CN109715799B - 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法 - Google Patents

经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109715799B
CN109715799B CN201780056754.0A CN201780056754A CN109715799B CN 109715799 B CN109715799 B CN 109715799B CN 201780056754 A CN201780056754 A CN 201780056754A CN 109715799 B CN109715799 B CN 109715799B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
ala
glu
sarcosine oxidase
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780056754.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109715799A (zh
Inventor
吉原绘里子
古川圭介
下地一彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kikkoman Corp
Original Assignee
Kikkoman Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kikkoman Corp filed Critical Kikkoman Corp
Publication of CN109715799A publication Critical patent/CN109715799A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109715799B publication Critical patent/CN109715799B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • C12N9/0034—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • C12Y105/03001—Sarcosine oxidase (1.5.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine

Abstract

本发明降低肌氨酸氧化酶的反应中L‑脯氨酸的影响。本发明提供一种对L‑脯氨酸的反应性降低的经修饰的肌氨酸氧化酶。

Description

经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法
技术领域
本发明涉及与修饰前的酶相比，对L-脯氨酸的反应性降低的经修饰的肌氨酸氧化酶、经修饰的肌氨酸氧化酶基因以及经修饰的肌氨酸氧化酶的制造方法。
背景技术
肌氨酸氧化酶是具有将肌氨酸水解生成甘氨酸和甲醛的催化作用的酶，可以用于测定人血清中或尿液中的肌酸酐量，能够用作以肾病为代表的各种疾病的诊断药物。
目前已知肌氨酸氧化酶是通过例如棒状杆菌属(例如参考非专利文献1)、芽孢杆菌属(例如参考专利文献1)、柱孢属(例如参考专利文献2)、假单胞菌属(例如参考专利文献3)、节杆菌属(例如参考专利文献4)等菌株产生的。
另外，本申请人等从芽孢杆菌属分离出肌氨酸氧化酶，通过基因工程方法成功地使该酶大量表达(例如参考专利文献5)。
但是，已知肌氨酸氧化酶与作为输液成分的L-脯氨酸也进行轻微的反应。因此，为了准确地测定肌酸酐或肌酸，需要不易受到L-脯氨酸影响的肌氨酸氧化酶。另外，关于对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶，已知有来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)TE1826的经修饰的肌氨酸氧化酶(专利文献6)、利用基因工程方法制造的七重突变体的经修饰的肌氨酸氧化酶(参考专利文献7等)，但仍然需要对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭54-52789号公报
专利文献2：日本特开昭56-92790号公报
专利文献3：日本特开昭60-43379号公报
专利文献4：日本特开平2-265478号公报
专利文献5：日本特开平5-115281号公报
专利文献6：日本特开平10-248572号公报(专利第3904098号公报)
专利文献7：日本特开2004-159566号公报(专利第4419044号公报)
非专利文献
非专利文献1：J.Biochem.，89，1981，第599页
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶。
解决问题的技术方案
本发明人等鉴于上述课题，对来自芽孢杆菌的肌氨酸氧化酶基因(日本特公平6-65303号公报记载)的基因进行了修饰，结果成功地得到了对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下内容：
[1]一种经修饰的肌氨酸氧化酶，其具有以下性质：
(a)作用：将1摩尔肌氨酸水解，生成1摩尔甘氨酸和1摩尔甲醛；以及
(b)底物特异性：当将对肌氨酸的活性作为100％时，对L-脯氨酸的相对活性为0.23％以下。
[2]一种经修饰的肌氨酸氧化酶，其选自以下：
(a)将肌氨酸氧化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行比对时，以下(i)～(vi)中至少一处位点被替换为下述氨基酸，并对L-脯氨酸的相对活性降低的肌氨酸氧化酶，即，(i)与SEQ ID NO:1中的第320位相对应位置的氨基酸为天冬酰胺、(ii)与SEQID NO:1中的第324位相对应位置的氨基酸为甘氨酸、(iii)与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置的氨基酸为酪氨酸、(iv)与SEQ ID NO:1中的第222位相对应位置的氨基酸为丙氨酸或组氨酸、(v)与SEQ ID NO:1中的第260位相对应位置的氨基酸为异亮氨酸，并且/或者(vi)与SEQ ID NO:1中的第314位相对应位置的氨基酸为丝氨酸，并对L-脯氨酸的相对活性低于野生型肌氨酸氧化酶；
(b-1)具有1个以上的所述(a)中的氨基酸替换，含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示有80％以上同一性的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性的蛋白质；
(b-2)经修饰的肌氨酸氧化酶，所述经修饰的肌氨酸氧化酶是具有1个以上的所述(a)中的氨基酸替换，含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示有75％以上的全长氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性的蛋白质，并且由SEQ ID NO:1中的第6～86位、第88～92位、第94～97位、第101～102位、第104～109位、第112～114位、第118位、第120～121位、第127～128位、第130～131位、第133～134位、第136～137位、第139～142位、第144～154位、第156～166位、第168～178位、第181～182位、第184位、第186位、第188～189位、第191～192位、第194～195位、第197～213位、第216～233位、第235～238位、第242～249位、第252～262位、第264～270位、第272～274位、第276～286位、第288～292位、第294位、第296～300位、第302～306位、第308～311位、第313～332位、第335～358位、第360～362位、第364～375位、第377～378位及第380～382位组成的同源性区域与由所述经修饰的肌氨酸氧化酶的各对应位置组成的同源性区域具有95％以上的氨基酸序列同一性；
(c-1)含有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列显示有80％以上同一性的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性的蛋白质；
(c-2)经修饰的肌氨酸氧化酶，所述经修饰的肌氨酸氧化酶是含有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列显示有75％以上的全长氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性的蛋白质，并且由SEQ ID NO:1中的第6～86位、第88～92位、第94～97位、第101～102位、第104～109位、第112～114位、第118位、第120～121位、第127～128位、第130～131位、第133～134位、第136～137位、第139～142位、第144～154位、第156～166位、第168～178位、第181～182位、第184位、第186位、第188～189位、第191～192位、第194～195位、第197～213位、第216～233位、第235～238位、第242～249位、第252～262位、第264～270位、第272～274位、第276～286位、第288～292位、第294位、第296～300位、第302～306位、第308～311位、第313～332位、第335～358位、第360～362位、第364～375位、第377～378位及第380～382位组成的同源性区域与由所述经修饰的肌氨酸氧化酶的各对应位置组成的同源性区域具有95％以上的氨基酸序列同一性；
(d)含有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质；或者
(e)含有在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22的氨基酸序列中在与SEQ ID NO:1中的第222位、第260位、第314位、第320位、第324位、第343位及第348位相对应位置以外的位置缺失、替换或增添1个或更多个氨基酸而形成的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性的蛋白质。
[3]根据[1]或[2]所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第320位相对应位置的氨基酸为天冬酰胺、与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第324位相对应位置的氨基酸为甘氨酸。
[4]根据[3]所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置的氨基酸为酪氨酸。
[5]根据[3]或[4]所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQ ID NO:1中的第222位相对应位置的氨基酸为丙氨酸或组氨酸。
[6]根据[3]～[5]中任一项所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQID NO:1中的第260位相对应位置的氨基酸为异亮氨酸。
