KR20240042017A - 발현 수준이 증가된 변형된 hla-b57 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HLA-B57 융합 단백질을 얻는 방법을 제공하며, 상기 융합 단백질은 증가된 안정성 및 발현을 부여하는 적어도 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명은 또한 암과 같은 의학적 상태를 치료하는 데 사용하기 위한 단리된 HLA-B57 융합 단백질, 핵산 또는 상기 HLA-B57 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 제공한다.
Description
본 발명은 2021년 8월 5일에 출원된 유럽 출원 EP21190004.8 및 EP21190005.5, 및 2021년 11월 9일에 출원된 EP21207324.1로부터 우선권을 주장한다.
본 발명은 치료제를 생산할 목적으로 포유동물 세포주로부터 증가된 발현을 부여하는 HLA-B57 폴리펩타이드의 변형에 관한 것이다.
고전적인 MHC-I 분자(인간에서는 HLA-I로도 알려져 있음)는 3개의 세포외 도메인(α1, α2 및 α3)이 있는 막 결합 중쇄를 포함하는 이량체 또는 삼량체 구조이며, β2-마이크로글로불린(β2m) 경쇄, 및 선택적으로 펩타이드 결합 틈(cleft)과 관련된 작은 펩타이드에 비공유적으로 결합되어 있다. 그러나, MHC 클래스 I 분자는 β2m이 결여된 유리 중쇄로 해리될 수도 있다(Arosa et al., Trends in Immunology 2007 Mar; 28(3):115-23).
본 발명자들은 이전에 HIV 감염에서 특정 면역 상관관계에 연결된 HLA-B57 중쇄를 유망한 면역조절 치료제로서 확인했다(WO 2017153438 A1 참조). 단리된 HLA-B57 중쇄 융합 분자를 얻기 위해서는 먼저 HLA 중쇄가 β2m과 함께 발현되어야 한다. 상등액으로부터 정제되면, HLA 중쇄/β2m 복합체가 분리될 수 있고, 단리된 HLA 사슬이 정제되고 재접힘(refolding)될 수 있다. 그러나 β2m-비결합 HLA-B57은 바람직한 면역 조절 특성을 갖고 있지만, 산업적 양으로 제조 규모를 확대하는 데 어려움이 있는 것으로 나타났다. HLA-B57 중쇄는 용액에서 올리고머와 응집체를 형성하여 세포 생존력을 감소시키고 HLA 중쇄/β2m 복합체와 파생된 단리된 β2m-비결합 HLA 중 융합 단백질 모두의 수율을 낮춘다.
상기 언급된 최신 기술에 기초하여, 본 발명의 목적은 고수율 재조합 단백질 발현이 가능하고 바람직한 면역조절 특성을 특징으로 하는 약학적 활성 HLA-B57 중쇄를 제공하는 것이다. 이러한 목적은 본 명세서의 종속항, 실시예, 도면 및 일반적인 설명에 기술된 추가적인 유리한 실시예와 함께 본 명세서의 독립항의 주제에 의해 달성된다.
본 발명의 제1 측면은 유리한 제조 및 면역조절 특성을 특징으로 하는, HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인의 변이체를 포함하는 HLA-B57 융합 단백질을 얻는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 적어도 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 도입하는 단계를 포함한다. 생성된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 안정화 폴리펩타이드에 연결되어 세포 배양에서 고도로 발현되는 변형된 변이체 HLA-B57 융합 단백질을 얻는다. 본 발명에 의해 자연 발생 HLA-B57 폴리펩타이드 서열에서 확인된 주요 아미노산 잔기는 위치 46의 알라닌(A)이 글루타메이트(E)로 및/또는 위치 97의 발린(V) 또는 트립토판(W)이 아르기닌(R)으로 교환된 것이다. 이에 대한 및 본 명세서에 언급된 임의의 다른 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드에 대한 위치 번호는 자연 발생 전장 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인을 개시하는 글리신(G), 세린(S), 히스티딘(H) 모티프를 각각 위치 1, 2 및 3에 할당함으로써 순차적으로 정의된다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기와 같은 자연 발생 HLA-B57 아미노산 서열의 세포외 도메인에 기초한 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함하지만 자연 발생 서열과는 달리 위치 46에 E가 있고, 97번 위치에 R이 있고, IgG Fc 부분에 연결되는 단리된 HLA 융합 단백질이다.
본 발명의 추가 측면은 악성 종양 질환(malignant neoplastic disease)을 치료할 목적으로 치료제로 사용하기 위한, 상기 특정된 단리된 HLA 융합 단백질, 또는 상기 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 또는 핵산 발현 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 화합물 중 적어도 하나와 약제학적으로 허용되는 적어도 하나의 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
용어 및 정의
본 명세서를 해석할 목적으로 다음 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우 단수로 사용된 용어는 복수도 포함하며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 아래에 명시된 정의가 여기에 참조로 포함된 문서와 충돌하는 경우 명시된 정의가 우선한다.
본 명세서에 사용된 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "함유하는(containing)", 및 "포함하는(including)"이라는 용어와 기타 유사한 형태, 및 이들의 문법적 등가물은 의미 면에서 동등한 것으로 간주되며, 이러한 단어 중 어느 하나 뒤에 오는 항목이 해당 항목의 전체 목록이거나 나열된 항목으로만 한정되는 것이 아니라는 점에서 개방적인 것으로 간주된다. 예를 들어, 구성요소 A, B 및 C를 "포함하는" 물품은 구성요소 A, B 및 C로 구성될 수 있거나(즉, 단지 포함) 구성요소 A, B 및 C뿐만 아니라 하나 이상의 다른 구성요소도 포함할 수 있다. 따라서, "포함한다" 및 이와 유사한 형태 및 이들의 문법적 등가물은 "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"의 실시예의 개시를 포함하는 것으로 의도되고 이해된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 및 해당 범위의 다른 명시된 값 또는 중간 값 사이에 있는 각 중간 값은 명시된 범위에서 특별히 제외된 한도에 따라 하한 단위의 10분의 1까지 공개 내용에 포함되는 것으로 이해된다. 명시된 범위가 한도 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한도 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 공개에 포함된다.
본 명세서에서 값 또는 매개변수에 대한 "약"이라는 언급은 해당 값 또는 매개변수 자체에 대한 변형을 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명에는 "X"에 대한 설명이 포함된다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나", "또는" 및 "그"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 지정된 두 가지 기능 또는 구성 요소 각각을 다른 기능과 함께 또는 다른 기능을 제외하고 구체적으로 나열하는 것으로 간주된다. 따라서 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 "A 및 B", "A 또는 B", "A(단독)" 및 "B(단독)"를 포함하도록 의도되었다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 측면을 포괄하기 위한 것이다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학). 분자적, 유전적, 생화학적 방법(일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (2002) 5th Ed, John Wiley & Sons, Inc. 참조) 과 화학적 방법에는 표준 기술이 사용된다.
본 명세서의 맥락에서 폴리펩타이드라는 용어는 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 연결된 선형 사슬을 형성하는 50개 이상의 아미노산으로 구성된 분자에 관한 것이다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열(생리학적으로 발견된)은 전체 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 나타낼 수 있다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 단백질 및 이의 단편을 포함한다. 폴리펩타이드는 본 명세서에서 아미노산 잔기 서열로서 개시된다.
아미노산 잔기 서열은 아미노에서 카르복실 말단까지 제공된다. 서열 위치에 대한 대문자는 한 글자 코드의 L-아미노산을 의미합니다(Stryer, Biochemistry, 3rd ed. p. 21). 아미노산 서열 위치의 소문자는 해당 D- 또는 (2R)-아미노산을 나타낸다. 서열은 아미노에서 카르복시 말단 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 표준 명명법에 따라 아미노산 잔기 서열은 다음과 같이 3문자 또는 단일 문자 코드로 표시된다: Alanine (Ala, A), Arginine (Arg, R), Asparagine (Asn, N), Aspartic Acid (Asp, D), Cysteine (Cys, C), Glutamine (Gln, Q), Glutamic Acid (Glu, E), Glycine (Gly, G), Histidine (His, H), Isoleucine (Ile, I), Leucine (Leu, L), Lysine (Lys, K), Methionine (Met, M), Phenylalanine (Phe, F), Proline (Pro, P), Serine (Ser, S), Threonine (Thr, T), Tryptophan (Trp, W), Tyrosine (Tyr, Y), 및 Valine (Val, V).
유전자 발현 또는 발현이라는 용어, 또는 유전자 생성물이라는 용어는 핵산(RNA)의 생성 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 생성 과정(및 이의 생성물) 중 하나 또는 둘 다를 지칭할 수 있으며, 각각 전사 및 번역 또는 폴리펩타이드 생성물을 얻기 위해 유전 정보의 처리를 조절하는 중간 과정 중 하나를 지칭하기도 한다. 유전자 발현이라는 용어는 RNA 유전자 생성물, 예를 들어, 조절 RNA 또는 구조적(예: 리보솜) RNA의 전사 및 처리에도 적용될 수 있다. 발현된 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA에서 유래한 경우, 발현에는 진핵세포에서 mRNA의 스플라이싱이 포함될 수 있다. 발현은 전사 및 번역 수준, 즉 mRNA 및/또는 단백질 생성물 모두에서 분석될 수 있다.
본 명세서의 맥락에서 핵산 발현 벡터라는 용어는 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 RNA와 관련되며, 이는 특정 관심 유전자를 갖는 표적 세포를 형질주입(transfect)(플라스미드 또는 RNA의 경우) 또는 형질도입(transduce)(바이러스 게놈의 경우), 또는 (형질주입되는 RNA 구조의 경우) 형질주입된 mRNA로부터 상응하는 관심 단백질을 번역하는 데에 사용된다. 전사 및 후속 번역 수준에서 작동하는 벡터의 경우, 관심 유전자는 프로모터 서열의 제어를 받고 프로모터 서열은 표적 세포 내에서 작동하므로, 관심 유전자는 구성적으로 또는 자극에 대한 반응으로 또는 세포의 상태에 따라 전사된다. 특정 실시예에서, 바이러스 게놈은 캡시드에 패키징되어 바이러스 벡터가 되고, 이는 표적 세포를 형질도입할 수 있다.
본 명세서의 맥락에서, 서열 동일성 및 서열 동일성의 백분율이라는 용어는 두 개의 정렬된 서열을 위치별로 비교함으로써 결정된 서열 비교의 결과를 나타내는 단일 정량적 매개변수를 의미한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 정렬은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 전체 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988)의 유사성 방법 검색 또는 CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함하되 이에 국한되지 않는 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 구현을 통해 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 예를 들어, National Center for Biotechnology-Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 제공된다.
아미노산 서열의 비교를 위한 한 가지 예는 디폴트 셋팅(default setting): 정확한 역치(Expect threshold): 10; 단어 크기(Word size): 3; 질의 범위에 있어서 최대 일치(Max matches in a query range): 0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트(Gap Costs): 존재(Existence) 11, 연장(Extension) 1; 조성 조절(Compositional adjustments): 조건화된 조성 점수 매트릭스 조절(Conditional compositional score matrix adjustment)을 사용하는 BLASTP 알고리즘이다. 핵산 서열의 비교를 위한 하나의 이러한 예는 디폴트 셋팅: 정확한 역치: 10; 단어 크기: 28; 질의 범위에 있어서 최대 일치: 0; 일치/미스매치 점수(Match/Mismatch Scores): 1.-2; 갭 코스트: 선형을 사용하는 BLASTN 알고리즘이다. 달리 기술하지 않는 한, 본 명세서에 제공된 서열 동일성 값은 단백질 및 핵산 비교 각각을 위한 상기 정의된 디폴트 매개변수를 사용하는 프로그램의 BLAST 스위트(suite)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))를 사용하여 수득된 값을 지칭한다.
백분율 값을 지정하지 않고 동일한 시퀀스를 언급하는 것은 100% 동일한 시퀀스(즉, 동일한 시퀀스)를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 약학 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 의미한다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 국소, 비경구 또는 주사 투여에 적합한 형태로 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 알려진 바와 같이 임의의 용매, 분산 매체, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예: 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향료, 염료 등 및 이들의 조합을 포함한다(예: Remington, the Science 및 Practice of Pharmacy, ISBN 0857110624 참조).
본 명세서에 사용된 용어 임의의 질병 또는 장애(예: 암)의 치료하는(treating) 또는 치료(treatment)는 일 실시예에서 질병 또는 장애를 개선하는 것(예: 질병 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 진행을 늦추거나 정지시키거나 감소시키는 것)을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 환자가 식별할 수 없는 것들을 포함하는 적어도 하나의 신체적 변수를 완화 또는 개선하는 것을 의미한다. 또 다른 실시예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 장애, 물리적으로(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화), 또는 둘 다 조절하는 것을 의미한다. 질병의 치료 및/또는 예방을 평가하는 방법은 아래에 구체적으로 설명되지 않는 한 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
본 명세서의 맥락에서, 펩타이드 링커 또는 아미노산 링커라는 용어는 단일 사슬 폴리펩타이드를 생성하기 위해 두 개의 폴리펩타이드를 연결하는 데 사용되는 가변 길이의 폴리펩타이드를 의미한다. 본 명세서에 명시된 본 발명을 실행하는데 유용한 링커의 예시적인 실시예는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산으로 구성된 올리고펩타이드 사슬이다. 아미노산 링커의 비제한적 예는 변형 HLA-B57 폴리펩타이드를 안정화 펩타이드와 연결하여 실시예에서 HLA 융합 단백질을 제공하는 데 사용되는 유연한 글리신이 풍부한 펩타이드 GGGGSGGGGS(서열번호 003)이다.
본 명세서의 문맥에서 인간 백혈구 항원, HLA, HLA 중쇄 또는 HLA 알파 사슬이라는 용어는 염색체 6의 I 형 주조직 적합성(Major histocompatibility, MHC) 항원 유전자 계열에 의해 코딩된 단백질 계열과 관련된다. HLA 중쇄는 단량체이거나, 3개의 세포 외 도메인(α1, α2 및 α3)을 갖는 중쇄를 포함하는 이량체 구조의 일부를 형성할 수 있고, β2m 경쇄에 비공유 결합하거나, 선택적으로 펩타이드 결합 틈새에 작은 펩타이드 에피토프가 연결된 삼량체 구조일 수 있다.
자연 발생 HLA-B57(HLA-B*57, B57, HLA-B57, HLA-B57 폴리펩타이드)이라는 용어는 구체적으로 다수의 유사한 단백질을 코딩하는 MHC I 형 I HLA-B57 유전자 하위군의 생성물을 의미한다. HLA-B57 계열은 현재 고유한 핵산 서열을 갖는 221개의 알려진 대립유전자와 HLA-B*57:01부터 HLA-B*57:141까지 번호가 매겨진 수십 개의 고유한 단백질 서열 (알려진 서열이고, 예를 들어European Bioinformatics Institute Immuno Polymorphism Database, Robinson J. et al. 2013 Nucleic Acids Res. 41:D1234, https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.htm에서 제공하는 MGT/HLA 대립 유전자 쿼리 양식에 검색어 "B*57"을 입력하여 검색할 수 있다)을 포함한다. 전장 자연 발생 HLA-B57은 α1, α2 및 α3 도메인, 연결 펩타이드 영역, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. HLA 중쇄 폴리펩타이드 서열과 관련된 본 명세서의 맥락에서 용어 변이체는 자연 발생 HLA 폴리펩타이드 서열과 다른 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 하나 또는 여러 개의 아미노산 치환이 도입되어 원래의 자연적으로 발생하는 인간 단백질 서열과 다른 변이체 HLA 중쇄 폴리펩타이드이다.
본 명세서의 맥락에서 HLA-B57 폴리펩타이드 또는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드에 적용되는 세포외 도메인이라는 용어는 적어도 α1, α2, 및 α3 도메인을 포함하는 HLA-B57 중쇄 단백질의 세포외 부분을 의미한다.
본 명세서의 맥락에서, HLA 융합 단백질 또는 HLA-B57 융합 단백질이라는 용어는 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 안정화 Fc 폴리펩타이드 도메인에 연결된 야생형 또는 변이체 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드를 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 폴리펩타이드를 의미한다. 본 설명에 명시된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질은 때때로 본 명세서의 실시예에서 HLA-B57(A46E, V97R)로 지칭된다. 이 용어는 세포 배양에서 분비된 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드와 복합체를 이루는 HLA 융합 단백질과 β2-마이크로글로불린에서 단리된 정제된 HLA 융합 단백질을 모두 포함한다. HLA 융합 단백질이라는 용어는 안정화 면역글로불린(Ig) Fc 도메인에 연결된 단일 HLA-B57 폴리펩타이드, 또는 첫 번째 HLA 융합 단백질 단량체의 결합에 의해 형성된 이량체와 Ig Fc 도메인의 결합에 의한 두 번째 HLA 융합 단백질 단량체를 모두 포함한다.
