KR20220016942A - 재조합 fap 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP: fibroblast activation protein)에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 상기 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약학 조성물, 및 FAP-발현 조직, 예컨대 종양 조직에서 생물학적 활성 분자의 국소화 또는 전달을 위한 방법 및 인간을 포함한 포유류에서의 질환, 예컨대 암을 치료, 진단 또는 영상화하는 방법에서의 상기 결합 단백질, 핵산 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

재조합 FAP 결합 단백질 및 이의 용도
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 6월 4일자로 유럽 특허청에 출원된 유럽 특허 출원 EP19178277호의 우선권 및 그 이익을 주장한다. 유럽 특허 출원 EP19178277호의 내용은 모든 표, 도면 및 청구항을 포함하여 그 전체가 본원에서 참조 인용된다.
기술분야
본 발명은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP: fibroblast activation protein)에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 상기 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약학 조성물, 및 FAP-발현 조직, 예컨대 종양 조직에서의 생체분자 또는 생활성 화합물의 국소화 또는 전달을 위한 방법 및 인간을 포함한 포유류에서의 질환, 예컨대 암을 치료, 진단 또는 영상화하는 방법에서의 상기 결합 단백질, 핵산 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한 세프라아제(Seprase)로 공지된 섬유아세포-활성화 단백질 α(FAP)는 II형 내재 막 세린 펩티다아제이다. FAP는 디펩티딜 펩티다아제 IV 패밀리에 속한다(문헌[Yu et al., FEBS J. 277, 1126-1144 (2010)]). 이는 효소의 촉매적 도메인이 배치되는 거대 C-말단 세포외 도메인을 갖는 2개의 N-글리코실화 서브유닛을 함유하는 170 kDa 단독이량체이다(문헌[Scanlan et al., Proc Natl Acad Sci USA 91: 5657-5661 (1994)]; 문헌[Wonganu et al., Biochim Biophys Acta 1858(8):1876-82 (2016)]). 글리코실화 형태의 FAP는 프롤릴후(post-prolyl) 디펩티딜 펩티다아제 및 젤라티나아제 활성 모두를 갖는다(문헌[Sun et al., Protein Expr Purif 24, 274-281 (2002)]). 인간 FAP의 상동체는 마우스 및 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)(마카카 파시쿨라리스 ( Macaca fascicularis ))를 포함하는 여러 종에서 발견되었다.
FAP는 폐, 결장, 방광, 난소 및 유방 암종을 포함하여 시험된 상피 악성 종양(원발성 및 전이성) 중 90% 초과의 반응성 기질 섬유아세포에서, 그리고 뼈 및 연조직 육종의 악성 중간엽 세포에서 선택적으로 발현되는 반면, 이는 일반적으로 정상 성인 조직에 부재한다(문헌[Brennen et al., Mol. Cancer Ther. 11(2): 257-266 (2012)]; 문헌[Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)]; 문헌[Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335 (1993)]; 문헌[Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988)]). FAP는 또한 특정 악성 종양 세포에서 발현된다.
많은 일반적인 암에서의 이의 발현 및 정상 조직에서의 이의 제한된 발현으로 인해, FAP는 다양한 암의 영상화, 진단 및 요법을 위한 유망한 항원 표적으로 고려되었다. FAP에 대한 단클론성(monoclonal) 항체, FAP 효소적 활성의 소분자 저해제, 세포독성 화합물의 FAP-활성화 전구약물 및 FAP-특이적 CAR T 세포를 포함하여, 임상적 이득을 위한 종양 기질에서의 FAP의 선택적 발현을 이용하기 위한 다양한 접근법이 고안되었다.
FAP에 대한 다수의 단클론성 항체, 예를 들어 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 F19 항체의 인간화 버전인 시브로투주맙(Sibrotuzumab)(문헌[Scott et al., Clin. Cancer Res. 9, 1639-1647 (2003)]; F19 에피토프 특이성을 갖는 인간 FAP에 대한 추가 인간화 또는 완전 인간 항체(문헌[Mersmann et al., Int J Cancer 92, 240-248 (2001)]; 문헌[Schmidt et al., Eur J Biochem 268, 1730-1738 (2001)]); 및 F19에 의해 인식되는 것과 상이한 에피토프를 인식하고 인간 및 마우스 FAP 단백질에 교차-반응성인 scFv MO36(문헌[Brocks et al., Mol Med 7, 461-469 (2001)])이 개발되었다. FAP에 대한 항체 중 일부는 FAP의 효소적 활성을 저해한다. 예를 들어, scFv 항체 E3 및 이의 유도체는 FAP 효소적 활성 및 생물학적 기능을 유의하게 저해하였다(문헌[Zhang et al., FASEB J. 2013 Feb; 27(2): 581-589]). 종양 생물학에서 FAP의 역할은 복잡하고 완전히 이해되지 않았으므로, 종양 생물학에서의 FAP 저해의 잠재적 효과가 또한 완전히 이해되지 않았다.
특이적 항체 융합 분자가 또한 개발되었고, 예를 들어 Bauer 등(문헌[Journal of Immunology 172: 3930-3939 (2004)])은 IgG1 CH2/CH3 Fc 도메인을 대체하는 인간화 항-FAP 항체 및 인간 종양 괴사 인자(TNF)로 이루어지는 융합 단백질의 생성을 보고하였다. 또한,
Figure pct00001
등(문헌[Mol. Cancer Ther. 15(5): 946-57 (2016)])은 종양 기질에서의 암-관련 섬유아세포 상의 FAP 및 종양 세포 상의 사멸 수용체 DR5를 동시에 표적으로 하는 이중특이적 항체의 조작(engineering)을 보고하였다.
종양 영상화 및 암 진단 접근법이 또한 기재되었고, 예를 들어
Figure pct00002
등(문헌[J. Control Release 186:1-10 (2014)])은 FAP를 겨눈 특이적 단쇄 Fv 절편을 포함하는 형광-활성화가능 리포좀의 생성을 보고하였고, 전신 형광 영상화에 의한 FAP-발현 종양 세포의 형광 진단 영상화에서의 사용에 관한 그 잠재력을 평가하였다. 또한, Hua 등(문헌[Diagnostic Pathology 6:111 (2011)])은 항-FAP 항체를 사용한 FAP에 대한 염색이 유방 관상피내암(DCIS: ductal carcinoma in situ) 유방암이 미세침윤을 야기하였는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있는지 여부를 조사하였다.
종양 기질에서 FAP 발현은 또한 국소적으로 활성화된 전구약물을 개발하려는 시도로 이어졌다. Brennen 등(문헌[Mol. Cancer Ther. 11(2): 257-266 (2012)])은 종양 기질 내의 세포독성 화합물의 활성화를 표적으로 하는 FAP-활성화 전구약물을 개발하기 위한 FAP의 제한된 발현 및 독특한 기질 선호도의 이점을 취하는 접근법을 논의하였다.
종합하여, FAP에 대한 항체가 암 요법, 영상화 및 진단에 유용할 수 있음이 제안되었다. 첫 번째 고무적인 결과에도 불구하고, FAP-특이적 결합으로부터의 이점이 있는 암의 치료 및 특징 분석을 위한 치료적, 진단적 및 영상화 접근법에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 상기 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약학 조성물, 및 FAP-발현 세포 또는 조직, 예컨대 종양 조직에 대한 생물학적 활성 분자의 국소화 또는 전달을 위한 방법 및 인간을 포함한 포유류에서의 질환, 예컨대 암을 치료, 진단 또는 영상화하는 방법에서의 상기 결합 단백질, 핵산 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 안키린 반복 도메인 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 75% 및 100% 이하인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고; SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 상기 안키린 반복 도메인의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A로 교환된다. 예로서, 한 특정 구현예에서, 본 발명의 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 48 내지 134의 안키린 반복 모듈 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80% 및 100% 이하인 안키린 반복 모듈을 포함한다. 예로서, 한 특정 구현예에서, 본 발명의 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 94 내지 96으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 한 특정 구현예에서, 본 발명의 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 갖는 안키린 반복 모듈, SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 갖는 안키린 반복 모듈, 및 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 갖는 안키린 반복 모듈을 포함한다.
또다른 양태에서, 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는, 상기 FAP-특이적 재조합 결합 단백질을 제공한다. 생물학적 활성 분자는 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 독소, 중합체, 및 핵산을 포함하는, 상이한 구조적 및 기능적 부류의 분자로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 생물학적 활성 분자는 FAP-특이적 재조합 결합 단백질에 공유 결합된다. 공유 결합은 융합 단백질을 야기하는, FAP-특이적 결합 단백질과 생물학적 활성 펩티드 또는 폴리펩티드 사이의 펩티드 결합일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성 분자는 FAP-특이적 결합 단백질에 공유결합적으로 접합될 수 있다. 예로서, 한 특정 구현예에서, 본 발명의 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 또다른 안키린 반복 도메인에 융합된 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 40 내지 42에 의해 제공된다. 한 특정 구현예에서, 본 발명의 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은, 암 생물학에 관련된 표적, 예컨대 예를 들어 종양-관련 항원, 면역-저해 분자, 또는 면역-자극 분자에 대한 결합 특이성을 갖는 또다른 폴리펩티드에 융합된 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 또다른 안키린 반복 도메인에 융합되고 또한 암 생물학과 관련된 표적, 예컨대 예를 들어 종양-관련 항원, 면역-저해 분자, 또는 면역-자극 분자에 대한 결합 특이성을 갖는 또다른 폴리펩티드에 융합된, FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 FAP-특이적 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 본 발명의 FAP-특이적 결합 단백질 또는 핵산 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 인간을 포함하는 포유류에서의 FAP-발현 조직에 생물학적 활성 분자를 국소화, 축적 및/또는 활성화시키는 방법, 생물학적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 FAP-특이적 결합 단백질을 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 특정 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 활성 분자를 포함하고 또한 결합 단백질의 혈청 반감기를 연장하는 분자에 공유 결합되거나 이를 포함하는, FAP-특이적 결합 단백질을 상기 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 상기 반감기 연장 분자는 당업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 항체의 Fc 부분 등을 포함한다. 본 발명의 한 특정 구현예에서, 결합 단백질의 혈청 반감기를 연장하는 상기 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이다. 한 특정 구현예에서, 상기 방법은 FAP-발현 종양 조직에서 생물학적 활성 분자의 국소화, 축적 및/또는 활성화를 야기하는, FAP-발현 종양을 갖는 포유류, 예컨대 인간 환자에게 FAP-특이적 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 한 특정 구현예에서, 상기 FAP-특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열, 또는 동등한 표적 특이성을 갖는 SEQ ID NO: 34 및/또는 SEQ ID NO: 38의 서열 변이체를 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 포유류, 예컨대 인간 환자에서 의학적 병상을 치료하는 방법, 생물학적 활성 분자에 공유 결합되거나 이를 포함하는 본 발명의 FAP-특이적 결합 단백질을 상기 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 생물학적 활성 분자는 치료적 유효 분자이다. 한 특정 구현예에서, 의학적 병상은 암이고, 여기서 암 또는 종양 조직은 FAP를 발현하고, 치료적 유효 분자는 항암제이다. 한 특정 구현예에서, 치료적 유효 분자는, FAP-특이적 결합 단백질이 종양 기질에서의 FAP-발현 섬유아세포와 같은 세포의 표면 상에서 발현된 FAP에 결합하는 경우에만 활성된다. 한 구현예에서, 상기 암은 결장암, 비(非)소세포 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 위암, 폐암, 침습성 방광암, 췌장암, 뇌의 전이성 암, 두경부 편평세포 암종, 식도 편평세포 암종, 폐 편평세포 암종, 피부 편평세포 암종, 흑색종, 유방 선암종, 폐 선암종, 자궁경부 편평세포 암종, 췌장 편평세포 암종, 결장 편평세포 암종, 또는 위 편평세포 암종, 전립선암, 골육종 또는 연조직 육종 및 FAP를 발현하는 양성 종양으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 암은 상피 악성 종양(원발성 및 전이성), 예컨대 폐, 결장, 방광, 위, 전립선, 난소 및 유방 암종, 및 뼈 및 연조직 육종으로부터 선택된다.
본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 박테리아에서 상기 재조합 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 크로마토그래피를 사용하여 상기 재조합 결합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
도 1a: 인간 FAP, DARPin® 단백질 #18에 대한 결합 특이성을 갖는 선택된 안키린 반복 단백질의 정제의 SDS-PAGE 겔 분석. M은 단백질 크기 마커에 해당한다.
도 1b: 인간 FAP, DARPin® 단백질 #34에 대한 결합 특이성을 갖는 또다른 선택된 안키린 반복 단백질의 정제의 SDS-PAGE 겔 분석. M은 단백질 크기 마커에 해당한다.
도 2: DARPin® 단백질 #34에 의해 예시되는 인간 FAP에 결합하는 안키린 반복 단백질의 표면 플라스몬 공명(SPR: Surface Plasmon Resonance) 분석. 정제된 안키린 반복 단백질의 다양한 농도(0.4., 1.1, 3.3, 및 10 nM)는 온-레이트(on-rate) 및 오프-레이트(off-rate) 측정을 위한 고정된 인간 FAP를 갖는 GLC 칩에 적용되었다. 수득된 SPR 추적(trace) 분석은 안키린 반복 단백질-FAP 상호작용을 측정하는데 사용되었다. RU, 공명 단위(Resonance Unit); s, 시간(초).
도 3: DARPin® 단백질 #18, DARPin® 단백질 #19, DARPin® 단백질 #26 및 DARPin® 단백질 #33에 의해 예시된 바와 같이, FAP+ 세포(WI38 세포)에 대한 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 결합. 농도-의존적 결합 곡선은 측정된 중앙 형광 강도(MFI: median fluorescence intensity)와 관련하여 나타내어진다.
도 4a: FAP+ 세포(WI38 세포)에 대한 FAP-특이적 DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35의 결합. DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35의 농도-의존적 결합 곡선은 MFI의 계산된 배수 증가와 관련하여 나타내어진다.
도 4b: CHO-wt 세포 및 CHO-FAP1.9 세포에 대한 FAP-특이적 DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35의 결합. DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35의 농도-의존적 결합 곡선은 MFI의 계산된 배수 증가와 관련하여 나타내어진다. DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35는 세포 표면 상에서 FAP를 발현하는 CHO-FAP1.9 세포에 대해서만 결합한다.
도 5a: DARPin® 단백질 #36에 의해 예시되는 인간 FAP에 결합하는 안키린 반복 단백질의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. 안키린 반복 단백질의 다양한 농도(3.13., 6.25, 12.5, 및 25 nM)는 온-레이트 및 오프-레이트 측정을 위한 고정된(immobilize) 인간 FAP를 갖는 GLC 칩에 적용되었다. 수득된 SPR 추적 분석은 안키린 반복 단백질-FAP 상호작용을 측정하는데 사용되었다. RU, 공명 단위; s, 시간(초).
도 5b: DARPin® 단백질 #36에 의해 예시되는 시노몰구스 FAP(cFAP)에 결합하는 안키린 반복 단백질의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석. 안키린 반복 단백질의 다양한 농도(3.13., 6.25, 12.5, 및 25 nM)는 온-레이트 및 오프-레이트 측정을 위한 고정된 시노몰구스 FAP를 갖는 GLC 칩에 적용되었다. 수득된 SPR 추적 분석은 안키린 반복 단백질-FAP 상호작용을 측정하는 데 사용되었다. RU, 공명 단위; s, 시간(초).
도 6: DARPin® 단백질 #18, DARPin® 단백질 #19, DARPin® 단백질 #26 및 DARPin® 단백질 #33에 의해 예시된 바와 같이, 시노몰구스 FAP+ CHO 세포에 대한 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 결합. 농도-의존적 결합 곡선은 측정된 중앙 형광 강도(MFI)와 관련하여 나타내어진다.
도 7a: U87MG 세포에 대한 FAP-특이적 DARPin® 단백질 #40 및 DARPin® 단백질 #41의 결합. DARPin® 단백질 #40 및 DARPin® 단백질 #41의 농도-의존적 결합 곡선은 측정된 중앙 형광 강도(MFI)와 관련하여 나타내어진다.
