ES2206546T3 - Proteasas v8 mutantes de staphylococcus aureus. - Google Patents

Proteasas v8 mutantes de staphylococcus aureus.

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ES2206546T3 ES96303939T ES96303939T ES2206546T3 ES 2206546 T3 ES2206546 T3 ES 2206546T3 ES 96303939 T ES96303939 T ES 96303939T ES 96303939 T ES96303939 T ES 96303939T ES 2206546 T3 ES2206546 T3 ES 2206546T3
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Masayuki Yabuta
Kazuhiro Ohsuye
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Abstract

SE OBTIENEN PROTEASAS MUTANTES CON UNO O MAS EMPLAZAMIENTOS DE MUTACION EN LA PROTEINA NATURAL DE LA PROTEASA V8 Y CON ACTIVIDADES ENZIMATICAS INCLUSO EN PRESENCIA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE UREA. SE MINIMIZA LA INACTIVACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA INCLUSO EN PRESENCIA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE UREA, PARA DE ESTA MANERA PERMITIR QUE SE AÑADAN CANTIDADES INFERIORES DE ENZIMAS A LOS SISTEMAS DE REACCION QUE CONTIENEN UREA Y ACORTAR LOS TIEMPOS DE REACCION. COMO UNA VENTAJA ADICIONAL, LA HABILIDAD PARA SEPARAR PROTEINAS EN PRESENCIA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE UREA HACE POSIBLE OBTENER HASTA AHORA FRAGMENTOS INALCANZABLES DE PEPTIDOS.

Description

Proteasas V8 mutantes de Staphylococcus aureus.
La presente divulgación se refiere a mutantes de la proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural, incluidas las que conservan actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas (a partir de aquí, se hará referencia a la proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural como "proteasa V8 natural"), a genes que codifican las proteínas enzimáticas, a vectores de expresión que contienen esos genes, a células recombinantes transformadas con dichos vectores de expresión, y a métodos para producir y utilizar las enzimas.
Las proteínas enzimáticas específicas descritas en este documento son proteasas V8 mutantes con una actividad enzimática más estable que la proteasa V8 natural conocida, incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas, tales como la presencia de desnaturalizantes de proteínas o temperatura elevada.
La proteasa V8 natural es una proteasa de serina segregada por S. aureus V8 en medio de cultivo. En 1972, G.R. Drapeau et al, la aislaron y purificaron como una proteasa de serina del medio de cultivo de S. aureus V8, que escindía específicamente un enlace peptídico C-terminal entre ácido glutámico y ácido aspártico (Jean Houmard y Gabriel R. Drapeau (1971), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3506-3509), y en 1987, Cynthia Carmona et al. informaron de una secuencia de nucleótidos de DNA que codificaba una secuencia de aminoácidos de la proteasa V8 natural (Cynthia Carmona y Gregory L. Gray (1987), Nucleic Acid Res. 15, 6757).
Después de que la enzima se exprese como un precursor, formado por 336 residuos de aminoácidos, se separa una secuencia "prepro" consistente en 68 residuos de aminoácidos y se secreta una proteína madura. La enzima tiene también una secuencia de repetición de prolina-ácido aspártico-asparagina en la región C-terminal (una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Nos. 221 a 256 del extremo N), pero los presentes inventores han descubierto ya que esta secuencia no es necesaria para la actividad enzimática (Solicitud de Patente Japonesa no. 6-296028).
Aunque la selección funcional de la proteasa V8 natural como enzima aún no está completo, la enzima se utiliza extensamente para determinar la secuencia de aminoácidos de proteínas, puesto que escinde específicamente un enlace peptídico C-terminal entre ácido glutámico y ácido aspártico. Del mismo modo, dado que la proteasa V8 natural actúa sobre su sustrato en cierta medida incluso en presencia de urea (aproximadamente urea 2M), uno de los agentes desnaturalizantes de proteínas que provoca la desnaturalización de proteínas, se le utiliza en procesos en los que una proteína fusionada insoluble, que comprende un péptido objeto expresado en una gran cantidad en un huésped por técnicas recombinantes, se solubiliza con urea, tras lo cual se deja actuar la enzima en presencia de la urea para liberar el péptido objeto de la proteína fusionada.
Los inventores de la presente invención han tenido éxito en la producción de calcitonina humana por técnicas de recombinación génica, con un elevado rendimiento, utilizando el método descrito anteriormente (Publicación de Patente Japonesa No Examinada No. 5-328992). Igualmente, en los casos en los que se expresa glucagón humano en forma de proteína fusionada en un sistema de expresión de E. coli, se utiliza la proteasa V8 natural para escindir el glucagón humano de la proteína fusionada (Kazumasa Yoshikawa et al. (1991), Journal of Protein Chemistry 11, 517-525).
Por consiguiente, la proteasa V8 natural se utiliza en una extensa gama de áreas de investigación bioquímica, así como para la producción de péptidos por recombinación génica. Debido a que la proteasa V8 natural lleva a cabo, en cierta medida, una reacción de escisión incluso en una mezcla de reacción enzimática que contiene urea (aproximadamente urea 2M), de la que se sabe que provoca la desnaturalización de proteínas, se le utiliza para la producción de péptidos útiles, etc. por métodos de recombinación.
Sin embargo, si fuere posible preparar y utilizar una proteasa V8 mutante dotada de actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan una mayor desnaturalización de proteínas, además de las propiedades de la proteasa V8 natural, se podría minimizar la pérdida de actividad enzimática bajo las citadas condiciones ambientales. El uso de una proteasa V8 mutante con dichas propiedades proporcionaría las ventajas de (1) requerir la adición de una cantidad menor de enzima al sistema de reacción en presencia de un desnaturalizante de proteínas, (2) permitir un acortamiento del tiempo de reacción, y (3) posibilitar la escisión de proteínas en presencia de altas concentraciones de desnaturalizantes de proteínas, y a temperaturas elevadas, para proporcionar fragmentos de péptidos que hasta ahora no se pueden obtener, motivos por los que una proteasa V8 mutante de este tipo sería altamente deseable en la investigación y la industria.
Un objetivo general, en este sentido, es proporcionar proteasas V8 nuevas y útiles, en especial con una actividad enzimática buena o mejorada bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas. Otros aspectos de esta divulgación se refieren a genes que codifican tales proteínas enzimáticas, a vectores de expresión que contienen dichos genes, a células recombinantes transformadas con esos vectores de expresión, y a métodos para producir y utilizar las proteínas enzimáticas.
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Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra (a) la estructura del gen de la proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural y los sitios de hibridación del gen, y (b) las secuencias de base de los cebadores de PCR usadas para la clonación.
La Fig. 2 muestra un proceso para la construcción del plasmidio pG97S4DhCT[G]R6 y del plasmidio pG97S4Dh
CT[G]R10.
La Fig. 3 muestra un procedimiento para la construcción del plasmidio pV8RT(-).
La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 3) de la proteína fusionada codificada en el plasmidio pV8RT(-). La porción subrayada es la porción de secuencia del derivado de la proteasa V8 salvaje RPT(-), y la porción con doble subrayado es la secuencia de aminoácidos del enlazador R6.
La Fig. 5 muestra (a) secuencias de nucleótidos (SEC ID Nos: 4 y 5) de los cebadores de PCR utilizados para la clonación, y (b) la estructura del plasmidio pV8RT(-) y los sitios de hibridación de los genes en el plasmidio.
La Fig. 6 ilustra la introducción de mutaciones de PCR en el plasmidio pV8RT(-).
La Fig. 7 muestra las variaciones con el paso del tiempo en la reactividad de los derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante en presencia de urea 5M.
La Fig. 8 enumera los resultados de identificación de los sitios de mutación en los derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante. El primer gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje se designa como nucleótido No. 1. El extremo N del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje se designa como aminoácido No. 1.
La Fig. 9 muestra un procedimiento para la construcción del plasmidio pV8RPT(-)158.
