ES2758352T3 - Proteínas de repetición diseñadas que se une a la seroalbúmina - Google Patents
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Abstract
Una proteína de unión que comprende al menos un dominio de repetición de anquirina, en la que dicho dominio de repetición de anquirina tiene especificidad de unión para una seroalbúmina de mamífero y en la que dicho dominio de repetición de anquirina comprende un módulo de repetición de anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en (1) SEC ID Nº:49, 50, 51 y 52; (2) SEC ID Nº: 49, 50, 51 y 52 en las que hasta 3 aminoácidos son intercambiados por otros aminoácidos; (3) una secuencia de aminoácidos X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID Nº:11) en la que X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A; X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID Nº: 11 se intercambian por cualquier aminoácido; (4) una secuencia de aminoácidos X1DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEC ID Nº:54) en la que X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID Nº: 54 se intercambian por cualquier aminoácido; (5) una secuencia de aminoácidos X1DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEC ID Nº:12) en la que X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID Nº: 12 se intercambian por cualquier aminoácido; (6) una secuencia de aminoácidos X1DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEC ID Nº:13) en la que X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, A, D, M, F, S, I, T, N, e Y; X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N e Y; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, N, T, H, K, A y F; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y M; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, K, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID Nº: 13 se intercambian por cualquier aminoácido; y (7) una secuencia de aminoácidos X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEC ID Nº:14) en la que X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y K; X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L y P; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, N, Y y A; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, V, T y S; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y F; y en la que opcionalmente hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID Nº: 14 se intercambian por cualquier aminoácido;
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas de repetición diseñadas que se une a la seroalbúmina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de repetición diseñadas con especificidad de unión para seroalbúmina, así como a ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de unión a la seroalbúmina, composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas, el uso de tales proteínas para modificar la farmacocinética de compuestos bioactivos y el uso de tales proteínas en el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes de la invención
Existe un gran interés por parte de la industria farmacéutica para aumentar la efectividad de los compuestos bioactivos, como, por ejemplo, las proteínas terapéuticas, al modular o aumentar sus propiedades farmacocinéticas (PK) in vivo. Esto es especialmente cierto para los compuestos bioactivos que se eliminan rápidamente de la circulación por aclaramiento renal. El riñón filtra por lo general fuera de la circulación las moléculas que tienen un peso molecular aparente inferior a 60 kDa. Una estrategia para mejorar las propiedades farmacocinéticas de tales compuestos bioactivos pequeños es sencillamente aumentar su tamaño molecular aparente (es decir, aumentar su radio hidrodinámico), por ejemplo, por medio de la adición de fracciones de polímeros no proteináceos como, por ejemplo, polímeros de polietilenglicol o residuos de azúcar o la adición de fracciones de polímeros proteináceos tales como, por ejemplo, proteínas globulares o polipéptidos no estructurados, como, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 2007/103515 y WO 2008/155134.
Otras estrategias aprovechan la prolongada semivida de circulación de las proteínas del suero, como, por ejemplo, las inmunoglobulinas y la seroalbúmina. La seroalbúmina que tiene un peso molecular de 67 kDa es la proteína más abundante en el plasma, presente en alrededor de 50mg/ml (0,6mM), y tiene una semivida en el suero de 19 días en los humanos. La seroalbúmina ayuda a mantener el pH del plasma, contribuye a la presión sanguínea coloidal, funciona como vehículo de muchos metabolitos y ácidos grasos, y sirve como una proteína principal de transporte de fármacos en el plasma. Hay varios sitios principales de unión de moléculas pequeñas en la albúmina que se han descrito.
Se ha demostrado que la asociación no covalente con la seroalbúmina puede extender la semivida de las moléculas o polipéptidos pequeños de corta duración (documento WO 1991/001743). Los polipéptidos que se unen específicamente a la seroalbúmina y que, por lo tanto, pueden extender la semivida in vivo de otras moléculas acopladas a ellos, incluyen variantes de dominios de unión a la albúmina bacteriana (por ejemplo, WO 2005/097202 y WO 2009/016043), péptidos pequeños (por ejemplo, Dennis, MS, et al., J. Biol. Chem. 277 (3), 35035-43, 2002 y w O 2001/045746) y fragmentos de inmunoglobulinas (por ejemplo, WO 2008/043822, Wo 2004/003019; WO 2008/043821; WO 2006/040153; WO 2006/122787 y WO 2004/041865). El documento WO 2008/043822 se refiere a otras proteínas de unión que no sean fragmentos de inmunoglobulinas, como, por ejemplo, moléculas basadas en dominios de proteína A, tendamistata, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de células T, repeticiones de anquirina diseñadas y dominios PDZ, que podrían generarse para unirse específicamente a la seroalbúmina. Sin embargo, el documento WO 2008/043822 no describe la selección de dominios de repetición de la anquirina diseñados con especificidad de unión para la seroalbúmina (SA) ni motivos de secuencia de repetición concretos de dominios de repetición que se unen específicamente a SA. Además, se describió que la semivida in vivo de los polipéptidos puede prolongarse por su fusión genética a la seroalbúmina (por ejemplo, Wo 1991/001743). Este tipo de alteración de la semivida in vivo de los fármacos puede alterar positivamente sus propiedades farmacocinéticas (PK) y/o farmacodinámicas (PD). Este es un tema clave en el desarrollo de nuevos y eficientes procedimientos terapéuticos y de tratamiento de enfermedades. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de nuevas formas de alterar PK y/o PD de los compuestos bioactivos.
Además de los anticuerpos, hay nuevas proteínas de unión o dominios de unión que pueden ser usados para unirse específicamente a una molécula diana (por ejemplo, Binz, H.K., Amstutz, P. y Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257 1268, 2005). Una de estas nuevas clases de proteínas de unión o dominios de unión se basa en proteínas de repetición diseñadas o dominios de repetición diseñados (WO 2002/020565; Kohl A., Binz, HK, Forrer, P., Stumpp, MT, Plückthun, A. y Grütter, M.G., P.N.A.S. 100, 1700-1705, 2003; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grütter, M.G. y Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K y Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008). El documento WO 2002/020565 describe cómo pueden construirse grandes bibliotecas de proteínas de repetición y su aplicación en general. Sin embargo, el documento WO 2002/020565 no describe la selección de los dominios de repetición con especificidad de unión para SA ni motivos concretos de secuencias de repetición de dominios repetición que se unen específicamente a SA. Además, el documento WO 2002/020565 no sugiere que los dominios de repetición con especificidad de unión para SA puedan ser usados para modular la PK o PD de otras moléculas. Estos dominios de repetición diseñados aprovechan la naturaleza modular de las proteínas de repetición y poseen módulos de limitación N-terminal y C-terminal para evitar que los dominios repetidos diseñados se agreguen al proteger el núcleo hidrofóbico del dominio (Forrer, P., Stumpp, MT, Binz, HK y Plückthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003). Estos módulos de protección se basaron en las repeticiones de limitación de la proteína natural de unión a guanina-adenina (proteína de unión a GA). Se demostró que la estabilidad térmica y
termodinámica de estos dominios de repetición de la anquirina diseñados podría aumentar aún más al mejorar la repetición de la limitación de C-terminal derivada de la proteína de unión a GA (Interlandi, G., Wetzel, SK, Settanni, G., Plückthun, A. y Caflisch, A., J. Mol. Biol.375, 837-854, 2008; Kramer, M.A, Wetzel, S.K., Plückthun, A., Mittl, P.R.E, y Grütter, M.G., J. Mol. Biol.404, 381-391, 2010). Los autores introdujeron un total de ocho mutaciones en este módulo de limitación y extendieron su hélice C-terminal a través de la adición de tres aminoácidos distintos. Sin embargo, la introducción de estas modificaciones en el módulo de limitación C-terminal dio como resultado una tendencia a la dimerización no deseada de un dominio de repetición diseñado que porta este módulo de limitación C-terminal mutado. Por lo tanto, existe la necesidad de generar más módulos de limitación de terminal C optimizados o repeticiones de limitación de terminal C de dominios de repetición de la anquirina.
Focalizarse en SA para modular la PK y/o PD con los enfoques disponibles en la actualidad no siempre es efectivo. Incluso se ha vuelto cada vez más evidente que la modulación de la PK y/o PD de las moléculas a través de la apropiación de SA es compleja y aún no se comprende por completo.
En general, existe una necesidad de proteínas de unión mejoradas con especificidad por SA capaces de mejorar la PK y/PD de las moléculas o los polipéptidos terapéuticamente relevantes para tratar el cáncer y otras afecciones patológicas.
El problema técnico que subyace en la presente invención es identificar nuevas proteínas de unión, como, por ejemplo, dominios de repetición con especificidad de unión a SA, capaces de modificar la PK y/o PD de moléculas terapéuticamente relevantes para un tratamiento mejorado del cáncer y otras afecciones patológicas. La solución a este problema técnico se logra al proporcionar las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en la que el mencionado dominio de repetición de la anquirina tiene especificidad de unión para una seroalbúmina de mamífero y en la que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición de la anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en (1) SEC ID N°:49, 50, 51 y 52;
(2) secuencias, en las que hasta 3 aminoácidos en SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52 son intercambiados por otros aminoácidos;
(3) una secuencia de aminoácidos
X1 DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5 IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 11 se intercambian por cualquier aminoácido;
(4) una secuencia de aminoácidos
X1 DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:54)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 54 se intercambian por cualquier aminoácido;
(5) una secuencia de aminoácidos
X1 DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:12)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC iD N°: 12 se intercambian por cualquier aminoácido;
(6) una secuencia de aminoácidos
X1 DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:13)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, A, D, M, F, S, I, T, N, e Y;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N e Y;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, N, T, H, K, A y F; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y M;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, K, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 13 se intercambian por cualquier aminoácido;
(7) una secuencia de aminoácidos
X1 NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEC ID N°:14)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L y P;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, N, Y A;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, V, T y S;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y F; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC iD N°: 14 se intercambian por cualquier aminoácido;
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1 DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5 IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 11 se
intercambian por cualquier aminoácido;
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1 DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:54)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 54 se intercambian por cualquier aminoácido;
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1 DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5 IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y N;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, y K;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A e Y;
En una realización preferente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado a partir del grupo que consiste en SEC ID N°s: 21, 27 y 46.
En una realización preferente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado a partir del grupo que consiste en SEC ID N°s: 21, 27 y 46. Preferiblemente, faltan el mencionado G en la posición 1 y/o S en la posición 2 del mencionado dominio de repetición de la anquirina.
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1 DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5 IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 11 se intercambian por cualquier aminoácido;
y en la que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende además un módulo de repetición de la anquirina que tiene la secuencia de aminoácidos
X1 DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:12)
en la que
Xi representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 12 se intercambian por cualquier aminoácido; y en la que el módulo de repetición de la anquirina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 12 está precedido por el módulo de repetición de la anquirina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 11.
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) SEC iD N°s: 49, 50, 51 y 52 y (2) secuencias, en las que hasta 2 aminoácidos en SEC ID N°s: 49, 50, 51 o 52 son intercambiados por otros aminoácidos.
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°:49.
En una realización preferente, el mencionado módulo de repetición de la anquirina tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) SEC ID N°: 50 y (2) secuencias, en las que se intercambian hasta 2 aminoácidos en SEC ID N°: 50 por otros aminoácidos.
En una realización preferente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado a partir del grupo que consiste en SEC ID N°s: 17 a 31 y 43 a 48, en las que G en la posición 1 y/o S en la posición 2 del mencionado dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
En una realización preferente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con el dominio de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 32.
En una realización preferente, la mencionada proteína de unión comprende además un compuesto bioactivo, en el que la mencionada proteína de unión tiene una semivida plasmática terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en comparación con la semivida plasmática terminal del mencionado compuesto bioactivo no modificado, en el que la mencionada semivida plasmática terminal mayor se confiere a la mencionada proteína de unión por el mencionado dominio de repetición de la anquirina.
En una realización adicional, el mencionado dominio de repetición tiene especificidad de unión para una seroalbúmina de mamíferos y el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N°s: 17 a 31 y 43 a 48, en las que G en la posición 1 y/o S en la posición 2 del mencionado dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
En particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión como se define en el presente documento anteriormente, en la que el dominio de repetición de la anquirina compite por unirse a una seroalbúmina de mamífero con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N°s: 17 a 31 y 43 a 48. Además, la presente invención se refiere a una proteína de unión de este tipo que comprende un compuesto bioactivo, en particular, una proteína de unión que comprende un compuesto bioactivo que tiene una semivida plasmática terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en comparación con la semivida plasmática terminal del mencionado compuesto bioactivo no modificado.
La presente invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de unión de la presente invención, y a una composición farmacéutica que comprende una o más de las proteínas de unión o moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente.
Se divulga un procedimiento de tratamiento de una afección patológica usando las proteínas de unión de la invención. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Análisis de estabilidad de DARPins seleccionados por SEC.
Perfiles de elución de series de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de DARPins con especificidad para xSA antes (Fig. 1a), después de la incubación a 30 mg/ml (~2mM) en PBS durante 28 días a 40°C (Fig. 1b) o después de su almacenamiento durante 1 mes a -80°C (Fig. 1c) analizado con una columna Superdex 2005/150 (Fig. 1a o Fig. 1b) o con un superdex200 10/300GL (Fig. 1c). Todas las muestras se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Para el análisis SEC, las muestras se diluyeron a una
concentración de 500^ M. Los estándares de masa molecular de la Aprotinina (AP) 6,5 kDa, la Anhidrasa carbónica (CA) 29 kDa y la Conalbúmina (CO) 75 kDa se indican a través de flechas. xSA, seroalbúmina de mamíferos, A, absorbancia a 280nm; t, tiempo de retención en minutos; DARPin #19 (SEC ID N°: 19 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #20 (SEC ID N°: 20 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #21 (SEC ID N°: 21 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #22 (SEC ID N°: 22 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #27 (SEC ID N°: 27 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #28 (SEC ID N°: 28 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #29 (SEC ID N°: 29 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #30 (SEC ID N°: 30 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal). DARPin #43 (SEC ID N°: 43 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal). DARPin #44 (SEC ID N°:44 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal). DARPin #45 (SEC ID N°:45 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal). DARPin #46 (SEC iD N°:46 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal). DARPin #47 (SEC ID N°:47 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal). DARPin #48 (SEC ID N°:48 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal).
Figura 2. Estabilidad térmica de DARPins seleccionados.
Trazas de desnaturalización térmica de DARPins con especificidad para xSA (seguido por un aumento de la intensidad de fluorescencia del colorante SYPRO orange presente en el tampón) en PBS a pH 7,4 (Fig. 2a) y en el tampón MES a pH 5,8 (Fig. 2b) (250mM Ácido 2-N-morfolino etano sulfónico pH 5,5), NaCl 150mM, mezclado con PBS pH 7,41 a 4 (v/v) y ajustando el pH a 5,8).
F, unidades de fluorescencia relativa (RFUs), excitación a 515-535nm, detección a 560-580nm; T, temperatura en °C; Definición de DARPins ver arriba.
Figura 3. Aclaramiento de plasma de DARPins seleccionados en ratones.
El aclaramiento del plasma sanguíneo de DARPins con especificidad para MSA (seroalbúmina de ratones) y DARPins de control se evaluaron en ratones.