[7]根据[3]～[6]中任一项所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQID NO:1中的第314位相对应位置的氨基酸为丝氨酸。
[8]根据[3]～[7]中任一项所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQID NO:1中的第343位相对应位置的氨基酸为甘氨酸。
[9]一种重组DNA，其含有载体，所述载体包含肌氨酸氧化酶基因，所述肌氨酸氧化酶基因编码根据[2]～[8]中任一项所述的经修饰的肌氨酸氧化酶。
[10]一种转化体或转导体，其含有根据[9]所述的重组DNA。
[11]一种经修饰的肌氨酸氧化酶的制造方法，其包括以下步骤：在培养基中培养根据[10]所述的转化体或转导体，从培养物中收集肌氨酸氧化酶。
[12]一种肌酸酐测定试剂，其含有根据[1]～[8]中任一项所述的经修饰的肌氨酸氧化酶。
[13]一种肌酸酐测定方法，其使用根据[1]～[8]中任一项所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，或者使用根据[12]所述的测定试剂。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-180796号的公开内容。
发明效果
本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶可以用作肌酸酐或肌酸的测定试剂。由于使用该经修饰的肌氨酸氧化酶的试剂不易受到L-脯氨酸的影响，因此可以进行更加准确的测定。
附图说明
图1表示脯氨酸对经修饰的肌氨酸氧化酶和修饰前的肌氨酸氧化酶的影响。
图2表示加入了经修饰的肌氨酸氧化酶或修饰前的肌氨酸氧化酶的肌酸酐测定试剂的反应性。
图3表示脯氨酸对经修饰的肌氨酸氧化酶和修饰前的肌氨酸氧化酶的影响(血清：PreciControlClinChemMulti1)。
图4表示脯氨酸对经修饰的肌氨酸氧化酶和修饰前的肌氨酸氧化酶的影响(血清：EXA Liquid 3normal)。
图5表示脯氨酸对经修饰的肌氨酸氧化酶和修饰前的肌氨酸氧化酶的影响(血清：SeikenLiquidNormal V)。
具体实施方式
下面详细地说明本发明。
本发明的肌氨酸氧化酶可以通过修饰编码肌氨酸氧化酶的基因来获得。用于经修饰的编码肌氨酸氧化酶的基因没有特别限制，例如可举出来自芽孢杆菌属的肌氨酸氧化酶基因(日本特公平6-65303号记载)等。作为其他示例，肌氨酸氧化酶基因可以来自节杆菌属TE1826(Arthrobacter sp.TE1826)(Journal of Fermentation and Bioengineering,1993年，75卷4期，第239-244页)。予以说明，可在本发明中使用的载体DNA没有特别限制。在一实施方式中，载体可以是pUTE300K’(日本特开2005-65583号公报记载)。
作为修饰上述基因的方法，可以使用已知的任何方法，可举出：使含有肌氨酸氧化酶基因，例如上述来自芽孢杆菌属的肌氨酸氧化酶基因的肌氨酸氧化酶表达质粒与羟胺、亚硝酸等化学诱变剂接触的方法，或者使用PCR法进行随机变换的方法等的点突变、利用市售试剂盒的用于产生位点特异性替换或缺失突变的公知技术的位点特异诱变法；选择性裂解所述重组体质粒DNA，然后除去或增添、连接所选择的寡核苷酸的方法；寡核苷酸诱变法等。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶具有以下性质。即，
(a)作用：将1摩尔肌氨酸水解，生成1摩尔甘氨酸和1摩尔甲醛；以及
(b-1)底物特异性：将对肌氨酸的活性作为100％时，对L-脯氨酸的相对活性为0.23％以下、0.22％以下、0.21％以下，例如0.20％以下，并且/或者
(b-2)底物特异性：与修饰前的蛋白质相比，对L-脯氨酸的相对活性为75％以下、74％以下，例如73％以下。
这里，当将对肌氨酸的活性作为100％时的对L-脯氨酸的相对活性，可以根据以下来确定：将特定浓度(例如95mM)的肌氨酸用作底物时的显色剂的吸光度变化作为100％，使用相同浓度(例如95mM)的L-脯氨酸来代替肌氨酸作为底物时的吸光度。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶可以是(i)与SEQ ID NO:1中的第320位相对应位置的氨基酸为天冬酰胺、(ii)与SEQ ID NO:1中的第324位相对应位置的氨基酸为甘氨酸、(iii)与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置的氨基酸为酪氨酸、(iv)与SEQ ID NO:1中的第222位相对应位置的氨基酸为丙氨酸或组氨酸、(v)与SEQ ID NO:1中的第260位相对应位置的氨基酸为异亮氨酸，并且/或者(vi)与SEQ ID NO:1中的第314位相对应位置的氨基酸为丝氨酸，并对L-脯氨酸的相对活性低于野生型肌氨酸氧化酶的肌氨酸氧化酶。根据情况，进一步地，(vii)与第343位相对应位置的氨基酸可以是甘氨酸。此时，与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置既可以是酪氨酸，也可以不是酪氨酸。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第320位相对应位置的氨基酸为天冬酰胺，并且与第324位相对应位置的氨基酸为甘氨酸。在一实施方式中，进一步地，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶中与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置的氨基酸为酪氨酸。在一实施方式中，进一步地，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶中与SEQ ID NO:1中的第222位相对应位置的氨基酸为丙氨酸或组氨酸。在一实施方式中，进一步地，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶中与SEQ ID NO:1中的第260位相对应位置的氨基酸为异亮氨酸。在一实施方式中，进一步地，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶中与SEQ ID NO:1中的第314位相对应位置的氨基酸为丝氨酸。在一实施方式中，进一步地，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶中与SEQ ID NO:1中的第343位相对应位置可以是甘氨酸；在这种情况下，与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置既可以是酪氨酸，也可以是苯丙氨酸。
作为确定氨基酸序列中“相对应位置”的方法，例如可以通过利用Lipman-Pearson法等公知算法对氨基酸序列进行比较，对存在于各蛋白质的氨基酸序列中的保守氨基酸残基赋予最大的同一性来进行。通过用这样的方法比对氨基酸序列，能够确定同源氨基酸残基在全长序列中的位置而不管氨基酸序列中存在的插入、缺失如何。认为相对应的位置(对应位置)在三维结构中存在于相同位置，能够推定在作为目标的肌氨酸氧化酶中具有相似功能。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶具有1个以上的上述(i)～(vii)的氨基酸替换，还含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示有70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同一性的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性。
氨基酸序列的同一性可以通过GENETYX(GENETYX公司制)的最大匹配或同源性检索等程序或DNASIS Pro(日立解决方案公司制)的最大匹配及多序列比对，或者CLUSTAL W的多序列比对等程序进行计算。为了计算氨基酸序列同一性，在比对2个以上的肌氨酸氧化酶时，可以研究该2个以上的肌氨酸氧化酶中相同的氨基酸位置。根据该信息，能够确定氨基酸序列中的相同区域。其中，在2个以上的氨基酸序列中，同一性％是指在利用Blosum62等算法对2个以上的氨基酸序列进行比对时，将可以比对的区域的总氨基酸数作为分母，将其中相同的氨基酸所占的位置数作为分子时的百分比。因此，一般当2个以上的氨基酸序列中存在完全无法观察到同一性的区域时，该区域无法进行比对，因此无法用于计算同一性％。
本说明书中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的由第6～86位、第88～92位、第94～97位、第101～102位、第104～109位、第112～114位、第118位、第120～121位、第127～128位、第130～131位、第133～134位、第136～137位、第139～142位、第144～154位、第156～166位、第168～178位、第181～182位、第184位、第186位、第188～189位、第191～192位、第194～195位、第197～213位、第216～233位、第235～238位、第242～249位、第252～262位、第264～270位、第272～274位、第276～286位、第288～292位、第294位、第296～300位、第302～306位、第308～311位、第313～332位、第335～358位、第360～362位、第364～375位、第377～378位和第380～382位组成的区域，被称为肌氨酸氧化酶的“同源性区域”。关于同源性区域，当不存在对应位置时，该位置不用于计算同一性％。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶具有1个以上的上述(i)～(vii)的氨基酸替换，还含有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示有70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上全长氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且，SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的由上述位置组成的同源性区域和由该经修饰的肌氨酸氧化酶的各对应位置组成的同源性区域显示有85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列同一性，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性。