La Fig. 10 muestra las variaciones con el paso del tiempo en la reactividad de los derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante que tienen dobles y triples mutaciones, en presencia de urea 5M.
La Fig. 11 muestra un procedimiento para la construcción del plasmidio pV8hCT[G].
La Fig. 12 muestra un procedimiento para la construcción del plasmidio pV8D.
La Fig. 13 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 9) de la proteína fusionada codificada en el plasmidio pV8D. La porción subrayada es la porción de secuencia del derivado D de la proteasa V8 salvaje (V8D), y las porciones con doble subrayado son las secuencias de aminoácidos de los enlazadores R6. Las flechas indican los sitios de escisión de la proteasa OmpT.
La Fig. 14 muestra un procedimiento para la construcción del plasmidio pV8F. El gen V8F es el gen que codifica el derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F).
La Fig. 15 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 15) de la proteína fusionada codificada en el plasmidio pV8F. La porción subrayada es la porción de secuencia del derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F), y las porciones con doble subrayado son las secuencias de aminoácidos de los enlazadores R6. Las flechas indican los sitios de escisión de la proteasa OmpT.
La Fig. 16 muestra un procedimiento para la construcción de los plasmidios pV8D1, pV8D5 y pV8D8.
La Fig. 17 muestra las actividades residuales de los derivados D de la proteasa V8 mutante (V8D1, V8D5 y V8D8) derivados de los plasmidios pV8D1, pV8D5 y pV8D8, y de los derivados D de la proteasa V8 salvaje (V8D), derivados de pV8D, en presencia de urea 3M.
La Fig. 18 muestra un procedimiento para la construcción de los plasmidios pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8 y pV8F158.
La Fig. 19 muestra las variaciones con el paso del tiempo de la reactividad de los derivados F de la proteasa V8 mutante (V8F1, V8F5, V8F7, V8F y V8F158), derivados de los plasmidios pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8 y pV8F158, y del derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F), derivado de pV8F, en presencia de urea 5M.
La Fig. 20 muestra las estabilidades frente a SDS al 0,1% de los derivados F de la proteasa V8 mutante (V8F1, V8F5 y V8F8), derivados de los plasmidios pV8F1, pV8F5 y pV8F8, y del derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F).
La Fig. 21 muestra las estabilidades térmicas a 50ºC de los derivados F de la proteasa V8 mutante (V8F1, V8F5 y V8F8), derivados de los plasmidios pV8F1, pV8F5 y pV8F8, y del derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F).
Explicaciones adicionales
Los presentes inventores han descubierto que, mediante la inducción de mutaciones en el gen de la proteasa V8 de tipo salvaje, es posible obtener genes para derivados de la proteasa V8 mutante, cuya actividad enzimática de proteasa V8, bajo condiciones desnaturalizantes, está marcadamente mejorada. En el presente trabajo, los inventores han utilizado PCR para inducir mutaciones aleatorias en un gen de un derivado de la proteasa V8 salvaje, obtenido por PCR del gen de la proteasa V8 natural. Los genes mutantes se expresan en un huésped adecuado y se selecciona una o más proteasas V8 mutantes que exhiben una estabilidad mejorada de la actividad enzimática condiciones de desnaturalización. Se generan, a continuación, los productos de proteína adecuados codificados por los genes seleccionados, es decir, un método conveniente para la aplicación industrial.
En la presente divulgación, una "proteasa V8 mutante" hace referencia a una proteína enzimática que tiene actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de la proteasa V8 natural; un "derivado de proteasa V8 salvaje" se refiere a una proteína enzimática preparada por la deleción de una porción C-terminal de la proteasa V8 natural; y un "derivado de proteasa V8 mutante" hace referencia a una proteína enzimática preparada por la generación de una mutación en un derivado de una proteasa V8 salvaje.
Se prepararon tres derivados de proteasa V8 salvaje diferentes, con distintas secuencias de aminoácidos C-terminales, los cuales se designan como (1) derivado RPT(-) de proteasa V8 salvaje (abreviado como V8RPT(-)), (2) derivado D de proteasa V8 salvaje (abreviado con V8D), y (3) derivado F de proteasa V8 salvaje (abreviado como V8F). Igualmente, se hace referencia a los derivados de proteasa V8 mutante, preparados por la introducción de mutaciones en los derivados de la proteasa V8 salvaje, añadiendo una cifra, por ejemplo, "1", "5", "7", "8" ó "158" al final del nombre del derivado, dependiendo del tipo de mutación (por ejemplo, V8RPT(-)1, V8D5, V8F158, etc.), que indica la mutación introducida.
Las condiciones ambientales bajo las que se estimula la desnaturalización de la proteasa V8 natural son conocidas, e incluyen casos en los que la estructura de la proteína varía debido a un agente desnaturalizante de proteínas o a la temperatura, y la explicación en la presente divulgación se refiere más específicamente a los agentes desnaturalizantes de proteínas, con ejemplos particulares de proteínas enzimáticas con resistencia suficiente contra concentraciones elevadas de urea, como agente desnaturalizante de proteínas.
Como se ha mencionado anteriormente, la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de DNA de la proteasa V8 natural han sido ya descubiertas, pero no se comprende todavía del todo la estructura tridimensional de la proteína. Por lo tanto, se desconoce por completo qué aminoácidos se pueden modificar para impartir la resistencia contra concentraciones altas de urea.
En este caso, los presentes inventores han diseñado un método consistente en efectuar mutaciones aleatorias en el gen que codifica esta enzima, para aislar un gen mutante para una enzima que exhiba resistencia a la urea, incorporar el gen mutado en un plasmidio de expresión, transformar células hospedadoras con el plasmidio recombinante y expresar el gen, analizando seguidamente las enzimas de expresión recombinante que exhiben actividad enzimática incluso en presencia de urea 5M (en la cual, la proteasa V8 natural resulta inactivada). En particular, los autores llevaron a cabo la siguiente investigación con los fines de la presente invención.
En primer lugar, se construyó un plasmidio pV8RPT(-), incorporando el gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje, obtenido del gen de la proteasa V8 natural por PCR. El derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje es un derivado con una deleción de 48 aminoácidos C-terminales de la proteasa V8 natural, y el plasmidio pVRPT(-) es un plasmidio que expresa una proteína fusionada de este derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje con un derivado de \beta-galactosidasa de E. coli (\beta-gal197S4D).
A continuación, se trató el gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje, en pV8RPT(-), para crear mutaciones aleatorias por PCR, con el fin de preparar un conjunto de genes mutados de derivados RPT(-) de la proteasa V8 salvaje. El conjunto de genes mutados sustituyó al gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje en pB8RPT(-) y se utilizó para transformar E. coli JM101, obteniendo de esta forma una serie de recombinantes. Los recombinantes se cultivaron, se añadió isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranósido (en lo sucesivo, IPTG), y se expresó el gen de la proteína fusionada. Después de añadir urea al medio de cultivo hasta una concentración final de aproximadamente 5M, se utilizó un sustrato sintetizado para la enzima, Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida, para la reacción enzimática.
Como resultado de la selección, se obtuvieron aproximadamente 700 cepas recombinantes, 4 cepas recombinantes U1, U5, U7 y U8, que tenían actividad enzimática bajo las condiciones de reacción anteriormente descritas. Al comparar las actividades enzimáticas de estas cepas mutantes, en presencia de urea 5M, con la proteasa V8 natural, todas ellas demostraron disponer de una resistencia a la urea muy superior a la de la proteasa V8 natural.
Asimismo, se aislaron los plasmidios de estos recombinantes y se determinaron las secuencias de nucleótidos de DNA de los genes del derivado RPT(-) de la proteasa V8 mutante, encontrándose, como consecuencia de ello, mutaciones de sustitución de lisina por arginina en la posición de aminoácido 147 en la cepa U1, de asparagina por serina en la posición de aminoácido 71 en la cepa U5, de asparagina por serina en la posición de aminoácido 71 y lisina por arginina en la posición de aminoácido 147 en la cepa U7, y de ácido aspártico por ácido glutámico en la posición de aminoácido 44 en la cepa U8. En otras palabras, resultó evidente que se habían obtenido tres tipos diferentes de sustituciones de aminoácidos y que el gen derivado de la cepa U7 era un doble mutante con una combinación de las sustituciones de aminoácidos de las cepas U1 y U5.