(Fig. 3a) DARPins que comprenden solo un dominio de repetición con especificidad de unión para MSA en comparación con DARPin #32 (ver más abajo) que no tiene especificidad de unión para MSA.
(Fig. 3b) DARPins que comprenden dos dominios de proteínas (uno de los cuales es un dominio de repetición con especificidad de unión para MSA) en comparación con DARPin #32 que no tiene especificidad de unión para MSA.
Las DARPins se etiquetaron por medio del His-Tag con un compuesto de 99mTc-carbonilo y se inyectaron por vía intravenosa en ratones. La radioactividad de la sangre de los ratones inyectados se midió en diferentes puntos de tiempo después de la inyección y se mostró como una relación de la dosis inyectada corregida para la descomposición radiactiva de 99mTc (%ID). Los ajustes de curvas muestran el resultado de regresiones no lineales de la radiactividad medida en diferentes puntos de tiempo - descomposición de dos fases (Graphpad Prism). Cada punto de datos indica el promedio de dos ratones por grupo.
% ID, porcentaje de dosis inyectada corregida por la descomposición radiactiva de pqeTc; t, tiempo en horas; DARPin #18 (SEC ID
N°: 18 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #23 (SEC ID N°: 23 con una Histag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #25 (SEC ID N°: 25 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #32 (un DARPin de control negativo sin especificidad de unión a xSA, SEC ID N°: 32 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal);
DARPin #33 (una DARPin que comprende dos dominios de repetición, uno con especificidad de unión para xSA, SEC ID N°: 33 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal).
DARPin #35 (un DARPin que comprende dos dominios repetidos, uno con especificidad de unión para xSA, SEC ID Na: 35 con una His-tag (SeC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal);
DARPin #36 (una DARPin que comprende dos dominios de repetición, uno con especificidad de unión para xSA, SEC ID N°: 36 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal).
Figura 4. Aclaramiento de plasma de DARPins seleccionados en monos cynomolgus.
El aclaramiento de DARPins con especificidad para CSA (seroalbúmina de mono cynomolgus) y se evaluó DARPins de control del plasma sanguíneo en monos cynomolgus.
(Fig. 4a) DARPin #26 se comparó con DARPin #32 que no tiene especificidad de unión a CSA. (Fig. 4b) DARPins #24, 34 y 17 se compararon con DARPin #32 que no tienen especificidad de unión a CSA. Las siguientes DARPins se inyectaron por vía intravenosa en monos cynomolgus a t = 0 horas a una concentración de 0,5mg/ml (DARPin #26, DARPin #24, DARPin #17 y DARPin #32) o 1 mg/ml (DARPin #34): La
concentración de las DARPins en el plasma de los monos se midió por ELISA en diferentes puntos de tiempo después de la inyección. Las curvas muestran el resultado de regresiones no lineales de las concentraciones medidas en diferentes puntos de tiempo - descomposición de dos fases (Graphpad Prism). A partir de la segunda fase, se puede determinar la semivida plasmática terminal de un DARPin. Cada único punto de datos indica el promedio de dos mediciones ELISA independientes de la misma muestra de suero.
C, concentración de DARPin en nM; t, tiempo en horas;
DARPin #17 (SEC ID N°:17 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal).; DARPin #24 (SEC ID N°:24 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #26 (SEC iD N°: 26 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal); DARPin #32 (un DARPin de control negativo sin especificidad de unión a xSA, s Ec ID N°: 32 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal);
DARPin #34 (un DARPin que comprende dos dominios repetidos, uno con especificidad de unión para xSA, SEC ID Na: 34 con una His-tag (SeC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal).
Descripción detallada de la invención
El dominio de unión de acuerdo con la presente invención es específico para una seroalbúmina de mamíferos (xSA). Preferiblemente, el dominio de unión de acuerdo con la presente invención es específico para una seroalbúmina de ratones, ratas, perros, conejos, monos o de origen humano. Más preferiblemente, el dominio de unión de acuerdo con la presente invención es específico para una seroalbúmina de origen humano (HSA).
El término "proteína" se refiere a un polipéptido, en el que al menos parte del polipéptido tiene o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida a través de la formación de estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias dentro de y/o entre su(s) cadena(s) de polipéptidos. Si una proteína comprende dos o más polipéptidos, las cadenas de polipéptidos individuales pueden unirse de forma no covalente o covalente, por ejemplo, por un enlace disulfuro entre dos polipéptidos. Una parte de una proteína, que tiene individualmente o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida a través de la formación de estructuras secundarias o terciarias, se denomina "dominio de proteína". Tales dominios de proteínas son bien conocidos por el profesional experto en la materia.
El término "recombinante" como se usa en la proteína recombinante, en el dominio de proteína recombinante, en la proteína de unión recombinante y similares, significa que los mencionados polipéptidos se producen a través del uso de tecnologías de ADN recombinante bien conocidas por el profesional experto en la técnica relevante. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante (por ejemplo, producida por síntesis génica) que codifica un polipéptido puede ser clonada dentro de un plásmido de expresión bacteriano (por ejemplo, pQE30, Qiagen), plásmido de expresión de levadura o plásmido de expresión de mamífero. Cuando, por ejemplo, tal plásmido de expresión bacteriano recombinante construido se inserta en una bacteria apropiada (por ejemplo, Escherichia coli), esta bacteria puede producir el polipéptido codificado por este ADN recombinante. El correspondientemente polipéptido producido se denomina polipéptido recombinante.
En el contexto de la presente invención, el término "polipéptido" se refiere a una molécula que consiste en una o más cadenas de aminoácidos múltiples, es decir, dos o más, unidos a través de enlaces peptídicos. Preferiblemente, un polipéptido consta de más de ocho aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.
El término "etiqueta de polipéptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a un polipéptido / proteína, en la que tal secuencia de aminoácidos es útil para la purificación, detección o focalización del mencionado polipéptido / proteína, o en la que la mencionada secuencia de aminoácidos mejora el comportamiento fisicoquímico del polipéptido / proteína, o en donde la mencionada secuencia de aminoácidos posee una función efectora. Las etiquetas de polipéptidos individuales, fracciones y/o dominios de una proteína de unión pueden conectarse entre sí directamente o a través de conectores de polipéptidos. Estas etiquetas de polipéptidos son bien conocidas en la técnica y están completamente disponibles para el experto en la materia. Ejemplos de etiquetas de polipéptidos son pequeñas secuencias de polipéptidos, por ejemplo, His (por ejemplo, la His-tag de SEC ID N°: 15), myc, FLAG o Strep-tags o fracciones como, por ejemplo, enzimas (por ejemplo, enzimas como la fosfatasa alcalina), que permiten la detección del/la mencionado/a polipéptido / proteína, o fracciones que pueden ser usados para focalizar (como, por ejemplo, inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) y/o como moléculas efectoras.
El término "enlazador de polipéptidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos, que es capaz de unir, por ejemplo, dos dominios de proteínas, una etiqueta de polipéptido y un dominio de proteínas, un dominio de proteínas y una fracción no polipéptida como, por ejemplo, polietilenglicol o dos secuencias de etiquetas. Tales dominios, etiquetas, fracciones no polipeptídicas y enlazadores adicionales son conocidos por la persona experta en la técnica relevante. Se proporciona una lista de ejemplos en la descripción de la solicitud de patente WO 2002/020565. Ejemplos particulares de tales enlazadores son los enlazadores de glicina-serina y los enlazadores de prolina-treonina de longitudes variables; preferiblemente, los mencionados enlazadores tienen una longitud de entre 2 y 24 aminoácidos; más preferiblemente, los mencionados enlazadores tienen una longitud de entre 2 y 16 aminoácidos. Un ejemplo de un enlazador de glicina-serina se proporciona en la SEC ID N°: 16.
El término "fracción polimérica" se refiere ya sea a una fracción polimérica proteica o a una fracción polimérica no proteica. Una "fracción polimérico proteico" es preferiblemente un polipéptido que no forma una estructura terciaria
estable mientras que no forma más del 10%, preferiblemente, no más del 5%; también preferiblemente, no más del 2%; incluso más preferiblemente, no más del 1%; y lo más preferiblemente, no hay cantidades detectables, según lo determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de oligómeros o agregados cuando se almacenan a una concentración de alrededor de 0,1mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) durante un mes. Tales fracciones poliméricas proteicas se ejecutan a un peso molecular aparente en SEC que es mayor que su peso molecular efectivo cuando se usan proteínas globulares como estándares de peso molecular para la SEC. Preferiblemente, el peso molecular aparente de las mencionadas fracciones poliméricas proteicas determinadas por SEC es 1,5x, 2x o 2,5x mayor que su peso molecular efectivo calculado a partir de su secuencia de aminoácidos. También preferiblemente, los pesos moleculares aparentes de las mencionadas fracciones poliméricas no proteicas determinadas por SEC son 2x, 4x u 8x mayores que su peso molecular efectivo calculado a partir de su composición molecular. Preferiblemente, más del 50%, 70% o incluso el 90% de los aminoácidos de la mencionada fracción polimérica proteica no forma estructuras secundarias estables a una concentración de alrededor de 0,1mM en PBS a Ta según lo determinado por mediciones de dicroísmo circular (CD). Más preferiblemente, en mencionado polímero proteico muestra un espectro de CD típico cercano a UV de una conformación aleatoria en espiral. Los mencionados análisis de CD son bien conocidos por persona experta en la técnica relevante. También son preferibles las fracciones poliméricas proteicas que consisten en más de 50, preferiblemente más de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, o lo más preferiblemente, más de 800 aminoácidos. Ejemplos de las fracciones poliméricas proteicas son los polipéptidos XTEN® (una marca registrada de Amunix; WO 2007/103515), o los polipéptidos que comprenden residuos de prolina, alanina y serina como se describe en el documento WO 2008/155134. Tales fracciones poliméricas proteicas pueden unirse covalentemente a, por ejemplo, un dominio de unión de la presente invención a través de la generación de polipéptidos de fusión genética al usarse tecnologías de clonación de ADN estándar, seguido de su expresión y purificación estándar.
Una fracción polimérica de la presente invención puede variar ampliamente en peso molecular (es decir, de alrededor de 1 kDa a alrededor de 150 kDa). Preferiblemente, la fracción polimérica tiene un peso molecular de al menos 2, más preferiblemente, de al menos 5, 10, 20, 30, 50, 70, o lo más preferiblemente, de al menos 100 kDa. Preferiblemente, la mencionada fracción polimérica está conectado por un enlazador polipeptídico a un dominio de unión.
Ejemplos de las fracciones poliméricas no proteicas son hidroxietilalmidón (HES), polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquileno. El término "PEGilado" significa que una fracción PEG está unido de forma covalente a, por ejemplo, un polipéptido de la presente invención.
En una realización específica, una fracción PEG o cualquier otro polímero no proteináceo puede, por ejemplo, acoplarse a una cisteína tiol a través de un enlazador maleimida con la cisteína acoplada a través de un enlazador péptido a la N-terminal o C-terminal de un dominio de unión como se describe en el presente documento.
El término "proteína de unión" se refiere a una proteína que comprende uno o más dominios de unión, uno o más compuestos bioactivos y uno o más fracciones poliméricas como se explica más detalladamente a continuación. Preferiblemente, la mencionada proteína de unión comprende hasta cuatro dominios de unión. Más preferiblemente, la mencionada proteína de unión comprende hasta dos dominios de unión. Más preferiblemente, la mencionada proteína de unión comprende solo un dominio de unión. Además, cualquiera de tales proteínas de unión puede comprender dominios de proteínas adicionales que no son dominios de unión, restos de multimerización, etiquetas de polipéptidos, enlazadores de polipéptidos y/o un solo residuo de Cys. Ejemplos de restos de multimerización son regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina que se emparejan para proporcionar dominios Fc de inmunoglobulina funcionales, y cremalleras de leucina o polipéptidos que comprenden un tiol libre que forma un enlace disulfuro intermolecular entre dos de los mencionados polipéptidos. El único residuo de Cys puede usarse para conjugar otras fracciones con el polipéptido, por ejemplo, al usar la química de maleimida bien conocida por el experto en la materia. Preferiblemente, la mencionada proteína de unión es una proteína de unión recombinante. También preferiblemente, los dominios de unión de la proteína de unión poseen diferentes especificidades de diana.
El término "dominio de unión" significa un dominio de proteína que exhibe el mismo "pliegue" (disposición tridimensional) que una proteína de andamio y que tiene una propiedad predeterminada, como se define a continuación. Tal dominio de unión puede obtenerse a través de técnicas de ingeniería de proteínas racionales, o más comúnmente combinadas, habilidades que se conocen en la técnica (Binz et al., 2005, loc. Cit.).Por ejemplo, un dominio de unión que tiene una propiedad predeterminada puede obtenerse a través de un procedimiento que comprende los pasos de (a) proporcionar una colección diversa de dominios de proteínas que exhiben el mismo pliegue que una proteína de andamio como se define más adelante; y (b) seleccionar la mencionada colección diversa y/o seleccionar de la mencionada colección diversa para obtener al menos un dominio de proteína que tenga la mencionada propiedad predeterminada. La colección diversa de dominios de proteínas puede ser proporcionada a través de varios procedimientos de acuerdo con el sistema de cribado y/o selección que se use, y puede comprender el uso de procedimientos bien conocidos por la persona experta en la técnica, como, por ejemplo, la visualización de fagos o la visualización de ribosomas. Preferiblemente, el mencionado dominio de unión es un dominio de unión recombinante.
El término "proteínas de andamio" se refiere a una proteína con áreas de superficie expuestas en las cuales las inserciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos son altamente tolerables. Ejemplos de proteínas de andamio que pueden ser usadas para generar dominios de unión de la presente invención son anticuerpos o fragmentos de los
mismos, como, por ejemplo, fragmentos Fv o Fab de cadena sencilla, proteína A de Staphylococcus aureus, la proteína de unión a bilina de Pieris brassicae u otras lipocalinas, proteínas de repetición de la anquirina u otras proteínas de repetición, y la fibronectina humana. Las proteínas de andamios son conocidas por la persona experta en la técnica (Binz et al., 2005, loc. Cit.; Binz et al., 2004, loc. Cit).
El término "propiedad predeterminada" se refiere a una propiedad como, por ejemplo, la unión a una diana, el bloqueo de una diana, la activación de una reacción mediada por la diana, actividad enzimática y otras propiedades relacionadas. En función del tipo de propiedad deseada, un experto en la materia podrá identificar el formato y los pasos necesarios para realizar el cribado y/o la selección de un dominio de unión con la propiedad deseada. Preferiblemente, la mencionada propiedad predeterminada es de unión para una diana.
En lo sucesivo, las definiciones para las proteínas de repetición se basan en las de la solicitud de patente WO 2002/020565. La solicitud de patente WO 2002/020565 contiene además una descripción general de características, técnicas y aplicaciones de proteínas de repetición.
El término "proteínas de repetición" se refiere a una proteína que comprende uno o más dominios de repetición. Preferiblemente, cada una de las mencionadas proteínas de repetición comprende hasta cuatro dominios de repetición. Más preferiblemente, cada una de las mencionadas proteínas de repetición comprende hasta dos dominios de repetición. Lo más preferible, cada una de las mencionadas proteínas de repetición solo comprende un dominio de repetición. Además, la mencionada proteína de repetición puede comprender dominios de proteína adicionales no repetidos, etiquetas de polipéptidos y/o enlazadores de polipéptidos.