본 명세서의 맥락에서, β2-마이크로글로불린 단백질(β2m 단백질, β2m, B2m, B2M, HLA 경쇄)이라는 용어는 MHC I형 이종이량체의 경쇄라고도 알려진 베타(β) 사슬을 의미한다. β2-마이크로글로불린 단백질이라는 용어는 첫째, 분비 신호, 예를 들어 Uniprot P61769의 서열 또는 서열번호 014 서열을 포함하는 전처리 β2-마이크로글로불린 단백질과 둘째, 폴리펩타이드가 세포에서 배출될 때 단백질의 분비 신호 부분이 절단에 의해 제거된 단백질의 분비 후 형태를 포함한다.
본 명세서의 맥락에서, β2m-비결합 HLA 중쇄라는 용어는 β2m 분자와의 결합이 결여된 HLA 중쇄 분자, 특히 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 재조합 단백질 제조 공정에 의해 HLA 융합 단백질 β2m-비결합 HLA 중쇄를 얻기 위해, HLA 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 분자가 포유동물 세포에서 β2m 단백질과 함께 발현되고, HLA(β2m 복합체)를 생성한다. β2m의 존재는 때때로 화합물 뒤에 접미사 ".β2m"으로 표시된다. 그런 다음 β2m이 산성 조건에서 분리되고, 그 후 β2m이 없는 HLA 융합 단백질이 크기 배제를 통해 정제된다. 본 명세서에서, 용어 HLA-B57.no β2m 또는 HLA-B57 (A46E/V97R) .no β2m은 각각 IgG Fc 폴리펩타이드에 연결된 비변이체 및 변이체 HLA 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질을 의미하며(여기서 (A46E/V97R)은 본 발명에 따른 변이체 HLA 폴리펩타이드의 존재를 나타냄), 이는 β2m 단백질로부터 분리되었다.
본 명세서의 맥락에서, 분비 신호, 분비 신호 펩타이드 또는 신호 서열이라는 용어는 일반적으로 길이가 약 6-30개 아미노산인 폴리펩타이드의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 개시하는 N-말단 리더 서열을 의미한다. 드문 경우, 분비 신호가 폴리펩타이드의 C-말단에 위치한다. 분비 신호는 때때로 표적화 신호, 국소화 신호, 수송 펩타이드, 리더 서열 또는 리더 펩타이드로 지칭된다. 세포로부터 폴리펩타이드의 효율적인 분비를 가능하게 하는 분비 신호는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 세포 기반 폴리펩타이드 제조 시스템에서 폴리펩타이드를 상등액으로 내보내는 것을 용이하게 하기 위해 재조합 단백질의 ORF에 포함되어 세포 상등액으로부터 폴리펩타이드를 정제할 수 있게 할 수 있다. 분비 신호를 코딩하는 mRNA의 번역 시, 이는 mRNA-리보솜 복합체의 소포체(endoplasmic reticulum, ER)의 채널 단백질로의 전달을 매개하는 세포질 단백질에 의해 인식된다. 분비 신호 펩타이드를 포함하는 새로 합성된 폴리펩타이드는 채널 단백질을 통해 ER 내강으로 이동되어 세포 분비 경로로 들어간다. 본 발명에 따라 특별히 사용되는 신호 서열은 서열번호 019와 같이 실시예에 사용된 것과 같이 번역 후 최종 폴리펩타이드 생성물로부터 절단되는 서열이거나 서열번호 020 내에 포함된 서열이다.
본 명세서의 맥락에서, 항체라는 용어는, 면역글로불린 타입 G(IgG), 타입 A(IgA), 타입 D(IgD), 타입 E(IgE) 또는 타입 M(IgM), 임의의 항원 결합 단편 또는 이들의 단일 사슬 및 관련되거나 유도된 구조체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 전체 항체를 의미한다. 전체 항체는 이황화 결합으로 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. IgG의 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 가지 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서 명세서에서는 VL로 약칭함)과 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 CL이라는 하나의 도메인을 포함한다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역에는 항원과 상호작동하는 결합 도메인이 포함된다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 첫 번째 구성요소를 포함하는 호스트 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 유사하게, 이 용어는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편인 소위 나노바디 또는 단일 도메인 항체를 포함한다.
본 명세서의 맥락에서, 면역글로불린 결정성 단편(Fc) 영역, 또는 Ig Fc라는 용어는 CH2 및 CH3 도메인이 포함된 항체 또는 면역글로불린(Ig)의 분획을 의미한다. Ig Fc는 이황화 결합에 의해 공유 연결된 두 개의 Ig Fc를 포함하는 단량체 또는 이량체를 모두 포함한다. 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질의 맥락에서, 이황화 결합은 각각 Ig Fc 도메인을 포함하는 2개의 HLA 융합 단백질 분자를 연결할 수 있다. HLA 융합 단백질에 Ig Fc가 존재하면 용해도, 안정성, 결합력, 반감기가 증가하고 기술적 관점에서 포유류 시스템에서 비용 효율적인 생산 및 정제(단백질 A 또는 G 정제)가 가능해진다.
본 명세서의 맥락에서 항체 유사 분자라는 용어는 높은 친화성/Kd ≤ 10E-8 mol/l로 다른 분자 또는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 항체 유사 분자는 항체의 특이적 결합과 유사하게 표적에 결합한다. 항체 유사 분자라는 용어는 고안된 안키린(ankyrin) 반복 단백질(Molecular Partners, Zurich)과 같은 반복 단백질, 매우 특이적이고 높은 친화도의 표적 단백질 결합을 나타내는 조작된 항체 모방 단백질을 포함한다(US2012142611, US2016250341, US2016075767 및 US2015368302 참조, 모두 참조로 여기에 포함됨). 용어 항체-유사 분자는 아르마딜로(armadillo) 반복 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드, 류신 풍부 반복 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 및 테트라트리코펩타이드(tetratricopeptide) 반복 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드를 추가로 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 용어 항체 유사 분자는 단백질 A 도메인, 섬유결합소 도메인 FN3, 컨센서스 피브로넥틴(consensus fibronectin) 도메인, 리포칼린(Skerra, Biochim. Biophys. Acta 2000, 1482(1-2):337-50 참조), 아연 핑거 단백질 유래 폴리펩타이드(Kwan et al. Structure 2003, 11(7):803-813 참조), Src 상동성 도메인 2(SH2) 또는 Src 상동성 도메인 3(SH3), PDZ 도메인, 감마-결정질, 유비퀴틴(ubiquitin), 시스테인 매듭 폴리펩타이드 또는 크노틴(knottin), 시스타틴, Sac7d, 삼중나선 코일드 코일(알파바디라고도 함), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 또는 쿠니츠-타입 프로테아제 억제제 및 탄수화물 결합 모듈 32-2를 추가로 포함한다.
아르마딜로 반복 단백질이라는 용어는 적어도 하나의 아르마딜로 반복을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하며, 여기서 아르마딜로 반복은 헤어핀 구조를 형성하는 한 쌍의 알파 나선을 특징으로 한다.
본 명세서의 맥락에서 용어 인간화 카멜리드(camelid) 항체는 중쇄 또는 중쇄의 가변도메인(VHH 도메인)만으로 구성되며, 인간에서 자연적으로 생성되는 항체와의 유사성을 높이기 위해 아미노산 서열을 변형시킨 항체를 의미하며, 따라서 인간에게 투여 시 감소된 면역원성을 나타낸다. 낙타류 항체를 인간화하기 위한 일반적인 전략은 Vincke et al. "General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold", J Biol Chem. 2009 Jan 30;284(5):3273-3284, 및 US2011165621A1에 나와있다.
본 명세서의 맥락에서, 체크포인트 억제제라는 용어는 면역 세포 활성화, 및 특히 면역 체크포인트 메커니즘, 특히 항체 단편, 디아바디 또는 단일 가변 사슬 항체 단편와 같은 체크포인트 억제제 항체 또는 항체 유사 분자로 당업계에 알려져 있는, T 세포 활성화를 제한하는 억제 신호 캐스케이드를 방해할 수 있는 암 면역치료제를 포함한다. 체크포인트 억제제의 예에는 예를 들어, 항체, 항체 유사 분자, 또는 CTLA-4 (Uniprot P16410), PD-1 (Uniprot Q15116), PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7), B7H3 (CD276; Uniprot Q5ZPR3), VISTA (Uniprot Q9H7M9), TIGIT (UniprotQ495A1), or TIM-3 (HAVCR2, Uniprot Q8TDQ0), CD137 (41BB, Uniprot Q07011), CD40 (Uniprot Q09LL4), CD27 (Uniprot P26841), OX40 (CD134, UniprotP43489), NKG2A (Uniprot P26715), CD86 (Uniprot P42081), CD80 (Uniprot P33681), 또는 LAG-3 (Uniprot P18627)에 특이적으로 결합하는 천연 리간드 수용체가 포함된다.
"암" 및 "악성 종양성 질환"이라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용된다. 본 명세서에 개시된 임의의 측면 및 실시예의 특별한 대안은 고형 종양의 치료에서 본 발명의 조합물의 사용에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 임의의 측면 및 실시예의 다른 대안은 골수성 또는 과립구성 백혈병, 특히 AML, 림프성, 림프구성 또는 림프구성 백혈병 및 림프종, 진성적혈구증가증 또는 적혈구증과 같은 액체 암의 치료에서 본 발명의 조합물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 β2m 결합 파트너가 없는 HLA-B57:01의 위상학적 구조를 보여준다. 돌연변이된 잔기 A46E 및 V97R은 구체로 강조 표시된다. 세포외 도메인의 세 가지 알파 도메인(α1, α2 및 α3)은 표시된 다른 회색 음영으로 색상으로 구분된다.
도 2는 다양한 HLA 분자 (HLA-B57:01: 서열번호 001; HLA-B27:05: 서열번호 007; HLA-B27:06: 서열번호 008; HLA-B58:01: 서열번호 009; HLA-CW08: 서열번호 010; HLA-CW14: 서열번호 011)의 세포외 도메인에 존재하는 글루탐산(E) 및 아르기닌(R) 아미노산이 CHO 시스템에서 일시적 형질감염을 사용한 발현 증가와 상관관계가 있음을 보여준다. HLA-B57에서 A46E 및 V97R의 아미노산 치환이 강조 표시된다.
도 3은 세포 생존력(A)과 발현된 단백질 역가(B)를 기준으로 HLA B57.β2m (DGC8-T39, DGC8-T64, DGC8-73) 및 HLA-B57(A46E/V97R).β2m (DGC8-T54, DGC8-T75, DGC8-91)에 대한 발현 세포 클론의 선택도를 보여준다. 결과는 모든 클론에 대해 비변이 HLA-B57.β2m 세포 생존력과 역가가 HLA-B57(A46E/V97R).β2m 보다 현저히 낮다는 것을 보여준다.
도 4는 (A) HLA-B57과 HLA-B57(A46E/V97R), 그리고 (B) 두 분자를 동시에 발현하는 β2m 클론의 RNA 프로필을 보여준다.
도 5는 정제된 HLA-B57.β2m(iosHv1로 표시) HLA-B57(A46E/V97R).β2m(iosHv2로 표시)의 단백질 수율 겔과 겔 로딩의 요약을 보여준다.
도 6은 3단계로 정제된 HLA-B57 및 HLA-B57(A46E/V97R) 구조물의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로파일을 보여준다. CHO 상등액(A) 친화성 정제(B)에서 두 가지 방법이 다르다. β2m 비결합 형태이성질체 정제는 β2m 제거를 위한 추가 단계로 수행되고, 이어서 SEC(C)가 수행되며, β2m 결합 HLA-B57의 정제는 직접 SEC(D)에 의해 수행된다. 결과는 HLA-B57 β2m-비결합 형태이성질체가 두 구조물 모두에서 정제될 수 있음을 보여준다. HLA-B57.β2m 은 고분자량(HMW) 종과 저분자량(LMW) 종의 양이 많고 단량체 함량이 감소한 반면, HLA-B57(A46E/V97R).β2m 은 HMW, LMW 및 고단량체 함량이 현저히 감소했다.
도 7은 도 6과 같이 제조공정의 각 단계에서 도 6에 표시된 단백질의 관련 수율을 요약한 표이다.
도 8은 HLA-B57 아미노산 치환이 LILRB2에 대한 결합을 증가시키는 것을 보여준다. ELISA 방법에 의해 HLA-B57.no β2m, HLA-B57(A46E/V97R).no β2m과 LILRB2의 결합 친화도를 정량적으로 평가한다. 여기서 HLA-B57.no β2m의 EC50은 21nM이고, HLA-B57(A46E/V97R).no β2m의 EC50은 8.3nM이다.
도 9는 HLA-B57.noβ2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m이 T 세포의 사멸 가능성을 증가시킨다는 것을 보여준다. T 세포를 E:T(효과기 세포:T 세포) 1:1의 비율로 세포 접촉 방식으로 THP-1 AML 세포와 함께 배양하고 화합물로 처리했다. (A)대표적인 세포 펠릿은 도금 후 7일차에 촬영되었다. (B) 적정된 HLA-B57.noβ2m 또는 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m 및 대조군을 사용한 자극 후 5일째에 공동 배양으로부터 얻은 암 세포의 수(유세포 측정법을 사용하여 측정). *P<0.05, **P<0.01 및 ****P<0.0001(다중 비교 보정을 사용한 일원 분산 분석).
도 10은 HLA-B57.noβ2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m이 향상된 식균작용과 관련된 M1 표현형으로 대식세포의 분극을 유도함을 보여준다. 인간 1차 단핵구를 분리하고 HLA-B57.noβ2m 또는 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m 화합물 또는 대조군과 함께 배양하고 M1 및 M2 대식세포에 대한 마커를 유세포 분석을 사용하여 6 내지 7일 후에 평가했다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001(다중 비교 보정을 사용한 일원 분산 분석).
도 11은 HLA-B57.noβ2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m은 암세포의 대식세포 식균작용을 유도한다. 여러 암 세포주(Jurkat T 세포 백혈병, A549 폐암 및 HCT-116 결장암)를 화합물로 6 내지 7일 동안 전처리한 대식세포와 함께 배양하고, 공배양 16시간 후 유세포 분석을 사용하여 식균작용을 평가했다. (A) 대조군과 비교하여 HLA-B57.noβ2m 또는 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m으로 처리 시 암세포의 식균작용을 나타내는 대표적인 유동 세포측정 블롯. (B) 식균작용의 백분율. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001(다중 비교 보정을 사용한 일원 분산 분석).
도 12는 β2m-비결합 HLA-B57(A46E/V97R) 융합 단백질의 단독요법이 C38 쥐 동계 결장암종 모델에서 종양의 크기를 감소시킨다는 것을 보여준다. 개별 동물 및 (A) IgG4 또는 (B) β2m-비결합 HLA-B57(A46E/V97R) IgG4 융합 단백질 치료에 대한 반응을 보여주는 거미줄 도표로서 치료군(n=8)의 종양 부피(mm3). 종양 부피 평균은 양방향 ANOVA에 이어 Bonferroni 사후 분석으로 분석되었다(****p<0.001).
도 13은 표시된 HLA-A30, B57, B58 및 C08 야생형 및 위치 46 및 97에 표시된 아미노산 치환을 갖는 변이체 구조의 IgG Fc 융합으로부터의 재조합 단백질 수율을 보여준다. CHO 세포는 다음의 2개 벡터 구조물로 일시적으로 형질감염되었다: a) Fc 융합 HLA 분자 및 b) 인간 β2m(1:1 비율). 발현된 단백질 역가는 단백질 A 바이오센서를 사용하여 Octet Red96 시스템(Sartorius)을 사용하여 정량화하였다.
도 2는 다양한 HLA 분자 (HLA-B57:01: 서열번호 001; HLA-B27:05: 서열번호 007; HLA-B27:06: 서열번호 008; HLA-B58:01: 서열번호 009; HLA-CW08: 서열번호 010; HLA-CW14: 서열번호 011)의 세포외 도메인에 존재하는 글루탐산(E) 및 아르기닌(R) 아미노산이 CHO 시스템에서 일시적 형질감염을 사용한 발현 증가와 상관관계가 있음을 보여준다. HLA-B57에서 A46E 및 V97R의 아미노산 치환이 강조 표시된다.
도 3은 세포 생존력(A)과 발현된 단백질 역가(B)를 기준으로 HLA B57.β2m (DGC8-T39, DGC8-T64, DGC8-73) 및 HLA-B57(A46E/V97R).β2m (DGC8-T54, DGC8-T75, DGC8-91)에 대한 발현 세포 클론의 선택도를 보여준다. 결과는 모든 클론에 대해 비변이 HLA-B57.β2m 세포 생존력과 역가가 HLA-B57(A46E/V97R).β2m 보다 현저히 낮다는 것을 보여준다.
도 4는 (A) HLA-B57과 HLA-B57(A46E/V97R), 그리고 (B) 두 분자를 동시에 발현하는 β2m 클론의 RNA 프로필을 보여준다.
도 5는 정제된 HLA-B57.β2m(iosHv1로 표시) HLA-B57(A46E/V97R).β2m(iosHv2로 표시)의 단백질 수율 겔과 겔 로딩의 요약을 보여준다.