Los presentes inventores han demostrado, por primera vez, que las mutaciones de aminoácidos en estas posiciones particulares permiten que un derivado RPT(-) de la proteasa V8 de tipo salvaje exhiba resistencia a la urea. Estas posiciones de aminoácidos se supone que son importantes desde el punto de vista de conservar la estructura proteica de la proteasa V8. Por lo tanto, la introducción de otros aminoácidos en estas posiciones altera la estructura de proteína de la enzima de la presente invención, incrementando, de esta forma, adecuadamente la resistencia a la urea.
Dado que la proteína de la cepa U7 con doble mutación mostró la máxima resistencia a la urea de los derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante obtenidos, los presentes inventores consideraron que si se combinaban los 3 tipos anteriormente mencionados de mutaciones y se las introducía en el gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje, podría aumentarse adicionalmente la resistencia a la urea exhibida por cada derivado RPT(-) individual de la proteasa V8 mutante, por lo que se preparó un gen de derivado RPT(-) de proteasa V8 mutante con una triple mutación, expresándose su proteína fusionada, en la que se estudió sus resistencia a la urea. Como resultado, el derivado RPT(-) de la proteasa V8 mutante con una triple mutación exhibió claramente una mayor resistencia a la urea que cualquier derivado RPT(-) individual de la proteasa V8 mutante.
Los presentes inventores han investigado, a continuación, la producción de este derivado de la proteasa V8 mutante. La producción se intentó por un método en el que el derivado D o F de la proteasa V8 mutante, cada uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos C-terminales diferentes de la del derivado RPT(-) de la proteasa V8 mutante, se expresó inicialmente como un cuerpo de inclusión inactivo, obteniéndose luego el derivado D o F activo de la proteasa V8 mutante. La razón de este proceder fue la baja cantidad de expresión con el derivado RPT(-) de la proteasa V8 mutante, que resulta inconveniente desde el punto de vista de la producción. Los derivados D y F de la proteasa V8 salvaje usados para la preparación de los derivados D y F de la proteasa V8 mutante, son derivados que carecen, respectivamente, de 56 y 53 aminoácidos del extremo C de la proteasa V8 natural.
Se incorporó el gen del derivado de la proteasa V8 mutante en plasmidios pV8D y pV8F, usados para expresar el derivado D de la proteasa V8 salvaje y el derivado F de la proteasa V8 salvaje y, después de cultivar, se recuperó una proteína fusionada insoluble consistente en el derivado de la \beta-galactosidasa de E. coli, el derivado D o F de la proteasa V8 mutante y un derivado de aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (tAPT); la proteína se escindió con la ompT-proteasa de E. coli en presencia de urea y se extrajo el derivado D o F de la proteasa V8 mutante de la proteína fusionada. A continuación, el derivado D o F de la proteasa V8 mutante se purificó a través de una etapa de replegamiento y una fase de cromatografía de purificación, que muestra que la producción fue posible a escala industrial.
Seguidamente, cada derivado D o F purificado de la proteasa V8 mutante se utilizó en un ensayo de comparación con sus formas salvajes, bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas de cada tipo, por ejemplo, en presencia de urea, en presencia de SDS y a temperatura alta. Como resultado, los mutantes mostraron índices más bajos de inactivación en presencia de urea o SDS, en comparación con las formas salvajes, lo que demuestra claramente la existencia de resistencia contra estos agentes desnaturalizantes.
Puesto que el derivado F de la proteasa V8 mutante con la triple mutación, es decir, V8F158, tuvo una actividad enzimática más estable que la proteasa V8 natural, incluso en presencia de urea 5M, se llevó a cabo un ensayo de escisión usando una proteína fusionada de esta proteína mutante. La proteína fusionada utilizada fue \beta-gal97S4DhCNP-22R5-3, que posee una estructura en la que están fusionados el péptido protector (\beta-gal97S4D) y un péptido natriurético auricular de tipo C humano (CNP-22) a través de un péptido de enlace, y la proteasa V8 libera CNP.
Como resultado del estudio de la eficacia de escisión de V8F158 y la proteasa V8 natural en la proteína fusionada del péptido natriurético auricular de tipo C humano en presencia de urea 5M, se demostró de forma concluyente que V8F158 fue capaz de escindir la proteína fusionada con una eficacia de escisión mucho mayor.
A partir de los ejemplos llevados a cabo por los presentes inventores, resulta evidente que los derivados de la proteasa V8 mutante (V8F1, V8F5 y V8F8) muestran una mayor resistencia contra los desnaturalizantes con reacción enzimática en presencia de una concentración de urea de 5M y SDS al 0,1%, que los derivados F de la proteasa V8 salvaje. Sin embargo, al comparar las reacciones enzimáticas a temperaturas elevadas (50ºC), el derivado F de la proteasa V8 mutante (V8F8) tuvo menor estabilidad térmica que el derivado F de la proteasa V8 salvaje.
Se han obtenido diferentes resultados para la resistencia de las enzimas bajo condiciones de desnaturalización, dependiendo de las diferentes condiciones de desnaturalización de proteínas de la urea y temperatura, y los resultados se pueden interpretar como una indicación adicional de que los residuos de aminoácidos de los sitios mutados son importantes para conservar la estructura superior de las proteínas. De este modo, puesto que un experto en la técnica puede inferir fácilmente que la resistencia contra la temperatura aumentará si se sustituye el aminoácido en el sitio de mutación del derivado F8 de la proteasa V8 mutante (V8F8) con otro aminoácido, la utilidad de la presente invención no disminuye de forma alguna.
Los presentes inventores han demostrado la utilidad de los derivados de la proteasa V8 mutante comparando las actividades enzimáticas de derivados de la proteasa V8 mutante, derivados de la proteasa V8 salvaje y la proteasa V8 natural bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas. A partir de los resultados obtenidos por los presentes inventores, resulta sencillo para un experto en la técnica inferir que la introducción de estos mutantes en la proteasa V8 natural dará como resultado una actividad enzimática igual o superior a la de la forma natural, incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas.
En consecuencia, las proteínas enzimáticas de la presente invención son proteasas V8 mutantes que exhiben actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas. Estas proteasas se caracterizan por tener uno o más sitios de mutación en la proteasa V8 natural.
Más específicamente, las proteasas de la presente invención se distinguen porque los sitios de mutación son el ácido aspártico en posición 44, la asparagina en posición 77 y/o la lisina en posición 147 desde el extremo N de la proteasa V8 natural, en cuyo caso puede haber uno, dos o tres sitios de mutación.
Las realizaciones más preferidas son:
(1) un caso de un sitio de mutación en el cual, contando desde el extremo N de la proteasa V8 natural, el sitio de mutación es una sustitución de ácido aspártico por ácido glutámico en posición 44, una sustitución de asparagina por serina en la posición 71, o una sustitución de lisina por arginina en posición 147;
(2) un caso de dos sitios de mutación, contando desde el extremo N de la proteasa V8 natural, los sitios de mutación son ácido aspártico en la posición 44 y asparagina en posición 71 (en cuyo caso, el ácido glutámico sustituye al ácido aspártico en la posición 44 y asparagina a serina en la posición 71), ácido aspártico en la posición 44 y lisina en la posición 147 (en cuyo caso, el ácido aspártico es sustituido preferentemente por ácido glutámico en la posición 44 y lisina por arginina en posición 147), o asparagina en la posición 71 y lisina en la posición 147 (en cuyo caso, asparagina es preferentemente sustituida por serina en posición 71 y lisina por arginina en la posición 147); y
(3) un caso de tres mutaciones, en el cual, contando desde la extremo N de la proteasa V8 natural, los sitios de mutación son ácido aspártico en posición 44, asparagina en posición 71 y lisina en posición 147 (en cuyo caso, el ácido aspártico está preferentemente sustituido por ácido glutámico en posición 44, asparagina por serina en posición 71 y lisina por arginina en posición 147).
