CN1711353B - 修饰的肌氨酸氧化酶,制备方法及其试剂组合物 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开一种蛋白质，其在构成具有肌氨酸氨化酶活性的蛋白质的氨基酸序列中通过添加、缺失、插入或置换至少一个氨基酸而被修饰后仍具有肌氨酸氧化酶活性，特征为在液体中与未修饰的蛋白相比具有改进的稳定性和/或与未修饰的蛋白相比对L-脯氨酸的作用降低。肌氨酸氧化酶具有至少一个下列的特征，即，在37℃和pH8.0条件下测量，基于肌酸对L-脯氨酸的作用为0.7％或更少且L-脯氨酸的Km值为150mM或更多；生产具有优异的底物特异性的肌氨酸氧化酶的方法，包括培养能生产肌氨酸氧化酶的微生物和从培养基中收集肌氨酸氧化酶；和含肌氨酸氧化酶的用于检测肌酐的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及通过以蛋白工程技术修饰具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白而得到的肌氨酸氧化酶，其特征在于具有在改进的液体稳定性，优异的底物特异性和对脯氨酸的作用降低，以及生产肌氨酸氧化酶的方法和使用其的试剂组合物。
背景技术
肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1)作为一种酶，与其他酶，如肌酐酶、肌酸酶和过氧化物酶一起用于检测体液内肌酸和肌酐，它们是诊断肌肉疾病和肾病的临床指示物。肌氨酸氧化酶在有水和氧气的情况下作用于作为底物的肌酸，产生甘氨酸、甲醛和过氧化氢。
已知肌氨酸氧化酶通过芽孢杆菌属(Bacillus)(JP-54-52789-A，JP-61-162174-A)，棒状杆菌属(Corynebacterium)(J.Biochem.89：599，1981)，柱孢属(cylindrocarpon)(JP-56-92790-A)，假单孢菌属(pseudomonas)(JP-60-43379-A)和节杆菌属(arthrobacter)(JP-2-265478-A)的细菌产生。利用例如带有通过基因工程技术从这些细菌获得的肌氨酸氧化酶基因的大肠杆菌宿主，大规模生产肌氨酸氧化酶的技术已经有报道(JP-5-115281-A，JP-6-113840-A，JP-8-238087-A)。
伴随近来的液体临床诊断试剂，液体中试剂组分的各种稳定化方法已经被研究，并且对用作检测肌酐和肌酸试剂的肌氨酸氧化酶，一种在液体中具有优异的稳定性的酶是渴望得到的。我们小组之前曾报道通过蛋白工程方式修饰野生型肌氨酸氧化酶而改进其突变型对金属离子的稳定性(参见，如，JP-7-163341)，但考虑到诊断试剂的长期储存稳定性，还期待有更多的改进。
此外，已知常规的肌氨酸氧化酶还对脯氨酸作用，其是出现在血液中的一种氨基酸，并已有指出它能导致在肌酐和肌酸测量时真实的或假的差异(Rinsho kagaku，20：144-152，1991；Seibutsu Shiryo Bunseki，17：332-337，1994)。为解决上述问题，我们小组报道了通过蛋白工程方式修饰野生型肌氨酸氧化酶而具有对脯氨酸作用降低的肌氨酸氧化酶(JP-10-248572-A)，但其对原始底物肌酸的作用还不清楚，还需要有更多的改进。
本发明的目的是提供具有改进的液体稳定性的修饰的肌氨酸氧化酶。
本发明的另一个目的是提供具有对脯氨酸低反应性和具有优异的底物特异性的肌氨酸氧化酶。
本发明的另一个目的是提供具有对脯氨酸作用降低的肌氨酸氧化酶。
发明内容
作为完成上述目的的广泛研究的结果，本发明人发现肌氨酸氧化酶经修饰后具有改进的液体稳定性或具有对脯氨酸的作用降低同时不破坏其对肌酸的作用。
此外，本发明人发现肌氨酸氧化酶能被修饰以保持与肌酸的高亲和力和具有对脯氨酸的作用降低，因此完成本发明。
换句话说，本发明由下列部分组成。
[1]修饰的肌氨酸氧化酶，其是一种在构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通过添加、删除、插入或置换至少一个氨基酸而转化的蛋白质，特征为具有肌氨酸氧化酶活性和与转化前的蛋白相比具有改进的液体稳定性。
[2]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[3]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列50％或更多的同源性。
[4]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列80％或更多的同源性。
[5]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[6]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的155到250位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[7]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的82到92或354到366位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[8]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于选自相应SEQ IDNO：1氨基酸序列的89，155，166，204，213，233，240，250和364位中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[9]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的89位赖氨酸被精氨酸替换。
[10]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的155位半胱氨酸被异亮氨酸替换。
[11]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的166位天冬酰胺被赖氨酸替换。
[12]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的204位甲硫氨酸被丙氨酸替换。
[13]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的213位丝氨酸被脯氨酸替换。
[14]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的233位半胱氨酸被丝氨酸替换。
[15]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的240位天冬酰胺被酪氨酸替换。
[16]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的250位谷氨酸被谷氨酰胺替换。
[17]根据[1]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的364位丙氨酸被缬氨酸替换。
[18]修饰的肌氨酸氧化酶，其为一种在构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通过添加、删除、插入或置换至少一个氨基酸而转化的蛋白质，特征为具有肌氨酸氧化酶活性和与转化前的蛋白相比对L-脯氨酸作用降低。
[19]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换.
[20]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列50％或更多的同源性。
[21]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列80％或更多的同源性。
[22]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[23]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的82到152和216到328位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[24]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的82到97和313到328位的相应区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[25]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于选自相应SEQID NO：1氨基酸序列的89，94和322位中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
[26]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的89位赖氨酸被精氨酸替换。
[27]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的94位缬氨酸被甘氨酸替换。
[28]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO：1氨基酸序列的322位赖氨酸被精氨酸替换。
[29]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于修饰后肌氨酸氧化酶的Km值在未修饰酶的3倍以内。
[30]根据[18]的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于修饰后肌氨酸氧化酶的Km值在未修饰酶的1.5倍以内。
[31]肌氨酸氧化酶，其特征在于37℃和pH8.0条件下测量具有至少下列一个特征：
对L-脯氨酸作用：基于肌酸为0.7％或更低；和
L-脯氨酸的Km值：150mM或更多。
[32]根据[31]的肌氨酸氧化酶，其特征在于37℃和pH8.0条件下测量具有至少下列一个特征：
对L-脯氨酸作用：基于肌酸为0.5％或更低；和
L-脯氨酸的Km值：200mM或更多。
[33]根据[31]的肌氨酸氧化酶，其中肌酸的Km值为10mM或更低。
[34]根据[31]的肌氨酸氧化酶，其中肌酸的Km值为5mM或更低。
[35]编码[1]到[17]和[18]到[30]任一项的修饰的肌氨酸氧化酶的基因。
[36]含有[35]的基因的载体。
[37]转化有[36]的载体的转化子。
[38]生产修饰的肌氨酸氧化酶的方法，特征在于培养[37]的转化子和从培养物中收集肌氨酸氧化酶。
[39]生产底物特异性优异的修饰的肌氨酸氧化酶的方法，特征在于培养具有[31]到[34]任一项的肌氨酸氧化酶的生产能力的微生物和从培养物中收集肌氨酸氧化酶.
