JP2016053031A - 反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体 - Google Patents
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Abstract
【課題】結合タンパク質の集合体を構築するための新規アプローチを同定する方法の提供。【解決手段】天然反復タンパク質ファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体をコードする核酸分子の集合体からの反復タンパク質。そのような集合体の構築および適用方法、ならびにそのような集合体の個々のメンバーに関する。(a)反復単位を同定する段階、(b)反復単位の配列分析および構造分析によって、反復配列モチーフを精密化する段階、(c)(b)の反復配列モチーフを含むように反復モジュールを構築する段階【選択図】図18
Description
本発明は、天然反復タンパク質の一つのファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子の集合体、そのような集合体の構築および適用方法、ならびにそのような集合体の個々のメンバーに関する。
本明細書において多くの文献を引用する。これらの文献の開示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
タンパク質-タンパク質相互作用、またはより一般的に、タンパク質-リガンド相互作用は、全ての生物において重要な役割を果たしており、認識および結合の重要な特徴を理解することは、現在の生化学研究の一つの焦点となっている。現在まで、作製された任意の抗体および誘導体が、この研究領域において主に用いられている。しかし、抗体技術は周知の欠点を有する。例えば、抗体は細胞質が還元的環境であるために細胞内にほとんど適用できない。このように、抗体の制限を克服する特徴を有する高親和性結合分子が必要である。そのような分子は、医学、バイオテクノロジー、および研究において新しい解決策となる可能性が最も高く、細胞内結合剤も同様に、ゲノム学においてますます重要になりつつある。
新規結合タンパク質を構築するための様々な活動が報告されている(NygrenおよびUhlen、1997)。最も有望な戦略は、限定されたライブラリ作製と、所望の特性のスクリーニングまたは選択との組み合わせであるように思われる。通常、結晶構造の分析後いくつかの露出したアミノ酸残基を無作為化するために、既存の足場構造が加えられた。しかし、安定性および発現性に関する進歩にもかかわらず、これまで報告されている親和性は抗体の親和性よりかなり低い(KuおよびSchultz、1995)。拘束は、それに対する結晶構造が既知である(Kirkhamら、1999)標的、または当初の標的分子と相同である標的に対する制限である可能性があるため、結合のための普遍的な足場はこれまで同定されていない。スクリーニング後に結合物質の見かけの親和性を増加させるために、いくつかのアプローチは、結合活性効果を利用するために単一の結合剤の多量体化を用いた。
したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、結合タンパク質の集合体を構築するための新規アプローチを同定することである。この技術的問題の解決は、請求の範囲に特徴を示す態様を提供することによって得られる。したがって、本発明によって、反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体を構築することができる。本発明の技術的アプローチ、すなわち、天然反復タンパク質の反復単位から上記のモジュールを誘導することは、先行技術において提供されておらず、示唆もされていない。
したがって、本発明は、それぞれの反復タンパク質が連続した反復モジュールの組を含む反復ドメインを含み、反復モジュールのそれぞれが天然反復タンパク質の一つのファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来し、上記の反復単位が骨格残基および標的相互作用残基を含み、上記の反復タンパク質が、上記の標的相互作用残基の一つに対応する少なくとも一つの位置で異なる、反復タンパク質の集合体をコードする核酸分子の集合体に関する。
本発明の意味において、「集合体」という用語は、少なくとも二つの異なる実体またはメンバーを含む集団を意味する。好ましくは、そのような集合体は、少なくとも105個、より好ましくは107個、および最も好ましくは109個以上の異なるメンバーを含む。「集合体」は、「ライブラリ」または「複数(plurarity)」と呼んでもよい。
「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかであるリボ核酸(RNA)、またはデオキシリボ核酸(DNA)分子であるポリヌクレオチド分子を意味する。核酸分子は、単離型で存在してもよく、または組み換え型核酸分子もしくはベクターに含まれてもよい。
「反復タンパク質」という用語は、一つまたは複数の反復ドメインを含む(ポリ)ペプチド/タンパク質を意味する(図1)。好ましくは、上記の反復タンパク質のそれぞれは、最大4個の反復ドメインを含む。より好ましくは、上記の反復タンパク質のそれぞれは、最大2個の反復ドメインを含む。しかし、最も好ましくは、反復タンパク質のそれぞれは、一つの反復ドメインを含む。さらに、上記の反復タンパク質は、さらに非反復タンパク質ドメイン(図2aおよび図2b)、(ポリ)ペプチドタグおよび/または(ポリ)ペプチドリンカー配列(図1)を含んでもよい。「(ポリ)ペプチドタグ」という用語は、上記アミノ酸配列が、上記の(ポリ)ペプチド/タンパク質の精製、検出、もしくはターゲティングのために利用できる、または上記のアミノ酸配列が上記の(ポリ)ペプチド/タンパク質の物理化学的挙動を改善する、または上記のアミノ酸配列がエフェクター機能を有する、(ポリ)ペプチド/タンパク質に結合したアミノ酸配列を意味する。そのような(ポリ)ペプチドタグは、小さいポリペプチド配列、例えばHisn(Hochuliら、1988;Lindnerら、1992)、myc、FLAG(Hoppら、1988;KnappikおよびPluckthun、1994)、またはストレップ(Strep)タグ(SchmidtおよびSkerra、1993;SchmidtおよびSkerra、1994;Schmidtら、1996)であってもよい。これらの(ポリ)ペプチドタグは全て、当技術分野で周知であり、当業者に十分に利用可能である。さらなる非反復ドメインはさらに、上記の反復タンパク質の検出を可能にする酵素(例えば、アルカリホスファターゼのような酵素)のような部分、またはターゲティングのためおよび/またはエフェクター分子として用いることができる(免疫グロブリンまたはその断片)部分であってもよい。反復タンパク質の個々のポリペプチドタグ、部分および/またはドメインは、互いに直接または(ポリ)ペプチドリンカーを通して結合してもよい。「(ポリ)ペプチドリンカー」という用語は、例えば、二つのタンパク質ドメイン、(ポリ)ペプチドタグとタンパク質ドメインまたは二つの配列タグを結合することができるアミノ酸配列を意味する。そのようなリンカー、例えば多様な長さのグリシン-セリンリンカー(例えば、ForrerおよびJaussi、1998)は、関連する技術分野の当業者に既知である。
本発明の意味において、「(ポリ)ペプチド」という用語は、多数、すなわちペプチド結合によって結合した二つまたはそれ以上のアミノ酸の一つまたは複数の鎖からなる分子を意味する。
「タンパク質」という用語は、(ポリ)ペプチドの少なくとも一部がその(ポリ)ペプチド鎖(複数)の内部、および/またはあいだで二次構造、三次構造、または四次構造を形成することによって既定の三次元配置を有する、または獲得することができる(ポリ)ペプチドを意味する。タンパク質が二つまたはそれ以上の(ポリ)ペプチドを含む場合、個々の(ポリ)ペプチド鎖は、非共有結合または共有結合によって、例えば二つの(ポリ)ペプチド間のジスルフィド結合によって結合してもよい。二次または三次構造を形成することによって、既定の三次元配置を個々に有するまたは獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、関連技術分野の当業者に周知である。
「天然反復タンパク質ファミリー」という用語は、上記の群のメンバーが類似の反復単位を含む、天然タンパク質の群を意味する。タンパク質ファミリーは、当業者に周知である。
「反復ドメイン」という用語は、上記の構造単位が同じ折り畳みを有し、きちんと積み重ねられてジョイント疎水性コアを有する高次らせん構造を作製する、構造単位として二つまたはそれ以上の連続した反復単位(モジュール)を含むタンパク質ドメインを意味する(概説として、KobeおよびKajava、2000を参照のこと)(図1)。「構造単位」という用語は、(ポリ)ペプチド鎖に沿って互いに近位である二次構造の二つまたはそれ以上のセグメント間の三次元相互作用によって形成された(ポリ)ペプチドの局所的に構築された部分を意味する。そのような構造単位は構造モチーフを含む。「構造モチーフ」という用語は、少なくとも一つの構造単位に存在する二次構造エレメントの三次元配置を意味する。例えば、LRRタンパク質に繰り返し存在する構造モチーフは、β鎖と、ループによって結合した反対の逆平行らせんセグメントとで構成される(図4a)。構造モチーフは、関連技術分野の当業者に周知である。上記の構造単位のみでは、既定の三次元配置を獲得できないが、反復ドメインにおいて反復モジュールとしてそれらが連続して配置されると、隣接単位の相互安定化が起こり、上記の高次らせん構造が得られる。
「反復モジュール」という用語は、天然タンパク質の反復単位(図3)に由来する、本発明の集合体の核酸分子によってコードされる反復タンパク質の反復アミノ酸配列を意味する。反復ドメインに含まれるそれぞれの反復モジュールは、天然反復タンパク質の一つのファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来する。
そのような「反復モジュール」は、アミノ酸残基が反復モジュールの全てのコピーに存在する位置(「固定位置」)、およびアミノ酸残基が異なるまたは「無作為化された」位置(無作為位置)を含んでもよい。
「反復モジュールの組」という用語は、反復ドメインに存在する反復モジュールの総数を意味する。反復ドメインに存在するそのような「反復モジュールの組」は、二つまたはそれ以上の連続した反復モジュールを含み、二つもしくはそれ以上のコピーにおいて反復モジュールの一種類のみ、またはそれぞれが一つもしくはそれ以上のコピーに存在する二つもしくはそれ以上の異なる種類のモジュールを含んでもよい。本発明による反復タンパク質の集合体は、対応する反復ドメイン1個あたり同数の反復モジュールを有する反復ドメインを含んでもよく(すなわち、反復モジュールの固定数を有する一つのセット)、または対応する反復ドメイン1個あたりの反復モジュールの数が異なる(すなわち、反復モジュールの異なる数を含む二つまたはそれ以上の組)反復ドメインを含んでもよい。
好ましくは、組に含まれる反復モジュールは、相同な反復モジュールである。本発明の意味において、「相同な反復モジュール」という用語は、70%を上回る上記の反復モジュールの骨格残基が相同である反復モジュールを意味する。好ましくは、80%を上回る上記の反復モジュールの骨格残基が相同である。最も好ましくは、90%を上回る上記の反復モジュールの骨格残基が相同である。Fasta、BlastまたはGapのようなポリペプチド間の相同性の百分率を決定するためのコンピュータープログラムは、関連技術分野の当業者に既知である。
好ましくは、本発明の反復モジュールは一つの反復単位に由来する。これは、それぞれの分子が本発明の反復ドメインをコードする核酸分子の集合体が、天然反復ドメインをコードする核酸分子のランダム変異誘発によって得られる状況を意味してもよい。このように、本発明の上記の反復ドメインは、上記のモジュールのそれぞれが上記の天然反復ドメインの対応する反復単位に由来する、反復モジュールの組を含む。エラープローン(error-prone)PCR(WilsonおよびKeefe、2000)またはDNAシャッフリング(VolkovおよびArnold、2000)のような核酸分子のランダム変異誘発のための方法は、関連技術分野の当業者に周知である。もう一つの状況において、単一の天然反復単位を用いて、本発明の反復配列モチーフを誘導してもよい。
より好ましくは、本発明の反復モジュールは、一つまたは複数の反復単位に由来する。これは、それぞれが天然反復ドメインをコードする二つまたはそれ以上の相同な核酸分子に、DNA組み換えまたはランダムキメラ誘発を行う状況を意味してもよい(VolkovおよびArnold、2000)。このように、本発明の上記の反復ドメインは、上記のモジュールのそれぞれが上記の相同な天然反復ドメインの一つまたは複数の対応する反復単位に由来する、反復モジュールの組を含む。好ましくは、上記の相同な核酸分子は、少なくとも75%のDNA配列同一性を有する。より好ましくは、上記の配列同一性は少なくとも85%である。
最も好ましくは、本発明の反復モジュールは、二つまたはそれ以上の反復単位を用いて本発明の反復配列モチーフを誘導する、二つまたはそれ以上の反復単位に由来する。そのような誘導プロセスを実施例に示す。
「一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュール」という用語は、以下を意味する:
(i)ランダム変異誘発、例えば、反復単位をコードする核酸分子のエラープローンPCRによって、反復モジュールをコードする核酸分子を作製する段階を含むプロセス;
または
(ii)それぞれが反復単位をコードする二つもしくはそれ以上の相同な核酸分子のランダムキメラ誘発によって、反復モジュールをコードする核酸分子を作製する段階を含むプロセス;
または
(iii)天然反復タンパク質の一つもしくは複数の反復単位の分析と、反復モジュールの推定とを含むプロセス。このプロセスは以下の段階を含んでもよい:
(a)天然反復単位を同定する段階;
(b)配列アラインメントによって最初の反復配列モチーフを決定する段階;
(c)上記の反復単位の配列分析および構造分析によって、反復配列モチーフを精密化する段階;
(d)(c)の反復配列モチーフに従って反復モジュールを構築する段階;
または
(iv)(i)、(ii)、もしくは(iii)のプロセスの後にランダム変異誘発もしくはランダムキメラ誘発によって反復モジュールのさらなる考案を含むプロセス。
(i)ランダム変異誘発、例えば、反復単位をコードする核酸分子のエラープローンPCRによって、反復モジュールをコードする核酸分子を作製する段階を含むプロセス;
または
(ii)それぞれが反復単位をコードする二つもしくはそれ以上の相同な核酸分子のランダムキメラ誘発によって、反復モジュールをコードする核酸分子を作製する段階を含むプロセス;
または
(iii)天然反復タンパク質の一つもしくは複数の反復単位の分析と、反復モジュールの推定とを含むプロセス。このプロセスは以下の段階を含んでもよい:
(a)天然反復単位を同定する段階;
(b)配列アラインメントによって最初の反復配列モチーフを決定する段階;
(c)上記の反復単位の配列分析および構造分析によって、反復配列モチーフを精密化する段階;
(d)(c)の反復配列モチーフに従って反復モジュールを構築する段階;
または
(iv)(i)、(ii)、もしくは(iii)のプロセスの後にランダム変異誘発もしくはランダムキメラ誘発によって反復モジュールのさらなる考案を含むプロセス。
「反復単位」という用語は、上記の「反復単位」が多数のコピーで存在し、タンパク質の折り畳みを決定する上記のモチーフ全てに対して共通の既定の折り畳み位相学を示す、一つまたは複数の天然タンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を意味する。そのような反復単位は、骨格残基(図4d)と相互作用残基(図4e)とを含む。そのような反復単位の例には、ロイシンリッチ反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、HEAT反復単位、およびロイシンリッチ変種反復単位(KobeおよびDeisenhofer、1994;GrovesおよびBarford、1999;Marinoら、2000;Kobe、1996に論評されている)が含まれる。二つまたはそれ以上のそのような反復単位を含む天然タンパク質は、「天然反復タンパク質」と呼ばれる。反復タンパク質の個々の反復単位のアミノ酸配列は、互いに比較した場合に有意な数の変異、置換、付加、および/または欠失を有してもよいが、反復単位の一般的パターン、またはモチーフをなおも実質的に保持している。
好ましくは、反復配列モチーフを推定するために用いられる反復単位は、反復単位が同じ構造モチーフを含み、70%を上回る上記の反復単位の骨格残基が相同である、相同的反復単位である。好ましくは、80%を上回る上記の反復単位の骨格残基が相同である。最も好ましくは、90%を上回る上記の反復単位の骨格残基が相同である。
「反復配列モチーフ」という用語は、一つまたは複数の反復配列から推定されたアミノ酸配列を意味する。そのような反復配列は骨格残基の位置および標的相互作用残基の位置を含む。上記の骨格残基は、上記の反復単位の骨格残基の位置に対応する。上記の標的相互作用残基の位置は、上記の反復配列の標的相互作用残基の位置に対応する。そのような反復配列モチーフは、固定位置と無作為化位置とを含む。「固定位置」という用語は、上記の位置が特定のアミノ酸に設定される、反復配列モチーフにおけるアミノ酸の位置を意味する。そのような固定位置は、骨格残基の位置に対応することが最も多い。「無作為化位置」という用語は、二つまたはそれ以上のアミノ酸が上記のアミノ酸位置で容認される反復配列モチーフにおけるアミノ酸位置を意味する。そのような無作為化位置は、標的相互作用残基の位置に対応することが最も多い。しかし、骨格残基のいくつかの位置も同様に無作為化してもよい。アミノ酸配列モチーフは関連技術分野の当業者に周知である。