El método para preparar los genes que codifican estas proteasas V8 mutantes puede ser un método de aislamiento de los genes desde S. aureus, por ejemplo, un método para diseñar un cebador a partir de la secuencia de genes de la proteasa V8 natural reportada, seguido por aislarlos del banco de genes de S. aureus, o el método de PCR utilizado por los presentes inventores. No es necesario mencionar que también es posible sintetizar químicamente los genes a partir de una secuencia génica de proteasa V8 natural de S. aureus.
En la presente divulgación, los genes de los derivados de la proteasa V8 mutante se prepararon por el método de PCR, pero los genes mutantes se pueden preparar utilizando cualquier otro método de mutación convencionalmente conocido, tal como un método in vivo (tratamiento con agentes mutágenos, tratamiento con luz ultravioleta o radiación, etc.), o alguno de los diversos métodos in vivo. Asimismo, se pueden seleccionar cepas mutantes de acuerdo con la presente invención por el método de selección de mutaciones espontáneas.
En cuanto a las condiciones de reacción enzimática que estimulan la desnaturalización de proteínas, la reacción enzimática se puede llevar a cabo en un medio de reacción que contiene urea o SDS, o a temperatura elevada (por ejemplo, 45ºC o superior), o con otros agentes desnaturalizantes de proteínas tales como hidrocloruro de guanidina y diversos tensioactivos. Las condiciones de reacción enzimática que poseen un efecto desnaturalizante de proteínas incluyen urea 2 a 5M, hidrocloruro de guanidina 0,01 a 6M, SDS al 0,01 a 10% y temperaturas de 45 a 65ºC.
Se pueden utilizar los siguientes métodos para expresar los genes de las proteasas V8 mutantes según la invención, que poseen actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas. En los Ejemplos de la presente divulgación, se utilizaron células de E. coli como células hospedadoras, si bien las células hospedadoras pueden ser también células procariotas tales como estafilococos, Salmonella, actinomicetos, Bacillus subtilis, etc., o células eucariotas tales como bacterias filamentosas, levaduras, células de insectos, células animales o similares. Los genes de la proteasa V8 mutante se pueden introducir en estas células hospedadoras por cualquier técnica de transformación habitualmente utilizada.
El plasmidio de expresión empleado para la transformación es, preferentemente, un plasmidio de expresión con un promotor capaz de controlar funcionalmente la expresión de un gen aguas abajo del promotor en las células hospedadoras, y mediante el cual se pueda llevar a cabo el método de expresión directa o el llamado método de expresión de la proteína de fusión. Asimismo, el vector utilizado puede ser uno capaz de producir una recombinación homóloga de genes, incorporando el gen de interés en el cromosoma de una célula hospedadora adecuada para expresar la proteína relativa. Mediante otro método, se puede utilizar un virus o un fago que incorpore el gen para infectar células hospedadoras para la expresión del gen de interés.
Como método para producir una proteasa V8 mutante según la invención, dotada de actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas, los presentes inventores han presentado en los Ejemplos un método de producción altamente eficaz, aun cuando se puede utilizar cualquier técnica de recombinación génica habitual conocida para la producción, sin limitarse al método descrito en este documento.
Ejemplos de posibles métodos de producción que emplean el método de expresión descrito anteriormente incluyen
(1) un método de producción por expresión directa de la proteína madura de interés en las células hospedadoras, seguido de la separación y purificación de la proteína en forma soluble o insoluble;
(2) un método de producción por expresión de la proteína de interés en las células hospedadoras como proteína fusionada, en forma soluble o insoluble, escisión de la proteína fusionada bajo condiciones que permiten la escisión por una enzima de procesamiento, seguido de separación y purificación de la proteína de interés;
(3) un método de producción por secreción extracelular de la proteína de interés, seguido de la separación y purificación de la proteína, y
(4) un método de producción por separación y purificación de la proteína de interés, en forma soluble o insoluble, a partir del periplasma de las células hospedadoras. No es necesario mencionar que cuando la proteína de interés se expresa por el método de expresión directa o de la proteína fusionada, la separación y purificación se logran a través de una etapa de replegamiento adecuada en los casos en los que haya obtenido una proteína insoluble.
En los Ejemplos de la presente divulgación, se utiliza cromatografía hidrófoba después del replegamiento para la purificación de los derivados de la proteasa V8 mutante de la invención, pero otros métodos de purificación normalmente utilizados para la purificación de proteínas, tales como filtración sobre gel, cromatografía iónica, etc., pueden proporcionar elevados grados de pureza. Del mismo modo, dado que la proteína enzimática se activa una vez que se ha completado la reacción de replegamiento y descompone cualquier proteína contaminante, dando como resultado el derivado de la proteasa V8 mutante como principal componente proteico tras finalizar la reacción, la purificación se alcanza, por supuesto, de forma muy sencilla.
Ejemplos
La presente invención se explicará ahora con más detalle mediante los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1 Aislamiento del gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje
El gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje se aisló por el método de PCR. Se diseñaron dos diferentes cebadores de PCR con las secuencias (SEC ID Nos: 1 y 2) que se muestran en la Fig. 1(b), que se sintetizaron con un sintetizador de DNA (Modelo 392, producto de Applied Biosystems Co.). Los cebadores A y B corresponden a las regiones del gen de la proteasa V8 que se muestran en la Fig. 1(a), y contienen secuencias de sus extremos 5', reconocidos por las endonucleasas de restricción XhoI y SalI, respectivamente.
La PCR se llevó a cabo utilizando cromosomas de S. aureus V8 (ATCC 27733), aislados y preparados de acuerdo con el método de Jayaswal, R.K. et al. (J. Bacteriol. 172:5783-5788 (1990)) y estos cebadores de PCR. A 50 \mul de una reacción de solución que contenía 1,0 \muM de cebador, 1 \mug de DNA cromosómico, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01% y 200 \muM de dNTP (mezcla de dATP, dGTP, dCTP y dTTP), se añadieron 2,5 unidades de TaqDNA-polimerasa, y la PCR se llevó a cabo con 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 2 minutos y 55ºC durante 2 minutos. Como resultado, se obtuvo el gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje, exento de la secuencia "prepro" y 48 aminoácidos C-terminales.
A continuación, el gen se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa y su purificó usando SUPERP.-2 (Takara Shuzo, KK.), escindiéndolo luego con las enzimas de restricción XhoI y SalI, para preparar un fragmento del gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje que contenía los extremos cohesivos XhoI y SalI.
Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión pV8RPT(-) y expresión del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje
El pG97S4DhCT[G]R6 utilizado en este Ejemplo (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42, 703-708) es un plasmidio con una elevada expresión de una proteína fusionada de un derivado de \beta-galactosidasa de E. coli con precursor de calcitonina humana (hCT[G]), y este plasmidio se construyó a partir del plasmidio pBR322 y el plasmidio pG97S4DhCT[G] (Fig. 2).
La cepa W3110 de E. coli, que contiene el plasmidio pGT97S4DhCT[G], se depositó en el Instituto Nacional de Biociencias y Agencia de Tecnología Humana de Ciencia y Tecnología Industriales 1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305, Japón, el 8 de agosto de 1991 como Escherichia coli SBM323, de acuerdo con el tratado de Budapest, asignándosele el Número de Depósito FERM BP-3503.
Con el fin de expresar el gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje, obtenido por PCR, se trató el plasmidio pG97S4DhCT[G]R6 con XhoI y SalI, y se preparó un fragmento de DNA (3,1 kb) exento del gen precursor de la calcitonina humana por electroforesis sobre gel de agarosa. Este fragmento de DNA se enlazó con el fragmento del gen del derivado de la proteasa V8 salvaje anteriormente obtenido, que contiene los extremos cohesivos XhoI y SalI, utilizando T4-DNA-ligasa, y se transformó JM101 (esta cepa está disponible en Takara Shuzo, KK. y otros sitios) con el mismo para construir pV8RPT(-) (Fig. 3). La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 3) para esta proteína fusionada (\betaG97V8RPT(-)) del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje y el derivado de \beta-galactosidasa, expresada en el plasmidio.