도 6은 3단계로 정제된 HLA-B57 및 HLA-B57(A46E/V97R) 구조물의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로파일을 보여준다. CHO 상등액(A) 친화성 정제(B)에서 두 가지 방법이 다르다. β2m 비결합 형태이성질체 정제는 β2m 제거를 위한 추가 단계로 수행되고, 이어서 SEC(C)가 수행되며, β2m 결합 HLA-B57의 정제는 직접 SEC(D)에 의해 수행된다. 결과는 HLA-B57 β2m-비결합 형태이성질체가 두 구조물 모두에서 정제될 수 있음을 보여준다. HLA-B57.β2m 은 고분자량(HMW) 종과 저분자량(LMW) 종의 양이 많고 단량체 함량이 감소한 반면, HLA-B57(A46E/V97R).β2m 은 HMW, LMW 및 고단량체 함량이 현저히 감소했다.
도 7은 도 6과 같이 제조공정의 각 단계에서 도 6에 표시된 단백질의 관련 수율을 요약한 표이다.
도 8은 HLA-B57 아미노산 치환이 LILRB2에 대한 결합을 증가시키는 것을 보여준다. ELISA 방법에 의해 HLA-B57.no β2m, HLA-B57(A46E/V97R).no β2m과 LILRB2의 결합 친화도를 정량적으로 평가한다. 여기서 HLA-B57.no β2m의 EC50은 21nM이고, HLA-B57(A46E/V97R).no β2m의 EC50은 8.3nM이다.
도 9는 HLA-B57.noβ2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m이 T 세포의 사멸 가능성을 증가시킨다는 것을 보여준다. T 세포를 E:T(효과기 세포:T 세포) 1:1의 비율로 세포 접촉 방식으로 THP-1 AML 세포와 함께 배양하고 화합물로 처리했다. (A)대표적인 세포 펠릿은 도금 후 7일차에 촬영되었다. (B) 적정된 HLA-B57.noβ2m 또는 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m 및 대조군을 사용한 자극 후 5일째에 공동 배양으로부터 얻은 암 세포의 수(유세포 측정법을 사용하여 측정). *P<0.05, **P<0.01 및 ****P<0.0001(다중 비교 보정을 사용한 일원 분산 분석).
도 10은 HLA-B57.noβ2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m이 향상된 식균작용과 관련된 M1 표현형으로 대식세포의 분극을 유도함을 보여준다. 인간 1차 단핵구를 분리하고 HLA-B57.noβ2m 또는 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m 화합물 또는 대조군과 함께 배양하고 M1 및 M2 대식세포에 대한 마커를 유세포 분석을 사용하여 6 내지 7일 후에 평가했다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001(다중 비교 보정을 사용한 일원 분산 분석).
도 11은 HLA-B57.noβ2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m은 암세포의 대식세포 식균작용을 유도한다. 여러 암 세포주(Jurkat T 세포 백혈병, A549 폐암 및 HCT-116 결장암)를 화합물로 6 내지 7일 동안 전처리한 대식세포와 함께 배양하고, 공배양 16시간 후 유세포 분석을 사용하여 식균작용을 평가했다. (A) 대조군과 비교하여 HLA-B57.noβ2m 또는 HLA-B57(A46E/V97R).noβ2m으로 처리 시 암세포의 식균작용을 나타내는 대표적인 유동 세포측정 블롯. (B) 식균작용의 백분율. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001(다중 비교 보정을 사용한 일원 분산 분석).
도 12는 β2m-비결합 HLA-B57(A46E/V97R) 융합 단백질의 단독요법이 C38 쥐 동계 결장암종 모델에서 종양의 크기를 감소시킨다는 것을 보여준다. 개별 동물 및 (A) IgG4 또는 (B) β2m-비결합 HLA-B57(A46E/V97R) IgG4 융합 단백질 치료에 대한 반응을 보여주는 거미줄 도표로서 치료군(n=8)의 종양 부피(mm3). 종양 부피 평균은 양방향 ANOVA에 이어 Bonferroni 사후 분석으로 분석되었다(****p<0.001).
도 13은 표시된 HLA-A30, B57, B58 및 C08 야생형 및 위치 46 및 97에 표시된 아미노산 치환을 갖는 변이체 구조의 IgG Fc 융합으로부터의 재조합 단백질 수율을 보여준다. CHO 세포는 다음의 2개 벡터 구조물로 일시적으로 형질감염되었다: a) Fc 융합 HLA 분자 및 b) 인간 β2m(1:1 비율). 발현된 단백질 역가는 단백질 A 바이오센서를 사용하여 Octet Red96 시스템(Sartorius)을 사용하여 정량화하였다.
HLA-B57 융합 단백질을 생산하는 개선된 방법
본 발명의 제1 측면은 향상된 포유동물 세포 시스템 발현 특성을 갖는 HLA-B57 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 HLA-B57 융합 단백질은 안정화 폴리펩타이드에 결합된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함한다. 이 방법은 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인에서 특정 아미노산을 변경하여 원하는 면역조절 특성을 유지하지만 안정성이 향상되고 응집체를 형성하는 경향이 적으며 용액에서는 발현 역가가 더 높아 제조가 더 쉬운 변이체를 제공하는 것과 관한 것이다.
일부 실시예에서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은, 안정화 폴리펩타이드에 융합된 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포 외 도메인의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 세포 내에 도입하는 것을 포함하며, 여기서 변이 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드(그러나 유래된 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드가 아닌)는 위치 46에 글루타민산염(E)을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 아미노산 위치 번호는 자연적으로 발생하는 HLA-B57 중쇄의 세포 외 도메인의 초기 glycine (G), serine (S), histidine (H) 모티프를 각각 위치 1, 2 및 3에 할당하여 순차적으로 정의된다. 즉, 분비 신호 펩타이드는 번호 매기기에 포함되지 않는다.
일부 실시예에서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 안정화 폴리펩타이드에 융합된 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인의 변이체를 포함하는 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 이러한 실시예에 따르면, 변이체 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드(그러나 유래된 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드는 아님)는 위치 97의 아르기닌(R)을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 다음과 같은 임의의 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 부분과 동일한 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 코딩한다:
- 전장 세포외 도메인을 포함하고,
- 위치 46의 E 및/또는 위치 97의 R이 특징으로 하지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 제1 단계로서, 임의의 자연 발생, 전장 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 아미노산 치환을 도입하여 위치 46에 E이고, 위치 97에 R인 것을 특징으로 하는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 제공하는 것을 포함하는 HLA 융합 단백질의 제조 방법이다. HLA-B57 서열에 따라, 이는 위치 46에 E(A46E)를 코딩하는 아미노산 치환을 도입하고/하거나 위치 97에 R(V97R 또는 W97R)을 코딩하는 아미노산 치환을 도입하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 안정화 폴리펩타이드에 연결된 상기 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 두 번째 단계를 포함한다.
본 발명의 제1 측면 또는 제2 측면에 따른 HLA 융합 단백질의 제조 방법은 발현 수준을 증가시키기 위해 β2m 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산을 동일한 세포에 도입하는 것과, HLA.β2m으로도 지칭되는 HLA 중쇄/β2m 복합체의 형태로 HLA 융합 단백질을 분비하는 단계를 포함한다. HLA.β2m은 추가로 해리되어 β2m이 결여된 단리된 HLA 분자를 제공할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 및 β2m 폴리펩타이드는 상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어하에 있다. 그런 다음 HLA-B57 및 β2m 코딩 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 세포를 배양하여 HLA.β2m 복합체를 제공한다. 본 발명에 따른 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질은 3:5 내지 7:5, 보다 특히 4:5 내지 6:5의 몰비로 β2m 분자와 회합된다. 즉, HLA 융합 단백질과 β2m 폴리펩타이드가 1:1에 가까운 비율로 존재한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면의 특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드에 연결된 안정화 폴리펩타이드는 Ig Fc 폴리펩타이드다. 보다 특정한 실시예에서, 안정화 펩타이드는 IgG Fc 폴리펩타이드다. 더욱 더 특정한 실시예에서, 안정화 펩타이드는 IgG4 Fc 폴리펩타이드다. 훨씬 더 특정한 실시예에서, 안정화 펩타이드는 서열번호 004의 서열을 갖는 IgG4 Fc 폴리펩타이드다. 본 발명자들이 실행 가능하다고 간주되는 다른 실시 형태에서, 안정화 폴리펩타이드는 소 또는 인간 혈청 알부민과 같은 알부민 폴리펩타이드다. 본 발명자들에 의해 실현 가능하다고 간주되는 다른 실시예에서, 안정화 폴리펩타이드는 PEG 함유 화합물이다.
본 발명에 따른 HLA 중쇄 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, 획득된 HLA 융합 단백질은 융합 단백질의 N'에서 C' 말단으로
i. 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드,
ii. 5 내지 20개 아미노산 길이의 펩타이드 링커, 더욱 특히 서열번호 003의 서열을 갖는 펩타이드 링커, 및
iii. 안정화 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 따른 HLA 중쇄 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질 핵산 서열 및 β2m 핵산 서열은 단일 핵산 벡터 분자 상에(예를 들어, 단일 플라스미드 상에) 존재한다. 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질 핵산 서열 및 β2m 핵산 서열은 서로 다른 핵산 벡터 분자 상에 존재한다(예를 들어, 두 개의 서로 다른 플라스미드로부터 발현됨). 이러한 실시예에서, β2m 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터에 대한 HLA 융합 단백질 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터의 최적 비율은 실시예의 도 3에 설명된 바와 같이 ≥ 1 및 ≤ 2이고, 특히 몰 비율은 > 1 및 < 2이다.
상기 명시된 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 일부 실시예에서, 방법은 다음과 같은 추가 단계를 포함한다:
a. 세포의 상등액으로부터 β2m 단백질과 결합된 HLA 융합 단백질, 즉 HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 정제하는 정제 단계; 및/또는
b. 단리된 HLA 융합 단백질이 단리된 β2m 단백질로부터 분리되는 조건 하에서 정제된 HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 해리시키는 해리 단계.
단계 a는 β2m 단백질과 결합된 HLA 융합 단백질을 제공할 것이고, 단계 b β2m 단백질로부터 단리된 HLA 융합 단백질 - β2m이 없는 폴리펩타이드는 도 12에서 생체 내 투여 시 종양 성장을 길항하는 것으로 입증되었다. 실시예에 제공된 데이터는 본 발명의 이러한 측면에 따른 정제 단계의 예시를 나타내며, 여기서 단백질 G 세파로스(Sepharose)는 β2m 단백질과 결합된 변이체 HLA-B57 융합 단백질(HLA:β2m 또는 HLA 융합 단백질 : β2m 단백질 복합체라고도 함)을 분리하기 위해 pH 2.8 IgG 용출 버퍼로 1차 용출한 후 세포 상등액으로부터 IgG4 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질을 포집하는 데 사용된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따라 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 일부 실시예에서, β2m-비결합 형태이성질체를 제공하기 위해 추가 해리 단계가 수행된다. 이는 예를 들어 HLA 융합 단백질:β2m 단백질 복합체를 산성 조건, 특히 대략 pH 3에 노출시켜 크기 배제 크로마토그래피에 의해 β2m 단백질로부터 β2m-비결합 형태이성질체HLA 융합 단백질을 분리함으로써 달성될 수 있다. 방법의 일부 실시예에서, 방법은 탈염 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 여기서 HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체로부터 β2m이 해리된 후, 정제된 HLA 융합 단백질이 생리학적 pH가 되어 단백질이 올바르게 접힐 수 있게 된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 HLA 융합 단백질을 제조하는 방법의 특정 실시예에서, 변이 HLA-B57 폴리펩타이드의 염기 서열을 형성하는 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 자연 발생 세포 외 도메인은 위치 46에 A를 특징으로 한다. 이러한 실시예는 위치 46이 이미 E인 것을 제외하고 변이체 HLA 중쇄 폴리펩타이드를 생성하기 위한 출발점으로서 임의의 HLA-B57 중쇄의 사용을 포함한다 (예: HLA-B57:16, HLA-B57:45, HLA-B57:51 또는 HLA-B57:69). 즉, 자연 발생 서열로부터 변이체 서열을 얻기 위해, 적어도 하나(A46E), 및 가능하게는 두 개의 아미노산 치환(A46E 및 V97R 또는 W97R 둘 다)이 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인의 표시된 부위에 도입된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 대안적인 실시예에서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인은 위치 97의 V를 특징으로 한다. 이는 위치 97이 이미 R (예: HLA-B57:05, HLA-B57:82, HLA-B57:83, HLA-B57:118 또는 HLA-B57:131)이거나 위치 97이 W(HLA-B57:11)인 경우를 제외하고 모든 HLA-B57 중쇄를 포함한다. 이들 실시예에서, 자연 발생 서열로부터 변이체 서열을 얻기 위해, 적어도 하나(V97R), 및 가능하게는 2개의 아미노산 치환(V97R 및 A46E 둘 다)이 표시된 부위에 도입된다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 대안적인 실시예에서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인은 위치 46의 A, 및 위치 97의 V 또는 W를 특징으로 한다. 즉, 자연 발생 HLA-B57 1배체형(haplotype)은 위치 46이 이미 E인 경우(예: HLA-B57:16, HLA-B57:45, HLA-B57:51, HLA-B57:69) 또는 위치 97이 이미 R(예: HLA-B57:05, HLA-HLA-B57:82, HLA-B57:83, HLA-B57:118 또는 HLA-B57:131)인 경우를 제외한 모든 HLA-B57 중쇄일 수 있다. 이들 실시예에서, 자연 발생 서열로부터 변이체 서열을 얻기 위해, 2개의 아미노산 치환, A46E 및 V97R 또는 W97R이 표시된 부위에 도입되어 변이체 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 대안적인 실시예에서, 2개의 아미노산 치환 A46E 및 V97R은 위치 46의 A와 위치 97의 V를 모두 특징으로 하는 임의의 HLA-B57 세포외 도메인의 자연 발생 폴리펩타이드 서열에 도입된다. 이러한 실시예는 위치 46이 이미 E(예: HLA-B57:16, HLA-B57:45, HLA-B57:51, 또는 HLA-B57:69)인 경우, 또는 위치 97이 이미 R(HLA-B57:05, HLA-B57:82, HLA-B57:83, HLA-B57:118, HLA-B57:131)인 경우, 또는 위치 97이 W(HLA-B57:11)인 경우를 제외한 융합 단백질의 변이체 HLA 폴리펩타이드 도메인을 얻기 위한 출발점으로서 임의의 HLA-B57 1배체형의 사용을 포함한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 추가 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질의 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 부분은 서열번호 002의 서열을 포함한다. 즉, 이러한 실시예에 따른 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법은 β2m 단백질을 코딩하는 핵산, 및 HLA 융합 단백질(IgG4에 결합된 변이체 HLA 중쇄 폴리펩타이드를 포함함)을 코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 위치 46의 E와 위치 97의 R을 코딩하는 아미노산 치환을 제외하고 자연 발생 HLA-B57:01 서열 서열번호 001과 동일하다. 그런 다음 이 세포를 두 단백질의 발현에 적합한 조건에서 배양하여 HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 제공한다.
본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 HLA 융합 단백질을 얻는 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 포유류 세포로부터 분비된 후 발견되는 융합 단백질로서 분비 신호가 결여된 서열 서열번호 015를 포함하는 폴리펩타이드 서열을 코딩한다. HLA 융합 단백질을 얻는 방법의 보다 구체적인 실시예에서, 핵산 서열은 서열 서열번호 005 또는 서열번호 020을 포함하는 HLA 융합 단백질 폴리펩타이드 서열을 암호화하며, 여기서 HLA 융합 폴리펩타이드 서열은 본 발명자들이 세포로부터 HLA 융합 단백질의 효율적인 분비를 촉진하기 위해 발견한 2개의 분비 신호 중 하나가 앞에 위치한다. 본 방법의 보다 구체적인 실시예에서, 핵산은 본질적으로 서열번호 005로 구성된 HLA 폴리펩타이드를 암호화한다.
HLA 융합 단백질을 얻는 방법의 일부 실시예에서, HLA 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 016의 서열을 포함하고, 바람직하게는 분비 신호 서열을 암호화하는 추가 핵산과 결합되어 있다.
HLA 중쇄 융합 단백질을 생산하는 방법의 추가 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질 핵산 서열은 분비 신호를 암호화한다. 보다 더 특정한 실시예에서, 이는 암HLA 호화된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 서열의 N-말단에 위치하는 16 내지 30개 아미노산 길이의 분비 신호를 암호화한다. 보다 더 특정한 실시예에서, HLA 융합 단백질 핵산 서열에 의해 암호화된 분비 신호는 서열번호 019의 서열을 갖는다.
HLA 융합 단백질을 얻는 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 HLA 융합 단백질 앞에 유용한 분비 신호를 암호화하는 서열번호 006을 포함한다. HLA 융합 단백질을 얻는 방법의 보다 특정한 실시예에서, HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 본질적으로 서열번호 006의 서열로 구성된다. HLA 융합 단백질 핵산 서열에 의해 암호화되는 분비 신호는 세포로부터 분비과정 동안 절단에 의해 제거된다.
상기 명시된 HLA 융합 단백질을 얻는 방법의 측면 중 어느 하나의 일부 실시예에서, HLA 융합 단백질을 생산하는 세포는 진핵 세포이다. 특정 실시예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 실시예에서 입증된 바와 같이 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 보다 특정한 실시예에서, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovarian, CHO) 세포가 재조합 융합 단백질 생성물을 발현하는데 사용되지만, 본 발명자들은 곤충 세포와 같은 다른 세포 유형, 또는 특히 다른 포유동물 세포 유형이 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 실현 가능하게 생산할 수 있을 것으로 예측한다.
향상된 고수율 HLA-B57 융합 단백질
본 발명의 다음 측면은 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인과 적어도 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 먼저 포함하는 단리된 HLA 융합 단백질 (변이체 HLA-B57 폴리펩타이드라는 용어의 정의에 따라 지정됨)이다. 상기 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 위치 46이 E이고, 위치 97이 R인 것을 특징으로 하며, 여기서 아미노산 잔기는 세포외 알파 1 도메인의 N-말단 영역에 위치한 G,S,H 모티프로부터 번호가 매겨진다(용어 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드의 정의에서 명시된 바와 같이 아미노산 번호 매기기를 사용함). 둘째, 단리된 HLA 융합 단백질은 안정화 폴리펩타이드, 예를 들어 Ig Fc를 포함한다. 특정 실시예에서, 안정화 폴리펩타이드는 IgG Fc이다. 훨씬 더 특정한 실시예에서, 안정화 펩타이드는 IgG4 Fc이다. 훨씬 더 특정한 실시예에서, 안정화 펩타이드는 서열번호 004로 지정된 폴리펩타이드 서열을 갖는 바람직한 약학적 품질을 갖는 IgG4 Fc이다.
본 발명에 따른 단리된 HLA 융합 단백질의 일부 실시예에서, 이는 HLA-B57 융합 단백질의 생산을 위한 개선된 방법 섹션에 기재된 양상 또는 실시예 중 어느 하나에 따른 방법에 따른 자연 발생 HLA-B57 폴리펩타이드의 세포외 부분에 아미노산 치환을 도입함으로써 얻은 위치 46에 E 및 위치 97에 R을 특징으로 하는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 단리된 HLA 융합 단백질은 서열번호 002를 포함하는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함한다. 보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 단리된 HLA 융합 단백질은 본질적으로 서열번호 002로 명명된 서열로 구성되는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 따른 단리된 HLA-B57 융합 단백질의 추가 특정 실시예에서, 이는 본질적으로 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드와 펩타이드 링커에 의해 연결된 안정화 폴리펩타이드로 구성된다. 특정 실시예에서, 펩타이드 링커의 길이는 5 내지 20개 아미노산이다. 보다 특정한 실시예에서, 이러한 연결 펩타이드 링커는 서열번호 003의 서열을 갖는다.
추가의 특정 실시예에서, 단리된 HLA 융합 단백질은 서열번호 015로 명명된 서열을 포함한다. 더욱 더 특정한 실시예에서, 단리된 HLA 융합 단백질은 본질적으로 서열번호 015로 명명된 서열을 갖는 폴리펩타이드로 구성된다.
단리된 HLA 융합 단백질의 특정 실시예에서, 이는 3:5 내지 7:5, 더욱 특히 4:5 내지 6:5의 몰비로 β2m 분자와 회합된다. 즉, HLA 융합 단백질과 β2m 폴리펩타이드가 1:1에 가까운 비율로 존재한다.
변이체 HLA-B57 폴리펩타이드
전장의 세포외 도메인을 포함하는 모든 자연 발생 HLA-B57 중쇄는 위치 46의 알라닌(A) 및/또는 위치 97의 발린(V) 또는 트립토판(W)을 특징으로 한다. HLA-B57 단백질 계열의 서열은 면역 다형성 데이터베이스의 대립 유전자 리소스에 검색어 "B*57"을 입력하여 검색할 수 있다(IBD, https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html, Robinson J. et al. 2013 Nucleic Acids Res. 41:D1234). 대다수는 위치 46에 A가 있고 위치 97에 V 또는 W가 있는 것이 특징이다. 따라서, 본 발명의 제1 및 제2 측면에 따른 방법은 원래의 단백질 서열에 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 도입하여 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 실시예에 제시된 도면들에서, 본 발명에 따른 이러한 HLA 융합 단백질의 제조는, 먼저 β2m 단백질과 복합체로 IgG4 Fc에 융합된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드의 복합체로서, 및 β2m 단백질에서 단리된 β2m-비결합 형태이성질체 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 IgG4 Fc 융합 단백질로서, 변형되지 않은 HLA-B*57:01 서열을 갖는 다른 동일한 구조와 비교할 때 위치 E46 및 R97의 아미노산 치환에 의해 개선된다.
동족 리간드 상호작동에 필요하지 않은 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 특정 도메인, 세포내 도메인 및 막관통 도메인은 본 발명의 측면 중 어느 하나에 따른 HLA 융합 단백질에는 존재하지 않는다. 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 알파 1, 2, 및 3 도메인을 포함하는 자연 발생 HLA 중쇄 단백질 서열의 세포외 부분의 핵심 구조를 포함하며, 이 부분은 융합 단백질에 표적 세포의 표면 분자와 상호작동하는 능력을 부여한다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 제조하는 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질에 포함된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 자연 발생 HLA 중쇄 단백질의 알파 1, 2 및 3 도메인을 포함하며, 이들 영역은 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질의 면역 조절 효과를 매개하는 수용체 리간드 상호작동에 필수적인 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 보다 구체적인 실시예에서, 때때로 "연결 펩타이드"로 주석이 달리거나 언급되는 막관통 도메인 앞의 HLA-B57 영역 내에서, 세포외 도메인의 트레오닌-발린-프롤린 잔기가 앞에 있는 C-말단 이소류신-발린 디펩타이드를 제외한 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 단백질은 자연 발생 HLA 중쇄 단백질의 알파 1, 2 및 3 도메인이다.
구조적 데이터에 따르면 HLA-B57은 막관통 영역에서 멀리 떨어진 영역을 통해 킬러 면역글로불린 유사 수용체(Killer immunoglobulin-like receptors, KIR) 및 백혈구 면역글로불린 유사 수용체(leukocyte immunoglobulin-like receptors, LILR)와 같은 리간드와 상호작동하는 것으로 나타났다. 막에 가까운 아미노산은 일반적으로 수용체와 상호작동하지 않는다. 또한, 본 발명자들은 전 문단에 명시된 자연 발생 HLA 중쇄 서열의 세포 외 도메인의 5 C-말단 아미노 내에 소수성 아미노산의 높은 함량이 단백질 응집 경향과 같은 재조합 융합 단백질에 바람직하지 않은 특성을 도입하여 다운스트림 생산 공정에서 생산, 정제, 안정성 및 독성에 영향을 미칠 수 있다고 추측한다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드는 HLA-B*57:01내지 HLA-B*57:141까지의 임의의 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인 폴리펩타이드로부터 유래된다(완전한 세포외 도메인 서열이 결여된 잘린 대립유전자는 제외). 세포외 도메인의 위치 46(G,S,H 모티브부터 계산)을 E로 하고, 위치 97의 아미노산을 R로 하는 자연 발생 폴리펩타이드의 아미노산 치환은 본 발명에 따른 변이체 HLA 중쇄 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 제공한다. 서열번호 001 외에, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드라는 용어의 정의에서 명시된 바와 같이 폴리펩타이드의 세포외 부분의 필수 알파 1, 2, 및 3 도메인을 포함하는 적합한 자연 발생 HLA-B57 중쇄 단백질 서열은 본 발명에 따른 변이체 HLA-B57폴리펩타이드 또는 HLA 융합 단백질을 구성하기 위한 출발점 역할을 할 수 있으며 공개 서열 저장소에서 찾을 수 있다. 이들은 EMBL-EBI 실험실의 IPD 데이터베이스에서 검색할 수 있는 다음 표의 첫 번째 열에 있는 HLA-B57 중쇄에서 선택되지만 이에 제한되지 않는 서열이 포함된다(용어 및 정의 섹션의 HLA-B57 용어 정의에 인용됨):
| Allele | Source |
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| B57:141 | https://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/imgt/hla/get_allele.cgi?B*57:141 |
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 다른 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는, 위치 46에 E 및 위치 97에 R을 특징으로 하는 것을 제외하고는, "연결 펩타이드" 영역(세포외 도메인 다음에 있고 막관통 앞에 있는 HLA-B57 중쇄 영역) 앞에서 절단된 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인과 동일하다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 또는 변이체 HLA-B57 융합 단백질은 분비 신호, 예를 들어, 신호 펩타이드로 주석이 달린 대부분의 자연 발생 HLA-B57 폴리펩타이드에 존재하는 초기 24개 아미노산, 또는 효율적인 HLA 융합 단백질 분비를 위해 설계된 대체 분비 신호(예: 서열번호 019)를 추가로 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 또는 변이체 HLA-B57 융합 단백질의 특정 실시예에서, 천연 HLA-B57 단백질 서열의 세포외 도메인의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인에 대한 C-말단, 알파 3 도메인을 막관통 도메인과 연결하는 HLA-B57 "연결 펩타이드" 영역의 초기 6개 잔기는 HLA-B57 폴리펩타이드의 대부분의 자연 발생 전장 변이체에서 발견되는 것으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 상기 특정된 천연 HLA-B57 폴리펩타이드 서열의 세포외 도메인에 아미노산 변형을 도입함으로써 얻을 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어에서 상기 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 HLA-B57 리간드와의 상호작동에 필요한 천연 HLA-B57 폴리펩타이드 서열의 세포외 도메인 부분의 변이체로 구성되거나 이를 포함하며, 특히 적어도 자연 발생 HLA-B57 단백질 서열의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 다음을 추가로 특징으로 한다:
- 아미노산 잔기 위치 46에 글루타메이트(E), 및
- 아미노산 잔기 위치 97에 아르기닌(R).
본 명세서에 사용된 HLA-B57에 대한 아미노산 넘버링은 변이체의 세포외 도메인의 초기 G,S,H 모티프 또는 서열번호 001의 서열을 갖는 자연 발생 HLA-B57 중쇄를 위치에 각각 1, 2, 및 3을 할당함으로써 순차적으로 정의된다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 선택적으로 다음을 추가로 포함한다:
- 분비 신호, 예를 들어 신호 펩타이드로 주석이 달린 대부분의 자연 발생 HLA-B57 폴리펩타이드에 존재하는 초기 24개 아미노산, 또는 효율적인 HLA 융합 단백질 분비를 위해 고안된 대체 분비 신호(예: 서열번호 019), 및/ 또는
- 자연 발생 HLA-B57 단백질 서열의 변이체 세포외 도메인의 알파 1, 알파 2 및 알파 3 도메인에 대한 C-말단, 알파 3 도메인을 막관통 도메인에 연결하고 자연 발생 전장 HLA-B57 폴리펩타이드에 존재하는 HLA-B57 "연결 펩타이드" 영역의 초기 6개 잔기.
본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드에는 다음이 결여되어 있거나 이의 핵산 서열이 다음을 암호화하지 않는다:
- 막관통 도메인, 및
- 자연 발생 HLA-B57 단백질 서열의 세포내 도메인.
특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드가 결여되어 있거나, 이의 핵산 서열이 마지막 3 내지 11개 잔기, 특히 알파 3 도메인과 막관통 도메인을 결합하는 대부분의 전장 천연 HLA-B57 단백질 서열에 존재하는 세포외 도메인의 "연결 펩타이드" 영역의 마지막 5개 잔기를 암호화하지 않는다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 "연결 펩타이드"의 최소 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 잔기 앞에서 절단된 전장 세포외 도메인을 포함하는 임의의 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인과 동일하고, 또한 46번 위치에 E가 있고 97번 위치에 R이 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 보다 특별한 실시예에서, 변이체 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드는 전장 세포외 도메인을 포함하는 임의의 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 도메인과 동일하지만 "연결 펩타이드" 영역의 5개 C-말단 아미노산 잔기가 결여되어 있고, 또한 위치 46에 E가 있고 위치 97에 R이 있는 것을 특징으로 한다.
특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 6번 위치에 E가 있고 97번 위치에 R이 있는 것을 제외하고는, 세포외 도메인의 알파 1 도메인의 GSH 모티프로부터 계산하여 임의의 자연 발생 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드의 세포외 부분을 코딩하는 초기 280개 아미노산과 동일하다.
본 발명에 따른 단리된 HLA 융합 단백질의 대안적인 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 하나의 상이한 아미노산 잔기를 제외하고는(여기서, 하나의 상이한 아미노산 잔기는 위치 46 또는 97이 아님), 위치 46에 E가 있고 위치 97에 R이 있는 것을 특징으로 하는 자연 발생 HLA-B57 폴리펩타이드 변이체의 세포외 도메인과 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 002를 포함한다. 즉, 위치 46 및/또는 97에서 하나, 또는 어떤 경우에 2개의 아미노산 치환에 더하여, 본 실시예에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 그것이 유래된 자연 발생 HLA-B57 분자와 비교하여 적어도 하나의 추가 아미노산 치환을 포함한다. 이 실시예에 따르면, 생성된 HLA 융합 단백질은 본 발명에 따른 단리된 HLA 융합 단백질의 모든 이전 실시예와 적어도 유사하거나 개선된 생물학적 기능을 갖는다. 구체적으로, HLA 융합 단백질의 기능은 본 명세서의 실시예에서 입증된 수단 및 방법, 즉 위치 46 및 97에 아미노산 치환이 결여된 유사한 구조물과 비교하여 특성화될 수 있다(A46 및 V97/W97이 특징). HLA 융합 단백질은 포유류 세포의 상등액에서 측정된 재조합 HLA 융합 단백질 역가가 동등한 대조군 HLA 융합 단백질과 비교하여 적어도 2배 이상 증가하는 것을 특징으로 하며, 즉, A46 및 V97/W97을 특징으로 하는 HLA 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 비해 역가가 증가하고 추가적인 변이 변형이 없는 것을 특징으로 한다(도 7에 요약되어 있음). 중요하게도, 위치 46 및 97 이외의 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드에 대한 추가 돌연변이를 포함하는 변이체는 또한 야생형 HLA-B57 서열을 포함하는 가용성 HLA 중쇄의 유리한 면역원성 특성을 유지해야 한다. 이는 β2m이 결여된 변이체 HLA-Fc 구조물의 LILRB2에 대한 결합을 측정하여 확인할 수 있으며, 실시예 8의 도 8에서 야생형 HLA-B57 기반 융합 단백질에 대해 입증된 바와 같이 약 21nM 이하(≤)의 EC50을 특징으로 하는 결합을 확인함으로써 확인할 수 있다.
실시예에 제시된 도 2 및 도 7의 데이터는 A46E 및 V97R을 보유하는 다양한 HLA 중쇄 구조물이 자연 발생 HLA-B57 폴리펩타이드와 비교할 때 세포주에 의한 HLA 중쇄 발현의 더 높은 수율과 상관관계가 있음을 보여준다. 도 3 내지 도 7은 천연 HLA-B57:01(서열번호 001) 중쇄 폴리펩타이드의 세포 외 부분에서 두 개의 아미노산(A46E 및 V97R)을 변경하면 수율이 크게 향상되고 HLA Ig Fc 융합 단백질과 복합된 β2m(HLA-B57(A46E, V97R).β2m) 및 또한 β2m이 결여된 HLA-B57(A46E, V97R) β2m-비결합 형태이성질체(HLA-B57(A46E, V97R).noβ2m)의 응집이 감소됨을 보여준다. 아미노산 치환은 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질의 HLPC 분석에서 단일 피크의 우세로 나타나는 바와 같이 세포 생존력, 생산 역가를 증가시키고 고분자량 및 저분자량 종을 감소시킨다. 중요하게도, 이러한 아미노산 치환은 HLA β2m 비결합 형태이성질체(HLA-B57(A46E, V97R).noβ2m)의 LILRB2에 대한 결합(도 8)이나, HLA-B57(A46E, V97R).noβ2m)이 CD8 T 세포의 살해 가능성 또는 M1 대식세포의 분극화 또는 식균작용 능력을 증가시키는 능력을 손상시키지 않는다(도 9 내지 11). 이는 위치 46과 97이 생성된 HLA 융합 단백질의 면역조절 특성을 손상시키지 않는다는 것을 확인시켜 준다. 추가적으로, β2m-해리된 HLA-B57(A46E, V97R).noβ2m 은 결장암 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 입증된 바와 같이 강력한 면역조절 효과 및 항암 치료 효능을 갖는다(도 12).
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA를 생산하는 방법의 특정 실시예에서, 변이체 HLA 융합 단백질로부터 유래된 β2m-비결합 형태이성질체는 그것이 유래된 자연 발생 HLA 중쇄 펩타이드를 포함하는 동등한 화합물에 비해 LILRB2(UniProt Q8N423)에 대한 향상된 결합을 갖는다. 즉, LILRB2와 HLA-B57(A46E, V97R) 융합 단백질의 결합 포화는 이것이 유래된 자연 발생 HLA 중쇄 펩타이드를 포함하는 동등한 구조물과 비교하여 더 낮은 농도에서 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 LILRB2 결합 포화는 특히 HLA 융합 단백질이 고정된 비오티닐화 LILRB2에 적정되고 항-Ig 2차 항체로 검출되는 효소 결합 면역검정을 사용한 측정을 의미한다. 다른 특정 실시예에서, β2m-비결합 형태이성질체 HLA 융합 단백질에 통합된 상기 변이체 HLA 중쇄는 약 21nM 이하(≤), 특히 ≤ 약 15nM, 더 특히는 ≤ 10nM의 EC50으로 LILRB2 수용체에 결합하고, 이는 LILRB2 결합 포화도가 약 2배 이상 증가했음을 나타낸다.