[40]含有[1]到[17]和[18]到[30]和[31]到[34]任一项的肌氨酸氧化酶的用于检测肌酸的试剂。
[41]含有[1]到[17]和[18]到[30]和[31]到[34]任一项的肌氨酸氧化酶的用于检测肌酐的试剂。
下面将详细描述本发明。
本发明的修饰的肌氨酸氧化酶对于临床检验领域分析肌酸和肌酐是有用的。
本发明的一个实施方案是一种在构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列中通过添加、删除、插入或置换至少一个氨基酸而修饰的蛋白，以及修饰的蛋白特征为具有肌氨酸氧化酶活性、与未修饰蛋白比较具有改进的液体稳定性、与原始底物肌酸相比对L-脯氨酸的作用充分降低，或具有肌氨酸氧化酶活性和与未修饰的蛋白相比L-脯氨酸的作用降低。
对脯氨酸的作用能通过用L-脯氨酸作底物的酶活性与用肌酸作底物的酶活性的相对比值(％)得到。在本发明的肌氨酸氧化酶中，对L-脯氨酸的作用为基于对肌酸的0.7％或更低，优选0.5％或更低。
在本发明另一实施方案中，肌氨酸氧化酶对脯氨酸具有高Km值(Michaelis-Menten常数)，并且在试剂应用于检测肌酐和肌酸时不太可能受样品中脯氨酸的影响。本发明的肌氨酸氧化酶对L-脯氨酸的Km值为150mM或更多，优选200mM或更多。
在本发明另一实施方案中，根据抑制要加入到检测试剂中的必需量和利用高底物特异性，本发明的肌氨酸氧化酶对肌氨酸的Km值优选为10mM或更低，及更优选为5mM或更低。
本发明的肌氨酸氧化酶不是特别限定的，只要其具有上述特征。比如，可以使用从微生物和哺乳动物得到的酶。通过利用基因工程/蛋白工程技术修饰公知的肌氨酸氧化酶获得的酶和通过化学修饰改进性质的酶也包括在内。
本发明一个实施方案中的修饰的肌氨酸氧化酶特征在于其液体稳定性与未修饰的相比进一步提高了。本发明中液体稳定性是指，例如，在修饰的酶溶解于合适的缓冲液和储存于合适的温度一段时间后，剩余的酶活力的比例。
“合适的缓冲液”不是特别限定的，只要选择其类型和温度使肌氨酸氧化酶的最适pH，即pH 7到8左右保持足够的缓冲能力。优选50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)或50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)。此外，如果需要，缓冲液中也可以包含表面活性剂、盐、螯合剂和防腐剂。
“储存于合适的温度一定时间”的条件不是特别限定的，但是优选，考虑液体诊断试剂长时间储存稳定性，选择加速(苛刻)测试条件。具体而言，包括“40℃储存3天”或“60℃储存30分钟”。如果时间允许，可以选择在低温条件2-10℃下储存，该条件通常用作液体诊断药物实际储存长时间，6个月或更多的温度。
储存中的肌氨酸氧化酶的浓度不是特别限定的，优选假定的通常用于诊断试剂的浓度1-30U/mL。更优选浓度为5到20U/mL。
“稳定性与未修饰的相比进一步改进”指储存一定时间后保留酶活力的比例比同一条件下测量的未修饰的酶活力保留比例要高。
本发明的一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，在50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中在60℃保存30分钟剩余的酶活力比例比未修饰的酶的剩余活力比例要高。另一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，在含2mM EDTA，50mM NaCl，0.1％(w/v)2-甲基异噻唑酮，和0.1％(w/v)TrintonX-100的50mM PIPES-NaOH缓冲液在40℃保存3天剩余的酶活力比例比未修饰的酶的剩余活力比例要高。
本发明一个实施方案中的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于与未修饰的相比其与脯氨酸的反应性降低。对脯氨酸的反应性指利用脯氨酸作为底物的酶活性与利用原始底物肌氨酸作为底物的酶活性的相对比例。只要对脯氨酸的反应性降低，即使利用肌氨酸作为底物的比活性发生变化，该酶也包括在本发明的修饰的肌氨酸氧化酶中。在本发明的修饰的肌氨酸氧化酶中，对肌氨酸的Km值可以改变，但当应用于检测肌酐和肌酸的试剂时，其导致降低的反应性，因此，肌氨酸的Km值优选为修饰前的3倍以内，更优选在1.5倍以内。
用于本发明的修饰的肌氨酸氧化酶不是特别限定的，例如，可以使用来自公知的属于芽孢杆菌属、假单孢菌属和棒状杆菌属的细菌的肌氨酸氧化酶。
来自节杆菌种TE1826(编号10637，发酵研究所，工业科学和技术机构)的肌氨酸氧化酶、以蛋白工程方式进行修饰的例子显示于本发明的一个实施例中。
本发明人小组成功地从节杆菌种TE1826提取的染色体DNA中分离出肌氨酸氧化酶基因，确定了其全部的DNA结构(描述于发酵和生物工程杂志(Journal of Fermentation and Bioengineering)，vol.75，No.4：239-244，1999)，成功地通过基因工程技术以高密度在转化子中生产肌氨酸氧化酶，并能够大量供应低廉的高纯度肌氨酸氧化酶(JP-6-113840-A)。来自节杆菌种TE1826的肌氨酸氧化酶的氨基酸序列显示于SEQ ID NO.1。编码该氨基酸序列的DNA序列显示于SEQ IDNO.2。
但是本发明并不限制于具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肌氨酸氧化酶，并可以是具有肌氨酸氧化酶活性的其他修饰的蛋白。其他具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的合适例子包括三维结构与具有SEQ IDNO.1氨基酸序列的肌氨酸氧化酶相似的肌氨酸氧化酶，和具体而言包括具有50％或以上同源氨基酸序列，更优选80％或以上同源氨基酸序列，且具有肌氨酸氧化酶活性的其他蛋白。这是基于在氨基酸序列具有50到80％或以上的同源性并表现出同样的催化活性的酶蛋白通常在三维结构上相似且通常具有与底物特异性相关的相同的氨基酸残基和相同的反应机制。
在修饰的肌氨酸氧化酶中，只要本发明酶的核心属性，酶活性和/或稳定性没有受到损害，还可以删除、替换或添加一个或多个氨基酸。具体而言，一个示例是可以在氨基酸序列的N-端或C-端添加组氨酸标记以利于肌氨酸氧化酶的纯化(如，“Jikken Igaku”20：479-482，2002)。
本发明中氨基酸序列的同源性能通过公知的基因分析软件进行计算(如，Genetyx-win ver.3，Genetyx公司)。同源性指在与要比较的氨基酸序列具有相似性的范围内，相同氨基酸残基的百分比。
本发明的另一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换，并与未修饰的肌氨酸氧化酶比较具有改进的液体稳定性.