Después del cultivo de JM101/pV8RPT(-) en 100 ml de medio LB (extracto de levadura al 0,5%, triptona al 1,0%, NaCl al 0,5%) a 37ºC hasta una DO660 de 1,0, se añadió IPTG hasta una concentración final de 2 mM para inducir la expresión. El cultivo se prosiguió durante 2 horas después de la adición y, entonces, se recogieron las células por centrifugación y se suspendieron en un tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM), hasta una DO660 de 5. La suspensión se descompuso con un disruptor de ultrasonido (Cellruptor: Toso Electric, KK.) y se separó la fracción insoluble por centrifugación durante 5 minutos, utilizando la fracción sobrenadante como solución enzimática bruta.
Se utilizó un sustrato sintético (Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida; producto de Boehringer-Mannheim) para medir la actividad de la proteasa V8. Después de mezclar 20 \mul de una solución de Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida 10 mM (solución DMSO) con 940 \mul de un tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), se añadieron 40 \mul de la solución enzimática bruta, y se midió el incremento de absorbancia a 405 nm tras la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos. Para la medición se utilizó un espectrofotómetro Hitachi Modelo U-3200.
Como resultado, se detectó una actividad correspondiente a 8 \mug/ml de proteasa V8 natural en la solución enzimática bruta preparada a partir de JM101/pV8RPT(-), lo que demuestra que la actividad se exhibe en forma de una proteína fusionada con el derivado de \beta-galactosidasa y exenta de la secuencia "prepro" y la secuencia de repetición C-terminal.
Ejemplo 3 Mutación del gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 por PCR
El gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje se sometió a mutación por PCR para obtener proteasas V8 resistentes a la urea. El pV8RPT(-) obtenido en el Ejemplo 2 (Fig. 3) es un plasmidio que expresa una proteína fusionada del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje exento de 48 aminoácidos en el extremo C (V8RPT(-)) con un derivado de \beta-galactosidasa de E. coli (\beta-gal97S4D), y la proteína fusionada se expresa en la fracción celular soluble (esta proteína fusionada se designará en lo sucesivo \betaG97V8RPT(-)) tiene actividad de proteasa V8.
Los cebadores que se muestran en la Fig. 5(a) (SEC ID Nos: 4 y 5) se utilizaron para una reacción de PCR con el gen de \betaG97V8RPT(-) en el plasmidio anteriormente mencionado (Fig. 5(b)). A 50 \mul de una solución de reacción que contiene 1 \mumol de cebador, 50 ng de pV(RPT(-(, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%, dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% y sendos 1 mM de dGTP, dCTP y dTTP y 200 \muM de dATP, se añadieron 2,5 unidades de Taq-DNA-polimerasa, llevándose a cabo la PCR con 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 2 minutos y 55ºC durante 2 minutos. El producto de PCR resultante (1 Kpb) se sometió a tratamiento con cloroformo y precipitación con etanol y, a continuación, se disolvió en 50 \mul de un tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM).
Ejemplo 4 Selección de derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante con resistencia a la urea (selección primaria)
El producto de PCR obtenido en el Ejemplo 3 se escindió con las enzimas de restricción BglII y SalI y se aisló el fragmento de 0,8 Kpb que contenía el gen del derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje mutada por electroforesis sobre gel de agarosa al 0,8%, tras lo cual se utilizó un kit de ligadura (producto de Takara Shuzo, KK.) para enlazarlo con el fragmento BglII-SalI derivado de un pV8RPT(-) de 3,0 Kpb (Fig. 6). Después de finalizar la reacción, se le utilizó para transformar E. coli JM101 (disponible en Vitrogen, Nº de Catálogo c660-00) por el método del cloruro de calcio, y se obtuvieron transformantes en un medio LB-agar que contenía tetraciclina (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%, agar al 1,5%). La reacción con enzimas de restricción, la electroforesis sobre gel de agarosa y la transformación se llevaron a cabo de acuerdo con métodos convencionales.
A continuación, se preparó un medio (pH 7,4) que contenía 5 mg/ml de glicerina, 6 mg/ml de Na_{2}HPO_{4}, 3 mg/ml de KH_{2}PO_{4}, 0,5 mg/ml de NaCl, 1,0 mg/ml de NH_{4}Cl, MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O 2 mM, CaCl_{2} 0,1 mM, 40 \mug/ml de cada aminoácido (20 tipos), 1 \mug/ml de cloruro de tiamina y 5 \mug/ml de tetraciclina, dispensando 50 \mul del mismo a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (producto nº 25860 de Corning Co.). Cada una de las cepas transformantes obtenidas anteriormente se sembró en el medio y se cultivó a 37ºC. Después de una noche de cultivo estático, se dispensaron 50 \mul de medio fresco de la misma composición a cada pocillo y se prosiguió el cultivo estático durante 3 horas a 37ºC. Seguidamente, se añadió una porción de 10 \mul de IPTG 50 mM para inducir la expresión del gen a 37ºC durante una hora.
A continuación, se añadieron 30 \mul de una solución de 10 mg/ml de lisozima acuosa y, después de dejar reposar durante 10 minutos, se añadieron 30 \mul de una solución que contenía triton X-100 al 0,1% y EDTA 5 mM (pH 8,0) para provocar la bacteriólisis.
Después de añadir seguidamente 160 \mul de Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) que contenía urea 10M (hasta una concentración final de urea de 4,85 M) y dejar reposar la mezcla a 30ºC durante 30 minutos, se añadieron 10 \mul de una solución de DMSO que contenía Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida 20 mM (producto de Boehringer-Mannheim Co.) para una reacción durante la noche a 30ºC.
Después de analizar alrededor de 700 transformantes, se obtuvieron 4 cepas con el grado máximo de coloración amarilla producida por la descomposición del sustrato enzimático Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida, asignándoles los nombres U1, U5, U7 y U8.
Ejemplo 5 Selección de derivados RPT(-) de proteasa V8 mutante con resistencia a la urea (selección secundaria)
Después de cultivar las cuatro cepas (U1, U5, U7 y U8) en 10 ml de medio LB (extracto de levadura al 0,5%, triptona al 1,0%, NaCl al 0,5%) a 37ºC hasta una DO660 de 1,0, se añadió IPTG hasta una concentración final de 2 mM, y el cultivo se continuó durante 2 horas, tras las cuales las células se recogieron por separación de centrifugación.
A continuación, las células se suspendieron en tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) hasta una DO660 de 5 y las células se descompusieron con un disruptor de ultrasonidos (Cellruptor: Toso Electric, KK.). La solución degradada se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 minutos para separar la fracción insoluble, y se utilizó la fracción sobrenadante como solución enzimática bruta.
Para la medición de la actividad de proteasa, se mezclaron 20 \mul de una solución de Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida 20 mM con 940 \mul de una solución tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), se añadieron 40 \mul de la solución enzimática bruta y se midió el incremento de absorción a 405 nm tras la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos, utilizando un espectrofotómetro Hitachi Modelo U-3200. Después de medir la actividad de proteasa V8 de las soluciones enzimáticas brutas de las 4 cepas, se utilizó una cantidad de cada solución enzimática bruta correspondiente a 0,2 \mug de actividad enzimática de proteasa V8 natural (por ejemplo, endoproteinasa Glu-C, producto de Boehringer-Mannheim Co.) para determinar la variación de reactividad en el transcurso del tiempo en presencia de urea. El experimento se llevó a cabo con una solución de reacción que contenía urea 5M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida 0,4 mM y DMSO al 2%, y se medió la variación de la reacción con el tiempo, basada en el incremento de absorbancia a 405 nm (utilizando un espectrómetro Hitachi Modelo U-3200). Los resultados se muestran en la Fig. 7.