「折り畳み位相学」という用語は、上記の反復単位の三次元構造を意味する。折り畳み位相学は、αヘリックスもしくはβシートの少なくとも一部を形成するアミノ酸の枝、直鎖ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸の枝、またはαヘリックス、βシート、および/もしくは直鎖状のポリペプチド/ループの任意の組み合わせによって決定されうる。
「連続」という用語は、上記のモジュールが縦列に配置される配置を意味する。
反復タンパク質において、少なくとも2個、通常は約2個〜6個、より通常は少なくとも約6個、しばしば20個またはそれ以上の反復単位が存在する。たいていの場合、反復タンパク質は、原核細胞ならびに脊椎動物および無脊椎動物を含む真核細胞に存在する構造タンパク質および/または接着タンパク質である。アンキリンタンパク質が抗体に類似していることが示唆されている(JacobsおよびHarrison、1998)。
ほとんどの場合、上記の反復単位は、高度の配列同一性(対応する位置に同じアミノ酸残基)または配列類似性(アミノ酸残基が異なるが類似の物理化学特性を有する)を示し、アミノ酸残基のいくつかは、天然タンパク質に認められる異なる反復単位において強く保存されている重要な残基である可能性がある。
しかし、天然タンパク質に認められる異なる反復配列単位におけるアミノ酸の挿入および/または欠失、および/または置換による高度の配列多様性は、共通の折り畳み位相学が維持される限り可能であると考えられる。
X線結晶学、NMR、CD分光法のような物理化学的手段によって反復タンパク質の折り畳み位相学を直接決定する方法は、関連技術分野の当業者に周知である。反復単位もしくは反復配列モチーフを同定して決定する方法、または相同性検索(BLAST等)のような、そのような反復単位もしくはモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定する方法は、生体情報学の分野において十分に確立されており、そのような技術分野の当業者に周知である。最初の反復配列モチーフを精密化する段階は、反復プロセスを含んでもよい。
アンキリン型反復(Bork、1993;Huxfordら、1998、図2gおよび図2hを参照のこと)の結晶構造、ロイシンリッチ反復配列(LRR)スーパーファミリー(KobeおよびDeisenhofer、1993、図2cを参照のこと)および他のLRRタンパク質(図2d〜図2fを参照のこと)のリボヌクレアーゼ阻害剤(RI)の結晶構造が報告されている。これらの構造を詳しく調べたところ、アンキリン反復の場合には伸張した形状、またはロイシンリッチ反復の場合には馬蹄形であり、極めて大きい表面を生じることが判明した。
「骨格残基」という用語は、折り畳み位相学に関与する、すなわち上記の反復単位(もしくはモジュール)の折り畳みに関与する、または隣接する単位(もしくはモジュール)の相互作用に関与する、反復単位のアミノ酸残基または対応する反復モジュールの対応するアミノ酸残基を意味する。そのような関与は、反復単位(モジュール)における他の残基との相互作用(4d)であってもよく、またはαヘリックスもしくはβシート、または直鎖状のポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸の枝に認められるポリペプチド骨格配座に及ぼす影響であってもよい。「標的相互作用残基」という用語は、標的物質との相互作用に関与する反復単位のアミノ酸残基または反復モジュールの対応するアミノ酸残基を意味する。そのような関与は、標的物質との直接相互作用であってもよく(図4e)、または例えば、上記の直接相互作用残基と上記の標的との相互作用を可能にするまたは増強するために、上記の反復単位(モジュール)の(ポリ)ペプチドの配座を安定化させることによる他の直接相互作用残基に対する影響であってもよい。そのような骨格および標的相互作用残基は、先に述べた物理化学的方法によって得られる構造データの分析によって、または構造生物学および/または生体情報学における当業者に周知の既知の関連構造情報と比較することによって同定してもよい。
「上記の標的物質との相互作用」という用語は、標的に対する結合、上記の標的の構造変化もしくは化学反応への関与、または上記の標的の活性化であってもよいがこれらに限定されない。
「標的」は、核酸分子、(ポリ)ペプチドタンパク質、糖質、または他の天然分子の任意の一部、またはそのような分子の二つもしくはそれ以上の複合体を含む、そのような個々の分子であってよい。標的は、細胞全体もしくは組織試料であってもよく、または天然に存在しない分子もしくは部分であってもよい。
「少なくとも一つの位置で異なる」という用語は、一つ以上のアミノ酸が認められる少なくとも一つの位置を有する反復タンパク質の集合体を意味する。好ましくは、そのような位置は無作為化される。「無作為化」という用語は、集合体内で可変であり、集合体において一つ以上のアミノ酸残基によって占有される反復モジュールの位置を意味する。好ましくは、無作為化位置は、一つの反復ドメイン内の反復モジュール間でさらに変化する。好ましくは、そのような位置は完全に無作為化してもよい、すなわち天然タンパク質を形成するアミノ酸残基の完全な組によって占有されてもよい。より好ましくは、そのような位置は部分的に無作為化してもよく、すなわち天然タンパク質を形成するアミノ酸残基の完全な組のサブセットによって占有されてもよい。アミノ酸残基のサブセットは、疎水性、親水性、酸性、塩基性、芳香族、もしくは脂肪族アミノ酸の組のような共通の物理化学的特性を有するアミノ酸残基の組、システインもしくはプロリンを含まない組のような特定の望ましくないアミノ酸残基を除き全てを含むサブセット、または天然反復タンパク質における対応する位置で認められる全てのアミノ酸残基を含むサブセットであってもよい。無作為化は、標的相互作用残基のいくつか、好ましくは全てに適用してもよい。上記の反復タンパク質をコードする核酸配列のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いることによる(例えば、モノヌクレオチドまたはトリヌクレオチドの混合物を用いることによって)(Virnekasら、1994)ような、または上記の核酸配列の合成の際のエラープローンPCRを用いることによるような、「無作為化」反復タンパク質を作製する方法は当業者に周知である。
好ましい態様において、上記の反復モジュールのそれぞれがアミノ酸配列を有し、少なくとも70%のアミノ酸残基が
(i)少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基;
または
(ii)天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する。
(i)少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基;
または
(ii)天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する。
「コンセンサスアミノ酸残基」は、先に定義したように決定された構造および/または配列相同性に基づいて、二つまたはそれ以上の反復単位を整列化することによって、および上記の単位におけるそれぞれの位置に関して最も頻繁なアミノ酸残基の一つを同定することによって(例を図5aおよび図5bに示す)発見してもよい。上記の二つもしくはそれ以上の反復単位は、単一の反復タンパク質に含まれる反復単位から得てもよく、または二つもしくはそれ以上の反復タンパク質から得られうる。二つまたはそれ以上のアミノ酸残基が上記の二つまたはそれ以上の反復単位において類似の確率で認められれば、コンセンサスアミノ酸は、最も頻繁に認められるアミノ酸の一つ、または上記の二つもしくはそれ以上のアミノ酸残基の組み合わせであるかも知れない。
上記の組が2個〜約30個の反復モジュールからなる集合体が、さらに好ましい。
6個〜約15個の反復モジュールからなる組が、より好ましい。
本発明のさらにより好ましい態様において、上記の反復モジュールは直接結合している。
本発明の意味において、「直接結合する」という用語は、介在アミノ酸が存在しない反復タンパク質における直接の反復として配置される反復モジュールを意味する。
さらにより好ましい態様において、上記の反復モジュールは(ポリ)ペプチドリンカーによって結合される。
したがって、反復モジュールは、個々のモジュールを分離する介在配列としての(ポリ)ペプチドリンカーによって間接的に結合してもよい。「介在配列」は、折り畳み位相学またはモジュールの積み重ねを妨害しない個々のモジュールに結合させる任意のアミノ酸配列であってよい。選択的に、上記の介在配列は、アミノ酸残基10個未満、さらにより好ましくは5個未満の短い(ポリ)ペプチドリンカーである。
本発明の集合体のさらにより好ましい態様において、各反復タンパク質のそれぞれは、上記の反復モジュールのいずれか一つと異なるアミノ酸配列を有するN末端および/またはC末端キャッピングモジュール(図1)をさらに含む。
「キャッピングモジュール」という用語は、上記のキャッピングモジュールが上記の反復モジュールと堅固な三次相互作用を形成して、それによって連続する反復モジュールに接していない側の上記の反復モジュールの疎水性コアを溶媒から保護するキャップを提供する、反復ドメインのN末端またはC末端反復モジュールに融合したポリペプチドを意味する(図1)。
上記のN末端および/またはC末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位(図3)、または天然反復タンパク質において反復単位に隣接して認められる他のドメインであってもよく、またはそれらに由来してもよい。「キャッピング単位」という用語は、上記の(ポリ)ペプチドが反復単位にN末端またはC末端で融合する特定の構造単位を定義する、上記の(ポリ)ペプチドが上記の反復単位と堅固な三次相互作用を形成して、それによって、上記の反復単位の一つの側の疎水性コアを溶媒から保護するキャップを提供する、天然の折り畳まれた(ポリ)ペプチドを意味する。そのようなキャッピング単位は、上記の反復配列モチーフに対して配列類似性を有してもよい。
好ましい態様において、本発明は、上記の反復単位がアンキリン反復単位である、核酸分子の集合体に関する。
アンキリン反復タンパク質の特徴は論評されており(SedgwickおよびSmerdon、1999)、一つの最小の折り畳み単位が調べられている(ZhangおよびPeng、2000)。アンキリン反復タンパク質は、ある程度詳細に調べられており、このデータを用いて本発明による反復タンパク質の構築を例示することができる。
アンキリン反復タンパク質は、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、および線虫(Caenorhabditis elegans)におけるそのような四つのタンパク質のあいだの配列比較によって1987年に同定された。ブリーデン(Breeden)およびナスミス(Nasmyth)は、swi6p、cdc10p、notchおよびlin-12の配列においておよそ33残基の反復単位の多数のコピーを報告した(BreedenおよびNasmyth、1987)。アンキリンタンパク質におけるこの反復単位の24コピーがその後発見されたことによって、この反復単位の名称はアンキリン反復となった(Luxら、1990)。後に、この反復単位は、異なる生物およびウイルスの数百ものタンパク質において同定された(Bork、1993;SMARTデータベース、Schultzら、2000)。これらのタンパク質は核、細胞質、または細胞外間隙に存在する。このことは、これらのタンパク質のアンキリン反復ドメインがジスルフィド架橋とは無関係であること、そしてこのように環境の酸化状態とは無関係であるという事実と一致する。タンパク質当たりの反復単位の数は、2個〜20個を上回る(SMARTデータベース、Schultzら、2000)。安定な折り畳まれたドメインを形成するために、最小数の反復単位が必要であるように思われる(ZhangおよびPeng、2000)。一方、一つの折り畳まれたドメインに存在する6個の反復単位の上限に関しても何らかの証拠がある(MichaelyおよびBennet、1993)。
これまでに決定されたアンキリン反復単位の三次構造は、二つの逆平行αヘリックスが続き、反復単位を次の反復単位に結合するループで終わるβ-ヘアピンからなる共通の折り畳み構造(SedgwickおよびSmerdon、1999)を共有する(図4c)。アンキリン反復単位で構築されるドメインは、反復単位を積み重ねて、より伸張した湾曲した構造を形成することによって形成される。これは、図2hにおけるマウスGA結合タンパク質β1サブユニットの構造によって説明される。
アンキリン反復ドメインを含むタンパク質は、しばしばさらなるドメインを含む(SMARTデータベース、Schultzら、2000)。後者のドメインは、多様な機能を有するが、アンキリン反復タンパク質ドメインの機能は、いくつかの例が示すように最もしばしば他のタンパク質との結合である(Batchelorら、1998;GorinaおよびPavletich、1996;Huxfordら、1999;JacobsおよびHarrison、1999;Jeffreyら、2000)。これらのタンパク質の反復単位を分析する場合、標的相互作用残基は主にβヘアピンおよび第一のαヘリックスの露出した一部において認められる(図4c)。したがって、これらの標的相互作用残基は、アンキリン反復ドメイン上で大きい接触表面を形成する。この接触表面は、αヘリックス1、αヘリックス2およびループの積み重ね単位の骨格構築上で露出している(図4c)。反復単位5個からなるアンキリン反復タンパク質に関して、他のタンパク質に接触するこの相互作用表面は、約1200Å2である。そのような大きい相互作用表面は、標的分子に対する高親和性を得るために都合がよい。例えば、IkBa(アンキリン反復単位6個のドメインを含む)のNF-κBヘテロダイマーに対する親和性は、KD=3nM(Malekら、1998)であるのに対し、ヒトGA結合タンパク質β1の、そのα単位に対する解離定数はKD=0.78 nMである(Suzukiら、1998)。広く用いられている抗体と比較して、本発明によるアンキリン反復タンパク質を用いる長所は、それらが可溶性の、単量体で安定な分子として大量に組み換え型で発現できるという点である(実施例2)。
上記の反復モジュールのそれぞれが、以下のアンキリン反復コンセンサス配列を含む集合体がさらに好ましい:
式中、「x」は、任意のアミノ酸を意味し、「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味し、「a」は、無極性側鎖を有するアミノ酸を意味し、および「p」は、極性側鎖を有する残基を意味する。「x」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている集合体が最も好ましい。
式中、「x」は、任意のアミノ酸を意味し、「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味し、「a」は、無極性側鎖を有するアミノ酸を意味し、および「p」は、極性側鎖を有する残基を意味する。「x」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている集合体が最も好ましい。
上記の反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、多様な集合体がさらにより好ましい:
式中、1は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
式中、2は、H、NおよびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
式中、1は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し;
式中、2は、H、NおよびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
さらに好ましい態様において、本発明は、上記の反復単位がロイシンリッチ反復(LRR)である核酸分子の集合体に関する。
LRR反復の特徴および特性は論評されている(KobeおよびDeisenhofer、1994)。LRRタンパク質はある程度詳細に研究されており、そのデータを用いて反復タンパク質の挙動を例示することができる。
LRRタンパク質は、2位、5位、7位または12位でロイシンまたは他の疎水性残基の高度に保存されたコンセンサスによって同定されている(図4b)。しかし、このアミノ酸分布パターンの重要性は、LRRの最初の構造であるリボヌクレアーゼ阻害剤タンパク質が溶解している場合に限って理解されていた(図2c)。最近、さらなるLRR結晶構造が解明されている(図2d〜図2f)。典型的なアンキリン反復ドメインタンパク質の構造を比較のために示す(図2g)。単一のLRRは常に、ロイシンまたは他の脂肪族残基のみからなるコアを取り巻く(Kajava、1998)β鎖および逆平行αヘリックス(独自のα/β襞、図4a)に対応すると仮定されている。リボヌクレアーゼ阻害剤(RI)であるLRRタンパク質の全体的な形状は、A型(アミノ酸29個)とB型(アミノ酸28個)が厳密に交互する縦列の相同な反復15個によって形成された馬蹄形である(図2c)と記述されうる。タンパク質の交互の特性は、配列が分析された時期に既に認識されていた(図5a(Leeら、1988))。
