KR930010766B1

KR930010766B1 - 닭 성장호르몬 유전자 및 그의 발현벡터

Info

Publication number: KR930010766B1
Application number: KR1019910017582A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 박영우
Original assignee: 주식회사 럭키; 최근선
Priority date: 1991-10-08
Filing date: 1991-10-08
Publication date: 1993-11-10
Also published as: KR930008145A

Abstract

내용 없음.

Description

닭 성장호르몬 유전자 및 그의 발현벡터

제1도는 본 발명에 따라 설계된 닭 성장호르몬 유전자의 염기서열과 이로부터 유추된 아미노산서열을 나타낸 것이고,

제2도는 제1도의 닭 성장호르몬 유전자를 합성하기 위한 전략을 도시한 것이고,

제3도는 본 발명에 따른 닭 성장호르몬 유전자를 대장균 발현벡터로 클로닝하는 과정을 도시한 것이고,

제4도는 본 발명의 닭 성장호르몬 발현벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여서 닭 성장호르몬 유전자를 발현시킨 결과를 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동으로 나타낸 것이다.

본 발명은 인공합성한 닭 성장호르몬(이하 CGH라함) 유전자와 그의 발현에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유전공학적인 방법으로 닭 성장호르몬을 대량 생산하는데 유용하도록 설계된 닭 성장호르몬 유전자와 이러한 유전자를 함유하고 있는 발현 벡터 및 대장균 형질전환체에 관한 것이다.

동물 성장호르몬은 지방 및 탄수화물 대사작용은 물론 단백질대사를 조절하고 조직성장을 촉진하는 단백질의 일종으로, 일반적으로 단일가닥의 구형 단백질(globular protein)이며 성숙형 성장호르몬은 약 190-200개의 아미노산으로 구성되어 있다(일반적인 성장호르몬에 관한 참고문헌 : Barrington.,, 2(1979)).

이들 성장호르몬은 뇌하수체 전엽에서 생성되며, 처음에는 세포내에서 아미노말단에 신호 서열을 갖고 있는 전구 물질로서 합성되고, ER(Endoplasmic Reticulum)막을 거쳐 신호서열이 절단되어 성숙형 성장호르몬으로 만들어진다(Davies.,. 466-438(1980)).

성장호르몬은 어린 동물들의 균형된 성장을 위해 요구되기 때문에 특히 가축산업에 유용하게 이용될 수 있다. 이들은 주로 아미노산들의 세포내로의 전달을 증가시키고 전령 RNA(mRNA)의 해독을 자극시킴으로써 동물들의 성장을 촉진시킨다. 또한 이들은 성장에 중요한 요소인 세포의 분열 작용을 증가시킨다. 따라서 성장호르몬을 투여받은 동물은 증가된 조직 단백질의 결과로서 사료량의 증가없이 부가적인 체중의 증가로 인하여 사료의 효율을 증대시킬 수 있다.

이러한 성장 호르몬은 종에 특이적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 동물 성장호르몬에 대한 전체 서열이 이미 공지되어 있으며, 지금까지 인간, 소, 돼지 및 쥐를 포함하는 몇몇 종의 동물 성장호르몬들이 클로닝되어 대장균 세포내에서 발현되었다(Miller.,, 7521-7524 ; Martial.,, 602-607(1979) ; Seeburg et al.,, 486-494(1977)).

그러나, 닭 성장호르몬을 유전공학적인 방법으로 대량 발현시킨 예는 찾아볼 수 없었는바, 이에 본 발명자들은 이미 알려진 닭 성장호르몬의 아미노산 서열을 바탕으로 하여 대장균에서 닭 성장호르몬을 대량 발현시키는데 적합한 닭 성장호르몬 유전자를 설계하고 이로써 닭 성장호르몬을 대량발현시키는데 성공하였다.