本发明的另一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于来自节杆菌种TE1826、如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的155到250位置至少有一个氨基酸被其他的氨基酸替换，或来自节杆菌种TE1826以外的肌氨酸氧化酶、与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中155到250位置相对应的部位至少有一个氨基酸被其他的氨基酸替换，并与未修饰的肌氨酸氧化酶比较具有改进的液体稳定性。
本发明的另一个实施方案是是修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于来自节杆菌种TE1826、如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中82到92位置至少有一个氨基酸被其他的氨基酸替换，或来自节杆菌种TE1826以外的肌氨酸氧化酶、与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中82到92位置相对应的部位至少有一个氨基酸被其他的氨基酸替换，并与未修饰的肌氨酸氧化酶比较具有改进的液体稳定性。
报道了三维结构通过X-射线晶体分析得到显示的肌氨酸氧化酶(如，“Structure”vol.7，No.3：331-345，1999)。根据该报道，该肌氨酸氧化酶与SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列具有同源性，并推测来自节杆菌种TE1826的肌氨酸氧化酶的氨基酸序列、如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中82到92位的部位，或来自节杆菌种TE1826以外的肌氨酸氧化酶的氨基酸序列、与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中82到92位相对应的位点，构成肌氨酸氧化酶催化结构域的连接位点和FAD结合结构域。
本发明的另一个实施方案是是修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于来自节杆菌种TE1826、如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中假定构成包含364位的α-螺旋的354到366位至少有一个氨基酸被其他的氨基酸替换，或来自节杆菌种TE1826以外的肌氨酸氧化酶、与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中354到366位相对应的部位至少有一个氨基酸被其他的氨基酸替换，并与未修饰的肌氨酸氧化酶比较具有改进的液体稳定性。
优选的是修饰的肌氨酸氧化酶，其中选自SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中89、155、16、204、213、233、240、250和364位或其他肌氨酸氧化酶中的相应位置至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
更优选的是修饰的肌氨酸氧化酶，其中选择下列组的至少一个氨基酸被其他的氨基酸替换。示例的修饰的肌氨酸氧化酶是89位赖氨酸被精氨酸替换，155位半胱氨酸被异亮氨酸替换，166位天冬酰胺被赖氨酸替换，204位甲硫氨酸被丙氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换，233位半胱氨酸被丝氨酸替换，240位天冬酰胺被酪氨酸替换，250位谷氨酸被谷氨酰胺替换或364位丙氨酸被缬氨酸替换。
本发明的另一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，其中具有肌氨酸氧化酶活性的该蛋白具有SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，其中在构成催化结构域和催化结构域和FAD结合结构域的连接位点的区域中至少一个氨基酸被其他的氨基酸替换。从与SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列具有同源性且三维结构已通过X-射线晶体分析得到显示的肌氨酸氧化酶(如，“Structure”vol.7，No.3：331-345，1999)中，已预测SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列中82到152位和216到328位构成肌氨酸氧化酶的催化结构域和催化结构域和FAD结合结构域的连接位点。
优选修饰的肌氨酸氧化酶，其中构成催化结构域和FAD结合结构域的连接位点，和与连接位点接近的催化结构域的β-折叠结构的区域中至少一个氨基酸被其他氨基酸替换.据预测SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列中82到97位和313到328位构成肌氨酸氧化酶的催化结构域和FAD结合结构域的连接位点，和与连接位点接近的催化结构域的β-折叠结构(如，“Structure”vol.7，No.3：331-345，1999)。
本发明的另一个实施方案是修饰的肌氨酸氧化酶，其中选自SEQID NO.1描述的氨基酸序列中89，94和322位氨基酸的至少一个氨基酸被其他氨基酸替换。
其中，优选SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，94位缬氨酸被甘氨酸替换或322位赖氨酸被精氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶。
本发明的另一个实施方案是编码上述修饰的肌氨酸氧化酶的基因，含有该基因的载体，转化有该载体的转化子和进一步生产修饰的肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于培养转化子和从培养物中收集肌氨酸氧化酶。
生产本发明的肌氨酸氧化酶的方法不是特别限定的，当公知的酶通过蛋白工程技术得到改进时，其就可能通过下述的方法制备。作为构成具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白的氨基酸序列的修饰方法，使用通常进行的修饰基因信息的技术。换句话说，具有修饰的蛋白的基因信息的DNA通过转变具有该蛋白的基因信息的DNA的特定碱基，或插入或删除特定的碱基而得到。具体的转变DNA分子中碱基的方法包括使用商业可获得的试剂盒(Transformer Mutagenesis Kit，Clonetech提供；EXO III/Mung Bean Deletion kit(绿豆缺失试剂盒)，Stratagene提供；QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit(位点导向的突变试剂盒)，Stratagene提供)或利用聚合酶链式反应(PCR)。
含有制备的修饰的肌氨酸氧化酶的基因信息的DNA被连接到质粒上，然后转染进微生物宿主，其然后成为生产修饰的肌氨酸氧化酶的转化子。当使用大肠杆菌(Escherichia coli)作为微生物宿主，可以使用pBluescript和pUC18质粒。作为微生物宿主，例如，可以使用大肠杆菌w3110，大肠杆菌C600，大肠杆菌JM109，大肠杆菌DH5α等。作为将重组载体转染进微生物宿主的方法，其中如果该微生物属于大肠杆菌属(Escherichia)，可以利用在存在钙离子下转染重组DNA的方法，和进一步，电穿孔的方法也可使用。此外，也可以使用可商业获得的感受态细胞(如，感受态High JM109，Toyobo公司提供)。
修饰的蛋白能通过在营养培养基中培养以该方法获得的转化子的微生物而大规模稳定生产。对微生物转化子的培养形式，选择培养条件应考虑宿主的营养生理性质，通常进行液体培养，但工业上，进行空气搅拌培养是有利的。作为培养基的营养源，可以广泛使用培养微生物的培养基。碳源可以是能被利用的碳化合物，例如，可以使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、丙酮酸等。氮源可以是可利用的氮化合物，例如，可使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、水解酪蛋白、豆饼碱性提取物等。另外，如果需要，可以使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁盐、钙盐、钠盐、铁盐、锰盐和锌盐、特定的氨基酸、特定的维生素。培养温度可在细菌生长和产生修饰蛋白的范围内合适地调整，就大肠杆菌而言，优选温度在大约20到42℃。培养周期根据条件增加或减少，由于在修饰蛋白的产量达到最大时培养可以合适地终止，通常为大约6到48小时。培养基pH可在细菌生长和产生修饰蛋白的范围内合适地调整，特别优选大约pH 6.0到9.0。
修饰的肌氨酸氧化酶可以通过在适合每个微生物生长的培养条件下使用合适的营养培养基培养把本发明肌氨酸氧化酶作为野生型酶的微生物而收集.同时，为诱导酶的表达，理想的是向培养基中添加适量的肌氨酸、肌酸和二甲基甘氨酸.