興味深いことに、哺乳類のRIはその標的タンパク質に対する極端な親和性を特徴とする。ヒトRIに対するRNaseAの結合に関して、Ki=5.9×10-14 M(KobeおよびDeisenhofer、1996)が報告されているが、アンジオゲニンは、ブタRIによってKi=7.1×10-16 Mで阻害され、このように、これはタンパク質間で既知の最も強力な相互作用の一つとなることが判明した。最もよく結合する抗体でさえも、親和性の特徴は1.5×10-11 Mまでである(Yangら、1995)。顕著な親和性をよりよく理解するために、二つのRIをその標的タンパク質と共に同時結晶した。結晶構造のその後の分析によって、相互作用が主に静電気的であり(KobeおよびDeisenhofer、1996)、関係するアミノ酸は主に内側のβシートおよび各単位をそのαヘリックスに結合させるループから出ていることが主に認められた(図4b、KobeおよびDeisenhofer、1995)。その上、馬蹄形の襞の幅は、標的タンパク質に適応するようにわずかに変化することができる(KobeおよびDeisenhofer、1994)。標的と阻害剤との界面は、相互作用の「パッチワーク」からなり、堅固な会合は、標的タンパク質が馬蹄形内部に結合している場合、形状の相補性よりむしろ埋もれた大きい表面積(約2550A2)に由来する(KobeおよびDeisenhofer、1996)。
RIに対するRNaseAとアンジオゲニン(わずか30%の配列同一性を有する二つの分子)の詳細な結合を比較すると、有意な差が明らかとなった(ChenおよびShapiro、1997)。RIの側ではほぼ同じ残基が関係しているが、標的タンパク質の残基は、相同ではないか、または異なる種類の結合を用いた(Papageorgiouら、1997)。言い換えれば、RIは、残基の最適な相補性よりむしろ正しい幾何学的方向に提示される多数の接触に基づいて、異なる標的分子にそれを結合させて、それを阻害させるように進化した。これは、新しい結合特異性を有する新しい結合分子を設計するための基礎である。形状は大きい表面を認識するように予め運命が決まっているように思われ、それによって抗体の比較的小さい「可変の」ドメインと比較して、はるかに多様なランダムアミノ酸にライブラリを作製させることができる。しかし、抗体のループは、小さいハプテンまたは深い溝を認識しなければならない場合には、優れているように思われる。さらに、反復そのものを変化させることができるのみならず、その数も標的分子に依存しうる。
上記のモジュールのそれぞれが以下のLRRコンセンサス配列を含む集合体が、さらに好ましい:
式中、「x」は、任意のアミノ酸を意味し、「a」は脂肪族アミノ酸、および「±」
は任意のアミノ酸または欠失を意味する。
式中、「x」は、任意のアミノ酸を意味し、「a」は脂肪族アミノ酸、および「±」
は任意のアミノ酸または欠失を意味する。
「脂肪族アミノ酸」という用語は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンの一覧から得られるアミノ酸を意味する。
「x」および/または「±」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている集合体が最も好ましい。
A型LRRコンセンサス配列における10位のシステイン残基が親水性のアミノ酸残基に置換され、17位のシステイン残基が疎水性アミノ酸残基に置換されている集合体がさらに好ましい。
親水性アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、およびアスパラギンのリストから得られうる。
疎水性アミノ酸残基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのリストから得られうる。
一本鎖Fvまたは従来の抗体と比較すると、いくつかの長所を列挙することができる。ジスルフィド架橋は、ほとんどの抗体の安定性のために必須であるが(Probaら、1997)、LRRタンパク質ではジスルフィド結合は必要でなく、このため細胞内への適用が可能となる。
したがって、還元環境において適用するために新しい結合分子を作製することができる。これは、サイトゾルにおける直接阻害によって、ゲノムシークエンシングプロジェクトによって同定された多数のタンパク質の機能を解明するための極めて強力なツールとなりうる。バイオテクノロジーでは多くの適用に関して、発現されたおよび正確に折り畳まれたタンパク質の大量が必要であり、大腸菌における産生は好ましいが、酸化的細胞外環境において放出された抗体にとって非常に難しい。対照的に、RI変種の折り畳みまたはひだの再形成は、それらが本来サイトゾルにおいて認められるためにより効率的である(実施例1を参照のこと)。
本発明による集合体のさらに好ましい態様において、上記のアンキリンまたはLRR反復モジュールにおけるアミノ酸残基の一つまたは複数が、対応する天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている。
好ましくは、30%までのアミノ酸残基、より好ましくは20%まで、および最も好ましくは10%までのアミノ酸残基が置換される。
上記の組が反復モジュールの一種類からなる集合体が特に好ましい。
「反復モジュールの種類」という用語は、モジュールの長さ、その「固定位置」のみならずその「無作為化位置」の数および組成によって決定されたモジュールの特徴を意味する。「異なる種類のモジュール」は、上記の特徴の一つまたは複数が異なっていてもよい。
上記の組が二つの異なる種類の反復モジュールからなる集合体が、さらに好ましい。
さらにより好ましい態様において、本発明は、上記の組が上記の反復タンパク質における対として連続した反復モジュールの二つの異なる型を含む集合体に関する。
上記の二つの異なる種類のモジュールが上記のA型LRRおよびB型LRRに基づく集合体が最も好ましい。
上記の組に含まれる反復モジュールのアミノ酸配列が無作為化残基を除いてそれぞれの上記の種類に関して同一である集合体がさらに好ましい。
それぞれの上記の種類のコピーをコードする核酸配列が、無作為化された位置におけるアミノ酸残基をコードするコドンを除いて同一である集合体がさらにより好ましい。
上記の反復タンパク質をコードする核酸分子が上記の反復モジュールのあいだに少なくとも9ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む集合体が特に好ましい。
上記の「少なくとも9ヌクレオチドの同一の核酸配列」は、一つのみの反復モジュールの末端の一部であってもよく、隣接する二つの反復モジュールの両端によって形成されてもよく、または二つの反復モジュールを結合する(ポリ)ペプチドリンカーの一部であってもよい。
本発明によるさらに好ましい集合体において、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子は、対のあいだに少なくとも9ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む。
上記の「少なくとも9ヌクレオチドの同一の核酸配列」は、反復モジュールの唯一の対の末端の一部であってもよく、反復モジュールの二つの隣接する対の両端によって形成されてもよく、または反復モジュールの二つの対を結合する(ポリ)ペプチドリンカーの一部であってもよい。
上記のモジュールまたは上記の対のあいだの核酸配列のそれぞれが制限酵素認識配列を含む集合体が最も好ましい。
「制限酵素認識配列」という用語は、制限エンドヌクレアーゼによって認識されて切断される核酸配列を意味する。上記の制限酵素認識配列は、3'末端および5'末端のあいだで対称的に分割されてもよく(例えば、両末端に6塩基対認識配列の3ヌクレオチド)、または非対称的であってもよい(一方の末端に2ヌクレオチド、もう一方の末端に4ヌクレオチド)。
上記のモジュールまたは上記の対のあいだの核酸配列のそれぞれが、二つの互換的制限酵素によって作製された付着末端から形成される核酸配列を含む集合体が特に好ましい。
「互換的制限酵素」という用語は、異なる認識配列を有するが、二本鎖DNAを切断する場合に互換的付着末端を形成する制限酵素を意味する。二つの互換的制限酵素から生じた付着末端二本鎖DNA断片の再ライゲーション後、産物DNAは、もはや双方の制限酵素の認識配列を示さない。
本発明の集合体のさらに最も好ましい態様において、上記の同一の核酸配列によって、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子のPCRに基づく構築が可能となる。
本発明による集合体の最も好ましい態様において、上記の反復タンパク質は、上記の対のそれぞれが以下の配列を有する、上記のA型LRRおよびB型LRRに基づく一つまたは複数のモジュール対を含む:
式中、1は、群
D、E、N、Q、S、R、K、WおよびYから選択されるアミノ酸残基を表し;
式中、2は群
N、SおよびTから選択されるアミノ酸残基を表し;
式中、3は、群
G、S、D、N、HおよびTから選択されるアミノ酸残基を表し;かつ
式中、4は、群
L、VおよびMから選択されるアミノ酸残基を表す。
式中、1は、群
D、E、N、Q、S、R、K、WおよびYから選択されるアミノ酸残基を表し;
式中、2は群
N、SおよびTから選択されるアミノ酸残基を表し;
式中、3は、群
G、S、D、N、HおよびTから選択されるアミノ酸残基を表し;かつ
式中、4は、群
L、VおよびMから選択されるアミノ酸残基を表す。
最も好ましくは、上記のモジュール対のそれぞれは、以下の核酸分子によってコードされる:
式中、111は群
D、E、N、Q、S、R、K、WおよびYから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、222は群
N、SおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、333は群
G、S、D、N、HおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し
;かつ
式中、444は群
L、VおよびMから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
式中、111は群
D、E、N、Q、S、R、K、WおよびYから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、222は群
N、SおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、333は群
G、S、D、N、HおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し
;かつ
式中、444は群
L、VおよびMから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
もう一つの好ましい態様において、上記の少なくとも一つのモジュール対におけるアミノ酸残基の一つまたは複数は、天然LRR内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基によって置換されている。
さらにもう一つの好ましい態様において、上記の少なくとも一つのモジュール対におけるアミノ酸コドンの一つまたは複数は、天然LRR内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換されている。好ましくは、アミノ酸残基またはアミノ酸コドンがそれぞれ30%まで、より好ましくは20%まで、および最も好ましくは10%まで置換されている。
さらにもう一つの好ましい態様において、上記の少なくとも一つのモジュール対におけるアミノ酸コドンの一つまたは複数は、天然LRR内の対応する位置において認められるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換されている。
さらに好ましい態様において、本発明は、本発明による核酸分子の集合体を含む組み換え型核酸分子の集合体に関する。
本発明の意味において、「組み換え型核酸分子」という用語は、上記の反復タンパク質をコードする核酸配列およびさらに核酸配列、例えば非コード配列を含むRNA分子またはDNA分子を意味する。
さらにより好ましい態様において、本発明は、本発明による核酸分子の集合体、または本発明による組み換え型核酸分子の集合体を含むベクターの集合体に関する。
本発明によるベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、またはウイルスもしくはバクテリオファージに基づくベクターであってもよく、およびクローニングまたはシークエンシングベクターであってもよく、または好ましくは原核もしくは真核細胞発現系のいずれかにおいて上記のベクターから核酸分子の発現にとって必要な全ての要素を含む発現ベクターであってもよい。核酸分子をクローニング、シークエンシング、および発現するためのベクターは、当業者に周知である。本発明の核酸分子を含むベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する周知の方法によって宿主細胞に移入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に一般的に用いられるが、例えばリン酸カルシウムもしくはDEAEデキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションは、他の細胞宿主のために用いてもよい;例えば、サムブルックら(Sambrook、1989)を参照のこと。
そのようなベクターは、適した宿主細胞および適した条件下において上記のベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、原核または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に結合する。上記の核酸分子の発現は、翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。それらは通常、転写の開始を確実にする調節配列、ならびに選択的に転写の終了および転写物の安定化を確実にするポリAシグナル、および/または上記の核酸分子の発現をさらに増強するイントロンを含む。さらなる調節エレメントには、転写と共に翻訳エンハンサー、および/または天然に会合するまたは異種プロモーター領域が含まれてもよい。原核宿主細胞における発現を可能にする可能性がある調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるpL、lac、trp、またはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、AOX1または酵母のGAL1プロモーター、またはCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー、または哺乳類および他の動物細胞におけるグロビンイントロンである。転写の開始に関与するエレメントの他に、そのような調節エレメントはまた、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位のような転写終了シグナルを、核酸分子の下流に含んでもよい。さらに、用いられる発現系に応じて、(ポリ)ペプチドを細胞区画に向けて、それを培地に分泌させることができるリーダー配列を、本発明の核酸分子のコード配列に加えてもよく、それらは当技術分野で周知である。リーダー配列(複数)は、翻訳、開始および終了配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質またはその一部のペリプラスム間隙または細胞外培地への分泌を指示することができるリーダー配列と共に適当な相で構築される。選択的に、異種配列は、所望の特徴、例えば発現された組み換え産物の安定化または精製の単純化を付与するC末端またはN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。この意味において、オカヤマ-ベルグcDNA発現ベクターpcDV1(ファルマシア社)、pCDM8、pRc/CMV、pDNA1、pcDNA3(インビトロジェン社)、pSPORT1(ギブコBRL社)、もしくはpCI(プロメガ社)、またはより好ましくはpTFT74(Geら、1995)もしくはpQEシリーズ(キアゲン社)のメンバーのような適した発現ベクターは、当技術分野において既知である。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子操作において従来用いられているベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージに関する。好ましくは、上記のベクターは発現ベクターである。当業者に周知の方法を用いて、組み換え型ウイルスベクターを構築することができる;例えばサムブルック(Sambrook)ら(「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory(1989)、N.Y.)、およびアウスユベール(Ausubel)ら(「分子生物学の現行プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989))に記載される技術を参照のこと。
さらに、本発明は、本発明による核酸分子の集合体を含む宿主細胞の集合体、本発明による組み換え型核酸分子の集合体、または本発明によるベクターの集合体に関する。
本発明の意味において、「宿主細胞」という用語は、大腸菌(Geら、1995)または枯草菌(Bacillus subtilis)(Wuら、1993a)のような細菌、酵母のような真菌(Horwitzら、1988;Ridderら、1995)、または糸状菌(Nyyssonenら、1993)、植物細胞(Hiatt、1990;HiattおよびMa、1993;Whitelamら、1994)、昆虫細胞(Potterら、1993;Wardら、1995)、または哺乳類細胞(Trillら、1995)を含むがこれらに限定されない、異種タンパク質を産生するために一般的に用いられる任意のものであってもよい。
もう一つの態様において、本発明は、本発明による核酸分子の集合体、本発明によるベクターの集合体によってコードされる、または本発明による宿主細胞の集合体によって産生された反復タンパク質の集合体に関する。
さらに、本発明は、本発明による核酸分子の集合体の構築方法であり、以下の段階を含む方法に関する:
(a)反復タンパク質ファミリー由来の反復単位を同定する段階;
(b)上記の反復単位において骨格残基および標的相互作用残基を同定する段階;