즉, 본 발명의 목적은 닭 성장호르몬을 유전공학적인 방법에 따라 대장균을 발현체로 하여 대량생산하는데 적합하도록 설계된 닭 성장호르몬 유전자를 제공하는 것이며, 또한 이러한 유전자를 함유하는 닭 성장호르몬 발현 벡터 및 대장균 형질전환체를 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에는 소우지등의 문헌(Souza, L.M..,, 465-473(1984))에 기재된 닭 성장호르몬의 아미노산 서열을 기초로하여 닭 성장호르몬 유전자를 다음과 같이 설계하였다.

(1) 성숙형의 닭 성장호르몬이 만들어지도록 시작 코오돈인 메티오닌의 다음이 성숙형 닭 성장호르몬의 아미노말단 아미노산인 트레오닌이 되도록 하고, 아울러 제한효소 NdeI의 인식부위(5-CATATG-3')을 갖도록 하였으며 ; (2) 카르복시말단은 성숙형 닭 성장호르몬의 카르복시말단 아미노산인 이소루이신에서 해독이 종료되도록 이소루이신 다음에 두개의 종료 코오돈 TAG와 TAA를 삽입하고, 동시에 발현벡터로의 클로닝을 용이하게 하기위하여 제한효소 SalI 인식부위(5'-GACGAC-3' )를 삽입하였으며, (3) 닭 성장호르몬 유전자내에 독특한 제한효소의 인식부위, 즉 제한효소 SacI 인식부위(5'-GAGCTC-3' ; 17번째 아미노산인 알지닌 위치), EcoRI 인식부위(5'-GAATTC-3' ; 31번째 아미노산인 글루탐산위치), BglII 인식부위(5'-GAGTCT-3' ; 115번째 아미노산인 아스파르산위치), HindIII 인식부위(5'-AAGCTT-3' ; 121번째 아미노산인 글루타민위치)를 갖도록 고안하여 닭 성장호르몬 유전자의 변환을 용이하게 할 수 있도록 하였으며, (4) 가능한 2차구조를 형성할 수 있는 요소를 제거함으로써 전사수준 및 해독수준에서의 닭 성장호르몬의 발현을 최적화시켜 주었다.

상기를 만족시킨 구체적인 닭 성장호르몬 유전자의 염기서열은 제1도에 개시한 바와 같다.

상기 닭 성장호르몬의 전체 유전자는 DNA 합성기를 이용한 합성법과 중합효소 연쇄반응(PCR : Polymerase Chain Reaction)등의 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있을 것이며, 구체적으로는 하기의 실시예에 의거하여 합성할 수 있다.

본 발명에서는 상기 닭 성장호르몬 유전자를 대장균에서 발현시키기 위해, 본 발명자들에 의해 대장균을 발현체로하여 성장호르몬을 발현시키는 것으로 밝혀진 대한민국 특허출원 제89-18190호(특허공고 제91-457호)에 개시된 ptrp322H-HGH(이 발현벡터 ptrp322H-HGH를 함유하는 대장균W3110은 한국종균협회에 KFCC-10667호로 기탁되어 있다)의 발현시스템을 이용하였다. 이는, ptrp322H-HGH의 인간 성장호르몬 유전자 대신에 제1도에 개시한 바와 같이 닭 성장호르몬 유전자를 대체시킴으로써 성취될 수 있다.

본 출원인은 상기와 같이 ptrp322H-HGH에서 인간 성장호르몬 유전자 대신에 제1도의 닭 성장호르몬 유전자를 대체시킨 닭 성장호르몬 발현벡터를 하기 실시예에 따라 제조하고 ptrp-CST라 명명하였다. 이 ptrp-CST를 대장균W3110(ATCC 27325)에 삽입시켜 1991년 6월 26일자로 부타페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 KCCM-10005호로 기탁하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 다음의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고 발명의 범위를 제한하지 않는다. 다음의 실시예에서 사용된 방법들은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.