已知肌氨酸氧化酶会通过氨基酸序列基序与辅酶结合。FAD结合型肌氨酸氧化酶中，与辅酶FAD结合的基序序列为Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(其中Xaa表示任意氨基酸)，其在各种FAD结合型肌氨酸氧化酶中高度保守。该基序序列可以在与SEQ ID NO:1的第11～16位相对应的位置的氨基酸序列中看到。因此，在一实施方式中，肌氨酸氧化酶的与SEQ IDNO:1的第11～16位相对应的位置的氨基酸序列为Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly(其中Xaa表示任意氨基酸)。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶含有与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22的氨基酸序列显示有70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同一性的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶含有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶含有在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22的氨基酸序列中在与SEQ ID NO:1中的第222位、第260位、第314位、第320位、第324位、第343位及第348位相对应位置以外的位置缺失、替换或增添1个或更多个氨基酸而形成的氨基酸序列，并具有与修饰前的蛋白质相比对L-脯氨酸的反应性降低的肌氨酸氧化酶活性。其中，更多个氨基酸是指例如10个、例如5个、4个、例如3个氨基酸。
在一实施方式中，本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶还可以具有另外的突变。例如，与SEQ ID NO:1中的第61位相对应位置的氨基酸可以是赖氨酸，与SEQ ID NO:1中的第241位相对应位置的氨基酸可以是甘氨酸，以及/或者与SEQ ID NO:1中的第269位相对应位置的氨基酸可以是组氨酸。另外，与SEQ ID NO:1中的第343位相对应位置的氨基酸可以是甘氨酸。
使用的载体DNA可以为任意DNA，例如可以是质粒DNA或噬菌体DNA等。在一实施方式中，载体可以是pUTE300K’(日本特开2005-65583号公报记载)。
然后，例如使用GenElute Plasmid Miniprep Kit(SIGMA公司)等将上述处理后的重组DNA纯化，得到各种重组DNA。
使用上述得到的各种重组DNA，转化或转导例如大肠杆菌K12，优选大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109(东洋纺织株式会社生产)、XL1-Blue(STRATAGENE公司制)等，可以得到含有携带引入有各种突变的肌氨酸氧化酶基因的重组DNA的转化体或转导体作为菌落。然后，培养每个菌落的携带各种突变的转化体或转导体，然后利用超声波、表面活性剂等进行破碎，得到携带各种突变的肌氨酸氧化酶粗酶液。
接着，确认每个菌落的肌氨酸氧化酶粗酶液对L-脯氨酸的反应性。具体而言，将从各菌落制备的各粗酶液对L-脯氨酸和肌氨酸的反应比(L-脯氨酸活性/肌氨酸活性)与修饰前的野生型肌氨酸氧化酶的L-脯氨酸活性/肌氨酸活性进行比较，由此选择对L-脯氨酸的反应性降低的转化体或转导体。另外，使从各菌落制备的各粗酶液与稀释的肌氨酸反应，由此确认其对肌氨酸的亲和性。
将上述得到的优良的修饰产物在营养培养基中培养，由此可以生产大量的经修饰的肌氨酸氧化酶。作为进行培养的培养基，例如，可使用如下得到的培养基：在酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、玉米浆、大豆或者小麦麦芽的浸出液等一种以上的氮源中添加磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等一种以上的无机盐，根据需要进一步适当添加糖类原料、维生素等而成。
予以说明，培养基的初始pH值优选被调节为7～9。另外，培养优选通过在30～42℃，优选约37℃进行6～24小时的通气搅拌深层培养、振荡培养、静置培养等实施。培养结束后，可以使用通常的酶收集手段从该培养物收集肌氨酸氧化酶。
例如通过过滤、离心分离等操作将菌体从培养物中分离，进行洗涤。优选从该菌体中收集肌氨酸氧化酶。在该情况中，也可以直接使用菌体，但优选通过使用超声波破碎机、弗氏压碎器、DYNAMILL等各种破碎设备将菌体破碎的方法、使用溶菌酶等细胞壁溶解酶将菌体细胞壁溶解的方法、使用Triton X-100等表面活性剂从菌体中提取酶的方法等，从菌体中收集肌氨酸氧化酶。
可以使用普通的酶纯化所用的方法从上述得到的粗酶液中分离肌氨酸氧化酶。例如，优选适当地组合使用硫酸铵盐析法、有机溶剂沉淀法、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、吸附色谱法、电泳法等来进行。
在一实施方式中，提供一种肌酸酐测定试剂，其含有本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶。肌酸酐测定试剂可以含有缓冲剂和稳定剂、肌酸酐酶、肌酸酶、过氧化物酶、显色剂等其他适当成分或试剂。各成分可以是相同或单独的试剂。在一实施方式中，提供一种肌酸酐测定方法，其使用本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶或上述测定试剂。该肌酸酐测定方法包括以下步骤：将本发明的经修饰的肌氨酸氧化酶，与可能含有肌氨酸的样品或可能通过酶作用等生成肌氨酸的样品接触。
(酶活性)
该酶对肌氨酸、L-脯氨酸的活性的测定，可以在以下条件下进行。予以说明，关于肌氨酸，将1分钟生成1微摩尔尿素的酶活性作为1单位(U)。
(制备试剂)
制备以下溶液，作为反应用试剂。
1)0.01M或0.2M肌氨酸、100mM Tris-HCl、2mM KCl、0.1％Triton-X100(pH7.7)或0.2M L-脯氨酸、100mM Tris-HCl、2mM KCl、0.1％Triton-X100(pH7.7)
2)80U/ml POD溶液
3)0.1％TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)溶液或0.1％苯酚溶液
4)0.2％4-氨基安替比林溶液
5)超纯水
6)0.3％SDS溶液
7)20mM Tris-HCl、1mM KCl、0.2％BSA(pH7.7)(酶稀释液)
接着，混合以下数量的上述各溶液，制备活性测定液。
1)5ml
2)1ml
3)2ml
4)1ml
5)1ml
测定可以如下进行。
1)在37℃将0.95mL活性测定液预孵育5分钟。
2)向各个底物中加入并混合适当稀释的酶液0.05ml。
3)在37℃，如果是肌氨酸，则反应10分钟；如果是L-脯氨酸，则反应60分钟。
4)进行10分钟(4.8mM、95mM肌氨酸)、60分钟(95mM L-脯氨酸)的反应后，混合上述0.3％SDS溶液，停止反应。
5)在25℃测定555nm的吸光度(OD样品)。
通过在混合酶液前混合0.3％SDS溶液来测定空白值(OD空白)。
6)首先确认通过与最终浓度95mM的肌氨酸、95mM L-脯氨酸的反应测定的ΔOD555nm(OD样品-OD空白)之比，然后计算与野生型的相对活性(95mM L-脯氨酸活性/95mM肌氨酸活性)之比。
另外，通过一并测定4.8mM肌氨酸活性，确认亲和性(4.8mM肌氨酸活性/95mM肌氨酸活性)，计算与野生型的相对活性比。
在一实施方式中，本发明提供一种突变型肌氨酸氧化酶，其具有K320N/E324G突变。在本说明书中，将其称为M0突变体。在另一实施方式中，本发明提供一种突变型肌氨酸氧化酶M1(SEQ ID NO:2)。M1突变体具有K320N/E324G/Y222H/F348Y/A314S突变。在另一实施方式中，本发明提供一种突变型肌氨酸氧化酶M2(SEQ ID NO:3)。M2突变体具有K320N/E324G/F260I突变。在另一实施方式中，本发明提供一种突变型肌氨酸氧化酶M3(SEQ IDNO:4)。M3突变体具有K320N/E324G/F260I/Y222A突变。在另一实施方式中，本发明提供一种突变型肌氨酸氧化酶M4(SEQ ID NO:22)。M4突变体具有K320N/E324G/Y222H/A314S/F343G突变。这些突变体蛋白质例如可以通过适当设计将突变引入野生型肌氨酸氧化酶基因的引物，引入突变，使经修饰的基因表达的方式来得到。
突变型肌氨酸氧化酶M0、M1、M2、M3和M4可以适当纯化，配制成肌酸酐测定试剂。另外，可以使用人工混入有L-脯氨酸的血清，评价对试剂中的L-脯氨酸的反应性。此外，关于构成上述突变型肌氨酸氧化酶的突变(即K320N、E324G、Y222H、Y222A、F348Y、A314S和F260I，还有F343G)，可以利用粗酶液或纯化酶来确认每个单独突变的效果。还可以根据需要制作多重突变体确认其效果。
[实施例]
下面通过实施例，对本发明进行更加具体的说明。
[实施例1]
在LB培养基(DIFCO公司制)中培养含有重组质粒DNA(在载体pUTE300K’中引入SEQID NO:1的SON基因而形成的DNA，以下记作pSON)的大肠杆菌(E.coli)DH5α(pSON)，收集菌体后，使用GenElute Plasmid Miniprep Kit(SIGMA公司)提取重组质粒DNA pSON，进行纯化。得到的重组质粒为约100μg。
基于得到的重组质粒，使用N末端、C末端用引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)进行易错PCR。易错PCR使用GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit(AgilentTechnologies公司制)进行。反应结束后，使用引入有各种突变的肌氨酸氧化酶基因文库转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(日本基因公司制)，生产突变型肌氨酸氧化酶，得到转化体文库。
接着，将得到的菌落在2ml TY培养基(含有25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG)中进行培养。在37℃培养18～24小时后，通过离心分离收集菌体，替换到20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMKCl(pH7.7)中进行超声波破碎，进行离心分离(12000r.p.m.、3分钟)。
将肌氨酸和L-脯氨酸作为底物，测定得到的破碎上清液的活性。筛选与突变前的酶相比，对脯氨酸的相对活性(95mM L-脯氨酸活性/95mM肌氨酸活性)降低，并且对肌氨酸的亲和性(4.8mM肌氨酸/95mM肌氨酸)不变或提高的酶。关于易错PCR和筛选，进行1个循环约1500株的筛选，使用结果为良好的突变体的质粒，进行下一个易错PCR。进行3个循环的“易错PCR→筛选”。
对于通过筛选而得到的优良突变体，进行DNA测序，鉴定出突变位点。另外，也一并确认单独突变引起的肌氨酸反应、L-脯氨酸反应的相关效果。通过进行该筛选，首先得到由5处突变位点组成的突变体M1。另外，还确认2处有效突变。然后，关于各个有效突变，制作单独突变体，确认其效果。用于制作单独突变体的引物如下(按正向、反向的顺序分别记载)。
Y222A：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8
Y222H：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10
E324G：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12
F348Y：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14