El término "dominio de repetición" se refiere a un dominio de proteína que comprende dos o más unidades de repetición consecutivas (módulos) como unidades estructurales, en el que dichas unidades estructurales tienen el mismo pliegue y se apilan firmemente para crear, por ejemplo, una estructura superhelical que tiene un núcleo hidrofóbico articular. Preferiblemente, un dominio de repetición comprende además una unidad (o módulo) de limitación de N-terminal y/o C-terminal. Incluso más preferiblemente, las mencionadas unidades (o módulos) de limitación de N-terminal y/o C-terminal son repeticiones de limitación.
El término "proteína de repetición diseñada" y "dominio de repetición diseñado" se refieren a una proteína de repetición o dominio de repetición, respectivamente, obtenido como resultado del procedimiento de la invención explicada en la solicitud de patente WO 2002/020565. Las proteínas de repetición diseñadas y los dominios de repetición diseñados son sintéticos y no de la naturaleza. Son proteínas o dominios artificiales, respectivamente, obtenidos a través de expresión de ácidos nucleicos diseñados correspondientemente. Preferiblemente, la expresión se lleva a cabo en células eucariotas o procariotas, como, por ejemplo, células bacterianas, o usando un sistema de expresión in vitro libre de células. Por consiguiente, una proteína de repetición de la anquirina diseñada (es decir, una DARPin) corresponde a una proteína de unión de la presente invención que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina.
El término "unidad estructural" se refiere a una parte localmente ordenada de un polipéptido, formada por interacciones tridimensionales entre dos o más segmentos de estructura secundaria que están cerca uno del otro a lo largo de la cadena polipeptídica. Tal unidad estructural exhibe un motivo estructural. El término "motivo estructural" se refiere a una disposición tridimensional de elementos de estructura secundarios presentes en al menos una unidad estructural. Los motivos estructurales son bien conocidos por el experto en la materia. Las unidades estructurales por sí solas no son capaces de adquirir una disposición tridimensional definida; sin embargo, su disposición consecutiva, por ejemplo, como módulos de repetición en un dominio de repetición, conduce a una estabilización mutua de las unidades vecinas, lo que resulta en una estructura superhelical.
El término "unidad de repetición" se refiere a secuencias de aminoácidos que comprenden motivos de secuencia de repetición de una o más proteínas de repetición de origen natural, en donde las mencionadas "unidades de repetición" se encuentran en múltiples copias, y que exhiben una topología de plegado definida común a todos los motivos que determinan el pliegue de la proteína. Tales unidades de repetición corresponden a las "unidades estructurales de repetición (repeticiones)" de proteínas de repetición como se describe por Forrer et al., 2003, loc. cit. o las "unidades estructurales homólogas consecutivas (repeticiones)" de proteínas de repetición según lo descrito por Binz et al, 2004, loc. cit. Tales unidades de repetición comprenden residuos de estructura y residuos de interacción. Ejemplos de tales unidades de repetición son las unidades de repetición de armadillo, unidades de repetición ricas en leucina, unidades de repetición de la anquirina, unidades de repetición de tetrapéptido, unidades de repetición de HEAT y unidades de repetición de variantes ricas en leucina. Las proteínas de origen natural que contienen dos o más de tales unidades de repetición se denominan "proteínas de repetición de origen natural". Las secuencias de aminoácidos de las unidades de repetición individuales de una proteína de repetición pueden tener un número significativo de mutaciones, sustituciones, adiciones y/o deleciones cuando se comparan entre sí, mientras que aún conservan sustancialmente el patrón o motivo general de las unidades de repetición.
La expresión "unidad de repetición de la anquirina" significa una unidad de repetición, que es una repetición de la anquirina como se describe, por ejemplo, por Forrer et al., 2003, loc. cit. Las repeticiones de la anquirina son bien conocidos por el experto en la materia.
El término "residuos de estructura" se refiere a residuos de aminoácidos de las unidades de repetición, o los residuos
de aminoácidos correspondientes de los módulos de repetición, que contribuyen a la topología de plegado, es decir, que contribuyen al pliegue de la mencionada unidad (o módulo) de repetición o que contribuyen a la interacción con una unidad (o módulo) vecina. Tal contribución podría ser la interacción con otros residuos en la unidad (o módulo) de repetición, o la influencia en la conformación del esqueleto del polipéptido como se encuentra en las a-hélices o pláminas, o en los tramos de aminoácidos que forman polipéptidos o bucles lineales.
El término "residuos de interacción de diana" se refiere a residuos de aminoácidos de las unidades de repetición, o los residuos de aminoácidos correspondientes de los módulos de repetición, que contribuyen a la interacción con la sustancia de diana. Tal contribución podría ser la interacción directa con las sustancias de diana, o la influencia en otros residuos que interactúan directamente, por ejemplo, al estabilizar la conformación del polipéptido de una unidad (o módulo) de repetición para permitir o mejorar la interacción de residuos que interactúan directamente con la mencionada diana. Tales residuos de interacción de estructura y diana pueden ser identificados a través del análisis de los datos estructurales obtenidos por medio de procedimientos fisicoquímicos, como, por ejemplo, la cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN y/o de CD, o a través de la comparación con información estructural conocida y relacionada bien conocida por los profesionales en biología estructural. y/o bioinformática.
Preferiblemente, las unidades de repetición utilizadas para la deducción de un motivo de secuencia de repetición son unidades de repetición homólogas, en las que las unidades de repetición comprenden el mismo motivo estructural y en las que más del 70% de los residuos de estructura de las mencionadas unidades de repetición son homólogas entre sí. Preferiblemente, más del 80% de los residuos de estructura de las mencionadas unidades de repetición son homólogos. Mas preferiblemente, más del 90% de los residuos de estructura de las mencionadas unidades de repetición son homólogos. Los expertos en la materia conocen los programas informáticos para determinar el porcentaje de homología entre polipéptidos, como, por ejemplo, Fasta, Blast o Gap. Más preferiblemente, las unidades de repetición utilizadas para la deducción de un motivo de secuencia de repetición son unidades de repetición homólogas obtenidas de dominios de repetición seleccionados en una diana, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 y que tienen la misma especificidad de diana.
La expresión "motivo de secuencia de repetición" se refiere a una secuencia de aminoácidos, que se deduce de una o más unidades de repetición o módulos de repetición. Preferiblemente, las mencionadas unidades de repetición o módulos de repetición son de dominios de repetición que tienen una especificidad de unión para la misma diana. Tales motivos de secuencia de repetición comprenden posiciones de residuos de estructura y posiciones de residuos de interacción de diana. Tales posiciones de residuos de estructura corresponden a las posiciones de residuos de estructura de las unidades (o módulos) de repetición. Asimismo, las mencionadas posiciones de residuos de interacción de diana corresponden a las posiciones de los residuos de interacción de diana de las unidades (o módulos) de repetición. Los motivos de secuencia de repetición comprenden posiciones fijas y posiciones aleatorias. El término "posición fija" se refiere a una posición de aminoácido en un motivo de secuencia de repetición, en la que la mencionada posición se establece en un aminoácido particular. Muy a menudo, tales posiciones fijas corresponden a las posiciones de los residuos de estructura y/o a las posiciones de los residuos de interacción de diana que son específicos para una determinada diana. El término "posición aleatoria" se refiere a una posición de aminoácidos en un motivo de secuencia de repetición, en el que se permiten dos o más aminoácidos en dicha posición de aminoácidos, por ejemplo, en la que se permite cualquiera de los veinte aminoácidos habituales de origen natural, o en la que la mayoría de los veinte aminoácidos de origen natural están permitidos, como, por ejemplo, los aminoácidos distintos de la cisteína o los aminoácidos distintos de la glicina, la cisteína y la prolina. Muy a menudo, tales posiciones aleatorias corresponden a las posiciones de los residuos de interacción de diana. Sin embargo, algunas posiciones de residuos de estructura también pueden ser aleatorias.
El término "topología de plegado" se refiere a la estructura terciaria de las mencionadas unidades de repetición o módulos de repetición. La topología de plegado se determinará a través de los tramos de aminoácidos que formen al menos partes de a-hélices o p-láminas, o los tramos de aminoácidos que formen polipéptidos o bucles lineales, o cualquier combinación de a-hélices, p-láminas y/o polipéptidos/bucles lineales.
El término "consecutivo" se refiere a una disposición, en la que las unidades de repetición o los módulos de repetición están dispuestos de forma conjunta. En las proteínas de repetición diseñadas, hay al menos 2, por lo general, de alrededor de 2 a 6, en particular, al menos alrededor de 6, frecuentemente 20 o más unidades (o módulos) de repetición. En la mayoría de los casos, las unidades (o módulos) de repetición de un dominio de repetición exhibirán un alto grado de identidad de secuencia (los mismos residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes) o similitud de secuencia (los residuos de aminoácidos son diferentes, pero tienen propiedades fisicoquímicas similares), y algunos de los residuos de aminoácidos podrían ser residuos clave que están fuertemente conservados. Sin embargo, un alto grado de variabilidad de secuencia por inserciones y/o deleciones de aminoácidos, y/o sustituciones entre las diferentes unidades (o módulos) de repetición de un dominio de repetición puede ser posible siempre y cuando la topología de plegado común de las unidades (o módulos) de repetición se mantenga.
Los profesionales expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para determinar directamente la topología de plegamiento de proteínas de repetición por medios fisicoquímicos como, por ejemplo, cristalografía de rayos X, RMN o espectroscopía de CD. Los procedimientos para identificar y determinar unidades de repetición o motivos de secuencia de repetición o para identificar familias de proteínas relacionadas que comprenden tales unidades o motivos de repetición, como, por ejemplo, búsquedas de homología (BLAST, etc.), están bien establecidos en el campo de la
bioinformática, y son bien conocidos por los profesionales en la técnica. El paso de refinar un motivo de secuencia de repetición inicial puede comprender un proceso iterativo.
El término "módulos de repetición" se refiere a las secuencias de aminoácidos de repetición de los dominios de repetición diseñados, que se derivan originalmente de las unidades de repetición de proteínas de repetición de origen natural. Cada módulo de repetición comprendido en un dominio de repetición se deriva de una o más unidades de repetición de la familia o subfamilia de proteínas de repetición de origen natural, por ejemplo, la familia de las proteínas de repetición del armadillo o de las proteínas de repetición de la anquirina.
Los "módulos de repetición" pueden comprender posiciones con residuos de aminoácidos presentes en todas las copias de los módulos de repetición correspondientes ("posiciones fijas") y posiciones con residuos de aminoácidos diferentes o "aleatorizados" ("posiciones aleatorias").
Una proteína de unión de acuerdo con la presente invención comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en el que el mencionado dominio de repetición tiene especificidad de unión para la seroalbúmina de mamíferos (xSA).
La expresión "tiene especificidad de unión para una diana", "se une específicamente a una diana" o "especificidad de diana" y similares se refiere a que una proteína de unión o dominio de unión se une en PBS a una diana con una constante de disociación menor que a una proteína no relacionada como, por ejemplo, la proteína de unión a la maltosa de E. coli (MBP). Preferiblemente, la constante de disociación en PBS para la diana es al menos 10, más preferiblemente, 102, aún más preferiblemente 103, o lo más preferible 104 veces menor que la constante de disociación correspondiente para MBP.
La proteína de unión de la presente invención no es un anticuerpo o un fragmento del mismo, como, por ejemplo, fragmentos Fab o scFv. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos son bien conocidos por el experto en la materia. Además, el dominio de unión de la presente invención no comprende un pliegue de inmunoglobulina como el presente en los anticuerpos y/o en el dominio de fibronectina tipo III. Un pliegue de inmunoglobulina es un pliegue común de todas-p las proteínas que consiste en un sándwich de dos capas de alrededor de 7 p-hebras antiparalelas dispuestas en dos p-láminas. Los pliegues de inmunoglobulina son bien conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, los mencionados dominios de unión que comprenden un pliegue de inmunoglobulina se describen en los documentos WO 2007/080392 o WO 2008/097497.
En particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en el que el mencionado dominio de repetición de la anquirina tiene especificidad de unión para una seroalbúmina de mamífero y en el que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición de la anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52 y secuencias, en el que hasta 3 aminoácidos en SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52 son intercambiados por otros aminoácidos.
Preferiblemente, se intercambian hasta 2 aminoácidos, más preferiblemente hasta 1 aminoácido, y lo más preferible, no se intercambian aminoácidos en las SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52.
Preferiblemente, cuando los aminoácidos se intercambian en SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52, estos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; más preferiblemente del grupo que consiste en A, D, E, H, I, K, L, Q, R, S, T, V e Y. También preferiblemente, el reemplazo de aminoácidos es por un aminoácido homólogo; es decir, un aminoácido se intercambia por un aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades biofísicas similares. Por ejemplo, el aminoácido con carga negativa D puede ser reemplazado por el aminoácido con carga negativa E, o un aminoácido hidrófobo como L puede ser reemplazado por A, I o V. El reemplazo de un aminoácido por un aminoácido homólogo es bien conocido por el experto en la materia.
Una proteína de unión preferida comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en el que el mencionado dominio de repetición une xSA con una constante de disociación (Kd) en PBS por debajo de 10-4M. Preferiblemente, el mencionado dominio de repetición se une a xSA con un Kd en PBS por debajo de 10-4M, más preferiblemente, por debajo de 10-5M, 10-6M, 10-7M, o lo más preferible, 10-8M.
Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para determinar las constantes de disociación de las interacciones proteína-proteína, como las tecnologías basadas en la resonancia de plasmones superficiales (SPR) (por ejemplo, análisis de equilibrio SPR) o calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Los valores medidos de Kd de una interacción proteína-proteína particular pueden variar si se miden en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH). Por lo tanto, las mediciones de los valores de Kd se llevan a cabo preferiblemente con soluciones estandarizadas de proteína y un tampón estandarizado, como PBS.
Las proteínas de unión que comprenden un dominio de repetición de la anquirina que une xSA con un Kd en PBS por debajo de 10-4M se muestran en los Ejemplos.
Un dominio de repetición de la anquirina de una proteína de unión de la presente invención se une a xSA. Se prefiere una proteína de unión que comprenda un dominio de repetición de la anquirina que se une a la seroalbúmina humano (HSA).
Más preferible es un dominio de unión que comprenda entre 70 y 300 aminoácidos, en particular, entre 100 y 200 aminoácidos.
Más preferible es una proteína de unión o dominio de unión desprovisto de un residuo libre de Cys. Un "residuo libre de Cys" no está involucrado en la formación de un enlace disulfuro. Aún más preferible es una proteína de unión o dominio de unión libre de cualquier residuo de Cys.
Un dominio de unión de la presente invención es un dominio de repetición de la anquirina o un dominio de repetición de la anquirina diseñado (Binz et al., 2004, loc. Cit ), preferiblemente como se describe en el documento WO 2002/020565. Los ejemplos de dominios de repetición de la anquirina diseñados se muestran en los Ejemplos.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en el que el mencionado dominio de repetición tiene especificidad de unión para una seroalbúmina de mamíferos y en el que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N°s: 17 a 31 y 43 a 48, en las que G en la posición 1 y/o S en la posición 2 del mencionado dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
Preferiblemente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina en una proteína de unión de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID N°:21, 27 y 46; preferiblemente 27 y 46. Como se definió anteriormente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina se une a xSA con una constante de disociación (Kd) en PBS por debajo de 10-4M. Preferiblemente, el mencionado dominio de repetición se une a xSA con un Kd en PBS por debajo de 10-4M, más preferiblemente, por debajo de 10-5M, 10-6M, 10-7M, o lo más preferible, 10-8M.
Preferiblemente, el mencionado dominio de repetición de la anquirina en una proteína de unión de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con "unidades de repetición aleatorias" o "posiciones aleatorias" en un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEC iD N°: 17 a 31 y 43 a 48.
Preferiblemente, en lugar del 70% de la identidad de secuencia de aminoácidos, el mencionado dominio de repetición de la anquirina en una proteína de unión de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos del 75%, más preferiblemente, al menos del 80%, más preferiblemente, al menos del 85%, más preferiblemente, al menos del 90%, o lo más preferible, al menos del 95% de identidad de secuencia de aminoácidos. En una realización particular, la proteína de unión con especificidad de unión para la seroalbúmina de un mamífero definida por el reemplazo de hasta 9 aminoácidos en módulos de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52, o definida por al menos el 70% de la identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N°: 17 a 31 y 43 a 48, tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con una proteína de unión correspondiente que no se une a la seroalbúmina de un mamífero, por ejemplo, el dominio de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 32.En la mencionada proteína de unión preferida, la semivida plasmática terminal mínima en humanos es de al menos 1 día, más preferiblemente, de al menos 3 días, aún más preferiblemente, de al menos 5 días.
Se divulga una proteína de unión, en la que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina
X1 DX2X3X4X5TPLHLAAX6X7GHLX8IVEVLLKX9GADVNA (SEC ID N°:53)
en la que X1 , X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 y X9, representan, independientemente el uno del otro, un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; preferiblemente en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, M, F, S, I, T, N, Y y K; más preferiblemente de K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N, I e Y; más preferiblemente de I, E e Y;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W, R, N, T, H, K, A y F; más preferiblemente de W, R y F;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, T y H; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, V y R; X7 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, Y, N, D, H, S, A, Q, T y G; más preferiblemente de E, Y y N;
X8 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y K;
Xg representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, Y, H y N; más preferiblemente de Y y H; y
en la que opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 53 se intercambian por cualquier aminoácido.
Se divulga una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina
X1 DX2X3GX4TPLHLAAX5X6GHLEIVEVLLKX7GADVNA (SEC ID N°:10)
en la que
Xi representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, M, F, S, I, T, N, Y y K; preferiblemente de K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N, I e Y; preferiblemente de I, E e Y;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W, R, N, T, H, K, A y F; preferiblemente de W, R y F;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, T y H;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, V y R;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, Y, N, D, H, S, A, Q, T y G; preferiblemente de E, Y y N;
X7 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, Y, H y N; preferiblemente de Y y H; y en la que opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en s Ec iD N°: 10 se intercambian por cualquier aminoácido;
En una realización adicional, la presente invención se refiere a una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina
X1 DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5 IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A; preferiblemente K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S; preferiblemente G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G; preferiblemente
Q, D y N; más preferiblemente de Q y N;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G; preferiblemente de E y K;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; preferiblemente H, A e Y, más preferiblemente de A e Y; y
en la que opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 11 se intercambian por cualquier aminoácido.
En otra realización más, la presente invención se refiere a una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina.
X1 DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:54)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; preferiblemente de S y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E; preferiblemente D y Q;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; preferiblemente de A y H; y en la que opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en s Ec iD N°: 54 se intercambian por cualquier aminoácido;
En particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina que comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina.
X1 DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:12)
en la que
Xi representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; preferiblemente S y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; preferiblemente de A y H; y en la que opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en s Ec iD N°: 12 se intercambian por cualquier aminoácido;
Se prefiere una proteína de unión, en la que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprenda un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 12, precedido por un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 11.
En otra realización adicional, la presente invención se refiere a una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina X1 DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:13)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, A, D, M, F, S, I, T, N, e Y; preferiblemente de K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N e Y, preferiblemente E, D e Y;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, N, T, H, K, A y F; preferiblemente R y F;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y M;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, K, A y N; preferiblemente de K y A; y en la que opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en s Ec ID N°: 13 se intercambian por cualquier aminoácido;
En otra realización más, la presente invención se refiere a una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina.
X1 NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEC ID N°:14)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L y P;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, N, Y y A; preferiblemente H y A;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, V, T y S; preferiblemente S
y A;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V e F; y en la que opcionalmente hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 14 se intercambian por cualquier aminoácido;
Se prefiere una proteína de unión, en la que el mencionado dominio de repetición de la anquirina comprenda un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 14, precedido por un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 13.
El término "módulo de limitación" se refiere a un polipéptido fusionado con el módulo de repetición N- o C-terminal de un dominio de repetición, en el que el mencionado módulo de limitación forma interacciones terciarias estrechas (es decir, interacciones de estructura terciaria) con el mencionado módulo de repetición proporcionando así una limitación que protege el núcleo hidrofóbico del mencionado módulo de repetición en el lado que no está en contacto con el módulo de repetición consecutivo del disolvente. El mencionado módulo de limitación N- y/o C-terminal puede ser, o puede derivarse de, una unidad de limitación u otra unidad estructural que se encuentra en una proteína de repetición de origen natural adyacente a una unidad de repetición. El término "unidad de limitación" se refiere a un polipéptido plegado de origen natural, en el que el mencionado polipéptido define una unidad estructural particular que está fusionada con N- o C-terminal a una unidad de repetición, en el que el mencionado polipéptido forma interacciones de estructura terciaria estrechas con la mencionada unidad de repetición proporcionando una limitación que protege el núcleo hidrofóbico de la mencionada unidad de repetición a un lado del disolvente. Preferiblemente, los módulos de limitación o unidades de limitación son repeticiones de limitación. El término "repetición de limitación" se refiere al módulo de limitación o unidad de limitación que tiene un pliegue similar o el mismo al de la mencionada unidad (o módulo) de repetición adyacente y/o similitudes de secuencia con la mencionada unidad (o módulo) de repetición adyacente. Los módulos de limitación y las repeticiones de limitación se describen en el documento WO 2002/020565 y en Interlandi et al., 2008 (loc. Cit.). Por ejemplo, el documento WO 2002/020565 describe el módulo de limitación N-terminal (es decir, una repetición de limitación) que tiene la secuencia de aminoácidos GSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNA (SEC ID N°: 1) y
el módulo de limitación de C-terminal (es decir, una repetición de limitación) que tiene la secuencia de aminoácidos QDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (SEC ID N°: 2).
Interlandi et al., 2008 (loc. Cit.) describe los módulos de limitación C-terminal que tienen las secuencias de aminoácidos QDKFGKTPFDLAIREGHEDIAEVLQKAA (SEC ID N°: 3) y QDKFGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAA (SEC ID N°: 4).
Por ejemplo, el módulo de limitación N-terminal de la SEC ID N°: 17 está codificado por los aminoácidos de la posición 1 a 32 y el módulo de limitación C-terminal de la SEC ID N°: 17 está codificado por los aminoácidos de la posición 99 a 126.
Un módulo de limitación N-terminal preferido comprende el motivo de secuencia
X1 LX2KKLLEAARAGQDDEVRILX3AX4GADVNA (SEC ID N°:5)
en el que X1 representa un residuo de aminoácido G, A o D;
en el que X2 representa un residuo de aminoácido G o D;
en el que X3 representa un residuo de aminoácido L, V, I, A o M; preferiblemente, L o M; y
en el que X4 representa un residuo de aminoácido A, H, Y, K, R o N; preferiblemente, A o N.
Más preferido es cualquier módulo de limitación de N-terminal que comprenda una repetición de limitación de N-terminal, en el que uno o más de los residuos de aminoácidos en la mencionada repetición de limitación se reemplacen por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de limitación correspondiente o unidad de repetición.
Un módulo de limitación C-terminal preferido comprende el motivo de secuencia
X1 DKX2GKTX3X4DX5X6X7DX8GX9EDX10AEX11LQKAA (SEC ID N°:6)
en el que X1 representa un residuo de aminoácido Q o K;
en el que X2 representa un residuo de aminoácido A, S. o F; preferiblemente, S o F;
en el que X3 representa un residuo de aminoácido A o P;
en el que X4 representa un residuo de aminoácido A o F;
en el que X5 representa un residuo de aminoácido I o L;
en el que X6 representa un residuo de aminoácido S o A;
en el que X7 representa un residuo de aminoácido I o A;
en el que X8 representa un residuo de aminoácido A, E o N; preferiblemente A o N;
en el que Xg representa un residuo de aminoácido N o H;
en el que X10 representa un residuo de aminoácido L o I;
en el que X11 representa un residuo de aminoácido I o V; y
en el que X2 no representa F si X4 representa F y X7 representa I y Xa representa N o E.
Otro módulo de limitación C-terminal preferido comprende el motivo de secuencia
X1 DKX2GKTX3ADX4X5X6DX7GX8EDX9AEX10LQKAA (SEC ID N°:7)
en el que Xi representa un residuo de aminoácido Q o K;
en el que X2 representa un residuo de aminoácido A, S. o F; preferiblemente, S o F;
en el que X3 representa un residuo de aminoácido A o P;
en el que X4 representa un residuo de aminoácido I o L;
en el que X5 representa un residuo de aminoácido S o A;
en el que X6 representa un residuo de aminoácido I o A;
en el que X7 representa un residuo de aminoácido A, E o N; preferiblemente, A o N;
en el que Xa representa un residuo de aminoácido N o H;
en el que Xg representa un residuo de aminoácido L o I;
en el que X10 representa un residuo de aminoácido I o V;
Otro módulo de limitación C-terminal preferido comprende el motivo de secuencia
X1 DKX2GKTX3ADX4X5ADX6GX7EDX8AEX9LQKAA (SEC ID N°:8)
en el que Xi representa un residuo de aminoácido Q o K;
en el que X2 representa un residuo de aminoácido A, S o F; preferiblemente, S o F;
en el que X3 representa un residuo de aminoácido A o P;
en el que X4 representa un residuo de aminoácido I o L;
en el que X5 representa un residuo de aminoácido S o A;
en el que X6 representa un residuo de aminoácido A, E o N; preferiblemente A o N;
en el que X7 representa un residuo de aminoácido N o H;
en el que Xa representa un residuo de aminoácido L o I;
en el que Xg representa un residuo de aminoácido I o V;
Preferiblemente, el mencionado módulo de limitación C-terminal que comprende el motivo de secuencia de la SEC ID N°: 6, 7 u 8 tiene un residuo de aminoácido A, I o K; preferiblemente, I o K; en la posición correspondiente a la posición 3 del mencionado motivo de secuencia.
También preferiblemente, el mencionado módulo de limitación C-terminal que comprende el motivo de secuencia de la SEC ID N°: 6, 7 u 8 tiene un residuo de aminoácido R o D; en la posición correspondiente a la posición 14 del mencionado motivo de secuencia.
Un módulo de limitación C-terminal preferido es un módulo de limitación C-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos QDKSGKTPADLAADAGHEDIAEVLQKAA (SEC ID N°: 9).
Además, se prefiere un módulo de limitación C-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 9, en la que
el residuo de aminoácido en la posición 1 es Q o K;
el residuo de aminoácido en la posición 4 es S o F;
el residuo de aminoácido en la posición 9 es A o F;
el residuo de aminoácido en la posición 13 es A o I;
el residuo de aminoácido en la posición 15 es A, E o N; y
en el que el mencionado módulo de limitación C-terminal no tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, 3 o 4.
Más preferido es un módulo de limitación C-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 70%, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, o lo más preferible, al menos el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos en la alineación con SEC ID N°: 9 o 2. Preferiblemente, el residuo de aminoácido del mencionado módulo de limitación C-terminal en la posición correspondiente a la posición 4 de la SEC ID: 9 en la alineación es S, el residuo de aminoácido del mencionado módulo de limitación C-terminal en la posición correspondiente a la posición 9 de la SEC ID: 9 en la alineación es A, el residuo de aminoácido del mencionado módulo de limitación C-terminal en la posición correspondiente a la posición 13 de la SEC ID: 9 en la alineación es A, y/o el residuo de aminoácido del mencionado módulo de limitación C-terminal en la posición correspondiente a la posición 15 de SEC ID: 9 en la alineación es A. Más preferiblemente, el residuo de aminoácido del mencionado módulo de limitación C-terminal en la posición correspondiente a la posición 9 de SEC ID: 9 en la alineación es A y/o el residuo de aminoácido del mencionado módulo de limitación C-terminal en la posición correspondiente a la posición 13 de la SEC ID: 9 en la alineación es A. También preferiblemente, el mencionado módulo de limitación C-terminal comprende 28 aminoácidos.
Más preferido es un módulo de limitación C-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o 9, en el que uno o más de los residuos de aminoácidos del mencionado módulo de limitación C-terminal se intercambian por un aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de limitación o repetición de limitación C-terminal correspondiente y en el que
el residuo de aminoácido en la posición 4 es S;
el residuo de aminoácido en la posición 9 es A;
el residuo de aminoácido en la posición 13 es A; y/o
el residuo de aminoácido en la posición 15 es A.
Preferiblemente, se intercambian hasta el 30% de los residuos de aminoácidos del mencionado módulo de limitación C-terminal, más preferiblemente, hasta el 20% e incluso más preferiblemente, se intercambian hasta el 10% de los residuos de aminoácidos. También preferiblemente, tal módulo de limitación de C-terminal es una repetición de limitación de C-terminal que de origen natural.
También se prefiere un módulo de limitación C-terminal que comprenda los aminoácidos de la posición 1 a 25 o desde la posición 1 a 26 de cualquiera de los módulos de limitación C-terminal anteriores basados en la SEC ID N°: 9.
Más preferido es un módulo de limitación C-terminal de este tipo que tenga una secuencia de aminoácidos que no comprenda el aminoácido N seguido de G.
También se prefiere un módulo de limitación de C-terminal que tenga al menos el 70%, preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, o lo más preferible, al menos el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de los módulos de limitación de C-terminal anteriores basados en SEC ID N°: 9 o con SEC ID N°: 9.
Más preferido es un módulo de limitación de C-terminal que tenga al menos un 70%, preferiblemente, al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, o lo más preferido, al menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID N°: 2 o 9 y en el que el mencionado módulo de limitación C-terminal tenga el aminoácido A en la posición 9; preferiblemente, que el mencionado módulo de limitación C-terminal tenga el aminoácido A en las posiciones 9 y 13; más preferiblemente, que el mencionado módulo de limitación C-terminal tenga el aminoácido A en las posiciones 9, 13 y 15; y lo más preferible, que el mencionado módulo de limitación C-terminal tenga el aminoácido A en las posiciones 9, 13 y 15 y S en la posición 4.
Más preferido es un módulo de limitación C-terminal de este tipo que no tenga el aminoácido R en la posición 14 y/o que no tenga el aminoácido E en la posición 15.
También se prefiere un módulo de limitación C-terminal de este tipo que no tenga una secuencia de aminoácidos idéntica a la SeC ID N°: 2, 3 o 4.