[참조예 1 : 제한효소를 이용한 DNA의 절단]

사용된 제한효소와 반응 완충용액은 NEB(New England Biolabs., 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, U.S.A.)사로부터 구매하였으며, 멸균된 1.5ml 에펜돌프튜브에서 보통 반응부피가 50㎕에서 100㎕가 되도록 하였다. 반응은 37℃에서 1 내지 2시간동안 실시하였으며, 반응이 완료된 후에는 65℃에서 15분간 열처리 하거나 또는 내열성인 제한효소는 페놀 추출과 에탄올 침전법을 이용하여 불활성화 시켰다.

제한 효소반응에 사용하는 10배 완충용액의 조성은 다음과 같다.

[참조예 2 : 페놀 추출 및 에탄올 침전]

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한효소를 불활성화시키거나 DNA를 추출할 때 사용하였다. 페놀은 10mM트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA(ethylendiamineacetic acid) 용액으로 평형화시켜 사용하였다. 페놀 추출은 시료와 페놀을 1:1(부피/부피)의 비율로 섞고 강하게 흔들어 혼합시킨 후 원심분리(15,000rpm, 5분)시켜 상등액을 새 튜브로 옮기고, 동일 과정을 3회 반복한 다음, 동일 부피의 클로로포름(클로로포름과 이소부탄올 비율이 24:1인 용액)으로 추출하고 0.1부피의 3M 나트륨 아세테이트와 2.5배 부피의 에탄올을 가하여 -70℃에서 30분간 혹은 -20℃에서 약 12시간 정치한 후 원심분리(15,000rpm, 20분, 4℃)하여 DAN를 침전시켰다.

[참조예 3 : 연결 반응]

연결 효소 반응은 NEB사의 T4 DNA 리가제와 10배 리가제 완충용액(0.5M 트리스-HCl, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/ml BSA(소혈청 알부민), pH 7.8)을 사용하였으며, 보통 20㎕부피에서 10단위의 리가제를 사용하고, 평활말단을 갖는 DNA 연결은 100단위의 리가제를 사용하였다. 반응조건은 보통 16℃에서 적어도 5시간 이상 또는 4℃에서 14시간 이상 반응시켰으며 반응이 완료된 후에 65℃에서 15분간 가열하여 리가제를 불활성화 시켰다.

[참조예 4 : 대장균의 형질전환]

대장균 숙주세포로는 국제기탁기관에서 용이하게 입수할 수 있는 공지의 대장균인HB101(ATCC 33694), W3110(ATCC 27325) 또는 JM105(ATCC 47016)등을 사용하였다. 숙주세포를 100ml 액체 LB 배지(1％ 박토 트립톤, 0.5％ 효모추출물, 0.5％ 염화 나트륨)에 접종한 후 37°에서 650nm에서의 광학 밀도 값이 0.25 내지 0.5에 달할때까지 배양한 다응, 원심분리기로 세포들을 분리하였다. 그 침전물의 50ml의 0.1M 염화마그네슘 용액을 가하여 세척한 후 원심분리시키고 침전물에 다시 50ml의 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음위에서 30분간 정치시켰다. 이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일 용액 5ml에 균일하게 현탁시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 형질전환은 위에서 얻은 세포 현탁액중 0.2ml을 취한후 여기에 연결반응 혼합물10㎕을 가하여 0℃에서 40분간 정치시키고, 42℃에서 1분동안 열처리 한 후 2.0ml 액체 LB 배지를 가하여 37℃에서 1시간동안 배양한 다음, 50㎍/ml 앰피 실린을 함유하고 있는 고체 LB 배지에 도포하고 37℃에서 밤새 배양하였다. M13 벡터 DNA는 열처리 후 여기에 100㎕ JM105 세포, 15㎕ 100mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside), 25㎕ 4％ X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) 및 48％로 미리 데워놓은 3ml 2배 연성 고체 YT 배지(1％ NaCl, 1％ 효모추출물, 1.6％ 박토트립톤, 0.7％ 박토아가)를 가하고 잘 섞어 준 후 2배 고체 YT 배지(1％ 효모추출물, 1.6％ 박토트립톤, 1.5％ 박토아가)에 도포하였다.

[참조예 5 : 올리고뉴클레오티드의 합성]

올리고뉴클레오티드는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 캐미스트리(Solid Phase Phosphoamidite Chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, 380 B, U.S.A.)로 합성한 후, 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12％ 아크릴아미드 : 비스(29:1, w/w), 50mM 트리스, 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기영동으로 분리하고 C₁₈컬럼인 SEP-PAK(Waters Ins., U.S.A)에 부착시킨 후, 50:50(v/v)의 아세토니트릴 : 물 혼합액으로 용출하여 순수 정제하고, 260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6 : 중합효소 연쇄 반응(PCR)]

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎕의 10배 농도 타크 폴리머라제 완충 용액(10mM 트리스-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1％(w/v) 젤라틴, pH 8.3), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 프라이머 2㎍씩 (보통 2개의 프라이머를 사용하며, 3개의 프라이머를 동시에 사용할 때는 중간에 위치한 프라이머를 0.02㎍을 사용하였다), 0.5㎕의 앰플리타크(AmpliTaq) DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin-Elmer Cetus, USA)를 이용하였으며, 순환프로그램은 95℃ 1분 ; 55℃ 1분 ; 72℃ 2분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다.

폴리머라제를 제거하기 위하여 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하였다.

상층액을 새 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 나트륨 아세테이트, 2배 부피의 100％ 에탄올을 넣고 혼합한 후 원심분리하여 이중 나선의 헥산을 얻었다. 이 헥산을 20㎕의 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 녹인 후 다음 실험에 이용하였다.

[실시예 1]

닭 성장호르몬 유전자 염기서열의 설계

5' 말단에 NdeI 제한효소 인지부위를 3' 말단에 2개의 종료 코돈과 SalI 제한효소 인지부위를 포함하도록 다음과 같은 10개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.

올리고뉴클레오티드 CGH1은 5' 말단쪽에 제한효소 NdeI 인식부위 5'-CATATG-3'를 갖고 있으며, 3' 말단쪽에 20개의 염기가 올리고 뉴클레오티드 CGH2의 5' 말단 20개의 염기와 상보적이고, 올리고 뉴클레오티드 CGH3의 5' 말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 CGH4의 3' 말단의 20개 염기와 서로 상보적이며, 올리고뉴클레오티드 CHG5의 5' 말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 CGH6의 3' 말단의 20개 염기와 서로 상보적이고, 올리고뉴클레오티드 CGH7의 5'말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 CGH8의 3'말단의 20개 염기와 서로 상보적이며, 올리고뉴클레오티드 CGH9의 5' 말단의 20개 염기는 올리고뉴클레오티드 CGH10의 3' 말단의 20개 염기와 서로 상보적이다.

[실시예 2]

닭 성장호르몬 전체 유전자의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 제2도의 전략에 따라 중합효소 연쇄반응을 실시하여 닭 성장 호르몬 전체 유전자를 제조하였다.

먼저 제1차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.

반응튜브 A에 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH1, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH2, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH3, 및 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH4를 투입하고, 반응튜브 B에는 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH5, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH6, 0.02㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH7 및 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH8를 투입하고, 반응튜브 C에는 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH9 및 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH10를 투입하였다. 각 반응튜브에 10㎕의 10×타크 폴리머라제 완충용액(100mM Tris. Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1％(w/v)젤라틴), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP,dATP,dTTP,dCTP가 각각 1.25mM), 67㎕ 증류수에 0.5㎕(5 단위/㎕)의 앰플리타크 DNA 폴리머라제(Perkin-Elmer Cetus, U.S.A)를 넣고 잘 혼합시켰다. 온도 순환기(Perkin Elmer-Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃ 30초 ; 55℃ 30초 ; 72℃ 1분간의 순환을 4의 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응을 시켰다. 반응이 완료된 후 이 제1차 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동을 통해 분리하고 이를 일루팁(Elutip)으로 정제하여 20㎕의 TE 완충용액(10mM Tris. Cl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다.

이들 제1차 PCR 산물을 이용하여 제2차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.

반응튜브 D에 약 100ng의 반응튜브 A의 PCR 산물, 약 100ng의 반응튜브 B의 PCR 산물, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH1, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH8, 10㎕의 10×타크 폴리머라제 완충용액(100mM Tris.Cl, pH 8.3, 500mM MCl, 15mM MgCl₂, 0.1％(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 67㎕ 증류수에 0.5㎕(5단위/㎕)의 앰플리 타크 DNA 폴리머라제(Perkin Elmer-Ceyus, U.S.A.)를 넣고 잘 혼합하여 위와 동일한 조건으로 PCR 반응을 20회 실시하였다. 반응이 완료된 후 이 제2차 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 통해 분리한 후 이를 일루팁으로 정제하여 20㎕의 TE 완충용액에 용존시켰다.

이들 제2차 PCR 산물을 이용하여 제3차 PCR 반응을 다음과 같이 실시하였다.

반응튜브 E에 약 100ng의 반응튜브 D의 PCR 산물, 약 100ng의 반응튜브 C의 PCR 산물, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH1, 2㎍의 올리고뉴클레오티드 CGH10, 10㎕의 10×타크 폴리머라제 완충용액(10mM Tris.Cl, pH 8.3 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1％(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 67㎕의 증류수에 0.5㎕(5단위/㎕)의 앰플리 타크 DNA 폴리머라제(Perkin Elmer-Cetus, U.S.A.)를 넣고 잘 혼합하여 위와 동일한 조건으로 PCR 반응을 20회 실시하였다. 반응이 완료된 후 PCR 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 통해 분리한 후, 일루팁으로 정제하였다. 이렇게하여 얻어진 닭 성장 호르몬 전체 유전자(이하 이 단편을 단편 CGH라 칭한다)를 20㎕의 TE 완충용액에 용존시켰다.

[실시예 3]

발현벡터의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 닭 성장호르몬 전체 유전자를 이용하여 제3도에 도시한 방법에 따라 발현벡터를 제조하였다.

닭 성장호르몬 전체 유전자 약 2㎍을 총부피 50㎕에서 NEB 완충용액 4의 조건하에서 37℃에서 제한효소 NdeI(10단위)으로 절단한 후 페놀-클로로포름 추출법에 의해 추출한 뒤 에탄올 침전시켰다. 침전된 핵산을 5㎕ NEB 완충용액 3으로 용존시킨 다음, 다시 제한효소 SalI(10단위)으로 37℃에서 2시간 처리하였다. 한편, E.coli W3110(KFCC-10667)로부터 분리한 플라스미드 ptrp322H-HGH 2㎍을 상기와 동일한 방법에 따라 제한효소 PstI와 제한효소 SalI으로 처리하고 동일 플라스미드 2㎍을 제한효소 PstI과 제한효소 NdeI로 처리하여 각각 완전절단하였다. 이를 0.7％ 아가로오스겔로 분리하여 약 0.6Kb, 1.5Kb 및 0.8Kb 크기의 단편을 얻었다. 이하, 이들 단편을 각각 단편 CGH-N/L, 단편 PL, 단편 PN이라 칭한다.

상기에서 얻은 단편들을 다음과 같이 연결반응시켰다.