F260I：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16
A314S：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18
K320N：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20
K320N/E324G：仅正向SEQ ID NO:21(反向为SEQ ID NO:20)
结果示于下文。结果使用粗酶液获得。予以说明，反应使用TOOS作为显色剂。
[表1]
单突变体和野生型的相对活性比(％)
Figure BDA0001995720180000161
当将修饰前的肌氨酸氧化酶在各底物中的相对活性作为100％时的各个单独突变体的相对活性比如表格所示，分别确认了各突变的效果。
另外，根据对肌氨酸、L-脯氨酸的反应结果，将确认的突变任意组合，由此得到优良的突变体M0、M2、M3。这些也是使用上述引物制作的。将M1和M0、M2、M3突变体的粗酶液对野生型的相对活性比示于下表。予以说明，该反应中，将TOOS用作显色剂进行。
[表2]
突变体M0、M1、M2、M3和野生型酶的相对活性比(％)
Figure BDA0001995720180000162
所有突变体对肌氨酸的反应性均不变，而与野生型相比，对脯氨酸的反应性则明显降低。
[实施例2]
在如上得到的突变体中，将含有M1、M2、M3的经修饰的肌氨酸氧化酶基因的大肠杆菌(E.coli)DH5α在100ml含有25μg/ml卡那霉素的TY培养基(1％细菌-胰蛋白胨、0.5％细菌-酵母提取物、0.5％NaCl、pH7.5)中在37℃振荡培养16小时，然后将10ml接种到同样制备的7L的TY培养基(其中，含有1mM IPTG)中。接种后，以120r.p.m.的转速在37℃培养约20小时。
步骤1(粗酶液的制备)
培养结束后，将7L培养液倒在UF膜(MW50000)上，除去培养基成分，置换到10mM磷酸缓冲液、1mM EDTA中。然后，加入EDTA(pH8.0)使最终浓度变成50mM，用压力式均质器处理，将菌体破碎。对破碎的菌体液进行离心分离，使碎片沉淀，得到粗酶液。
步骤2(硫酸铵沉淀处理)
向500ml上述得到的粗酶中加入20％的硫酸铵，进行硫酸铵沉淀。硫酸铵沉淀后，将沉淀物溶解在由100mM KCl、10mM磷酸钾缓冲液、1mM EDTA组成的缓冲液中，混合，利用相同缓冲液进行透析，由此除去硫酸铵。再对实施了透析的处理液进行离心分离(10,000g、30分钟)，进行粗酶液的澄清化。
步骤3(Q-琼脂糖凝胶FF离子交换色谱，分批式)
将上述粗酶液吸附在填充有500ml的Q Sepharose Fast Flow(商标，GEHealthcare公司制)载体的柱上，用1500ml的100mM KCl、10mM磷酸钾缓冲液、1mM EDTA(pH8.0)洗涤后，用300mM KCl、10mM磷酸钾缓冲液、1mM EDTA(pH8.0)洗脱。洗脱结束后，回收纯化度高的级分，进行浓缩，用含有150mM KCl、1mM EDTA的10mM磷酸缓冲液pH8.0进行透析。
步骤4(Q-琼脂糖凝胶FF离子交换色谱，梯度)
将500ml在步骤3中处理的酶液装载到填充有用含有150mM KCl、1mM EDTA的10mM磷酸钾缓冲液缓冲的500ml的Q-琼脂糖凝胶FF(商标，GE Healthcare公司制)载体的柱上，用1500ml含有200mM KCl、1mM EDTA的10mM磷酸缓冲液洗涤，然后用具有10mM磷酸钾、1mMEDTA的200mM-300mM KCl的梯度缓冲液(总液量7500ml)进行洗脱，回收级分。分析回收的级分，将比活性(U/OD280nm)高的级分混合，对10mM磷酸钾缓冲液pH8.0进行透析，制作酶标准品。
[实施例3]
使用将肌氨酸活性统一为约33.0U/ml的酶液，将用上述方法纯化的经修饰的肌氨酸氧化酶M1、M2、M3和修饰前的肌氨酸氧化酶对L-脯氨酸的反应性进行比较。予以说明，在该反应中，将苯酚用作显色剂。
结果示于下文。当将修饰前的肌氨酸氧化酶在各底物中的相对活性作为100％时，经修饰的肌氨酸氧化酶M1对L-脯氨酸的相对活性比为51.5％，M2对L-脯氨酸的相对活性比为73.0％，M3对L-脯氨酸的相对活性比为68.7％。
[表3]
纯化的突变体M1、M2、M3和野生型的相对活性比(％)
Figure BDA0001995720180000181
[实施例4]
对于用上述方法纯化的经修饰的肌氨酸氧化酶M1、M2、M3和修饰前的肌氨酸氧化酶，研究了当将对肌氨酸的活性作为100％时，对L-脯氨酸的相对活性(％)。对于实验条件，按照与实施例1相同的顺序，将使用95mM肌氨酸作为底物时的吸光度作为100％，评价使用95mM脯氨酸作为底物时的吸光度。显色剂使用苯酚。结果示于下文。
[表4]
纯化的突变体M1、M2、M3对脯氨酸的相对活性(％)
对脯氨酸的相对活性(％)
野生型 0.27
M1 0.14
M2 0.20
M3 0.19
[实施例5]
评价将上述得到的各种肌氨酸氧化酶用于肌酸酐测定试剂时的脯氨酸的影响程度。肌酸酐测定试剂如下。
准备下述第一试剂和第二试剂，使用市售的对照血清(PreciControlClinChemMulti1、EXA Liquid 3normal或SeikenLiquidNormal V)作为样品，进行肌酸酐的测定。
(第一试剂)
抗坏血酸氧化酶 10U/mL
过氧化氢酶 300U/mL
肌酸酶 35U/mL
肌氨酸氧化酶 11U/mL
TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸)缓冲液 20mM，pH8.2
N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基-间甲苯胺)(TOOS) 1.0mM
Triton X-100 0.1％
氯化钾 70mM
(第二试剂)
4-氨基安替比林 4.0mM
肌酸酐酶 370U/mL
过氧化物酶 15U/mL
TES缓冲液 20mM，pH8.0
Triton X-100 0.1％
氯化钾 70mM
叠氮化钠 0.09％
予以说明，关于各酶，将1分钟生成1微摩尔生成物的酶活性作为对于各个酶的1单位(U)。
在对照血清中加入L-脯氨酸作为测定样品，使得浓度为0、10、20、30、40、50mg/dL。在7μL样品中，加入125μL第一试剂，开始测定。从测定开始起，在5分钟后加入63.0μL第二试剂。测定使用日本电子公司制的BM-1650自动分析仪器，关于测定波长，主波长设为545nm，亚波长设为658nm。试剂空白使用生理盐水作为样品。预先测定试剂空白和肌酸酐浓度已知的水溶液，绘制标准曲线，据此求出样品测定时的肌酸酐的测定的值。
如图1所示，与修饰前的肌氨酸氧化酶相比，脯氨酸对经修饰的肌氨酸氧化酶的影响降低。
通过使用经修饰的肌氨酸氧化酶、修饰前的肌氨酸氧化酶的试剂，来比较对5.0mg/dL肌酸酐的反应性。
如图2所示，可知使用经修饰的肌氨酸氧化酶的试剂和使用修饰前的肌氨酸氧化酶的试剂的反应性没有变化。
由此可知，经修饰的肌氨酸氧化酶与修饰前的肌氨酸氧化酶相比，反应不变，脯氨酸对经修饰的肌氨酸氧化酶的影响得到了抑制。
[实施例6]
M4的制作方法
简而言之，是将SOD-M1的质粒作为模板，使用以下引物(SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24)，通过PCR法来制作具有突变K320N/E324G/Y222H/A314S/F343G的经修饰的肌氨酸氧化酶M4(SEQ ID NO:22)。
Figure BDA0001995720180000211
质粒的获得步骤和PCR条件与实施例1相同。测定得到的质粒DNA的序列，确认突变的引入。
M4的评价方法
按照与实施例2相同的步骤，培养含有制作的M4的经修饰的肌氨酸氧化酶基因的大肠杆菌(E.coli)DH5α，制备纯化酶液。然后，对于经修饰的肌氨酸氧化酶M4，按照与实施例5相同的步骤，评价用于肌酸酐测定试剂时的脯氨酸的影响程度。肌酸酐测定试剂与实施例5相同。另外，所使用的血清如下：
PreciControlClinChemMulti1批次168 332-02
EXA Liquid 3normal批次NL052G
SeikenLiquidNormal V批次VNO10103。
结果，M4对脯氨酸的反应性不仅低于修饰前的肌氨酸氧化酶，与M1相比，M4对脯氨酸的反应性也有所降低(图3-5)。
予以说明，通过使用经修饰的肌氨酸氧化酶M4和修饰前的肌氨酸氧化酶(SEQ IDNO:1)的试剂，来比较对5.0mg/dL肌酸酐的反应性，结果，在修饰前后的反应性不变。由此可知，经修饰的肌氨酸氧化酶M4与修饰前的肌氨酸氧化酶相比，反应不变，脯氨酸对M4的影响得到了抑制。
序列说明
SEQ ID NO:1：来自芽孢杆菌(Bacillus)NS-129的野生型肌氨酸氧化酶
SEQ ID NO:2：经修饰的肌氨酸氧化酶M1(K320N/E324G/Y222H/F348Y/A314S)
SEQ ID NO:3：经修饰的肌氨酸氧化酶M2(K320N/E324G/F260I)
SEQ ID NO:4：经修饰的肌氨酸氧化酶M3(K320N/E324G/F260I/Y222A)
SEQ ID NO:5：易错PCR用N末端侧序列atgagcacgcattttgacgta
SEQ ID NO:6：易错PCR用C末端侧序列ttattttactgcttctttttttaatgcatc
SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:21：突变引入用引物
SEQ ID NO:22：经修饰的肌氨酸氧化酶M4(K320N/E324G/Y222H/A314S/F343G)
SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:24：突变引入用引物
本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请均通过直接引用而并入本说明书。
序列表
<110> 龟甲万株式会社
<120> 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法
<130> PH-7027-PCT
<150> JP 2016-180796
<151> 2016-09-15
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 387
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.) NS-129
<400> 1
Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu
            20                  25                  30
Val Asp Ser Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp
        35                  40                  45
Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr
65                  70                  75                  80
His His Lys Ile Phe Thr Gln Thr Gly Val Leu Val Tyr Gly Pro Lys