펩타이드 안정화 및 연결
방법의 임의의 측면에 따른 HLA 융합 단백질 또는 상기 명시된 본 발명에 따른 단리된 HLA 융합 단백질은 융합 단백질의 HLA-B57 부분에 발현 및 정제 동안 안정성을 부여하는 추가적인 폴리펩타이드를 포함한다. HLA 융합 단백질의 안정화 부분의 존재는 HLA 융합 단백질의 분해 및 올리고머화를 감소시킬 뿐만 아니라 융합 단백질을 발현하는 세포의 생존력을 증가시킴으로써 수율 및 용해도를 증가시킨다.
HLA 융합 단백질, 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질의 안정화 폴리펩타이드는 인간 Ig Fc 폴리펩타이드이다. 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질의 안정화 펩타이드는 이소형 IgG Fc이다. IgG Fc 안정화 펩타이드 도메인은 단백질 A 또는 G 코팅 표면에 흡수되도록 하여 HLA 융합 단백질을 정제하는 동안 추가적인 이점을 제공한다. Fc 부분은 또한 생체내에서 분자의 생체내 반감기를 연장할 수 있다. 본 발명자들은 Ig Fc 대신 기능성 HLA 폴리펩타이드에 부착되면 소 혈청 알부민일 수 있는 유사한 이점을 제공할 수 있는 가능한 대안을 고려한다. 본 발명자들의 이전 연구는 소 혈청 알부민과 같은 알부민 분자가 또한 안정화 폴리펩타이드로서 역할을 할 수 있다는 것을 확립하였다. 페길화(PEGylation)는 순환 중인 단백질의 반감기를 향상시킬 수 있으며, 따라서 또 다른 실현 가능한 안정화 폴리펩타이드라는 것도 알려져 있다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질은 IgG4 폴리펩타이드를 포함한다. 보다 특정한 실시예에서, HLA 융합 단백질은 서열번호 004인 서열을 갖는 변형된 IgG4 S228P.dk 분자를 포함한다. 이는 원래 IgG4 항체의 228번 위치에서 프롤린(P)이 세린(S)으로 치환된 IgG4 힌지 영역의 돌연변이가 특징이며, dK는 원래 IgG4 서열에서 마지막 아미노산인 라이신(K)이 결실되었음을 나타낸다. 이러한 변화는 IgG4 형식의 안정성을 제공하고 이질성을 줄인다. 두 가지 변화 모두 잘 확립되어 있으며 다양한 Fc 구조물에서 일반적으로 사용된다.
특정 실시예에서, 단리된 HLA 융합 단백질은 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체이고, 다른 단량체의 각각의 단량체는 독립적으로 Ig Fc 부분에 융합된 HLA 중쇄 폴리펩타이드를 포함하며, 이의 후자는 이황화 결합을 통해 결합될 수 있다.
HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 특정 실시예에서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 아미노산 5, 10, 15, 20 또는 심지어 50개 잔기 길이의 짧은 서열인 펩타이드 링커에 의해 단일 폴리펩타이드 사슬의 일부로서 IgG 폴리펩타이드와 연결된다. 특정 실시예에서, 펩타이드 링커는 세린 및 글리신 잔기가 풍부한 비면역원성 서열이다. 보다 특정한 실시예에서, 펩타이드 링커는 서열번호 003의 서열을 갖는다.
인간 세포의 소포체에서 발현되는 천연 HLA 분자는 수송을 거쳐 세포 표면에 표시되기 전에 펩타이드 에피토프와 결합한다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 특정 실시예에서, HLA 폴리펩타이드는 펩타이드 에피토프와 결합되지 않는다. 즉, HLA 폴리펩타이드의 알파 1 및 알파 2 도메인에 의해 형성된 항원 결합 홈 또는 항원 결합 틈은 작은 항원성 펩타이드에 결합되지 않는다. HLA 클래스 분자에 대한 펩타이드의 결합은 형태를 변화시키는 것으로 생각되며, 이는 LILRB1 및 LILRB2와 같은 결합 파트너와의 상호 작동에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 에피토프와 더 이상 결합되지 않은 본 발명에 따른 B2m 폴리펩타이드와 결합된 HLA-B57 폴리펩타이드의 결합 친화도 및 면역조절 효과는 예를 들어 도 12에서 입증된다.
본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법의 대안적인 실시예에서, HLA 융합 단백질은 추가적으로 펩타이드 에피토프 단편을 포함한다.
핵산
본 발명의 또 다른 측면은 위에 언급된 본 발명의 측면 또는 실시예 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공하며, 여기서 HLA 융합 단백질의 암호화된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 부분은 E46 및 R97을 특징으로 한다. 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 서열번호 016의 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 핵산은 또한 HLA 융합 단백질의 효율적인 정제를 가능하게 하기 위해 세포의 분비를 허용하는 분비 신호를 코딩한다. 다른 특정 실시예에서, 단리된 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 분비 신호를 추가로 코딩하는 서열번호 006으로 지정된 서열을 포함한다. 보다 특정한 실시 형태에서, 이는 본질적으로 서열번호 006으로 구성된다.
본 발명의 추가 측면은 상기 특정된 핵산을 포함하는 핵산 발현 벡터 및 세포에서 작동가능한 프로모터 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 프로모터는 진핵 세포에서의 발현에 적합하다. 보다 특정한 실시예에서, 포유동물 세포에 대한 프로모터가 사용된다.
본 발명의 추가 측면은 본 발명의 임의의 이전 측면에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 세포이다. 본 발명의 이들 측면은 HLA 융합 단백질을 위한 DNA 또는 RNA 기반 전달 시스템, 또는 HLA 융합 단백질을 발현하는 세포의 전달을 포함한다.
약학 조성물 및 투여
실시예에 제시된 데이터는 표적 아미노산 치환에 의해 HLA-B*57:01 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 A46 및 V97이 E46 및 R97로 치환된 본 발명에 따른 변이 HLA 융합 단백질이 LILRB2에 결합하여 CD8 T 세포의 살상 능력을 증가시키고 생체 내에서 항종양 면역 반응을 유발한다는 것을 보여준다. 본 발명에 의해 제공되는 변이 HLA-B57 폴리펩타이드의 아미노산 치환은 분자의 면역 조절 효과, 즉 T 세포 사멸, 대식세포 활성화 및 식균 작동 및 생체 내 치료 효능을 유지하면서 상기 변이 HLA-B57 폴리펩타이드를 포함하는 결과 HLA 융합 단백질의 수율을 증가시킨다는 점에서 유리하다(도 9 내지 도 12).
본 발명의 일 측면은 악성 종양 질환의 치료에 사용하기 위해, 본 명세서에 기재된 바와 같이 HLA 융합 단백질 또는 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 중 적어도 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 본 명세서에 기술된 것과 같은 적어도 2개의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
특정 실시예에서, 약학적 HLA 융합 단백질 제제가 사용되는 악성 종양 질환은 고형암이다. 보다 특정한 실시예에서, 고형암은 폐암 또는 전이성 폐암이다. 다른 특정 실시예에서, 암은 결장직장암 또는 전이성 결장암 형태이다.
다른 특정 실시예에서, 약학적 HLA 융합 단백질 제형은 혈액 세포 유래 암을 치료하는데 사용된다. 보다 특정한 실시예에서, 이는 T 세포 백혈병을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 HLA 융합 단백질은 일반적으로 쉽게 제어할 수 있는 약물 용량을 제공하고 환자에게 우아하고 쉽게 취급할 수 있는 제품을 제공하기 위해 약학적 투여형으로 제형화된다.
본 발명의 HLA 융합 단백질의 투여 요법은 특정 치료제의 약력학적 특성 및 투여 방식 및 경로, 수용자의 종, 연령, 성별, 건강, 의학적 상태 및 체중, 증상의 성격 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 투여 경로, 환자의 신장 및 간 기능 및 원하는 효과와 같은 공지된 요인에 따라 달라질 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명의 HLA 융합 단백질은 1일 1회 투여하거나, 1일 총 투여량을 1일 2회, 3회 또는 4회로 분할하여 투여할 수 있다.
약학 조성물을 제조하기 위한 많은 절차 및 방법이 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, L. Lachman et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 4th Ed, 2013 (ISBN 8123922892)참조.
병용 치료제(Combination medicaments)
본 발명의 또 다른 측면은 체크포인트 억제제와 조합하여 투여하기 위해 제제화된, 본 발명에 따른 변이체 HLA 융합 단백질, 또는 상기 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명자들은 이전에 체크포인트 억제제의 효과를 향상시키는 HLA-B57 IgG4 융합 단백질 화합물을 발견했으며, 이 분자가 예시에서 테스트한 시험관 내 분석에서 유사한 면역 조절 작동을 보였기 때문에 변이체 HLA-B57 중쇄 폴리펩타이드를 기반으로 하는 유사한 분자가 병용 투여될 때 유사한 효과를 제공할 것으로 예상한다.
본 발명의 또 다른 측면은 HLA 융합 단백질, 핵산, 또는 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 벡터와 조합하여 투여하기 위해 제제화된 악성 종양 질환 치료에 사용하기 위한 체크포인트 억제제이다.
본 발명에 따른 체크포인트 억제제는 면역 세포 활성화, 특히 T 세포 활성화를 제한하는 억제 신호 전달 계통을 파괴할 수 있다. 특정 실시예에서, 체크포인트 억제제는 10-7 mol/L 이하(더 높은 선호도)의 해리 상수로 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 중 하나에 결합할 수 있는 항체 단편 또는 항체 유사 분자이다.
본 명세서의 맥락에서, 해리 상수(K D )라는 용어는 화학 및 물리학 기술에서 알려진 의미로 사용되며, 이는 [대부분 두 개의] 상이한 성분으로 구성된 복합체가 그 구성 성분으로 가역적으로 해리되는 성향을 측정하는 평형 상수를 지칭한다. 복합체는 예를 들어 항체 Ab와 항원 Ag로 구성된 항체-항원 복합체 AbAg가 될 수 있다. KD는 몰 농도[mol/L]로 표시되며, [Ag]의 결합 부위의 절반을 차지하는 [Ab]의 농도, 즉 결합되지 않은 [Ab]의 농도는 [AbAg] 복합체의 농도와 같다. 해리 상수는 다음 공식에 따라 계산할 수 있다:
[Ab]: 항체 농도; [Ag]: 항원 농도; [AbAg]: 항체-항원 복합체 농도
특히, 체크포인트 억제제는 비작동제 CTLA-4 리간드, 비작동제 PD-1 리간드, 비작동제 PD-L1 리간드 또는 비작동제 PD-L2 리간드로서, T 세포의 표면에서 각각 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 결합할 때 T 세포 활성을 약화시키지 않는다. 특정 실시예에서, 본 발명에 사용되는 비-작동제 CTLA-4 리간드는 CTLA-4에 결합될 때, CTLA-4와 그 결합 파트너 CD80 및/또는 CD86의 상호작동을 입체적으로 차단할 수 있고, 본 발명에 사용되는 비-작동제 PD-1 리간드는 PD-1에 결합될 때, PD-1과 그 결합 파트너 PD-L1 및/또는 PD-L2의 상호작동을 입체적으로 차단할 수 있다.
특정 실시예에서, 체크포인트 억제제는 해리 상수가 10-7 mol/L, 특히 10-8 mol/L 또는 심지어 10-9 mol/L인 CTLA-4에 결합하는 능력을 통해 억제 신호 캐스케이드를 방해하며, 이는 KD 값으로 표현되는 최소 친화도를 나타내며, 각각의 표적의 생물학적 활성을 억제한다. 본 발명의 의미에서 비작동제 PD-1 리간드 또는 비작동제 PD-L1(PD-L2) 리간드는 해리 상수가 적어도 10-7 mol/L, 특히 10-8 mol/L 또는 심지어 10-9 mol/L 이하인 PD-1(PD-L1, PD-L2)에 결합할 수 있고, 각각의 표적의 생물학적 활성을 억제하는 분자를 지칭한다. 특정 실시예에서, 체크포인트 억제제는 항체, 특히 PD-1에 특이적인 항체이며, PD-L1과의 상호작동을 억제하여 T 세포 반응을 향상시키는 항체이다.
병용 치료를 위한 약학 조성물의 특정 실시예에서, 체크포인트 억제제는 임상적으로 이용가능한 항체 약물인 이필리무맙(ipilimumab, Bristol-Myers Squibb; CAS No. 477202-00-9), 트레멜리무맙(tremelimumab, CAS 745013-59-6), 니볼루맙(nivolumab, Bristol-Myers Squibb; CAS No 946414-94-4), 펨브롤리주맙(pembrolizumab, Merck Inc.; CAS No. 1374853-91-4), 피딜리주맙(pidilizumab, CAS No. 1036730-42-3), 아테졸리주맙(atezolizumab, Roche AG; CAS No. 1380723-44-3), 아벨루맙(avelumab, Merck KGaA; CAS No. 1537032-82-8), 더발루맙(durvalumab, Astra Zeneca, CAS No. 1428935-60-7), 및 세미플리맙(cemiplimab, Sanofi Aventis; CAS No. 1801342-60-8)으로부터 선택된 체크포인트 억제제 항체이다
특정 실시예에서, 체크포인트 억제제는 4-1BB 단백질에 대한 특이적 결합을 특징으로 한다. 특정 실시예에서, 체크포인트 억제제는 유토미루맙(utomilumab, CAS 번호 1417318-27-4) 또는 우레루맙(urelumab, CAS 번호 934823-49-1)으로부터 선택된 임상적으로 이용가능한 항체 약물이다.
WO 2017153438 A1의 발명자들에 의한 이전 개시는 가용성 HLA 중쇄 펩타이드가 다중 종양 모델 단독에서 또는 PD-1, PD-L1 및 4-1BB에 대한 특이적 결합을 특징으로 하는 체크포인트 억제제와 쌍을 이룰 때 종양 부담을 감소시킨다는 것을 보여준다.
항체 단편은 Fab 도메인 또는 항체의 가변 단편(Fv) 도메인일 수도 있고, 단일 사슬 항체 단편(항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역이 펩타이드 링커로 연결된 융합 단백질)일 수도 있다. 억제제는 중쇄 또는 경쇄로부터 단리된 가변 도메인으로 구성된 단일 도메인 항체일 수도 있다. 추가적으로, 항체는 낙타류에서 발견되는 항체와 같은 중쇄로만 구성된 중쇄 항체일 수도 있다. 항체 유사 분자는 설계된 안키린 반복 단백질(Molecular Partners, Zurich)과 같은 반복 단백질일 수 있다.
특정 실시예에서, 병용 요법은 두 가지 상이한 제형을 포함하는데, 예를 들어, 상기 HLA 융합 단백질은 종양 내 전달을 위한 제형으로 제공되거나, 예를 들어 피하 주사 또는 고형 종양으로의 종양 내 주사에 의한 종양 부근의 국소 전달을 위한 제형으로 제공되고, 상기 체크포인트 억제제는 전신 전달, 특히 정맥 주사에 의한 전신 전달을 위한 제형으로 제공된다. 그러나, 상기 체크포인트 억제제 및 상기 HLA 융합 단백질은 또한 두 가지 유사한 제형으로 전달될 수 있다.
병용 투여는 체크포인트 억제제와 HLA 융합 단백질을 함께 또는 별도의 제형으로 동시 투여하거나, 한 물질의 투여 직전, 예를 들어 두 번째 물질의 투여 직전 또는 직후, 예를 들어 그 다음 주에 한 물질을 투여하는 것을 모두 포함한다. 일부 실시예에서, 2개의 제제를 조합하여 투여하는 것은 제2 제제 이전, 특히 1개월 전에 하나의 제제를 투여하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, 1초는 제1 제제 이후, 특히 몇 주 또는 몇 달 후에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 체크포인트 억제제 및 HLA 융합 단백질은 중복 투여 방식으로 투여된다.
본 발명은 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질 및 체크포인트 억제제를 포함하는 약학 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명은 최근 체크포인트 억제제를 투여받았거나 투여 예정인 환자를 치료하는데 사용하기 위한 HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 추가로 포함한다.
본 발명은 최근에 HLA 융합 단백질을 투여받았거나 투여 예정인 환자를 치료하는 데 사용하기 위한 체크포인트 억제제를 포함하는 약학 조성물을 추가로 포함한다.
의학적 치료, 제형, 제조방법
특정 측면 및 실시예에서, 본 발명에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 다양한 형태의 암을 치료하는데 사용하기 위해 제공된다.
HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물의 특정 실시예에서, 이는 일종의 액상암 또는 혈액암을 치료하는 데 사용하기 위해 제공된다. 본 발명자들은 특징적인 T 세포 고갈 및 T 세포에 대한 순환 혈액암 세포의 접근성을 고려하고, 본 발명에 따른 약학 조성물에 의해 유도된 대식세포 활성화는 이러한 조합이 효과적일 가능성이 있음을 의미한다. 특정한 그러한 실시예에서, 본 명세서에서 저캇(Jurkat) 세포로 모델링된 바와 같이, T 세포 백혈병으로 진단된 환자에서 사용하기 위해 약학 조성물이 제공된다. 다른 특정 실시예에서, THP-1 AML 세포주에 의해 모델링된 바와 같이, 다발성 골수종으로 진단된 환자에서 사용하기 위해 약학 조성물이 제공된다.
다른 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 고형암 또는 고형암의 전이로 진단된 환자에게 사용하기 위해 제공된다. 일부 특정 실시예에서, 약학 조성물은 폐암으로 진단된 환자에게 사용하기 위한 것이다. 특정 실시예에서, 폐암은 비소세포 폐암의 한 형태이다. 다른 특정 실시예에서, 폐암은 소세포 폐암 또는 암종의 형태이다. 다른 특정 실시예에서, HLA 융합 단백질 또는 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 약학 조성물은 결장암으로 진단된 환자에게 사용하기 위한 것이다. 특정 실시예에서, 전이성 결장암.
체크포인트 억제제 외에 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 관한 본 발명의 측면의 일부 실시예에서, 이는 체크포인트 억제 요법이 단독요법 또는 병용요법에 대해 승인된 악성 질환 또는 암의 형태에 사용하기 위해 제공된다. 특정 실시예에서, 병용 치료는 결장암, 특히 전이성 결장암 환자에게 사용하기 위한 것이다. 다른 특정 실시예에서, 암은 흑색종이다. 추가의 특정 실시예에서, 암은 췌장암이다. 추가의 특정 실시예에서, 암은 유방암이다.
본 발명은 추가적인 대안적 측면으로서, 암의 치료 또는 재발 방지를 위한 의약품의 제조 방법에 사용하기 위한, 상술한 바와 같이 HLA 융합 단백질 또는 HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물의 사용을 더 포함한다. 또 다른 대안적인 측면은 상기 상세히 명시된 HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여함으로써 악성 종양 질환의 형태로 진단된 환자를 치료하는 방법이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물과 체크포인트 억제제를 포함하는 약학 조성물을 암 환자에게 공동 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 체크포인트 억제제를 포함하는 약학 조성물을 이미 투여받은 환자에게 본 발명에 따른 HLA 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
투여 형태는 피하, 정맥내, 간내 또는 근육내 주사 형태와 같은 비경구 투여용일 수 있다. 선택적으로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제가 존재할 수 있다.
본 발명은 다음 항목을 추가로 포함한다:
A. 자연 발생 HLA-B57 중쇄에 아미노산 치환을 도입하여 얻은 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은:
a. 변이체 HLA-B57 중쇄는 위치 46에 E가 있고 위치 97에 R이 있고, 위치 번호는 서열번호 001을 갖는 HLA-B57:01 중쇄의 GSH 모티프를 위치 1, 2 및 3로 각각 할당함으로써 순차적으로 정의되는, 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 HLA 핵산 서열, 및
b. β2m 단백질을 코딩하는 β2m 핵산 서열을 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포 내로 도입하는 것을 포함하고,
모두 상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 있으며, HLA 및 β2m 코딩 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 세포를 인큐베이션하여 HLA 중쇄/β2m 복합체를 제공하는, 방법.
B. 자연 발생 HLA-B57 중쇄에 아미노산 치환을 도입하여 얻은 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은:
a. 다음을 포함하는 HLA 융합 단백질:
i. 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 위치 46의 E 및 위치 97의 R(항목 A에 명시된 바와 같음)을 특징으로 하는, 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포외 도메인의 변이체;
ii. 안정화 폴리펩타이드, 특히 IgG Fc를 포함하는 안정화 펩타이드, 더욱 특히 IgG4 Fc를 포함하는 안정화 폴리펩타이드; 및
b. β2m 핵산 서열;을 코딩하는 핵산 서열을 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포 내로 도입하는 것을 포함하고;
상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 있으며, HLA-B 융합 단백질 및 β2m-암호화 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 세포를 인큐베이션하여 HLA 중쇄/β2m 복합체를 제공하는, 방법.
C. HLA 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은:
a. 아미노산 잔기는 항목 A에 명시된 바와 같이 번호가 매겨져 있는, HLA-B57 중쇄의 자연 발생 세포외 도메인에 아미노산 변화를 도입하여 위치 46의 E 및/또는 위치 97의 R을 특징으로 하는 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 제공하는 아미노산 치환 단계;
b. 발현 단계에서:
i. a.에 따른 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 및 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질, 및
ii. β2m 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고,
모두 상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 있으며, HLA-B57 및 β2m-암호화 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 세포를 인큐베이션하여 HLA 중쇄/β2m 복합체를 제공하는, 방법.
D. 항목 A 내지 C 중 어느 하나에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄가 위치 46의 A 및/또는 위치 97의 V 또는 W를 특징으로 하는 방법.
E. 항목 A 내지 C 중 어느 하나에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄가 위치 46의 E 및 위치 97의 R을 이미 특징으로 하지 않는 방법.
F. 항목 A 내지 E 중 어느 하나에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄는 위치 46에 A가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
G. 항목 A 내지 F 중 어느 하나에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄가 위치 97에 V가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
H. 항목 A 내지 G 중 어느 하나에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄는 위치 46에 A, 및 위치 97에 V 또는 W가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
I. 항목 A 내지 H 중 어느 하나에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 중쇄 서열은 서열번호 001인 방법.
J. 항목 A 내지 I 중 어느 하나에 있어서, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드가 서열번호 002의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 방법.
K. 항목 A 내지 J 중 어느 하나에 있어서, HLA 융합 단백질은 N'에서 C' 말단까지:
a. 항목 A 내지 J 중 어느 하나에 명시된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드, 및
b. 펩타이드 링커, 특히 길이가 5 내지 20개 아미노산인 펩타이드 링커, 더욱 특히 서열번호 003의 서열을 갖는 펩타이드 링커, 및
c. 안정화 폴리펩타이드, 특히 IgG Fc를 포함하는 안정화 폴리펩타이드, 더욱 특히 IgG4 Fc를 포함하는 안정화 폴리펩타이드, 더욱 더 특히 서열번호 004의 서열을 갖는 IgG4 폴리펩타이드,
d. 및 선택적으로 분비 신호, 특히 서열번호 019의 서열을 갖는 분비 신호를 포함하거나 본질적으로 이들로 구성되는 방법.
L. 항목 A 내지 K 중 어느 하나에 있어서, HLA 융합 단백질 핵산 서열 및 β2m 핵산 서열은 단일 핵산 벡터 분자 상에 존재하는 방법.
M. 항목 A 내지 K 중 어느 하나에 있어서, HLA 융합 단백질 핵산 서열과 β2m 핵산 서열은 다른 핵산 벡터 분자 상에 존재하는 방법.
N. 항목 M에 있어서, β2m 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터에 대한 HLA-B57 융합 단백질 핵산 서열을 포함하는 핵산 벡터의 비율이 대략 1인 방법.
O. 항목 1 내지 N 중 어느 하나에 있어서,
a. 세포의 상등액으로부터 HLA 융합 단백질/β2m 복합체를 정제하는 정제 단계;
b. 단리된 HLA 융합 단백질이 단리된 β2m 폴리펩타이드로부터 분리되는 조건 하에서 정제된 HLA 융합 단백질/β2m 복합체가 분리되는 해리 단계;
c. 및 선택적으로, 단리된 HLA 융합 단백질 폴리펩타이드를 생리학적 pH로 만드는 탈염 및 재접힘 단계를 추가로 포함하는 방법.
P. 항목 O에 있어서, 해리 단계가 산성 조건, 특히 pH 3 이하에서 처리하여 수행되는 방법.
Q. 항목 A 내지 P 중 어느 하나에 있어서, 안정화 폴리펩타이드는 IgG Fc를 포함하고, 정제 단계에서 HLA 융합 단백질/β2m 복합체는 단백질 G에 연결된 표면에 의해 포획되는 방법.
R. 항목 A 내지 Q 중 어느 하나에 있어서, HLA 융합 단백질이 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovarian cell)에서 발현되는 방법.
S. 단리된 HLA 융합 단백질로서,
a. 변이 HLA-B57 폴리펩타이드는 위치 46에 E, 위치 97에 R을 특징으로 하며, 여기서 위치 번호는 서열이 서열 ID NO 001인 HLA-B57:01 중쇄의 G, S, H 모티프를 각각 위치 1, 2 및 3에 할당하여 순차적으로 정의되는 자연 발생 HLA-B57 중쇄의 세포외 부분의 변이체인 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드, 및
b. 안정화 폴리펩타이드, 특히 Ig Fc, 보다 특히 IgG Fc, 더욱 더 특히 IgG4 Fc를 포함하는, 단리된 HLA 융합 단백질.
T. 항목 S에 있어서,
a. 항목 S에 따라 명시된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드, 특히 서열번호 002의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드, 및
b. 서열번호 004를 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 IgG4 Fc를 포함하고,
특히, 단리된 HLA 융합 단백질이 서열번호 005, 또는 서열번호 020(분비 신호를 포함하는), 또는 서열번호 015(분비 후 분비 신호가 없는)로부터 선택된 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고, 특히 HLA 융합 단백질이 서열번호 015를 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는, 단리된 HLA 융합 단백질.
U. 항목 S 또는 T에 있어서, 서열번호 015와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되거나, 단일 상이한 아미노산 잔기를 제외하고는 서열번호 015와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 이에 비해 동등한 자연 발생 HLA-B57:01 서열을 포함하는 단리된 융합 단백질과 비교하여, 상기 HLA 융합 단백질은:
a. 상기 HLA 융합 단백질을 발현하는 포유동물 세포의 생존력이 적어도 3배 증가하고/하거나
b. 세포 배양 상등액에서 측정된 상기 HLA 융합 단백질 역가의 적어도 10배 증가하고,
시험관 내 분석에서 다음을 유도하는 능력:
c. 대식세포의 세포 표면에서의 CD68, CD206 및/또는 CD209 발현 수준의 적어도 80%, 특히 90% 상향조절 및/또는
d. 종양 세포의 대식세포 식균작용 수준의 최소 80%, 특히 90%
및/또는 생체내 마우스 종양 모델에서 다음을 유도하는 능력:
e. 종양 부피의 적어도 2배 감소, 특히 3배 감소를 특징으로 하는, 단리된 HLA 융합 단백질.
V. 항목 S 내지 U 중 어느 하나에 있어서, 특히 서열번호 016(핵심 HLA 융합 단백질 구조만)을 포함하는 핵산, 특히 서열번호 006(HLA 융합 단백질 및 분비 신호)을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
W. 세포, 특히 진핵 세포, 보다 특히 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 항목 V의 핵산을 포함하는 벡터.
X. 항목 S 내지 U 중 어느 하나에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 항목 V에 따른 핵산, 또는 항목 W에 따른 벡터를 포함하는 세포.
Y. 치료제로 사용하기 위한, 또는 치료제의 제조에 사용하기 위한, 특히 암 치료용 치료제로 사용하기 위한 항목 S 내지 U 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질 또는 항목 V에 따른 핵산.
Z. 자연 발생 HLA-B57 세포의 도메인 폴리펩타이드에 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 도입하여 얻은 인간 백혈구 항원(HLA) 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은:
a. 다음을 포함하는 HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열:
i. 위치 46의 글루타메이트(E) 및 위치 97의 아르기닌(R)을 특징으로 하는 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드인, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드; 및
ii. 면역글로불린(Ig) 단편 결정화 가능 영역(Fc) 폴리펩타이드, 특히 이소형 G Ig(IgG) Fc, 더욱 특히 이소형 4 IgG(IgG4) Fc; 및
b. β2-마이크로글로불린(β2m) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포에 도입하는 것을 포함하고,
각각은 상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 있으며,
이어서, HLA 융합 단백질 코딩 핵산 서열 및 β2m 단백질 코딩 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 세포를 배양하여 HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 제공하는, 방법.
AA. HLA 융합 단백질을 생산하는 방법으로서,
c. 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드에서 위치 46의 아미노산을 E로 교체하고/하거나 위치 97의 아미노산을 R로 교체하여 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 제공하는 아미노산 치환 단계; 및
d. 발현 단계에서,
i. 상기 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 및 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질, 및
ii. β2m 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고,
상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 있으며, HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 제공하는, 방법.
BB. 항목 Z 또는 AA에 있어서, 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드가
iii. 위치 46에 A, 및
iv. 위치 97에 V;를 특징으로 하고,
특히 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 서열번호 002의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 방법.
CC. 항목 Z 내지 BB 중 어느 하나에 있어서, HLA 융합 단백질이
a. 항목 Z 내지 BB 중 어느 하나에 명시된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드,
b. IgG Fc 폴리펩타이드, 특히 IgG4 F 폴리펩타이드 c, 보다 특히 서열번호 004의 서열을 갖는 IgG4 Fc 폴리펩타이드,
c. 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 IgG Fc 폴리펩타이드에 연결하는 펩타이드 링커, 특히 길이가 5 내지 20개 아미노산인 펩타이드 링커, 더욱 특히 서열번호 003의 서열을 갖는 펩타이드 링커를 포함하고,
선택적으로 HLA 융합 단백질은
d. 분비 신호, 특히 분비 신호의 길이는 16 내지 30개 아미노산이고, 더욱 특히 분비 신호는 세포로부터의 분비 과정 동안 절단에 의해 제거되며, 더욱 더 특히 서열번호 019의 서열을 갖는 분비 신호를 추가로 포함하는 방법.
DD. 단리된 HLA 융합 단백질로서,
a. 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드,
- 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드의 변이체이고;
- 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 위치 46에 E가 있고 위치 97에 R이 있는 것을 특징으로 하며;
b. Ig Fc 폴리펩타이드, 보다 특히 IgG Fc 폴리펩타이드, 더욱 더 특히 IgG4 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 단리된 HLA 융합 단백질.
EE. 항목 DD에 있어서,
- 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 서열번호 002의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고/되거나;
- Ig Fc 폴리펩타이드는 서열번호 004의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고,
- 및 선택적으로, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 및 Ig Fc 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 연결되며, 특히 펩타이드 링커의 길이는 5 내지 20개의 아미노산 길이이고, 더욱 특히 펩타이드 링커는 서열번호 003의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 단리된 HLA 융합 단백질.
FF. 항목 DD 또는 EE에 있어서, 서열번호 015로 지정된 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 단리된 HLA 융합 단백질.
GG. 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체의 형태이고;
- 상기 제1 단량체는 항목 Z 내지 CC 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻은 제1 HLA 융합 단백질, 또는 항목 DD 내지 FF 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고;
- 상기 제2 단량체는 Z 내지 CC 항목 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻은 제1 HLA 융합 단백질, 또는 DD 내지 FF 항목 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되며;
특히 상기 제1 단량체와 제2 단량체는 동일한 항목 DD 내지 FF 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 단리된 HLA.
HH. 상기 HLA 융합 단백질은 상기 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 동등한 HLA 융합 단백질과 비교하여 LILRB2에 대한 향상된 결합을 갖는 Z 내지 CC 항목 중 어느 하나에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 DD 내지 GG 항목 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 생산하는 방법.
II. 특히 서열번호 016의 서열을 포함하는 단리된 핵산, 특히 서열번호 006의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 항목 DD 내지 HH 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
JJ. 세포, 특히 진핵 세포, 보다 특히 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 항목 II에 따른 핵산을 포함하는 핵산 발현 벡터.
KK. 항목 DD 내지 HH 중 어느 하나에 따른 HLA 융합 단백질, 또는 항목 II에 따른 단리된 핵산, 또는 항목 JJ에 따른 핵산 발현 벡터를 포함하는 세포.
LL. 항목 Z 내지 CC 중 어느 하나에 명시된 방법으로부터 얻은 HLA 융합 단백질, DD 내지 HH 항목 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질, 항목 II에 따른 핵산, 또는 항목 JJ에 따른 핵산 발현 벡터을 포함하는 악성 종양 질환(malignant neoplastic disease)의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
MM. 항목 LL에 있어서,
- 약학 조성물은 체크포인트 억제제 투여 전, 체크포인트 억제제와 병용하여 또는 체크포인트 억제제 투여 후에 투여되고,
- 특히 상기 체크포인트 억제제는 항체, 항체 단편 또는 항체 유사 분자로부터 선택되며,
- 특히 상기 체크포인트 억제제는 적어도 10-7 mol/L의 해리 상수로 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 중 하나에 결합할 수 있고,
- 특히 상기 체크포인트 억제제는 전신 전달을 위한 투여 형태로 제공되는 약학 조성물.
NN. 악성 종양 질환의 치료에 사용하기 위한 체크포인트 억제제로서,
체크포인트 억제제는 항목 Z 내지 CC 중 어느 하나에 따른 방법으로부터 얻은 HLA 융합 단백질, 또는 HH, DD 내지 HH 항목 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질, 항목 II에 따른 핵산, 또는 항목 JJ에 따른 핵산 발현 벡터와 조합하여 투여되고,
- 특히 체크포인트 억제제가 항체, 항체 단편, 또는 항체 유사 분자로부터 선택되고,
- 특히 상기 체크포인트 억제 항체는 적어도 10-7 mol/L의 해리 상수로 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 중 하나에 결합할 수 있으며,
- 특히 상기 체크포인트 억제 항체는 전신 전달을 위한 투여 형태로 제공되는 악성 종양 질환의 치료에 사용하기 위한 체크포인트 억제제.
단일 분리 가능한 특징에 대한 대안이 본 명세서에서 "실시예"로 배치되는 경우, 이러한 대안은 본 명세서에 개시된 본 발명의 별개의 실시예를 형성하기 위해 자유롭게 결합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명되며, 이로부터 추가적인 실시예 및 이점이 도출될 수 있다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 그 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
클론 풀 생성
분비 리더 신호 앞에 HLA-B57-Fc(서열번호 012) 및 HLA-B57(A46E/V97R)-Fc(서열번호 006)를 암호화하는 CDNA를 발현 벡터(Probiogen)에 개별적으로 복제했다. HLA-B57-Fc 및 HLA-B57(A46E/V97R)-Fc를 발현하는 벡터 구조체는 NEON Transfection Kit(Life Technologies #MPK10096)를 사용하여 마이크로포레이션(MP)을 통해 β2m 단백질(서열번호 014)을 암호화하는 핵산(서열번호 013)을 포함하는 플라스미드와 공동 감염시켰다. 동일한 프로세스를 사용하여 대체 면역원성 HLA 1등급 중쇄 IgG4 융합 단백질을 코딩하는 핵산 발현 벡터는 HLA-A30:01(서열번호 021), HLA-B58:01(서열번호 022) 또는 HLA-Cw08:02(서열번호 023)의 세포 외 도메인 또는 HLA 중쇄 폴리펩타이드의 46 및 97 위치에서 단일 또는 이중 아미노산 치환이 특징인 변형 세포 외 도메인을 포함하여 생성되었다. 각 HLA-Fc 융합 단백질의 HLA 중쇄 세포외 도메인 부분에 E46 아미노산 잔기 또는 R97 잔기를 추가하거나 제거하는 아미노산 치환의 영향을 측정하기 위해 다음과 같이 변형된 구조체를 도입하여 만들었다: HLA-A30E46A(서열번호 024), HLA-A30I97R(서열번호 025), HLA-A30E46A/I97R(서열번호 026), HLA-B57A46E(서열번호 027), HLA-B57V97R(서열번호 028), HLA-B57A46E/V97R(서열번호 015), HLA-B58E46A (서열번호 029), HLA-B58R97V (서열번호 030), HLA-B58E46A/R97V (서열번호 031), HLA-C08E46A (서열번호 032), HLA-C08R97V (서열번호 033), HLA-C08E46A/R97V (서열번호 034).
CHO-DG44 스타터 세포는 HLA-Fc 대 β2m 플라스미드의 다양한 비율(4:1, 2:1, 1:1, 1:2)로 형질감염되었다. 선택된 클론 풀은 퓨로마이신 및 메토트렉세이트가 포함된 125mL의 PBG-CD-C4 보충 배지에서 4E5 vc/mL의 정의된 세포 파종 밀도로 표준화된 진탕 플라스크에서 성장되었다. 항생제를 사용하여 조정된 선택 압축을 수행한 후 분석을 위해 개별 클론 풀을 선택했다. 생존율 및 생존 세포 밀도 측정은 Vi-CELL XR 시스템 및 Trypan blue 세포 배제 방법을 사용하여 수행되었다. 단백질 A 바이오센서가 장착된 Octect RED 기계(ForteBio, Pall Division)를 사용하여 다양한 시점(일)에 역가 정량을 측정했다.
HLA-B57.β2m 정제 및 HLA-B57(A46E/V97R).β2m 및 β2m 제거 절차
분비된 HLA-B57.β2m 및 HLA-B57(A46E/V97R).β2m을 함유하는 여과된 상층액을 친화성 컬럼 정제에 사용했다. 산성 조건에서 단백질 정제 및 β2m 제거는 2단계 정제 프로토콜로 수행되었다. 첫 번째 단계로, 단백질 G 세파로스[(4 Fast Flow) Sigma, #GE-17-0618-01)] 비드를 사용하여 상층액에서 HLA-B57 + β2m 및 HLA-B57(A46E/V97R) + β2m을 포획했다. 로커에서 4도에서 밤새 인큐베이션한 후, 회수된 비드를 PBS로 세척한 다음, 표준 IgG-용출 완충액(pH 2.8)(Pierce?? IgG Elution Buffer, Thermo Fischer #21004)을 사용하여 단백질을 용출시켰다. 크기 배제 크로마토그래피 기반 정제의 두 번째 단계는 산성 조건에서 β2m에서 HLA-B57 및 HLA-B57(A46E/V97R)을 분리하기 위해 수행되었다. 구연산나트륨(100mM, pH 3.0)으로 사전 평형화된 Superdex 10/300 겔 여과 컬럼을 분리에 사용했다. 2.0mg/ml 농도의 단백질 0.5ml를 주입했고, 원하는 비-β2m-결합 HLA-B57 (서열번호 018) & HLA-B57(A46E/V97R) (서열번호 015)단백질 피크는 12.7ml에서 용출되었고 β2m에 대한 피크는 22.0ml에서 용출되었다. 이러한 결과는 산성 조건에서 β2m의 분리와 비-β2m-결합 HLA-B57 및 HLA-B57(A46E/V97R)의 정제가 가능함을 입증한다.
LILRB2와 비-β2m-결합 HLA-B57 및 HLA-B57
(A46E/V97R)
의 상호 작동 정량화
LILRB2와 비-β2m-결합 HLA-B57 및 HLA-B57(A46E/V97R)의 상호작동 친화도 정량화는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 방법을 사용하여 수행되었다. 평평한 바닥 PierceTM 스트렙타비딘 코팅된 높은 결합 용량 96웰 플레이트(Pierce #15500)를 사용하고 50μl의 c-말단 비오티닐화 항원 분자(LILRB2, BPS Bioscience #100335)를 PBS 완충액에 5μg/ml의 최종 농도로 고정했다. PBS 및 IgG 이소형을 음성 대조군으로 사용했다. 비-β2m-결합 HLA-B57 또는 HLA-B57(A46E/V97R) (8개 농도점: 10, 2.5, 1, 0.25, 0.1, 0.025, 0.01, 0.0025 μg/ml)의 연속 희석액(50μl)을 두 번 적용했다. TBS(50μl)에 1:100으로 희석된 APC 접합 염소 항-인간 IgG 항체(Jackson Immuno Research #109-135-098)를 검출에 사용했다. 마지막으로, 각 웰에 TBS 50μl를 첨가하고 각각 650 nm 및 660 nm의 APC 여기 및 방출 파장으로 형광 스캔을 수행했다. Graphpad Prism v9.1.2를 사용하여 3개 매개변수 기반 로그(작동제) 대 반응 모델을 사용하여 상호작동의 EC50을 결정했다.
항체 염색
유동 세포 계측법은 LSR Fortessa 분석기(BD Biosciences)에서 수행되었다. T 세포 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8은 1:100으로 희석된 항체 염색(BioLegend)으로 평가되었다. 대식세포에 대한 HLA-DR 발현은 1:100으로 희석된 항체 염색(BioLegend)으로 평가되었다. 대식세포 분극 패널은 1:100으로 희석된 CD80, CD86, CD68, CD163, CD206 및 CD209 항체(Biolegend)를 사용하여 수행되었다. 모든 얼룩은 얼음 위에서 20분 동안 수행한 다음 표준 관행에 따라 세척하고 재현탁했다.
T 세포 사멸 분석
공배양 분석을 위해 건강한 기증자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 인간 T 세포를 분리하고 CD3/CD28 활성화제(ThermoFisher #11131D)로 자극한 다음 50 U/ml rhIL-2의 존재 하에 48 시간 배양했다. 그런 다음 T 세포를 CD3/CD28-활성화제로부터 세척한 다음 이중 웰의 U-바닥 96-웰 플레이트에서 표시된 인간 백혈병 세포와 혼합했다. 화합물을 지시된 농도로 각 웰에 첨가하였다. 백혈병 세포는 제조업체의 지시에 따라 CellTrace™ 보라색 세포 증식 마커(ThermoFisher #C34557)와 공동 배양하기 전에 염색되었다. 도금된 세포의 수, E:T 비율 및 공동 배양 기간은 다양한 백혈병 세포주에 대해 테스트되었으며 관련 그림에 표시되어 있다. 공동배양물은 도립현미경을 사용하여 사진을 찍고, T 세포는 CD3, CD4 및 CD8 항체로 염색하고 LSR Fortessa 분석기로 분석했다. 살아있는 암세포는 보라색 세포 증식 마커에 대해 양성이었고 시톡스 적혈구 사멸 세포 염색(ThermoFisher #S34859)에 대해서는 음성이었다. Bright count bead(ThermoFisher #C36590)를 사용하여 T 세포와 보라색 염색 양성 암세포의 절대 개수를 측정했다.
대식세포 식균작용 유세포 분석 기반 분석
1차 인간 기증자 유래 단핵구를 건강한 기증자의 PBMC로부터 분리하고 ImmunoCult 배지(StemCell Technologies #10961) + 50ug/ml rhMCSF(StemCell #78057.1)에서 5~7일간 배양하여 대식세포로 분화했다. 플레이팅 후 1일차에 화합물을 20μg/ml의 농도로 웰에 첨가했다. 플레이팅 후 5-7일째에, 화합물을 다시 한 번 대식세포에 첨가하고 2개의 다운스트림 실험을 수행했다:1) 대식세포의 분극화: 분극화 연구를 위해 배양된 대식세포를 화합물로 두 번째 처리한 지 1일 후에 CD80, CD86, CD68, CD163, CD206 및 CD209(Biolegend)의 발현에 대해 유세포 분석법으로 분석했다. 2) 식작동: 표적 세포를 12웰 플레이트에 0.5x106 대 1x106 대식세포의 비율로 대식세포에 플레이팅하고 플레이팅 후 16시간에 식균작용을 분석했다. 표적 세포는 공동 배양 전에 CellTrace™ 보라색 세포 증식 마커로 염색되었으며, 유세포 분석법을 통해 HLA-DR로 염색된 대식세포와 구별할 수 있었다. 식균작용은 FlowJo v.10.6.1(Tree Star)을 사용하여 분석한 바와 같이 HLA-DR 양성 대식세포의 보라색 염색 양성 표적 세포의 백분율로 평가되었다. 각 식균작용 반응은 기술적 중복으로 수행되었다. 모든 생물학적 복제물은 독립적인 인간 대식세포 기증자를 나타낸다.
생체 내 치료
C38 종양 단편을 동계 암컷 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사했다. 결장에서 종양이 ±50 mm3에 도달하면 동물을 개별 종양 부피 크기에 따라 분포시키고 그들 사이에 통계적 차이가 없는 그룹으로 나누었다. 종양 직경은 캘리퍼를 사용하여 측정하였고, 부피는 D/2×d2 공식에 따라 계산했다. 여기서 D와 d는 각각 종양의 가장 긴 직경과 가장 짧은 직경(mm)입니다. 세포 주입 시점과 물질 주입의 실험 설계는 다음과 같이 확립되었다: 이소타입 IgG4(10mg/Kg) biwk x 3; 비-β2m-결합 HLA-B57(A46E/V97R)(10 mg/Kg) biwk x 3; Biwk= 격주
실시예 1: HLA 서열과 발현 수준의 상관관계
의료용 HLA- 중쇄 비-β2m-결합 Ig Fc 융합 단백질의 발현 프로파일을 최적화하기 위해 중국 햄스터 난소 세포(CHO)를 사용한 일시적 감염 시스템에서 수율 증가와 잠재적으로 관련된 잔기를 식별하기 위해 다양한 HLA 중쇄 서열의 단백질 서열을 정렬했다. 이 비교를 통해 다양한 HLA 분자에 존재하는 특정 글루탐산(E) 및 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 상등액에서 측정한 재조합 단백질 농도로 측정한 발현 증가와 상관관계가 있음을 확인했으며, 이러한 아미노산 치환 변화는 포유류 세포에서 발현 시 관련 HLA 단백질의 우수한 발현 수준을 가진 변이 HLA-B57(A46E/V97R)을 부여할 수 있음을 시사한다(도 1 및 2).
HLA-B57 1배체형은 면역 표현형에 대한 유전적 연결을 특징으로 하며, 면역글로불린 유사 수용체 하위군 B 멤버 2(LILRB2)를 포함한 선천성 수용체에 결합하여 HLA-B57 단백질 서열을 HLA 융합 단백질에 사용하기에 특히 바람직한 HLA-중쇄 성분으로 만든다. 자연 발생 HLA-B57:01 단백질(서열번호 001)의 HLA-B57 알파 1, 2, 및 3 도메인에 기반한 HLA-IgG4 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열에 치환 돌연변이를 도입하여 46번 위치의 A를 E로, 97번 위치의 V를 R로 교환했다(도 1). 그런 다음 두 개의 HLA 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 합성하여 짧은 아미노산 브리징 서열로 연결된 IgG4 폴리펩타이드를 야생형 HLA-B57 세포 외 폴리펩타이드(서열번호 012, HLA-B57-Fc) 또는 돌연변이 HLA-B57(A46E/V97R) 폴리펩타이드(서열번호 006, HLA-B57(A46E/V97R)-Fc) 중 하나의 HLA 중쇄 폴리펩타이드 옵션에 포함시켰다. 각 구조물을 발현 벡터로 개별적으로 복제되었다. 인간 β2m 단백질을 코딩하는 두 번째 플라스미드를 다양한 비율로 조합하여 HLA-B57-Fc 및 HLA-B57(A46E/V97R)-Fc를 발현하는 벡터 구조물을 CHO 세포에 공동 감염시켰다.
실시예 2: HLA-B57
(A46E/V97R)
.β2m의 발현 개선
대체 아미노산 잔기가 재조합 HLA 중쇄 IgG4 융합 단백질의 발현 또는 수율에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, HLA-B57(A46E/V97R)-Fc 및 HLA-B57-Fc 구조를 발현하는 CHO 세포 클론을 분리하여 하위 복제했고, 야생형(HLA-B57.β2m) 또는 돌연변이 HLA-B57(HLA-B57(A46E/V97R).b2m) 융합 단백질과 함께 2m을 구성하는 결과 복합체의 농도를 단백질 A 바이오센서(옥텟 레드96 시스템, 사토리우스)로 평가했다. HLA-B57(A46E/V97R).β2m 생산 클론은 HLA-B57: β2m 발현 대조군 세포에 비해 세포가 증가하고 상등액에서 유의하게 높은 역가의 HLA 융합 단백질을 생성하는 것으로 나타났다(도 3). 두 가지 돌연변이 외에 대체 분비 신호를 포함하는 구조(서열번호 020)는 재조합 융합 단백질의 상등액 수율을 유사하게 생성했다. HLA-B57. 2βm, HLA-B57(A46E/V97R).β2m 및 β2m의 RNA 수준은 세포 클론 간에 동일했으며, 이는 HLA-B57(A46E/V97R).β2m 의 높은 역가 발현이 더 많은 DNA 사본 수와 상관관계가 없고 오히려 새로운 구조의 본질적인 효율적인 접힘, 용해성 및 안정성과 관련이 있음을 보여준다(도 4). 정제된 단백질의 HPLC 분석 결과, 돌연변이 HLA-B57(A46E/V97R) 구조물을 발현하는 클론의 상등액은 모체 HLA-B57 구조의 상등액에서 증가된 고분자량 올리고머에 비해 저분자량 HLA 중쇄/β2m 이량체의 비율이 더 높은 것으로 나타났다(도 5). β2m 경쇄와의 결합성 없이 HLA를 구성하는 단량체를 정제 및 재접합한 후에도 HLA-B57(A46E/V97R) 구조물의 수율 증가가 분명하게 나타났다(도 6, 도 7에 요약).
실시예 3: HLA-B57
(A46E/V97R)
의 면역조절 특성
여러 분석에서 HLA-B57(A46E/V97R)의 활성을 HLA-B57(A46/V97) 모 구조물과 비교하여 두 가지 아미노산 변화가 추가되어도 HLA IgG4 Fc 융합 단백질의 HLA 도메인의 생물학적 활성이 손상되지 않음을 확인했다. 비-변이 또는 변이 HLA-B57 중쇄 서열에 기반한 비-β2m-결합 화합물의 ELISA 분석 결과, 두 아미노산 치환이 LILRB2에 대한 결합을 감소시키지 않았으며 실제로 변이 HLA 융합 단백질은 LILRB2 결합 포화도의 개선되고 낮은 EC50 값을 보였다(도 8). 비-β2m-결합 HLA-B57(A46/V97) 형태이성질체의 면역 조절 효과는 다양한 종양 세포주로 배양한 M1 대식세포의 분극화(대표적인 표면 표현형 마커로 측정) 및 식균작용 능력을 측정하는 분석에서 아미노산 치환이 없는 대조군과 유사하게 나타났다(도 9). 마지막으로, 비-β2m-결합 HLA-B57(A46E/V97R)-Fc 분자는 생체 내 전달 시 대장암 마우스 모델의 성장을 억제하여 생체 내 치료 면역 자극 작동을 입증했다(도 12).