(c)上記の反復タンパク質ファミリーの少なくとも一つのメンバーからの骨格残基および無作為化標的相互作用残基を含む少なくとも一種類の反復モジュールを推定する段階;ならびに
(d)それぞれが、段階(c)において推定された反復モジュールの上記の少なくとも一種類の二つまたはそれ以上のコピーを含む反復タンパク質をコードする核酸分子を構築する段階。
(a)反復タンパク質ファミリー由来の反復単位を同定する段階;
(b)上記の反復単位において骨格残基および標的相互作用残基を同定する段階;
(c)上記の反復タンパク質ファミリーの少なくとも一つのメンバーからの骨格残基および無作為化標的相互作用残基を含む少なくとも一種類の反復モジュールを推定する段階;ならびに
(d)それぞれが、段階(c)において推定された反復モジュールの上記の少なくとも一種類の二つまたはそれ以上のコピーを含む反復タンパク質をコードする核酸分子を構築する段階。
本発明の方法を行う様式を、本発明の核酸分子の集合体の態様に関連して上記に説明する。そのような二つの様式の説明を実施例において説明する。
本発明の方法の好ましい態様において、段階(c)において推定された上記の少なくとも一つの反復モジュールがアミノ酸配列を有し、少なくとも70%のアミノ酸残基が、
(i)少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定したコンセンサスアミノ酸残基、または
(ii)天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する。
(i)少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定したコンセンサスアミノ酸残基、または
(ii)天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する。
本発明による(ポリ)ペプチド/タンパク質の集合体の産生方法であり、以下の段階を含む方法がさらに好ましい:
(a)本発明による宿主細胞の集合体を提供する段階;および
(b)上記の宿主細胞に含まれる核酸分子の集合体を発現させる段階。
(a)本発明による宿主細胞の集合体を提供する段階;および
(b)上記の宿主細胞に含まれる核酸分子の集合体を発現させる段階。
以下の段階を含む既定の特性を有する反復タンパク質を得る方法が特に好ましい:
(a)本発明による反復タンパク質の集合体を提供する段階、および
(b)上記の既定の特性を有する少なくとも一つの反復タンパク質を得るために、上記の集合体をスクリーニングする段階および/または上記の集合体から選択する段階。
(a)本発明による反復タンパク質の集合体を提供する段階、および
(b)上記の既定の特性を有する少なくとも一つの反復タンパク質を得るために、上記の集合体をスクリーニングする段階および/または上記の集合体から選択する段階。
反復タンパク質の多様な集合体は、用いられるスクリーニングおよび/または選択系に従っていくつかの方法によって提供してもよく、バクテリオファージ(国際公開公報第90/02809号;Smith、1985;Kayら、1996;Dunn、1996)、または細菌細胞(国際公開公報第93/10214号)の表面上でのディスプレイ、リボソームディスプレイ(国際公開公報第91/05058号;国際公開公報第98/48008号;Hanesら、1998)、プラスミド上のディスプレイ(国際公開公報第93/08278号)などの方法を用いること、または共有結合RNA-反復タンパク質ハイブリッド構築物を用いることによって(国際公開公報第00/32823号)、タンパク質相補性アッセイ(国際公開公報第98/341120号;Pelletierら、1998)によるような細胞内発現および選択/スクリーニングのような方法を用いることを含んでもよい。これらの全ての方法において、反復タンパク質は、核酸分子の対応する集合体の発現の後に反復タンパク質のスクリーニングを行い、その後反復タンパク質に関連した遺伝情報によって所望の特性を有する一つまたは複数の反復タンパク質を同定することによって提供される。
本発明の意味において、「既定の特性」という用語は、反復タンパク質の集合体からの反復タンパク質の一つが有する特性、および集合体のスクリーニングおよび/または選択のための基礎を形成する特性を意味する。そのような特性は、標的に対する結合、標的の阻害、標的媒介反応の活性化、酵素活性のような特性、および当業者に既知のさらなる特性を含む。所望の特性の種類に応じて、当業者は、フォーマット、およびスクリーニングおよび/または選択を行うための必要な段階を同定することができると考えられる。
最も好ましくは、本発明は、上記の既定の特性が標的に対する結合である方法に関する。
もう一つの態様において、本発明は、本発明による集合体からの反復タンパク質に関する。
好ましくは上記の反復タンパク質は、上記の方法によって得られ、既定の特性の一つを有する。
さらに、本発明は、本発明による反復タンパク質をコードする核酸分子に関する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。
本発明は、本発明の集合体からの反復タンパク質、または上記の反復タンパク質をコードする核酸分子、および選択的に薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物にも関する。
適した薬学的担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩液、水、油/水乳剤のような乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって調製することができる。これらの薬学的組成物は、適した用量で被験者に投与することができる。適した組成物の投与は、異なる方法で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内、または気管支内投与によって行ってもよい。投与レジメは主治医および臨床要因によって決定されると考えられる。医学の技術分野において周知であるように、患者への任意の用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身健康状態、および同時投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。典型的な用量は例えば、0.001〜1000μg(またはこの範囲の発現または発現の阻害に関して核酸の)となりうるが、特に上記の要因を考慮してこの例となる範囲より下または上の用量が想定される。一般的に、薬学的組成物の定期的な投与としての療法は、1μg〜10 mg単位/日の範囲でありうる。療法が持続的注入の場合、同様に1μg〜10 mg単位/kg体重/分の範囲でありうる。定期的な評価によって進行をモニターすることができる。用量は変更するが、DNAの静脈内投与の好ましい用量は、DNA分子約106コピー〜1012コピーである。本発明の組成物は、局所または全身投与してもよい。投与は、一般的に非経口投与、例えば静脈内投与でありうる。DNAはまた、例えば内部もしくは外部標的に対するバイオリスティック輸送によって、または動脈内の部位にカテーテルによって、標的部位に直接投与してもよい。非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝培地を含む、水、アルコール/水性溶液、乳液、または懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、液体および栄養補給剤、電解質補給剤(リンゲルデキストロースに基づく補給剤のような)等が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等のような保存剤および他の添加剤も同様に存在してもよい。さらに、本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の意図する用途に応じて、インターロイキン、またはインターフェロンのような物質をさらに含んでもよい。
本発明の薬学的組成物に含まれる反復タンパク質は、共有または非共有結合によって結合されるさらなるドメインを含みうる。結合は、当技術分野で既知の方法および上記の方法に従って、遺伝的融合に基づくことができ、例えば、国際公開公報第94/04686号に記載されるような例えば化学的クロスリンクによって行うことができる。本発明に従って用いられるペプチド、ポリペプチド、または抗体を含む融合タンパク質に存在するさらなるドメインを、好ましくは、ポリペプチドリンカーが上記のさらなるドメインのC末端と反復タンパク質のN末端とのあいだ、またはその逆の距離に及ぶほど十分な長さの複数の疎水性のペプチド結合アミノ酸を含む、柔軟なリンカー、都合がよいのはポリペプチドリンカーによって結合してもよい。上記の融合タンパク質はさらに、切断可能なリンカーまたはプロテナーゼの切断部位を含んでもよい。
さらに、上記のさらなるドメインは、既定の特異性または機能を有するドメインであってもよい。この意味において、本発明による薬学的組成物に存在する反復タンパク質は、当技術分野で既知の従来の方法によってさらに改変してもよい。これによって、本発明の反復タンパク質と、他の機能的アミノ酸配列、例えば異種タンパク質に由来してもよい核局在シグナル、トランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ(GST、GFP、h-mycペプチド、FLAG、HAペプチド)とを含む融合タンパク質を構築することができる。このように、本発明の組成物の投与は、標識のみならず非標識(ポリ)ペプチドまたは抗体を利用することができる。
上記の核酸分子が
である、本発明による集合体を構築するために反復モジュール対をコードする核酸分子がさらに好ましい:
式中、111は群
D、E、N、Q、S、R、K、WおよびYから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、222は群
N、SおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、333は群
G、S、D、N、HおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し
;かつ
式中、444は群
L、VおよびMから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
である、本発明による集合体を構築するために反復モジュール対をコードする核酸分子がさらに好ましい:
式中、111は群
D、E、N、Q、S、R、K、WおよびYから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、222は群
N、SおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し;
式中、333は群
G、S、D、N、HおよびTから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し
;かつ
式中、444は群
L、VおよびMから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
これらおよび他の態様は、本発明の説明および実施例によって開示され、含まれる。本発明に従って用いられる任意の方法、用途、および化合物に関するさらなる文献を、例えば電子装置を用いて公共のライブラリから検索してもよい。例えば、インターネット上で利用できるデータベース「PubMed」(Sequeiraら、2001)を利用してもよい。
バイオテクノロジーにおける特許情報の概要、ならびにレトロスペクティブ検索にとっておよび現在の認識にとって有用な特許情報の調査または関連起源は、バークス(Berks、1994)に示される。
実施例は本発明を例示するものである。
実施例において特記しない限り、全ての組み換えDNA技術を、記載のプロトコールに従って行う(Sambrookら、1989、またはAusubelら、1994)。用いたデータベースは以下の通りであった:
GenBank
国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、ベセスダ(Bethesda)、アメリカ(USA);
Swiss-Prot
スイス生体情報学研究所、ジュネーブ(Geneva)、スイス(Switzerland);
タンパク質データベース(Protein Data Base)
ラトガーズ大学分子生物物理および生物物理化学センター、ニュージャージー州(New Jersey)、アメリカ(USA);ならびに
単純モジュール構築研究ツール(SMART)
EMBL、ハイデルベルグ(Heidelberg)、ドイツ(Germany)。
GenBank
国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、ベセスダ(Bethesda)、アメリカ(USA);
Swiss-Prot
スイス生体情報学研究所、ジュネーブ(Geneva)、スイス(Switzerland);
タンパク質データベース(Protein Data Base)
ラトガーズ大学分子生物物理および生物物理化学センター、ニュージャージー州(New Jersey)、アメリカ(USA);ならびに
単純モジュール構築研究ツール(SMART)
EMBL、ハイデルベルグ(Heidelberg)、ドイツ(Germany)。
1.哺乳類リボヌクレアーゼ阻害剤の反復単位に由来する反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体
本実施例は、哺乳類のリボヌクレアーゼ阻害剤(RI)に由来するロイシンリッチ反復タンパク質の集合体の構築を説明する。この足場構造は、RI(Leeら、1989)によるアンジオゲニンおよびRIによるRNaseA(KobeおよびDeisenhofer、1996)の結合に関して、フェントモル範囲での極めて堅固な相互作用が報告されていることから選択した。
本実施例は、哺乳類のリボヌクレアーゼ阻害剤(RI)に由来するロイシンリッチ反復タンパク質の集合体の構築を説明する。この足場構造は、RI(Leeら、1989)によるアンジオゲニンおよびRIによるRNaseA(KobeおよびDeisenhofer、1996)の結合に関して、フェントモル範囲での極めて堅固な相互作用が報告されていることから選択した。
RIアミノ酸配列は、A型およびB型LRR反復単位(KobeおよびDeisenhofer、1994)と呼ばれる、二つの交互の異なるが相同な反復単位の特徴的なパターンを示したことから、2つの反復モチーフを誘導してこれを用いて反復ドメインを構築した。A型のLRR反復モチーフとB型のLRR反復モチーフとの構築物を、本明細書においてRI反復モチーフ対と呼ぶ。RI反復モチーフ対を含む反復モジュール対のモデルを示す(図4f)。本実施例は、反復ドメインを構築するために一つ以上の反復モチーフを用いることを示し、これは一つのみのモチーフを用いる実施例2とは対照的である。
1)哺乳類RIの予備的な反復配列モチーフの誘導
ヒトRI(アクセッション番号P13489、Leeら、1988)およびブタRI(P10775、Hofsteengeら、1988)のタンパク質配列を用いて相同配列を検索した。ラットRI(P29315、Kawanomotoら、1992)およびマウスRIタンパク質の完全なタンパク質配列が判明した(AAK68859、非公表)。
ヒトRI(アクセッション番号P13489、Leeら、1988)およびブタRI(P10775、Hofsteengeら、1988)のタンパク質配列を用いて相同配列を検索した。ラットRI(P29315、Kawanomotoら、1992)およびマウスRIタンパク質の完全なタンパク質配列が判明した(AAK68859、非公表)。
得られたRIタンパク質配列の反復単位は、GCG(商標)Wisconsin Package(登録商標)において実行される「FastA」(アクセルリス、アメリカ)を用いて整列化した。ヒトRIのタンパク質配列を示し(図5a)、2位、5位、7位、12位、20位、および24位でのロイシンまたは他の脂肪族残基を特徴とするLRRパターン(KobeおよびDeisenhofer、1994)を強調して示す。それぞれの位置に関して最も豊富なアミノ酸をヒト、マウス、ブタ、およびラットRI配列に関して計算した(図5cおよび図5d)。最初のRI反復モチーフ対は、所定の位置での場合の50%(図5cおよび図5dを参照のこと)またはそれ以上に存在するアミノ酸によって定義された。
これは、配列モチーフを配列情報およびアラインメントのみからどのようにして誘導できるかを説明するためのものである。しかし、好ましくは、構造情報を考慮に入れるべきである。
2)骨格と標的相互作用残基の位置を決定する
A型とB型LRR単位双方の分析によって、2位、5位、7位、10位、12位、17位、20位、および24位でのアミノ酸の側鎖が常に疎水性コアに向いていること(KobeおよびDeisenhofer、1994、ならびに図4bおよび図4d)、そしてこれらのアミノ酸が骨格残基のサブセットを構成することが判明した。他の骨格残基は、それらがそれぞれのLRR単位のαヘリックスを開始させて終了させることから、16位のグリシンならびにA型残基では28位(A28と省略)およびB型LRR単位では27位(B27位と省略)のプロリンである。さらに、位置A1、A3、A13、A18、A19、A22、A25、A27、ならびにB1、B3、B11、B14、B18、B22、およびB26は、周辺溶媒の方向を向いた親水性アミノ酸残基を有することが最も多く、骨格位置として処理された。同様に、位置A14、A15、A21、A23、A26、ならびにB15、B19、B21、B25、およびB29は通常、反復モジュールの界面を安定化させる疎水性アミノ酸残基によって占有され、このように、同様に骨格位置として処理される。さらに、位置A11、B13、B23およびB28は、他のアミノ酸残基より柔軟性を可能にするグリシンを特徴とし、したがって骨格にとって同様に重要である。対照的に位置4、6、8および9は、RI反復モチーフ対における標的相互作用の位置であると定義された。