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ala Phe Val Ser Glu Thr Met Glu Ala Ala Asn Ile His
            100                 105                 110
Ser Leu Glu His Glu Leu Phe Glu Gly Lys Gln Leu Thr Asp Arg Trp
        115                 120                 125
Ala Gly Val Glu Val Pro Asp Asn Tyr Glu Ala Ile Phe Glu Pro Asn
    130                 135                 140
Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Gln Ala Tyr Arg Glu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ala His Gly Ala Thr Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp
                165                 170                 175
Phe Glu Val Thr Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser
            180                 185                 190
Tyr Thr Ala Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln
    210                 215                 220
Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala
225                 230                 235                 240
His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly
                245                 250                 255
Phe Pro Ser Phe Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His Ser Tyr
            260                 265                 270
Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Ala Tyr
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu Gln Tyr Met Pro
    290                 295                 300
Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Lys Tyr Ser Asn
                325                 330                 335
Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser
            340                 345                 350
Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu
        355                 360                 365
His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu
    370                 375                 380
Ala Val Lys
385
<210> 2
<211> 387
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.) NS-129
<400> 2
Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu
            20                  25                  30
Val Asp Ser Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp
        35                  40                  45
Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr
65                  70                  75                  80
His His Lys Ile Phe Thr Gln Thr Gly Val Leu Val Tyr Gly Pro Lys
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ala Phe Val Ser Glu Thr Met Glu Ala Ala Asn Ile His
            100                 105                 110
Ser Leu Glu His Glu Leu Phe Glu Gly Lys Gln Leu Thr Asp Arg Trp
        115                 120                 125
Ala Gly Val Glu Val Pro Asp Asn Tyr Glu Ala Ile Phe Glu Pro Asn
    130                 135                 140
Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Gln Ala Tyr Arg Glu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ala His Gly Ala Thr Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp
                165                 170                 175
Phe Glu Val Thr Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser
            180                 185                 190
Tyr Thr Ala Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro His Arg Gln
    210                 215                 220
Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala
225                 230                 235                 240
His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly
                245                 250                 255
Phe Pro Ser Phe Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His Ser Tyr
            260                 265                 270
Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Ala Tyr
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu Gln Tyr Met Pro
    290                 295                 300
Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ser Val Cys Met Tyr Thr Asn
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asp Gly His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Lys Tyr Ser Asn
                325                 330                 335
Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Tyr Lys Phe Ser Ser
            340                 345                 350
Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu
        355                 360                 365
His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu
    370                 375                 380
Ala Val Lys
385
<210> 3
<211> 387
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.) NS-129
<400> 3
Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu
            20                  25                  30
Val Asp Ser Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp
        35                  40                  45
Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr
65                  70                  75                  80
His His Lys Ile Phe Thr Gln Thr Gly Val Leu Val Tyr Gly Pro Lys
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ala Phe Val Ser Glu Thr Met Glu Ala Ala Asn Ile His
