 94%.
이 오일은 두 부분으로 나누어졌다. 첫 번째는 133℃/1.3 Torr에서 쿠겔로흐 장치를 사용하여 증류되었는데, 이는 총 3개의 분획을 제공하였다. 분획 1 (가장 휘발성이 큼)은 61% 알데하이드, 31% 락톤 및 8%의 다른 불순물로 구성된 10.8 g을 함유하였다. 분획 2는 상당한 양의 글리콜산으로 오염된 락톤 2.7 g을 함유하고, 분획 3은 낮은 휘발성을 가진 노란색의 불순물을 함유하였다. 분획 2를 톨루엔 (200 mL)에 용해시키고, 물 (200 mL)로 세정한 다음, 건조시키고 진공상태에서 농축하여, 무색의 GC에 의한 순도가 91%인 무색의 오일 형태로 화합물 13 (1.8 g)을 수득하였다 (알데하이드는 관찰되지 않음). 그런 다음, 80℃/4-5 Torr에서 쿠겔로흐 증류를 통해, 분획 1에서 대부분의 알데하이드를 제거하고, 잔류물로서, 6.1 g의 락톤 함유-12% 알데하이드 및 결정되지 않은 양의 글리콜산을 수득하였다. 그리고 나서, 이 물질을 톨루엔 (200 mL)에 용해시키고, 물 (200 mL)로 세정하여 건조한 다음 (MgS04), 진공 상태에서 농축하여, GC에 의해 4% 알데하이드, 90% 순도인 무색의 오일 형태로 화합물 3 (4.4 g)을 수득하였다.
물질의 두 번째 부분을 톨루엔 (200 mL)에 용해시키고, 물 (200 mL)로 세정하여 건조한 다음 (MgS04), 진공 상태에서 농축하였다. 그 결과 생성된 오일을 쿠겔로흐 장치로 140℃/1.6 Torr에서 증류시킴으로써, 낮은 휘발성 불순물을 제거한 다음, 60℃/1.3 Torr에서 더 증류하여 잔존하는 알데하이드를 제거하였다. 이러한 증류를 통해 제거된 물질은 GC에 의해 5.15 g의 89% 순도, 6% 알데하이드인 것으로 밝혀졌다.
총 수율: 11.4 g, 38% ; GC 순도: 90%
실시예 28
미생물 효소 스크린.
화합물 11 및 12의 경우와 같이, 화합물 13을 96 웰 배양 플레이트에 대해 스크린하였다. 키랄성 GC를 통해 샘플을 분석하였다; 사용된 고속 키랄성 GC 방법은 대락적인 수치만을 제공한다는 것을 명심해야 한다. 스크린의 결과는 도 3E에 나타낸 바와 같다.
다수의 균주는 GC 크로마토그램에서 관찰된 피크 1 및 2 모두에 대한 선택성과 함께, 화합물 13에 대한 활성을 나타내었다. 거울상 이성질체 과량 > 40% ee를 제공하는 것들은 표 21에 나타낸 바와 같다.
Figure 112006063532414-pct00074
1차 스크린의 결과에서, 피크 1에 대한 최상의 선택성 및 좋은 피크 영역을 나타낸 균주를 재-스크린하였다. 그 활성을 재검증받은 균주는 하기 표 22에 나타낸 바와 같다.
Figure 112010006056316-pct00128
실시예 29
CMC 103869 & 103661에 대한 생체내 변화의 스케일-업.