도 7b: WI38 세포에 대한 FAP-특이적 DARPin® 단백질 #40 및 DARPin® 단백질 #41의 결합. DARPin® 단백질 #40 및 DARPin® 단백질 #41의 농도-의존적 결합 곡선은 측정된 중앙 형광 강도(MFI)와 관련하여 나타내어진다.
도 8: 마우스의 꼬리 정맥에 단일 정맥내 볼루스(bolus) 주사 이후 시간의 함수로서 생물학적 활성 분자(DARPin® 단백질 #40, DARPin® 단백질 #41 및 DARPin® 단백질 #42)에 융합된 FAP-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 혈청 농도.
도 9: 주사후 48시간에 FAP-포지티브 마우스 종양 모델에서 평가되고 측정된 방사능의 장기/혈액 비율로서 측정된, 모두 Tc99m로 라벨링된 DARPin® 단백질 #41 및 대조군 화합물 DARPin® 단백질 #43의 생체분포.
본원에 개시되고 예시된 바와 같이, 본 개시내용은 FAP를 특이적으로 표적화하는 안키린 반복 단백질을 제공한다. 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리(국제 공개 WO2002/020565호; 문헌[Binz et al., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004]; 문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008])는 높은 친화력으로 그 표적에 결합하는 표적-특이적 설계된 안키린 반복 도메인의 선택에 사용될 수 있다. 결과적으로, 상기 표적-특이적 설계된 안키린 반복 도메인은 질환의 치료를 위한 재조합 결합 단백질의 가치있는 구성성분으로서 사용될 수 있다. 설계된 안키린 반복 단백질은 단클론성 항체의 한계를 극복하는 잠재력을 갖는 결합 분자의 부류이므로, 신규한 치료적 접근을 허용한다. 상기 안키린 반복 단백질은 단일 설계된 안키린 반복 도메인을 포함할 수 있거나, 둘 이상의 설계된 안키린 반복 도메인과 동일 또는 상이한 표적 특이성의 조합을 포함할 수 있다(문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008]; 미국 특허 제9,458,211호). 오로지 단일 설계된 안키린 반복 도메인만을 포함하는 안키린 반복 단백질은 높은 친화성 및 특이성으로 주어진 표적 단백질에 결합하도록 선택될 수 있는 작은 단백질(14 kDa)이다. 이러한 특징, 및 한 단백질에서 둘 이상의 설계된 안키린 반복 도메인을 조합하는 가능성은, 설계된 안키린 반복 단백질을 이상적인 아고니스트적, 안타고니스트적 및/또는 저해 약물 후보로 만든다. 또한, 상기 안키린 반복 단백질은 예를 들어 세포독성제 또는 반감기 연장제와 같은 다양한 효과인자(effector) 기능을 가지도록 조작될 수 있어, 완전히 신규한 약물 포맷을 가능하게 한다. 종합해보면, 설계된 안키린 반복 단백질은 기존의 항체 약물을 능가할 가능성이 있는 차세대 단백질 치료제의 예이다.
DARPin®는 스위스 소재의 Molecular Partners AG가 소유한 상표이다.
한 양태에서, 본 발명은 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 대한 결합 특이성을 갖고, 상기 안키린 반복 도메인은 (1) SEQ ID NO: 48 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 48 내지 134 중 어느 하나에서 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 48 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 48 내지 134 중 어느 하나에서 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 48 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 48 내지 134 중 어느 하나에서 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 48 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 48 내지 134 중 어느 하나에서 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 48 내지 134로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 중 어느 하나에서 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 중 어느 하나에서 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 중 어느 하나에서 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 중 어느 하나에서 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 94에서 1 또는 2개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 95에서의 1 또는 2개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 96에서의 1 또는 2개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 97에서 1 또는 2개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 98에서의 1 또는 2개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 상기 프레임워크 위치에서의 교환의 구현예는 상기 교환이 명시적으로 기재되었는지 여부와 상관 없이 모든 구현예에 적용될 것이다. 한 구현예에서, 본원에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다. 상기 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서의 교환의 구현예는 상기 교환이 명시적으로 기재되었는지 여부와 상관 없이 모든 구현예에 적용될 것이다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다.
한 구현예에서, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) SEQ ID NO: 48 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 48 내지 134 중 어느 하나에서 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 제1, 상기 제2, 및 존재하는 경우 상기 제3 안키린 반복 모듈은, (1) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 중 어느 하나에서 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서의 6개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 6개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 6개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 6개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 6개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서의 5개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 5개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 5개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 5개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 5개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서의 4개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 4개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 4개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 4개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 4개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서의 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 3개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 3개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서의 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 2개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 2개의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서의 1개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 1개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 1개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 모듈은 제1 안키린 반복 모듈이고, (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하고, 상기 안키린 반복 도메인은 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제3 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하고, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다. 한 구현예에서, 상기 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다. 또한, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1, 제2, 및 제3 안키린 반복 모듈을 포함하고, 여기서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 9개 이하, 또는 8개 이하, 또는 7개 이하, 또는 6개 이하, 또는 5개 이하, 또는 4개 이하, 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 6개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 안키린 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 6개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 5개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 5개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 4개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 4개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 3개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 2개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 1개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 1개의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함하고, 여기서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 97 및 (2) SEQ ID NO: 97에서의 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 (1) SEQ ID NO: 98 및 (2) SEQ ID NO: 98의 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다. 한 구현예에서, 상기 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다. 한 구현예에서, 상기 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 아미노산 교환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생한다. 또한, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함하고, 여기서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치된다.
한 구현예에서, 상기 기재된 상기 안키린 반복 모듈(들)에서 상기 아미노산 교환 모두는 프레임워크 위치 및 상기 안키린 반복 모듈(들)의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생하고, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 교환에 의해 영향을 받지 않는다.
또다른 양태에서, 본 발명은 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 대한 결합 특이성을 갖고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34, 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 34 및 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 19의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 19의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 19의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 19의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 26의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 26의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 26과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 33과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 35와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 35와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 35와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 35와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 35와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인에서 잠재적 상호작용 잔기는 SEQ ID NO: 1 내지 35의 안키린 반복 도메인 중 어느 하나에서의 상응하는 위치와 동일하다.
한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만, 또는 10-8M 미만, 또는 10-9M 미만, 또는 5 x 10-10M 미만, 또는 3 x 10-10M 미만, 또는 2 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 10-9M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 5 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 2 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-9M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 5 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 6, 8, 9, 11 내지 20, 25 내지 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 29, 31 및 33 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 19의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 19의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 2 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28 및 31의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 8, 9, 11 내지 20, 26, 28, 31 및 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 2 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 해리 상수(KD)의 전형적인 및 바람직한 측정은 실시예 2에 기재되어 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 FAP에 대한 상기 결합 특이성은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 PBS 중에서 측정된다. 한 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 FAP에 대한 상기 결합 특이성은 실시예 2에 기재된 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 PBS 중에서 측정된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만, 또는 10-8M 미만, 또는 약 10-9M 또는 그 미만, 또는 약 5 x 10-10M 또는 그 미만, 또는 약 3 x 10-10M 또는 그 미만, 또는 약 2 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 약 5 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 또다른 구현예에서 상기 안키린 반복 도메인은 약 2 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 4, 5, 9 내지 15, 18, 19, 26 내지 30, 및 32 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 5 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9 내지 11, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 5 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 5 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 19의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 19의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 5 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 5 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 2 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 26 및 33 의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 26 및 33 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
인간 FAP-발현 WI38 세포에 대한 각각 본 발명의 안키린 반복 도메인 및 재조합 결합 단백질의 결합의 전형적이고 바람직한 측정 및 EC50의 측정은 실시예 3에 기재되어 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 안키린 반복 도메인 및 재조합 결합 단백질의 인간 FAP-발현 WI38 세포에 대한 상기 결합은 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정된다. 한 구현예에서, 본 발명의 안키린 반복 도메인 및 재조합 결합 단백질의 인간 FAP-발현 WI38 세포에 대한 상기 결합은 실시예 3에 기재된 바와 같은 FACS 분석에 의해 측정된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 9, 11 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-9M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-9M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 5 내지 9, 11 내지 21, 25 내지 29, 31 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-9M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 10-9M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5, 9, 11 내지 15, 18, 19, 26 내지 29, 32 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 5, 9, 11 내지 15, 18, 19, 26 내지 29, 32 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 5, 9, 11 내지 15, 18, 19, 26 내지 29, 32 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 5 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 5 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 5, 9, 11 내지 15, 18, 19, 26 내지 29, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 5, 9, 11 내지 15, 18, 19, 26 내지 29, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 5, 9, 11 내지 15, 18, 19, 26 내지 29, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 11 내지 15, 18, 19, 26, 28, 29, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 9, 11 내지 15, 18, 19, 26, 28, 29, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 9, 11 내지 15, 18, 19, 26, 28, 29, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 11 내지 15, 18, 19, 26, 28, 29, 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 9, 11 내지 15, 18, 19, 26, 28, 29, 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 9, 11 내지 15, 18, 19, 26, 28, 29 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 19의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 19의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 93%인 아미노산 서열을 포함하고; 추가 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 포함하고; 한 구현예에서, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 9, 13 내지 15, 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 2 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합한다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 2 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 약 3 x 10-10M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 9, 14, 18 및 26 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 9, 14, 18 및 26의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 9, 14, 18 및 26의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과, 또는 20% 초과, 또는 15% 초과, 또는 10% 초과, 또는 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0% 초과로 저해하지 않는다. 따라서, 한 구현예에서, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 상기 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않는다. 또다른 구현예에서, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 상기 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고; 추가 구현예에서, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 상기 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 15% 초과로 저해하지 않는다. 한 구현예에서, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 상기 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 10% 초과로 저해하지 않는다.
FAP에 대한 본 발명의 재조합 결합 단백질의 결합이 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 저해하는지 여부를 측정하기 위한 전형적이고 바람직한 방법이 실시예 6에 기재되어 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질에 의한 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성의 상기 저해는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 15% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33 내지 35, 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 33, 144, 145 및 148-150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18, 19, 26, 및 33 내지 35의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18, 19, 26 및 33의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 18과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 18의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 19와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 19의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 19의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N은 선택적으로 A에 의해 교환된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인은 3 x 10-10M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 약 10-9M 또는 그 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고, FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합은 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 20% 초과로 저해하지 않고, 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 34와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%인 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 34의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S는 선택적으로 누락된다.
한 구현예에서, 상기 기재된 상기 안키린 반복 도메인(들)에서의 서열 변동성 중 어느 하나는 N-말단 캡핑(capping) 모듈, C-말단 캡핑 모듈 및/또는 안키린 반복 모듈에서 발생하고, 여기서 안키린 반복 모듈에서의 임의의 서열 변동성은 오로지 프레임워크 위치에서 및 안키린 반복 모듈의 무작위화된 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 발생하고, 전형적으로 안키린 반복 모듈 및 안키린 반복 도메인의 전체 구조는 서열 변동성에 의해 영향을 받지 않는다.
한 구현예에서, 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 여기서 상기 결합 단백질은 생물학적 활성 분자를 추가로 포함한다.
한 구현예에서 및 예로서, 상기 생물학적 활성 분자는 본 발명의 재조합 단백질의 생체내(in vivo) 반감기를 증가시킬 수 있다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이고, 여기서 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 38 또는 SEQ ID NO: 38과 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 서열로 이루어진다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이고, 여기서 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 38로 이루어진다. 한 구현예에서, SEQ ID NO: 38로 이루어지는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 펩티드 링커로 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인에 연결되고, 여기서 상기 펩티드 링커는 바람직하게는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:39의 펩티드 링커이다.
한 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 (1) SEQ ID NO: 40 내지 42 및 (2) SEQ ID NO: 40 내지 42 중 어느 하나에서 9개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 (1) SEQ ID NO: 40 및 (2) SEQ ID NO: 40에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 (1) SEQ ID NO: 41 및 (2) SEQ ID NO: 41에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 (1) SEQ ID NO: 42 및 (2) SEQ ID NO: 42에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이고, 여기서 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 (1) SEQ ID NO: 159 및 (2) SEQ ID NO: 159에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인이고, 여기서 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 (1) SEQ ID NO: 160 및 (2) SEQ ID NO: 160에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
한 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 (1) SEQ ID NO:34 및 (2) SEQ ID NO:34에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 아미노산 서열을 포함하고, (1) SEQ ID NO:159 및 (2) SEQ ID NO: 159에서 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제2 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 상기 제1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:34이고, 상기 제2 아미노산 서열은 SEQ ID NO:159이다. 한 구현예에서, 상기 제1 아미노산 서열 및 상기 제2 아미노산 서열은 펩티드 링커로 연결된다. 한 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커, 바람직하게는 SEQ ID NO:39의 펩티드 링커이다.
중요하게는, FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 대한 생물학적 활성 분자의 융합은 세포의 표면 상에서 발현된 FAP를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 본 발명의 재조합 단백질의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것이 또한 나타났다(실시예 5). 실시예 5에 나타낸 바와 같이, FAP-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하는 융합 단백질은 본 발명의 재조합 단백질에 존재하는 추가 생물학적 활성 분자와 상관 없이 세포의 표면 상에서 발현된 FAP에 효율적으로 결합하는 이의 능력을 보유한다.
또한, FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 단백질은, 우선적으로 FAP를 발현하는 종양 조직에 생물학적 활성 분자를 생체내 국소화 또는 전달 또는 표적화할 수 있다는 것이 나타났다(실시예 5). 이는 본 발명의 방사성 라벨링된 재조합 단백질을 사용하여 생체분포 분석에 의해 FAP-포지티브 마우스 종양 모델에서 평가되었다. 주사후 48시간 생체분포 분석은, FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인과 같은 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 단백질이, FAP-발현 종양 조직에 상기 생물학적 활성 분자 및 재조합 단백질을 국소화 또는 전달 또는 표적화할 수 있을 뿐만 아니라 FAP-발현 종양 조직에서 상기 생물학적 활성 분자의 축적 및 이의 보유를 연장시킬 수 있다는 것을 또한 나타낸다. 따라서, 생물학적 또는 치료적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 재조합 단백질은 FAP-발현 종양에 상기 본 발명의 재조합 단백질을 국소화, 전달, 표적화, 축적, 활성화 및/또는 보유하면서 전체로서 다른 장기 및 유기체에서 상기 생물학적 또는 치료적 활성 분자의 잠재적 부작용을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 단백질은 FAP-특이적 치료제, 영상화제 및/또는 진단제의 구성성분으로서 역할할 수 있다.
또한, FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 단백질은 FAP 효소적 활성을 유의하게 저해하지 않는다는 것이 나타났다(실시예 6). 이것은 본 발명의 재조합 단백질의 존재 및 부재 하에 형광생성 기질(fluorogenic substrate)에서 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 측정함으로써 평가되었다.
본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인은 하나 이상의 추가 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질에 대한 빌딩 블록으로서 역할할 수 있다. 다중 특징은 본 발명의 바람직한 재조합 결합 단백질로서 SEQ ID NO: 40-42에 의해 인코딩된 단백질을 특징짓는다. 이는 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 및 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 이는 혈청 알부민-결합 및 FAP-결합을 조합하는 제1 재조합 결합 단백질이다. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인, 특히 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 159 또는 SEQ ID NO: 160의 안키린 반복 도메인, 또는 이의 변형은 생체내 반감기를 개선시켰다. 결과적으로, FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 치료적 적용에 특히 유용한 구현예이다.
한 구현예에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 10-5M 미만; 바람직하게는 10-6M 미만; 또는 더 바람직하게는 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서, 마우스, 랫트, 개, 시노몰구스 원숭이, 또는 인간 기원의 혈청 알부민, 더 바람직하게는 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간 기원의 혈청 알부민, 더 바람직하게는 시노몰구스 원숭이 또는 인간 기원의 혈청 알부민, 더 바람직하게는 인간 기원의 혈청 알부민에 결합한다. 한 구현예에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 159 또는 SEQ ID NO: 160으로 이루어지고, 10-5M 미만; 바람직하게는 10-6M 미만; 또는 더 바람직하게는 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 혈청 알부민에 결합한다. 표면 플라스몬 공명을 사용한 해리 상수 측정의 예는 실시예, 예를 들어 실시예 2 및 국제 공개 WO2014/083208호에 제공되어 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 상기 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드 태그를 추가로 포함한다. 폴리펩티드 태그는 폴리펩티드/단백질에 부착된 아미노산 서열이며, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출 또는 표적화에 유용하거나, 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 물리화학적 거동을 개선하거나, 상기 아미노산 서열은 효과인자 기능을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그는 결합 단백질의 다른 부분에 직접 연결되거나 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 폴리펩티드 태그는 모두 당업계에 익히 공지되어 있고, 당업자가 충분히 이용가능하다. 폴리펩티드 태그의 예는 작은 폴리펩티드 서열, 예를 들어 His, HA, myc, FLAG 또는 Strep-태그, 또는 폴리펩티드, 예컨대 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타아제)이며, 이는 상기 폴리펩티드/단백질, 또는 표적화에(예컨대 면역글로불린 또는 이의 절편) 및/또는 효과인자 분자로서 사용될 수 있는 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다.
