JP2004154014A - 耐熱性コージビオースホスホリラーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】耐熱性コージビオースホスホリラーゼを提供するとともに本酵素の製造方法を提供する。
【解決手段】野生型のコージビオースホスホリラーゼより反応至適温度と熱安定性が有意に上昇した新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物中から採取する酵素の製造方法により解決する。
【選択図】 なし
【解決手段】野生型のコージビオースホスホリラーゼより反応至適温度と熱安定性が有意に上昇した新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物中から採取する酵素の製造方法により解決する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性コージビオースホスホリラーゼに関し、更に詳細には、無機質のリン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す酵素コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、反応至適温度及び温度安定性が向上した耐熱性コージビオースホスホリラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】
特開平１０−３０４８８２号公報
【非特許文献１】
『酵素ハンドブック』朝倉書店（１９８２年）
【０００３】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。これらホスホリラーゼとその作用については非特許文献１にまとめられている。しかしながら、当時、コージビオースを生成しうるホスホリラーゼは学術的にも未報告で、その存在さえ知られておらず、その提供が望まれていた。
【０００４】
斯かる状況下、本発明者等は、当時、未知のコージビオースホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索し、その結果、特許文献１に明らかにされているように、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ ３５０４７）が、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見いだし、下記の理化学的性質を有することを明らかにするとともに、その製造方法を確立した。
（１） 作用
（ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する。
（ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質にグルコース基の転移を触媒する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００ダルトン
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．５
（４） 至適温度
ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近
（５） 至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近
（６） 温度安定性
ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定
（７） ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．０
さらに、本コージビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号３に記載の塩基配列にコードされており、配列表における配列番号４に記載されているアミノ酸配列を有することも見いだした。また、本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質共存下で作用させることにより得られるグルコ転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立した。
【０００５】
酵素の耐熱性は、酵素反応の利用の際、極めて重要な因子で、耐熱性の高い酵素は、少量の酵素量で長時間反応できるため、酵素反応における酵素量が低減でき、糖質の製造上、経済的に有利である。酵素はタンパク質から出来上がっており、酵素が示す諸特性はその酵素タンパク質のアミノ酸一次配列に起因しており、酵素の耐熱性も、アミノ酸一次配列やその一次配列で形成される高次構造によって生み出されることは一般的に認識されているところである。現在では、遺伝子操作技術を用いて、酵素タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列を解読することにより、一義的に酵素タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。また、遺伝子ＤＮＡの塩基配列中の塩基を他の塩基に人為的に置換し、コードされるアミノ酸残基を変え、他のアミノ酸残基に置換した変異酵素タンパク質を作製することが可能であり、いくつかの酵素タンパク質においては、人為的に遺伝子変異を与えることによって耐熱化酵素が得られている。しかしながら、コージビオースホスホリラーゼにおいては、転移糖質の生成反応に経済的に有利な耐熱性の高い酵素が望まれていたものの、その耐熱性コージビオースホスホリラーゼは実現していなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、反応至適温度及び温度安定性が向上した耐熱性コージビオースホスホリラーゼ及びその製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、先ず、サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ ３５０４７由来の、配列表における配列番号３に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡをそのアミノ酸配列を変えることなく変異させ制限酵素切断部位などを導入し、それを大腸菌での発現プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に組換え、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ高産生組換えプラスミドを作製した。次いで、得られた組換えプラスミドからコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡを取り出し、試験管内でランダムにＤＮＡ変異を与え、様々なアミノ酸置換が起こっているコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡ混合物を作製した。その変異ＤＮＡを組換えプラスミドに戻した後、大腸菌に形質転換して、変異コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ライブラリーを作製した。次に、得られた遺伝子ライブラリーから組換え大腸菌を単離し、培養し、得られた培養菌体から変異コージビオースホスホリラーゼを抽出し、その変異酵素の熱安定性を調べることによって、熱安定性が向上した変異コージビオースホスホリラーゼを産生する形質転換体をスクリーニングした。その結果、目的とする形質転換株を１株得ることができた。さらに、その形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの塩基配列を決定してコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡの変異箇所を調べたところ、該ＤＮＡは配列表における配列番号２に記載の塩基配列を有しており、ランダム変異前の配列表における配列番号５に記載の塩基配列と異同を調べたところ、第１，５３７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列の第５１３番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ（アスパラギン酸）が、配列表における配列番号２の塩基配列に併記したアミノ酸配列に見られるとおり、Ａｓｎ（アスパラギン）に置換していたことがわかった。