            100                 105                 110
Ser Leu Glu His Glu Leu Phe Glu Gly Lys Gln Leu Thr Asp Arg Trp
        115                 120                 125
Ala Gly Val Glu Val Pro Asp Asn Tyr Glu Ala Ile Phe Glu Pro Asn
    130                 135                 140
Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Gln Ala Tyr Arg Glu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ala His Gly Ala Thr Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp
                165                 170                 175
Phe Glu Val Thr Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser
            180                 185                 190
Tyr Thr Ala Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr Arg Gln
    210                 215                 220
Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala
225                 230                 235                 240
His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly
                245                 250                 255
Phe Pro Ser Ile Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His Ser Tyr
            260                 265                 270
Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Ala Tyr
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu Gln Tyr Met Pro
    290                 295                 300
Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Asn
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asp Gly His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Lys Tyr Ser Asn
                325                 330                 335
Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser
            340                 345                 350
Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu
        355                 360                 365
His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu
    370                 375                 380
Ala Val Lys
385
<210> 4
<211> 387
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.) NS-129
<400> 4
Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu
            20                  25                  30
Val Asp Ser Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp
        35                  40                  45
Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr
65                  70                  75                  80
His His Lys Ile Phe Thr Gln Thr Gly Val Leu Val Tyr Gly Pro Lys
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ala Phe Val Ser Glu Thr Met Glu Ala Ala Asn Ile His
            100                 105                 110
Ser Leu Glu His Glu Leu Phe Glu Gly Lys Gln Leu Thr Asp Arg Trp
        115                 120                 125
Ala Gly Val Glu Val Pro Asp Asn Tyr Glu Ala Ile Phe Glu Pro Asn
    130                 135                 140
Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Gln Ala Tyr Arg Glu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ala His Gly Ala Thr Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp
                165                 170                 175
Phe Glu Val Thr Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser
            180                 185                 190
Tyr Thr Ala Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro Ala Arg Gln
    210                 215                 220
Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala
225                 230                 235                 240
His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly
                245                 250                 255
Phe Pro Ser Ile Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His Ser Tyr
            260                 265                 270
Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Ala Tyr
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu Gln Tyr Met Pro
    290                 295                 300
Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Asn
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asp Gly His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Lys Tyr Ser Asn
                325                 330                 335
Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser
            340                 345                 350
Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu
        355                 360                 365
His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu
    370                 375                 380
Ala Val Lys
385
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 5
atgagcacgc attttgacgt a 21
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 6
ttattttact gcttcttttt ttaatgcatc 30
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 7
caaccagcac gtcaagtagt aggattc 27
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 8
ttgacgtgct ggttgtaatg gaattt 26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 9
caaccacacc gtcaagtagt aggattc 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 10