약 100ng의 단편 CGH-N/L, 100ng의 단편 PL, 약 100ng의 단편 PN, 2㎕의 10배 리가제 완충용액, 10단위의 T4 DNA 리가제와 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)을 형질전환시켜 닭 성장호르몬 유전자 단편을 함유하고 있는 ptrp-CST을 선별하고, 이들을 염기서열 결정용 시발체인 시발체 2090(5'-CATCACCGAAACGCGCGAG-3')와 시발체 ptrpl(5'-(GACAATTAATCATCGAACTA-3')를 사용하여 디데옥시 염기서열결정방법(5463(1977))에 따라 전체 닭 성장호르몬 유전자의 염기서열을 확인하였다.

[실시예 4]

대장균으로의 형질 전환 및 닭 성장호르몬 유전자 발현의 확인

상기 실시예 3에서 얻은 ptrp-CST를 함유하고 있는 플라스미드를 발현용 대장균인 W3110(ATCC 27325)에 형질전환시킨 후 이들을 50㎍/ml의 엠피실린이 함유된 액체 LB 배지(1％ 박토트립톤, 0.5％ 효모추출물, 0.5％ 염화나트륨)에서 12시간동안 진탕 배양하였다. 이중 5ml을 1ℓ의 M9의 배양액(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1％ 글루코스, 0.1mM MgSo₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4％ 카사미노산, 10㎍/ml VitB₁, 40㎍/ml 앰피실린)으로 옮긴 후 37℃에서 약 3-4시간동안 진탕 배양하여 대장균의 성장이 650nm에서 흡광도가 0.5 정도가 될때 여러가지 농도(0.1mM부터 시작하여 0.1mM씩 증가시켜 1.0mM까지)의 IAA(Indoleacrylic acid)를 첨가하여 닭 성장호르몬 유전자가 발현되도록 하였다. 또는 IAA 첨가없이 밤새 배양하여 닭 성장호르몬 유전자가 자동적으로 발현되도록 하였다.

IAA를 첨가하여 강제로 발현을 유도한 경우에는 IAA를 첨가한 지 약 5시간후에, 자동유도 하였을 때는 12시간에서 24시간이 경과한 후에, 세포배양액을 원심분리기(Beckman J6-B, Rotor JS 4.2)를 이용하여 3000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수집하였다. 세포 균질액을 라앰리의 방법(Laemmli,227, 680(1970)에 따라 소듐도데실설페이트의 존재하에 12％ 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하여 유전자산물의 발현을 확인하고 이를 제4도에 나타내었다.

제4도의 제1열과 제4열은 닭 성장호르몬 유전자를 함유하고 있지 않은 대장균의 단백질 젤 패턴이고, 제2열과 제3열 및 제5열은 ptrp-CST를 함유하고 있는 대장균으로, 제2열은 IAA의 첨가없이 배양을 시작한지 12시간에서, 제3열은 배양을 시작한지 24시간에서, 제5열은 강제유도시 IAA의 농도를 0.1mM로 했을때의 단백질젤 패턴이다.

제4도로부터 알 수 있는 바와 같이 제2열, 제3열 및 제5열에서는 22킬로달톤 위치에서 뚜렷한 밴드가 나타났는바, 닭 성장호르몬이 전체 대장균 단백질의 30％ 이상에 해당하는 양으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

상기 실시예는 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 갖는 전문가에게 자명한 방법으로 변형되어 수행될 수 있으며 이러한 변형은 당연히 본 발명의 범주를 벗어나지 않는다.

Claims

제1도의 염기 서열을 갖는 닭 성장호르몬 유전자.
제1항의 닭 성장호르몬 유전자를 함유하는 발현벡터.
제2항에 있어서, ptrp-CST.
제1도의 염기서열을 갖는 닭성장 호르몬 유전자를 함유하는 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균.
제4항에 있어서, ptrp-CST에 의해 형질전환된 대장균W3110(KCCM-10005).
제1도의 염기서열을 갖는 닭성장 호르몬 유존자를 함유하는 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균을 배양함을 포함하는 닭성장 호르몬의 제조방법.