한 구현예에서, 본 발명의 상기 FAP-특이적 재조합 결합 단백질은 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 펩티드 링커는, 예를 들어 2개의 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그와 단백질 도메인, 단백질 도메인과 비단백질성 화합물 또는 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 단백질 도메인과 생물학적 활성 분자, 단백질 도메인과 국소화제, 또는 2개의 서열 태그를 연결시킬 수 있는 아미노산 서열이다. 펩티드 링커는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예의 목록은 국제 특허 공개 WO2002/020565호의 상세한 설명에 제공되어 있다. 상기 링커의 특정 예는 가변 길이의 글리신-세린-링커 및 프롤린-트레오닌-링커이다. 글리신-세린-링커의 예는 아미노산 서열 GS 및 SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열이고, 프롤린-트레오닌-링커의 예는 SEQ ID NO:39의 아미노산 서열이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 및 SEQ ID NO: 35로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 18로 이루어지는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 34로 이루어지는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 핵산은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 실시예에서, 핵산을 사용하여, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 E. 콜라이(E. coli)에서 생성하였다. 본 발명의 핵산의 예는 SEQ ID NO: 156에 의해 제공되고, 이는 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 인코딩한다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인을 인코딩하는 핵산 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 공지되어 있으며, 하기에서 보다 상세히 설명된다. 또한, 하나 이상의 상기 언급된 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인 및/또는 핵산, 특히 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 진단 조성물 또는 종양 영상화 조성물이 제공된다.
약학 조성물은 본원에서 기재된 바와 같은 재조합 결합 단백질, 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 핵산, 바람직하게는 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 및 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다.
당업자에게 공지된 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 예를 들어 식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로오스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 고정유, 에틸 올레에이트, 식염수 중 5% 덱스트로오스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충액 및 보존제를 포함한다. 다른 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 조성물을 수여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 그 자체가 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 약학 조성물은 또한 추가의 활성제, 예컨대 항암제 또는 항혈관형성제 또는 추가의 생활성 화합물을 포함하는 조합 제형일 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 무균성 또는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본 발명의 한 구현예는 약학 조성물의 제조를 위한, FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인과 같은 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인을 포함하나 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인은 포함하지 않는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비하여, 증가된 말기 반감기(terminal half-life), 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 또는 250%의 증가된 말기 반감기를 나타낸다. 본 발명의 한 구현예에서, 재조합 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 결합 단백질 및 세척제(detergent) 예컨대 비이온성 세척제, 완충액 예컨대 포스페이트 완충액, 및 당 예컨대 수크로오스를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 조성물은 상기 기재된 바와 같이 재조합 결합 단백질 및 PBS를 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 상기 생물학적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 상기 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 FAP-발현 세포 또는 조직에 생물학적 활성 분자를 국소화시키는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 FAP와 상이한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 결합 단백질이다. 한 구현예에서, 상기 포유류는 인간이고, 상기 FAP-발현 세포 또는 조직은 종양, 예컨대 원발성 종양, 전이 및/또는 종양 기질에 배치된다. 종양 조직에서의 생물학적 활성 분자의 선택적 국소화, 축적, 보유 및/또는 활성화는 종양 조직에 분자의 활성을 집중시키는 한편, 정상 및 비종양형성 조직에서 분자의 활성을 훨씬 적게 야기하는 이점을 갖는다. 상기 효과는 종양 미세환경 내에서 FAP의 국소화에 따라, FAP의 효소적 활성 또는 종양 진행에서의 역할과 무관할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 의학적 병상의 치료 방법을 제공하고, 여기서 상기 생물학적 활성 분자는 치료적 유효 분자이다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 FAP-발현 세포 또는 조직에 국소화될 때 치료적 유효 분자이다. 한 구현예에서, 상기 생물학적 활성 분자는 FAP와 상이한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 결합 단백질이다. 한 구현예에서, 상기 FAP-발현 세포 또는 조직은 종양, 예컨대 원발성 종양, 전이 및/또는 종양 기질에 배치된다. 따라서, 이러한 구현예는 생물학적 활성 분자, 예컨대, 예를 들어 면역 체크포인트 저해제 또는 면역 공동-자극 아고니스트의 활성을 종양 미세환경에 국소화함으로써 종양 기질에서 FAP의 제한된 발현의 이점을 취하는 것을 허용한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 종양을 영상화하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 생물학적 활성 분자는 상기 결합 단백질에 의해 결합된 세포를 영상화하는 데 효과적인 분자이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 진단하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 생물학적 활성 분자는 상기 환자의 암을 진단하는 데 효과적인 분자이다.
한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료를 위한 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 이러한 목적을 위해, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 재조합 결합 단백질은 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 투여된다. 투여는 국소 투여, 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 전형적인 투여 경로는 비경구 투여이다. 비경구 투여에서, 본 발명의 약학 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 단위 투여량 주사가능 형태로 상기 정의된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제형화될 것이다. 투여량 및 투여 방식은 치료하고자 하는 개체 및 특정 질환에 따라 달라질 것이다.
또한, 상기 언급된 약학 조성물 또는 재조합 결합 단백질 중 임의의 것은 장애의 치료를 위해 고려된다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 상기 재조합 결합 단백질 또는 상기 다른 약학 조성물은 정맥내로 적용된다. 비경구 적용을 위해, 재조합 결합 단백질 또는 상기 약학 조성물은 볼루스 주사로서 또는 느린 주입(infusion)에 의해 치료적 유효량으로 주사될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명은 의학적 병상의 치료 방법에 관한 것이고, 방법은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 치료적 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명은 의학적 병상의 치료 방법에 관한 것이고, 방법은 본 발명의 약학 조성물의 치료적 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료를 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 의학적 병상의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료에 사용하기 위한 핵산에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료를 위한 약제로서의 상기 약학 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 약제의 제조를 위한 상기 약학 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 약학 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 질환의 치료를 위한 약제의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 약학 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자는 약제의 활성 성분이다. 한 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자를 사용한 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 사용하는 의학적 병상의 치료에 관한 것이고, 상기 의학적 병상은 암이다.
암 질환의 치료를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 상기 약학 조성물의 사용은 또한 당업계에 공지된 하나 이상의 다른 요법과 조합될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "조합 사용"은 주어진 계획(regimen) 하에 수행되는 공동-투여를 나타낼 것이다. 이것은 상이한 화합물들의 동시 투여뿐만 아니라 상이한 화합물의 시간차(time-shifted) 투여를 포함한다(예를 들어, 화합물 A가 1회 제공되고, 그 후 화합물 B가 수회 제공되거나, 그 반대이거나, 화합물 둘 모두 동시에 제공되고, 두 화합물 중 하나는 후기 단계에서 또한 제공됨).
추가 구현예에서, 본 발명은 의학적 병상, 바람직하게는 종양 질환(neoplastic disease), 더 바람직하게는 암의 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 종양 질환, 특히 암일 수 있는 의학적 병상의 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 상기 언급된 안키린 반복 도메인 중 어느 하나를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질, 및/또는 상기 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및/또는 상기 약학 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 FAP-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 재조합 결합 단백질, 및/또는 FAP-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및/또는 FAP-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 재조합 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물, 및/또는 FAP-특이적 안키린 반복 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO: 34를 포함하는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질, 예를 들어 SEQ ID NO:18 또는 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이고, 방법은 (i) 박테리아에서 상기 재조합 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 크로마토그래피를 사용하여 상기 재조합 결합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가의 단계를 포함할 수 있다. 상기 본 발명의 재조합 결합 단백질의 제조 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.
본 발명은 실시예에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않는다.
본 명세서는 "P5618_Sequence_Listing.txt"로 명명된 본 명세서의 아미노산 서열 목록의 다수의 아미노산 서열을 참조하고, 서열 목록의 아미노산 서열은 본원에서 참조 인용된다.
정의
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "단백질"은 폴리펩티드를 포함하는 분자를 나타내고, 여기서 폴리펩티드의 적어도 일부는 단일 폴리펩티드 사슬 내에 및/또는 다수의 폴리펩티드 사슬들 사이에 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 형성함으로써 정의된 3차원 배열을 갖거나 이를 획득할 수 있다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우, 개별 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 두 폴리펩티드 사이의 디술파이드 결합에 의해 비공유결합적으로 또는 공유결합적으로 연결될 수 있다. 2차 및/또는 3차 구조를 형성함으로써 정의된 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 이를 획득할 수 있는 단백질의 일부는 "단백질 도메인"으로 칭한다. 상기 단백질 도메인은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
재조합 단백질, 재조합 폴리펩티드 등에서 사용된 용어 "재조합"은, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 당업자에게 익히 공지된 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 생성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 DNA 분자(예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성됨)는 박테리아 발현 플라스미드(예를 들어, pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드 또는 식물 발현 플라스미드 또는 시험관내(in vitro) 발현을 가능하게 하는 DNA로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 상기 재조합 박테리아 발현 플라스미드가 적절한 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))에 삽입되는 경우, 이 박테리아는 이러한 재조합 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)을 생성할 수 있다. 상응하여 생성된 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질로 칭해진다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "결합 단백질"은 결합 도메인을 포함하는 단백질을 나타낸다. 결합 단백질은 또한 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 본 발명의 결합 단백질은 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
또한, 임의의 상기 결합 단백질은 당업자에게 익히 공지된 추가의 폴리펩티드(예컨대 예를 들어, 폴리펩티드 태그, 펩티드 링커, 결합 특이성을 갖는 단백질성 도메인에 대한 융합, 사이토카인, 호르몬, 또는 안타고니스트), 또는 화학적 개질(예컨대, 폴리에틸렌-글리콜, 독소(예를 들어, 면역원으로부터의 DM1), 소분자, 항생제 등에 대한 커플링)을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 국소화제 분자를 포함할 수 있다.
용어 "결합 도메인"은 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 도메인을 의미한다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다.
용어 "표적"은 개별 분자 예컨대 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물 또는 임의의 다른 자연 발생 분자를 비롯한 상기 개별 분자의 임의의 부분 또는 상기 분자 2개 이상의 복합체, 또는 전체 세포 또는 조직 샘플, 또는 임의의 비천연 화합물을 나타낸다. 바람직하게는, 표적은 자연 발생 또는 비천연 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 화학적 개질, 예를 들어 자연 발생 또는 비천연 포스포릴화, 아세틸화 또는 메틸화를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, FAP 및 FAP-발현 세포 및 조직은 FAP-특이적 결합 단백질의 표적이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어지는 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 시스테인의 S-S 가교에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산 사슬들을 포함한다. 폴리펩티드는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호 및 문헌[Forrer et al., 2003(Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K.,
Figure pct00003
, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은 반복 단백질 특징 및 반복 도메인 특징, 기술 및 적용의 일반적 설명을 함유한다. 용어 "반복 단백질"은 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 나타낸다. 바람직하게는, 반복 단백질은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 반복 도메인을 포함한다. 또한, 상기 반복 단백질은 추가의 비(非)반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및/또는 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 반복 도메인은 결합 도메인일 수 있다.
용어 "반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속적 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인을 나타내고, 여기서 상기 반복 모듈은 구조적 및 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 추가로 포함한다. 명확성을 위해, 캡핑 모듈은 반복 모듈일 수 있다. 상기 반복 도메인, 반복 모듈 및 캡핑 모듈, 서열 모티프 뿐만 아니라 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인(국제 공개 WO2002/020565호), 류신-풍부 반복 도메인(국제 공개 WO2002/020565호), 테트라트리코펩티드 반복 도메인(문헌[Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003]), 및 아르마딜로 반복 도메인(국제 공개 WO2009/040338호)의 예로부터 당업자에게 익히 공지되어 있다. 상기 반복 도메인은 반복된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 상이하고, 여기서 모든 반복된 아미노산 서열은 개별 도메인(예를 들어 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있다는 것이 당업자에 또한 익히 공지되어 있다.
설계된 반복 단백질, 설계된 반복 도메인 등에서 사용된 용어 "설계된"은 상기 반복 단백질 및 반복 도메인이 각각 인공적인 것이고 자연에서 발생하지 않는다는 특성을 나타낸다. 본 발명의 결합 단백질은 설계된 반복 단백질이고, 이는 적어도 하나의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다.
용어 "표적 상호작용 잔기"는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 나타내고, 이는 표적과의 직접적 상호작용에 기여한다.
용어 "프레임워크 잔기"는 폴딩 토폴로지(folding topology)에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 나타내고, 즉 이는 상기 반복 모듈의 폴딩에 기여하거나 이웃 모듈과의 상호작용에 기여한다. 상기 기여는 반복 모듈에서 다른 잔기와의 상호작용, 또는 α-헬릭스 또는 β-시트에서 발견되는 폴리펩티드 백본 형태에 대한 영향, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치에서의 참여일 수 있다.
상기 프레임워크 및 표적 상호작용 잔기는 물리화학적 방법, 예컨대 X-선 결정학, NMR 및/또는 CD 분광학에 의해 수득된 구조 데이터의 분석에 의하여, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보학에서 당업자에 익히 공지되어 있는 공지된 및 관련된 구조적 정보와 비교하는 것에 의하여 식별될 수 있다.
용어 "반복 모듈"은 설계된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열 및 구조 단위를 나타내고, 이는 본래 자연 발생 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래된다. 반복 도메인에 포함된 각각의 반복 모듈은 자연 발생 반복 단백질의 패밀리 또는 하위패밀리, 예를 들어 안키린 반복 단백질의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유래된다. 또한, 반복 도메인에 포함된 각각의 반복 모듈은 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같이, 표적 상에서 선택된 반복 도메인으로부터 수득된 상동 반복 모듈로부터 추론되고, 동일한 표적 특이성을 갖는 "반복 서열 모티프"를 포함할 수 있다.
따라서, 용어 "안키린 반복 모듈"은 본래 자연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 유래되는 반복 모듈을 나타낸다. 안키린 반복 단백질은 당업자에 익히 공지되어 있다.
반복 모듈은 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적으로 라이브러리에서 무작위화되지 않은 아미노산 잔기를 갖는 위치("비무작위화된 위치") 및 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적으로 라이브러리에서 무작위화된 아미노산 잔기를 갖는 위치("무작위화된 위치")를 포함할 수 있다. 비무작위화된 위치는 프레임워크 잔기를 포함한다. 무작위화된 위치는 표적 상호작용 잔기를 포함한다. "무작위화됨"은 둘 이상의 아미노산이 반복 모듈의 아미노산 위치에서 허용되었음을 의미하고, 예를 들어 여기서 일반적인 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것이 허용되었거나, 20개의 자연 발생 아미노산의 대부분, 예컨대 시스테인 이외의 아미노산 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린 이외의 아미노산이 허용되었다. 본 특허 출원의 목적을 위해, SEQ ID NO: 48 내지 134의 아미노산 잔기 3, 4, 6, 14 및 15는 본 발명의 안키린 반복 모듈의 무작위화된 위치이다.
용어 "반복 서열 모티프"는 하나 이상의 반복 모듈로부터 추론되는 아미노산 서열을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 반복 모듈은 동일한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인으로부터의 것이다. 상기 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임워크 잔기 위치는 반복 모듈의 프레임워크 잔기의 위치에 해당한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 모듈의 표적 상호작용 잔기의 위치에 해당한다. 반복 서열 모티프는 비무작위화된 위치 및 무작위화된 위치를 포함한다.