Además, se prefiere un módulo de limitación C-terminal de este tipo que tenga la secuencia de aminoácidos basada en SEC ID N°: 9, en la que el mencionado módulo de limitación C-terminal tenga aminoácidos en las posiciones 26, 27 y 28 seleccionados del grupo que consiste en A, L, R, M, K y N; más preferiblemente, A, L, R y K; y lo más preferible, K, A y L.
Un módulo de limitación de un dominio de repetición puede intercambiarse por un módulo de limitación de la presente invención combinando técnicas, como, por ejemplo, la alineación de secuencias de aminoácidos, mutagénesis y síntesis de genes, conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, la repetición de limitación de C-terminal de
SEC ID N°: 17 puede ser reemplazada por la repetición de limitación de C-terminal de SEC ID N°: 9 por (i) la determinación de la repetición de limitación de C-terminal de SEC ID N°: 17 (es decir, la posición de secuencia 99 a 126) a través de la alineación de secuencia con SEC ID N°: 9, (ii) el reemplazo de la secuencia de la repetición de limitación de C-terminal determinada de SEC ID N°: 17 con la secuencia de SEC ID N°: 9, (iii) la generación de un gen que codifica el dominio de repetición que codifica el módulo de limitación C-terminal intercambiado, (iv) la expresión del dominio de repetición modificado en el citoplasma de E. coli y (v) la purificación del dominio de repetición modificado por medios estándar.
Además, un dominio de repetición de la presente invención puede ser construida genéticamente ensamblando un módulo de limitación de N-terminal (es decir, la repetición de limitación de N-terminal de SEC ID N°: 1) seguido de uno o más módulos de repetición (es decir, los módulos de repetición que comprenden los residuos de aminoácidos de la posición 33 a 98 de SEC ID N°: 17) y un módulo de limitación C-terminal (es decir, la repetición de limitación de C-terminal de SEC ID N°: 9) a través de la síntesis genética. El gen de dominio de repetición ensamblado genéticamente puede ser expresado en E. coli como se describió anteriormente.
También se prefiere una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina o el dominio de repetición de la anquirina diseñado comprenda un módulo de limitación C-terminal con el motivo de secuencia de SEC ID N°: 6, 7 u 8, en el que el mencionado módulo de limitación tenga el aminoácido I en la posición 3 y en el que el mencionado módulo de repetición esté precedido por un módulo de repetición con el motivo de secuencia de repetición de la anquirina de SEC ID N°: 12.
Más preferida es una proteína de unión, un dominio de repetición, un módulo de limitación N-terminal o un módulo de limitación C-terminal que tenga una secuencia de aminoácidos desprovista de los aminoácidos C, M o N.
Más preferida es una proteína de unión, un dominio de repetición, un módulo de limitación N-terminal o un módulo de limitación C-terminal que tenga una secuencia de aminoácidos desprovista de aminoácidos N seguido de G.
Más preferido es cualquier módulo de limitación de C-terminal que comprenda una repetición de limitación de C-terminal, en el que uno o más de los residuos de aminoácidos en la mencionada repetición de limitación se reemplacen por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de limitación correspondiente o unidad de repetición.
Más preferida es una proteína de unión que comprenda cualquiera de los módulos de limitación N-terminal o C-terminal de este tipo.
Ejemplos de secuencias de aminoácidos de los mencionados módulos de limitación C-terminal son las secuencias de aminoácidos de la posición 99 a 126 en las SEC ID N°: 19, 21, 27, 28, 38, 40 y 42. El ejemplo 6 demuestra que la estabilidad térmica de un dominio de repetición puede aumentarse reemplazando sus módulos de limitación de C-terminal por un módulo de limitación de la presente invención.
El término "diana" se refiere a una molécula individual como, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico, un polipéptido o proteína, un carbohidrato o cualquier otra molécula de origen natural, incluyendo cualquier parte de la molécula individual de este tipo, o complejos de dos o más moléculas de este tipo. La diana puede ser una célula completa o una muestra de tejido, o puede ser cualquier molécula o fracción que no sea de natural. Preferiblemente, la diana es un polipéptido de origen natural o que no sea de origen natural o un polipéptido que contenga modificaciones químicas, por ejemplo, modificado por fosforilación, acetilación o metilación natural o no natural. En la aplicación particular de la presente invención, la diana es xSA.
El término "xSA" se refiere a una seroalbúmina de mamífero, como, por ejemplo, una seroalbúmina de ratón, rata, conejo, perro, cerdo, mono o humano. El término "MSA" se refiere a una seroalbúmina de ratón (adhesión primaria Uni-ProtKB / Swiss-Prot número P07724), el término "CSA" se refiere a una seroalbúmina de mono cynomolgus (es decir, macaca fascicularis) (adhesión primaria Uni-ProtKB / Swiss-Prot número A2V9Z4) y el término "HSA" se refiere a una seroalbúmina humano (adhesión primaria Uni-ProtKB / Swiss-Prot número P02768).
El término "secuencia de consenso" se refiere a una secuencia de aminoácidos, en la que la mencionada secuencia de consenso se obtiene a través de la alineación estructural y/o secuencial de múltiples unidades de repetición. Usando dos o más unidades de repetición alineadas estructurales y/o secuenciales, y permitiendo espacios en la alineación, es posible determinar el residuo de aminoácido más frecuente en cada posición. La secuencia de consenso es esa secuencia que comprende los aminoácidos que se representan con mayor frecuencia en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén representados por encima del promedio en una sola posición, la secuencia de consenso puede incluir un subconjunto de esos aminoácidos. Las mencionadas dos o más unidades de repetición pueden tomarse de las unidades de repetición comprendidas en una única proteína de repetición, o de dos o más proteínas de repetición diferentes.
Las secuencias de consenso y los procedimientos para determinarlos son bien conocidos por el experto en la materia. Un "residuo de aminoácido de consenso" es el aminoácido encontrado en una posición determinada en una secuencia de consenso. Si dos o más, por ejemplo, tres, cuatro o cinco residuos de aminoácidos se encuentran con una probabilidad similar en las mencionadas dos o más unidades de repetición, el aminoácido de consenso puede ser uno
de los aminoácidos más frecuentemente encontrados o una combinación de los mencionados dos o más residuos de aminoácidos.
Más preferidos son los módulos de limitación de origen no natural, módulos de repetición, proteínas de unión o dominios de unión.
La expresión "de origen no natural" significa sintético o no de la naturaleza, más específicamente, la expresión significa fabricado por la mano del hombre. La expresión "proteína de unión de origen no natural" o "dominio de unión de origen no natural" significa que la mencionada proteína de unión o el mencionado dominio de unión es sintético (es decir, producida por síntesis química a partir de aminoácidos) o recombinante y no de origen natural. "Proteína de unión de origen no natural" o "dominio de unión de origen no natural" es una proteína o dominio artificial, respectivamente, obtenido por expresión de ácidos nucleicos diseñados correspondientemente. Preferiblemente, la expresión se realiza en células eucariotas o bacterianas, o usando un sistema de expresión in vitro libre de células. Además, el término significa que la secuencia de la mencionada proteína de unión o del mencionado dominio de unión no está presente como una entrada de secuencia no artificial en una base de datos de secuencias, por ejemplo, en GenBank, EMBL-Bank o Swiss-Prot. Estas bases de datos y otras bases de datos de secuencias similares son bien conocidas por el experto en la materia
En una realización particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende un dominio de unión, en el que el mencionado dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina y se une específicamente a xSA y en el que la mencionada proteína de unión y/o dominio de unión tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) de punto medio por encima de 40°C tras el despliegue térmico en PBS y forma menos del 5% (p/p) de agregados insolubles a concentraciones de hasta 10g/l cuando se incuba a 37°C durante 1 día en PBS. En una realización particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende un dominio de unión, en el que el mencionado dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina y se une específicamente a xSA y en el que la mencionada proteína de unión y/o dominio de unión tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) de punto medio por encima de 40°C tras el despliegue térmico en PBS y forma menos del 5% (p/p) de agregados insolubles a concentraciones de hasta 10g/l cuando se incuba a 37°C durante 1 día en PBS.
El término "PBS" significa una solución de agua tamponada con fosfato que contiene 137mM de NaCl, 10mM de fosfato y 2,7mM de KCl y tiene un pH de 7,4.
Preferiblemente, la proteína de unión y/o el dominio de unión tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) del punto medio por encima de 45°C, más preferiblemente por encima de 50°C, más preferiblemente, por encima de 55°C, y lo más preferible, por encima de 60°C tras el despliegue térmico en PBS a pH 7,4 o en tampón MES a pH 5,8. Una proteína de unión o un dominio de unión de la presente invención posee una estructura secundaria y terciaria definida en condiciones fisiológicas. El despliegue térmico del mencionado polipéptido da como resultado una pérdida de su estructura terciaria y secundaria, que puede ser seguida, por ejemplo, por mediciones de dicroísmo circular (CD). El punto medio de la temperatura de desnaturalización de una proteína de unión o dominio de unión tras el despliegue térmico corresponde a la temperatura en el punto medio de la transición cooperativa en tampón fisiológico tras la desnaturalización térmica de la mencionada proteína o dominio aumentando lentamente la temperatura de 10°C a alrededor de 100°C. La determinación de un punto medio de la temperatura de desnaturalización tras el despliegue térmico es bien conocida por el experto en la materia. La temperatura de desnaturalización del punto medio de una proteína de unión o dominio de unión tras el despliegue térmico es indicativa de la estabilidad térmica del mencionado polipéptido. Preferiblemente, la proteína de unión y/o el dominio de unión tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) del punto medio por encima de 45°C, más preferiblemente por encima de 50°C, más preferiblemente, por encima de 55°C, y lo más preferible, por encima de 60°C tras el despliegue térmico en PBS a pH 7,4 o en tampón MES a pH 5,8. Una proteína de unión o un dominio de unión de la presente invención posee una estructura secundaria y terciaria definida en condiciones fisiológicas. El despliegue térmico del mencionado polipéptido da como resultado una pérdida de su estructura terciaria y secundaria, que puede ser seguida, por ejemplo, por mediciones de dicroísmo circular (CD). El punto medio de la temperatura de desnaturalización de una proteína de unión o dominio de unión tras el despliegue térmico corresponde a la temperatura en el punto medio de la transición cooperativa en tampón fisiológico tras la desnaturalización térmica de la mencionada proteína o dominio aumentando lentamente la temperatura de 10°C a alrededor de 100°C. La determinación de un punto medio de la temperatura de desnaturalización tras el despliegue térmico es bien conocida por el experto en la materia. La temperatura de desnaturalización del punto medio de una proteína de unión o dominio de unión tras el despliegue térmico es indicativa de la estabilidad térmica del mencionado polipéptido.
También se prefiere una proteína de unión y/o dominio de unión que forme menos del 5% (p/p) de agregados insolubles a concentraciones de hasta 20g/l, preferiblemente hasta 40g/l, más preferiblemente, hasta 60g/l, incluso más preferiblemente, hasta 80g/l, y lo más preferible, hasta 100g/l cuando se incuba durante más de 5 días, preferiblemente, durante 10 días, más preferiblemente, durante 20 días, más preferiblemente, durante 40 días, y lo más preferible, durante 100 días a 37°C en PBS. La formación de agregados insolubles puede detectarse por la aparición de precipitaciones visuales, filtración en gel o dispersión dinámica de la luz, que aumenta fuertemente con la formación de agregados insolubles. Los agregados insolubles pueden ser eliminados de una muestra de proteína a través de la centrifugación a 10'000 x g durante 10 minutos. Preferiblemente, una proteína de unión y/o dominio de unión forma menos del 2%, más preferiblemente, menos del 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1%, o lo más preferible, menos del
0,05% (p/p) de agregados insolubles bajo las condiciones de incubación mencionadas a 37°C en PBS. Los porcentajes de los agregados insolubles pueden determinarse al separar los agregados insolubles de la proteína soluble, seguido por la determinación de las cantidades de proteína en la fracción soluble e insoluble a través de los procedimientos de cuantificación estándar.
También se prefiere una proteína de unión y/o dominio de unión que no pierda su estructura tridimensional nativa tras la incubación en PBS que contiene ditiotreitol (DTT) 100mM durante 1 o 10 horas a 37°C.
En una realización particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende un dominio de unión que es un dominio de repetición de la anquirina, que se une específicamente a xSA y que tiene el punto medio de la temperatura de desnaturalización indicado o preferido y propiedades no agregantes como se definió anteriormente, en donde la mencionada proteína de unión tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con un dominio de unión que no se une a una proteína del suero como xSA. Preferiblemente, el mencionado dominio de unión tiene al menos 10 veces, más preferiblemente, al menos 20 veces, 40 veces, 100 veces, 300 veces, o lo más preferible, al menos 103 veces mayor semivida plasmática terminal en un mamífero en comparación con un dominio de unión que no se une a una proteína del suero como xSA.
También preferiblemente, el mencionado dominio de unión no se une a xSA indicado por un Kd superior a 10-4M, más preferiblemente, superior a 10-3M o lo más preferiblemente superior a 10-2M para la unión de xSA. Un ejemplo de un dominio de unión que no se une a xSA es el dominio de repetición de SEC ID N°: 32.
Más preferiblemente, el mencionado dominio de unión es un dominio de repetición y tiene al menos 5 veces, más preferiblemente, al menos 10 veces, 20 veces, 40 veces, 100 veces, 300 veces, o lo más preferible, al menos 103 mayor (es decir, más larga) semivida plasmática terminal en un mamífero en comparación con el dominio de repetición de SEC ID N°: 32 o en comparación con DARPin #32, DARPin #41 o DARPin #42.
Una proteína de unión preferida comprende un dominio de unión con especificidad de unión para HSA que tiene una semivida plasmática terminal superior a 1, más preferiblemente, superior a 3, 5, 7, 10, 15, o lo más preferible, superior a 20 días en humanos.
La semivida terminal en plasma de un dominio de unión puede determinarse a través de ensayos bien conocidos por el experto en la materia (Toutain, P.L. y Bousquet-Mélou, A., J. Vet. Pharmacol. Ther.27 (5), 427-439, 2004). Los ejemplos sobre la determinación de la semivida plasmática terminal se dan en los Ejemplos.
La expresión "semivida plasmática terminal" de un fármaco como, por ejemplo, una proteína de unión o dominio de unión de la presente invención se refiere al tiempo requerido para alcanzar la mitad de la concentración plasmática del fármaco aplicado a un mamífero después de alcanzar el pseudo-equilibrio. Esta semivida no se define como el tiempo requerido para eliminar la mitad de la dosis del medicamento administrado al mamífero.
En una realización particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende un dominio de unión que es un dominio de repetición de la anquirina, que se une específicamente a xSA y que comprende un compuesto bioactivo.
El término "compuesto bioactivo" se refiere a un compuesto que modifica la enfermedad cuando se aplica a un mamífero que tiene la mencionada enfermedad. Un compuesto bioactivo puede tener propiedades antagonistas o agonistas y puede ser un compuesto bioactivo proteináceo o un compuesto bioactivo no proteináceo.
Los compuestos bioactivos proteicos de este tipo pueden unirse covalentemente, por ejemplo, a un dominio de unión de la presente invención a través de la generación de polipéptidos de fusión genética usando tecnologías de clonación de a Dn estándar, seguido de su expresión y purificación estándar. Por ejemplo, DARPin #36 comprende un dominio de repetición con especificidad de unión para un factor de crecimiento humano (es decir, un compuesto bioactivo) seguido de un dominio de repetición con especificidad de unión para HSA.
Los compuestos bioactivos no proteicos de este tipo pueden unirse covalentemente a, por ejemplo, un dominio de unión de la presente invención por medios químicos, por ejemplo, a través del acoplamiento a una cisteína tiol a través de un conector maleimida con una cisteína acoplada a través de un enlace peptídico al N- o C-terminal de un dominio de unión como se describe en el presente documento.
Los ejemplos de compuestos bioactivos proteicos son dominios de unión que tienen una especificidad de diana distinta (por ejemplo, neutralizar un factor de crecimiento uniéndose a él), citocinas (por ejemplo, interleucinas), factores de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humano), anticuerpos y fragmentos de los mismos, hormonas (por ejemplo, GLP-1) y cualquier posible fármaco proteináceo.
Ejemplos de compuestos bioactivos no proteicos son toxinas (por ejemplo, DM1 de ImmunoGen), moléculas pequeñas que se dirigen a GPCR, antibióticos y cualquier posible fármaco no proteico.
En una realización particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión que comprende un dominio de repetición de la anquirina que se une específicamente a xSA y que además comprende un compuesto bioactivo, en el que la mencionada proteína de unión tiene una semivida terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en
comparación con la semivida terminal del mencionado compuesto bioactivo no modificado, en el que la mencionada semivida terminal más alta se confiere a la mencionada proteína de unión por el mencionado dominio de repetición. Preferiblemente, la mencionada proteína tiene al menos 5 veces, más preferiblemente, al menos 10 veces, 20 veces, 40 veces, 100 veces, 300 veces, o lo más preferible, al menos 103 mayor semivida plasmática terminal en un mamífero en comparación con el mencionado compuesto bioactivo no modificado.
Otra realización preferente es una proteína de unión recombinante que comprende un dominio de unión que se une específicamente a xSA y en el que el mencionado dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina o un dominio de repetición de la anquirina diseñado. Tal dominio de repetición de la anquirina puede comprender uno, dos, tres o más módulos de repetición internos que participarán en la unión a xSA. Preferiblemente, tal dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de limitación N-terminal, dos a cuatro módulos de repetición internos y un módulo de limitación C-terminal. Preferiblemente, el mencionado dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina o un dominio de repetición de la anquirina diseñado. También preferiblemente, los mencionados módulos de limitación son repeticiones de limitación.
En particular, la presente invención se refiere a una proteína de unión como se define anteriormente en el presente documento, en la que el dominio de repetición de la anquirina compite por unirse a una seroalbúmina de un mamífero con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEC ID N°:17 a 31 y 43 a 48; preferiblemente, SEC ID N°s: 17 a 31; más preferiblemente, SEC ID N°: 19, 21, 27 y 28, en particular, SEC ID N°: 19 y 27.
La más preferida es una proteína de unión, en la que el dominio de repetición de la anquirina se selecciona del grupo que consiste en SEC ID N°s: 17 a 31 y 43 a 48, en las que G en la posición 1 y/o S en la posición 2 del mencionado dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
También preferiblemente, el mencionado dominio de repetición compite por unirse a xSA con una proteína de unión seleccionada del grupo de DARPins #17 a 31 y 43 a 48. Preferiblemente, el mencionado dominio de repetición compite por unirse a xSA con una proteína de unión del grupo de DARPins #19, 21, 27, 28, 45, 46, 47 y 48. Más preferiblemente, el mencionado dominio de repetición compite por unirse a xSA con la proteína de unión DARPin #19, 45, 46, 48 o 27; incluso más preferiblemente, el mencionado dominio de repetición compite por unirse a xSA con la proteína de unión DARPin #46 o 27.
El término "competir por la unión" se refiere a la incapacidad de dos dominios de unión diferentes de la presente invención para unirse simultáneamente a la misma diana, mientras que ambos pueden unirse a la misma diana individualmente. Por lo tanto, estos dos dominios de unión compiten por la unión a la mencionada diana. Preferiblemente, los mencionados dos dominios de unión competitivos se unen a un epítopo de unión superpuesto o igual en la mencionada diana. El profesional conoce bien los procedimientos, como el ensayo competitivo de inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) o las mediciones SPR de competencia (por ejemplo, al utilizar el instrumento Proteon de BioRad), para determinar si dos dominios de unión compiten por la unión a una diana.
Otra realización preferente es una proteína de unión que comprende un dominio de repetición con especificidad de unión para xSA seleccionado del grupo que consiste en los dominios de repetición de SEC ID N°: 17 a 31. Preferiblemente, el mencionado dominio de repetición es el dominio de repetición de SEC ID N°: 19, 21, 27 o 28. Más preferiblemente, el mencionado dominio de repetición es el dominio de repetición de SEC ID N°: 19. También más preferiblemente, el mencionado dominio de repetición es el dominio de repetición de SEC ID N°: 21. También más preferiblemente, el mencionado dominio de repetición es el dominio de repetición de SEC ID N°: 27.También más preferiblemente, el mencionado dominio de repetición es el dominio de repetición de SEC ID N°: 28.
Más preferida es una proteína de unión, en la que el mencionado dominio de repetición con especificidad de unión para xSA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición del mencionado grupo de dominios de repetición. Preferiblemente, la mencionada identidad de secuencia de aminoácidos es al menos un 75%, más preferiblemente, al menos un 80%, más preferiblemente, al menos un 85%, más preferiblemente, al menos un 90% y lo más preferible, al menos un 95%. Más preferida es una proteína de unión, en la que el mencionado dominio de repetición con especificidad de unión para xSA comprende un módulo de repetición que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de aminoácidos con un módulo de repetición del mencionado grupo de dominios de repetición. Preferiblemente, la mencionada identidad de secuencia de aminoácidos es al menos un 75%, más preferiblemente, al menos un 80%, más preferiblemente, al menos un 85%, más preferiblemente, al menos un 90% y lo más preferible, al menos un 95%. Más preferida es una proteína de unión, en la que la mencionada proteína de unión comprende dos o más de los mencionados dominios de repetición con especificidad de unión para xSA. Preferiblemente, la mencionada proteína de unión comprende 2 o 3 de los mencionados dominios de repetición. Los mencionados dos o más dominios de repetición tienen la misma o diferente secuencia de aminoácidos.
En una realización preferente adicional de una proteína de unión que comprende un dominio de repetición de acuerdo con la presente invención, uno o más de los residuos de aminoácidos de los módulos de repetición del mencionado dominio de repetición se intercambian por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la
alineación de una unidad de repetición. Preferiblemente, se intercambian hasta el 30% de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, hasta el 20%, e incluso más preferiblemente, se intercambian hasta el 10% de los
residuos de aminoácidos. Más preferiblemente, la mencionada unidad de repetición es una unidad de repetición de
origen natural.
En una realización preferente adicional de una proteína de unión que comprende un dominio de repetición de acuerdo
con la presente invención, uno o más de los residuos de aminoácidos del módulo de limitación N-terminal del mencionado dominio de repetición se intercambia por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de limitación N-terminal. Preferiblemente, se intercambian hasta el 30% de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, hasta el 20%, e incluso más preferiblemente, se intercambian hasta el 10% de los residuos de aminoácidos. Más preferiblemente, la mencionada unidad de limitación
N-terminal es una unidad de limitación N-terminal de origen natural.
En una realización preferente adicional de una proteína de unión que comprende un dominio de repetición de acuerdo
con la presente invención, uno o más de los residuos de aminoácidos del módulo de limitación C-terminal del mencionado dominio de repetición se intercambia por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de limitación C-terminal. Preferiblemente, se intercambian hasta el 30% de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, hasta el 20%, e incluso más preferiblemente, se intercambian hasta el 10% de los residuos de aminoácidos. Más preferiblemente, la mencionada unidad de limitación
C-terminal es una unidad de limitación C-terminal de origen natural.
En aún otra realización particular, hasta el 30% de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, hasta el 20%, e
incluso más preferiblemente, hasta el 10% de los residuos de aminoácidos se intercambian con aminoácidos que no se encuentran en las correspondientes posiciones de las unidades de repetición, unidades de limitación N-terminal o unidades de limitación C-terminal.
En realizaciones adicionales, cualquiera de las proteínas o dominios de unión a xSA descritos en el presente documento puede unirse covalentemente a uno o más restos adicionales, que incluyen, por ejemplo, un resto que se
une a una diana diferente para crear un agente de unión de especificidad dual, un compuesto bioactivo, una fracción
de etiquetado (por ejemplo, un marcador fluorescente como, por ejemplo, fluoresceína, o un marcador radiactivo), un
resto que facilita la purificación de proteínas (por ejemplo, una pequeña etiqueta peptídica, como, por ejemplo, una
His- o strep-Tag), una fracción que proporciona funciones efectoras para una eficacia terapéutica mejorada (por ejemplo, la parte Fc de un anticuerpo para proporcionar citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos,
una fracción de proteína tóxica como la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA) o un agente tóxico molecular pequeño como los maytansinoides o los agentes alquilantes de ADN) o una fracción que proporciona una farmacocinética mejorada. La farmacocinética mejorada puede evaluarse de acuerdo con la necesidad terapéutica percibida. A menudo es deseable incrementar la biodisponibilidad y/o incrementar el tiempo entre dosis, posiblemente incrementando el tiempo que una proteína permanece disponible en el suero después de la dosificación. En algunos
casos, es deseable mejorar la continuidad de la concentración de suero de la proteína a través del tiempo (por ejemplo, disminuir la diferencia en la concentración de suero de la proteína entre la concentración poco después de la administración y la concentración poco antes de la próxima administración).
En una realización adicional, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas
de unión particulares, los módulos de limitación de N-terminal particulares o los módulos de limitación de C-terminal particulares. Además, se proporciona un vector que comprende la mencionada molécula de ácido nucleico.
Además, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más de las proteínas de unión mencionadas anteriormente, en particular, proteínas de unión que comprenden dominios de repetición o moléculas de
ácido nucleico que codifican las proteínas de unión particulares, y opcionalmente se proporciona un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por
el experto en la materia y se explican con más detalle a continuación. Aún más, se describe una composición de diagnóstico que comprende una o más de las proteínas de unión mencionadas anteriormente, en particular proteínas
de unión que comprenden dominios de repetición.
Una composición farmacéutica comprende proteínas de unión como se describieron anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o estabilizador, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. [1980]. Los vehículos, excipientes o estabilizadores adecuados conocidos por el experto en la materia son solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank,
aceites fijos, oleato de etilo, dextrosa al 5% en solución salina, sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, tampones y conservantes. Otros vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí
mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, como, por ejemplo, proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. Una composición farmacéutica también puede ser una formulación combinada, que comprende un
agente activo adicional, tal como, por ejemplo, un agente anticancerígeno o un agente antiangiogénico.
Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo deben ser asépticas o estériles. Esto se logra fácilmente a través de la filtración a través de membranas de filtración estériles.
La composición farmacéutica puede administrarse por cualquier procedimiento adecuado dentro del conocimiento del experto en la materia. La ruta de administración preferida es parenteralmente. En la administración parenteral, el medicamento de la presente invención será formulado en una forma inyectable de dosis unitaria, como, por ejemplo, una solución, suspensión o emulsión, en asociación con los excipientes farmacéuticamente aceptables como se definió anteriormente. La dosificación y el modo de administración dependerán del individuo a tratar y la enfermedad particular. Por lo general, la composición farmacéutica se administra de modo que la proteína de unión de la presente invención se administre a una dosis de entre 1|jg/kg y 20|jg/kg, más preferiblemente de entre 10|jg/kg y 5mg/kg, lo más preferible, de entre 0,1 y 2mg/kg. Preferiblemente, se administra como una dosis en bolo. La infusión continua también puede usarse e incluye el suministro subcutáneo continuo a través de una minibomba osmótica. Si es así, la composición farmacéutica puede infundirse a una dosis de entre 5 y 20jig/kg/minuto, más preferiblemente, de entre 7 y 15jig/kg/minuto.
Además, cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente se describe para el tratamiento de una enfermedad. Además, se describen procedimientos de tratamiento. El procedimiento comprende administrar, a un paciente que lo necesite, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión de la presente invención.
Además, se describe un procedimiento para tratar una afección patológica en un mamífero que incluye al hombre, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente.
La proteína de unión de acuerdo con la presente invención puede obtenerse y/o desarrollarse adicionalmente a través de varios procedimientos, como, por ejemplo, la visualización en la superficie de bacteriófagos (WO 1990/002809, WO 2007/006665) o células bacterianas (w O 1993/010214), visualización ribosómica (WO 1998/048008), mostrar en plásmidos (WO 1993/008278) o a través del uso de construcciones híbridas de proteínas de repetición de ARN covalente (WO 2000/032823), o expresión y selección / cribado intracelular, como, por ejemplo, por ensayo de complementación de proteínas (WO 1998/341120), Tales procedimientos son bien conocidos por el experto en la materia.
Se puede obtener una biblioteca de proteínas de repetición de la anquirina utilizadas para la selección / cribado de una proteína de unión de acuerdo con la presente invención de acuerdo con los protocolos conocidos por el experto en la materia (WO 2002/020565, Binz, HK, et al., J. Mol.Biol., 332, 489-503, 2003, y Binz et al., 2004, loc. cit). El uso de la mencionada biblioteca para la selección de DARPins específicas de xSA se da en el Ejemplo 1. En analogía, los motivos de la secuencia de repetición de la anquirina como se presentaron anteriormente pueden ser usados para construir bibliotecas de proteínas de repetición de la anquirina que pueden usarse para la selección o el cribado de DARPins específicas de xSA. Además, los dominios de repetición de la presente invención pueden ensamblarse de forma modular a partir de los módulos de repetición de acuerdo con la presente invención y los módulos de limitación o repeticiones de limitación apropiados (Forrer, P., et al., FEBS letras 539, 2-6, 2003) usando tecnologías de ADN recombinantes estándares (por ejemplo, WO 2002/020565, Binz et al., 2003, loc. Cit. Y Binz et al., 2004, loc. Cit). La presente invención no está restringida a las realizaciones particulares descritas en los Ejemplos. Se pueden usar y procesar otras fuentes siguiendo el esquema general que se describe a continuación.
Ejemplos
Todos los materiales de partida y reactivos descritos a continuación son conocidos por los expertos en la materia, y están disponibles comercialmente o pueden prepararse usando técnicas bien conocidas.
Materiales
Los productos químicos se adquirieron de Fluka (Suiza). Los oligonucleótidos fueron de Microsynth (Suiza). A menos que se indique lo contrario, las polimerasas de ADN, las enzimas de restricción y los tampones fueron de New England Biolabs (e E. UU.) o Fermentas (Lituania). La cepa de clonación y producción de proteínas fue E. coli XL1-blue (Stratagene, EE. UU.) o BL21 (Novagen, EE. UU.). Se adquirieron seroalbúmina purificada y sueros de diferentes especies (por ejemplo, de Sigma-Aldrich, Suiza o Innovative Research, EE. UU.). La seroalbúmina biotinilada de diferentes especies se obtuvo químicamente a través de acoplamiento De la fracción de biotina a aminas primarias de las albúminas de suero purificadas usando reactivos y procedimientos de biotinilación estándar (Pierce, EE.UU.). Biología molecular
A menos que se indique lo contrario, los procedimientos se realizan de acuerdo con los protocolos descritos (Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, Nueva York).
Bibliotecas de proteínas de repetición de la anquirina diseñadas
Se describen las bibliotecas de proteínas de repetición de la anquirina diseñadas por N2C y N3C (WO 2002/020565; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz y col. 2004, loc. cit.). El dígito en N2C y N3C describe el número de módulos de repetición aleatorizados presentes entre los módulos de limitación N-terminal y C-terminal. La nomenclatura utilizada para definir las posiciones dentro de las unidades y módulos de repetición se basa en Binz et al. 2004, loc. cit. con la
modificación de que los bordes de los módulos de repetición de la anquirina y las unidades de repetición de la anquirina se desplazan a través de una posición de aminoácido. Por ejemplo, la posición 1 de un módulo de repetición de la anquirina de Binz et al.2004 (loc. Cit.) Corresponde a la posición 2 de un módulo de repetición de la anquirina de la presente divulgación y, en consecuencia, a la posición 33 de un módulo de repetición de la anquirina de Binz et al.
2004, loc. cit. corresponde a la posición 1 de un siguiente módulo de repetición de la anquirina de la presente divulgación.
Todas las secuencias de ADN se confirmaron a través de la secuenciación, y el peso molecular calculado de todas las proteínas descritas se confirmó por espectrometría de masas.
Ejemplo 1: Selección de proteínas de unión que comprenden un dominio de repetición con especificidad de unión para xSA
Usando la presentación de ribosomas (Hanes, J. y Plückthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997), muchas proteínas de repetición de la anquirina diseñadas (DARPins) con especificidad de unión para xSA se seleccionaron de las bibliotecas DARPin N2C o N3C descritas por Binz et al. 2004 (loc. Cit.). La unión de los clones seleccionados a dianas específicas (xSA; es decir, MSA, HSA o CSA) e inespecíficos (MBP, proteína de unión a maltosa de E. coli) se evaluó a través de un ELISA de extracto bruto que indica que las proteínas de unión a xSA fueron seleccionadas con éxito.
Los dominios de repetición de SEC ID N°: 17 a 31 constituyen secuencias de aminoácidos de proteínas de unión seleccionadas que comprenden un dominio de repetición con especificidad de unión para xSA. El análisis de secuencia de los aglutinantes seleccionados reveló motivos específicos de secuencia de repetición de la anquirina inherentes a ciertas familias de aglutinantes seleccionados. Tales motivos de secuencia de repetición de la anquirina presentes en los dominios de repetición con especificidad de unión para xSA se proporcionan en SEC ID N°: 11 a 14.
Selección de proteínas de repetición de la anquirina específicas de la seroalbúmina por visualización de ribosomas
La selección de proteínas de repetición de la anquirina específicas de la seroalbúmina se realizó a través de la visualización de ribosomas (Hanes y Plückthun, loc. Cit.) usando HSA, CSA o MSA como proteínas de diana la biblioteca de proteínas de repetición de la anquirina diseñadas como se describe (WO 2002/020565, Binz et al., 2003, loc. cit. y Binz et al., 2004, loc. cit) y protocolos establecidos (Zahnd, C., Amstutz, P. y Plückthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007). Las rondas de selección de presentación de ribosomas se realizaron en HSA, CSA o MSA (incluidas las variantes biotiniladas de HSA o MSA inmovilizadas sobre neutravidina o estreptavidina) con ambas bibliotecas N2C y N3C DARPin utilizando protocolos establecidos (Binz et al. 2004, loc. cit.). El número de ciclos de transcripción inversa (RT)-CRP después de cada ronda de selección se redujo constantemente de 40 a 30, ajustándose al rendimiento debido al enriquecimiento de aglutinantes. Cuatro rondas de selección en HSA, CSA o MSA produjeron grupos de DARPins de afinidad micromolar a nanomolar, de acuerdo con lo revelado por las mediciones ELISA y SPR de clones individuales. La afinidad de ciertas DARPins se mejoró aún más a través del uso de la maduración por afinidad a través de procedimientos bien conocidos por la persona experta en la técnica (por ejemplo, a través de la diversificación de los clones de DARPin a través de PCR propensa a errores y la selección y cribado de aglutinantes mejorados como se describe anteriormente).
Los clones seleccionados se unen específicamente a la seroalbúmina como se muestra por el extracto en bruto ELISA
Las DARPins individuales seleccionadas que fueron unidas específicamente a xSA se identificaron a través de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando extractos crudos de Escherichia coli de células de expresión de DARPin usando protocolos estándar. A través de la visualización de ribosomas, los clones seleccionados se clonaron en el vector de expresión pQE30 (Qiagen), se transformaron en E. coli XL1-Blue (Stratagene) y a continuación se cultivaron durante la noche a 37°C en una placa de 96 pocillos de profundidad (cada clon en un solo pocillo) que contiene 1ml de medio de cultivo (2YT que contiene 1% de glucosa y 100|jg/ml de ampicilina). Se inoculó 1ml de 2YT fresco que contenía 50jg/ml de ampicilina con 100jl del cultivo nocturno en una placa nueva de 96 pocillos de profundidad. Después de la incubación durante 2 horas a 37°C, se indujo la expresión con IPTG (concentración final 1mM) y continuó durante 3 horas. Las células se cosecharon, se resuspendieron en 100jl de B-PERII (Pierce) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación. posteriormente, se añadieron 900jl de PBS-Tc (PBS suplementado con 0,25% de hidrolizado de caseína, 0,1% de Tween 20®, pH 7,4) y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Se aplicaron 100jl de cada clon lisado a un pocillo de una placa MaxiSorp recubierta con NeutrAvidina que contenía xSA o la MBP no relacionada inmovilizada a través de su fracción de biotina y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado exhaustivo con PBS-T (PBS suplementado con 0,1% de Tween 20®, pH 7.4), la placa se desarrolló usando procedimientos ELISA estándar usando el anticuerpo monoclonal anti-RGS(His)4 (34650, Qiagen) como anticuerpo primario y policlonal de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (A3562, Sigma) como reactivo secundario. A continuación, se detectó la unión utilizando 4-nitrofenil fosfato disódico (4NPP, Fluka) como un sustrato para la fosfatasa alcalina. El desarrollo del color se midió a 405nm. El cribado de varios cientos de clones a través de tal extracto celular bruto ELISA reveló más de cien DARPins diferentes con especificidad para xSA. Estas proteínas de unión fueron elegidas para su posterior análisis. Se proporcionan ejemplos de secuencias de aminoácidos de dominios de repetición seleccionados que se unen específicamente a xSA en SEC ID N°: 17 a 31, 37 a 40 y 43 a 48.
Deducir motivos de secuencia de repetición de dominios de repetición seleccionados con especificidad de unión para
xSA
Las secuencias de aminoácidos de dominios de repetición seleccionados con especificidad de unión para xSA se analizaron adicionalmente a través de herramientas de análisis de secuencia conocidas por el profesional en la materia (WO 2002/020565; Forrer et al., 2003, loc. Cit.; Forrer, P., Binz, HK, Stumpp, MT y Plückthun, A., ChemBioChem, 5 (2), 183-189, 2004). Sin embargo, en contraste con el documento WO 2002/020565 en el que se usaron motivos de repetición de origen natural para deducir motivos de secuencia de repetición, en el presente documento los motivos de secuencia de repetición se dedujeron de las unidades de repetición de dominios de repetición seleccionados con especificidad de unión para xSA. De este modo, se determinaron las familias de dominios de repetición seleccionados que comprenden un motivo de secuencia de repetición común. Tales motivos de secuencia de repetición presentes en los dominios de repetición con especificidad de unión para xSA se proporcionan en SEC ID N°: 11 a 14.
Alto nivel y expresión soluble de DARPins
Para un análisis adicional, los clones seleccionados que muestran unión específica a xSA en el ELISA de extracto de células en bruto como se describió anteriormente se expresaron en células E. coli BL21 o XL1-Blue y se purificaron usando su His-tag usando protocolos estándar. Se usaron 25ml de cultivos estacionarios nocturnos (LB, glucosa al 1%, 100mg/l de ampicilina; 37°C) para inocular cultivos de 1l (mismo medio). A una absorbancia de 0,7 a 600nm, los cultivos se indujeron con IPTG 0,5mM y se incubaron a 37°C durante 4 horas. Los cultivos se centrifugaron y los sedimentos resultantes se resuspendieron en 40ml de TBS500 (Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, pH 8) y se sonicaron. El lisado se volvió a centrifugar, y se añadieron al sobrenadante resultante glicerol (concentración final al 10% (v / v)) e imidazol (concentración final 20mM). Las proteínas se purificaron sobre una columna de ácido Ni-nitrilotriacético (volumen de columna de 2,5ml) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAgen, Alemania). Alternativamente, las DARPins o dominios de repetición seleccionados desprovistos de una etiqueta 6xHis se purificaron por cromatografía de intercambio aniónico seguido de cromatografía de exclusión por tamaño de acuerdo con resinas estándar y protocolos conocidos por la persona experta en la técnica. Se pueden purificar hasta 200mg de DARPins altamente solubles con especificidad de unión a la seroalbúmina a partir de un litro de cultivo de E. coli con una pureza > 95% de acuerdo con la estimación de SDS-15% PAGE. Tales DARPins purificados se usan para caracterizaciones adicionales.
Ejemplo 2: Análisis de estabilidad y cromatografía de exclusión por tamaño de DARPins con especificidad de unión para xSA
Las DARPins #19 a 22 y las DARPins #27 a 30 con especificidad de unión para xSA se purificaron hasta casi la homogeneidad usando su His-tag como se describe anteriormente y se almacenaron en PBS durante 28 días a 30mg/ml (~2mM) a 40°C (estudio de estabilidad). En el día 0 (Figura 1a) y en el día 28 (Figura 1b) se tomaron muestras, se diluyeron a 500|M y se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para evaluar su peso molecular aparente y su estabilidad (es decir, su tendencia de agregación, multimerización o degradación) a través del tiempo.
En otro experimento (Fig. 1c), las DARPins #19 y 43 a 48 con especificidad de unión para xSA se purificaron hasta casi la homogeneidad usando su His-tag como se describe anteriormente y se almacenaron en PBS durante 28 días a aproximadamente 100mg/ml a -80°C, diluido a 500|M y analizado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para su caracterización (es decir, su tendencia de agregación, multimerización o degradación). En particular, se utilizó una columna más larga en comparación con la primera serie de análisis (ver más abajo).
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
La SEC analítica se llevó a cabo utilizando un sistema de HPLC (serie Agilent 1200) utilizando una columna Superdex 2005/150 (Fig. 1a y Fig. 1b) o una columna Superdex 200 10 / 300GL (Fig. 1c) (GE Healthcare) a 20°C. La columna Superdex 200 5/150 tiene un volumen de lecho de 3,0ml y un volumen vacío de 1,08ml (determinado experimentalmente usando dextrano azul). La columna Superdex 200 10/300GL tiene un volumen de lecho de 24ml y un volumen vacío de aproximadamente 8ml. Las mediciones se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la materia. Las ejecuciones se realizaron a un caudal de 0,2ml/min y una presión máxima de 15 bar (Superdex 2005/150) o 0,6ml/min y una presión máxima de 18 bar (Superdex 20010 / 300Gl ) en PBS. Las muestras de proteínas fueron diluidas en PBS a alrededor 20-500|M, se filtraron (0,22|m) y se inyectaron 20-100|l de las muestras diluidas en la columna para su separación. Los perfiles de elución de las muestras de proteínas se registraron al leer la absorbancia a 280nm. Se utilizaron aprotinina (AP) con un peso molecular de 6,5 kDa, anhidrasa carbónica (CA) con un peso molecular de 29 kDa y conalbúmina (CO) con un peso molecular de 75 kDa, como proteínas estándar para obtener una curva de calibración a partir de la cual se pueden determinar los pesos moleculares aparentes de las proteínas de muestra.
Los resultados se muestran en la Figuras 1. DARPins #19-22 y 27-30 muestran cromatogramas SEC indistinguibles (es decir, perfiles de elución indistinguibles) en el día 0 y en el día 28 del estudio de estabilidad. En conclusión, todas las DARPins eluyen como monómero en las condiciones de ensayo y las DARPins #19-23 y 27-30 son estables durante al menos 1 mes a 40°C en PBS (es decir, sus perfiles de elución no revelaron ninguna tendencia de agregación, multimerización o degradación).
Ejemplo 3: Estabilidad térmica de DARPins con especificidad de unión de xSA
La estabilidad térmica de DARPins con especificidad para xSA se analizó con un ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia (Niesen, F.H., Nature Protocols 2 (9): 2212-2221, 2007). De este modo, la temperatura a la que se despliega una proteína (es decir, una del tipo DARPin) se mide por un incremento en la fluorescencia de un tinte (por ejemplo, SYPRO naranja; Invitrogen, cat. N° S6650) con afinidad por las partes hidrofóbicas de la proteína, que se exponen a medida que la proteína se despliega. La temperatura en el punto medio de transición de fluorescencia obtenido de este modo (desde una intensidad de fluorescencia más baja a una intensidad de fluorescencia más alta) corresponde a la temperatura de desnaturalización (Tm) del punto medio de la proteína analizada.
Ensayo de estabilidad térmica basada en fluorescencia.
La desnaturalización térmica de DARPins usando SYPRO orange como un tinte de fluorescencia se midió usando un instrumento de PCR en tiempo real (es decir, el termociclador C1000 (BioRad) en combinación con un sistema óptico CFX96 (BioRad)). Se prepararon DARPins a una concentración de 80|M en PBS a pH 7,4 o tampón MES a pH 5,8 que contenía 1x SYPRO Orange (diluido a partir de una solución madre SYPRO Orange 5'000x, Invitrogen) y se añadieron 50|l de tales soluciones de proteína o tampón solo en una placa de PCR blanca de 96 pocillos (Bio-Rad). Las placas se sellaron con sellos adhesivos Microseal 'B' (Bio-Rad) y se calentaron en el instrumento de PCR en tiempo real de 20°C a 95°C en incrementos de 0,5°C, incluido un paso de retención de 25 segundos después de cada incremento de temperatura, y la desnaturalización térmica de las DARPins fue seguida por la medición de las unidades de fluorescencia relativa de las muestras en cada incremento de temperatura. Las unidades de fluorescencia relativas en los pocillos de la placa se midieron usando el canal 2 de los instrumentos de PCR en tiempo real (es decir, la excitación fue a 515-535nm y la detección fue a 560-580nm), y se restaron los valores correspondientes obtenidos para el tampón solamente. A partir de los puntos medios de transición de desnaturalización térmica obtenidos de este modo, se pueden determinar los valores de Tm para los DARPins analizados.
Los resultados de la desnaturalización térmica de DARPins en PBS a pH 7,4 o MES-buffer a pH 5,8 seguido de un incremento en la intensidad de fluorescencia de SYPRO Orange se muestran en la Figura 2 y la Figura 3. Las transiciones de desnaturalización térmica medidas demuestran que todas las DARPins con especificidad de unión para xSA analizadas tienen valores de Tm muy superiores a 40°C (tanto a pH 7,4 como a pH 5,8).
Ejemplo 4: Caracterización de las DARPins con unión por especificidad para xSA por análisis de resonancia de plasmón superficial
Las DARPins con especificidad de unión para xSA se inmovilizaron en una celda de flujo a través de su His-tag para el anticuerpo a-RGS-His recubierto (Qiagen, cat. No. 34650), y la interacción de seroalbúmina de humanos, mono cynomolgus (cyno), ratón, rata, conejo y perro se analizaron con las DARPins inmovilizadas.
Análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR)
SPR se midió utilizando un instrumento ProteOn (BioRad) y la medición se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la materia. El tampón de ejecución fue PBS, pH 7,4, que contenía Tween 20® al 0,01%. El anticuerpo anti-RGS-His se inmovilizó covalentemente en un chip GLC (BioRad) a un nivel de alrededor de 2000 unidades de resonancia (RU). La inmovilización de DARPins en el chip recubierto con anticuerpo se realizó inyectando 150|l de solución de DARPin 1|M en 300 s (velocidad de flujo = 30|l/min). La interacción con la albúmina sérica de las diferentes especies se midió entonces inyectando en 60 segundos un volumen de 100|l de tampón (PBS que contiene Tween® al 0,01%) que contiene una seroalbúmina distinta a una concentración de 400, 200, 100, 50nM (medición de velocidad de entrada), seguido de un flujo continuo de tampón durante 10 a 30 minutos (velocidad de flujo = 100|l/min) (medición de velocidad de descarga). Las señales (es decir, los valores de la unidad de resonancia (RU)) de una celda de referencia no revestida y de una inyección de referencia (es decir, la inyección de tampón en ejecución solamente) se sustrajeron de las trazas de RU obtenidas después de la inyección de las albúminas de suero (doble referencia). A partir de las trazas de SRP obtenidas a partir de las mediciones de la tasa de activación y de desactivación, puede determinarse la tasa de activación y de desactivación de la interacción de seroalbúmina DARPin correspondiente.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 y en la Tabla 2. Las constantes de disociación (Kd) se calcularon a partir de las tasas estimadas de activación y desactivación utilizando procedimientos estándar conocidos por la persona experta en la materia y que se encuentran en el rango de alrededor de 3 a alrededor de 300nM. Mientras que la seroalbúmina de humano y de mono cynomolgus está unida por todas las DARPins analizadas, la seroalbúmina de conejo, ratón, rata y perro solo está unida por un subconjunto de estas DARPins.
Tabla 1: Constantes de disociación de las interacciones de seroalbúmina DARPin
Kd [nM] Kd [nM] (cyno) Kd [nM] (mouse) Kd [nM] (rat) Kd [nM] (rabbit) Kd [nM] (dog) _______________ (humano)_______________________________________________________________________________ DARPin 15 7 n.b. n.b. 17 n.b.
#29
DARPin 27 110 124 242 n.b. 185 #20
DARPin 11 6 n.b. n.b. 19 n.b.
#27
DARPin 13 74 68 109 n.b. 81 #22
DARPin 6 3 n.b. n.b. 9 n.b.
#28
DARPin 14 63 56 91 n.b. 77 #19
DARPin 26 110 142 266 n.b. 180 #21
DARPin 7 4 n.b. n.b. 8 n.b.
#30
Las constantes de disociación para diversas interacciones de seroalbúmina DARPin (de diferentes especies como se indica en el título de cada columna) se midieron usando SPR. (n.b. = sin unión observable).
Tabla 2: Constantes de disociación de las interacciones de seroalbúmina DARPin
Kd [nM] (humano)
DARPin #43 30
DARPin #44 39
DARPin #45 35
DARPin #46 43
DARPin #47 96
DARPin #48 68
Las constantes de disociación para diversas interacciones de seroalbúmina humano DARPin se midieron usando SPR.
Ejemplo 5: Semivida plasmática terminal de DARPins con especificidad de unión para xSA
La semivida plasmática terminal de DARPins en ratones y monos cynomolgus (Macaca fascicularis, también abreviado como "cyno") se determinó de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la materia (Toutain, et al., Loc. Cit.). Una cierta cantidad de DARPin se inyectó por vía intravenosa en un mamífero y el aclaramiento de DARPin del plasma sanguíneo fue seguido a través del tiempo siguiendo su concentración plasmática. La concentración de DARPin inicialmente disminuye hasta que se alcanza un pseudo-equilibrio (fase alfa) seguido de una disminución exponencial adicional de la concentración de DARPin en el plasma (fase beta). A partir de esta fase beta, puede calcularse la semivida plasmática terminal de DARPin.
Determinación del aclaramiento plasmático de DARPin en ratones
Para evaluar el aclaramiento plasmático de las DARPins con especificidad de unión para xSA, las proteínas de prueba se radiomarcaron y se inyectaron en la vena de la cola de ratones Balb/c sin tratamiento previo. Se inyectaron los siguientes DARPins: DARPin #19, DARPin #21, DARPin #23, DARPin #25, DARPin #18'' DARPin #32, DARPin #35, DARPin #36, DARPin #33, DARPin #34, DARPin #37, DARPin #38, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 y DARPin #48. Las DARPins se radiomarcaron con un complejo de 99mTc-carbonilo como se describió previamente (Waibel, R., et al., Nature Biotechnol. 17 (9), 897-901, 1999).
Las DARPins (40|jg) se incubaron con 99mTc-carbonilo (0,8-1,6m Ci) durante 1 hora antes de diluirse a 400jl en PBS (pH 7.4). Cada ratón fue inyectado por vía intravenosa con 100jl de la solución DARPin marcada obtenida de este modo (equivalente a 10jg de proteína y 0,2 - 0,4m Ci). Se recogieron muestras de sangre de los ratones a las 1 hora, 4 horas, 24 horas y 48 horas después de la inyección inicial y se midió la radioactividad de las muestras. El nivel de radioactividad medido en un determinado momento es una medida directa de la cantidad de DARPin que todavía está presente en el plasma sanguíneo en ese punto de tiempo. El % de dosis inyectada es el porcentaje de la radioactividad total de la sangre total del ratón (1,6ml para un ratón de 18g) medido en un cierto punto de tiempo en relación con la radioactividad total de la muestra inyectada corregida por la desintegración radiactiva de 99mTc. Las DARPins con especificidad de unión para MSA tienen una semivida plasmática terminal fuertemente aumentada en ratones en comparación con DARPin #32 que no tiene especificidad de unión para xSA (Figura 4). DARPin #19, DARPin #21, DARPin #23, DARPin # 3, DARPin #37, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 y DARPin
#48 tuvieron una semivida plasmática terminal en ratones de alrededor 2 - 2,5 días.
Determinación del aclaramiento plasmático de DARPin en monos cynomolgus
DARPin diluido en PBS se inyectó como una inyección en bolo en la vena cefálica de monos cynomolgus. Se inyectaron los siguientes DARPins: DARPin #26 (0,5mg/kg), DARPin #24 (0,5mg/kg), DARPin #17 (0,5mg/g), DARPin #34 (1mg/kg), y DARPin #32 (0,5mg/kg). En diferentes puntos de tiempo después de la inyección, se generó plasma a partir de la sangre recogida de la vena femoral de los animales. La concentración de las DARPins en las muestras de plasma se determinó luego a través de un ELISA sándwich utilizando protocolos estándar conocidos por el experto en la materia y una curva estándar de DARPin apropiada con concentraciones de DARPin conocidas.
Las muestras de plasma de monos cynomolgus se diluyeron en serie en PBS-C (PBS que contiene 0,25% de caseína, pH 7,4) en placas ELISA MaxiSorp que se revistieron con un anticuerpo monoclonal de conejo específico anti-DARPin. Después de un lavado exhaustivo con PBS-T (PBS suplementado con 0,1% Tween 20®, pH 7,4), las placas se desarrollaron con el anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)4 etiquetado con peroxidasa de rábano picante HRP (Qiagen). La unión se detectó utilizando 100|jl de sustrato BM-Blue POD (Roche Diagnostics). La reacción se detuvo agregando 50|jl de H2SO4 1 M y se midió la absorbancia a 450nm (y restando la absorbancia a 620nm). La concentración de DARPin en la muestra de plasma se calculó realizando una regresión mono-exponencial en una curva estándar de DARPin diluida en suero de mono (GraphPad Prism). La semivida terminal plasmática de las DARPins se calculó realizando regresiones no lineales (decaimiento de dos fases) en los valores de concentración determinados hasta 240 horas después de la inyección. La semivida de la segunda fase (beta) corresponde a la semivida plasmática terminal.
La DARPin con especificidad de unión para xSA tiene una semivida plasmática terminal aumentada en el mono cynomolgus en comparación con la DARPin #32 que no tiene especificidad de unión para xSA (Figura 5, Tabla 3). DARPin #19, DARPin #21, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 y DARPin #48 tuvieron una semivida plasmática terminal en el mono cynomolgus de alrededor de 10 a 15 días.
Tabla 3: Estimaciones de la semivida plasmática terminal de DARPins en el mono cynomolgus (cyno)
*1/2 [h]
DARPin #32 0.2
DARPin #26 129
DARPin #34 111
DARPin #17 40
DARPin #24 126
DARPin #19 288
DARPin #21 384
DARPin #28 144
Estimaciones de parámetros farmacocinéticos t1/2: semivida plasmática terminal
Ejemplo 6: Mayor estabilidad térmica de DARPins con módulos de limitación de C-terminal mejorados
La estabilidad térmica de DARPins se analizó con un ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia como se describe en el Ejemplo 3. Alternativamente, la estabilidad térmica de un DARPin se analizó por espectrometría de CD; es decir, al medir su desnaturalización por calor siguiendo su señal de dicroísmo circular (CD) a 222nm a través de las técnicas bien conocidas por la persona experta en la técnica relevante. La señal de CD de la muestra se registró a 222nm en un instrumento Jasco J-715 (Jasco, Japón) mientras se calentaba lentamente la proteína a una concentración de 0,02mM en PBS pH 7.4 de 20°C a 95°C usando una rampa de temperatura de 1°C por min. Este es un medio eficaz para seguir la desnaturalización de las DARPins, ya que consisten principalmente en hélices alfa que muestran un fuerte cambio en su señal de CD a 222nm al desplegarse. El punto medio de la transición observada de la mencionada señal de CD medida para un DARPin corresponde a su valor Tm.
La estabilidad térmica de DARPin #37 (SEC ID N°: 37 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal) se comparó con la estabilidad térmica de DARPin #38 (SEC ID N°: 38 con una His-tag (SEC ID Na: 15) fusionada a su N-terminal) usando el ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia. Estas dos DARPins poseen una secuencia de aminoácidos idéntica a excepción del módulo de limitación C-terminal de sus dominios de repetición. El dominio de repetición de DARPin #38, pero no DARPin #37, comprende un módulo de limitación C mejorado tal como se describe en el presente documento. Los valores de Tm en PBS pH 7,4 determinados para DARPin #37 y DARPin #38 fueron de alrededor de 63°C y de alrededor de 73°C, respectivamente. Los valores de Tm en el tampón MES pH 5,8 determinado para DARPin #37 y DARPin #38 fueron alrededor de 54,5°C y de alrededor de 66°C, respectivamente. La estabilidad térmica de DARPin #39 (SEC ID N°: 39 con una His-tag (SEC ID N°: 15) fusionada a su N-terminal) se
Claims (17)
1. Una proteína de unión que comprende al menos un dominio de repetición de anquirina, en la que dicho dominio de repetición de anquirina tiene especificidad de unión para una seroalbúmina de mamífero y en la que dicho dominio de repetición de anquirina comprende un módulo de repetición de anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en
(1) SEC ID N°:49, 50, 51 y 52;
(2) SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52 en las que hasta 3 aminoácidos son intercambiados por otros aminoácidos;
(3) una secuencia de aminoácidos
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC iD N°: 11 se intercambian por cualquier aminoácido;
(4) una secuencia de aminoácidos
X1DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:54)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 54 se intercambian por cualquier aminoácido;
(5) una secuencia de aminoácidos
X1DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:12)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 12 se intercambian por cualquier aminoácido;
(6) una secuencia de aminoácidos
X1DX2X3GTTPLHLAAVYGHLEX4VEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:13)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, A, D, M, F, S, I, T, N, e Y;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N e Y;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, N, T, H, K, A y F;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y M;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, K, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC iD
N°: 13 se intercambian por cualquier aminoácido; y
(7) una secuencia de aminoácidos
X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEC ID N°:14)
en la que
Xi representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L y P;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, N, Y y A; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, V, T y S; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y F; y en la que opcionalmente hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID
N°: 14 se intercambian por cualquier aminoácido;
2. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID
N°: 11 se intercambian por cualquier aminoácido;
3. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1DFX2GX3TPLHLAAX4X5GHLEIVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:54)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID
N°: 54 se intercambian por cualquier aminoácido;
4. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
Xi representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S; X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y N; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y N; X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y K; y X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A e Y; 5. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho dominio de repetición de anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de anquirina seleccionado a partir del grupo que consiste en SEC ID N°s: 21,27 y 46.
6. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho dominio de repetición de anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado a partir del grupo que consiste en SEC ID N°s: 21,27 y 46.
7. La proteína de unión de la reivindicación 6, en la que G en la posición 1 y/o S en la posición 2 de dicho dominio de repetición de anquirina faltan.
8. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene una secuencia de aminoácidos
X1DYFX2HTPLHLAARX3X4HLX5IVEVLLKX6GADVNA (SEC ID N°:11)
en la que
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G; X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 11 se intercambian por cualquier aminoácido;
y en la que dicho dominio de repetición de la anquirina comprende además un módulo de repetición de la anquirina que tiene la secuencia de aminoácidos
X1DFX2GX3TPLHLAAX4DGHLEIVEVLLKX5GADVNA (SEC ID N°:12)
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; y opcionalmente, hasta 2 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEC ID N°: 12 se intercambian por cualquier aminoácido;
y en la que el módulo de repetición de la anquirina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 12 está precedido por el módulo de repetición de la anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°:11.
9. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) SEC ID N°: 49, 50, 51 y 52 y (2) SeC ID N°: 49, 50, 51 y 52, en las que hasta 2 aminoácidos son intercambiados por otros aminoácidos.
10. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°:49.
11. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que dicho módulo de repetición de anquirina tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) SEC ID N°: 50 y (2) SEC ID N°: 50, en las que hasta 2 aminoácidos son intercambiados por otros aminoácidos.
12. La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho dominio de repetición de anquirina compite por unirse a una seroalbúmina de un mamífero con un dominio de repetición de anquirina seleccionado del
grupo que consiste en SEC ID N°: 17 a 31 y 43 a 48.
13. La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho dominio de repetición de anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de anquirina seleccionado a partir del grupo que consiste en SEC ID N°s: 17 a 31 y 43 a 48, en las que G en la posición 1 y/o S en la posición 2 de dicho dominio de repetición de anquirina faltan opcionalmente.
14. La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho dominio de repetición de anquirina tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con el dominio de repetición de anquirina de SEC ID N°: 32.
15. La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que comprende además un compuesto bioactivo, en la que dicha proteína de unión tiene una semivida plasmática terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en comparación con la semivida plasmática terminal del mencionado compuesto bioactivo no modificado y en la que dicha semivida plasmática terminal mayor se confiere a dicha proteína de unión por dicho dominio de repetición de anquirina.
16. Un ácido nucleico que codifica una proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el ácido nucleico de la reivindicación 16, y opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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