스크린으로부터 2개의 균주가 스케일-업을 위해 선택되었다. 이것은 CMC103869 (미확인) 및 CMC 103661 (S. 세레비지애)이었다. 둘의 배양체가 성장하여, 수득된 세포 페스트를 -20℃에 보관하였다. 생체내 변화는 pH 및 온도 콘트롤 모드를 사용하여 30 mL 규모로 셋업되었다. 초기 생체내 변화는 O.1M Tris-HCl, pH 7에 있었다. 아마도 높은 pH로 인한, 부족한 거울상 이성질체 과량 및 기질 안정성이 관찰되었다. pH를 6으로 낮추는 것은 부분적으로 선택성을 증가시켰으나, 여전히 기질 안정성 문제는 존재하였다. 버퍼를 50 mM KH2PO4, pH 6으로 변화시킨 것은 거울상 이성질체 과량을 더욱 증가시켰다. 두 균주 모두로부터의 결과는 도 4에 정리한 바와 같다. CMC 103869를 이용한 화합물 13의 분리는 70% ee의 잔존하는 에스테르를 제공하였다. CMC 103361을 사용한 결과는 실망스러웠으므로, 이 균주를 이용한 심층 연구를 포기하였다. 모든 생체내 변화에 있어서, 잔존하는 기질의 손실이 관찰되었는데, 이는 아마도 25℃에서의 빈약한 기질 안정성 또는 두 번째 효소로 인한 것으로 추측된다. 최종적으로, 온도를 10℃로 내려줌으로써, 선택성을 95% ee 이상으로 증가시켰으나, 시간 동안 기질의 총 손실은 여전히 존재하였다. 전환 및 그로 인한 절대 선택성은 알려져 있지 않다.
CMC 103661는 플라스크 내 YM 배지에서 성장하였고, CMC 103869는 TSB 배지에서 성장하였다. 두 균주 모두 25℃에서 성장하였고, 세포는 원심분리에 의해 회수되었다 (4℃, 20분, 2000g). 세포 페스트는 -20℃에 보관되었다. 생체내 변화는 온도 및 pH 콘트롤 (1N NaOH)와 함께, 마그네틱 스틸러 (magnetic stirrer)를 가진 200 mL 자켓티드 베슬에서 수행되었다. 세포 페스트를 O.1M Tris-HCl 버퍼 (요구되는 pH로 적정된 버퍼), 또는 50 mM KH2PO4, pH 6에서 10% w/v로 재현탁하였다. 기질, 버퍼 및 세포 페스트를 베슬에 첨가하고, 샘플을 MTBE에 희석하여 키랄성 GC로 분석하였다.
실시예 30
Figure 112006063532414-pct00076
화합물 4
화합물 4에 대한 분석적 전개
분석의 키랄성 분석 HPLC 방법에 대한 조건은 재현되어, 하기 크로마토그램에서 나타나는 분리를 제공하였다:
HPLC 조건:
컬럼: Chiralcel OJ
치수: 250 x 4.6 mm
이동상: 85% 헵탄
15% EtOH
유속: 1.0 ㎖/분
검출: UV @ 254 nm
보유 시간: 1 - 7.47 분
2 - 11.16 분
분석 조건에 있어서, 거울상 이성질체의 피크 모양은 약간 넓었으므로 (도 1K), 상기 분석을 개선하기 위한 노력이 시도되었다. 이는 4 분 이내에 완전히 용해되는 날카로운 피크를 제공하는 두 이성질체를 사용하여, 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC)를 통해 완수되었다. 도 1L 참고.
최적화된 SFC 조건:
컬럼: Chiralcel OJ (250 x 4.6 mm)
이동상: 95% C02, 5% MeOH
유속: 3.0 ㎖/분
압력: 3000 psi
컬럼 온도: 35℃
보유 시간: 1 - 2.73 분 [(-)-거울상 이성질체]
2 - 3.28 분 [(+)-거울상 이성질체]
화합물 4의 생분리
화합물 1의 생체내 변화를 연구하는 동안, 상기 물질이 비-효소 가수분해와 양립할 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 부티레이트의 비누화 이전에 생체내 변화가 락톤의 오프닝인 것에 대해 가능한 경로인, 요구된 락톤알코올 산물의 불안정성 및 가수분해에 대한 화합물 1의 높은 치환성으로 인한 것일 것이다. 이것이 사실이라면, 화합물 4의 효소 분리가 가능할 것이다. 그러므로, 20℃, 톨루엔-pH 7 버퍼에서, 리파아제 PS, PPL, M, MY 및 SAWA 고정된 리파아제를 사용하여 화합물 4의 반응성을 테스트하였다. 어떠한 반응도 관찰되지 않았다 (TLC, 24 시간). 아마도 효소 반응은 부티레이트의 첫 번째 절단에 의해 진행된 다음, 가능한 락톤 오프닝에 의해 진행된다.