培养物中含有生产修饰蛋白的微生物细胞的培养液能直接使用，但通常，当依照标准方法培养液中存在修饰蛋白时，在通过过滤、离心等将含修饰蛋白的培养液从微生物细胞分离后再利用。当修饰蛋白存在于微生物细胞内，通过过滤、离心等方法从培养物收集微生物细胞，然后通过机械方法或酶学方法，如溶菌酶裂解这些微生物细胞，如果需要，通过加入螯合剂，如EDTA，或表面活性剂溶解修饰的蛋白，以作为水溶液分离/收集。
这种方法获得的含修饰的蛋白的溶液可以通过，例如，减压浓缩、经膜浓缩、以硫酸铵或硫酸钠盐析沉淀，或通过亲水性有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮分级沉淀而沉淀出来。热处理和利用等电点处理也是有效的纯化方法。纯化的修饰蛋白可以通过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析或通过吸附试剂和凝聚过滤试剂的亲和层析获得。
本发明的另一个实施方案是含有上述修饰的肌氨酸氧化酶的检测肌酸和肌酐的试剂。在检测肌酸或肌酐的试剂中，通过使用具有改进的液体稳定性和对脯氨酸作用降低的修饰的肌氨酸氧化酶，该试剂的活性时间能够延长或检测精确性能够增强。对脯氨酸的影响程度能够被降低到低于7％和优选低于5％。
本发明的检测肌酸的试剂包括具有改进的液体稳定性、对脯氨酸有低的底物特异性或对脯氨酸反应降低的修饰的肌氨酸氧化酶，肌酸脒基水解酶、过氧化物酶和检测过氧化氢的试剂。
检测肌酐的试剂包括具有改进的液体稳定性、对脯氨酸有低的底物特异性或对脯氨酸反应降低的修饰的肌氨酸氧化酶，肌酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶、过氧化物酶和检测过氧化氢的试剂。
检测过氧化氢的试剂是检测过氧化物酶存在时肌氨酸氧化酶产生的过氧化氢作为形成的色素的试剂，其包括氧化性着色剂和如果需要的偶联剂，诸如4-氨基安替比林和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮。
本发明的检测过氧化氢的试剂不是特别限定的，能使用各种的可商业获得的试剂。此外，在上述检测肌酸或肌酐的试剂中，金属盐、蛋白质、氨基酸、糖、有机酸等也能被用作稳定剂。防腐剂和表面活性剂经常以对试剂性能无害的条件添加，并与合适的缓冲液一起使用。根据不同目的，如各试剂成分的保存和酶的反应，可以选择一种或多种用于缓冲液的类型、浓度和pH，并且当使用任何缓冲液时，酶反应的pH优选在5.0到10.0的范围。
在本发明中，肌氨酸氧化酶活性在下述条件下检测。
<试剂>
100Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)(含200mM肌氨酸和0.1％TritonX-100)
0.1％4-氨基安替比林
0.1％苯酚
25U/mL过氧化物酶
<检测条件>
反应混合物的制备是将上述Tris-HCl缓冲液，4-氨基安替比林溶液，酚溶液和过氧化物酶溶液以5∶1∶2∶2的比例混和.取反应混合物(1mL)至试管，37℃预热约5分钟，加入0.05mL酶溶液开始反应.反应在37℃准确进行10分钟，然后加入2.0mL的0.25％SDS溶液终止反应，以及在500nm检测溶液的吸收值.在盲测中，用蒸馏水代替酶溶液加入到试剂混合物中，以同样操作检测吸收值.在上述条件下，每分钟产生1μmol过氧化氢的酶量称为一个单位.对脯氨酸的反应性在用同样浓度的L-脯氨酸代替上述试剂中的肌氨酸时，以酶活性的相对比例来测量.
根据本发明，通过蛋白工程技术修饰具有肌氨酸氧化酶活性的蛋白，有可能供应具有改进的液体稳定性的修饰的肌氨酸氧化酶，具有对脯氨酸作用降低的修饰的肌氨酸氧化酶，及对L-脯氨酸有小的作用和具有优异的底物特异性的修饰的肌氨酸氧化酶。通过使用本发明的修饰的肌氨酸氧化酶作为检测体液内肌酸和肌酐的酶，所述肌酸和肌酐是诊断肌肉疾病和肾脏疾病的临床指示物，有可能精确检测肌酸和肌酐而不受同时存在的物质的影响(如，脯氨酸)，及试剂的液体稳定性可以改进。
发明的最佳实施方式
本发明将通过下述实施例进行具体的描述，但本发明不限制于此。
例如，在实施例3A所示的13种修饰的肌氨酸氧化酶和其后实施例3B所示的9种修饰的肌氨酸氧化酶中，SAOM1是SEQ ID NO：1的氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换的突变体，而SAOM2是SEQID NO：1的氨基酸序列中94位缬氨酸被甘氨酸替换的突变体。然而，可以在突变体的性能基本不受影响的范围内进一步删除、替换或添加一个或数个氨基酸。对于SAOM1和SAOM2之外的突变体也一样。
实施例1.构建表达肌氨酸氧化酶的质粒
表达质粒pSAOEP3用于表达衍生自节杆菌种TE1826株的肌氨酸氧化酶以JP-7-163341-A描述的方法构建。该表达质粒在pUC18的多克隆位点具有大约1.7kbp含编码TE1826的肌氨酸氧化酶的基因的DNA插入片段。其核苷酸序列显示于SEQ ID NO：2，由核苷酸序列推测的肌氨酸氧化酶的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1。
实施例2A.修饰的肌氨酸氧化酶基因的制备
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM1A)的制备方法是使用含有肌氨酸氧化酶基因的表达质粒pSAOEP3和SEQ ID NO：3的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，利用QuickChangeTM位点导向的突变试剂盒(Stratagen提供)，参照流程操作，随后进行测序。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中155位半胱氨酸被异亮氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM2A)的制备方法是使用pSAOEP3和SEQ ID NO：4的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，利用QuickChangeTM位点导向的突变试剂盒(Stratagen提供)，并以上述相同的方式进行操作。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中166位天冬酰胺被赖氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM3A)通过使用pSAOEP3和SEQ ID NO：5的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中204位甲硫氨酸被丙氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM4A)通过使用pSAOEP3和SEQ ID NO：6的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中213位丝氨酸被脯氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM5A)通过使用pSAOEP3和SEQID NO：7的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到.