A型とB型LRR単位双方の分析によって、2位、5位、7位、10位、12位、17位、20位、および24位でのアミノ酸の側鎖が常に疎水性コアに向いていること(KobeおよびDeisenhofer、1994、ならびに図4bおよび図4d)、そしてこれらのアミノ酸が骨格残基のサブセットを構成することが判明した。他の骨格残基は、それらがそれぞれのLRR単位のαヘリックスを開始させて終了させることから、16位のグリシンならびにA型残基では28位(A28と省略)およびB型LRR単位では27位(B27位と省略)のプロリンである。さらに、位置A1、A3、A13、A18、A19、A22、A25、A27、ならびにB1、B3、B11、B14、B18、B22、およびB26は、周辺溶媒の方向を向いた親水性アミノ酸残基を有することが最も多く、骨格位置として処理された。同様に、位置A14、A15、A21、A23、A26、ならびにB15、B19、B21、B25、およびB29は通常、反復モジュールの界面を安定化させる疎水性アミノ酸残基によって占有され、このように、同様に骨格位置として処理される。さらに、位置A11、B13、B23およびB28は、他のアミノ酸残基より柔軟性を可能にするグリシンを特徴とし、したがって骨格にとって同様に重要である。対照的に位置4、6、8および9は、RI反復モチーフ対における標的相互作用の位置であると定義された。
3)不都合なアミノ酸の置換
RIコンセンサスはまた、位置A10およびA17ならびにB21およびB29において極めてよく保存されたシステインを特徴とする。しかし、遊離のシステインは酸化されて、合併症を引き起こす可能性があるため、システインを含まないモジュールを設計することが望ましい。したがって、適当な置換を調べた。三次元構造(MTS#1)を調べると、A10位のシステインは水素結合を形成することが判明した。さらに、より遠位のLRR分子とのアラインメントにより、ほとんどの場合アスパラギン、セリン、またはトレオニンのいずれかが存在することが判明した。したがって、LRRモジュールにおける位置A10は、これらの三つのアミノ酸が存在するように設計された。同様に、位置A17は疎水性コアの一部であることが判明し、これがLRRモジュールにおいてメチオニン、ロイシン、またはバリンを用いる理由である。同時に、これらの二つの位置A10およびA17は、骨格位置が無作為化される場合を構成する。位置B21において、分析された全てのRI配列における最初と最後の反復のシステインは、常にロイシンによって置換され(バリンを一つの例外として)、このように、最終的なLRRモジュールにおいてロイシンであると定義された。位置B29の場合、したがって、選択はセリンとトレオニンのあいだであり、この場合、BssHIIとMluIの制限エンドヌクレアーゼ部位との構築を可能にするように、トレオニンを選択した(詳しい説明に関しては、図6を参照のこと)。
RIコンセンサスはまた、位置A10およびA17ならびにB21およびB29において極めてよく保存されたシステインを特徴とする。しかし、遊離のシステインは酸化されて、合併症を引き起こす可能性があるため、システインを含まないモジュールを設計することが望ましい。したがって、適当な置換を調べた。三次元構造(MTS#1)を調べると、A10位のシステインは水素結合を形成することが判明した。さらに、より遠位のLRR分子とのアラインメントにより、ほとんどの場合アスパラギン、セリン、またはトレオニンのいずれかが存在することが判明した。したがって、LRRモジュールにおける位置A10は、これらの三つのアミノ酸が存在するように設計された。同様に、位置A17は疎水性コアの一部であることが判明し、これがLRRモジュールにおいてメチオニン、ロイシン、またはバリンを用いる理由である。同時に、これらの二つの位置A10およびA17は、骨格位置が無作為化される場合を構成する。位置B21において、分析された全てのRI配列における最初と最後の反復のシステインは、常にロイシンによって置換され(バリンを一つの例外として)、このように、最終的なLRRモジュールにおいてロイシンであると定義された。位置B29の場合、したがって、選択はセリンとトレオニンのあいだであり、この場合、BssHIIとMluIの制限エンドヌクレアーゼ部位との構築を可能にするように、トレオニンを選択した(詳しい説明に関しては、図6を参照のこと)。
分析された位置A21の36%に生じる最後まで残っているシステイン(図5c)は、これが所定の位置での次に最も頻繁なアミノ酸であり、同様に疎水性環境に一致するように思われることからアラニンと設定した。B21位でロイシンが認められたほとんどの場合において、A21位にアラニンが存在することが認められたために、この決定が促進された。言い換えれば、B21位でのロイシンは、A21位でのアラニンを好むように思われる。このように、積み重ねは、LRRモジュールにおけるこの選択によって最もよく支持されると考えられた。
A1位に関しては、もう一つの決定が必要であった。二つの可能性がある陽性荷電アミノ酸であるリジンとアルギニンのうち、上記の制限エンドヌクレアーゼ部位に一致するように後者が選択された。
4)標的相互作用残基の定義
標的相互作用位置の定義に関して、ヒトRI-アンジオゲニン(Papageorgiouら、1997)およびブタRI-RNaseA(KobeおよびDeisenhofer、1995)複合体の双方を分析した。N末端およびC末端キャッピング単位の双方における広い相互作用を別にして、反復単位の相互作用は、A型LRR単位の6位、8位、および9位を含むことが最も多く、一方B型LRR単位では、4位、6位および9位を用いることが最も多かった。これらの位置は全てLRR単位のβ鎖から生じた側鎖を特徴とし(図4e)、したがって、標的相互作用に適している。しかし、B型LRR単位の4位のグルタメートは例外なく存在し、さらなる構造上の重要性を無視することができないため、本発明者らはこの位置を無作為化しなかった。このように、この位置は、標的相互作用の位置が無作為化されていない場合を構成する。対照的に、位置A4は、30%未満の保存を示したために、無作為化されていると定義した。したがって、LRRモジュールにおいてA4、A6、A8、およびA9ならびにB6およびB9を無作為化した。無作為化位置でのアミノ酸の選択されたサブセットは、天然アミノ酸の物理化学特性を大きく反映し、したがって、多くの場合において結合を支持することが知られている全ての荷電アミノ酸、いくつかの水素結合形成アミノ酸、および芳香族アミノ酸を選択した。同時に、A型LRR単位の位置に限ってより大きいアミノ酸が許容されるように、そしてB型LRR単位の位置では交互の状態において立体妨害を最小限にするより小さいアミノ酸のみが許容されるように決定した。このように、この段階で得られた反復配列モチーフは、以下のように記述することができる。
標的相互作用位置の定義に関して、ヒトRI-アンジオゲニン(Papageorgiouら、1997)およびブタRI-RNaseA(KobeおよびDeisenhofer、1995)複合体の双方を分析した。N末端およびC末端キャッピング単位の双方における広い相互作用を別にして、反復単位の相互作用は、A型LRR単位の6位、8位、および9位を含むことが最も多く、一方B型LRR単位では、4位、6位および9位を用いることが最も多かった。これらの位置は全てLRR単位のβ鎖から生じた側鎖を特徴とし(図4e)、したがって、標的相互作用に適している。しかし、B型LRR単位の4位のグルタメートは例外なく存在し、さらなる構造上の重要性を無視することができないため、本発明者らはこの位置を無作為化しなかった。このように、この位置は、標的相互作用の位置が無作為化されていない場合を構成する。対照的に、位置A4は、30%未満の保存を示したために、無作為化されていると定義した。したがって、LRRモジュールにおいてA4、A6、A8、およびA9ならびにB6およびB9を無作為化した。無作為化位置でのアミノ酸の選択されたサブセットは、天然アミノ酸の物理化学特性を大きく反映し、したがって、多くの場合において結合を支持することが知られている全ての荷電アミノ酸、いくつかの水素結合形成アミノ酸、および芳香族アミノ酸を選択した。同時に、A型LRR単位の位置に限ってより大きいアミノ酸が許容されるように、そしてB型LRR単位の位置では交互の状態において立体妨害を最小限にするより小さいアミノ酸のみが許容されるように決定した。このように、この段階で得られた反復配列モチーフは、以下のように記述することができる。
このように、8個の位置での無作為化によって、2.8×105個の独立したRI反復モジュール対が得られた。言い換えれば、上記の反復配列モチーフを満足する分子の合成は、約300,000個のしかし非常に相同なメンバーを作製すると考えられる。
詳細に分析したもう一つの位置は、双方のLRR反復単位の上部のループ領域、すなわち11位である。A型およびB型LRR単位の双方におけるコンセンサスはそれぞれ、36%および25%であったため、アミノ酸の対の発生をチェックした。B型LRR単位において、荷電アミノ酸が11位ではわずかに好ましく、リジンはA型LRR単位においてアスパラギン酸塩と共にしばしば生じた。この推定の塩架橋は、設計されたLRRモジュールの安定性および溶解度を増加させると考えられ、したがってこれらを選択した。もう一つの可能性(A11でのグリシンおよびB11でのグルタミン酸)は柔軟性が高すぎるために却下した。
A14位での選択は、アラニンとグルタミン酸のいずれかであり、この場合も溶解度および疎水性の外皮の正しい方向を増強するために後者を選択した。同様に、B22位は、グルタミン酸またはグルタミンのいずれかを示唆し、この場合後者は、先に定義したA22でセリンによりよく一致するように思われたため、後者を選択した。
最後に、26位を精査に供した。この場合、選択はB26位でのグルタミンと共にA26位のアラニン、およびB26位でのアスパラギン酸塩と共にA26位でのセリンのいずれかであった。LRRモジュールの溶解度を増強するために、この場合も後者の変種を用いた。
5)哺乳類RIのLRRに由来する反復ドメインの設計
多数の反復モジュールをドメインに構築することは簡単である。ここに、本発明者らは、互換的オーバーハングを作製する2つの異なる制限酵素を含むアプローチを行った(図6を参照のこと)。このように、ライゲーションの方向は、ライゲーション産物を再度消化することによって単純に制御することができ、この場合、正しくライゲーションした分子は切断されない。
多数の反復モジュールをドメインに構築することは簡単である。ここに、本発明者らは、互換的オーバーハングを作製する2つの異なる制限酵素を含むアプローチを行った(図6を参照のこと)。このように、ライゲーションの方向は、ライゲーション産物を再度消化することによって単純に制御することができ、この場合、正しくライゲーションした分子は切断されない。
さらに、本発明者らは、反復ドメインの推定の結合疎水性コアを周辺の溶媒から保護するように設計されたN末端およびC末端キャッピングモジュールによって、構築されたLRRモジュールを補則することを選択した。哺乳類RIタンパク質の分析から、最初と最後のLRR単位が上記のコンセンサスとは有意に異なることが判明した(図5cおよび図5d)。単純にするために、ヒトRIの対応するキャッピング単位をわずかに改変してクローニングし、以降これをキャッピングモジュールと呼ぶ。このように、N末端キャッピングモジュールに関してアミノ酸1位〜28位およびC末端モジュールに関してヒトRIのアミノ酸427位〜460位を用いて、アミノ酸残基PYARをコードする短いリンカーをN末端キャッピングモジュールとRI反復モジュール対とのあいだに導入して、長さの必要条件を一致させた。
改訂したアミノ酸コンセンサスをDNA配列に逆翻訳する場合、以下のパラメータを考慮した。望ましくない制限酵素認識配列は、反復モジュール対内に容認されず、コドンの使用は大腸菌での発現に関して最適化された。
6)発現プラスミドの調製
適当な制限消化部位が隣接するN末端モジュールを得るために、pTRP-PRI(LeeおよびVallee、1989)をオリゴヌクレオチドMTS2およびMTS4によって増幅して(表1)、PCR断片Nを得た。このように、5'末端において、NcoIおよびBamHIを導入し、3'末端はBssHIIおよびHindIII部位を特徴とした。得られたDNA断片は、正確なフレームで翻訳されたアミノ酸を示す(図8における四角で囲まれた部分の上)。
適当な制限消化部位が隣接するN末端モジュールを得るために、pTRP-PRI(LeeおよびVallee、1989)をオリゴヌクレオチドMTS2およびMTS4によって増幅して(表1)、PCR断片Nを得た。このように、5'末端において、NcoIおよびBamHIを導入し、3'末端はBssHIIおよびHindIII部位を特徴とした。得られたDNA断片は、正確なフレームで翻訳されたアミノ酸を示す(図8における四角で囲まれた部分の上)。
PCR断片Nを、pTFT74のNcoIおよびHindIII部位にライゲーションして(Geら、1995)、プラスミドpTFT_N(図9a)を得た。同時に、N末端のFlagタグおよび6×Hisタグを導入した。上記の反復モジュールを挿入するために、いくつかのベクターをpTFT_Nから誘導した。pTFT_NのNcoI-HindIII挿入物を同じ制限消化酵素によって調製したpQE60(キアゲン社、ヒルデン、ドイツ)にクローニングした(プラスミドpQE_Nを生じる)。pTFT_NのBamHI-HindIII挿入物(N末端Flagタグおよび6×Hisタグを含まない)を、λファージタンパク質D遺伝子挿入物の下流のpQE60誘導体にインフレームでクローニングしてC末端融合反復ドメインを得た(プラスミドpQE-pD_Nを生じる)。
pTFT誘導体は、lacオペレータの下でT7ポリメラーゼプロモーターを特徴とするのに対し、pQE誘導体は、同じ制御系においてT5ポリメラーゼプロモーターを提供する。溶解度および発現を増加させるためにN末端融合パートナーとしてλファージタンパク質Dを選択した(ForrerおよびJaussi、1998)。
7)反復モジュールライブラリの合成
オリゴヌクレオチドMTS7およびMTS9を、トリヌクレオチドから部分的に構築して(Virnekasら、1994)、他の全てのオリゴヌクレオチドを標準的な技術によって合成した。
オリゴヌクレオチドMTS7およびMTS9を、トリヌクレオチドから部分的に構築して(Virnekasら、1994)、他の全てのオリゴヌクレオチドを標準的な技術によって合成した。
下記に示す戦略により、パリンドローム制限酵素およびライゲーションを用いて、既定の方向にDNA断片のポリマーを得る方法を説明する。そのような一つの可能性は、互換的オーバーハングを生じる制限酵素BssHIIおよびMluI(図6)を用いることである。同じオーバーハングを有するが当初の認識部位が異なるDNA断片を再度ライゲーションすると、当初の酵素のいずれによっても消化できない新しい複合部位(図6および図7a〜図7cにおいて*で示される)が形成されうる(図6)。しかし、同一の末端がライゲーションされると、当初の認識部位が形成され、したがってこれらの分子は、制限消化によって区別することができない。互換的オーバーハングを有する制限酵素の他の対は、当業者に周知である。
以下の段階の番号は、図7a〜図7cにおいて用いた番号を意味する。
(段階I)
反復モジュールの第一のライブラリを作製するために、部分的無作為化オリゴヌクレオチドMTS7、MTS8、MTS9、およびMTS10をPCRによって構築して、MTS11bおよびMTS14bの10倍モル過剰量によって一段階で増幅した(95℃で2分間;次に95℃で15秒間、55℃で15秒間、および72℃で20秒間を20サイクル行った後に、72℃で1分間)。本明細書に記載するLRRライブラリの場合、最初のPCRは上記のA/B対を一つのモジュールに構築する。得られたDNA断片は正しいフレームで翻訳されたアミノ酸を示す(図8における四角で囲った部分、オリゴヌクレオチドを矢印として示す)。
反復モジュールの第一のライブラリを作製するために、部分的無作為化オリゴヌクレオチドMTS7、MTS8、MTS9、およびMTS10をPCRによって構築して、MTS11bおよびMTS14bの10倍モル過剰量によって一段階で増幅した(95℃で2分間;次に95℃で15秒間、55℃で15秒間、および72℃で20秒間を20サイクル行った後に、72℃で1分間)。本明細書に記載するLRRライブラリの場合、最初のPCRは上記のA/B対を一つのモジュールに構築する。得られたDNA断片は正しいフレームで翻訳されたアミノ酸を示す(図8における四角で囲った部分、オリゴヌクレオチドを矢印として示す)。
(段階II)
BamHIおよびMluIまたはBssHIIのいずれかによる個々の広範囲の制限消化の後に、T4リガーゼによるライゲーションを行った(室温で1時間および酵素の熱不活化)。得られたライゲーション産物は、低融点アガロースゲル電気泳動によって精製した。二量体反復モジュールに対応するバンドを単離して、エタノール沈殿によるβアガロース消化後にDNAを回収した。
BamHIおよびMluIまたはBssHIIのいずれかによる個々の広範囲の制限消化の後に、T4リガーゼによるライゲーションを行った(室温で1時間および酵素の熱不活化)。得られたライゲーション産物は、低融点アガロースゲル電気泳動によって精製した。二量体反復モジュールに対応するバンドを単離して、エタノール沈殿によるβアガロース消化後にDNAを回収した。
(段階III)
反復モジュールの二量体を増幅するために、プライマーT7proおよびsrpTFT1(95℃で2分間;次に95℃で15秒間、50℃で15秒間、72℃で40秒間を15サイクル行った後に、72℃で1分間)による第二のPCR反応を行った。LRRライブラリの場合、この段階は四つのロイシンリッチ反復である二つのA/B対を生じた。分子約1012個に対応する鋳型1μgをLRRライブラリのために用いると、全体の理論的多様性はなおこの段階で含まれた。
反復モジュールの二量体を増幅するために、プライマーT7proおよびsrpTFT1(95℃で2分間;次に95℃で15秒間、50℃で15秒間、72℃で40秒間を15サイクル行った後に、72℃で1分間)による第二のPCR反応を行った。LRRライブラリの場合、この段階は四つのロイシンリッチ反復である二つのA/B対を生じた。分子約1012個に対応する鋳型1μgをLRRライブラリのために用いると、全体の理論的多様性はなおこの段階で含まれた。