고체 라세미 혼합물 연구
화합물 4의 단일 거울상 이성질체 및 라세미체의 IR 스펙트럼을 비교하여, 유사하나 동일하지 않다는 것을 발견하였다.
그런 다음, 시차주사열량계 (DSC)를 통해 상기 화합물 각각의 융해점을 결정하여, 라세미체에 대해 91.7℃ 및 (-)-거울상 이성질체 (98.7% ee)에 대해 81.1℃의 용융 (melting) 개시 (onset)를 제공하는 것으로 발견하였다. 상기 융해점을 비교한 결과, 라세미체는 단일 거울상 이성질체보다 높은 융해점을 가진다는 것을 발견할 수 있었다. 고체 라세미 혼합물인 화합물에 대하여, 라세미체 및 단일 거울상 이성질체의 IR 스펙트럼은 동일해야만 하며, 라세미체의 융해점은 상평형 그림에서 가장 낮은 지점인 것으로 요구된다. 그러므로, 상기 화합물은 명백하게 고체 라세미 혼합물이 아니다.
그 후에, 화합물 4에 대한 상평형 그림이 제작되었다. 상기 화합물의 ee가 결정화에 의해 거울상 이성질체 순도까지 증진될 수 있는 포인트 이상으로 공융 혼합물의 위치가 결정되었다. 이러한 상평형 그림 정보는 10% ee 증분 (10% ee)으로 거울상 이성질체 과량을 다르게 하는 샘플의 융해점 (다시 DSC에 의해)을 분석함으로써 얻어지는 것이다. 이러한 샘플은 초기에 요구되는 양의 라세미체 및 단일 거울상 이성질체를 아세톤에 용해시키고, 용매를 제거함으로써 제조되었다. 이 방법은 오직 1개의 피크를 함유하는 DSC 트레이스 (trace)와 함께, 10% ee, 80% ee 및 90% ee 샘플에 대하여 성공적이었다. 그러나, 모든 다른 샘플에 있어서는 DSC에 의해 2개의 피크가 관찰되었다 (아마도 동질이상 (polymorph)에 기인한 것으로 추축됨). 이와 같은 문제를 제거하기 위하여, 이러한 샘플을 제작하기 위한 다수의 방법이 시도되었다. 이들은 샘플을 녹이는 것; 아세톤에 용해시키고, 65℃에서 하룻밤 동안 가열하는 것; 용매로 디클로로메탄을 사용하고 65℃에서 하룻밤 동안 용해시키고 가열하는 것을 포함하였으나; DSC는 여전히 2개의 피크를 제공하였다. 그러므로, 상평형 그림/공융 혼합물은 이와 같은 방법으로 결정할 수 없었다. 또한, 화합물은 극도로 가용성이므로, 오직 각각 단일 거울상 이성질체 및 라세미체 1 g만을 사용할 수 있으며, 용해도 연구는 배제되었다. 그러나, DSC를 통해 라세미체 및 단일 거울상 이성질체 샘플에서는 오직 하나의 피크만이 주어지므로, 상기 샘플에 대한 융해점 및 엔탈피 수치는 결정될 수 있다. 이는 상평형 그림이 이론적으로 제작될 수 있게 하였다 (J. Jacques, A. Collet and S. H. Wilden, Enantiomers, Racemates and Resolutions, New York: Wiley, 1981).