용어 "반복 단위"는 하나 이상의 자연 발생 단백질의 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 나타내고, 여기서 상기 "반복 단위"는 다중 카피에서 발견되고, 단백질의 폴딩을 결정하는 모든 상기 모티프에 공통적인 정의된 폴딩 토폴로지를 나타낸다. 상기 반복 단위의 예는 류신-풍부 반복 단위, 안키린 반복 단위, 아르마딜로 반복 단위, 테트라트리코펩티드 반복 단위, HEAT 반복 단위, 및 류신-풍부 변이체 반복 단위를 포함한다.
용어 "표적에 대한 결합 특이성을 가짐", "표적에 특이적으로 결합함", "높은 특이성으로 표적에 결합함", "표적에 대해 특이적" 또는 "표적 특이성" 등은, 결합 단백질 또는 결합 도메인이 PBS 중에서, E. 콜라이 말토오스 결합 단백질(MBP)과 같은 비관련 단백질에 결합하는 것보다 낮은 해리 상수(즉, 이것은 더 높은 친화도로 결합함)로 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 표적에 대한 PBS 중에서의 해리 상수("KD")는 MBP에 대한 상응하는 해리 상수보다 적어도 102; 더 바람직하게는 적어도 103; 더 바람직하게는 적어도 104; 또는 더 바람직하게는 적어도 105배 더 낮다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 기반 기술(예를 들어, SPR 평형 분석) 또는 등온 적정 열량계(ITC: isothermal titration calorimetry)와 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 측정하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 KD 값은, 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, KD 값의 측정은 바람직하게는 표준화된 단백질 용액 및 표준화된 완충액, 예컨대 PBS에 의해 이루어진다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 안키린 반복 도메인 및 재조합 결합 단백질의 해리 상수(KD)의 전형적인 및 바람직한 측정은 실시예 2에 기재되어 있다.
용어 "약"은 언급된 값 +/- 20%를 의미하고; 예를 들어 "약 50"은 40 내지 60을 의미할 것이다.
용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트 및 2.7 mM KCl을 함유하고, pH가 7.4인 포스페이트 완충 수용액을 의미한다.
용어 "마우스 혈청 알부민"은 UniProt 수탁 번호 P07724를 나타내며, 용어 "시노몰구스 원숭이 혈청 알부민"(즉, 마카카 파시쿨라리스(macaca fascicularis))은 UniProt 수탁 번호 A2V9Z4를 나타내며, 용어 "인간 혈청 알부민"은 UniProt 수탁 번호 P02768을 나타낸다. 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 154에 제공된다.
바람직하게는, 제거율(clearance) 및/또는 노출률 및/또는 말기 반감기는 포유류, 더 바람직하게는 마우스 및/또는 시노몰구스 원숭이, 더 바람직하게는 시노몰구스 원숭이에서 평가된다. 바람직하게는, 마우스에서 제거율 및/또는 노출률 및/또는 말기 반감기를 측정하는 경우, 평가는 주사후 48시간까지의 데이터를 고려하여 이루어진다. 더 바람직하게는, 마우스에서 말기 반감기의 평가는 24시간으로부터 48시간까지 계산된다. 바람직하게는, 시노몰구스 원숭이에서 제거율 및/또는 노출률 및/또는 말기 반감기를 측정하는 경우, 평가는 주사후 제7일까지의 데이터를 고려하여 이루어진다. 더 바람직하게는, 시노몰구스 원숭이에서 말기 반감기의 평가는 제1일로부터 제5일까지 계산된다. 당업자는 또한 표적-매개 제거율(target-mediated clearance)과 같은 효과를 식별하고 이를 말기 반감기를 계산할 때 고려할 수 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질과 같은 약물의 "말기 반감기"라는 용어는 유사 평형(pseudo-equilibrium)에 도달된 후에, 포유류에 적용된 약물의 혈장 농도의 절반에 도달하는 데 필요한 시간(예를 들어, 마우스에서 24시간으로부터 48시간까지 계산되거나, 시노몰구스 원숭이에서 제1일로부터 제5일까지 계산됨)을 나타낸다. 말기 반감기는 포유류에 투여된 약물의 투여량의 절반을 제거하는 데 필요한 시간으로서 정의되지 않는다. 용어 말기 반감기는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 바람직하게는, 약동학적 비교는 임의의 투여량, 더 바람직하게는 등가 투여량(즉, 동일한 mg/㎏ 투여량) 또는 등몰 투여량(즉, 동일한 mol/㎏ 투여량), 더 바람직하게는 등몰 투여량(즉, 동일한 mol/㎏ 투여량)으로 이루어진다. 동물에서의 등가 및/또는 등몰 투여는 적어도 20%, 더 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 실험 투여량 변동에 적용된다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 바람직하게는, 약동학적 측정에 사용되는 투여량은 0.001 내지 1000 mg/㎏, 더 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/㎏, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/㎏, 더 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/㎏으로부터 선택된다.
또한 프롤릴 엔도펩티다아제 FAP 또는 세프라아제(EC 3.4.21)로 공지된 용어 "섬유아세포 활성화 단백질" 또는 "FAP"는 달리 나타내지 않는 한, 임의의 척추동물 원, 예컨대 포유류 예컨대 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류(예를 들어 시노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 랫트)로부터의 임의의 네이티브 FAP를 나타낸다. 용어는 "전장", 비조작된 FAP 뿐만 아니라 세포에서의 조작으로부터 야기되는 FAP의 임의의 형태를 포함한다. 용어는 또한 FAP의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 인간, 마우스 및/또는 시노몰구스 FAP에 특이적 결합할 수 있다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt(www.uniprot.org) 수탁 번호 Q12884, 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) Ref. Seq. NP_004451.2에 나타나 있다. 인간 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 760까지 연장된다. His-태깅된 인간 FAP ECD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 45에 제공된다. 마우스 FAP의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P97321, 또는 NCBI Ref. Seq. NP_032012.1에 나타나 있다. 마우스 FAP의 세포외 도메인(ECD)은 아미노산 위치 26으로부터 761까지 연장된다. SEQ ID NO: 47은 마우스 FAP ECD의 아미노산 서열을 나타낸다. 시노몰구스 FAP의 아미노산 서열은 NCBI Ref. Seq. XP_005573377.1에 나타나 있다. SEQ ID NO: 46은 His-태깅된 시노몰구스 FAP ECD의 아미노산 서열을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 항-FAP 결합 분자는 FAP의 세포외 도메인에 결합한다.
용어 "생활성 분자" 및 "생물학적 활성 분자"는 포유류, 예컨대 예를 들어 인간에서 생물학적 효과 또는 활성을 갖고, 본 발명의 결합 단백질과 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 연결되거나, 접합되거나, 융합되거나, 다르게는 물리적으로 연관될 수 있는 임의의 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 용어는 또한 오로지 활성화 이벤트, 예컨대 예를 들어 클러스터링, 단백질 가수분해 절단, 알로스테릭 변화 또는 이량체화 시에만 생물학적 효과 또는 활성을 나타내는 임의의 상기 분자를 포함한다. 용어는 폴리뉴클레오티드, 펩티드/폴리펩티드 및/또는 약제를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로는 달리 나타내지 않는 한, DNA를 나타내지만, RNA 및 DNA 또는 RNA의 변형 또는 인공 형태를 포함할 수 있다. 용어는 유전자, cDNA, 올리고뉴클레오티드, RNAi, 플라스미드 등을 포함한다. 용어는 또한 표적 장기에서 생성물을 발현하기 위한 센스 DNA 또는 RNA, 및 표적 장기에서 네이티브 또는 도입된 유전자의 발현을 감소 또는 제거하기 위한 안티센스 DNA 또는 RNA를 포함한다. 용어 "펩티드"는 4 내지 600개의 아미노산 길이, 예컨대 4 내지 200개의 아미노산 길이의 펩티드 사슬을 나타내고, 이에 따라 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 용어는 임의의 자연 발생 또는 인공 결합 단백질, 결합 도메인, 성장 인자 수용체 또는 이의 절편 또는 리간드, 사이토카인, 효소, 폴리펩티드 호르몬, 항체, 스캐폴드를 기반으로 하는 항체-유사 단백질, 면역조절 단백질 등을 포함한다. 또한, 용어 "펩티드"는 예를 들어 글리코실화에 의해 개질된 펩티드, 및 예를 들어 디술파이드 결합에 의해 가교된 각각 길이가 4 내지 600개의 아미노산 길이의 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질, 예컨대 예를 들어 인슐린 및 면역글로불린을 포함한다. 용어 "약제"는 생리학적, 약리학적 또는 치료적 효과를 유도하기 위해 수용자에게 투여될 수 있는 임의의 천연 또는 합성 화합물을 포함하도록 의도된다. 상기 작용제의 예는 항-종양 약물, 독소, 항생제, 호르몬, 항염증제, 항기생충제, DNA 백신 등이다.
용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라, 또한 면역원-결합 능력을 보유하는 항체 분자의 임의의 절편 및 변이체를 의미한다. 상기 절편 및 변이체는 또한 당업계에 익히 공지되어 있고, 시험관내 및 생체내에서 자주 사용된다. 따라서, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자, 항체 절편 예컨대, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 및 단일 사슬 V 영역 절편(scFv), 이중특이적 항체, 키메라 항체, 항체 융합 폴리펩티드, 및 비통상적 항체를 포함한다.
"FAP-발현 세포 또는 조직에 대한 생물학적 활성 분자의 국소화"의 맥락에서 본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "국소화" 또는 "전달"은, 생물학적 활성 분자가 FAP-특이적 결합 단백질에 연결되지 않는 경우에 비하여, 생물학적 활성 분자가 FAP-특이적 결합 단백질에 연결되는 경우에 포유류에서 FAP-발현 세포 또는 조직에 대한 생물학적 활성 분자의 증가된 국소화를 나타낸다. 용어는 또한 포유류에서 표적의 부위에 대한 분자의 표적화를 나타내고, 여기서 분자는 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 연결된 생물학적 활성 분자이고, 표적은 FAP이고, 표적의 부위는 FAP-발현 세포 또는 조직이다. 용어는 바람직하게는 또한 포유동물에서 FAP-발현 세포 또는 조직의 부위에서 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 연결된 생물학적 활성 분자의 축적 및/또는 보유를 포함한다. 용어는 또한 바람직하게는 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 연결된 생물학적 활성 분자 또는 포유류에서 FAP-발현 세포 또는 조직의 부위에서의 생물학적 활성 분자에 의해 유도된 생물학적 반응의 국소화된 활성화를 포함한다. 상기 국소화된 활성화는, 예를 들어 FAP-발현 세포 또는 조직에 대한 본 발명의 연결된 안키린 반복 도메인의 결합시에, 생물학적 활성 분자 또는 생물학적 활성 분자에 의해 결합된 단백질(예컨대, 예를 들어 세포 표면 수용체)의 클러스터링을 통해 발생할 수 있다. 상기 국소화된 활성화는 또한 다른 메커니즘을 통해, 예를 들어 생물학적 활성 분자의 단백질 가수분해 절단, 알로스테릭 변화 또는 이량체화(예를 들어 전구약물의 활성화에서와 같음)를 통해 발생할 수 있다. 본 단락에서 사용된 "포유류"는 인간을 포함한다. "국소화"의 결과는 당업자에 익히 공지된 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 예로서, "국소화"는 실시예 5에 기재된 바와 같이, 본 발명의 안키린 반복 도메인에 연결된 생물학적 활성 분자의 장기-대-혈액 비율의 측정에 의하여 측정될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 연결된 생물학적 활성 분자의 "국소화"에 대한 FAP-특이적 안키린 반복 도메인의 효과는, FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 연결되지 않은 상응하는 생물학적 활성 분자에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 또는 300%의 증가된 장기-대-혈액 비율로 나타난다.
본원에서 사용된 용어 "FAP-발현 세포" 또는 "FAP-발현 조직"은 FAP를 발현하는, 세포, 또는 세포를 포함하는 조직을 나타낸다. 상기 FAP-발현 세포는 섬유아세포, 및 특히 종양 기질 섬유아세포를 포함한다. FAP는 상피 악성 종양(원발성 및 전이성), 예컨대 폐, 결장, 방광, 난소 및 유방 암종의 90% 초과의 기질 섬유아세포, 및 뼈 및 연조직 육종의 악성 중간엽 세포에서 선택적으로 발현되는 한편, 이는 일반적으로 정상 성인 조직에서는 부재한다. FAP는 또한 특정 악성 종양 세포 예컨대 피부, 전립선 및 췌장 종양 세포에서 발현된다(문헌[Rettig et al., Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988)]; 문헌[Garin-Chesa et al., Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)]; 문헌[Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335 (1993)]; 문헌[Jin et al., Anticancer Res 23, 3195-3198 (2003)]; 문헌[Brennen et al., Mol Cancer Ther. 11: 257-266 (2012)]; 문헌[Hamson et al., Proteomics Clin Appl. 8: 454-63 (2014)]).
용어 "의학적 병상"(또는 장애 또는 질환)은 자가면역 장애, 염증성 장애, 망막병증(특히, 증식성 망막병증), 신경퇴행성 장애, 감염, 대사성 질환, 및 종양 질환을 포함한다. 본원에서 기재된 임의의 재조합 결합 단백질은 상기 장애, 특히 자가면역 장애, 염증성 장애, 면역 장애 및 종양 질환을 포함하는 군으로부터 선택되는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. "의학적 병상"은 부적절한 세포 증식을 특징으로 하는 것일 수 있다. 의학적 병상은 과증식성 병상일 수 있다. 본 발명은 특히 의학적 병상의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 상기 약학 조성물의 치료적 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 의학적 병상은 종양 질환이다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 질환"은 급속하게 증식하는 세포 성장 또는 종양을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 비정상적인 상태 또는 병상을 나타낸다. 한 구현예에서, 상기 의학적 병상은 악성 종양 질환이다. 한 구현예에서, 상기 의학적 병상은 암이다. 용어 "치료적 유효량"은 환자에서 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로는 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 병상을 나타내거나 이를 기재하기 위해 본원에서 사용된다. 암은 고형 종양 및 액형 종양, 뿐만 아니라 원발성 종양 및 전이를 포함한다. "종양"은 하나 이상의 암 세포를 포함한다. 고형 종양은 전형적으로 또한 종양 기질을 포함한다. 암의 예는 제한 없이, 원발성 및 전이성 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 및 임의의 기타 상피 및 림프성 악성 종양을 포함한다. 상기 암의 더욱 특정한 예는 뇌암, 방광암, 유방암, 난소암, 투명 세포 신장 암, 두경부 편평세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암(SCLC: small-cell lung cancer), 삼중복 음성 유방암, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 광범위 거대 B-세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL: Hodgkin's lymphoma), 맨틀 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL), 두경부의 편평세포 암종(SCCHN), 만성 골수성 백혈병(CML), 소림프구성 림프종(SLL), 악성 중피종, 결장암, 또는 위암을 포함한다.
실시예
이하 개시되는 출발 물질 및 시약은 당업계에 공지되어 있고, 시판되고, 및/또는 익히 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
물질
화학물질은 Sigma-Aldrich(미국 소재)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 Microsynth(스위스 소재)에서 입수하였다. 달리 나타내지 않는 한, DNA 폴리머라아제, 제한 효소 및 완충액은 New England Biolabs(미국 소재) 또는 Fermentas/Thermo Fisher Scientific(미국 소재)에서 입수하였다. 클로닝 및 단백질 생성 균주는 E. 콜라이 XL1-blue(미국 소재의 Stratagene) 또는 BL21(미국 소재의 Novagen)이었다. 재조합 인간 FAP는 RnD Systems(미국 소재, 제품 번호 3715-SE) 또는 Proteros(독일 소재, 제품 번호 PR-0071)에서 구입하였고, 재조합 마우스 FAP는 RnD Systems(미국 소재, 제품 번호 8647-SE)으로부터 구입하였다. 히스티딘-태깅된 시노몰구스 FAP는 곤충 세포에서 ReliaTech(독일 소재)에서 발현되었고, 표준 정제 방법을 사용하여 Molecular Partners에서 정제되었다. 비오티닐화 FAP는 표준 비오티닐화 시약 및 방법을 사용하여 단백질의 1차 아민에 비오틴 모이어티를 커플링시키는 것을 통해 화학적으로 얻었다. 인간 FAP 활성 검정을 위한 Z-Gly-Pro-AMC 형광 기질은 Bachem(제품 번호 # I-1145.0250)에서 입수하였다.