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中233位半胱氨酸被丝氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM6A)通过使用pSAOEP3和SEQ ID NO：8的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中240位天冬酰胺被酪氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM7A)通过使用pSAOEP3和SEQ ID NO：9合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM8A)通过使用pSAOEP3和SEQ ID NO：10的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中364位丙氨酸被缬氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM9A)通过使用pSAOEP3和SEQID NO：11的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换和213位丝氨酸被脯氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM10A)通过使用pSAOM1A和SEQ ID NO：7的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换，和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM11A)通过使用pSAOM10A和SEQ IDNO：10的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，155位半胱氨酸被异亮氨酸替换，166位天冬酰胺被赖氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换，250位谷氨酸被谷氨酰胺替换，和364位丙氨酸被缬氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM12A)通过使用pSAOM11A和SEQ ID NOs：4，5，11的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，204位甲硫氨酸被丙氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换，233位半胱氨酸被丝氨酸替换，240位天冬酰胺被酪氨酸替换，和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM13A)通过使用pSAOM11A和SEQ ID NOs：6，8，9的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
实施例3A.修饰的肌氨酸氧化酶的制备
以下列各重组质粒pSAOM1A、pSAOM2A、pSAOM3A、pSAOM4A、pSAOM5A、pSAOM6A、pSAOM7A、pSAOM8A、pSAOM9A、pSAOM10A、pSAOM11A、pSAOM12A和pSAOM13A转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得转化子。
将400mL Terrific营养液装在2L Sakaguchi烧瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却，然后加入终浓度为100μg/mL的分开除菌和过滤的氨苄青霉素。预先在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基30℃培养16小时的大肠杆菌JM109(pSAOM1A)的培养液(5mL)被接种到上述培养基中，通气于30℃振荡培养20小时。培养结束后，在上述的活性测量中肌氨酸氧化酶活性约为9.5U/mL的培养液。
上述细菌细胞通过离心收集，悬于20mM磷酸缓冲液(pH 7.5)，然后超声破碎，进一步离心获得作为粗酶溶液的上清。用聚乙烯亚胺从得到的粗酶溶液中去除核酸，对其进行硫酸铵分级沉淀，然后通过对20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)透析进行分离和纯化，上样到DEAEsepharose CL-6B(Amersham Bioscience提供)和进一步热处理一小时以产生纯化的酶制剂。通过本方法得到的该制剂在SDS-PAGE上表现为几乎一条带。该突变体定名为SAOM1A。
对以下列各重组质粒pSAOM2A、pSAOM3A、pSAOM4A、pSAOM5A、pSAOM6A、pSAOM7A、pSAOM8A、pSAOM9A、pSAOM10A、pSAOM11A、pSAOM12A和pSAOM13A转化的大肠杆菌JM109的转化子，纯化的酶制剂通过上述相同的方式得到，得到的酶制剂分别定名为SAOM2A、SAOM3A、SAOM4A、SAOM5A、SAOM6A、SAOM7A、SAOM8A、SAOM9A、SAOM10A、SAOM11A、SAOM12A、SAOM13A。
对比实施例1.野生型肌氨酸氧化酶的制备
作为对比实施例，用pSAOEP3转化大肠杆菌JM109，对得到的转化子，以上述相同的方式得到未修饰的酶的纯化制剂。
实施例4A.修饰的肌氨酸氧化酶的评估1
实施例3A中获得的突变型肌氨酸氧化酶(SAOM1A、SAOM2A、SAOM3A、SAOM4A、SAOM5A、SAOM6A、SAOM7A、SAOM8A)和对比实施例1中获得的肌氨酸氧化酶各自以浓度5U/mL加入到50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，60℃保存30分钟后测量剩余的酶活力的比例(％)。结果显示于表1。如表1所示，可以证实本发明的修饰的肌氨酸氧化酶与未修饰的相比具有改进的液体稳定性。
表1
| 修饰的酶 | 突变体 | 剩余活力比例(％) |
| SAOM1A | K89R | 34 |
| SAOM2A | C155I | 46 |
| SAOM3A | N166K | 37 |
| SAOM4A | M204A | 51 |
| SAOM5A | S213P | 47 |
| SAOM7A | N240Y | 52 |
| SAOM8A | E250Q | 31 |
| 未修饰的酶 | - | 19 |
实施例4A.修饰的肌氨酸氧化酶的评估2
实施例3A中获得的突变型肌氨酸氧化酶(SAOM1A、SAOM2A、SAOM5A、SAOM6A、SAOM7A、SAOM8A、SAOM9A)和对比实施例1中获得的肌氨酸氧化酶各自以浓度5U/mL加入到含有2mM二氢二钠乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，0.1％(w/v)2-甲基异噻唑酮(RocheDiagnostics提供)和0.1％(w/v)Triton X-100的IPES-NaOH缓冲液(pH7.5)，40℃保存3天后测量剩余的酶活力的比例(％)。结果显示于表2。如表2所示，可以证实本发明的修饰的肌氨酸氧化酶与未修饰的相比具有改进的液体稳定性。
表2
| 修饰的酶 | 突变体 | 剩余活力比例(％) |
| SAOM1A | K89R | 41 |
| SAOM2A | C155I | 47 |
| SAOM5A | S213P | 49 |
| SAOM6A | C233S | 72 |
| SAOM7A | N240Y | 73 |
| SAOM8A | E250Q | 40 |
| SAOM9A | A364V | 45 |
| 未修饰的酶 | - | 30 |
实施例5A.修饰的肌氨酸氧化酶的评估3
对实施例3A中获得的突变型肌氨酸氧化酶(SAOM1A、SAOM10A、SAOM11A、SAOM12A、SAOM13A)和对比实施例1中获得的肌氨酸氧化酶在用于检测肌酐的试剂中的稳定性进行分析。向含1mM二氢二钠乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，0.1％(w/v)2-甲基异噻唑酮(Roche Diagnostics提供)和0.1％(w/v)Triton X-100，0.02％(w/v)4-氨基安替比林，0.02％(w/v)TOOS(Dojindo公司提供)，100U/mL肌酐酰胺水解酶(CNH-211，Toyobo公司提供)，50U/mL肌酸脒基水解酶(CNH-221，Toyobo公司提供)，和10U/mL过氧化物酶(PEO-301，Toyobo公司提供)的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)中加入浓度为10U/mL的上述肌氨酸氧化酶，35℃保存2周后测量剩余的酶活力的比例。结果显示于表3。如表3所示，可以证实本发明的修饰的肌氨酸氧化酶与未修饰的相比在用于测量肌酐的试剂中具有改进的液体稳定性。
表3
| 修饰的酶 | 突变体 | 剩余活力比例(％) |
| SAOM1A | K89R | 28 |
| SAOM10A | K89R，S213P | 44 |
| SAOM11A | K89R，S213P，E250Q | 51 |
| SAOM12A | K89R，C155I，N166K，S213P，E250Q，A364V | 77 |
| SAOM13A | K89R，M204A，S213P，C233S，N240Y，E250Q | 79 |
| 未修饰的酶 | - | 16 |
实施例6A.修饰的肌氧酸氧化酶的评估4
对实施例3A中获得的突变型肌氨酸氧化酶(SAOM1A、SAOM10A、SAOM11A、SAOM12A、SAOM13A)和对比实施例1中获得的肌氨酸氧化酶在用于检测肌酐的试剂中的稳定性进行分析。向含1mM二氢二钠乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，0.1％(w/v)2-甲基异噻唑酮(Roche Diagnostics提供)和0.1％(w/v)Triton X-100，0.02％(w/v)4-氨基安替比林，0.02％(w/v)TOOS(Dojindo公司提供)，50U/mL肌酸脒基水解酶(CNH-221，Toyobo公司提供)，和10U/mL过氧化物酶(PEO-301，Toyobo公司提供)的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)中加入浓度为10U/mL的上述肌氨酸氧化酶，35℃保存2周后测量剩余的酶活力的比例。结果显示于表3。如表3所示，可以证实本发明的修饰的肌氨酸氧化酶与未修饰的相比在用于测量肌酸的试剂中具有改进的液体稳定性。
表4
| 修饰的酶 | 突变体 | 剩余活力比例(％) |
| SAOM1A | K89R | 31 |
| SAOM10A | K89R，S213P | 44 |
| SAOM11A | K89R，S213P，E250Q | 52 |
| 修饰的酶 | 突变体 | 剩余活力比例(％) |
| SAOM12A | K89R，C155I，N166K，S213P，E250Q，A364V | 80 |
| SAOM13A | K89R，M204A，S213P，C233S，N240Y，E250Q | 77 |
| 未修饰的酶 | - | 14 |
实施例2B.修饰的肌氨酸氧化酶基因的制备
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM1B)通过使用含有肌氨酸氧化酶基因的表达质粒pSAOEP3和SEQ ID NO：3的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，利用QuickChangeTM位点导向的突变试剂盒(Stratagen提供)，参照流程操作，以及随后进行测序而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中94位缬氨酸被甘氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM2B)通过使用pSAOEP3和SEQ IDNO：12的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，利用QuickChangeTM位点导向的突变试剂盒(Stratagen提供)，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中322位赖氨酸被精氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM3B)通过使用pSAOEP3和SEQID NO：13的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中94位缬氨酸被甘氨酸替换和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM4B)通过使用pSAOM2B和SEQ ID NO：10的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，94位缬氨酸被甘氨酸替换和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM5B)通过使用pSAOM4B和SEQ ID NO：3的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，94位缬氨酸被甘氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM6B)通过使用pSAOM5B和SEQ ID NO：7的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，94位缬氨酸被甘氨酸替换，204位甲硫氨酸被丙氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM7B)通过使用pSAOM6B和SEQ ID NO：14的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，94位缬氨酸被甘氨酸替换，166位天冬酰胺被赖氨酸替换，204位甲硫氨酸被丙氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换和250位谷氨酸被谷氨酰胺替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM8B)通过使用pSAOM7B和SEQ ID NO：5的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
编码SEQ ID NO：1氨基酸序列中89位赖氨酸被精氨酸替换，94位缬氨酸被甘氨酸替换，166位天冬酰胺被赖氨酸替换，204位甲硫氨酸被丙氨酸替换，213位丝氨酸被脯氨酸替换，250位谷氨酸被谷氨酰胺替换和322位赖氨酸被精氨酸替换的修饰的肌氨酸氧化酶的重组质粒(pSAOM9B)通过使用pSAOM8B和SEQ ID NO：13的合成寡核苷酸及其合成的互补寡核苷酸，并以上述相同的方式操作而得到。
实施例3B.修饰的肌氨酸氧化酶的制备
以下列各重组质粒pSAOM1B、pSAOM2B、pSAOM3B、pSAOM4B、pSAOM5B、pSAOM6B、pSAOM7B、pSAOM8B和pSAOM9B转化大肠杆菌JM109感受态细胞获得转化子。
将400mL Terrific营养液装在2L Sakaguchi烧瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却，然后加入终浓度为100μg/mL的分开除菌和过滤的氨苄青霉素。预先在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基30℃培养16小时的大肠杆菌JM109(pSAOM1)的培养液(5mL)被接种到上述培养基中，通气于30℃振荡培养20小时。培养结束后，在上述的活性测量中肌氨酸氧化酶活性约为9.5U/mL的培养液。
上述细菌细胞通过离心收集，悬于20mM磷酸缓冲液(pH 7.5)，然后超声破碎，进一步离心获得作为粗酶溶液的上清。用聚乙烯亚胺从得到的粗酶溶液中去除核酸，对其进行硫酸铵分级沉淀，然后通过对20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)透析进行分离和纯化，上样到DEAEsepharose CL-6B(Amersham Bioscience提供)和进一步热处理一小时以产生纯化的酶制剂。通过本方法得到的该制剂在SDS-PAGE上表现为几乎一条带。该突变体定名为SAOM1B。
对以下列各重组质粒pSAOM2B、pSAOM3B、pSAOM4B、pSAOM5B、pSAOM6B、pSAOM7B、pSAOM8B和pSAOM9B转化的大肠杆菌JM109的转化子，纯化的酶制剂通过上述相同的方式得到，得到的酶制剂分别定名为SAOM2B、SAOM3B、SAOM4B、SAOM5B、SAOM6B、SAOM7B、SAOM8B、SAOM9B。
实施例4B.修饰的肌氨酸氧化酶的评估
对实施例3B和对比实施例1中得到的各种肌氨酸氧化酶进行评估。
对脯氨酸的作用通过以上述的活力测量方法测量的利用L-脯氨酸作底物的酶活力和利用肌氨酸作底物的酶活力的相对比例来计算。肌氨酸和L-脯氨酸的Km值通过在上述活力检测方法中改变底物浓度来测量。结果显示于表5。
如表5所示，已经证实本发明的修饰的肌氨酸氧化酶对脯氨酸的反应性与未修饰的酶相比降低。修饰的肌氨酸氧化酶对肌氨酸的Km值几乎等于未修饰肌氨酸氧化酶的Km值或在其1.5倍或1.5倍以内。此外，有显示修饰的肌氨酸氧化酶具有下列至少一种属性：对脯氨酸的反应性为0.7％或更少，或对L-脯氨酸的Km值为150mM或更多。
表5
| 修饰的酶 | 突变体 | 对脯氨酸的作用 | Km值(脯氨酸) | Km值(肌氨酸) |
| SAOM1B | K89R | 0.70％ | 151mM | 3.4mM |
| SAOM2B | V94G | 0.45％ | 214mM | 4.1mM |
| SAOM3B | K322R | 0.42％ | 122mM | 4.7mM |
| SAOM4B | V94G，E250Q | 0.58％ | 213mM | 3.4mM |
| SAOM5B | V94G，E250Q，K89R | 0.55％ | 198mM | 3.3mM |
| SAOM6B | K89R，V94G，S213P，E250Q | 0.54％ | 210mM | 3.5mM |
| SAOM7B | K89R，V94G，M204A，S213P，E250Q | 0.41％ | 203mM | 3.4mM |
| SAOM8B | K89R，V94G，N166K，M204A，S213P，E250Q | 0.41％ | 205mM | 3.4mM |
| SAOM9B | K89R，V94G，N166K，M204A，S213P，E250Q，K322R | 0.28％ | 202mM | 4.4mM |
| 未修饰的(对照) | - | 0.85％ | 142mM | 3.4mM |
实施例6B.脯氨酸对检测肌酐的试剂的影响
当实施例3B和对比实施例1中获得的各种肌氨酸氧化酶应用于检测肌酐的试剂时，对脯氨酸的影响进行评估.向含10U/mL的上述肌氨酸氧化酶(实施例3B和对比实施例1获得)，1mM二氢二钠乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，0.1％(w/v)Triton X-100，0.02％(w/v)4-氨基安替比林，0.02％(w/v)TOOS(Dojindo公司提供)，100U/mL肌酐酰胺水解酶(CNH-211，Toyobo公司提供)，50U/mL肌酸脒基水解酶(CNH-221，Toyobo公司提供)，和10U/mL过氧化物酶(PEO-301，Toyobo公司提供)的300μL 50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)中加入10μL浓度为5mg/dL肌酐的水溶液在37℃反应，使用Hitachi 17060型自动分析仪检测546nm吸收值的变化。用100mg/dL L-脯氨酸水溶液代替肌酐水溶液，用上述相同的方式检测吸收值的改变。利用L-脯氨酸作底物与利用肌酐作底物反应5分钟，通过吸收值增加的相对比例(％)来计算脯氨酸的影响。结果显示于表6。正如表6所示，已经证实通过使用本发明的修饰的肌氨酸氧化酶作为检测肌酐的试剂，脯氨酸对试剂的影响得以降低。