ttgacggtgt ggttgtaatg gaattt 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 11
ggattcccaa gcattggcgg aagcg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 12
cgcttccgcc aatgcttggg aatcc 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctgaaaaaag gctcagtttg catg 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 14
catgcaaact gagccttttt tcag 24
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 15
gtatactaac actccagatg agcactttg 29
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctggagtgtt agtatacatg caaactg 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 17
ccagatgggc actttgtaat tgactta 27
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 18
aaagtgccca tctggagtct tagtatacat 30
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 19
ctctggacat ggatataaat tctcaagc 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 20
gcttgagaat ttatatccat gtccagag 28
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 21
gtatactaac actccagatg ggcactttg 29
<210> 22
<211> 387
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.) NS-129
<400> 22
Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val Lys Thr Leu Leu
            20                  25                  30
Val Asp Ser Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His Gly Asp
        35                  40                  45
Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro
    50                  55                  60
Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr
65                  70                  75                  80
His His Lys Ile Phe Thr Gln Thr Gly Val Leu Val Tyr Gly Pro Lys
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ala Phe Val Ser Glu Thr Met Glu Ala Ala Asn Ile His
            100                 105                 110
Ser Leu Glu His Glu Leu Phe Glu Gly Lys Gln Leu Thr Asp Arg Trp
        115                 120                 125
Ala Gly Val Glu Val Pro Asp Asn Tyr Glu Ala Ile Phe Glu Pro Asn
    130                 135                 140
Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Gln Ala Tyr Arg Glu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ala His Gly Ala Thr Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val Glu Asp
                165                 170                 175
Phe Glu Val Thr Glu Asp Leu Val Thr Ile Lys Thr Ala Lys Gly Ser
            180                 185                 190
Tyr Thr Ala Asn Lys Leu Val Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys
        195                 200                 205
Leu Leu Ser Lys Leu Asp Val Glu Ile Pro Leu Gln Pro His Arg Gln
    210                 215                 220
Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Ala Lys Tyr Ser Asn Asn Ala
225                 230                 235                 240
His Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Glu Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly
                245                 250                 255
Phe Pro Ser Phe Gly Gly Ser Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His Ser Tyr
            260                 265                 270
Gly Gln Gln Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Ala Tyr
        275                 280                 285
Pro Glu Asp Glu Ala Asn Leu Arg Lys Phe Leu Glu Gln Tyr Met Pro
    290                 295                 300
Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gly Ser Val Cys Met Tyr Thr Asn
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asp Gly His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Lys Tyr Ser Asn
                325                 330                 335
Val Ala Ile Ala Ala Gly Gly Ser Gly His Gly Phe Lys Phe Ser Ser
            340                 345                 350
Val Val Gly Glu Thr Leu Ala Gln Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu
        355                 360                 365
His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Leu Asn Arg Asp Ala Leu Lys Lys Glu
    370                 375                 380
Ala Val Lys
385
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 23
gcagctggtg gttctggaca tggatttaaa 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 24
atgtccagaa ccaccagctg caattgcaac 30

Claims (8)

1.一种经修饰的肌氨酸氧化酶，其选自以下：
(a)将肌氨酸氧化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行比对时，(i)与SEQID NO:1中的第320位相对应位置的氨基酸为天冬酰胺，并且，(ii)与SEQ ID NO:1中的第324位相对应位置的氨基酸为甘氨酸，进一步地，以下(A)～(C)中至少一处位点被替换为下述氨基酸，并对L-脯氨酸的相对活性降低的肌氨酸氧化酶，即，(A)与SEQ ID NO:1中的第348位相对应位置的氨基酸为酪氨酸、(B)与SEQ ID NO:1中的第260位相对应位置的氨基酸为异亮氨酸，并且/或者(C)与SEQ ID NO:1中的第314位相对应位置的氨基酸为丝氨酸，并对L-脯氨酸的相对活性低于野生型肌氨酸氧化酶。
2.根据权利要求1所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQ ID NO:1中的第222位相对应位置的氨基酸为丙氨酸或组氨酸。
3.根据权利要求2所述的经修饰的肌氨酸氧化酶，其中，进一步地，与SEQ ID NO:1中的第343位相对应位置的氨基酸为甘氨酸。
4.一种重组DNA，其含有载体，所述载体包含肌氨酸氧化酶基因，所述肌氨酸氧化酶基因编码根据权利要求1所述的经修饰的肌氨酸氧化酶。
5.一种转化体或转导体，其含有根据权利要求4所述的重组DNA。
6.一种经修饰的肌氨酸氧化酶的制造方法，其包括以下步骤：在培养基中培养根据权利要求5所述的转化体或转导体，从培养物中收集肌氨酸氧化酶。
7.一种肌酸酐测定试剂，其含有根据权利要求1所述的经修饰的肌氨酸氧化酶。
8.一种肌酸酐测定方法，其使用根据权利要求1所述的经修饰的肌氨酸氧化酶。