약동학 연구를 위한 건강한 암컷 BALB/c 마우스는 프랑스 생 베흐테방 세덱스 소재의 Janvier에 의해 공급되었다. DARPin® 단백질은 PBS 용액(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 Gibco Life Technologies, Ref.: 10010-015) 중에 제형화되었다. 마우스 혈청 샘플 중 DARPin® 단백질 농도는, NUNC Maxisorb ELISA 플레이트 상의 캡처 시약으로서 다클론성 염소 항-토끼 IgG 항체(Ab18, Thermo Scientific, No. 31210) 및 토끼 항-DARPin® 1-1-1 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법에 의해 측정되었다. 검출은 쥣과 항-RGS-His-HRP IgG(Ab06, Qiagen, No. 34450) 및 TMB 기질 용액으로 수행되었다.
분자 생물학
달리 나타내지 않는 한, 방법은 공지된 프로토콜에 따라 수행되었다(예를 들어 문헌[Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York] 참조).
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리를 생성하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제7,417,130호; 앞에 인용한 문헌(loc. cit.)[Binz et al. 2003]; 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]에 기재되어 있다. 상기 방법에 의해, 무작위화된 안키린 반복 모듈 및/또는 무작위화된 캡핑 모듈을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리가 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 라이브러리는 이에 따라 고정된 N-말단 캡핑 모듈(예를 들어 SEQ ID NO: 135, 136 또는 137의 N-말단 캡핑 모듈) 또는 SEQ ID NO: 138에 따른 무작위화된 N-말단 캡핑 모듈, SEQ ID NO: 139, 140 또는 141의 서열 모티프에 따른 하나 이상의 무작위화된 반복 모듈, 및 고정된 C-말단 캡핑 모듈(예를 들어 SEQ ID NO: 142, 157 또는 158의 C-말단 캡핑 모듈) 또는 SEQ ID NO: 143에 따른 무작위화된 C-말단 캡핑 모듈을 기반으로 어셈블링될 수 있다. 바람직하게는, 상기 라이브러리는 반복 또는 캡핑 모듈의 무작위화된 위치에서 아미노산 C, G, M, N(G 잔기의 앞) 및 P 중 어느 것도 갖지 않도록 어셈블링된다. 또한, SEQ ID NO: 139, 140 또는 141의 서열 모티프에 따른 무작위화된 반복 모듈은 위치 10 및/또는 위치 17에서 추가로 무작위화될 수 있고; SEQ ID NO: 138의 서열 모티프에 따른 무작위화된 N-말단 캡핑 모듈은 위치 7 및/또는 위치 9에서 추가로 무작위화될 수 있고; SEQ ID NO: 143의 서열 모티프에 따른 무작위화된 C-말단 캡핑 모듈은 위치 10, 11 및/또는 17에서 추가로 무작위화될 수 있다.
또한, 상기 라이브러리에서 상기 무작위화된 모듈은 무작위화된 아미노산 위치로 추가적 폴리펩티드 루프 삽입을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드 루프 삽입의 예는 항체의 상보성 결정 영역(CDR: complement determining region) 루프 라이브러리 또는 새로 생성된 펩티드 라이브러리이다. 예를 들어, 상기 루프 삽입은 가이드로서 인간 리보뉴클레아제 L의 N-말단 안키린 반복 도메인의 구조를 사용하여 설계될 수 있다(문헌[Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929-3938, 2004]). 10개의 아미노산이 2개의 안키린 반복의 경계 부근에 존재하는 베타-턴에 삽입되는 이러한 안키린 반복 도메인과 유사하게, 안키린 반복 단백질 라이브러리는 안키린 반복 도메인의 하나 이상의 베타-턴에 삽입된 다양한 길이(예를 들어, 1 내지 20개의 아미노산)의 무작위화된 루프(고정된 및 무작위화된 위치를 가짐)를 함유할 수 있다.
안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 상기 N-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 RILLAA, RILLKA 또는 RELLKA 모티프(예를 들어 SEQ ID NO:34에서 위치 21 내지 26에 존재함)를 가지고, 안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 상기 C-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 KLN, KLA 또는 KAA 모티프(예를 들어 SEQ ID NO:34에서 마지막 3개의 아미노산에 존재함)를 가진다.
상기 안키린 반복 단백질 라이브러리의 설계는, 표적과 상호작용하는 안키린 반복 도메인의 공지된 구조에 의해 가이드될 수 있다. 이의 단백질 정보 은행(PDB: Protein Data Bank) 고유 접근 또는 식별 코드(PDB-IDs)에 의해 식별되는 상기 구조의 예는, 1WDY, 3V31, 3V30, 3V2X, 3V2O, 3UXG, 3TWQ-3TWX, 1N11, 1S70 및 2ZGD이다.
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리, 예컨대 N2C 및 N3C 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리의 예가 기재되어 있다(미국 특허 제7,417,130호; 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2003]; 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]). N2C 및 N3C에서 숫자는 N-말단 캡핑 모듈과 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 무작위화된 반복 모듈의 수를 기재한다.
반복 단위 및 모듈 내부의 위치를 정의하는데 사용된 명명법은 안키린 반복 모듈 및 안키린 반복 단위의 경계가 하나의 아미노산 위치에 의해 이동되는 개질과 함께, 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]을 기반으로 한다. 예를 들어, 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]의 안키린 반복 모듈의 위치 1은 본 개시 내용의 안키린 반복 모듈의 위치 2에 해당하고, 이에 따라 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]의 안키린 반복 모듈의 위치 33은 본 개시 내용의 다음 안키린 반복 모듈의 위치 1에 해당한다.
DNA 서열 모두는 시퀀싱에 의해 확인되었고, 선택된 단백질의 계산된 분자량은 질량 분광학에 의해 확인되었다.
실시예 1: FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
리보솜 디스플레이(문헌[Hanes, J. and
Figure pct00004
, A., PNAS 94, 4937-42, 1997])를 사용하여, 인간 FAP(hFAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 많은 안키린 반복 단백질은 앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]에 의해 기재된 바와 유사한 DARPin® 라이브러리로부터 선택되었다. 재조합 인간 FAP 표적에 대한 선택된 클론의 결합은 미정제 추출물 균질 시간 분해 형광법(HTRF: Homogeneous Time Resolved Fluorescence)에 의해 평가되어, 수백 개의 hFAP-특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타낸다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1 내지 33의 안키린 반복 도메인은 hFAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. hFAP에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 안키린 반복 도메인으로부터의 개별적 안키린 반복 모듈은 SEQ ID NO: 48 내지 134에 제공된다.
리보솜 디스플레이에 의한 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 선택
hFAP-특이적 안키린 반복 단백질의 선택은, 표적 단백질로서 인간 FAP, 상기 기재된 안키린 반복 단백질의 라이브러리 및 확립된 프로토콜(문헌[Zahnd, C., Amstutz, P. and
Figure pct00005
, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007])을 사용하여 리보솜 디스플레이(앞에 인용한 문헌[Hanes and
Figure pct00006
])에 의해 수행하였다. 각 선택 라운드 이후 역전사(RT)-PCR 사이클의 수는 결합제의 농축으로 인한 수율에 따라 조정하여 45로부터 28로 지속적으로 감소시켰다. 처음 4개의 라운드의 선택은 라운드 1로부터 라운드 4까지 선택 압력을 증가시키 위해 표적 농도를 감소시키고 세척 엄격성을 증가시키는 것을 사용하는 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였다(앞에 인용한 문헌[Binz et al. 2004]). 고친화성 FAP-특이적 안키린 반복 단백질을 농축시키기 위해, 표준 리보솜 디스플레이 선택(상기)의 제4 라운드로부터의 출력은 선택 엄격성이 증가된 1개 또는 2개의 오프-레이트 선택 라운드에 적용하였다(앞에 인용한 문헌[Zahnd, 2007]). 최종 표준 선택 라운드를 각각의 오프-레이트 선택 라운드 이후 수행하여, 오프-레이트 선택된 결합 단백질을 증폭 및 회수하였다.
선택된 클론은 미정제 추출물 HTRF에 의해 나타난 바와 같은 FAP에 특이적으로 결합함
용액 중 FAP를 특이적으로 결합시키는 개별적 선택된 안키린 반복 단백질은 표준 프로토콜을 사용하여 안키린 반복 단백질-발현 에스케리키아 콜라이 세포의 미정제 추출물을 사용하여 균질 시간 분해 형광법(HTRF) 검정에 의해 식별하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 선택된 안키린 반복 단백질 클론을 pQE30(Qiagen) 발현 벡터에 클로닝하고, E. 콜라이 XL1-Blue(Stratagene)에 형질전환시키고, 이후 150 μl 성장 배지(1% 글루코오스 및 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 TB)를 함유하는 96 웰 플레이트(각각 단일 웰에서 클로닝됨)에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 50 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 150 μl의 새로운 LB 배지를 새로운 96-딥-웰 플레이트에서 10 μl의 밤새 배양물로 접종하였다. 37℃ 및 800rpm에서 120분 동안 인큐베이션한 이후, 발현을 IPTG(0.5 mM 최종 농도)로 유도하고, 4 시간 동안 지속하였다. 세포를 수확하고, 8.5 μl B-PERII(Pierce) 중에 재현탁시키고, 완전한 펠릿 재현탁까지 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 160 μl PBS를 첨가하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하였다.
각각의 용해된 클론의 추출물을, 384 웰 플레이트의 웰에 2.25 nM(최종 농도) 비오티닐화 인간 FAP, 1:250(최종 농도)의 항-HA-D2 HTRF 항체 - FRET 수용체 접합물(Cisbio) 및 1:400(최종 농도)의 항-strep-Tb 항체 FRET 공여체 접합물(Cisbio)과 함께 PBSTB(0.1% Tween 20® 및 0.2%(w/v) BSA로 보충된 PBS, pH 7.4) 중 1:1000 희석물(최종 농도)로서 적용하고, 60분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 340 nm 여기 파장 및 665 ±10 nm 방사 필터를 사용하여 Tecan M1000에서 HTRF를 판독하였다. 백그라운드에 대해 신호를 정규화하였다. 상기 미정제 세포 추출물 HTRF에 의한 수백 개의 클론의 스크리닝은 인간 FAP에 대한 특이성을 갖는 수백 개 초과의 상이한 안키린 반복 도메인을 밝혀냈다. 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 선택된 안키린 반복 도메인의 아미노산 서열의 예는 SEQ ID NO: 1 내지 33에 제공된다.
인간 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 이러한 안키린 반복 도메인 및 인간 FAP에 대한 결합 특이성을 갖지 않는 네거티브 대조군 안키린 반복 도메인(SEQ ID NO:44)을 N-말단 His-태그(SEQ ID NO:36) 또는 N-말단 His-HA-태그(SEQ ID NO:37)를 제공하는 pQE(독일 소재의 QIAgen) 기반 발현 벡터에 클로닝하여, 이하 기재되는 단순한 단백질 정제를 용이하게 하였다. N-말단 His-HA-태그는 His-태그 및 HA-태그를 조합한다. 예를 들어, 하기 안키린 반복 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 구축하였다:
DARPin® 단백질 #1(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:1);
DARPin® 단백질 #2(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:2);
DARPin® 단백질 #3(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:3);
DARPin® 단백질 #4(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:4);
DARPin® 단백질 #5(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:5);
DARPin® 단백질 #6(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:6);
DARPin® 단백질 #7(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:7);
DARPin® 단백질 #8(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:8);
DARPin® 단백질 #9(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:9);
DARPin® 단백질 #10(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:10);
DARPin® 단백질 #11(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:11);
DARPin® 단백질 #12(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:12);
DARPin® 단백질 #13(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:13);
DARPin® 단백질 #14(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:14);
DARPin® 단백질 #15(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:15);
DARPin® 단백질 #16(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:16);
DARPin® 단백질 #17(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:17);
DARPin® 단백질 #18(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:18);
DARPin® 단백질 #19(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:19);
DARPin® 단백질 #20(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:20);
DARPin® 단백질 #21(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:21);
DARPin® 단백질 #22(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:22);
DARPin® 단백질 #23(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:23);
DARPin® 단백질 #24(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:24);
DARPin® 단백질 #25(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:25);
DARPin® 단백질 #26(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:26);
DARPin® 단백질 #27(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:27);
DARPin® 단백질 #28(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:28);
DARPin® 단백질 #29(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:29);
DARPin® 단백질 #30(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:30);
DARPin® 단백질 #31(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:31);
DARPin® 단백질 #32(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:32);
DARPin® 단백질 #33(His-HA-태그(SEQ ID NO:37)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:33);
DARPin® 단백질 #36(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:18);
DARPin® 단백질 #37(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:19);
DARPin® 단백질 #38(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:26);
DARPin® 단백질 #39(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:33); 및
DARPin® 단백질 #44(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N-말단에 융합된 SEQ ID NO:44).
DARPin ® 단백질 #34 및 DARPin ® 단백질 #35의 조작
또한, 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 하기 안키린 반복 단백질을 인코딩하는 pQE 기반 발현 벡터를 구축하였다:
DARPin® 단백질 #34(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:34); 및
DARPin® 단백질 #35(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:35).
각각 SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19의 서열을 기반으로 SEQ ID NO:34 및 SEQ ID NO:35를 조작하였다. SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19의 안키린 반복 도메인에서, N-말단 캡핑 모듈에 존재하는 RILLAA 모티프(위치 21 내지 26)는 RELLKA 모티프로 대체하였고, C-말단 캡핑 모듈은 KLN 모티프 대신 KAA 모티프를 함유하도록 개질하였다(SEQ ID NO:18에서 위치 157 내지 159 및 SEQ ID NO:19에서 위치 124 내지 126).
DARPin ® 단백질 #144 내지 #153의 조작
또한, 인간 FAP에 특이적으로 결합하는 하기 안키린 반복 단백질을 인코딩하는 pQE 기반 발현 벡터를 구축하였다:
DARPin® 단백질 #144(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:144); DARPin® 단백질 #145(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:145); DARPin® 단백질 #146(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:146); DARPin® 단백질 #147(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:147); DARPin® 단백질 #148(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:148); DARPin® 단백질 #149(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:149); DARPin® 단백질 #150(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:150); DARPin® 단백질 #151(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:151); DARPin® 단백질 #152(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:152); 및 DARPin® 단백질 #153(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N 말단에 융합된 SEQ ID NO:153).
SEQ ID NO:144 내지 SEQ ID NO:153은 SEQ ID NO:18의 서열을 기반으로 조작하였다. SEQ ID NO:18의 안키린 반복 도메인에서, N-말단 캡핑 모듈에 존재하는 RILLAA 모티프(위치 21 내지 26)은 RILLKA 또는 RELLKA 모티프로 대체하였고/하였거나, C-말단 캡핑 모듈은 KLN 모티프 대신 KAA 모티프를 함유하도록 개질시켰고/시켰거나(SEQ ID NO:18에서 위치 157 내지 159), 제3 반복 모듈은 류신으로 프롤린을 대체하도록 개질시켰다(SEQ ID NO:18에서 위치 116). 단독으로 또는 조합으로의 이러한 개질 중 어느 것도 SEQ ID NO:18에 비하여 SEQ ID NO:144 내지 153의 유의하게 변경된 구조 또는 기능적 특성을 야기하지 않았다.
FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 높은 수준 및 가용성 발현
추가 분석을 위해, 상기 기재된 미정제 세포 추출물 HTRF에서 특이적 FAP 결합을 나타내는 선택된 클론을 E. 콜라이 BL21 또는 XL1-Blue 세포에서 발현시켰고, 표준 프로토콜에 따라 이의 His-태그를 사용하여 정제하였다. 25 ml의 정지 밤새 배양물(TB, 1% 글루코오스, 50 mg/l의 암피실린; 37℃)을 사용하여 500ml 배양물(TB, 50 mg/l 암피실린, 37℃)을 접종하였다. 600 nm에서 1.0 내지 1.5의 흡광도에서, 배양물을 0.5 mM IPTG로 유도하고, 진탕시키면서 4-5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 원심분리하고, 생성된 펠릿을 25 ml의 TBS500(50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8)에 재현탁시키고, 용해시켰다(초음파 처리 또는 프렌치 프레스(French press)). 용해 이후, 샘플을 30분 동안 62.5℃에서 열처리하고, 원심분리하고, 상청액을 수집하고 여과하였다. Triton X100(1%(v/v) 최종 농도) 및 이미다졸(20 mM 최종 농도)을 균질액에 첨가하였다. 단백질을 Ni-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 컬럼 이후 당업자에 공지된 표준 프로토콜 및 수지에 따른
Figure pct00007
™ 시스템에서의 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 대안적으로, His-태그가 없는 선택된 안키린 반복 도메인을 당업자에 공지된 표준 수지 및 프로토콜에 따른 음이온 교환 크로마토그래피 이후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 높은 가용성 안키린 반복 단백질을 15% SDS- PAGE로부터 추정된 바 >95%의 순도로 E. 콜라이 배양물(배양물 1 리터 당 200 mg 이하의 안키린 반복 단백질)로부터 정제하였다. 상기 SDS-PAGE 겔의 대표적 예는 도 1a 및 도 1b에 나타나 있다. 상기 정제된 안키린 반복 단백질을 추가 특징분석을 위해 사용하였다.