表6
| 修饰的酶 | 突变体 | 脯氨酸的作用 |
| SAOM1B | K89R | 5.7％ |
| SAOM2B | V94G | 3.6％ |
| SAOM3B | K322R | 3.5％ |
| SAOM4B | V94G，E250Q | 3.8％ |
| SAOM5B | V94G，E250Q，K89R | 3.5％ |
| SAOM6B | K89R，V94G，S213P，E250Q | 3.4％ |
| SAOM7B | K89R，V94G，M204A，S213P，E250Q | 3.2％ |
| SAOM8B | K89R，V94G，N166K，M204A，S213P，E250Q | 3.3％ |
| SAOM9B | K89R，V94G，N166K，M204A，S213P，E250Q，K322R | 1.9％ |
| 未修饰的(对照) | - | 7.2％ |
实施例7B.脯氨酸对检测肌酸的试剂的影响
当实施例3B和对比实施例1中获得的各种肌氨酸氧化酶应用于检测肌酸的试剂时，对脯氨酸的影响进行评估.向含10U/mL的上述肌氨酸氧化酶(实施例3B和对比实施例1获得)，1mM二氢二钠乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，0.1％(w/v)Triton X-100，0.02％(w/v)4-氨基安替比林，0.02％(w/v)TOOS(Dojindo公司提供)，50U/mL肌酸脒基水解酶(CNH-221，Toyobo公司提供)，和10U/mL过氧化物酶(PEO-301，Toyobo公司提供)的300μL 50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)中加入10μL浓度为5mg/dL的肌酸的水溶液，在37℃反应，使用Hitachi17060型自动分析仪检测546nm吸收值的变化。用100mg/dL L-脯氨酸水溶液代替肌酸水溶液，用上述相同的方式检测吸收值的改变。利用L-脯氨酸作底物与利用肌酸作底物反应5分钟，通过吸收值增加的相对比例(％)来计算脯氨酸的影响。结果显示于表7。正如表7所示，已经证实通过使用本发明的修饰的肌氨酸氧化酶作为检测肌酸的试剂，脯氨酸对试剂的影响得以降低。
表7
| 修饰的酶 | 突变体 | 对脯氨酸的作用 |
| SAOM1B | K89R | 5.3％ |
| SAOM2B | V94G | 3.1％ |
| SAOM3B | K322R | 3.2％ |
| SAOM4B | V94G，E250Q | 3.0％ |
| SAOM5B | V94G，E250Q，K89R | 3.4％ |
| SAOM6B | K89R，V94G，S213P，E250Q | 3.1％ |
| SAOM7B | K89R，V94G，M204A，S213P，E250Q | 2.9％ |
| SAOM8B | K89R，V94G，N166K，M204A，S213P，E250Q | 3.1％ |
| SAOM9B | K89R，V94G，N166K，M204A，S213P，E250Q，K322R | 1.9％ |
| 未修饰的(对照) | - | 7.0％ |
序列表
<110>东洋纺织株式会社(Toyo Boseki Kabushiki Kaisya)
<120>修饰的肌氨酸氧化酶，制备方法及其试剂组合物
(Altered Sarcosine Oxidase，Method for preparing the sameand Reagent Composition using the same)
<130>SCT051523-47
<150>JP2002-329428
<151>2002-11-13
<150>JP2003-33641
<151>2003-02-12
<150>JP2002-329427
<151>2002-11-13
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>389
<212>PRT
<213>Arthrobacter SP.TE1826
<400>1
Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser
1 5 10 15
Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr
20 25 30
Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His
35 40 45
Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr
50 55 60
Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys
65 70 75 80
Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly
85 90 95
Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys
100 105 110
Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys
115 120 125
Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu
130 135 140
Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg
145 150 155 160
Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val
165 170 175
Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr
180 185 190
Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn
195 200 205
Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr
210 215 220
Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn
225 230 235 240
Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr
245 250 255
Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His
260 265 270
Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly
275 280 285
Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr
290 295 300
Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr
305 310 315 320
Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe
325 330 335
Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe
340 345 350
Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys
355 360 365
Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys
370 375 380
Gln Lys Glu Thr Ile
385
<210>2
<211>1167
<212>DNA
<213>Arthrobacter SP.TE1826
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1167)
<223>
<400>2
atg agt att aaa aaa gat tat gat gta att gtg gtt ggc gct ggt tcc 48
Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser
1 5 10 15
atg gga atg gca gct ggg tac tat ctg tct aaa caa ggt gtt aaa aca 96
Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr
20 25 30
cta ttg gta gat tca ttt cat cct ccc cat aca aat ggc agc cat cat 144
Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His
35 40 45
ggc gat aca cgg atc att cgt cac gca tat ggc gaa gga aga gag tat 192
Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr
50 55 60
gta ccg ttt gcc ttg aga gca caa gag tta tgg tat gaa tta gaa aag 240
Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys
65 70 75 80
gag act cat cat aaa ata ttt aca aaa aca ggt gta ctc gtt ttt ggt 288
Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly
85 90 95
cct aaa gga gaa gct cct ttc gtt gcc gaa aca atg gaa gcc gca aag 336
Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys
100 105 110
gaa cat tca tta gat gtt gat tta cta gaa gga agt gaa ata aat aag 384
Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys
115 120 125
cgt tgg cca ggt gta acg gtt cct gag aat tat aat gct att ttt gaa 432
Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu
130 135 140
aaa aat tct ggt gtc tta ttt agt gaa aat tgt att cgc gct tac cgt 480
Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg
145 150 155 160
gaa ttg gcg gaa gca aat ggt gcg aaa gtt cta acg tac aca ccc gtt 528
Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val
165 170 175
gaa gat ttc gag att gcc gag gac ttc gtc aaa atc caa acc gcc tat 576
Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr
180 185 190
ggc tcc ttt aca gcc agt aaa tta att gtt agc atg ggc gct tgg aat 624
Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn
195 200 205
agc aaa ctg cta tca aaa tta aat att gaa atc cca ttg cag cca tac 672
Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr
210 215 220
cgt caa gtt gtc gga ttc ttc gaa tgt gat gaa aaa aaa tat agc aat 720
Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn
225 230 235 240
aca cat ggt tat ccg gcg ttc atg gtc gaa gtc cca act ggc atc tat 768
Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr
245 250 255
tac gga ttt cca agc ttc ggc ggc tgc ggc ttg aaa ata ggc tat cat 816
Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His
260 265 270
acg tat ggt caa aaa atc gat cca gat acg att aat cgt gaa ttt ggt 864
Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly
275 280 285
att tac ccg gag gat gaa ggg aat att cgc aaa ttc ctg gaa aca tat 912
Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr
290 295 300
atg ccg gga gca acc ggc gaa tta aaa agt ggg gca gtt tgc atg tac 960
Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr
305 310 315 320
aca aaa aca cct gat gag cat ttc gtg att gat tta cat cct caa ttc 1008
Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe
325 330 335
tcg aat gtc gcg att gca gcc gga ttc tcc gga cat ggg ttt aaa ttc 1056
Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe
340 345 350
tca agc gta gtt ggt gaa aca tta agt caa tta gct gta acc ggt aaa 1104
Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys
355 360 365
aca gaa cac gat att tcc atc ttt tca atc aat cgc cct gct tta aaa 1152
Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys
370 375 380
caa aaa gaa acg att 1167
Gln Lys Glu Thr Ile
385
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>3
gactcatcat aaaatattta caagaacagg tgtactcg 38
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>4
gtgtcttatt tagtgaaaat attattcgcg cttacc 36
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>5
gaattggcgg aagcaaaagg tgcgaaagtt ctaacg 36
<210>6
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>6
gccagtaaat taattgttag cgcgggcgct tggaatag 38
<210>7
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>7
gaatagcaaa ctgctaccaa aattaaatat tgaaatcc 38
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<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
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gtcggattct tcgaaagcga tgaaaaaaaa tatagc 36
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>9
gtgatgaaaa aaaatatagc tatacacatg gttatccg 38
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ccggcgttca tggtccaggt cccaactggc atc 33
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gaaacattaa gtcaattagt tgtaaccggt aaaacag 37
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<220>
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caaaaacagg tgtactcggt tttggtccta aaggag 36
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<400>13
gtttgcatgt acacaagaac acctgatgag catttcg 37
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<220>
<223>Arthrobacter SP.TE1826
<400>14
ccagtaaatt aattgttagc gcgggcgctt ggaatag 37
Claims (10)
1.修饰的肌氨酸氧化酶，其是由SEQ ID NO：1的94位的缬氨酸被甘氨酸替换的氨基酸序列组成的蛋白。
2.权利要求1的修饰的肌氨酸氧化酶，其具有肌氨酸氧化酶活性并与转化前的相比具有改进的液体稳定性和/或对L-脯氨酸作用降低。
3.权利要求1的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于修饰后肌氨酸氧化酶的Km值在未修饰的3倍以内。
4.权利要求1的修饰的肌氨酸氧化酶，其特征在于修饰后肌氨酸氧化酶的Km值在未修饰的1.5倍以内。
5.编码权利要求1到4中任一项的修饰的肌氨酸氧化酶的基因。
6.含有权利要求4的基因的载体。
7.转化有权利要求6的载体的大肠杆菌。
8.生产修饰的肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于培养权利要求7的大肠杆菌和从培养物中收集肌氨酸氧化酶。
9.用于检测肌酸的试剂，其含有权利要求1到4中任一项的肌氨酸氧化酶。
10.用于检测肌酐的试剂，其含有权利要求1到4中任一项的肌氨酸氧化酶。
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