【０００８】
得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体を培養したところ、産生するコージビオースホスホリラーゼ活性は変異前の組換え体とほぼ同じ活性量であり、耐熱性コージビオースホスホリラーゼも大腸菌内で高発現し容易に製造できることがわかった。得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼの諸特性を調べたところ、至適ｐＨなどには変化はなく、熱安定性及び至適温度が、変異前の酵素よりも約５℃上昇して耐熱化していることがわかった。
【０００９】
得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼは高い耐熱性を有することから、該酵素を調製する工程で大腸菌由来の他の酵素タンパク質などを熱失活させる際、コージビオースホスホリラーゼ活性を失活させることなく安心して熱処理ができ、また、酵素剤の保存においても、より長期間の保存でも失活が少ない。さらに、変異のない酵素と比べ、より高い温度で反応することができ、すなわち約７５℃までで反応することができ、熱による失活が少ないため、より長時間の反応ができることから、少量の酵素量で反応ができるため、該酵素によって生成するコージオリゴ糖などの糖質製造において有利に利用できる。
【００１０】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１１】
【実験１】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドの作製＞
配列表における配列番号６に示す５０塩基の合成ＤＮＡと配列表における配列番号７に示す４２塩基の合成ＤＮＡとを常法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後、その混合液を常法に従って熱処理して両ＤＮＡをアニーリングした。予め、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＰｓｔＩとで切断したプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社販売）と、アニーリングした合成ＤＮＡとを混合した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位の間に合成ＤＮＡを挿入して新たにＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位を有するプラスミドｐＫＳＳ２を得た。
【００１２】
特許文献１に記載のコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＫＰ１を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＪ２０００（パーキン・エルマ社製造）を用いて、９５℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒と７２℃で４分３０秒のサイクルを２５回した後、７２℃で１０分間保持することで、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡを常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、予め、同じ酵素で切断したプラスミドｐＫＳＳ２と混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間にコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有し、且つ、配列表における配列番号３に記載の塩基配列において、第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧがＡＴＧに置換したコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を得た。
【００１３】
コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー４とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを得た。
【００１４】
次いで、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー８とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを得た。このようにして得られた組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有していた。配列表における配列番号３に記載の塩基配列及びアミノ酸配列と異同を調べたところ、コードするアミノ酸配列は同一で、即ち、配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列中の第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧが同じくＭｅｔをコードする塩基配列ＡＴＧに置換しており、且つ、第２６９番目のＳｅｒ（セリン）をコードする塩基配列ＴＣＡが同じくＳｅｒをコードする塩基配列ＴＣＧに置換していることによりＸｈｏＩ切断部位（ＣＴＣＧＡＧ）が導入され、第７００番目のＴｈｒ（スレオニン）をコードする塩基配列ＡＣＡが同じくＴｈｒをコードする塩基配列ＡＣＣに置換していることによりＫｐｎＩ切断部位（ＧＧＴＡＣＣ）が導入されたコージビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが判明した。本プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して得られた形質転換体を『ＫＢＫ１４ＸＫ』と名付けた。
【００１５】
【実験２】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子への変異導入＞
組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、このＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６と配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用い、ＰＣＲ変異キット（商品名『ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ』、ストラスジーン社販売）を用い、そのキットに添付されていたプロトコールに従って、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡにランダムな変異を導入した。変異処理したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩと制限酵素ＫｐｎＩとで切断した後、ランダム変異が導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って精製した。別途、ｐＫＢＫ１４ＸＫを同じ制限酵素で切断した後、約５．６ＫｂｐＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて上記の変異導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片と連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子にランダムな変異が導入された組換えプラスミドを有する組換え大腸菌ライブラリーを作製した。
【００１６】
【実験３】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼのスクリーニング＞
実験２の方法で作製した組換え大腸菌ライブラリーを用いて、１％トリプトン（バクト社製造）、０．５％酵母エキス（バクト社製造）、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩、及び１．５％寒天を含む培養プレート上で組換え大腸菌をコロニーとして分離し、この分離したコロニーのうち、１，１４０個を別々に同じ培地組成のスラント培地に移植し３７℃で２４時間培養した。培養した菌体を１白金耳採り、１．６％トリプトン、１％酵母エキス（バクト社製造）、０．５％塩化ナトリウム、及び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩からなる液体培地（５ｍｌ）が入った試験管に移植し、３７℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液の１ｍｌを、０．４ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）からなる水溶液（３ｍｌ）が入った試験管に加え、３７℃で３時間振とうし溶菌した後、７０℃で３０分間保持して熱処理した。対照として、ランダム変異が導入されていないプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを有する組換え大腸菌『ＫＢＫ１４ＸＫ』を同様に培養し処理した。得られた酵素液について、熱処理前後のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定し、熱処理後の該酵素活性が比較的に残存する酵素液を選ぶことによって、変異により耐熱化したコージビオースホスホリラーゼを産生する組換え大腸菌をスクリーニングした結果、試験した１，１４０コロニーのうち、Ｎｏ．１０−５４が高い残存酵素活性を示すことがわかった。この耐熱性コージビオースホスホリラーゼ変異組換え体を『ＫＢＫＴＳ』と名付けた。結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
なお、コージビオースホスホリラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、４０℃で３０分間放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。
【００１９】
【実験４】
＜ＤＮＡ分析＞
実験３の方法で得た組換え体ＫＢＫＴＳを常法に従い、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡを含んでおり、併記したアミノ酸配列、すなわち配列番号１に記載したアミノ酸配列をコードしていることが判明した。ランダム変異前の配列表における配列番号５に示す塩基配列と異同を調べたところ、第１，５３７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって第５１３番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ（アスパラギン酸）がＡｓｎ（アスパラギン）に置換していることがわかった。
【００２０】
【実験５】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼの産生＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験３の方法で得た組換え体ＫＢＫＴＳを接種し、２７℃で約２４時間回転振とう培養したものを種培養液とした。次に、５ｇ／ｌデキストリン、２０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌポリペプトン及び１ｇ／ｌリン酸１水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ７．０に調整し、１０ｌ容ジャーファメンターに７ｌ入れ、１２０℃で２０分間加熱処理し、冷却した後、アンピシリンナトリウム塩７００ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製し、種培養液を７０ｍｌ接種し、２７℃で約２４時間通気攪拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して湿重量約２０１ｇの菌体を回収し、それを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６７０ｍｌに懸濁し、リゾチーム２７０ｍｇを加えて３７℃で１時間静置した後、菌体破砕装置（商品名『ＵＨ−６００』、エスエムティー社製造）を用いて超音波処理して菌体を破砕した。それを６０℃で１時間熱処理し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して不溶物を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４８時間透析し、再度、遠心分離して不溶物を除去して、酵素液約７５０ｍｌを得た。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約１２．８単位の当該酵素が産生されていた。
【００２１】
第一の対照として、実験１の方法で得たアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株を、上述の場合と同一条件で、培養し、培養菌体（約２２０ｇ）から菌体破砕物の上清を採取し、透析して酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、対照の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約１４単位であり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫＴＳの場合と比較してほぼ同じ値であった。
【００２２】
第二の対照として、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ ３５０４７を特許文献１に記載の方法に準じて、温度６０℃、約４０時間嫌気培養し、培養液約４０ｌを遠心分離して採取した湿重量９２ｇの培養菌体を上述と同一の条件で処理して、酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ ３５０４７の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約０．１単位であり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫＴＳの場合と比較して約１／１０００以下の値であった。
【００２３】
【実験６】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼの性質＞
実験５の方法で得た本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照（第一）のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼを用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。即ち、温度の影響を調べる際には、活性測定方法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４乃至８のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定方法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。それらの測定結果を、図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。図中、「○」は本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼを示し、「●」は対照を示す（以下、同じ）。至適温度は、ｐＨ５．５、３０分間反応の条件で、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの場合、７０℃付近で、対照の酵素の場合、６５℃付近であった。至適ｐＨは、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照の酵素とも、５．５付近であった。酵素の温度安定性は、酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。それらの結果を、図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの温度安定性は７０℃付近までで、対照の酵素は６５℃付近までであった。ｐＨ安定性は、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照の酵素とも、約５．５乃至１０．０であった。
【００２４】
この実験５の方法で得た酵素液を、さらに特許文献１に記載の方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、得られた精製酵素を分析したところ、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの比活性は蛋白質ｍｇ当たり６５．３単位で、対照（第二）の遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイＡＴＣＣ ３５０４７由来の精製コージビオースホスホリラーゼの比活性（蛋白質ｍｇ当たり７１．４単位）と比べるとほぼ同等（約９１％）であった。また、精製された耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、上述した結果と同様に、至適温度７０℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性７０℃付近まで、及びｐＨ安定性約５．５乃至１０．０を示した。
【００２５】
【実験７】
＜コージビオース生成＞
濃度１０％β−Ｄ−グルコース−１リン酸、濃度７％Ｄ−グルコース及び１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む水溶液に、実験５の方法で得た本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり６単位加え、７０℃で２４時間反応した後、１００℃で１０分間熱処理して反応を停止した。反応液を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、その濾過液を電気透析器（商品名『ＭＩＣＲＯ ＡＣＩＬＹＥＲ Ｇ０』、旭化成株式会社製造）で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で糖組成を分析した。対照として、実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株由来のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼを用いて、同一条件で反応し分析した。ＨＰＬＣカラムはＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳカラム（三菱化学株式会社製造）を用い、カラム温度８５℃で、溶出溶媒が水で流速０．４ｍｌ／分の条件で通液し、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０２０』、東ソー株式会社製造）を用いて検出した。これらの結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】
表２の結果から明らかなように、反応温度７０℃の試験条件で本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照のコージビオースホスホリラーゼとを比較したところ、耐熱性のコージビオースホスホリラーゼの場合、生成物のコージビオースが３４．２％で、さらにそのコージビオースに転移したコージトリオースが８．５％で合計４２．７％が総生成物量であるのに対して、対照のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼの場合、生成物のコージビオースが２０．５％で、さらにそのコージビオースに転移したコージトリオースが３．０％で合計２３．５％が総生成物量と本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの約１／２であることがわかり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは高い反応温度条件でもコージビオースやコージトリオースの生成率が高いことが判明した。
【００２８】
以上の実験の結果は、本来、コージビオースホスホリラーゼを産生する微生物から該酵素遺伝子をクローン化し、それに人為的な変異を与え、ＤＮＡの塩基を置換することによって、それがコードするアミノ酸残基を置換し、適当なベクターに組換え、適当な宿主に形質転換し組換え微生物を得、その組換え微生物を培養し、酵素を生産させ採取することによって、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼを製造できることを示している。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ技術によって作製された組換え体の酵素生産性が高く、酵素製造が容易であり、高い反応温度でも失活が少ないため、コージビオースやコージトリオースなどオリゴ糖の生産に有利に利用できることを示している。
【００２９】
【発明の効果】
叙上のように本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡに変異を与え、コードするアミノ酸残基を置換し、これまで得ることができなかった耐熱性コージビオースホスホリラーゼを作製するものである。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、更に組換え微生物からの酵素生産も高い。したがって、本発明の酵素を利用すれば、コージビオースやコージトリオースなどのコージオリゴ糖を大量且つ安価に製造できることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義ある発明といえる。
【００３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性コージビオースホスホリラーゼに関し、更に詳細には、無機質のリン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す酵素コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、反応至適温度及び温度安定性が向上した耐熱性コージビオースホスホリラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】
特開平１０−３０４８８２号公報
【非特許文献１】
『酵素ハンドブック』朝倉書店（１９８２年）
【０００３】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。これらホスホリラーゼとその作用については非特許文献１にまとめられている。しかしながら、当時、コージビオースを生成しうるホスホリラーゼは学術的にも未報告で、その存在さえ知られておらず、その提供が望まれていた。
【０００４】
斯かる状況下、本発明者等は、当時、未知のコージビオースホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索し、その結果、特許文献１に明らかにされているように、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ ３５０４７）が、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見いだし、下記の理化学的性質を有することを明らかにするとともに、その製造方法を確立した。
（１） 作用
（ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する。
（ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質にグルコース基の転移を触媒する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００ダルトン
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．５
（４） 至適温度
ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近
（５） 至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近
（６） 温度安定性
ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定
（７） ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．０
さらに、本コージビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号３に記載の塩基配列にコードされており、配列表における配列番号４に記載されているアミノ酸配列を有することも見いだした。また、本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質共存下で作用させることにより得られるグルコ転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立した。
【０００５】
酵素の耐熱性は、酵素反応の利用の際、極めて重要な因子で、耐熱性の高い酵素は、少量の酵素量で長時間反応できるため、酵素反応における酵素量が低減でき、糖質の製造上、経済的に有利である。酵素はタンパク質から出来上がっており、酵素が示す諸特性はその酵素タンパク質のアミノ酸一次配列に起因しており、酵素の耐熱性も、アミノ酸一次配列やその一次配列で形成される高次構造によって生み出されることは一般的に認識されているところである。現在では、遺伝子操作技術を用いて、酵素タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列を解読することにより、一義的に酵素タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。また、遺伝子ＤＮＡの塩基配列中の塩基を他の塩基に人為的に置換し、コードされるアミノ酸残基を変え、他のアミノ酸残基に置換した変異酵素タンパク質を作製することが可能であり、いくつかの酵素タンパク質においては、人為的に遺伝子変異を与えることによって耐熱化酵素が得られている。しかしながら、コージビオースホスホリラーゼにおいては、転移糖質の生成反応に経済的に有利な耐熱性の高い酵素が望まれていたものの、その耐熱性コージビオースホスホリラーゼは実現していなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、反応至適温度及び温度安定性が向上した耐熱性コージビオースホスホリラーゼ及びその製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、先ず、サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ ３５０４７由来の、配列表における配列番号３に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡをそのアミノ酸配列を変えることなく変異させ制限酵素切断部位などを導入し、それを大腸菌での発現プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に組換え、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ高産生組換えプラスミドを作製した。次いで、得られた組換えプラスミドからコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡを取り出し、試験管内でランダムにＤＮＡ変異を与え、様々なアミノ酸置換が起こっているコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡ混合物を作製した。その変異ＤＮＡを組換えプラスミドに戻した後、大腸菌に形質転換して、変異コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ライブラリーを作製した。次に、得られた遺伝子ライブラリーから組換え大腸菌を単離し、培養し、得られた培養菌体から変異コージビオースホスホリラーゼを抽出し、その変異酵素の熱安定性を調べることによって、熱安定性が向上した変異コージビオースホスホリラーゼを産生する形質転換体をスクリーニングした。その結果、目的とする形質転換株を１株得ることができた。さらに、その形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの塩基配列を決定してコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡの変異箇所を調べたところ、該ＤＮＡは配列表における配列番号２に記載の塩基配列を有しており、ランダム変異前の配列表における配列番号５に記載の塩基配列と異同を調べたところ、第１，５３７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列の第５１３番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ（アスパラギン酸）が、配列表における配列番号２の塩基配列に併記したアミノ酸配列に見られるとおり、Ａｓｎ（アスパラギン）に置換していたことがわかった。
【０００８】
得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体を培養したところ、産生するコージビオースホスホリラーゼ活性は変異前の組換え体とほぼ同じ活性量であり、耐熱性コージビオースホスホリラーゼも大腸菌内で高発現し容易に製造できることがわかった。得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼの諸特性を調べたところ、至適ｐＨなどには変化はなく、熱安定性及び至適温度が、変異前の酵素よりも約５℃上昇して耐熱化していることがわかった。
【０００９】
得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼは高い耐熱性を有することから、該酵素を調製する工程で大腸菌由来の他の酵素タンパク質などを熱失活させる際、コージビオースホスホリラーゼ活性を失活させることなく安心して熱処理ができ、また、酵素剤の保存においても、より長期間の保存でも失活が少ない。さらに、変異のない酵素と比べ、より高い温度で反応することができ、すなわち約７５℃までで反応することができ、熱による失活が少ないため、より長時間の反応ができることから、少量の酵素量で反応ができるため、該酵素によって生成するコージオリゴ糖などの糖質製造において有利に利用できる。
【００１０】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１１】
【実験１】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドの作製＞
配列表における配列番号６に示す５０塩基の合成ＤＮＡと配列表における配列番号７に示す４２塩基の合成ＤＮＡとを常法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後、その混合液を常法に従って熱処理して両ＤＮＡをアニーリングした。予め、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＰｓｔＩとで切断したプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社販売）と、アニーリングした合成ＤＮＡとを混合した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位の間に合成ＤＮＡを挿入して新たにＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位を有するプラスミドｐＫＳＳ２を得た。
【００１２】
特許文献１に記載のコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＫＰ１を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＪ２０００（パーキン・エルマ社製造）を用いて、９５℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒と７２℃で４分３０秒のサイクルを２５回した後、７２℃で１０分間保持することで、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡを常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、予め、同じ酵素で切断したプラスミドｐＫＳＳ２と混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間にコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有し、且つ、配列表における配列番号３に記載の塩基配列において、第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧがＡＴＧに置換したコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を得た。
【００１３】
コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー４とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを得た。
【００１４】
次いで、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー８とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを得た。このようにして得られた組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有していた。配列表における配列番号３に記載の塩基配列及びアミノ酸配列と異同を調べたところ、コードするアミノ酸配列は同一で、即ち、配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列中の第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧが同じくＭｅｔをコードする塩基配列ＡＴＧに置換しており、且つ、第２６９番目のＳｅｒ（セリン）をコードする塩基配列ＴＣＡが同じくＳｅｒをコードする塩基配列ＴＣＧに置換していることによりＸｈｏＩ切断部位（ＣＴＣＧＡＧ）が導入され、第７００番目のＴｈｒ（スレオニン）をコードする塩基配列ＡＣＡが同じくＴｈｒをコードする塩基配列ＡＣＣに置換していることによりＫｐｎＩ切断部位（ＧＧＴＡＣＣ）が導入されたコージビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが判明した。本プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して得られた形質転換体を『ＫＢＫ１４ＸＫ』と名付けた。
【００１５】
【実験２】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子への変異導入＞
組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、このＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６と配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用い、ＰＣＲ変異キット（商品名『ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ』、ストラスジーン社販売）を用い、そのキットに添付されていたプロトコールに従って、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡにランダムな変異を導入した。変異処理したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩと制限酵素ＫｐｎＩとで切断した後、ランダム変異が導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って精製した。別途、ｐＫＢＫ１４ＸＫを同じ制限酵素で切断した後、約５．６ＫｂｐＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて上記の変異導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片と連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子にランダムな変異が導入された組換えプラスミドを有する組換え大腸菌ライブラリーを作製した。
【００１６】
【実験３】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼのスクリーニング＞
実験２の方法で作製した組換え大腸菌ライブラリーを用いて、１％トリプトン（バクト社製造）、０．５％酵母エキス（バクト社製造）、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩、及び１．５％寒天を含む培養プレート上で組換え大腸菌をコロニーとして分離し、この分離したコロニーのうち、１，１４０個を別々に同じ培地組成のスラント培地に移植し３７℃で２４時間培養した。培養した菌体を１白金耳採り、１．６％トリプトン、１％酵母エキス（バクト社製造）、０．５％塩化ナトリウム、及び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩からなる液体培地（５ｍｌ）が入った試験管に移植し、３７℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液の１ｍｌを、０．４ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）からなる水溶液（３ｍｌ）が入った試験管に加え、３７℃で３時間振とうし溶菌した後、７０℃で３０分間保持して熱処理した。対照として、ランダム変異が導入されていないプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを有する組換え大腸菌『ＫＢＫ１４ＸＫ』を同様に培養し処理した。得られた酵素液について、熱処理前後のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定し、熱処理後の該酵素活性が比較的に残存する酵素液を選ぶことによって、変異により耐熱化したコージビオースホスホリラーゼを産生する組換え大腸菌をスクリーニングした結果、試験した１，１４０コロニーのうち、Ｎｏ．１０−５４が高い残存酵素活性を示すことがわかった。この耐熱性コージビオースホスホリラーゼ変異組換え体を『ＫＢＫＴＳ』と名付けた。結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
なお、コージビオースホスホリラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、４０℃で３０分間放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。
【００１９】
【実験４】
＜ＤＮＡ分析＞
実験３の方法で得た組換え体ＫＢＫＴＳを常法に従い、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡを含んでおり、併記したアミノ酸配列、すなわち配列番号１に記載したアミノ酸配列をコードしていることが判明した。ランダム変異前の配列表における配列番号５に示す塩基配列と異同を調べたところ、第１，５３７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって第５１３番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ（アスパラギン酸）がＡｓｎ（アスパラギン）に置換していることがわかった。
【００２０】
【実験５】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼの産生＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験３の方法で得た組換え体ＫＢＫＴＳを接種し、２７℃で約２４時間回転振とう培養したものを種培養液とした。次に、５ｇ／ｌデキストリン、２０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌポリペプトン及び１ｇ／ｌリン酸１水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ７．０に調整し、１０ｌ容ジャーファメンターに７ｌ入れ、１２０℃で２０分間加熱処理し、冷却した後、アンピシリンナトリウム塩７００ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製し、種培養液を７０ｍｌ接種し、２７℃で約２４時間通気攪拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して湿重量約２０１ｇの菌体を回収し、それを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６７０ｍｌに懸濁し、リゾチーム２７０ｍｇを加えて３７℃で１時間静置した後、菌体破砕装置（商品名『ＵＨ−６００』、エスエムティー社製造）を用いて超音波処理して菌体を破砕した。それを６０℃で１時間熱処理し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して不溶物を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４８時間透析し、再度、遠心分離して不溶物を除去して、酵素液約７５０ｍｌを得た。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約１２．８単位の当該酵素が産生されていた。
【００２１】
第一の対照として、実験１の方法で得たアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株を、上述の場合と同一条件で、培養し、培養菌体（約２２０ｇ）から菌体破砕物の上清を採取し、透析して酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、対照の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約１４単位であり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫＴＳの場合と比較してほぼ同じ値であった。
【００２２】
第二の対照として、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ ３５０４７を特許文献１に記載の方法に準じて、温度６０℃、約４０時間嫌気培養し、培養液約４０ｌを遠心分離して採取した湿重量９２ｇの培養菌体を上述と同一の条件で処理して、酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ ３５０４７の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約０．１単位であり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫＴＳの場合と比較して約１／１０００以下の値であった。
【００２３】
【実験６】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼの性質＞
実験５の方法で得た本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照（第一）のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼを用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。即ち、温度の影響を調べる際には、活性測定方法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４乃至８のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定方法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。それらの測定結果を、図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。図中、「○」は本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼを示し、「●」は対照を示す（以下、同じ）。至適温度は、ｐＨ５．５、３０分間反応の条件で、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの場合、７０℃付近で、対照の酵素の場合、６５℃付近であった。至適ｐＨは、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照の酵素とも、５．５付近であった。酵素の温度安定性は、酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。それらの結果を、図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの温度安定性は７０℃付近までで、対照の酵素は６５℃付近までであった。ｐＨ安定性は、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照の酵素とも、約５．５乃至１０．０であった。
【００２４】
この実験５の方法で得た酵素液を、さらに特許文献１に記載の方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、得られた精製酵素を分析したところ、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの比活性は蛋白質ｍｇ当たり６５．３単位で、対照（第二）の遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイＡＴＣＣ ３５０４７由来の精製コージビオースホスホリラーゼの比活性（蛋白質ｍｇ当たり７１．４単位）と比べるとほぼ同等（約９１％）であった。また、精製された耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、上述した結果と同様に、至適温度７０℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性７０℃付近まで、及びｐＨ安定性約５．５乃至１０．０を示した。
【００２５】
【実験７】
＜コージビオース生成＞
濃度１０％β−Ｄ−グルコース−１リン酸、濃度７％Ｄ−グルコース及び１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む水溶液に、実験５の方法で得た本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり６単位加え、７０℃で２４時間反応した後、１００℃で１０分間熱処理して反応を停止した。反応液を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、その濾過液を電気透析器（商品名『ＭＩＣＲＯ ＡＣＩＬＹＥＲ Ｇ０』、旭化成株式会社製造）で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で糖組成を分析した。対照として、実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株由来のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼを用いて、同一条件で反応し分析した。ＨＰＬＣカラムはＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳカラム（三菱化学株式会社製造）を用い、カラム温度８５℃で、溶出溶媒が水で流速０．４ｍｌ／分の条件で通液し、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０２０』、東ソー株式会社製造）を用いて検出した。これらの結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
表２の結果から明らかなように、反応温度７０℃の試験条件で本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照のコージビオースホスホリラーゼとを比較したところ、耐熱性のコージビオースホスホリラーゼの場合、生成物のコージビオースが３４．２％で、さらにそのコージビオースに転移したコージトリオースが８．５％で合計４２．７％が総生成物量であるのに対して、対照のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼの場合、生成物のコージビオースが２０．５％で、さらにそのコージビオースに転移したコージトリオースが３．０％で合計２３．５％が総生成物量と本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの約１／２であることがわかり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは高い反応温度条件でもコージビオースやコージトリオースの生成率が高いことが判明した。
【００２８】
以上の実験の結果は、本来、コージビオースホスホリラーゼを産生する微生物から該酵素遺伝子をクローン化し、それに人為的な変異を与え、ＤＮＡの塩基を置換することによって、それがコードするアミノ酸残基を置換し、適当なベクターに組換え、適当な宿主に形質転換し組換え微生物を得、その組換え微生物を培養し、酵素を生産させ採取することによって、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼを製造できることを示している。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ技術によって作製された組換え体の酵素生産性が高く、酵素製造が容易であり、高い反応温度でも失活が少ないため、コージビオースやコージトリオースなどオリゴ糖の生産に有利に利用できることを示している。
【００２９】
【発明の効果】
叙上のように本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡに変異を与え、コードするアミノ酸残基を置換し、これまで得ることができなかった耐熱性コージビオースホスホリラーゼを作製するものである。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、更に組換え微生物からの酵素生産も高い。したがって、本発明の酵素を利用すれば、コージビオースやコージトリオースなどのコージオリゴ糖を大量且つ安価に製造できることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義ある発明といえる。
【００３０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
Claims (3)
- 至適温度がｐＨ５．５、３０分間反応の条件で７０℃付近で、温度安定性がｐＨ５．５、１時間保持の条件で７０℃付近まで安定な配列表における配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する耐熱性コージビオースホスホリラーゼ。
- 請求項１に記載の耐熱性コージビオースホスホリラーゼをコードする配列表における配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ。
- 請求項２に記載の耐熱性コージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体を栄養培地に培養し、培養物から産生した耐熱性コージビオースホスホリラーゼを採取することを特徴とする耐熱性コージビオースホスホリラーゼの製造方法。
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