Como muestra claramente la Fig. 7, las proteínas fusionadas de los derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante, producidos por las cepas mutantes U1, U5, U7 y U8 (en lo sucesivo, denominados, respectivamente, \betaG97V8RPT(-)1, \betaG97V8RPT(-)5, \betaG97V8RPT(-)7 y \betaG97V8RPT(-)8) conservaron la actividad de descomposición sobre el sustrato, exhibiendo resistencia contra la urea, en contraste con la forma salvaje \betaG97V8RPT(-).
Ejemplo 6 Identificación de los sitios de mutación y preparación de la proteína fusionada de derivado RPT(-) de proteasa V8 mutante con mutaciones combinadas
Los plasmidios se aislaron y purificaron a partir de las cepas mutantes U1, U5, U7 y U8 por métodos convencionales. Estos plasmidios se designan en lo sucesivo pV8RPT(-)1, pV8RPT(-)5, pV8RPT(-)7 y pV8RPT(-)8.
A continuación, se determinaron las secuencias de nucleótidos de DNA de los genes de derivados de la proteasa V8 mutante en cada uno de los plasmidios usando un secuenciador de DNA (A.L.F. DNA Sequencer), fabricado por Pharmacia. La determinación de las secuencias de nucleótidos de DNA se efectuó por le método de la marca fluorescente empleando fluoro-dUTP y usando un AutoRead Sequencing Kit, también fabricado por Pharmacia, y se usaron los siguientes cebadores.
Cebador A (un cebador de sentido que se hibrida con una porción de los nucleótidos Nos. 1 a 22, siendo el nucleótido nº 1 la primera base del gen que codifica el derivado RPT(-) de la proteasa V8 salvaje que se muestra en la Fig. 4);
5'-ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT-3' (SEC ID NO: 6);
Cebador D1 (un cebador de sentido que se hibrida con una porción de los nucleótidos Nos. 266 a 294 del mismo);
5'-CAGGCGAAGGAGCGCTAGCAATAGTTAAA-3' (SEC ID NO: 7);
Cebador D2 (un cebador antisentido que se hibrida con una porción de los nucleótidos Nos. 266 a 294 del mismo);
5'-TTTAACTATTGCTAGCGCTCCTTCGCCTG-3' (SEC ID NO: 8)
Se actuó de acuerdo con el procedimiento de secuenciación de DNA descrito en el manual de laboratorio del fabricante. Como resultado, se demostró que las mutaciones que se muestran en la Fig. 8 se habían producido en los derivados RPT(-) de la proteasa V8 mutante por las 4 cepas mutantes. En particular, el derivado de la proteasa V8 mutante en pV8RPT(-)7 fue una doble mutación, que demostró ser una combinación de las mutaciones de pV8RPT(-)1 y pV8RPT(-)5. De este modo, se concluyó que la mutación doble fue la razón de la mayor actividad de \betaG97V8RPT
\hbox{(-)7}
que se muestra en la Fig. 7, comparada con \betaG97V8RPT(-)1 y \betaG97V8RPT(-)5. Se demuestra así la posibilidad de crear una enzima altamente resistente a la urea mediante la combinación de las mutaciones.
Para confirma este aspecto, se construyó el plasmidio pV8RPT(-)158, que tiene todas las mutaciones obtenidas. Se utilizaron los sitios de enzimas de restricción (DraI, EcoRI) presentes en el gen de la proteasa V8 para la construcción, de acuerdo con el procedimiento descrito en la Fig. 9. El fragmento DraI-EcoRI de 0,4 Kpb de pV8RPT(-)7 se intercambió por el de pV8RPT(-)8 para construir pV8RPT(-)158.
En el derivado RPT(-) de la proteasa V8 triple mutante, procedente de este plasmidio (\betaG97V8RPT(-)158), se estudiaron las variaciones de reactividad con el paso del tiempo en presencia de urea 5M, de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito (véase la Fig. 10). Como resultado, se demostró que \betaG97V8RPT(-)158 tiene una reacción de descomposición más prolongada sobre el sustrato sintético que \betaG97V8RPT(-)7, por lo que se comprendió que las 3 mutaciones imparten resistencia a la urea de forma acumulativa.
Ejemplo 7 Construcción del vector de expresión pV8D
Se construyó un plasmidio pV8D que expresa el derivado D de la proteasa V8 salvaje (V8D) en forma de un cuerpo de inclusión inactivo de acuerdo con el procedimiento descrito en las Figs. 11 y 12. En primer lugar, se prepararon un fragmento BglII-SalI (3,0 kb) y un fragmento EcoRV-BglII (0,7 kb) a partir de pV8RPT(-) y se enlazaron con un fragmento NarI-SalI (0,2 kb), preparado a partir de pG97S4DhCT[G]10, para obtener pV8hCT[G] (Fig. 11). El plasmidio pG97S4DhCT[G]R10 (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995) 42, 703-708) se puede construir a partir del plasmidio pBR322 y del plasmidio pG97S4DhCT[G] de la misma forma que pG97S4DhCT[G]R6 en el Ejemplo 2.
A continuación, se sustituyó la porción hCT[G] del pV8hCT[G] obtenido (el fragmento de 0,1 kb BstE-SalI) por un fragmento SmaI-SalI de 0,8 kb, que contiene la región del gen aminoglucósido 3'-fosfotranferasa (APT) de pUC4K (Vieira, J. y Messing, J., Gene 19, 259 (1982); fácilmente disponible como Producto nº 27-4958-01 de Pharmacia Biotech), para construir pV8D (Fig. 12). La Fig. 13 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 9) de la proteína fusionada del derivado D de la proteasa V8 salvaje (V8D) expresada por este plasmidio. El derivado D de la proteasa V8 salvaje es un derivado que carece de 56 de los aminoácidos C-terminales de la proteasa natural.
La proteína fusionada se preparó utilizando la porción de proteasa V8 natural hasta el aminoácido nº 212 del extremo N (sitio EcoRV). Es decir, la proteína fusionada tiene una estructura en la que el derivado de \beta-galactosidasa y parte de la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (tAPT) están fusionados en las porciones N-terminal y C-terminal del derivado D de la proteasa V8 salvaje (V8D), respectivamente, a través de enlazadores R6.
El enlazador R6 posee la secuencia de aminoácidos:
Arg Leu Tyr Arg Arg His His Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser Pro Leu Arg Ala His Glu Gln Phe Leu Glu (SEC ID NO: 10)
y tiene una estructura en la que el enlace peptídico entre RR en la secuencia está escindido por la ompT-proteasa de E. coli.
Ejemplo 8 Construcción del vector de expresión pV8F
El plasmidio pV8F, que expresa el derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F) como un cuerpo de inclusión inactivo, es un plasmidio que expresa una proteína fusionada que es un derivado del derivado D de la proteasa V8 salvaje (V8D) anteriormente mencionado, que tiene una porción de proteasa V8 3 aminoácidos más larga en el extremo C-terminal, y se construyó de la forma siguiente por el método de PCR y clonación de genes.
En primer lugar, se sintetizaron el cebador IV (SEC ID NO: 11):
5'-ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT-3'
\hskip1.3cm
Xho I
y el cebador V (SEC ID NO: 12)
5'-GACTTATTGGTCATCGAGCTCAAAATGGATATC-3'
\hskip3.8cm
Sac I
y se utilizaron 0,1 \mug de pV8RPT(-) construido en el Ejemplo 2 como DNA modelo para una reacción de amplificación en el extremo del gen del derivado de la proteasa V8 salvaje, tras lo cual se escindió con EcoRI y SacI para preparar un fragmento de gen de 0,1 kb.
Mientras tanto, se sintetizaron también el cebador VI (SEC ID NO: 13)
5'-AATATTGAAGAGCTCCGCTATATCGCCGACAT-3'
\hskip1cm
Sac I
y el cebador VII (SEC ID NO: 14):
5'-GAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTT-3'
\hskip3.5cm
EcoT221
y se utilizó 0,1 \mug de pV8D modo DNA modelo para una reacción de amplificación de la secuencia del enlazador R6 y la porción del gen de aminoglucósido 3'-fosfotransferasa, tras lo cual se escindió en EcoT221 y SacI para preparar un fragmento génico de 0,3 kb. La PCR se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que en el Ejemplo 1.