실시예 2: 표면 플라스몬 공명( SPR ) 분석에 의한 FAP에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 해리 상수(K D )의 측정
인간 FAP 표적에 대한 정제된 안키린 반복 단백질의 결합 친화성을 ProteOn 기기(BioRad)를 사용하여 분석하고, 당업자에 공지된 표준 과정에 따라 측정을 수행하였다.
간단히 말해서, 인간 FAP를 10 mM Na-아세테이트 pH 5.3 완충액에 희석시키고, 약 2000 공명 단위(RU)의 수준으로 GLC 칩(BioRad) 상에 공유결합적으로 고정시켰다. 이후 30 nM 내지 0.5 nM(온-레이트 측정)의 농도 범위를 포함하는 안키린 반복 단백질의 연속 희석물을 함유하는 200 μl 러닝 완충액(PBS, pH 7.4, 0.005% Tween 20®을 함유) 이후 100 μl/분(오프-레이트 측정)의 일정한 흐름 속도로 적어도 25분 동안 러닝 완충액 흐름을 주입함으로써 안키린 반복 단백질과 hFAP의 상호작용을 측정하였다. 15 μl의 10 mM 글리신 pH 2 이후 15 μl의 124 mM H3P04을 사용하여 재생을 수행하였다. 인터스팟(interspot) 및 참조 주입(즉, 러닝 완충액 단독의 주입)의 신호(즉, 공명 단위(RU) 값)를 안키린 반복 단백질의 주입 이후 수득된 RU 추적으로부터 뺐다(이중-참조(double-referencing)). 온-레이트 및 오프-레이트 측정으로부터 얻어진 SPR 추적을 기반으로, 상응하는 안키린 반복 단백질-FAP 상호작용의 온-레이트 및 오프-레이트를 측정하였다.
대표적 예로서, 도 2는 DARPin® 단백질 #34에 대해 얻어진 SPR 추적을 나타낸다. 당업자에 공지된 표준 과정을 사용하여 추정된 온-레이트 및 오프-레이트로부터 해리 상수(KD)를 계산하였다. 선택된 안키린 반복 단백질의 KD 값은 5 pM 내지 10 nM 범위에 있는 것으로 측정되었다. 표 1은 실시예로서 일부 선택된 안키린 반복 단백질의 KD 값을 제공한다.
[표 1]
Figure pct00008
실시예 3: FACS에 의한 FAP + 세포에 대한 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 결합
FAP-발현 세포에 대한 정제된 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 결합을 FACS에 의해 분석하였다.
다중-웰 플레이트를 사용하여, 20,000개의 WI38 세포를 웰 마다 50 μl의 PBS에 첨가하였다. 이후, 안키린 반복 단백질의 적절한 희석액(2x 희석 단계) 50 μl를 세포에 첨가하고 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 안키린 반복 단백질-결합 반응 이후, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 이후, Penta-His AF647 접합물(QIAgen)을 사용한 His-태깅된 안키린 반복 단백질의 직접적 면역형광 검출 및 LIVE/DEAD™ 고정성 그린 사멸 세포 염색 키트(Fixable Green Dead Cell Stain Kit)(ThermoFisher)를 사용한 생세포의 측정을 하나의 단계로 함께 수행하였다. Penta-His AF647 접합물 및 LIVE/DEAD™ 고정성 그린 염료를 1/200(Penta-His) 및 1/1000(L/D Fixable) 최종 희석물 중에서 함께 세포에 적용하고, 20 내지 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. PBS에 의한 세포의 세척 이후, 세포를 1X CellFix™ 완충액(BD Biosciences)(10x 스톡은 물 중에 1/10로 희석됨) 중에 재현탁시켰다. 15-20분 동안 RT에서 CellFix™ 완충액 중에서 샘플을 인큐베이션한 후, 5분 동안 400g으로 스핀다운하였다. 상청액을 버리고, 세포를 200 μl PBS 중에 재현탁시키고, 획득 및 FACS 분석까지 4℃에서 저장하였다. 획득 및 FACS 분석, 예컨대 중앙 형광 강도(MFI)의 측정은 AttuneNxT 기기를 사용하여 염색 이후 5일 이내에 이루어졌다. GraphPad Prism 소프트웨어(v 7.0.4)를 사용한 비선형 회귀 곡선 피팅에 의해 결합 곡선을 피팅하였다.
대표적 예로서, 도 3은 DARPin® 단백질 #18, DARPin® 단백질 #19, DARPin® 단백질 #26 및 DARPin® 단백질 #33에 대해 수득된 결합 곡선을 나타낸다. 당업자에 공지된 표준 과정을 사용하여 EC50 값을 측정하였다. 선택된 안키린 반복 단백질의 EC50 값은 100 pM 내지 5 nM의 범위인 것으로 측정되어, FAP-발현 WI38 세포에 대한 높은 친화성 결합을 입증하였다. 표 2는 예로서 선택된 안키린 반복 단백질의 EC50 값을 제공한다.
[표 2]
Figure pct00009
유사하게는, FAP-발현 WI38 세포에 대한 조작된 안키린 반복 단백질, 즉 DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35의 결합을 또한 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였다. 샘플 MFI를 백그라운드 대조군의 MFI로 나눔으로써 배수 증가 MFI를 계산하였다. 백그라운드 대조군의 경우, 결합 반응 완충액을 안키린 반복 단백질의 부재 하에, 오로지 Penta-His AF647 접합물과 함께 인큐베이션하였다.
도 4a는 WI38 세포에서 DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35에 대한 결합 곡선을 나타내며, DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35 모두가 높은 친화성으로 FAP-발현 WI38 세포에 결합함을 입증한다. DARPin® 단백질 #34의 경우 EC50 값은 0.736 nM이었고, DARPin® 단백질 #35의 경우 EC50 값은 0.994 nM이었다(표 3 참조).
FAP-발현 세포에 대한 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 결합이 실제로 세포 표면 상에서 발현된 FAP에 대한 결합에 의해 매개되었음을 입증하기 위하여, FAP 발현과 함께 또는 없이 세포에 대한 선택된 안키린 반복 단백질의 결합을 측정하였다. 이러한 목적을 위해, 세포 표면에서 FAP를 발현하는 CHO 세포를 생성하였다. 이러한 FAP-발현 CHO 세포는 FAP를 발현하지 않는 야생형 CHO 세포와 비교하여 사용될 수 있다.
간단히 말해서, 인간 FAP를 인코딩하는 cDNA(OriGene Technologies로부터 수득됨)를 사용하여 표준 분자 생물학 기술에 의해 발현 벡터를 생성하였다. CHO 세포를 Lipofectamine을 사용하여 발현 벡터로 형질감염시켰다. 상이한 농도의 Geneticin G-418(Promega, V8091)을 사용하여 선택 압력을 적용하였다. hFAP의 발현을 항-FAP 항체를 사용하는 유세포 분석에 의해 분석하였다. 이러한 세포(CHO-FAP1.9 세포)에서 FAP의 비교적 낮은 발현 수준을 기반으로, 1.9 mg/mL G-418을 사용하여 수득된 CHO-hFAP 형질감염체의 집단을 추가 실험을 위해 선택하였다. FACS 분석은 야생형 CHO 세포(CHO-wt)가 아닌 CHO-FAP1.9 세포가 세포 표면에서 hFAP를 발현함을 입증하였다(데이터는 나타내지 않음).
DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35의 일련의 희석액을 야생형 CHO 세포(CHO-wt) 및 CHO 세포를 발현하는 hFAP(CHO-FAP1.9)에 첨가하였다. 결합 반응 및 후속 분석 및 MFI 측정은 본질적으로 WI38 세포에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 4b는 CHO-wt 세포 및 CHO-FAP1.9 세포에 대한 DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35에 관한 결합 곡선을 나타내며, DARPin® 단백질 #34 및 DARPin® 단백질 #35가 오로지 세포 표면에서 FAP를 발현하는 이러한 CHO 세포(즉 CHO-FAP1.9)에만 결합함을 입증하였다. 따라서, 세포에 대한 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 결합은 세포 표면에서 발현된 FAP에 대한 결합에 의해 매개된다. CHO-FAP1.9 세포에 대한 결합에 관한 EC50 값은 DARPin® 단백질 #34의 경우 1.186 nM 및 DARPin® 단백질 #35의 경우 2.016 nM이었다(표 3 참조).
[표 3]
Figure pct00010
실시예 4: SPR 및 cFAP 형질감염된 CHO 세포에 의해 측정된 시노몰구스 FAP에 대한 결합
ProteOn 기기(BioRad)를 사용하여 가용성 cFAP 표적에서 및 당업자에 공지된 표준 과정에 따라 형질감염된 CHO 세포 및 FACS를 사용하여 세포 cFAP 표적에서 시노몰구스 FAP(cFAP)에 대한 선택된 안키린 반복 단백질의 결합을 평가하였다.
간단히 말해서, 시노몰구스 FAP를 10mM Na-아세테이트 pH5.3 완충액에 희석시키고, 약 2000 공명 단위(RU)의 수준으로 GLC 칩(BioRad) 상에 공유결합적으로 고정시켰다. 이후 25 nM 내지 0.3 nM(온-레이트 측정)의 농도 범위를 포함하는 안키린 반복 단백질의 연속 희석물을 함유하는 200 μl 러닝 완충액(PBS, pH 7.4, 0.005% Tween 20®을 함유) 이후 100 μl/분(오프-레이트 측정)의 일정한 흐름 속도로 적어도 25분 동안 러닝 완충액 흐름을 주입함으로써 안키린 반복 단백질과 cFAP의 상호작용을 측정하였다. 15 μl의 10 mM 글리신 pH 2 이후 15 μl의 124 mM H3P04를 사용하여 재생을 수행하였다. 인터스팟 및 참조 주입(즉, 러닝 완충액 단독의 주입)의 신호(즉, 공명 단위(RU) 값)를 안키린 반복 단백질의 주입 이후 수득된 RU 추적으로부터 뺐다(이중-참조). 온-레이트 및 오프-레이트 측정으로부터 얻어진 SPR 추적을 기반으로, 상응하는 안키린 반복 단백질-FAP 상호작용의 온-레이트 및 오프-레이트를 측정하였다.
대표적 예로서, 도 5는 시노몰구스 및 인간 FAP 모두에서 DARPin® 단백질 #36에 대해 얻어진 SPR 추적을 나타낸다. 당업자에 공지된 표준 과정을 사용하여 추정된 온-레이트 및 오프-레이트로부터 해리 상수(KD)를 계산하였다. cFAP에서 KD 값은 hFAP에서 KD 값의 2배 범위 이내인 것으로 측정되어, 이러한 상이한 종의 FAP 단백질에 대한 선택된 안키린 반복 단백질의 필적가능한 결합을 입증하였다. 표 4는 예로서 선택된 안키린 반복 단백질 중 일부의 cFAP 및 hFAP에 대한 KD 값을 제공한다.
[표 4]
Figure pct00011
세포 표면에서 발현된 시노몰구스 FAP(cFAP)에 대한 선택된 안키린 반복 단백질의 결합을 평가하기 위해, cFAP를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO 세포를, cFAP를 인코딩하는 cDNA가 사용된 것을 제외하고는 본질적으로 hFAP에 대하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다.
안키린 반복 단백질의 일련의 희석액을 CHO 세포를 발현하는 cFAP에 첨가하였다. 결합 반응 및 후속 분석 및 MFI 측정은 본질적으로 WI38 세포에 대하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 6은 cFAP-발현 CHO 세포에서 DARPin® 단백질 #18, DARPin® 단백질 #19, DARPin® 단백질 #26 및 DARPin® 단백질 #33에 대한 결합 곡선을 나타내며, FAP-특이적 안키린 반복 단백질이 또한 세포 표면에서 발현된 시노몰구스 FAP에 결합함을 입증한다. cFAP-발현 CHO 세포에 대한 결합에 관한 EC50 값은 표 5에 제공되어 있다.
[표 5]
Figure pct00012
실시예 5: 생물학적 활성 분자에 융합된 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 FAP-발현 세포 결합, SPR , 약동학, 생체-분포, 및 종양 국소화 데이터
생물학적 활성 분자에 융합된 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 구축
선택된 FAP-특이적 안키린 반복 도메인을 당업자에 공지된 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 생물학적 활성 분자에 유전적으로 융합시켰다. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인(SEQ ID NO:38)을 예시적 생물학적 활성 분자로서 선택하였다. 혈청 알부민-특이적 안키린 반복 도메인 및 상이한 표적 특이성을 갖는 공유결합적으로 부착된 안키린 반복 도메인의 생체내 반감기 연장을 위한 이의 사용은 이전에 보고되었다(예를 들어 문헌[Steiner et al., 2017, "Half-life extension using serum albumin-binding DARPin® domains," Protein Eng. Des. Sel. 30(9):583-591 (2017)]; 미국 특허 제9,284,361호; 미국 특허 제9,458,211호 참조). SEQ ID NO:38의 안키린 반복 도메인은 다양한 종, 예컨대 마우스, 인간 및 시노몰구스 원숭이의 혈청 알부민에 결합한다. 생물학적 활성 분자를 펩티드 링커를 통해 FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 연결하였다. 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커(SEQ ID NO:39)를 이러한 목적을 위한 예시적 펩티드 링커로서 선택하였다.
펩티드 링커 및 생물학적 활성 분자와 함께 FAP-특이적 안키린 반복 도메인을, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 단순한 단백질 정제를 용이하게 하기 위해 N-말단 His-태그(SEQ ID NO:36)를 제공하는 pQE(독일 소재의 QIAgen) 기반 발현 벡터에 클로닝하였다. 예를 들어, 하기 안키린 반복 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 구축하였다:
DARPin® 단백질 #40(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N-말단에 융합된 SEQ ID NO:40). SEQ ID NO:40은 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:18을 포함한다.
DARPin® 단백질 #41(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N-말단에 융합된 SEQ ID NO:41). SEQ ID NO:41은 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:19를 포함한다.
DARPin® 단백질 #42(His-태그(SEQ ID NO:36)가 N-말단에 융합된 SEQ ID NO:42). SEQ ID NO:42는 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO:38 및 SEQ ID NO:26을 포함한다.