삭제
순수한 거울상 이성질체의 접합의 융해점 및 엔탈피를 사용하여, 참된 라세미체 화합물에 대한 공융 혼합물 및 거울상 이성질체 사이의 액체화 곡선을 계산하기 위하여, Schroder-Van Laar 반응식이 사용될 수 있다:
Figure 112006063532414-pct00077
몰 분획; 0.9 Tf = 351.64 K 78.64℃
0.8 Tf = 346.60 K 73.60℃
0.7 Tf = 341.05 K 68.05℃
0.6 Tf = 334.86 K 61.86℃
그런 다음, 고형물 층이 순수한 라세미 화합물로 구성되는 하기 커브의 부분은 하기 반응식 (Prigogine-Defay)에 따라 결정될 수 있다:
Figure 112006063532414-pct00078
몰 분획; 0.9 Tf = 349.26K 76.26℃
0.8 Tf = 360.81K 87.81℃
0.7 Tf = 366.53K 93.53℃
0.6 Tf = 369.41K 96.40℃
상기 식에 있어서:
x = Tf에서 용융이 종결되는 혼합물의 가장 풍부한 거울상 이성질체 (0.5 ≤ x ≤ 1)의 몰 분획 (K).
ΔHA f = 단일 거울상 이성질체 접합의 엔탈피 (J.mol-1).
ΔHR f = 라세미체 접합의 엔탈피 (J.mol-1).
R = 8.31 (J.K-l.mol-1).
TA f = 순수한 단일 거울상 이성질체의 융해점 (K).
TR f = 라세미체의 융해점 (K).
그런 다음, 상기 카브 모두는 동일한 그래프 상에 그려져서 상평형 그림을 제공한다. 직선이 교차하는 부분이 이 경우 77.5% ee인 공융 혼합물이다. 도 4 참고.
실시예 31
Figure 112006063532414-pct00079
DAPD
DAPD 를 위한 분석적 전개
시스-DAPD 및 그의 부티레이트 에스테르에 대한 키랄성 분석을 전개하여, DAPD의 효소 에스테르화 스크린을 분석하였다. 도 1M 참고.
DAPD 에 대한 SFC 조건:
컬럼: Chiralpak AD
치수: 250 x 4.6 mm
이동상: 70% CO2, 0.1% TEA를 가진 30% MeOH
유속: 3.0 ㎖/분
압력: 3000 psi
컬럼 온도: 35℃
검출: UV @ 254 nm
보유 시간:1 - 3.57 분
2 - 5.64 분
DAPD 물질에 대한 생체내 변화의 진행을 모니터링하기 위하여, 상기 분석을 변형하여. DAPD 및 및 부티레이트의 기준선 분리를 포함하게 하였다. 도 1N 참고. 조건 및 크로마토그램은 다음과 같다:
DAPD 및 부티레이트 에스테르에 대한 SFC 조건:
컬럼: Chiralpak AD
치수: 250 x 4.6 mm
이동상: 80% CO2, 0.1% TEA를 가진 20% MeOH
유속: 3.0 ㎖/분
압력: 3000 psi
컬럼 온도: 35℃
검출: UV @ 254 nm
보유 시간: 1 - 4.49 분 2 - 5.90 분
3 - 9.18 분 4 - 11.0 분
DAPD 의 효소 분리
비닐 부티레이트를 사용하는 에스터 교환반응에 의해 시스-DAPD의 이성질체를 분석하기 위하여 제한된 효소 스크린을 수행하였다. 알려진 에스터 교환반응 활성에 준하여 효소를 선택하였다. 연구된 용매는 톨루엔 (기질 불용해성), DMF 및 피리딘 (기질 가용성)이었다. 반응 후 TLC를 수행하고, 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) (Chiralpak AD)를 통해 거울상 이성질체 과량을 측정하였다. 확인하기 위하여, HPLC 분석 (100% MeOH, Chiralpak AD)을 통해 거울상 이성질체 과량을 다시 측정하였고, 이 결과는 SFC 결과와 일치하였다.