Los fragmentos de genes de 0,1 kb y 0,3 kb obtenidos de la forma anteriormente descrita se enlazaron con un fragmento EcoRI-EcoT221 (4,2 kb) procedente de pV8D para construir pV8F (Fig. 14). La Fig. 15 muestra una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 15) de la proteína fusionada del derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F), expresada por este plasmidio. El derivado F de la proteasa V8 salvaje es un derivado que carece de 53 aminoácidos C-terminales de la proteasa natural.
Ejemplo 9 Producción de derivados D (V8D) y F (V8F) de la proteasa V8 mutante y confirmación de la resistencia a la urea
Se utilizaron los plasmidios pV8D y pV8F para intentar una alta expresión de los derivados D (V8D) y F (V8F) de la proteasa V8 mutante.
(1) Derivado D de la proteasa V8 mutante
Como se muestra en la Fig. 16, los fragmentos de 0,7 kpb BgIII-EcoRI, derivados de pV8RPT(-)1, pVRPT(-)5 y pVRPT(-)8 se insertaron en el fragmento de 3,9 kpb BgIII-EcoRI para construir pV8D1, pV8D5 y pV8D8.
Después de cultivar JM101 que tienen cada uno de los plasmidios en un fermentador (30L Kit Fermenter, producto de Komatsugawa Chemical Instruments), en un medio (20 l, pH 7,0) que contenía 4 g/l de K_{2}HPO_{4}, 4 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2,7 g/l de Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g/l de NH_{4}Cl, 1,2 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 4 g/l de extracto de levadura, 2 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 40 mg/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 40 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10 mg/l de MnSO_{4}\cdotnH_{2}O, 10 mg/l de AlCl_{3}\cdot6H_{2}O, 4 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 2 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 1 mg/l de CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,5 mg/l de H_{3}BO_{4} y 10 mg/l de tetraciclina, a 37ºC hasta una DO660 de 10, añadiendo sucesivamente glicerina, se agregó IPTG hasta una concentración final de 2 mM y el cultivo se prosiguió durante 3 horas.
El caldo de medio de cultivo obtenido se sometió a homogeneización con un homogeneizador MantonGaullin (Modelo 15M-8TBA, de MantonGaullin Co.) bajo condiciones de 600 kg/cm^{2} y la fracción precipitante se recuperó por centrifugación a 7000 rpm durante 30 minutos. Después de añadir agua desionizada hasta una DO660 del precipitado de 100, se tomaron 15 ml del mismo y se añadieron 2,5 ml de Tris-HCl 1M (pH 8,0), 250 \mul de ditiotreitol 1M (DTT) y 12 g de urea para disolver los cuerpos de inclusión, tras lo cual se añadió agua desionizada para preparar 50 ml y la solución se incubó a 37ºC durante 6 horas.
Después de una subsiguiente dilución de 21 veces con tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,5), que contenía (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,4M, se dejó reposar la solución sobre hielo durante la noche. Este procedimiento de replegamiento proporcionó aproximadamente 80 \mug/ml de cada uno de los derivados D de la proteasa V8 mutante, es decir, los derivados D de la proteasa V8 mutante V8D1, V8D5 y V8D8, derivados de pV8D1, pV8D5 y pV8D8.
Para la purificación de cada una de las proteasas, se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una concentración final de 1,8M y, entonces, se purificaron 300 ml de la mezcla utilizando un Toyopearl de butilo (producto de Toso, KK.). La muestra se añadió a una columna de diámetro interno de 16 mm x 62 mm equilibrada con tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 7,5) que contenía (NH_{4})_{2}SO_{4}, y la purificación se llevó a cabo con un gradiente de concentración lineal desde 1,8M hasta una concentración de 0M de (NH_{4})_{2}SO_{4}. Cada una de las proteasas eluyó próxima a la concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,9M, obteniéndose alrededor de 20 mg de cada enzima purificada.
Las actividades de las enzimas purificadas se midieron por el método descrito en el Ejemplo 3.
V8D1, V8D5 y V8D8 purificados se utilizaron para volver a examinar la resistencia contra la urea. Cada una de las enzimas mutantes (V8D1, V8D5 y V8D8) se añadió a 40 \mul (concentración: 150 \mug/ml) a 960 \mul de una mezcla de reacción que contenía urea 3M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y DMSO al 2%, dejando reposar las mezclas a 30ºC durante 30 minutos, tras lo cual se añadió un sustrato sintético (Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida) hasta una concentración final de 0,4 mM, y se midió la actividad residual de cada enzima, definiendo la actividad inmediatamente después de la adición como 100%. El derivado D de la proteasa V8 salvaje (V8D) producido a partir de pV8D por el mismo procedimiento, se utilizó como control. Como resultado, V8D1, V8D5 y V8D8 tuvieron actividades residuales superiores a la de V8D, lo que demuestra que la introducción de sus mutaciones producen derivados D de la proteasa V8 mutante con una resistencia mejorada a la urea (Fig. 17).
(2) Derivados F de la proteasa V8 mutante
También se estudiaron las mutaciones introducidas en pV8F. Tras el procedimiento descrito en la Fig. 18, se insertaron fragmentos de 0,7 kpb de BgIII-EcoRI derivados de pV8RPT(-)1, pV8RPT(-)5, pV8RPT(-)7, pV8RPT(-)8 y pV8RPT(-)158 en el fragmento de 3,9 kpb de BgIII-EcoRI de pV8F para construir pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8 y pV8F158.
Se utilizaron cepas JM101 que poseían estos plasmidios para separar derivados F de la proteasa V8 mutante que tenían cada una de estas mutaciones, es decir, los derivados F de la proteasa V8 mutante V8F1, V8F5, V8F7, V8F8 y V8F158, derivados de pV8F1, pV8F5, pV8F7, pV8F8 y pV8F158, por el método anteriormente descrito.
Se utilizaron los derivados purificados V8F1, V8F5, V8F7, V8F8, V8F158 y el derivado F de la proteasa V8 salvaje (V8F), derivado de pV8F como control, producidos por el mismo procedimiento, para volver a examinar la resistencia contra la urea. Como resultado, se confirmó nuevamente que cada una de las enzimas mutantes tenían una excelente resistencia contra la urea en presencia de urea 5M (Fig. 19), lo que demuestra la capacidad para producir derivados F de la proteasa V8 mutante con excelente resistencia a la urea.
Ejemplo 10 Estudio de la estabilidad de V8F1, V8F5 y V8F8 frente al dodecil-sulfato sódico (al 0,1%) y calor (50ºC)
Se utilizaron V8F1, V8F5 y V8F8, obtenidos en el Ejemplo 9, para estudiar su estabilidad frente al dodecil-sulfato sódico (en lo sucesivo, SDS) y al calor. Para la estabilidad frente a SDS, se incubó a 30ºC una solución que contenía SDS al 0,1%, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y una cantidad de cada enzima (V8F1, V8F5, V8F8), correspondientes a 4,0 \mug/ml de actividad enzimática de la proteasa V8 natural, y se tomaron 900 \mul de la misma a intervalos establecidos, tras lo cual se añadieron 100 \mul de una solución que contenía Z-Phe-Leu-Glu-4-nitroanilida 4 mM y DMSO al 20%, midiendo a continuación la actividad residual.
Para la estabilidad térmica a 50ºC, se incubó a 50ºC una solución que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y una cantidad de cada enzima (V8F1, V8F5, V8F8) correspondiente a 4,0 \mug/ml de actividad enzimática de proteasa V8 natural, y se tomaron 900 \mul de la misma a los intervalos prescritos, se enfrió con hielo y se midió la actividad residual.
Como se muestra en la Fig. 20, las enzimas mutantes V8F1, V8F5 y V8F8 tuvieron tasas de inactivación más bajas que la forma salvaje usada como control, y una estabilidad incrementada contra SDS al 0,1%. Esto demostró que la introducción de las 3 mutaciones de resistencia a la urea Lys147Arg (V8F1), Asn71Ser (V8F5) y Asp44Glu (V8F8) también es eficaz contra la desnaturalización por SDS. Asimismo, tras la inactivación térmica a 50ºC, V8F1 y V8F5 tuvieron índices de inactivación más bajos que el V8F salvaje, lo que demuestra que las mutaciones Lys147Arg y Asn71Ser proporcionan resistencia térmica (Fig. 21).
Ejemplo 11 Escisión de la proteína fusionada por V8F158
Se utilizó V8F158 (el derivado F de la proteasa V8 con triple mutación) para un experimento de escisión de proteína en presencia de urea. Se usó una proteína fusionada derivada de pG97S4DhCNP-225R-3 como sustrato para el experimento. La proteína fusionada \beta-gal97S4DhCNP-225R-3 tiene una estructura en la que un péptido protector (\beta-gal97S4D) y un péptido natriurético auricular de tipo C humano (hCNP) se fusionan a través de un enlazador, y la proteasa V8 libera hCNP (Publicación de Patente Japonesa No Examinada No. 5-328992).
Se comparó la proteasa V8 natural y V8F158 en su capacidad para escindir hCNP del péptido fusionado, en presencia de urea 5M. El tipo de péptido fusionado derivado de pG97S4DhCNP-225R-3, la expresión del péptido fusionado, la recuperación del cuerpo de inclusión expresado, las condiciones de reacción para la proteasa V8 y el análisis de la proteína fusionada y hCNP liberado fueron acordes, en su totalidad, a las condiciones descritas en la Publicación de Patente Japonesa No Examinada No. 5-328992. Sin embargo, la concentración de urea se ajustó a 5M para la reacción, y se añadió V8F158 en una cantidad correspondiente a 4 \mug/ml de actividad en términos de proteasa V8 natural.
Después de 30 minutos de reacción, se calculó la eficacia de escisión (proporción de proteína fusionada escindida) a partir del pico de HPLC, dando como resultado 60% para la proteasa V8 natural frente a 98% para V8F158, por lo que se demostró también la eficacia de V8F158 en presencia de una elevada concentración de urea en la reacción de la escisión de proteínas fusionadas.
La proteasa V8 natural, conocida públicamente, se utiliza por lo general para la producción de péptidos útiles, etc. por métodos de recombinación génica, porque aún conserva algún grado de capacidad de escisión incluso en soluciones de reacción enzimática que contienen aproximadamente urea 2M; no obstante, como se ha mencionado anteriormente, las enzimas de la presente invención pueden añadir una resistencia todavía mayor a la urea a las propiedades de la enzima natural. De este modo, se puede usar una enzima según la invención para minimizar la inactivación de la actividad enzimática incluso en presencia de altas concentraciones de urea, a lo que se añade la necesidad de cantidades menores de enzima agregada a los sistemas de reacción que contienen urea, y tiempos de reacción más breves. Una ventaja adicional es que la capacidad para escindir proteínas en presencia de altas concentraciones de urea permite lograr fragmentos de péptidos que no se podían obtener hasta la fecha.
Se debe comprender que se pueden tolerar variaciones de secuencia diferentes de las mutaciones anteriormente mencionadas (o, incluso, pueden ser deseables, con otros efectos técnicos en mente), siempre que se conserve la actividad de la proteasa V8 de la enzima derivada de Staphylococcus aureus natural. En particular, puede haber deleciones, adiciones o sustituciones relativas a la secuencia de tipo salvaje, tal como se ha ilustrado ya por el uso de proteasas truncadas en su extremo C-terminal. La adopción o tolerancia deliberada de estas variaciones de secuencia constituye, evidentemente, una cuestión de rutina para el experto en la técnica, dado que lo realmente importante en relación con la presente invención se puede determinar mediante ensayos sencillos, concretamente los de la actividad de la proteasa V8 y su conservación bajo condiciones desnaturalizantes.
SEC ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 31
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 31
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGCGTCGACTTATTGGTCATCGTTGGCAAA 
\hfill
31 
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SEC ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 344
Tipo de secuencia: aminoácido
Topología: lineal
Tipo molecular: proteína
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 28
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCCGAGGCCTATGACCATGATTACGGAT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 31
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TCGCGTCGACTTATTGGTCATCGTTGGCAAA 
\hfill
31 
\newpage
SEC ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 31
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT 
\hfill
31 
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SEC ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 29
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGGCGAAGGAGCGCTAGCAATAGTTAAA 
\hfill
29 
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SEC ID NO: 8
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Longitud de secuencia: 29
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TTTAACTATTGCTAGCGCTCCTTCGCCTG 
\hfill
29 
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SEC ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 532
Tipo de secuencia: aminoácido
Topología: lineal
Tipo molecular: proteína
Secuencia
3
30
4
40
SEC ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 24
Tipo de secuencia: aminoácido
Topología: lineal
Tipo molecular: péptido
Secuencia
7
SEC ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 31
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
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ACCGCTCGAGGTTATATTACCAAATAACGAT 
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31 
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SEC ID NO: 12
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Longitud de secuencia: 33
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GACTTATTGGTCATCGAGCTCAAAATGGATATC 
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33 
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SEC ID NO: 13
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Longitud de secuencia: 33
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AATATTGAAGAGCTCCGCCTATATCGCCGACAT 
\hfill
33 
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SEC ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 27
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Tipo de cadena: sencillo
Topología: lineal
Tipo molecular: DNA sintético
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTT 
\hfill
27 
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SEC ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud de secuencia: 537
Tipo de secuencia: aminoácido
Topología: lineal
Tipo molecular: proteína
Secuencia
5
6

Claims (14)

1. Una proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural mutante que comprende al menos una secuencia de aminoácidos N-terminal desde la primera valina hasta el 212º ácido aspártico de la secuencia de aminoácidos de la proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural, en la que al menos uno del 44º ácido aspártico, la 71ª asparagina y la 147ª lisina están sustituidos por otro aminoácido.
2. Una proteasa mutante según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos desde la 125ª Val hasta la 336ª Asp en la SEC ID NO: 3, en la que al menos una de la 168ª Asp, la 195ª Asn y la 217ª Lys está sustituida por otro aminoácido.
3. Una proteasa mutante según la reivindicación 2, en la que una de la 168ª Asp, la 195ª Asn y la 217ª Lys está sustituida por otro aminoácido.
4. Una proteasa mutada según la reivindicación 2, en la que (a) la 168ª Asp y la 195ª Asn, (b) la 168ª Asp y la 217ª Lys, o (c) la 195ª Asn y la 217ª Lys están sustituidas con otros aminoácidos.
5. Una proteasa mutada según la reivindicación 2, en la que todas las 168ª Asp, la 195ª Asn y la 271ª Lys están sustituidas con otros aminoácidos.
6. Una proteasa mutada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que la longitud total de la secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la 105ª Arg hasta la 345ª Gln de la SEC ID NO: 3.
7. Una proteasa mutada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que la secuencia total de aminoácidos corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la 105ª Arg hasta la 340ª Arg de la SEC ID NO: 9.
8. Una proteasa mutada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que la secuencia total de aminoácidos corresponde a la secuencia de aminoácidos desde la 105ª Arg hasta la 345ª Arg de la SEC ID NO: 15.
9. Una proteasa mutada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la que la 168ª Asp está reemplazada por Glu, la 195ª Asn está reemplazada por Ser; y/o la 271ª Lys está reemplazada por Arg.
10. Un gen que codifica una proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un vector de expresión que contiene un gen según la reivindicación 10.
12. Células recombinantes transformadas con un vector de expresión según la reivindicación 11.
13. Un método para producir una proteasa V8 de Staphylococcus aureus natural mutante con actividad enzimática incluso bajo condiciones ambientales que estimulan la desnaturalización de proteínas, método que comprende cultiva células recombinantes según la reivindicación 12 y, seguidamente, recuperar la proteína de proteasa deseada desde el producto cultivado.
14. Uso de una proteasa V8 mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la escisión de proteínas.
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