U87 MG 및 WI38 세포에 대한 생물학적 활성 분자에 융합된 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 결합
FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 대한 생물학적 활성 분자의 용합이 세포의 표면에서 발현된 FAP를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 분자의 능력에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해, FAP-발현 세포에 대한 선택된 안키린 반복 융합 단백질의 결합을 시험하였다. U87 MG 세포 및 WI38 세포는 세포 표면에서 FAP를 발현하는 것으로 공지되어 있고, 이를 이러한 실험을 위한 대표적 세포로서 선택하였다. U87 MG 및 WI38 세포에서 FAP 발현을 FACS 분석에 의해 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
다중-웰 플레이트를 사용하여, 40,000개의 세포(U87MG 또는 WI38)를 웰 마다 50 μl의 PBS에 첨가하였다. 이후 안키린 반복 융합 단백질(DARPin® 단백질 #40 또는 DARPin® 단백질 #41)의 적절한 희석액(2x 희석 단계) 50 μl를 세포에 첨가하고 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 안키린 반복 융합 단백질-결합 반응 이후, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 이후 Penta-His AF647 접합물(QIAgen)을 사용한 His-태깅된 안키린 반복 융합 단백질의 직접적 면역형광 검출 및 LIVE/DEAD™ 고정성 그린 사멸 세포 염색 키트(ThermoFisher)를 사용한 생세포의 측정을 하나의 단계로 함께 수행하였다. Penta-His AF647 접합물 및 LIVE/DEAD™ 고정성 그린 염료를 1/400(Penta-His) 및 1/1000(L/D Fixable) 최종 희석물 중에 함께 세포에 적용하고, 20 내지 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. PBS에 의한 세포의 세척 이후, 세포를 1X CellFix™ 완충액(BD Biosciences)(10x 스톡은 물 중에 1/10로 희석됨) 중에 재현탁시켰다. 15-20분 동안 RT에서 CellFix™ 완충액 중에서 샘플을 인큐베이션한 후, 5분 동안 400g으로 스핀다운하였다. 상청액을 버리고, 세포를 200 μl PBS 중에 재현탁시키고, 획득 및 FACS 분석까지 4℃에서 저장하였다. 획득 및 FACS 분석, 예컨대 중앙 형광 강도(MFI)의 측정은 AttuneNxT 기기를 사용하여 염색 이후 5일 이내에 이루어졌다. GraphPad Prism 소프트웨어(v 7.0.4)를 사용한 비선형 회귀 곡선 피팅에 의해 결합 곡선을 피팅하였다.
도 7은 각각 U87MG 및 WI38 세포에 대한 DARPin® 단백질 #40 및 DARPin® 단백질 #41의 결합 곡선을 나타낸다. 안키린 반복 융합 단백질 모두는 농도-의존적 방식으로 상이한 세포 유형에 결합하여, 10 내지100 nM의 농도로 결합 포화를 달성한다. 따라서, 세포 FAP에 대한 안키린 반복 융합 단백질의 특이적 결합은 생물학적 활성 분자에 대한 융합이 없는 FAP-특이적 안키린 반복 도메인과 비교하여 유사하다. 따라서, 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인은 생물학적 활성 분자에 융합될 수 있고, 상기 FAP-특이적 안키린 반복 융합 단백질은 세포의 표면에서 발현되는 FAP에 효율적으로 결합하는 이의 능력을 보유한다.
마우스에서 생물학적 활성 분자에 융합된 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 약동학적 프로파일
본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인은 이것이 치료제의 개발에 유용하기 위해 생체내에서 적절한 혈청 반감기를 가질 수 있는지 여부를 측정하기 위해, DARPin® 단백질 #40, DARPin® 단백질 #41 및 DARPin® 단백질 #42의 약동학 프로파일을 마우스에서 분석하였다.
생체내 투여 및 샘플 수집
각각의 안키린 반복 융합 단백질에 대해 6마리의 마우스의 꼬리 정맥에 단일 정맥내 볼루스 주사로서 DARPin® 단백질 #40, DARPin® 단백질 #41 및 DARPin® 단백질 #42를 투여하였다. 표적 투여량 수준은 5 mL/㎏의 적용 부피로 1 mg/㎏이었다. 안키린 반복 융합 단백질을 포스페이트-완충 식염수(PBS) 용액 중에 제형화하였다.
마우스를 동일한 수의 동물로 2개의 군으로 나누었다. 각 마우스로부터 4개의 혈청 샘플을 수집하였다. 약동학 조사를 위한 혈액 샘플은 화합물 투여 이후 5분, 4시간, 24시간, 48시간, 76시간, 96시간 및 168시간에 복재 정맥으로부터 수집하였다. 혈액을 실온에서 유지하여 응고시켰고, 이후 원심분리 및 혈청의 수집이 뒤따랐다.
혈청 샘플에서 안키린 반복 단백질을 측정하기 위한 ELISA에 의한 생체 분석
PBS 중 10 nM 다클론성 염소 항-토끼 IgG 항체(Ab18)의 웰 당 100 μl를 4℃에서 밤새 NUNC Maxisorb ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 웰 마다 300 μl PBST(0.1% Tween20로 보충된 PBS)로 5회 세척한 이후, Heidolph Titramax 1000 진탕기(450 rpm)에서 실온(RT)에서 1시간 동안 0.25% Casein(PBST-C)로 보충된 300 μl PBST로 웰을 블로킹하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. PBST-C 중 100 μl 5 nmol/L 토끼 항-DARPin® 1-1-1 항체를 첨가하고, 1시간 동안 오비탈 진탕(450 rpm)과 함께 RT(22℃)에서 플레이트를 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다.
100 μl의 희석된 혈청 샘플(1:20 - 1:312500, 1:5 희석 단계) 또는 안키린 반복 단백질 표준 곡선 샘플(0 및 50 - 0.0008 nmol/L, 1:3 희석 단계)을 450 rpm으로 진탕시키면서 RT에서 2시간 동안 적용하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다.
이후 웰을 100 μl 쥣과 항-RGS-His-HRP IgG(Ab06, PBST-C 중 1:2000)와 함께 인큐베이션하고, 1시간 동안, RT, 450 rpm으로 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 5분 동안 100 μl/웰 TMB 기질 용액을 사용하여 ELISA를 전개시켰고, 100 μl 1 mol/L H2SO4의 첨가에 의해 중단하였다. 450 nm에서의 흡광도와 620 nm에서의 흡광도 사이의 차이를 계산하였다. 2개의 상이한 플레이트에서 이중으로 샘플을 측정하였다. 도 8은 마우스에의 단일 정맥내 투여 이후 시간의 함수로서 DARPin® 단백질 #40, DARPin® 단백질 #41 및 DARPin® 단백질 #42의 혈청 농도를 나타낸다. 추적은 화합물의 대략적 단일-지수 제거를 나타낸다.
약동학적 분석
Phoenix 64(미국 노스 캐롤라이나주 소재의 Pharsight)의 일부로서 WinNonlin 프로그램의 버전 7.0을 사용하여 Molecular Partners에서 약동학적 데이터 분석을 수행하였다. 정맥내 볼루스 주사를 통해 투여된 동물의 평균 농도-시간 데이터를 기반으로 하는 약동학적 매개변수의 계산을 비구획적 분석(NCA 모델 200-202, IV 볼루스, 선형 사다리꼴 선형 보간(linear trapezoidal linear interpolation))으로 수행하였다. 하기 약동학 매개변수를 계산하였다:
AUCinf, AUClast, AUC_%extrapol, Cmax, Tmax, Cl_pred, Vss_pred, t1/2
최대 혈청 농도(Cmax) 및 이의 발생 시간(Tmax)을 혈청 농도-시간 프로파일로부터 직접 수득하였다. 혈청 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUCinf)은, 최종 샘플링 지점(Tlast)까지 선형 사다리꼴 식 및 최종 단계의 단일-지수 감소를 가정한 무한대로의 외삽에 의해 측정하였다. 무한대까지의 외삽을 Clast / λz를 사용하여 수행하였고, 여기서 λz는 로그 선형 회귀에 의해 추정된 최종 속도 상수를 나타내고 Clast는 최종 로그-선형 회귀에 의한 Tlast에서 추정된 농도를 나타낸다. 총 혈청 청소율(Cl_pred) 및 겉보기 말기 반감기는 하기와 같이 계산하였다: Cl_pred = 정맥내(i.v.) 투여량 / AUCinf 및 t1/2 = ln2 / λz. 분포의 정상-상태 부피 Vss는 하기에 의해 측정하였다: Vss = 정맥내 투여량 - AUMCinf / (AUCinf)2. AUMCinf는 AUCinf의 계산을 위해 기재된 바와 동일한 외삽 절차를 사용하여 무한대로 외삽된 약물 농도-시간 곡선의 첫 번째 모멘트 하의 총 면적을 나타낸다. nmol/L으로 주어진 농도를 기반으로 PK 매개변수를 계산하기 위해, mg/㎏으로 주어진 투여량 값을 안키린 반복 단백질의 분자량을 사용하여 nmol/㎏으로 전환하였다. 표 6은 시험된 안키린 반복 융합 단백질에 대해 수득된 약동학적 데이터를 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00013
혈청 반감기는 DARPin® 단백질 #40의 경우 38.8시간, DARPin® 단백질 #41의 경우 26.9시간, 및 DARPin® 단백질 #42의 경우 26.1시간으로서 측정되었다. 이러한 데이터는 혈청 알부민-특이적 안키린 반복 도메인에 융합될 때, 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인이 충분한 생체내 반감기를 가져, 이를 생물학적 활성 분자에 공유결합적으로 연결된 FAP-특이적 안키린 반복 도메인을 포함하는 치료제의 구성성분으로서 유용하게 만든다는 것을 나타낸다.
생물학적 활성 분자에 융합된 FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 종양 국소화
본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인이, FAP를 발현하는 종양 조직에 바람직하게 생물학적 활성 분자를 국소화하는 데 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 생물학적 활성 분자에 융합된 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 생체내 국소화를 마우스 종양 모델에서 분석하였다.
SPR에 의해 측정된 마우스 및 인간 FAP에 대한 DARPin ® 단백질 #41의 결합
마우스 종양 모델에서 FAP-특이적 안키린 반복 융합 단백질을 분석하기 전에, FAP-특이적 안키린 반복 융합 단백질이 인간 FAP 뿐만 아니라 또한 마우스 FAP(mFAP)에 결합함을 나타내야 한다. 이러한 목적을 위해, 가용성 마우스 및 인간 FAP에 대한 DARPin® 단백질 #41의 결합을 당업자에 공지된 표준 과정에 따라 ProteOn 기기(BioRad)를 사용한 SPR 측정에 의해 평가하였다.
간단히 말해서, 마우스 FAP를 10mM Na-아세테이트 pH5.3 완충액에 희석시키고, 약 2000 공명 단위(RU)의 수준으로 GLC 칩(BioRad) 상에 공유결합적으로 고정시켰다. 이후 50 nM 내지 3 nM(온-레이트 측정)의 농도 범위를 포함하는 DARPin® 단백질 #41의 연속 희석물을 함유하는 200 μl 러닝 완충액(PBS, pH7.4, 0.005% Tween20®을 함유) 이후 100 μl/분(오프-레이트 측정)의 일정한 흐름 속도로 30분 동안 러닝 완충액 흐름을 주입함으로써 DARPin® 단백질 #41과 mFAP의 상호작용을 측정하였다. 15 μl의 10 mM 글리신 pH 2 이후 15 μl의 124 mM H3P04를 사용하여 재생을 수행하였다. 인터스팟 및 참조 주입(즉, 러닝 완충액 단독의 주입)의 신호(즉, 공명 단위(RU) 값)를 DARPin® 단백질 #41의 주입 이후 수득된 RU 추적으로부터 뺐다(이중-참조). hFAP에 대한 DARPin® 단백질 #41의 결합을 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였다.
해리 상수(KD)를 당업자에 공지된 표준 과정을 사용하여 추정된 온-레이트 및 오프-레이트로부터 계산하였고, 표 7에 보고하였다. 이러한 결과는, 생물학적 활성 분자(DARPin® 단백질 #41)에 융합된 FAP-특이적 안키린 반복 도메인은 상응하는 FAP-특이적 안키린 반복 도메인 단독(표 1에서 DARPin® 단백질 #19 참조)과 유사한 KD로 인간 FAP에 결합하고, 이는 마우스 FAP와 교차-반응함을 나타낸다. 마우스 FAP에 대한 결합에 관한 DARPin® 단백질 #41의 해리 상수는 1.3 nM인 것으로 측정되었다.
[표 7]
Figure pct00014
생체분포 분석에 의한 FAP-포지티브 마우스 종양 모델에서 평가된 DARPin® 단백질 #41의 생체내 국소화
U87 MG 교아세포종 세포를 포함하는 마우스 종양 모델을 DARPin® 단백질 #41의 생체내 국소화의 평가를 위한 대표적 FAP-포지티브 종양 모델로서 선택하였다. U87 MG 세포는 이의 세포 표면에서 FAP를 발현하고, 이는 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인에 의해 결합된다(상기 참조). 또한, 마우스에서 U87 종양은 예상되는 바와 같이 FAP도 발현한다(데이터는 나타내지 않음).
마우스 당 1000만개의 U87 MG 세포를 암컷 CD1(nu/nu) 마우스에 피하 이식하였다. 2개의 별도의 위치에서 세포를 이식하여(위치 당 500만개의 세포), 마우스 당 2개의 종양을 생성하였다. 이식된 종양 세포를 증식시키고, 500 ㎣의 종양 부피가 달성될 때까지 그리고 안키린 반복 융합 단백질이 투여되기 전에 3 내지 4주 동안 종양을 성장시켰다. 투여를 위한 안키린 반복 융합 단백질을 생성하기 위해, 당업계에 공지된 방법에 따라, DARPin® 단백질 #41의 His-태그와의 복합체 형성에 의해 99m-Technetium에 의해 DARPin® 단백질 #41을 방사성 라벨링하였다(예를 들어, 문헌[Waibel et al., Nature Biotech. 17: 897-901 (1999)]; 문헌[Egli et al., J. Nucl. Med. 40: 1913-1917 (1999)] 참조). 대조군 화합물로서, FAP-특이적 안키린 반복 도메인이 비결합 안키린 반복 도메인(즉, FAP에 결합하지 않고 공지된 결합 특이성을 갖지 않는 안키린 반복 도메인)으로 대체된 것을 제외하고는, DARPin® 단백질 #41과 동일한 단백질(DARPin® 단백질 #43; SEQ ID NO:43)을 사용하였다. DARPin® 단백질 #43을 DARPin® 단백질 #41과 유사하게 99m-Technetium에 의해 라벨링하였다.
30마리의 암컷 U87-종양-함유 CD1(nu/nu) 마우스를 2개의 군으로 나누었다. 한 군은 꼬리 정맥에의 주사에 의한 약 3.6 MBq(약 1 mg/㎏)의 DARPin® 단백질 #41의 단일 투여량을 받았다. 다른 군은 꼬리 정맥에의 주사에 의한 약 3.6 MBq(약 1 mg/㎏)의 DARPin® 단백질 #43의 단일 투여량을 받았다. 방사성 라벨링된 안키린 반복 융합 단백질의 주사 이후 1시간, 24시간 및 48시간의 시점에 생체분포를 모니터링하였다. 마우스를 마취시키고, 경추 탈구에 의해 죽이고(각 시점에서 5마리의 마우스), 혈액의 분취량을 수집하였다. 관심 대상인 장기(예컨대 예를 들어 종양, 비장, 신장, 간, 근육)를 추출하고, 칭량하고, 방사능을 γ-카운터(Packard Cobra II Gamma D5010, 미국 소재의 GMI)로 측정하였다. 혈액에서 측정된 방사능에 대한 상이한 장기에서 측정된 방사능의 비율을 계산하였다.