각 효소의 경우: 라세미 시스-DAPD (TP0041/97/D-1, 10 mg, 0.04 mmol)에 용매 (1 mL) (톨루엔, DMF 또는 피리딘, 표 13 참고), 비닐 부티레이트 (0.1 mL, 0.8 mmol)를 첨가한 다음, 효소 (5 - 10 mg)를 첨가하였다. 유리병을 30℃ 배양기에서 흔들어 주고, 50 ㎕ 분취량을 제거하여, 메탄올로 희석하고, TLC (10:1:0.1 EtOAc:MeOH:H20) 및 키랄성을 통해 분석함으로써 주기적으로 분석하였다. 얻은 결과는 표 23에 나타난 바와 같다.
Figure 112006063532414-pct00080
Figure 112006063532414-pct00081
표 23에 나타난 결과는 DAPD의 에스테르화가 일어난다 할지라도, 광학선택적 반응 (enantioselective)이 아니라는 것을 보여주었다. TLC는 하나 이상의 산물이 동일 경우 형성되었다는 것을 보여주었다. 그러나, PeptiCLEC-BL 및 리파아제 AY의 경우, 오직 바람직한 부티레이트만이 빠른 반응에서 형성되었으므로, 이들이 위치 선택적으로 부드럽게 에스테르를 산소에 두기에 좋은 효소일 것이다.

Claims (20)

  1. a) 화학식 (Ia) 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올 또는 화학식 (Ib)의 알데히드를 수득하고;
    b) 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올 또는 화학식 (Ib)의 알데히드를 글리콜산으로 고리화시켜 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 수득하고;
    c) 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤을 분할(resolving)하여 실질적으로 순수한 D- 또는 L-락톤을 수득하고;
    d) 환원제를 이용하여 선별적으로 환원시키고, 실질적으로 순수한 D- 또는 L-키랄성 락톤을 활성화시켜, 화학식 (III)의 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을 수득하고;
    e) 상기 화학식 (III)의 실질적으로 순수한 D- 또는 L-1,3-디옥솔란을, 활성화되거나, 보호되거나, 또는 활성화되고 보호된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체에 커플링하여 화학식 (IV)의 실질적으로 순수한 보호된 D- 또는 L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 α:β 혼합물을 수득하는 것을 포함하는, 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 제조방법:
    Figure 112011079041816-pct00082
    Figure 112011079041816-pct00083
    Figure 112011079041816-pct00084
    Figure 112011079041816-pct00085
    Figure 112011079041816-pct00086
    상기 식에서,
    각 R1은 독립적으로 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 알크아릴, 알킬헤테로아릴, 알킬헤테로사이클릭, 또는 아르알킬이고;
    R2는 제거가능기이고;
    L은 이탈기이고;
    B는 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체이고;
    상기 실질적으로 순수라는 것은 해당 뉴클레오시드의 지정된 에난티오머를 85% 내지 100 중량% 포함하는 뉴클레오시드 조성물을 의미한다.
  2. 제1항에 있어서, 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드가 4(R)-[(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일]-메탄올 (β-D-DAPD)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 루이스 산의 존재 하에 수행되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 루이스 산은 BF3·Et20인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (d)의 환원제는 LiAlH(OtBu)3인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 이탈기가 0-아실, OAc, 할로겐, O메실레이트 및 O톨루에이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, R2는 이소-부티릴 또는 p-메톡시 벤조일인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 활성화되거나, 보호되거나, 또는 활성화되고 보호된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 그의 유도체가 활성화된 2,6-디클로로퓨린인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 실질적으로 순수한 보호된 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드가 탈보호되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 R2가 p-메톡시 벤조일인 경우 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해되지 않는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 화학식 (Ia)의 에스테르화된 2,2-디알콕시 에탄올은 R2가 이소-부티릴인 경우 화학식 (Ib)의 해당하는 알데하이드로 가수분해되지 않는 방 법.