(段階IV)
四量体に関して、得られたDNAを再度BamHIおよびMluIまたはBssHIIによって消化した。より長いポリマーに関して、単消化および二重消化DNA断片の混合物を調製した。
四量体に関して、得られたDNAを再度BamHIおよびMluIまたはBssHIIによって消化した。より長いポリマーに関して、単消化および二重消化DNA断片の混合物を調製した。
(段階V)
ライゲーション、制限消化、および精製は反復モジュールの所望の数が得られるまで繰り返すことができる。
ライゲーション、制限消化、および精製は反復モジュールの所望の数が得られるまで繰り返すことができる。
(段階VI)
定方向のおよび効率的なプラスミドへのクローニングのために両末端で二つの異なる非互換的制限消化部位を有するDNA断片を得るために、以下の「キャッピング」戦略を改訂した。ヒトRIのC末端反復単位も同様に、PCRによってプラスミドpTRP-PRIから増幅し、それによって、BssHII制限部位を5'末端に、そしてHindIII制限部位を3'末端に導入した。得られたDNA断片は正しい枠内に翻訳されたアミノ酸を示す(図8における四角で囲まれた部分の下)。
定方向のおよび効率的なプラスミドへのクローニングのために両末端で二つの異なる非互換的制限消化部位を有するDNA断片を得るために、以下の「キャッピング」戦略を改訂した。ヒトRIのC末端反復単位も同様に、PCRによってプラスミドpTRP-PRIから増幅し、それによって、BssHII制限部位を5'末端に、そしてHindIII制限部位を3'末端に導入した。得られたDNA断片は正しい枠内に翻訳されたアミノ酸を示す(図8における四角で囲まれた部分の下)。
プライマーMTS5aおよびMTS3を、このPCR反応(95℃で2分、次に、95℃で15秒間、45℃で15秒間、および72℃で10秒間を20サイクル行った後に72℃で1分間)において用い、産物をQIAquickによって精製してBssHIIによって制限消化した。
(段階VII)
BssHII消化C末端反復モジュールを、T4リガーゼによってMluI消化ポリマーにライゲーションした(室温で1時間および酵素の熱不活化)。BssHII、MluIおよびHindIIIによるその後の十分な制限消化によって、モジュールの方向が正しいことを確認した。混合物は、低融点アガロースゲル電気泳動によって分離して、所望のバンドを上記のように回収した。最後に、回収された断片をBssHII-HindIII消化プラスミドpTFT_N、pTFT-pD_N、pQE_N、またはpQE-pD_Nのいずれかにライゲーションした。得られたライゲーション混合物をQIAquickによって精製して、シンデュら(Sindhu、2000)に従って調製したXL10Gold細胞のエレクトロポレーションに用いた。
BssHII消化C末端反復モジュールを、T4リガーゼによってMluI消化ポリマーにライゲーションした(室温で1時間および酵素の熱不活化)。BssHII、MluIおよびHindIIIによるその後の十分な制限消化によって、モジュールの方向が正しいことを確認した。混合物は、低融点アガロースゲル電気泳動によって分離して、所望のバンドを上記のように回収した。最後に、回収された断片をBssHII-HindIII消化プラスミドpTFT_N、pTFT-pD_N、pQE_N、またはpQE-pD_Nのいずれかにライゲーションした。得られたライゲーション混合物をQIAquickによって精製して、シンデュら(Sindhu、2000)に従って調製したXL10Gold細胞のエレクトロポレーションに用いた。
上記のプロトコールによって、異なるプラスミドライブラリが得られ、そのようなプラスミドの二つの代表的なダイヤグラムを示す(図9bおよび図9c)。
8)反復モジュールタンパク質ライブラリの特徴付け
標準的なDNAシークエンシング技術を用いて、発現プラスミドのDNA配列を決定した。例として、クローンD17(図11c、図11d、および図12dにおける発現と比較)のDNA配列を示す(図10aおよび図10b)。C末端モジュールと共にN末端モジュールおよび四つの反復モジュールを示す。発現は本質的に記述通りに行って(キアゲン社、「QIAexpressionist」)、超音波処理後の単一のクローンおよび/またはクローンのプールの可溶性および不溶性タンパク質をSDS-PAGE分析によって分離して、クーマシーブルー染色を施した(図11a〜図d)。ウェスタンブロット分析は、製造元が提供したプロトコールに従って実施した。抗Flag M2抗体(シグマ社)を、N末端タンパク質Dを含まない構築物のために用い、抗RGS-His(キアゲン社)を、N末端タンパク質Dを有する構築物のために用いた(図12a〜図d)。
標準的なDNAシークエンシング技術を用いて、発現プラスミドのDNA配列を決定した。例として、クローンD17(図11c、図11d、および図12dにおける発現と比較)のDNA配列を示す(図10aおよび図10b)。C末端モジュールと共にN末端モジュールおよび四つの反復モジュールを示す。発現は本質的に記述通りに行って(キアゲン社、「QIAexpressionist」)、超音波処理後の単一のクローンおよび/またはクローンのプールの可溶性および不溶性タンパク質をSDS-PAGE分析によって分離して、クーマシーブルー染色を施した(図11a〜図d)。ウェスタンブロット分析は、製造元が提供したプロトコールに従って実施した。抗Flag M2抗体(シグマ社)を、N末端タンパク質Dを含まない構築物のために用い、抗RGS-His(キアゲン社)を、N末端タンパク質Dを有する構築物のために用いた(図12a〜図d)。
精製(図13および図14)、CD分光法(図15)、およびサイズ排除クロマトグラフィー(図16)を、実施例2に記載のように実施した。
9)細菌毒素を阻害する(ポリ)ペプチド/タンパク質の選択
中等度のレベルの毒素でも単独では細菌において認容できないため、様々な細菌毒素が対応する抗毒素と共に存在することが知られている。したがって、CcdBの遺伝子(Jensenら、1995)を、DH5□Z1(LutzおよびBujard、1997)、XL10Gold、またはXL1Blueのようなテトラサイクリン抑制株において堅固に抑制されたテトラサイクリンプロモーターと共にpZシリーズの低コピープラスミドにクローニングした。これと同時に、0.1%活性を有する野生型バーナーゼ(barnase)(Hartley、1988)およびH102K変異体(JucovicおよびHartley、1996)をクローニングした。これらの毒素プラスミドの一つを有する化学的コンピテント細胞を記述のように調製して(Inoueら、1990)、これらの毒素プラスミドの一つを有するエレクトロポレーションコンピテント細胞を記述のように調製した(Sindhuら、2000)。毒素阻害剤をコードするプラスミドを選択するために、細胞をLRRに基づくライブラリによって形質転換して、選択プレート(50 mg/Lアンピシリン、20 mg/Lカナマイシン、40 μM IPTG、および30 μg/Lアンヒドロテトラサイクリンを添加したLB培地)上に播種して、25℃または37℃のいずれかで増殖させた。阻害特性がプラスミドに連鎖していることを確認するために、pQE誘導体を再度単離して、再度形質転換した。
中等度のレベルの毒素でも単独では細菌において認容できないため、様々な細菌毒素が対応する抗毒素と共に存在することが知られている。したがって、CcdBの遺伝子(Jensenら、1995)を、DH5□Z1(LutzおよびBujard、1997)、XL10Gold、またはXL1Blueのようなテトラサイクリン抑制株において堅固に抑制されたテトラサイクリンプロモーターと共にpZシリーズの低コピープラスミドにクローニングした。これと同時に、0.1%活性を有する野生型バーナーゼ(barnase)(Hartley、1988)およびH102K変異体(JucovicおよびHartley、1996)をクローニングした。これらの毒素プラスミドの一つを有する化学的コンピテント細胞を記述のように調製して(Inoueら、1990)、これらの毒素プラスミドの一つを有するエレクトロポレーションコンピテント細胞を記述のように調製した(Sindhuら、2000)。毒素阻害剤をコードするプラスミドを選択するために、細胞をLRRに基づくライブラリによって形質転換して、選択プレート(50 mg/Lアンピシリン、20 mg/Lカナマイシン、40 μM IPTG、および30 μg/Lアンヒドロテトラサイクリンを添加したLB培地)上に播種して、25℃または37℃のいずれかで増殖させた。阻害特性がプラスミドに連鎖していることを確認するために、pQE誘導体を再度単離して、再度形質転換した。
効率よく折り畳まれた構築物のスクリーニング
GFPは、標的タンパク質のC末端に融合させた場合に折り畳みレポーターとして首尾よく用いられてきた(Waldoら、1999)。急速に凝集する標的は、C末端融合GFPを折り畳ませず、コロニーをUV光においてスクリーニングすることができる。GFPの蛍光は、正しく折り畳まれたタンパク質の量に相関した。本発明者らの戦略において、GFPを、MTS5aおよびMTS6、ならびに再度pTRP-PRIを鋳型として用いて、PCR増幅によって得られたC末端に設計されたNheI部位およびEcoRI部位にクローニングした。それによって、アミノ酸12個のリンカー、GSAGSAAGSGEFを導入した。得られたDNA断片は、正しいフレームに翻訳されたアミノ酸を有することが示された(図8の底部)。
GFPは、標的タンパク質のC末端に融合させた場合に折り畳みレポーターとして首尾よく用いられてきた(Waldoら、1999)。急速に凝集する標的は、C末端融合GFPを折り畳ませず、コロニーをUV光においてスクリーニングすることができる。GFPの蛍光は、正しく折り畳まれたタンパク質の量に相関した。本発明者らの戦略において、GFPを、MTS5aおよびMTS6、ならびに再度pTRP-PRIを鋳型として用いて、PCR増幅によって得られたC末端に設計されたNheI部位およびEcoRI部位にクローニングした。それによって、アミノ酸12個のリンカー、GSAGSAAGSGEFを導入した。得られたDNA断片は、正しいフレームに翻訳されたアミノ酸を有することが示された(図8の底部)。
停止コドンを含まない構築物の選択
ライブラリの構築後のフレームシフトおよび停止コドンの数を減少させるために、構築物を、クロラムフェニコール耐性遺伝子に結合するリンカーの上流でクローニングして、プレート上で生存クローンを選択した。
ライブラリの構築後のフレームシフトおよび停止コドンの数を減少させるために、構築物を、クロラムフェニコール耐性遺伝子に結合するリンカーの上流でクローニングして、プレート上で生存クローンを選択した。
ディスプレイ技術を用いた結合標的の選択
インビトロでの結合パートナーを同定するために、リボソームディスプレイ(Hanesら、1998)およびファージディスプレイ(Dunn、1996)の双方を用いた。結合パートナーは、RNaseスーパーファミリーのRNaseAおよびオンコナーゼ(Wuら、1993b)ならびに無関係な小さいポリペプチドであるタンパク質D(ForrerおよびJaussi、1998)であった。
インビトロでの結合パートナーを同定するために、リボソームディスプレイ(Hanesら、1998)およびファージディスプレイ(Dunn、1996)の双方を用いた。結合パートナーは、RNaseスーパーファミリーのRNaseAおよびオンコナーゼ(Wuら、1993b)ならびに無関係な小さいポリペプチドであるタンパク質D(ForrerおよびJaussi、1998)であった。
タンパク質相補性アッセイを用いる結合標的の選択
結合パートナーを同定するために、大腸菌ゲノムライブラリをDHFR1断片(Pelletierら、1998)に融合したが、LRRに基づくライブラリは、DHFR2の隣に融合した。トリメトプリムを含むM9プレート上での選択によって、相互作用分子が得られた。
結合パートナーを同定するために、大腸菌ゲノムライブラリをDHFR1断片(Pelletierら、1998)に融合したが、LRRに基づくライブラリは、DHFR2の隣に融合した。トリメトプリムを含むM9プレート上での選択によって、相互作用分子が得られた。
得られた構築物を改善するためのDNAモジュールシャッフリング
さらなる発展的改善のために、得られた構築物にDNAシャッフリング(Stemmer、1994)および戻し交配を行った。これにより、改善を高めることができ、作用を有しない変異は失われた。
さらなる発展的改善のために、得られた構築物にDNAシャッフリング(Stemmer、1994)および戻し交配を行った。これにより、改善を高めることができ、作用を有しない変異は失われた。
実施例2
アンキリン反復単位に由来する反復モジュールを含む(ポリ)ペプチド/タンパク質の集合体
本発明に従って設計されたアンキリン反復タンパク質を作製する方法を記述する。この方法によって、N末端アンキリンキャッピングモジュール、二つまたはいくつかのアンキリン反復モジュールおよびC末端アンキリンキャッピングモジュールを用いて様々な長さのアンキリン反復タンパク質を構築することが可能である。
アンキリン反復単位に由来する反復モジュールを含む(ポリ)ペプチド/タンパク質の集合体
本発明に従って設計されたアンキリン反復タンパク質を作製する方法を記述する。この方法によって、N末端アンキリンキャッピングモジュール、二つまたはいくつかのアンキリン反復モジュールおよびC末端アンキリンキャッピングモジュールを用いて様々な長さのアンキリン反復タンパク質を構築することが可能である。
実施例1におけるアンキリン反復モジュールの集合体を作製するための基礎であったアンキリン反復モチーフの定義を下記に説明する。アンキリン反復モチーフに至った分析には、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質の構造分析に関すると共に天然アンキリン反復タンパク質に関する公共のデータベースの検索が含まれた。この分析のために、アンキリン反復モジュールの配列モチーフを誘導してアンキリンキャッピングモジュールを誘導した。さらに、アンキリン反復モチーフに関して骨格と標的相互作用残基の位置を決定した。アンキリン反復モジュールのライブラリを作製するために、天然のアミノ酸20個中17個が、アンキリン反復モチーフにおける標的相互作用残基の位置で許容された。骨格残基の位置は、それぞれ特定のアミノ酸に指定された。得られたペプチド配列を、コドンの使用が大腸菌において最適であるが望ましくない制限部位を作製しないように逆翻訳した。オリゴヌクレオチドは、アンキリン反復モジュールのアセンブリPCRを行うことができるように設計した。従来のオリゴヌクレオチドと共にトリヌクレオチドオリゴヌクレオチド(Virnekasら、1994)を用いた(表2および表3)。同様に、N末端およびC末端アンキリンキャッピングモジュールは、従来のオリゴヌクレオチドを用いてアセンブリPCRによって作製した(表2)。得られたPCR産物は全て、それらの末端でIIs型制限酵素認識部位(図17)を含み、その末端でその後次の/前の反復(またはキャッピング)モジュールのDNAに結合されると考えられる(図18)。それぞれの制限酵素によって切断すると、得られた互換的モジュール末端は、いずれの方向にもインフレームでライゲーションすることができると考えられる。したがって、N末端アンキリンキャッピングモジュールは一つまたはいくつかのアンキリン反復モジュールにライゲーションすることができ、ライゲーション産物は、C末端アンキリンキャッピングモジュールにライゲーションすることができる。DNAが既定の位置で異なるために、この方法によって、アンキリン反復タンパク質の集合体をコードするDNA分子の多様な組を同時に構築することが可能であった。アンキリン反復タンパク質の得られた集合体の特徴は、結晶化と共に、発現、精製、円偏光二色性分光法、変性実験、サイズ排除クロマトグラフィーによって調べた。実験によって、このアンキリン反復タンパク質ライブラリの非選択メンバーを、可溶性および折り畳まれた配座で、細胞質の還元的環境において高レベルで発現させることができることが示された。
アンキリン反復モチーフ配列の定義
技法および結果:
本発明の実施例として用いたアンキリン反復モチーフは、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質の構造分析と共にアンキリン反復タンパク質配列分析に由来した(日時:2000年8月)。
技法および結果:
本発明の実施例として用いたアンキリン反復モチーフは、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質の構造分析と共にアンキリン反復タンパク質配列分析に由来した(日時:2000年8月)。
アンキリン反復単位のアミノ酸配列に関してまず、SMARTデータベース(Schultzら、2000)を検索した。229アンキリン反復単位のClustal-W(Thompsonら、1994)アラインメントを、アンキリン反復単位のコンセンサス「A」を決定するための鋳型として用いた(図19)。コンセンサス「A」は、アンキリン反復単位のアラインメントのそれぞれの位置に関する残基頻度発生率を計算することによって決定した。考慮した229アンキリン反復単位は、これまでに述べた一般的なアンキリン反復単位コンセンサス配列と比較して、挿入または欠失を含まなかった(SedgwickおよびSmerdon、1999)。しかし、コンセンサス「A」には、セドウィック(Sedgwick)およびスマードン(Smerdon)(1999)の長さアミノ酸33個のコンセンサス配列の残基3個〜32個のみが含まれた(図19)。コンセンサスをさらに精密化して、欠損する位置を定義するために、GenBank(Bensonら、2000)に対するBLAST(Altschulら、1990)検索をデフォルトパラメータを用いて行った。この検索に関して、コンセンサス「A」は、最初のアミノ酸として20位で環状入れ替え型として提出された(図19)。欠失または曖昧な位置に、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質のアンキリン反復単位のコンセンサスにおいて最高の頻度を有する残基を当てはめた(手動で整列化、上記の統計学)。得られたBLASTヒットの最初の200個を手動で配列させて、アンキリン反復単位コンセンサス「A」を上記のように残基頻度分析によって精密化して、コンセンサス「B」を得た(図19)。「コンセンサス「B」は、pfamデータベースの同一の分析によって確認した(Batemanら、1999;データは示していない)。
最後のアンキリン反復単位コンセンサス「C」(図19)を、この段落において言及した方法を組み入れることによって得た。アンキリン反復タンパク質の公表された三次元構造を肉眼で検分して、どのアミノ酸が特定の位置で最適であるかをさらに決定した。アンキリン反復単位コンセンサス「B」に対して最高の相同性を示す三次元構造である、マウスGA結合タンパク質β1サブユニット(AC:2981726、pdb);1AWC;Batchelorら、1998)は、ほとんどの場合の指標基準であったが、ヒトp18(AC:4139830,pdb;1IHB;Venkatamaraniら、1998)のような他の構造も同様に検討した。天然アンキリン反復単位配列におけるアミノ酸の対、三重項および四重項の相互依存性も同様に、コンセンサス「B」をさらに開発または確認するために用いた。さらに、相同性モデリングおよびエネルギー最小化を含むモデリングアプローチ(インサイトIIパッケージ;インフォマックスインク、アメリカ)を行って、最適な空洞回避および充填最適化に向けてコンセンサス配列を作製した。コンセンサスのそれぞれの残基の二次構造傾向(O'NeilおよびDeGrado、1990;ChouおよびFasman、1978)は、天然のアンキリン反復単位内の対応する位置で二次構造に一致することをさらに確認した。さらに、PhD-予測を用いて(Rost B.、1996)二次構造を分析して確認した。タンパク質の安定性およびコンセンサスのプロテアーゼ抵抗性は、PEST(Rogersら、1986;スイス生物情報研究所、スイス)およびGCGのペプチドソート(アクセルリス社、アメリカ;Womble, D.D.、2000)を用いて分析して、コンセンサスは十分に安定であると予想された。
コンセンサス「C」(図19)に対するアンキリン反復単位コンセンサス「B」(図19)の定義の際の重要な残基は16位、17位、18位、19位、21位、22位、25位、および26位であった。16位は、その位置から前の反復と隠れた水素結合を作製することから、最終的にヒスチジンであると決定された。17位のロイシンは、最終的にこれが二つの反復モジュールの界面を安定化させることから他のアミノ酸より好ましかった。18位のグルタミン酸は、ヒトp18においてこの位置でグルタミン酸とアスパラギン酸塩の反復を生じるために選択した。同様に、21位のグルタミン酸は、マウスGA結合タンパク質における多数の連続コピーに存在する。25位のリジンは、マウスGA結合タンパク質において塩基性残基であるアルギニンとリジンが繰り返し存在することから、他のアミノ酸より好ましかった。26位に関して、三つのアミノ酸、ヒスチジン、チロシン、またはアスパラギンは全てこの位置の要件を満たすために、これらのアミノ酸のいずれも用いる折衷案を選択した。したがって、19位および22位には、これらの残基が等しく十分に適合することから、イソロイシンまたはバリン、およびバリンまたはロイシンをそれぞれ当てはめた。
最終的に決定されたアンキリン反復単位コンセンサス「C」(図19)は、アンキリン反復モジュールの基礎として役立った。アンキリン反復モチーフの配列を図20に示す。クローニングの理由から、モチーフは、環状入れ替え型コンセンサス「C」に基づく。図19において用いたコンセンサス番号付けスキームを一致させるために、そしてセドウィック(Sedgwick)およびスマードン(Smerdon)(1999)によって用いられるように、アンキリン反復モチーフにおける位置の数字はアミノ酸配列に平行して環状に入れ替えた。アンキリン反復モチーフはアミノ酸33個の長さであり、そのうち27個の位置は骨格残基であると定義され、位置6個は標的相互作用残基であると定義された。骨格残基の位置は、アンキリン反復単位コンセンサス「C」を用いて定義した。三次元構造の分によっては、アンキリン反復単位の2位、3位、5位、13位、14位、および33位がタンパク質-タンパク質相互作用に関係し、したがって、標的相互作用残基を構成することが示された。これはまた、アンキリン反復単位コンセンサスの定義の際に示されたこれらの位置の高い多様性によっても示唆された。アンキリン反復モジュールに関して、これらの残基は、17個のアミノ酸A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYのいかなるものであると定義された。
したがって、アンキリン反復モジュールの集合体の独立したメンバーの数は、3・176=72'412'707個であると計算することができる。
アンキリンキャッピングモジュールの定義
技法および結果:
誘導したアンキリン反復モチーフはマウスGA結合タンパク質のβ1サブユニット(GABPβ1;AC:2981726;Batchelorら、1998)と高い相同性を示したために、後者のタンパク質のN末端およびC末端アンキリン反復キャッピング単位(Batchelorら、1998)に従う反復1および反復5)を、N末端およびC末端キャッピングモジュールの基礎として選択した。N末端およびC末端アンキリンキャッピングモジュールはいずれもマウスGA結合タンパク質β1キャッピング単位と比較して変更しなければならなかった。N末端GA結合タンパク質β1キャッピング単位は、アンキリン反復モチーフの設計に立体的に適合するようにそのループを改変した。C末端GA結合タンパク質β1キャッピング単位を、いくつかの位置で改変した。GA結合タンパク質β1の反復4のループの一部ならびに反復4および5と結合するβヘアピン(Batchelorら、1998)は、クローニングの理由のためにC末端キャッピングモジュールに含めなければならなかった。それによって、ループおよびβヘアピンは、アンキリン反復モチーフの設計に立体的に適合するように改変された。改変は、GABPβ1を、本発明によるタンパク質ライブラリのメンバーであるE3-5と整列化させた図21において示すことができる(下記参照)。
技法および結果:
誘導したアンキリン反復モチーフはマウスGA結合タンパク質のβ1サブユニット(GABPβ1;AC:2981726;Batchelorら、1998)と高い相同性を示したために、後者のタンパク質のN末端およびC末端アンキリン反復キャッピング単位(Batchelorら、1998)に従う反復1および反復5)を、N末端およびC末端キャッピングモジュールの基礎として選択した。N末端およびC末端アンキリンキャッピングモジュールはいずれもマウスGA結合タンパク質β1キャッピング単位と比較して変更しなければならなかった。N末端GA結合タンパク質β1キャッピング単位は、アンキリン反復モチーフの設計に立体的に適合するようにそのループを改変した。C末端GA結合タンパク質β1キャッピング単位を、いくつかの位置で改変した。GA結合タンパク質β1の反復4のループの一部ならびに反復4および5と結合するβヘアピン(Batchelorら、1998)は、クローニングの理由のためにC末端キャッピングモジュールに含めなければならなかった。それによって、ループおよびβヘアピンは、アンキリン反復モチーフの設計に立体的に適合するように改変された。改変は、GABPβ1を、本発明によるタンパク質ライブラリのメンバーであるE3-5と整列化させた図21において示すことができる(下記参照)。
実験技法
実施例Aにおける全ての章に関して、サムブルック(Sambrook), J.、フリッチュ(Fritsch), E.F.およびマニアティス(Maniatis), T.、(1989;「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular cloning:a laboratory manual)」、Cold Spring Laboratory Press、New York)、またはアウスユベール(Ausubel), F.M.、ブレント(Brent), R.、キングストン(Kingston), R.E.、ムーア(Moore), D.D.、セイドマン(Seidman), J.G.、スミス(Smith), J.A.およびストルール(Struhl), K.、(1994;「分子生物学の現行プロトコール(Current protocols in molecular biology)」、John Wiley and Sons, Inc.、New York)の第1〜4巻、またはコリガン(Coligan, J.E.)、ダン(Dunn, B.M.)、プロー(Ploegh, H.L.)、スペイチャー(Speicher, D.W.)およびウィングフィールド(Wingfield, P.T.、(1995;「タンパク質科学の現行プロトコール(Current protocols in protein science)」、John Wiley and Sons, Inc.、New York)の第1巻および第2巻に記載されるプロトコールに従って実施した。
実施例Aにおける全ての章に関して、サムブルック(Sambrook), J.、フリッチュ(Fritsch), E.F.およびマニアティス(Maniatis), T.、(1989;「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular cloning:a laboratory manual)」、Cold Spring Laboratory Press、New York)、またはアウスユベール(Ausubel), F.M.、ブレント(Brent), R.、キングストン(Kingston), R.E.、ムーア(Moore), D.D.、セイドマン(Seidman), J.G.、スミス(Smith), J.A.およびストルール(Struhl), K.、(1994;「分子生物学の現行プロトコール(Current protocols in molecular biology)」、John Wiley and Sons, Inc.、New York)の第1〜4巻、またはコリガン(Coligan, J.E.)、ダン(Dunn, B.M.)、プロー(Ploegh, H.L.)、スペイチャー(Speicher, D.W.)およびウィングフィールド(Wingfield, P.T.、(1995;「タンパク質科学の現行プロトコール(Current protocols in protein science)」、John Wiley and Sons, Inc.、New York)の第1巻および第2巻に記載されるプロトコールに従って実施した。
本発明によるアンキリン反復タンパク質をコードするDNAの合成
技法および結果:
オリゴヌクレオチドINT1およびINT2はトリヌクレオチドから部分的に構築して(Virnekasら、1994)、モルフォシス(MorphoSys)(ドイツ)から得た。他のオリゴヌクレオチドは全て、標準的な技術によって合成して、マイクロシンスから得た(スイス、表2および表3を参照のこと)。DNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドは、100 μM保存液濃度で用い、鋳型として用いるオリゴヌクレオチドは、10 μM保存液として用いた。酵素および緩衝液はニューイングランドバイオラブス(アメリカ)またはファーメンタス(リトアニア)社から得た。クローニング株は大腸菌XL1-Blue(ストラタジーン社)であった。
技法および結果:
オリゴヌクレオチドINT1およびINT2はトリヌクレオチドから部分的に構築して(Virnekasら、1994)、モルフォシス(MorphoSys)(ドイツ)から得た。他のオリゴヌクレオチドは全て、標準的な技術によって合成して、マイクロシンスから得た(スイス、表2および表3を参照のこと)。DNAを増幅するためのオリゴヌクレオチドは、100 μM保存液濃度で用い、鋳型として用いるオリゴヌクレオチドは、10 μM保存液として用いた。酵素および緩衝液はニューイングランドバイオラブス(アメリカ)またはファーメンタス(リトアニア)社から得た。クローニング株は大腸菌XL1-Blue(ストラタジーン社)であった。
アンキリン反復モジュールは、3.5 mM MgSO4を追加的に添加した標準的な緩衝液中で、オリゴヌクレオチド(それぞれ1μl)INT1、INT2、INT3、INT4、INT5、およびINT6a[95℃5分間、20×(95℃30秒間、50℃1分間、72℃30秒間)、72℃5分間]ならびにVent DNAポリメラーゼを用いるアセンブリPCRによって、最終容積50 μlで作製した。
N末端アンキリンキャッピングモジュールは、オリゴヌクレオチド(それぞれ1μl)EWT1、EWT2、TEN3、およびINT6[95℃5分間、30×(95℃30秒間、40℃1分間、72℃30秒間)、72℃5分間]ならびにVent DNAポリメラーゼを用いるアセンブリPCRによって反応容積50 μlで調製した。得られたDNAはBamHI/HindIIIによってpQE30(キアゲン社、ドイツ)にクローニングした。DNA配列は標準的な技術を用いて確認した、C末端アンキリン反復モジュールはそれに従って、しかし、オリゴヌクレオチドWTC1、WTC2、WTC3およびINT5を用いて調製した。
単一のアンキリン反復モジュールからのアンキリン反復タンパク質をコードするDNAと、アンキリン反復キャッピングモジュールとのライゲーションを図18に略図で示す。アンキリン反復タンパク質を構築するために、クローニングしたN末端アンキリンキャッピングモジュールをオリゴヌクレオチドTEN3およびINT6aを用いてPCR増幅した(N末端アンキリンキャッピングモジュールに関して上記の通り)。DNAは、QIAquickDNA精製キット(キアゲン社、ドイツ)を用いて精製して、BsaIによって切断して、同じキットを用いて再度精製した。次に、N末端アンキリンキャッピングモジュールをBpiI切断物および精製アンキリン反復モジュールにライゲーションした。この定方向クローニングは、切断配列とは異なるDNA配列を認識する(図17)二つの種類のIIs制限酵素であるBpiIおよびBsaIの切断配列を、非対称性であるが互いに互換的であるように選択したために可能であった。N1と呼ばれるライゲーション産物をゲル精製して(LMP-アガロース、β-アガラーゼ、酢酸ナトリウム/エタノール沈殿)、オリゴヌクレオチド(それぞれ1μl)EWT3およびINT6b[95℃5分間、20×(95℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間)、72℃5分間]ならびにVent DNAポリメラーゼを用いるアセンブリPCRによって反応容積50 μlの標準的な緩衝液においてPCR増幅した。増幅産物を、QIAquickを用いて精製し、BsaIを用いて切断して再度精製した。次に、BpiI切断アンキリン反復モジュールにライゲーションすると、新しいサイクルの伸張を開始し、これを所望の数のアンキリン反復モジュールがN末端アンキリンキャッピングモジュール(N2、N3、N4などと呼ばれる)に付加されるまで繰り返した。PCR増幅N2、N3、およびN4に対応するDNA種をBsaIによって切断して、これを、クローニングしたC末端アンキリンキャッピングモジュールの予めBpiIによって切断したPCR産物にライゲーションした。これによって、N2C、N3C、およびN4Cアンキリン反復タンパク質ライブラリをコードするDNA分子が得られた。最終産物を、EWT3およびWTC3それぞれ1μl[95℃5分間、25×(95℃30秒間、50℃30秒間、72℃1分間)、72℃5分間]を用いてPCR増幅して、BamHI/HindIIIによってpQE30(キアゲン社)にクローニングした。
タンパク質発現と精製
技法:
大腸菌XL1-Blue(ストラタジーン社)を、異なる長さのアンキリン反復タンパク質を発現させるための株として用いた。N2Cに対応する二つのクローン(E2-5およびE2-17と呼ぶ)、N3Cに対応する二つのクローン(E3-5およびE3-19)、ならびにN4Cに対応する二つのクローン(E4-2およびE4-8)を無作為に選択してさらに分析した。これらのクローンの静止期一晩培養物(LB、1%グルコース、100 mg/Lアンピシリン;37℃)25 mlを、培養物1リットルに接種した(前培養と同じ培地)。OD600=0.7になった時に、培養物を300 μM IPTGによって誘導して4時間インキュベートした。様々な時点で試料を採取して、SDS-PAGEで分析した(図22を参照のこと)。培養物を遠心分離して、得られた沈降物をTBS500 40 mlに溶解して(50 mMトリス塩酸、pH 8.0、500 mM NaCl)、超音波処理した。次に、溶解物に10%グリセロールおよび20 mMイミダゾールを加えて、再度遠心分離した。得られた上清を、製造元に従って(キアゲン社、ドイツ)Hisタグカラム(カラム容積2.5 cl)上での精製のために用いた。
技法:
大腸菌XL1-Blue(ストラタジーン社)を、異なる長さのアンキリン反復タンパク質を発現させるための株として用いた。N2Cに対応する二つのクローン(E2-5およびE2-17と呼ぶ)、N3Cに対応する二つのクローン(E3-5およびE3-19)、ならびにN4Cに対応する二つのクローン(E4-2およびE4-8)を無作為に選択してさらに分析した。これらのクローンの静止期一晩培養物(LB、1%グルコース、100 mg/Lアンピシリン;37℃)25 mlを、培養物1リットルに接種した(前培養と同じ培地)。OD600=0.7になった時に、培養物を300 μM IPTGによって誘導して4時間インキュベートした。様々な時点で試料を採取して、SDS-PAGEで分析した(図22を参照のこと)。培養物を遠心分離して、得られた沈降物をTBS500 40 mlに溶解して(50 mMトリス塩酸、pH 8.0、500 mM NaCl)、超音波処理した。次に、溶解物に10%グリセロールおよび20 mMイミダゾールを加えて、再度遠心分離した。得られた上清を、製造元に従って(キアゲン社、ドイツ)Hisタグカラム(カラム容積2.5 cl)上での精製のために用いた。
結果:
細胞分画実験から、全てのアンキリン反復タンパク質が、200 mg/L培養物の収率で可溶性型で発現されることが示された(図22)。Hisタグ精製によって、1回の精製段階で純粋なタンパク質が得られた(図23)。タンパク質の完全性はさらに、質量分析によって確認した(示していない)。可溶性型での発現は、設計された反復タンパク質の適切な折り畳みを示している。
細胞分画実験から、全てのアンキリン反復タンパク質が、200 mg/L培養物の収率で可溶性型で発現されることが示された(図22)。Hisタグ精製によって、1回の精製段階で純粋なタンパク質が得られた(図23)。タンパク質の完全性はさらに、質量分析によって確認した(示していない)。可溶性型での発現は、設計された反復タンパク質の適切な折り畳みを示している。
サイズ排除クロマトグラフィー
技法:
上記の精製試料6個を、ファルマシアSMARTシステムを用いて流速60 μl/分で、TBS 150(50 mMトリス塩酸、pH 7.5;150 mM NaCl)を実施緩衝液としてSuperdex75カラム(アマシャムファルマシアバイオテク、USA)上で分析した。標準物質は、□-アミラーゼ(シグマ社)およびファージタンパク質pDおよびSHPであった(Yangら、2000)。例として、N3C-ライブラリメンバーであるE3-5の溶出プロフィールを図24に示す。
技法:
上記の精製試料6個を、ファルマシアSMARTシステムを用いて流速60 μl/分で、TBS 150(50 mMトリス塩酸、pH 7.5;150 mM NaCl)を実施緩衝液としてSuperdex75カラム(アマシャムファルマシアバイオテク、USA)上で分析した。標準物質は、□-アミラーゼ(シグマ社)およびファージタンパク質pDおよびSHPであった(Yangら、2000)。例として、N3C-ライブラリメンバーであるE3-5の溶出プロフィールを図24に示す。
結果:
溶出プロフィールから、調べたタンパク質がほとんどの場合単量体のみであることが示されたが、タンパク質試料の少量(E2-17およびE4-8)は、単量体の他に多量体であったが可溶性である種を示した。ゲル濾過によって測定した保持から、調べたタンパク質が折り畳まれておりランダムコイルではないことが示された。
溶出プロフィールから、調べたタンパク質がほとんどの場合単量体のみであることが示されたが、タンパク質試料の少量(E2-17およびE4-8)は、単量体の他に多量体であったが可溶性である種を示した。ゲル濾過によって測定した保持から、調べたタンパク質が折り畳まれておりランダムコイルではないことが示された。
CD分光法
技法:
本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質(E3-5、N3C分子)の円偏光二色性スペクトルは、pH 6.5の10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(天然)またはpH 6.5の20 mMリン酸緩衝液および6M塩酸グアニジニウム(変性)のいずれかにおいて、Jasco J-715機器[ジャスコ、日本;10 nm/s、8秒反応、0.2 nmデータピッチ、2nmバンド幅、195 nm〜250 nm(天然)、または212 nm〜250 nm(変性)、3回蓄積、1試料あたり3回測定、1mmキュベット]を用いて記録した。CDシグナルは、変性条件で280 nmで分光測光法によって決定した試料の濃度を用いて平均残基楕円率に変換した。
技法:
本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質(E3-5、N3C分子)の円偏光二色性スペクトルは、pH 6.5の10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(天然)またはpH 6.5の20 mMリン酸緩衝液および6M塩酸グアニジニウム(変性)のいずれかにおいて、Jasco J-715機器[ジャスコ、日本;10 nm/s、8秒反応、0.2 nmデータピッチ、2nmバンド幅、195 nm〜250 nm(天然)、または212 nm〜250 nm(変性)、3回蓄積、1試料あたり3回測定、1mmキュベット]を用いて記録した。CDシグナルは、変性条件で280 nmで分光測光法によって決定した試料の濃度を用いて平均残基楕円率に変換した。
結果:
E3-5は最小で208 nmおよび222 nmにおいて天然条件下でαヘリックススペクトルを示した。二次構造は6M塩酸グアニジニウム中で失われる(図25)。このことは、E3-5における二次構造要素が適切に形成されていることを示している。
E3-5は最小で208 nmおよび222 nmにおいて天然条件下でαヘリックススペクトルを示した。二次構造は6M塩酸グアニジニウム中で失われる(図25)。このことは、E3-5における二次構造要素が適切に形成されていることを示している。
変性挙動
技法:
本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質(E2-5、E3-5、およびE4-8、図22)の変性挙動を、基本的に図25に示す円偏光二色性によってしかし異なる緩衝液を用いて測定した。塩酸グアニジニウム変性曲線は、20 mM NaPO4、pH 6.5、100 mM NaCl中で塩酸グアニジニウムの異なる濃度でインキュベートした異なるタンパク質を用いて220 nmでCD分光測光法によって、室温で一晩測定した。220 nmでの円偏光二色性シグナルは、各試料において1試料あたり3本ずつ測定した。
技法:
本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質(E2-5、E3-5、およびE4-8、図22)の変性挙動を、基本的に図25に示す円偏光二色性によってしかし異なる緩衝液を用いて測定した。塩酸グアニジニウム変性曲線は、20 mM NaPO4、pH 6.5、100 mM NaCl中で塩酸グアニジニウムの異なる濃度でインキュベートした異なるタンパク質を用いて220 nmでCD分光測光法によって、室温で一晩測定した。220 nmでの円偏光二色性シグナルは、各試料において1試料あたり3本ずつ測定した。
結果:
塩酸グアニジニウムの異なる濃度に対するE2-5、E3-5、およびE4-8の変性曲線を図26に示す。変性の中央点は、2.5 M〜3.8 M塩酸グアニジニウムの範囲内である。したがって、二次構造は、変性剤の高濃度に限って失われ、このことは調べた分子の安定性が比較的高いことを示す。
塩酸グアニジニウムの異なる濃度に対するE2-5、E3-5、およびE4-8の変性曲線を図26に示す。変性の中央点は、2.5 M〜3.8 M塩酸グアニジニウムの範囲内である。したがって、二次構造は、変性剤の高濃度に限って失われ、このことは調べた分子の安定性が比較的高いことを示す。
結晶化
技法および結果:
本発明によるN3Cライブラリメンバーであるアンキリン反復タンパク質E3-5を、20%PEG 6000、100 mM MES/NaOH、pH 6.0中で9mgタンパク質/mlのTBS 50(50 mMトリス塩酸、pH 8.0、50 mM NaCl、図27を参照のこと)溶液から懸滴(2μlタンパク質および2μl緩衝液を混合;500μl緩衝液を貯蔵)によって20℃で5日間結晶化した。結晶は、予備的なX線実験において3Åに屈折した(示していない)。
技法および結果:
本発明によるN3Cライブラリメンバーであるアンキリン反復タンパク質E3-5を、20%PEG 6000、100 mM MES/NaOH、pH 6.0中で9mgタンパク質/mlのTBS 50(50 mMトリス塩酸、pH 8.0、50 mM NaCl、図27を参照のこと)溶液から懸滴(2μlタンパク質および2μl緩衝液を混合;500μl緩衝液を貯蔵)によって20℃で5日間結晶化した。結晶は、予備的なX線実験において3Åに屈折した(示していない)。
表
表1:ヒトRIに由来するライブラリのクローニングのために用いられるオリゴヌクレオチド;
表2:実施例2によるアンキリン反復モジュールの作製のために用いられるオリゴヌクレオチド;
表3:本発明による一つ以上のアンキリン反復モジュールを含むアンキリン反復タンパク質をクローニングするためと共にN末端およびC末端アンキリンキャッピングモジュールを作製するために用いられるオリゴヌクレオチド。
表1:ヒトRIに由来するライブラリのクローニングのために用いられるオリゴヌクレオチド;
表2:実施例2によるアンキリン反復モジュールの作製のために用いられるオリゴヌクレオチド;
表3:本発明による一つ以上のアンキリン反復モジュールを含むアンキリン反復タンパク質をクローニングするためと共にN末端およびC末端アンキリンキャッピングモジュールを作製するために用いられるオリゴヌクレオチド。
(表1) ヒトRIに由来するライブラリのクローニングのために用いられるオリゴヌクレオチド
1小文字はアニーリングのための領域を示す。
2略語:fwd-フォワード;rev-リバース。
3NNNはトリヌクレオチドの混合物を意味する。
1小文字はアニーリングのための領域を示す。
2略語:fwd-フォワード;rev-リバース。
3NNNはトリヌクレオチドの混合物を意味する。
(表2) 実施例2によるアンキリン反復モジュールを作製するために用いられるオリゴヌクレオチド
1NNNは、アミノ酸A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびY(Virnekasら、1994)をコードするトリヌクレオチドの混合物を意味する。
2Dは、A、T、またはGを表す。
1NNNは、アミノ酸A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびY(Virnekasら、1994)をコードするトリヌクレオチドの混合物を意味する。
2Dは、A、T、またはGを表す。
Claims (48)
- 各反復(repeat)タンパク質が、連続した反復モジュールの組(set)を含む反復ドメインを含み、各反復モジュールのそれぞれが、天然反復タンパク質ファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来し、反復単位が骨格残基および標的相互作用残基を含み、反復タンパク質が少なくとも一つの位置で異なる、反復タンパク質の集合体(collection)をコードする核酸分子の集合体。
- 反復モジュールのそれぞれがアミノ酸配列を有し、少なくとも70%のアミノ酸残基が、
(i)少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基;または
(ii)天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する、請求項1記載の集合体。 - 組が2個〜約30個の反復モジュールからなる、請求項1または2記載の集合体。
- 反復モジュールが直接結合している、請求項1から3のいずれか一項記載の集合体。
- 反復モジュールが(ポリ)ペプチドリンカーによって結合している、請求項1から3のいずれか一項記載の集合体。
- 反復ドメインが、反復モジュールのいずれか一つと異なるアミノ酸配列を有するN末端および/またはC末端キャッピングモジュールをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項記載の集合体。
- 反復単位がアンキリン反復である、請求項1から6のいずれか一項記載の集合体。
- 「x」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている(randomized)、請求項8から10のいずれか一項記載の集合体。
- 反復単位がロイシンリッチ反復(LRR)である、請求項1から6のいずれか一項記載の集合体。
- 「x」および/または「±」によって示される一つまたは複数の位置が無作為化されている、請求項14から16のいずれか一項記載の集合体。
- A型LRRコンセンサス配列における10位のシステイン残基が親水性アミノ酸残基に置換され、かつ17位のシステイン残基が疎水性アミノ酸残基に置換されている、請求項15記載の集合体。
- コンセンサス配列における一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている、請求項8から12、または14から18のいずれか一項記載の集合体。
- 組が一種類の反復モジュールからなる、請求項1から19のいずれか一項記載の集合体。
- 組が二つの異なる種類の反復モジュールからなる、請求項1から19のいずれか一項記載の集合体。
- 組が、反復ドメインにおける対として二つの異なる種類の連続した反復モジュールを含む、請求項20記載の集合体。
- 二つの異なる種類のモジュールがA型LRRおよびB型LRRに基づく、請求項21または22記載の集合体。
- 組に含まれる反復モジュールのアミノ酸配列が、無作為化残基を除く各種類に関して同一である、請求項20から23のいずれか一項記載の集合体。
- それぞれの種類のコピーをコードする核酸配列が、無作為化された位置におけるアミノ酸残基をコードするコドンを除いて同一である、請求項24記載の集合体。
- 核酸分子が、反復モジュールのあいだに少なくとも9ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む、請求項1から25のいずれか一項記載の集合体。
- 核酸分子が、対のあいだに少なくとも9ヌクレオチドの同一核酸配列を含む、請求項22または23記載の集合体。
- モジュールまたは対のあいだの核酸配列のそれぞれが制限酵素認識配列を含む、請求項1から26のいずれか一項記載の集合体。
- モジュールまたは対のあいだの核酸配列のそれぞれが、二つの互換的制限酵素によって作製された付着末端から形成された核酸配列を含む、請求項1から27のいずれか一項記載の集合体。
- 同一の核酸配列によって、PCRに基づく核酸分子の構築(assembly)を行うことができる、請求項26または27記載の集合体。
- 少なくとも一つのモジュール対における一つまたは複数のアミノ酸残基が、天然LRR内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている、請求項31記載の集合体。
- 少なくとも一つのモジュール対における一つまたは複数のアミノ酸コドンが、天然LRR内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基をコードするコドンに置換されている、請求項32記載の集合体。
- 請求項1から34のいずれか一項記載の核酸分子の集合体を含む組み換え型核酸分子の集合体。
- 請求項1から34のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、または請求項35記載の組み換え型核酸分子の集合体を含むベクターの集合体。
- 請求項1から34のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、請求項35記載の組み換え型核酸分子の集合体、または請求項36記載のベクターの集合体を含む、宿主細胞の集合体。
- 請求項1から34のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、請求項35記載の組み換え型核酸分子の集合体、請求項36記載のベクターの集合体によってコードされる、または請求項37記載の宿主細胞の集合体によって産生される、反復タンパク質の集合体。
- 請求項1から34のいずれか一項記載の核酸分子の集合体を構築する方法であり、以下の段階を含む方法:
(a) 反復タンパク質ファミリー由来の反復単位を同定する段階;
(b) 反復単位において骨格残基および標的相互作用残基を同定する段階;
(c) 反復タンパク質ファミリーの少なくとも一つのメンバーからの骨格残基および無作為化標的相互作用残基を含む、少なくとも一種類の反復モジュールを推定する段階;ならびに
(d) 段階(c)において推定された少なくとも一種類の反復モジュールの二つまたはそれ以上のコピーを含む反復タンパク質をそれぞれがコードする核酸分子を構築する段階。 - 段階(c)において推定された少なくとも一つの反復モジュールがアミノ酸配列を有し、少なくとも70%のアミノ酸残基が、
(i)少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基;または
(ii)天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する、請求項38記載の方法。 - 請求項38記載の反復タンパク質の集合体を作製する方法であり、以下の段階を含む方法:
(a)請求項37記載の宿主細胞の集合体を提供する段階;および
(b)宿主細胞に含まれる核酸分子の集合体を発現させる段階。 - 既定の特性を有する反復タンパク質を得る方法であり、以下の段階を含む方法:
(a) 請求項38もしくは39記載の、または請求項41に従って産生された、反復タンパク質の集合体を提供する段階;ならびに
(b) 既定の特性を有する少なくとも一つの反復タンパク質を得るために、集合体をスクリーニングする段階および/または集合体から選択する段階。 - 既定の特性が、標的に対する結合である、請求項42記載の方法。
- 請求項24から34のいずれか一項記載の集合体からの反復タンパク質。
- 請求項44記載の反復タンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項45記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項44記載の反復タンパク質または請求項45記載の核酸分子、ならびに選択的に、薬学的に許容される担体および/もしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
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