도 9는 주사후 48시간에 DARPin® 단백질 #41 및 대조군 화합물 DARPin® 단백질 #43의 생체분포를 나타낸다. 방사능의 높은 장기/혈액 비율은 신장 및 2개의 종양에서 DARPin® 단백질 #41에 대해 관찰되었으나, 다른 장기에서는 관찰되지 않았다. 대조군 DARPin® 단백질 #43의 경우, 방사능의 상승된 장기/혈액 비율이 신장에서 관찰되었으나, 2개의 종양 또는 다른 장기에서는 관찰되지 않았다. 신장이 DARPin® 분자 제거의 부위일 가능성이 있기 때문에, 신장에서 DARPin® 단백질 #41 및 DARPin® 단백질 #43에 대해 관찰된 방사능의 상승된 수준이 예상된다. 2개의 종양에서 DARPin® 단백질 #41에 대해 관찰된 방사능의 상승된 수준은 DARPin® 단백질 #41의 FAP-표적이 높은 종양 축적 및 보유를 야기하였음을 나타낸다. DARPin® 단백질 #41의 혈청 반감기(상기 참조) 및 순환으로부터의 DARPin® 단백질 #41의 예상된 제거율을 고려하여, 주사후 48시간에 DARPin® 단백질 #41에 대해 관찰된 높은 종양/혈액 비율은 또한 FAP-표적화로 인한 연장된 종양 보유를 나타낸다. 종합하여, 생체분포 분석의 결과는 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인이 생물학적 활성 분자(예컨대, 예를 들어, DARPin® 단백질 #41에서의 혈청 알부민-결합 도메인)에 융합될 수 있고, FAP-발현 종양 조직에서 생물학적 활성 분자를 국소화하고 보유하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 FAP-특이적 안키린 반복 도메인은 FAP-발현 종양에서 치료적 활성 분자(예컨대 항-종양제)를 국소화하고 보유하고, 이에 따라 다른 장기 및 전체로서 유기체에서 치료적 활성 분자의 잠재적 부작용을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
실시예 6 : 생물학적 활성 분자에 융합된 FAP -특이적 안키린 반복 단백질은 종양 성장을 저해시키고, 종양에서 인간 CD8 T 세포의 밀도를 선택적으로 증가시킴
생체내에서 T 세포를 자극하고 종양 성장을 저해하는 생물학적 활성 분자(면역 조절제)에 연결된 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 능력을 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(MiXeno)로 재구성된 HT-29 결장 암종 이종이식 모델에서 시험하였다. 이러한 인간화 마우스 모델은 면역 체크포인트 및 공동-자극 약물의 면역 자극 효능을 시험하기에 적합한 것으로 기재되었다. FAP-특이적 안키린 반복 도메인 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 본 발명의 결합 단백질이 종양내 T 세포 침윤을 증가시키고 종양 성장을 늦출 수 있었는지 여부를 평가하기 위해 모델을 사용하였다. 실험에 사용된 결합 단백질(DARPin® 단백질 #45)은, 생물학적 활성 분자로서 아고니스트적 T-세포 공동자극 수용체(TCCR)-특이적 안키린 반복 단백질에 대해 펩티드 링커(SEQ ID NO:39)에 의해 그 C-말단에서 연결된 SEQ ID NO: 34를 포함하였다. TCCR의 분자 동일성은, 2019년 6월 4일에 미국 특허청에 출원되고 Molecular Partners AG에 양도된 "다중특이성 단백질"의 명칭의 미국 임시 특허 출원 제62/857,037호에, 및 미국 특허 제62/857,037호로부터의 우선권을 주장하고 본 PCT 출원의 출원일에 출원된 PCT 국제 특허 출원에 개시된다. TCCR 및 다른 면역 조절제는 당업계에 익히 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Smith-Garvin et al., Annu Rev Immunol. 27: 591-619 (2009)] 참조). 이러한 모델에서 표적화된 TCCR에 대한 단클론성 항체에 의한 치료는 유의하게 느린 종양 성장에 충분하였으나, 이는 또한 강한 전신적 효과 예컨대 가속화된 이식편 대 숙주 질환(GVHD: graft versus host disease) 및 간 T 세포 침윤을 유도하여, 비치료된 마우스에 비해 조기 사망을 야기하였다.
물질 및 방법:
종양 실험: 면역결핍 NOG 마우스를 HT-29 종양 세포(3.5 × 106)로 우측 옆구리 부분에 피하 접종하였다. 이후 2명의 건강한 인간 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 주사하여 마우스를 인간화하였다(3.5 x 106개의 세포/마우스). 표 8에 나타낸 바와 같은 사전 결정된 요법에 따라 종양-함유 마우스에 시험 물품을 투여하였다.
[표 8]
Figure pct00015
종양 세포 및 PBMC 접종의 날짜를 제0일로 나타냈다. 종양 성장을 3 내지 4일마다 모니터링하였다. 실험 제18일에, 마우스를 희생시키고, 종양을 제거하고, 유세포 분석 및 정량적 면역형광법(QIF)에 의해 연구하였다. 종양 성장 분석은 18일로 제한되었는데, 이는 이 시간 이후 마우스가 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 신호를 나타내기 시작했기 때문이다.
유세포 분석: 원시 FCS 파일로부터의 데이터를 FlowJo 소프트웨어(TreeStar)로 분석하였다. 인간 표면 마커 CD45, CD4 및 CD8을 발현하는 생림프구에 세포를 게이팅하였다. 사멸 세포는 생-사멸(live-dead) 라벨링 염료 7-AAD의 혼입을 통해 분석으로부터 제외하였다. 혈액에서 검출된 총 인간 CD45 포지티브 세포의 백분율로서 인간 CD8 T 세포의 백분율이 나타난다.
면역조직화학: 해부 시 마우스로부터 조직을 회수하고, 최적 절단 온도 화합물(Sakura)에 포매하고, 사전 고정화 없이 동결시켰다. OCT 포매된 저온보존된 시편을 7 μm 섹션으로 절단하고, 유리 슬라이드 상에 두었다. 슬라이드를 차가운 아세톤으로 고정하였다. 다중 면역형광 염색을 하기 항체에 의해 수행하였다: 항-CD4(염소 Pab, R&D System #AF-379-NA), 항-CD8(토끼 PAb, Abcam #ab40555) 및 항-CD45(클론 HI30, Biolegend #304002). 이러한 항체는 각각 항-양- Alexa Fluor® 647(Thermofisher # A21448), 항-토끼- Rhodamine Red™-X(Jackson ImmunoResearch #711-296-152) 및 항-마우스IgG1- Alexa Fluor® 488(Jackson ImmunoResearch #115-545-205)에 의해 검출하였다. Zeiss Axio Scan.Z1 슬라이드스캐너에서 영상을 획득하였다. Zen blue 소프트웨어로 영상을 전송하고, FIJI 패키지와 함께 ImageJ 1.51n 소프트웨어를 사용해 분석하여, 인간 CD45, CD8 및 CD4 T 세포의 수를 정량화하였다.
통계적 분석: Prism 7.0.2 소프트웨어(GraphPad 소프트웨어)에 의해 통계적 분석을 수행하였다. 반복 측정 이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 시험(Tukey's multiple comparison test)(GraphPad Prism, Vers. 7.02)을 사용하여 통계적으로 유의한 차이에 대하여 종양 성장 및 체중 데이터를 분석하였다. 생존 곡선을 카플란 마이어 방법(Kaplan-Meier method)에 의해 분석하고, 로그-순위 시험(log-rank test)에 의해 비교하였다. 연구 종료시에 유세포 분석 데이터를 일원 ANOVA(GraphPad Prism, Vers. 7.02)를 사용하여 분석하였다. 양측 P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
결과
종양 성장: 종양 성장은 시간 경과에 따라 개별적으로 추적하였다. 독립적-샘플 T 시험을 사용한 종양 접종 이후 제18일에 수득된 데이터에 대해 수행된 통계적 분석 이외에, 반복 측정 이원 ANOVA와 이후 터키 다중 비교 시험을 사용하여 통계적으로 유의한 차이에 대해 종양 성장 데이터를 분석하였다. 종양 성장 저해를 표 9에 요약하였다.
[표 9]
Figure pct00016
a. 평균 ± SEM; b. 종양 성장 곡선의 모든 시점에 대한 RM 이원 ANOVA 이후 비히클 대조군에 대한 터키 다중 비교 시험(* p<0.05, ** p<0.001).
전체 종양 성장 곡선의 분석은, 연구 종료 시 최종 종양 부피만의 분석에 비하여 더 높은 분석력을 제공한다. 2개의 분석은 잘 연관되어 있다. DARPin® 단백질 #45 치료군(p<0.001)에서 종양 성장이 지연되었다. 투여된 비히클은 종양 성장에 대해 유의한 영향을 갖지 않았다. 요약하면, 시험 물질, DARPin® 단백질 #45는 피하 HT-29 인간 결장암 MiXeno 모델에서 유의한 항-종양 활성을 입증하였다.
혈액 및 종양의 면역표현형: 유세포 분석에 의해 수득된 결과를 확인하기 위해, 인간 CD4 및 CD8 T 림프구 밀도를 제18일에 절제된 종양에서 조직학에 의해 분석하였다. 군 당 5마리의 마우스로부터 조직을 사용하여 조직학적 실험을 수행하였다(데이터는 나타내지 않음). DARPin® 단백질 #45에 의한 치료는 비히클 군과 비교하여 인간 CD8 T 림프구의 더 조밀한 침윤을 야기하였다. 차이는 유의성을 달성하였다(P<0.01). 다른 한편으로는, CD4 종양 침윤 림프구의 수는 군 간에 유의하게 차이가 없었다.
간 T 세포 침윤의 조직학적 분석: 제18일에 절제된 간의 조직학적 실험은 군 당 5마리의 마우스로부터의 조직을 사용하여 수행하였다. 표면적에 의해 소, 중 및 대로 분류된 침윤물의 정량화는, DARPin® 단백질 #45에 의한 치료가 간 T 세포 침윤에서 증가를 유도하지 않았음을 나타냈다. 이는 항-TCCR 단클론성 항체의 투여가 NOG 마우스에서 인간 PBMC에 의한 증가된 간 T 세포 침윤을 유도하였음을 나타내는 공개된 결과와 대조적이다. DARPin® 단백질 #45에 의한 치료는 또한 비치료된 마우스에 비해 가속화된 이식편 대 호스트 질환(GVHD)을 유도하지 않았거나 조기 사망을 야기하지 않았다.
결론
DARPin® 단백질 #45는 피하 HT-29 인간 결장암 MiXeno 모델에서 항-종양 활성을 입증하였다. DARPin® 단백질 #45에 의한 치료는 비히클-치료된 마우스에 비하여 종양에서 인간 CD8 T 세포의 증가된 밀도를 야기하였다. DARPin® 단백질 #45에 의한 치료는 비히클 군에 비하여, 내성이 좋았고, 체중 손실 또는 감소된 생존을 야기하지 않았고, 증가된 간 T 세포 침윤을 생성하지 않았다.
실시예 7: FAP -특이적 안키린 반복 단백질의 결합시에 FAP 기능적 활성의 특징 분석
FAP의 기능적 활성에 대한 안키린 반복 결합의 효과를 평가하기 위해, FAP 효소적 활성을 저해하는 그 능력에 대하여 선택된 FAP-특이적 안키린 반복 단백질을 시험하였다. 이를 위해, 형광 기질에 대한 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 존재 및 부재 하에 측정하였다.
간단히 말하면, 인간 FAP 단백질, Z-Gly-Pro-AMC 형광 기질(Bachem) 및 과량의 FAP-특이적 안키린 반복 단백질을 검정 완충액(50 mM Tris, 1 M NaCl, 1 mg/mL BSA, pH 7.5)에 희석시키고, 웰 마다 100 μl의 총 최종 부피를 위하여 0.1 μl/ml의 인간 FAP, 50 μM의 기질 및 112-배 몰 과량의 안키린 반복 단백질(hFAP에 대해)의 최종 농도로 F16 Black Maxisorp 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 75분 이후, hFAP에 의한 기질의 절단을 각각 380 nm 및 460 nm의 여기 및 방사 파장을 사용하여 Tecan 1000 판독기에서 측정하였다. 100 μl의 50 μM 기질을 기질 블랭크(백그라운드 대조군으로서)를 위해 로딩하고, 안키린 반복 단백질(검정 완충액으로 대체됨)이 없는 샘플을 사용하여 FAP의 최대 활성을 측정하였다. 백그라운드 정규화 이후, 최대 FAP 활성에 대한 안키린 반복의 존재 하의 FAP 활성의 비율을 기준으로, 주어진 안키린 반복 단백질의 존재 하에 남겨진 FAP 활성의 백분율을 측정하였다. FAP-특이적 안키린 반복 단백질의 선택된 패널에 대한 결과를 표 10에 요약한다. 선택된 안키린 반복 단백질 중 어느 것도 FAP 효소적 활성을 유의하게 저해하지 않았다.
[표 10]
Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Molecular Partners AG <120> RECOMBINANT FAP BINDING PROTEINS AND THEIR USE <130> P5618PC00 <150> EP19178277.0 <151> 2019-06-04 <160> 160 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 1 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Gly Val Asn 50 55 60 Ala Asp Asp Met Asp Gly Arg Thr Pro Leu His Pro Ala Ala Tyr Lys 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 100 105 110 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys Leu Asn 115 120 125 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 2 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu 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Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 145 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 145 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 146 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 146 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 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Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 149 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 149 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 145 150 155 <210> 150 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 150 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 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Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 152 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 152 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 153 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 153 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Val Leu Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Glu Gly 35 40 45 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Lys Lys Gly Trp Thr Pro Leu Gln Leu Ala Ala Arg Thr 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Lys Asp His Ile Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp 100 105 110 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 115 120 125 Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 145 150 155 <210> 154 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus GS-linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, wherein n is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 <400> 155 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 156 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 156 ggttctgatt taggcaagaa gctgttggag gcggcccgtg ctggccagga cgacgaagtc 60 cgtgagctgc tgaaagcggg tgcggacgtg aatgccaaag acgtgttggg ctggacccct 120 ctgcatctgg ctgccttcga gggccacctg gagattgtgg aagtccttct caaggctggc 180 gctgatgtga acgcaaagga caaaaagggt tggactccgc tgcagctggc ggcgcgtacc 240 ggtcacctcg aaattgtaga ggtcctgttg aaggcgggcg cagatgtaaa tgctaaagac 300 catattggcg caactccgct ccacctggcg gcatggcagg gccacccaga gatcgtggag 360 gtcctcctga aggcaggcgc cgacgtgaac gcccaagaca aatccggtaa gactccggcg 420 gacctggctg ccgacgcagg ccatgaggac atcgcggaag tcttgcagaa ggcggct 477 <210> 157 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 157 Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 20 25 <210> 158 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-cap <400> 158 Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly 1 5 10 15 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 20 25 <210> 159 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 159 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 160 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain <400> 160 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125

Claims (15)

  1. 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 상기 안키린 반복 도메인이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP: fibroblast activation protein)에 대한 결합 특이성을 갖고, 상기 안키린 반복 도메인이 (1) SEQ ID NO: 48 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 48 내지 134 중 어느 하나에서 9개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 모듈을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안키린 반복 모듈이 (1) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 및 (2) SEQ ID NO: 94 내지 98, 111 내지 113 및 132 내지 134 중 어느 하나에서 9개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 안키린 반복 모듈이 제1 안키린 반복 모듈이고, (1) SEQ ID NO: 94 및 (2) SEQ ID NO: 94에서 9개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인이 (1) SEQ ID NO: 95 및 (2) SEQ ID NO: 95의 9개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제2 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인이 (1) SEQ ID NO: 96 및 (2) SEQ ID NO: 96의 9개 이하의 아미노산이 또다른 아미노산에 의해 교환되는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제3 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈이 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치되고, 상기 제2 안키린 반복 모듈이 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제3 안키린 반복 모듈의 N-말단에 배치되는, 결합 단백질.
  5. 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 상기 안키린 반복 도메인이 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 대한 결합 특이성을 갖고, 상기 안키린 반복 도메인이 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153 중 어느 하나와 아미노산 서열 동일성이 적어도 80%인 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 1 내지 35 및 144 내지 153의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S가 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 1 내지 33, 144, 145 및 148 내지 150의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N이 선택적으로 A에 의해 교환되는, 재조합 결합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인이 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S가 선택적으로 누락되고, SEQ ID NO: 18의 마지막에서 두 번째 위치에서의 L 및/또는 마지막 위치에서의 N이 선택적으로 A에 의해 교환되는, 결합 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인이 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 안키린 반복 도메인의 위치 1에서의 G 및/또는 위치 2에서의 S가 선택적으로 누락되는, 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안키린 반복 도메인이 10-7M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중에서 인간 FAP에 결합하고/하거나 상기 안키린 반복 도메인이 10-8M 미만의 EC50으로 인간 FAP-발현 WI38 세포에 결합하고/하거나 FAP에 대한 상기 안키린 반복 도메인의 결합이 FAP의 프롤릴 엔도펩티다아제 활성을 25% 초과로 저해하지 않는, 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제10항의 핵산, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 약학 조성물.
  12. 생물학적 활성 분자를 포유류의 FAP-발현 세포 또는 조직에 국소화시키는 방법으로서, 제9항의 결합 단백질을 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 의학적 병상(medical condition)의 치료 방법으로서, 제9항의 결합 단백질의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물학적 활성 분자는 치료적 유효 분자인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 FAP-발현 세포 또는 조직이 종양에 배치되는, 방법.
  15. 환자에서 종양을 영상화하고/하거나 암을 진단하는 방법으로서, 제9항의 결합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물학적 활성 분자는 상기 결합 단백질에 의해 결합되는 세포 또는 조직을 영상화하는데 효과적인 분자인, 방법.
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