  14. 제1항에 있어서, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤의 분리는 키랄성 크로마토그래피를 이용하여 이루어지는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 화학식 (II)의 1,3-디옥솔란 락톤의 분리는 효소 분리를 이용하여 이루어지는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드가 하기 화학식 A 내지 D 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법:
    Figure 112011079041816-pct00087
    Figure 112011079041816-pct00088
    상기 식에서,
    R은 독립적으로 H, 할로겐, OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, Cl-C4알킬, CH3, CH=CH2, N3C=CH2, CO2H, C02R', CONH2, CONHR', CH20H, CH2CH20H, CF3, CH2CH2F, CH=CHC02H, CH=CHCO2R', CH=CHCl, CH=CHBr, 또는 CH=CHI이고;
    각 R'은 독립적으로 Cl-C4알킬이며;
    Z는 CH 또는 C-X이고;
    각 X 및 Y는 독립적으로 H, 할로겐, OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, 또는 CH3이다.
  17. a) 화학식 (a)의 화합물을 제공하고;
    b) 화학식 (a)의 화합물을 화학식 (b)의 화합물로 전환하고;
    c) 화학식 (b)의 화합물을 글리콜산으로 고리화하여 화학식 (c)의 라세미 1,3-디옥솔원 락톤을 수득하고;
    d) 화학식 (c)의 화합물을 분해하여 화학식 (d)의 키랄성 디옥솔란 락톤을 수득하고;
    e) 화학식 (d)의 키랄성 디옥솔란 락톤을 아세틸화하여 화학식 (e)의 키랄성 디옥솔란 아세테이트를 수득하고;
    f) 화학식 (e)의 화합물을 활성화되거나, 보호되거나, 또는 활성화되고 보호된 아데닌 염기에 커플링하는 것을 포함하는, 실질적으로 순수한 4(R)-[(2,6-디아미노-푸린-9-일)-[1,3]-디옥솔란-2(R)-일]-메탄올(β-D-DAPD)의 제조방법:
    Figure 112011079041816-pct00089
    Figure 112011079041816-pct00090
    Figure 112011079041816-pct00091
    Figure 112011079041816-pct00092
    Figure 112011079041816-pct00093
    상기 식에서,
    각 Rl은 독립적으로 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 알크아릴, 알킬헤테로아릴, 알킬헤테로사이클릭, 또는 아르알킬이고;
    R은 독립적으로 H, 할로겐, OH, OR', OCH3, SH, SR', SCH3, NH2, NHR', NR'2, Cl-C4알킬, CH3, CH=CH2, N3C=CH2, C02H, C02R', CONH2, CONHR', CH20H, CH2CH2OH, CF3, CH2CH2F, CH=CHC02H, CH=CHC02R', CH=CHCl, CH=CHBr, 또는 CH=CHI이고;
    상기 실질적으로 순수라는 것은 해당 뉴클레오시드의 지정된 에난티오머를 85% 내지 100 중량% 포함하는 뉴클레오시드 조성물을 의미한다.
  18. 제1항에 있어서, 화학식 (IV)의 실질적으로 순수한 보호된 D- 또는 L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 α:β 혼합물을 정제하여 실질적으로 순수한 보호된 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
  19. 제1항 또는 제18항에 있어서, 실질적으로 순수한 보호된 β-D-또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 탈보호하여 실질적으로 순수한 β-D- 또는 β-L-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
  20. 제17항에 있어서, 단계 (f)의 화합물을 정제하고 탈보호하여 β-D-2,6-디아미노퓨린 디옥솔란을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
KR1020067017856A 2004-02-03 2005-02-03 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법 KR101157468B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54154504P 2004-02-03 2004-02-03
US60/541,545 2004-02-03
PCT/US2005/003620 WO2005074654A2 (en) 2004-02-03 2005-02-03 Methods to manufacture 1,3-dioxolane nucleosides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070085075A KR20070085075A (ko) 2007-08-27
KR101157468B1 true KR101157468B1 (ko) 2012-07-06

Family

ID=34837503

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067017856A KR101157468B1 (ko) 2004-02-03 2005-02-03 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7785839B2 (ko)
EP (1) EP1720840B1 (ko)
KR (1) KR101157468B1 (ko)
CN (2) CN105039489A (ko)
BR (1) BRPI0507363A (ko)
CA (1) CA2554782C (ko)
ES (1) ES2568467T3 (ko)
HK (1) HK1216432A1 (ko)
WO (1) WO2005074654A2 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2473736C (en) * 2002-01-25 2011-10-11 Shire Biochem Inc. Process for producing dioxolane nucleoside analogues
CN105039489A (zh) * 2004-02-03 2015-11-11 埃莫里大学 制备1,3-二氧戊环核苷的方法
CN105385621B (zh) * 2015-11-20 2018-10-02 浙江昌明药业有限公司 琼氏不动杆菌zjutfet-1及其应用
WO2019245444A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Medivir Ab Base-modified cytidine nucleotides for leukemia therapy

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5270315A (en) 1988-04-11 1993-12-14 Biochem Pharma Inc. 4-(purinyl bases)-substituted-1,3-dioxlanes
NZ228645A (en) 1988-04-11 1991-09-25 Iaf Biochem Int 1,3-dioxolane derivatives substituted in the 5th position by a purine or pyrimidine radical; treatment of viral infections
US6175008B1 (en) 1988-04-11 2001-01-16 Biochem Pharma Inc. Processes for preparing substituted 1,3-oxathiolanes with antiviral properties
US5041449A (en) 1988-04-11 1991-08-20 Iaf Biochem International, Inc. 4-(nucleoside base)-substituted-1,3-dioxolanes useful for treatment of retroviral infections
US6703396B1 (en) * 1990-02-01 2004-03-09 Emory University Method of resolution and antiviral activity of 1,3-oxathiolane nuclesoside enantiomers
US5914331A (en) * 1990-02-01 1999-06-22 Emory University Antiviral activity and resolution of 2-hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolane
US5276151A (en) 1990-02-01 1994-01-04 Emory University Method of synthesis of 1,3-dioxolane nucleosides
US6069252A (en) * 1990-02-01 2000-05-30 Emory University Method of resolution and antiviral activity of 1,3-oxathiolane nucleoside enantiomers
US5204466A (en) * 1990-02-01 1993-04-20 Emory University Method and compositions for the synthesis of bch-189 and related compounds
US5700937A (en) * 1990-02-01 1997-12-23 Emory University Method for the synthesis, compositions and use of 2'-deoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine and related compounds
US5179104A (en) 1990-12-05 1993-01-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Process for the preparation of enantiomerically pure β-D-(-)-dioxolane-nucleosides
US5925643A (en) 1990-12-05 1999-07-20 Emory University Enantiomerically pure β-D-dioxolane-nucleosides
US5444063A (en) 1990-12-05 1995-08-22 Emory University Enantiomerically pure β-D-dioxolane nucleosides with selective anti-Hepatitis B virus activity
ZA923640B (en) 1991-05-21 1993-02-24 Iaf Biochem Int Processes for the diastereoselective synthesis of nucleosides
GB9311709D0 (en) 1993-06-07 1993-07-21 Iaf Biochem Int Stereoselective synthesis of nucleoside analogues using bicycle intermediate
JP3524606B2 (ja) * 1994-12-28 2004-05-10 三洋電機株式会社 固形製剤充填装置
GB9525606D0 (en) * 1995-12-14 1996-02-14 Iaf Biochem Int Method and compositions for the synthesis of dioxolane nucleosides with › - configuration
US5792773A (en) 1996-11-15 1998-08-11 Yale University L-β-dioxolane uridine analog administration for treating Epstein-Barr virus infection
DE69823984T2 (de) * 1997-03-19 2005-05-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Synthese, anti-hiv- und anti-hepatitis-b-virus-aktivitäten von 1,3-oxaselenolannukleosiden
KR100856416B1 (ko) 1998-08-12 2008-09-04 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 1,3-옥사티올란 뉴클레오시드의 제조 방법
ATE254126T1 (de) 1998-12-23 2003-11-15 Shire Biochem Inc Antivirale nukleosidanaloga
JP2002538780A (ja) 1999-02-11 2002-11-19 シェア バイオケム インコーポレーテッド ヌクレオシド類似体の立体選択的合成
US6512845B1 (en) * 1999-07-20 2003-01-28 Canon Kabushiki Kaisha Iterative approximation of color patch area
DE60127946D1 (de) 2000-02-11 2007-05-31 Shire Biochem Inc Ein stereoselektives verfahren zur herstellung von nukleosidanalogen
PL361310A1 (en) * 2000-10-13 2004-10-04 Shire Biochem Inc. Dioxolane analogs for improved inter-cellular delivery
CA2473736C (en) 2002-01-25 2011-10-11 Shire Biochem Inc. Process for producing dioxolane nucleoside analogues
US6855821B2 (en) * 2002-08-06 2005-02-15 Pharmasset, Ltd. Processes for preparing 1,3-dioxolane nucleosides
CN105039489A (zh) * 2004-02-03 2015-11-11 埃莫里大学 制备1,3-二氧戊环核苷的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20060036092A1 (en) 2006-02-16
BRPI0507363A (pt) 2007-07-03
WO2005074654A3 (en) 2005-09-22
WO2005074654A2 (en) 2005-08-18
HK1216432A1 (zh) 2016-11-11
KR20070085075A (ko) 2007-08-27
EP1720840A2 (en) 2006-11-15
CN101044122A (zh) 2007-09-26
EP1720840B1 (en) 2016-02-03
CA2554782C (en) 2013-08-13
EP1720840A4 (en) 2009-01-21
US20110130559A1 (en) 2011-06-02
US8420354B2 (en) 2013-04-16
ES2568467T3 (es) 2016-04-29
CN105039489A (zh) 2015-11-11
US7785839B2 (en) 2010-08-31
CA2554782A1 (en) 2005-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5276151A (en) Method of synthesis of 1,3-dioxolane nucleosides
RU2439069C2 (ru) Способ получения 1,3-оксатиолановых нуклеозидов
AP879A (en) Method and compositions for the synthesis of dioxolane nucleosides with b-configuration.
RO117916B1 (ro) Procedeu stereoselectiv pentru prepararea unor derivati si analogi cis-nucleozidici
US20100063283A1 (en) Process for stereoselective synthesis of lamivudine
KR101157468B1 (ko) 1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 제조방법
EP1265890B1 (en) Stereoselective synthesis of nucleoside analogues
IL166682A (en) PROCESSES FOR PREPARING D- or L- DIOXOLANE NUCLEOSIDES
MXPA06008722A (en) Methods to manufacture 1,3-dioxolane nucleosides
US6034087A (en) Nucleoside derivatives and process for preparing thereof
JP4501135B2 (ja) ジオキソランヌクレオシド類似体の立体選択的製造方法
WO1997003053A1 (en) N-(acyloxymethyl or hydroxymethyl) (optionally (oxa or thia) substituted)bicyclo([2.2.1] or [2.2.2])azalk(an or en)one compounds
KR19990006811A (ko) 새로운 광학활성 뉴클레오시드 유도체, 그의 제조 방법 및 이를 함유하는 항 hbv 조성물
HU212108B (en) Process for producing 2-tetrahydrofurane derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150608

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160517

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160620

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180529

Year of fee payment: 7