CN201780056754.0A 2016-09-15 2017-09-13 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法 Active CN109715799B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016180796 2016-09-15
JP2016-180796 2016-09-15
PCT/JP2017/032992 WO2018052005A1 (ja) 2016-09-15 2017-09-13 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109715799A CN109715799A (zh) 2019-05-03
CN109715799B true CN109715799B (zh) 2023-04-04

Family

ID=61619543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780056754.0A Active CN109715799B (zh) 2016-09-15 2017-09-13 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11479757B2 (zh)
JP (1) JP7090547B2 (zh)
CN (1) CN109715799B (zh)
WO (1) WO2018052005A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111876397A (zh) * 2020-08-07 2020-11-03 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种在大肠杆菌中发酵生产肌氨酸氧化酶的方法
WO2023190087A1 (ja) * 2022-03-31 2023-10-05 東洋紡株式会社 クレアチニン高値検体測定時の正確性向上

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1711353A (zh) * 2002-11-13 2005-12-21 东洋纺织株式会社 修饰的肌氨酸氧化酶,制备方法及其试剂组合物
CN101407795A (zh) * 2008-11-17 2009-04-15 浙江大学 定向进化构建的耐热型肌氨酸氧化酶及其基因

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6029473B2 (ja) 1977-10-04 1985-07-10 東洋醸造株式会社 ザルコシン・オキシダ−ゼの製法
JPS5692790A (en) 1979-12-26 1981-07-27 Hideaki Yamada Preparation of sarcosine oxidase
DE3326888A1 (de) 1983-07-26 1985-02-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Sarcosin-oxidase
JPH0787780B2 (ja) 1989-04-04 1995-09-27 東洋紡績株式会社 新規なザルコシンオキシダーゼおよびその製法
JPH05115281A (ja) 1991-10-25 1993-05-14 Kikkoman Corp 新規なザルコシン・オキシダーゼｍ、その遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びザルコシン・オキシダーゼｍの製造法
JP3904098B2 (ja) * 1997-03-10 2007-04-11 東洋紡績株式会社 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途
JP2000175685A (ja) 1998-12-14 2000-06-27 Kikkoman Corp ザルコシンオキシダーゼ及びその製造法
JP4419044B2 (ja) 2002-11-13 2010-02-24 東洋紡績株式会社 改変型ザルコシンオキシダーゼ
WO2004044193A1 (ja) 2002-11-13 2004-05-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha 改変型ザルコシンオキシダーゼ、その製造法およびそれを用いた試薬組成物
JP2009072196A (ja) 2008-10-15 2009-04-09 Toyobo Co Ltd 改変型ザルコシンオキシダーゼ
JP2009055919A (ja) 2008-10-15 2009-03-19 Toyobo Co Ltd 改変型ザルコシンオキシダーゼ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1711353A (zh) * 2002-11-13 2005-12-21 东洋纺织株式会社 修饰的肌氨酸氧化酶,制备方法及其试剂组合物
CN101407795A (zh) * 2008-11-17 2009-04-15 浙江大学 定向进化构建的耐热型肌氨酸氧化酶及其基因

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alteration of L-proline oxidase activity of sarcosine oxidase and a structural interpretation;Nishiya Y等;《Journal of Analytical Bio-Science》;20101231;第33卷(第2期);摘要和第162页右栏第1段、第163页左栏第2段以及第164页右栏第1-4段 *
Bacillus sp.BSD-8肌酐降解酶系的研究;郭康平;《中国博士学位论文全文数据库 基础科技辑》;20081115;A006-67 *
Nishiya Y等.Alteration of L-proline oxidase activity of sarcosine oxidase and a structural interpretation.《Journal of Analytical Bio-Science》.2010,第33卷(第2期), *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190218528A1 (en) 2019-07-18
JP7090547B2 (ja) 2022-06-24
US11479757B2 (en) 2022-10-25
WO2018052005A1 (ja) 2018-03-22
CN109715799A (zh) 2019-05-03
JPWO2018052005A1 (ja) 2019-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2020439B1 (en) Eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability, gene and recombinant DNA for the eukaryotic amadoriase, and process for production of eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability
Tanaka et al. Crystal structure of the ternary complex of mouse lung carbonyl reductase at 1.8 Å resolution: the structural origin of coenzyme specificity in the short-chain dehydrogenase/reductase family
EP2602318B1 (en) Amadoriase having altered substrate specificity
WO2008059777A1 (fr) Glucose déshydrogénase dépendante du flavine-adénine dinucléotide modifiée
KR20130038914A (ko) 글루코스 탈수소효소
JP2013099359A (ja) ヘモグロビンＡ１ｃ測定法およびそれに用いる酵素とその製造法
WO2013038062A1 (en) Enzyme variants with improved properties
WO2010053161A1 (ja) 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
Kudo et al. Two isozymes of P450nor of Cylindrocarpon tonkinense: molecular cloning of the cDNAs and genes, expressions in the yeast, and the putative NAD (P) H-binding site
CN109715799B (zh) 经修饰的肌氨酸氧化酶及其基因和制造方法
EP2808386B1 (en) Amadoriase having improved thermal stability, gene and recombinant dna of same, and method for producing amadoriase having improved thermal stability
CN105683390B (zh) 使用作用于糖基化肽的阿马多里酶的HbA1c测定方法
CN110804596B (zh) 一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用
JP4133326B2 (ja) 新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
CN115247158B (zh) 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用
EP0486067B1 (en) Peroxidase gene of microbial origin
JP4308768B2 (ja) フルクトシルアミンオキシダーゼ
EP0545688A2 (en) DNA Coding for Uricase and Process for Producing Uricase
JP3819969B2 (ja) 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
KR20050042771A (ko) 글루코오스 탈수소효소
US20110020896A1 (en) Mutant dna polymerases and their genes
US7132253B2 (en) Modified sarcosine oxidases, modified sarcosine oxidase genes, and methods for preparing the modified sarcosine oxidases
US6194190B1 (en) Amino-terminal deblocking enzyme
JP2008306963A (ja) 高速反応性カタラーゼの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant