KR100284038B1 - 인간 칼시토닌 유전자, 그의 발현벡터 및 인간 칼시토닌의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼시토닌의 대량 발현을 위해 유비퀴틴 유전자에 인간 칼시토닌 유전자를 융합시키고, 유비퀴틴 유전자와 인간 칼시토닌 유전자 사이에 6개 히스티딘 서열과 FactorXa 절단 부위를 삽입시킨 재조합 인간 칼시토닌 유전자, 상기 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물, 및 이에 의해 제조된 인간 칼시토닌 융합 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

인간 칼시토닌 유전자, 그의 발현벡터 및 인간 칼시토닌의 제조방법

제1도는 5′ 말단에 SacII 제한효소 인지부위를 가지고 3′ 말단에 SalI 제한효소 인지부위를 갖는 칼시토닌 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 전체 칼시토닌 유전자의 합성 올리고머 1, 2, 3 및 4 의 위치 및 접합순서와, 6개 히스티딘 및 FactorXa 절단 부위를 제공하기 위한 프라이머 CA-H-FXA 의 염기서열을 나타낸 것이고,

제3도는 칼시토닌 유전자의 M13 벡터로의 클로닝 및 대장균 발현 벡터로의 클로닝을 도식화한 것이고,

제4도는 본 발명의 칼시토닌 발현 벡터(pTrpH-UB-6His-FXa-CALCITONIN)를 함유하는 대장균의 농축 배양액을 SDS 폴리 아크릴아마이드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 인간 칼시토닌 유전자의 발현에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 칼시토닌을 대량 발현시키기 위해 유비퀴틴-6개 His-FactorXa 절단부위-칼시토닌 유전자 염기 서열을 인위적으로 연결시킨 인간 칼시토닌 유전자, 그의 대장균 발현벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물, 및 이에 의해 제조된 인간 칼시토닌 융합 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

칼시토닌(calcitonin, 이하 “CT”라 함)은 포유동물이나 파충류와 조류의 울티모 아가미선 (Ultimo-branchial glands)의 C-난포방(C-parafollicular) 세포에서 생성되는 33개 아미노산으로 이루어진 호르몬 단백질이다. 부 갑상선 호르몬 및 1,25-디하이드록시 콜레칼시페롤과 함께 CT는 칼슘과 인산대사의 조절에 중요한 역할을 한다. CT는 골체의 칼슘을 고정화시켜서 뼈의 약화를 방지한다.

칼시토닌은 과칼슘증(hypercalcemia)이나 골함몰증(bone resorption) 등과 같은 병의 치료에 이용되어 왔다. 인간의 치료에 최근까지 주로 이용된 것은 연어와 돼지의 칼시토닌이었으나 이들을 6개월 이상 주입하면 환자에게 거부반응을 일으키며 특히 칼시토닌에 의한 항체의 형성 및 축적으로 인해 그 후에 계속적으로 주입되는 칼시토닌이 약으로서의 효과를 발휘하지 못하게 된다는 등의 문제점이 있었다[Gennari, First International Workshop, Florence, April 2-3 Elsevier, Amsterdam 1982, P44-48].

이러한 이유 때문에 인간 CT 의 발현이 요구되었는데, 1982년 크레이그(Craig) 등[Roger K. Craig et al., Nature 295, 345(1982)]에 의해 인간 CT 의 아미노산 서열이 부분적으로 밝혀진 이래 1984년 모울(Moulle)[FEBS, 167, 93(1984)] 등에 의해 인간의 프레프로칼시토닌 (preprocalcitonin)의 전체 아미노산 서열이 밝혀져 재조합 기법에 의한 인간 CT 의 생산이 가능하게 되었다. 그 예로 1987년 이바노프(Ivanov)[Gene 59, 223-230(1987)] 등이 대장균에서 인간 CT를 발현시켰다.

한편, 유비퀴틴은 1975년 발견된 분자량 5500 달톤의 단백질로서 전반적으로 진핵세포에서 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고되고 있다[Goldstein et al., PNAS 72, 11 (1975)] 지금까지 동물세포로부터 유래된 유비퀴틴은 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 역할은 여러 가지가 있으나 그 중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다[Finley et al., Trends. Biochem. Sci 16, 343(1985)].

효모의 유비퀴틴 시스템에서는 76개의 아미노산으로 구성된 유비퀴틴이 다른 형태의 유비퀴틴보다 세포내에서 절단 공정이 매우 빠르며 아르기닌-글리신-글리신 (Arg-Gly-Gly) 다음에서 매우 효율적으로 절단되는 것으로 보고되어 있다[Oxkaynak et al., Nature 312, 663-666(1987)]. 또한 세포내에 존재하는 효소가 유비퀴틴에 결합된 외래 유전자를 Arg-Gly-Gly 다음에서 아주 정확하게 절단하나[Bachmair et al., Science 234, 178-186(1986)], Arg-Gly 뒤에 Gly 이 아닌 다른 아미노산이 올 경우 뒤의 단백질을 절단하지 못하고 비가역적으로 융합된 형태로 세포내에 축적된다고 보고된 바 있다[Robert R.W. Hodgins et al., J.B.C. 267, 8807-8812].

그러나 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포 내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 비가역적 유비퀴틴 융합 단백질 그대로 세포내에 축적된다.

이러한 비가역적 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 불안정 할 때, 예를들면 각 세포내의 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 비가역적으로 융합된 유비퀴틴이 단백질의 분해를 억제하므로 매우 유용하며, 항 유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 유비퀴틴 유전자 다음과 인간 CT 유전자 앞에 6개의 히스티딘 염기서열과 FactorXa 절단 부위를 연결시키므로써 대장균에서 발현될 때 유비퀴틴이 융합된 분해에 안정한 단백질을 얻을 수 있고, CT 의 정제과정에서 구리 고정화 컬럼과 FactorXa를 사용하여 정제과정을 간단히 할 수 있도록 유도하는 재조합 인간 CT 유전자 및 상기 재조합 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 발현 벡터로 미생물을 형질전환시켜 인간 CT를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명자는 여러가지 발현 시스템에서 유용한 유비퀴틴 유전자 다음에 인간 CT 유전자를 연결하였는데, 발현 후 인간 CT 를 구리 고정화 컬럼에서 정제가 편리하도록 유비퀴틴 유전자와 인간 CT 유전자 사이에 아미노산 히스티딘의 염기서열 6개를 삽입하고 6개 히스티딘 염기서열 다음에 이소루이신-글루탐산-글리신-아르기닌으로 구성된 FactorXa에 의해 절단될 수 있는 FactorXa 절단부위를 삽입하여, 이 연결된 뉴클레오티드 서열을 인간 CT 의 정제 과정에서 고정화 컬럼에 붙인 다음 FactorXa 로 절단시키고, 인간 CT 만 용출시킴으로써 목적하는 인간 CT 를 정제할 수 있는 시스템을 설계하여 인간 CT 를 발현시키는데 성공하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

이미 알려진 CT 의 33개 아미노산 서열[Ivan Ivanov, Gene, 59, 223-230(1987)]을 이용하여 효모의 선호 코돈을 기준으로 5′ 말단에 SacII, 3′ 말단에 SalI 제한효소 인지부위를 갖는 CT 유전자를 설계하고(제1도), 이 유전자를 경제적으로 합성하기 위하여 서로 15개 염기가 상보적인 윗가닥 2개 아랫가닥 2개의 올리고뉴클레오티드 총 4개를 고안하고(제2도), CT 유전자와 유비퀴틴 유전자 사이에 6개의 히스티딘과 FactorXa 절단부위(Ile-Glu-Gly-Arg)를 삽입하기 위한 프라이머 CA-H-FXA를 고안하여 핵산 합성기로 합성한다(제2도). 이렇게 하여 수득된 단일가닥의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 총 162 염기쌍으로 이루어진 핵산을 수득하고, 이들 클레나우(Klenow) 단편으로 처리하고 M13 핵산에 클로닝한 후, 디데옥시 핵산 서열 분석 방법으로 염기 서열을 확인하여 제2도에 나타낸 바와 같은 본 발명의 염기서열을 갖는 유전자를 함유한 M13 벡터를 선별한다.

선별된 벡터를 제한효소 SacII, SalI 으로 절단한 후 동일효소로 절단된 발현 벡터 pTrpH-UB-Core14(기탁번호 ATCC 68642, 1991. 7. 1 기탁)에 삽입하여 pTrpH-UB-6His-FXa-CT 를 얻고, 상기 재조합 발현 벡터로 대장균을 형질전환시켜 대장균내에서 상기 재조합 유전자를 발현시킨 후, 대장균 세포외로 분비되어 배양액중에 존재하는 유비퀴틴과 융합된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 확인한다.

본 출원인은 CT 유전자를 함유하는 발현벡터를 pTrpH-UB-6His-FXa-CT 라 명명하고, 이를 1993년 1월 4일자로 한국 유전자은행 (KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC 0062BP).

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

[실시예 1]

[인간 칼시토닌 유전자의 합성]

단계 1: 인간 칼시토닌 유전자의 염기서열 설계

이미 알려진 CT 의 33개 아미노산 서열[Ivan Ivanov, Gene, 59, 223-230(1987)]을 이용하여, 효모내에서 유전자 발현을 증가시키기 위해, 생성되는 CT 단백질의 아미노산 서열은 천연 CT 와 같도록 하되 그 염기서열을 효모의 선호 코돈[Bennetzen. J.M. ＆ Hall B.D., J. Biol. Chem. 257, 3026(1982)]으로 변형시켰는데, 그 이유는 CT 유전자를 대장균과 효모 두 균주에서 발현시키고자 할 때 DNA 합성을 중복하지 않고 클로닝에 필요한 프라이머만 합성하면 두 균주 모두에 대한 CT 발현 벡터를 만들 수 있기 때문이다. 따라서 본 발명에서는 유비퀴틴 유전자 다음과 인간 CT 유전자 앞에 6개의 히스티딘과 FactorXa 절단부위를 연결시키는 프라이머를 설계하여 대장균에서 발현될 때 유비퀴틴과 융합된 단백질을 얻을 수 있고 CT 의 정제과정에서 구리 고정화 컬럼과 FactorXa를 사용하여 정제 과정을 간단히 할 수 있도록 유도하는 대장균 발현 벡터를 설계하였다.

단계 2: 올리고머의 합성

전체 CT 유전자를 경제적으로 합성하기 위하여 서로 15개의 염기가 상보적인 윗가닥 2개 아랫가닥 2개의 총 4개 올리고 뉴클레오티드를 고안하였고(제2도), CT 유전자와 유비퀴틴 유전자 사이에 6개 히스티딘과 FactorXa 절단부위(이소루이신-글루탐산-글리신-아르기닌)를 삽입하기 위한 프라이머 CA-H-FXA(5′- AAAAAACCGCGGTCACCACCACCACCACCACTCGATCGAAGGTAGATGTGGTAACTTGTCTACTTG - 3′)를 고안하여 하기와 같이 합성하였다.

상기 올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(Solid Phase Phosphoamidite Chemistry)를 이용하여 DNA 합성기 (Applied Biosystem 380B, 미합중국)로 합성한 후(제2도), 변성 폴리아크릴아마이드겔 (2M 우레아, 50mM 트리스 중의 12% 아크릴아마이드:비스아크릴아마이드(29:1, w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA)을 이용한 전기영동으로 분리한 후 추출 완충액 (0.5M 염화나트륨, 0.1M 트리스, pH 8.0, 50mM EDTA)으로 12시간 동안 37℃에서 방치하여 겔로부터 올리고머 핵산을 추출하였다. 그런 다음, C18 컬럼인 SEP-PAK(Waters, 미합중국)에 올리고머를 부착시킨 후 50% 의 아세트니트릴로 올리고머 핵산을 용출시켜 정제하고, 260nm 에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정한 다음 진공 건조시켜서 흡광도 5를 기준으로 증류수에 녹여 영하 20 ℃에 보관하였다.

단계 3: 중합효소 연쇄반응에 의해 이중나선의 전체 CT DNA 합성 및 6-히스티딘-Factor Xa 의 연결

중합효소 연쇄반응에 의해 전체 CT DNA를 합성하기 위해서, 10㎕ 의 10X Taq 중합효소 완충액 (100mM 트리스, pH 8.3, 500mM 염화칼륨, 15mM 염화마그네슘, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕ 의 dNTP 혼합액 (dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각각 1.25mM), 올리고머 1,4 (각각 0.8㎍)와 100배 희석한 올리고머 2,3 을 각각 1㎕(1.6ng)씩 사용하여 전체 CT DNA 합성 반응을 수행하였다. 상기 반응에는 0.5㎕(5유니트/㎕)의 Ampli Taq 중합효소(Perkin Elmer-Cetus, 미합중국)를 이용하였으며, 95℃, 30초: 45℃, 30초: 72℃, 1분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃ 에서 10분간 추가 반응을 시키는 순환 프로그램을 이용하였다. 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 131 염기쌍의 DNA가 합성된 것을 확인한 후, 반응액 속에 남아 있는 중합효소를 제거하기 위해 반응물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 혼합한 후 원심분리하였다. 상징액을 새로운 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 (pH 4.5)과 2배 부피의 100% 에탄올을 가하여 혼합한 후, 원심 분리하여 핵산 침전물을 수득하였다. 침전된 DNA를 건조시킨 후, TE 완충액 (10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA) 20㎕에 용해시켰다.

6-His-FactorXa 절단부위를 접합시키기 위해 10㎕ 의 10X Taq 중합효소 완충액 (상기 동일)과 10㎕ 의 dNTP 혼합액 (상기 동일)에 5㎕ 의 올리고머 4 및 프라이머 CA-H-FXA(각각 0.8㎍)와 상기에서 합성한 CT DNA를 희석하여 1㎕(1.6ng)를 가하고, 67㎕ 의 증류수와 0.5㎕(5유니트/㎕)의 Ampli Taq DNA 중합효소를 넣고 잘 혼합한 다음 온도 순환기에서 상기에서와 같은 순환 프로그램으로 DNA 합성반응을 수행하였다. 폴리아크릴 아마이드 겔 전기 영동을 통해 162 염기쌍의 DNA가 합성된 것을 확인한 후, 반응액 속에 남아 있는 중합효소를 제거하기 위해 반응물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 혼합한 후 원심분리하였다. 상징액을 새로운 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 4.5)과 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한 후 원심 분리하여 핵산 침전물을 수득하였다. 침전된 DNA를 건조시킨 후 TE 완충액 (10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA) 20㎕에 용해시켜, M13 벡터로의 클로닝에 사용하였다.

[실시예 2]

[합성된 CT 유전자 핵산의 M13 벡터로의 클로닝 및 염기서열 확인]

상기 단계 3 의 TE 완충액에 용해된 162 염기쌍의 CT 핵산을 평활 말단(blunt end) 상태로 M13 벡터에 접합하기 위해, 먼저 CT 유전자를 클레나우 단편과의 반응조건하에 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 65℃ 에서 20분간 열처리 한 다음, 키나제 반응 조건으로 완충액을 전환시켜 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후, 65℃ 에서 20분간 열처리하고, 이어서 반응액속에 남아 있는 중합효소를 제거하기 위해 반응물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 혼합한 후 원심분리하였다. 상징액을 새로운 튜브에 옳기고, 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 (pH 4.5)과 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한 후 원심분리하여 핵산 침전물을 수득하였다. 침전된 DNA를 건조시킨 후 TE 완충액 (10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA) 10㎕에 용해시켰다. CT 의 162 염기쌍 핵산과 M13 핵산의 접합반응은 2㎕의 10X 접합 완충액 (660mM 트리스, pH 7.6, 66mM 염화 마그네슘, 100mM DTT), 2㎕ 의 10mM ATP, 2㎕ 의 CT핵산 절편 (0.2㎍), 1㎍ 의 EcoRV 로 절단되어 평활화된 M13 벡터 DNA(약 0.1 ㎍), 12㎕ 의 증류수중의 1㎕ 의 T4 DNA 리가제 (리가제 1 유니트/㎕, United States Biochemicals, U.S.A.)를 사용하여 14℃ 에서 1시간정도 수행하였다, 상기 반응액중 10㎕를 E. coli JM105(ATCC 47016) 세포에 하나한(Hanahan) 방법[J. Mol. Biol., 116, 557(1983)]에 의해 형질전환시켰다(제3도).

형질전환시킨 대장균 세포에 8㎕ 의 0.2M IPTG 용액을 가하고, 미리 배양시킨 헬프 세포(Help Cell, JM 105) 100㎕, 3㎖ 의 2XYT 상층 연성 아가(soft agar, 16g 박토트립톤, 10g 효모 추출물, 5g 염화나트륨, 5g 박토아가/ℓ)와 25㎕ 의 4% X-갈 용액을 혼합하고 최소 A 플레이트(1 ℓ 당 10.5g K₂HPO₄, 1g(NH₄)₂SO₄, 0.5g 시트르산 나트륨, 12g 박토아가, 1㎖ 의 20% MgSO₄, 0.5㎖ 의 1% 비타민 B, 10㎖ 의 50% 글루코즈) 위에 평판시킨 후, 37℃ 배양기에서 12시간 배양하여 생성된 투명한 플라크를 이쑤시게로 찍어서 2㎖ 의 2XYT 액체 배지로 옮겨 37℃에서 5시간 정도 배양하였다. 그런 후에 상기 배양액을 원심분리하여 상징액을 취한 후, 1/4 부피의 20% PEG(폴리에틸렌 글리콜), 2.5M 염화나트륨을 가하고, M13 파아지를 수거하여 단일 가닥 핵산을 추출한 후 시쿼나제(Sequenase) (United States Biochemicals, U.S.A.) 를 이용한 디데옥시 DNA 서열분석[Tabor S. et al., PNAS 84, 4767 (1987)] 방법으로 CT 의 염기서열을 확인하였고 제2도에 나타낸 염기서열의 유전자를 갖는 벡터 DNA 를 선별하고, 이 벡터를 M13 rt2-CT 로 명명하였다.

[실시예 3]

[칼시토닌의 대장균에서의 발현]

단계 1: M13 벡터로부터 CT의 대장균 발현 벡터(pTrpH-UB-6His-FXa-CT) 로의 클로닝

상기 실시예 2에서 제작한 벡터 M13 rt2-CT 를 SacII, SalI 제한효소로 절단하여 176 염기쌍의 핵산 절편을 전기 영동에 의해 겔로부터 DNA 를 추출하는 방법으로 순수 분리하였다. 그런 후에, 선출원 (대한민국 특허출원 제 91-13597 호)한 “한국형 C형 간염 바이러스의 항원 단백질 유비퀴틴의 융합 단백질을 발현시키는 발현 벡터 및 그에 의해 제조되는 단백질”의 발현 벡터 pTrpH-UB-CORE14 를 SacII, SalI 제한효소로 절단하여 CORE14가 제거된 벡터, SacII/SalI 로 절단된 pTrpH-UB 핵산 절편을 얻었다. 그런 후에 이 절편을 앞에서 얻은 핵산 절편(SacII/SalI 로 절단된 CT 절편)과 동일 몰 비율로 가하고 10배 농도의 2㎕ 의 접합 완충액 (600mM 트리스-Cl, pH 7.5, 10mM DTT, 100mM MgCl), 2㎕ 의 10mM ATP, 1유니트의 T4 DNA 리가제 (USB, U.S.A.)와 함께 증류수를 20㎕ 가 되게 가한 후에 14℃ 에서 2시간 이상 반응시켰다. 이 접합 반응액을 E. coli HB101 (ATCC 33694) 컴피턴트(competent) 세포에 첨가시켜 하나한의 방법[J. Mol. Biol., 116, 557(1983)]에 따라 형질전환시킨 후 엠피실린 함유 플레이트에서 선별하여 유비퀴틴에 융합된 CT 유전자를 갖는 발현 벡터 (pTrpH-UB-6His-FXa-CT)를 제조하였다.

단계 2: 칼시토닌의 대장균에서의 발현 유도

상기 단계 1 에서 얻은 CT 유전자를 함유하는 플라스미드를 발현용 대장균인 E. coli W3110(ATCC 37335)에 형질전환시켰다.

형질 전환된 대장균을 5㎍/㎖ 의 엠피실린이 함유된 액체 LB 배지 (6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 12시간동안 진탕 배양한 다음, 상기 배양액 5㎖ 를 1ℓ 의 M9 배지 (40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 글루코즈, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ 비타민 B1, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옮겨서, 37℃ 에서 약 3 내지 4시간동안 진탕 배양하여 배양액의 0D650 값이 0.5 정도가 될 때 인돌 아크릴산(IAA)을 최종 농도 1.4mM 이 되게 첨가하여 재조합된 CT 유전자가 발현되도록 하였다. IAA 를 첨가한 지 약 5시간 후에 세포 배양액을 원심 분리기 (Beckman J6 B, Rotor JS4.2)를 이용하여 3000rpm 으로 25분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 수집하였다. 이렇게 하여 수득한 세포 균질액을 램리[Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)]의 방법에 따라 15% SDS-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동한 결과 6-His-FXa-CT 유전자 산물이 유비퀴틴 단백질과 융합되어 발현되었음을 확인하였다. 그 결과를 제4도에 나타내었다.

제4도에서, 제7, 12, 17 열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균 시료를 전기영동한 것이며, 제1, 2 열은 pTrpH-UB-6His-FXa-CT 벡터를 함유한 대장균으로서 IAA 첨가 전에 채취된 시료를 전기영동한 것이며, 제3 내지 6 열은 pTrpH-UB-6His-FXa-CT 벡터를 함유한 대장균으로서 IAA 를 첨가한지 2시간 후에 채취된 시료를 전기영동한 것이며, 제8 내지 11 열은 pTrpH-UB-6His-FXa-CT 벡터를 함유한 대장균으로서 IAA 를 첨가한지 5시간 후에 채취된 시료를 전기영동한 것이며, 제13 내지 16 열은 pTrpH-UB-6His-FXa-CT 벡터를 함유한 대장균으로서 IAA 를 첨가한지 하룻밤 후에 채취된 시료를 전기영동한 것이며, 제MK 열은 단백질 표준분자량으로서 위로부터 43, 29, 18, 14, 7.5, 3.5 킬로달톤을 나타낸다.

Claims (6)

1. 유비퀴틴-6개 His-FXa 절단부위-칼시토닌의 융합 칼시토닌 단백질.
2. 유비퀴틴 유전자, FXa 절단부위 및 인간 칼시토닌 유전자를 포함하는 재조합 유전자.
3. 제2항에 있어서, 인간 칼시토닌 유전자가 5′ 말단에 SacII 제한효소 인지부위, 3′ 말단에 SalI 제한효소 인지부위, 및 생성된 칼시토닌의 아미노산 서열은 천연 칼시토닌과 같도록 하면서 효모의 선호 코돈으로 변형시킨 칼시토닌 염기서열을 포함하는 다음의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 유전자.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 6개 His-FXa 절단부위를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열(프라이머 CA-H-FXA)이 다음의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제2항 내지 제4항중 어느 한 항의 유전자를 포함하는 발현 벡터(KCTC 0062BP).
6. 제5항의 발현 벡터로 대장균 또는 효모를 형질전환시키는 단계, 형질전환된 대장균 또는 효모를 배양하는 단계 및 배양물로부터 인간 칼시토닌을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 인간 칼시토닌의 제조방법.