실시예 4: E6E 및 97R과 결합된 개선된 HLA I형 중쇄 발현
인간 집단에서 다양한 면역 표현형과 관련된 다양한 HLA 1형 중쇄의 최적 재조합 발현을 위해 46E 및 97R 잔기의 중요성을 확인하기 위해, 발명자들은 이러한 아미노산 치환이 인간 집단에서 다양한 면역원성 효과와 관련된 추가 HLA 1형 중쇄 폴리펩타이드 서열, HLA-A30, HLA-B58 및 HLA-C08로 구성된 추가 IgG Fc 융합 단백질 구조에 미치는 영향을 측정했다(도 13). 핵산 발현 벡터는 HLA 대립유전자에 대한 IPD-IMGT/HLA 온라인 데이터 대립유전자 보고 기능에서 제공하는 HLA 중쇄 단백질 서열의 세포 외 도메인을 포함하는 야생형 HLA IgG4 융합 단백질을 코딩하여 생성되었다: HLA-A30, A*30:01:01:01(서열번호 021), HLA-B57 B*57:01:01:01(서열번호 018), HLA-B58, B*58:01:01:01(서열번호 022), HLA-C08, C*08:02:01:01(서열번호 023)이 있다. 다음으로, 각 HLA-Fc 융합 단백질의 HLA 중쇄 세포외 도메인 부분에 E46 아미노산 잔기 또는 R97 잔기를 추가하거나 제거하는 아미노산 치환이 미치는 영향을 측정하기 위해 다음과 같이 변형된 구조를 도입하여 만들었다: HLA-A30E46A, HLA-A30I97R, HLA-A30E46A / I97R, HLA-B57A46E, HLA-B57V97R, HLA-B57A46E / V97R, HLA-B58E46A, HLA-B58R97V, HLA-B58E46A / R97V, HLA-C08E46A, HLA-C08R97V, HLA-C08E46A / R97V. 야생형 및 변이형 HLA 중쇄 IgG4 융합 단백질을 코딩하는 핵산 발현 벡터를 일시적으로 감염시킨 CHO 세포에 의한 β2m-결합 HLA 구조물의 생산 수율과 단백질 A 바이오센서(Octet Red96 시스템, Sartorius)를 사용하여 CHO 세포의 상등액에서 β2m을 평가했다.
이 결과는 테스트한 모든 분자에서 아미노산 46E와 97R 잔기가 모두 특징인 HLA 중쇄가 최적의 재조합 단백질 수율과 관련이 있으며, HLA-B57 중쇄 서열에 A46E와 V97R 치환을 모두 도입하면 모든 구성 중에서 가장 높은 수율을 달성한다는 것을 확인했다. 반대로 야생형 HLA-B57에 존재하는 46A와 97V를 모두 HLA-A30, HLA-B58 또는 HLA-C08에 도입하면 생산 수율이 크게 감소하여 아미노산 46E와 97R이 HLA-Fc 분자를 포함한 HLA 중쇄의 최적 역가 안정화 및 생산에 중요하다는 것을 확인했다.
서열:
SEQ ID NO 001 자연적으로 발생하는 HLA-B57:01 세포외 도메인
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS
SEQ ID NO 002 변이체 HLA-B57 (A46E/V97R) 중쇄 세포외 도메인
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS
SEQ ID NO 003 링커
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO 004 IgG4 Fc 폴리펩타이드
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 005 분비 신호를 갖는 재조합 HLAB57 (A46E/V97R) 융합 단백질
AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQCGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 006 HLAB57 (A46E/V97R) 융합 단백질 DNA
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtggatcccactctatgagatacttctacaccgcaatgtctcgtcctggtcgcggggaacctagatttattgctgtgggatatgttgatgatactcaatttgtgcgttttgactccgacgcagcctcaccacggatggagcctagagcaccctggatagaacaagaagggcctgaatactgggatggtgaaacgcgaaacatgaaagcatcagctcaaacctatcgggagaacctgcgtatcgcactgagatactacaaccaatctgaggctggaagtcacattatccaacgtatgtatggttgtgacgtcggtcccgacggtcgcctgctccgtggtcatgaccaatcggcctatgacggaaaggattacatcgccttaaacgaggacctgagctcgtggactgccgcagatactgccgctcaaattacccaacggaagtgggaagcggcgcgcgtcgccgaacaactgcgagcctacctggagggcctgtgcgtcgagtggttgagacgctacctggagaacgggaaagagacgctgcaaagggccgatccccccaagacccatgtcacacatcacccgatctcggatcacgaagcaactctgcgatgctgggctcttgggttctaccccgctgagattacactgacttggcaaagggacggcgaagatcaaacacaagacaccgaacttgtggagactaggccagctggagatagaaccttccaaaagtgggctgccgtcgtcgtccctagtggagaggaacaacgatatacttgccacgtccaacacgaaggtttgccaaagcccctcactcttcgctgggaacctagctcgcaatcaggaggcggaggctcgggaggcggaggcagcgaaagcaaatacggtccaccctgcccaccttgcccggcgcctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccgaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagaccccgaagtccaatttaattggtatgtcgacggcgtcgaggtgcataatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctcgtcaattgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactatacccagaagtccctgtccctgagcctgggctgatga
SEQ ID NO 007 HLA-B27:05의 세포외 도메인
GSHSMRYFHTSVSRPGRGEPRFITVGYVDDTLFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRETQICKAKAQTDREDLRTLLRYYNQSEAGSHTLQNMYGCDVGPDGRLLRGYHQDAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGECVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS
SEQ ID NO 008 HLA-B27:06의 세포외 도메인
GSHSMRYFHTSVSRPGRGEPRFITVGYVDDTLFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRETQICKAKAQTDRESLRTLLRYYNQSEAGSHTLQNMYGCDVGPDGRLLRGYDQYAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGECVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPGEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS
SEQ ID NO 009 HLA-B58:01의 세포외 도메인
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS
SEQ ID NO 010 HLA-CW08의 세포외 도메인
CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAARTAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQS
SEQ ID NO 011 HLA-CW14의 세포외 도메인
CSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMFGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYIALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEPSSQP
SEQ ID NO 012 CDNA 암호화 HLA-B57-Fc
gcggccgccatgaactttggcctgcggctgatcttcctggtgctgaccctgaagggcgtgcagtgcggatcccactccatgcggtacttctacaccgccatgtcccggcctggacggggagagcctagattcattgccgtgggctacgtggacgacacccagttcgtcagattcgactccgacgccgcctctcctcggatggctcctagagccccttggatcgagcaggaaggccccgagtactgggacggcgagacacggaacatgaaggcctccgcccagacctacagagagaacctgagaatcgccctgcggtactacaaccagtccgaggccggctcccacatcatccaagtgatgtacggctgcgacgtgggccccgatggcagactgctgagaggccacgatcagtccgcctacgacggcaaggactatatcgccctgaacgaggacctgtcctcctggaccgctgccgataccgccgctcagatcactcagcggaagtgggaggccgccagagtggctgaacagctgagagcctacctggaaggcctgtgcgtggaatggctgcggagatacctggaaaacggcaaagagacactgcagcgggccgacccccctaagacccacgtgacccaccaccctatctccgaccacgaggccaccctgagatgttgggccctgggcttttaccccgccgagatcaccctgacctggcagagagatggcgaggaccagacccaggacaccgagctggtggaaaccagacctgccggcgaccggaccttccagaaatgggctgctgtggtggtgccctccggcgaggaacagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggcctgcccaagcccctgactctgagatgggagccttccagccaatcaggaggcggaggctcgggaggcggaggcagcgaaagcaaatacggtccaccctgcccaccttgcccggcgcctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccgaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagaccccgaagtccaatttaattggtatgtcgacggcgtcgaggtgcataatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctcgtcaattgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactatacccagaagtccctgtccctgagcctgggctgatga
SEQ ID NO 013 핵산 암호화 b2m 단백질
gcggccgccatgtcccggagcgttgcgctggctgtgttggccctgctctctctctccgggctggaagcaattcaacgtacacccaagattcaggtctatagtcgccaccccgctgagaatggaaagtctaattttctgaactgctatgtgtccggctttcatccctccgatattgaggttgacttactcaagaacggagagcgcatagaaaaggttgaacactctgacctcagttttagcaaggactggagtttctacttactgtactacactgaattcacccctaccgaaaaggacgaatacgcttgtcgtgtgaatcacgttactctgtctcaacccaaaattgtcaagtgggatcgggatatgtgataag
SEQ ID NO 014 β2m 단백질
AAAMSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
SEQ ID NO 015 변이체 HLA-B57 (A46E/V97R) IgG4 Fc 융합 단백질
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS GGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 016 HLAB57 (A46E/V97R) 돌연변이 융합 단백질 DNA
ggatcccactctatgagatacttctacaccgcaatgtctcgtcctggtcgcggggaacctagatttattgctgtgggatatgttgatgatactcaatttgtgcgttttgactccgacgcagcctcaccacggatggagcctagagcaccctggatagaacaagaagggcctgaatactgggatggtgaaacgcgaaacatgaaagcatcagctcaaacctatcgggagaacctgcgtatcgcactgagatactacaaccaatctgaggctggaagtcacattatccaacgtatgtatggttgtgacgtcggtcccgacggtcgcctgctccgtggtcatgaccaatcggcctatgacggaaaggattacatcgccttaaacgaggacctgagctcgtggactgccgcagatactgccgctcaaattacccaacggaagtgggaagcggcgcgcgtcgccgaacaactgcgagcctacctggagggcctgtgcgtcgagtggttgagacgctacctggagaacgggaaagagacgctgcaaagggccgatccccccaagacccatgtcacacatcacccgatctcggatcacgaagcaactctgcgatgctgggctcttgggttctaccccgctgagattacactgacttggcaaagggacggcgaagatcaaacacaagacaccgaacttgtggagactaggccagctggagatagaaccttccaaaagtgggctgccgtcgtcgtccctagtggagaggaacaacgatatacttgccacgtccaacacgaaggtttgccaaagcccctcactcttcgctgggaacctagctcgcaatcaggaggcggaggctcgggaggcggaggcagcgaaagcaaatacggtccaccctgcccaccttgcccggcgcctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccgaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagaccccgaagtccaatttaattggtatgtcgacggcgtcgaggtgcataatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctcgtcaattgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactatacccagaagtccctgtccctgagcctgggctgatga
SEQ ID NO 017 HLA-B57 융합 단백질 및 분비 신호
AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQCGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 018 HLA-B57 융합 단백질
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 019 분비 신호
AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQC
SEQ ID NO 020 재조합 변이체 HLA-B57 (A46E/V97R) 융합 단백질 및 분비 신호
MASPAQLLFLLLLWLPDGVHAGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 021 HLA-A30 IgG4 Fc 융합 단백질
GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQERPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
HLA-A*30:01의 세포외 도메인, 펩타이드 링커 , IgG4 Fc
SEQ ID NO 022 HLA-B58 IgG4 Fc 융합 단백질
GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
HLA-B*58:01의 세포외 도메인, 펩타이드 링커 , IgG4 Fc
SEQ ID NO 023 HLA-C08 IgG4 Fc 융합 단백질
CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
HLA-Cw0802의 세포외 도메인, 펩타이드 링커 , IgG4 Fc
SEQ ID NO 024 HLA-A*30:01 E46A
GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMAPRAPWIEQERPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO 025 HLA-A*30:01 I97R
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SEQ ID NO 026 HLA-A*30:01 E46A / I97R
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SEQ ID NO 027 HLA-B*5701 A46E
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SEQ ID NO 028 HLA-B*5701 V97R
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SEQ ID NO 029 HLA-B*58:01 E46A
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SEQ ID NO 030 HLA-B*58:01 R97V
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SEQ ID NO 031 HLA-B*58:01 E46A, R97V
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SEQ ID NO 032 HLA-Cw0802 E46A
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SEQ ID NO 033 HLA-Cw0802 R97V
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SEQ ID NO 034 HLA-Cw0802 E46A, R97V
CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGAPRAPWVEQEGPEYWDRETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQVMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYIALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
인용된 문헌:
Arosa et al. Trends in Immunology 2007 Mar; 28(3):115-23
WO 2017153438 A1
Claims (18)
- 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드에 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 도입하여 얻어지는 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 융합 단백질을 생산하는 방법으로서,
a. HLA 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 HLA 융합 단백질은:
i. 위치 46의 글루타메이트(E) 및 위치 97의 아르기닌(R)을 특징으로 하는 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드인, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드; 및
ii. 면역글로불린(Ig) 단편 결정화 가능 영역(Fc) 폴리펩타이드, 특히 이소형 G Ig(IgG) Fc, 더욱 특히 이소형 4 IgG(IgG4) Fc를 포함하는, 핵산 서열; 및
b. β2-마이크로글로불린(β2m) 단백질을 암호화하는 핵산 서열;을 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포 내로 도입하는 단계,
각각의 핵산 서열은 상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어하에 있고,
이어서, HLA 융합 단백질 코딩 핵산 서열 및 β2m 단백질 코딩 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 세포를 배양하여 HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 제공하는 단계를 포함하는,
HLA 융합 단백질을 생산하는 방법. - HLA 융합 단백질을 생산하는 방법으로서,
a. 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드에서 위치 46의 아미노산을 E로 교체하고/하거나 위치 97의 아미노산을 R로 교체하여 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 제공하는 아미노산 치환 단계; 및
b. 발현 단계로서,
i. 상기 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 및 IgG Fc 폴리펩타이드를 포함하는 HLA 융합 단백질, 및
ii. β2m 단백질을 암호화하는 핵산 서열을, 세포, 특히 진핵 세포, 더욱 특히 포유동물 세포 내로 도입하는, 발현단계를 포함하며,
모두 상기 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 있으며, HLA 융합 단백질/β2m 단백질 복합체를 제공하는,
HLA 융합 단백질을 생산하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드가:
i. 위치 46에 A, 및
ii. 위치 97에 V;를 특징으로 하고,
특히 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 서열번호 002의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는,
HLA 융합 단백질을 생산하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
HLA 융합 단백질이:
a. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 명시된 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드,
b. IgG Fc 폴리펩타이드, 특히 IgG4 F 폴리펩타이드 c, 보다 특히 서열번호 004의 서열을 갖는 IgG4 Fc 폴리펩타이드,
c. 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드를 IgG Fc 폴리펩타이드에 연결하는 펩타이드 링커, 특히 길이가 5 내지 20개 아미노산인 펩타이드 링커, 더욱 특히 서열번호 003의 서열을 갖는 펩타이드 링커를 포함하고,
선택적으로 HLA 융합 단백질은:
d. 분비 신호, 특히 분비 신호의 길이는 16 내지 30개 아미노산이고, 더욱 특히 분비 신호는 세포로부터의 분비 과정 동안 절단에 의해 제거되며, 더욱 더 특히 서열번호 019의 서열을 갖는 분비 신호를 더 포함하는,
HLA 융합 단백질을 생산하는 방법. - 단리된 HLA 융합 단백질로서,
a. 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드,
- 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드의 변이체이고;
- 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 위치 46에 E가 있고 위치 97에 R이 있는 것을 특징으로 하며;
b. Ig Fc 폴리펩타이드, 보다 특히 IgG Fc 폴리펩타이드, 더욱 더 특히 IgG4 Fc 폴리펩타이드를 포함하는,
단리된 HLA 융합 단백질. - 제5항에 있어서,
- 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드는 서열번호 002의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고/되거나;
- Ig Fc 폴리펩타이드는 서열번호 004의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고,
- 및 선택적으로, 변이체 HLA-B57 폴리펩타이드 및 Ig Fc 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 연결되며, 특히 펩타이드 링커의 길이는 5 내지 20개의 아미노산 길이이고, 더욱 특히 펩타이드 링커는 서열번호 003의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는,
단리된 HLA 융합 단백질. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 따른 방법 또는 제5항 또는 제6항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질로서,
HLA 융합 단백질 또는 단리된 HLA 융합 단백질은 서열번호 015로 지정된 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는,
방법 또는 단리된 HLA 융합 단백질. - 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
단리된 HLA는 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체의 형태이고;
- 상기 제1 단량체는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻은 제1 HLA 융합 단백질, 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되고;
- 상기 제2 단량체는 제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻은 제1 HLA 융합 단백질, 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 하나에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되며;
- 특히 상기 제1 단량체와 제2 단량체는 동일한,
단리된 HLA 융합 단백질. - 제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질로서,
상기 HLA 융합 단백질은 상기 자연 발생 HLA-B57 세포외 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 동등한 HLA 융합 단백질과 비교하여 LILRB2에 대한 향상된 결합을 갖는,
방법 또는 단리된 HLA 융합 단백질. - 제1항 내지 제4항, 제7항, 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질로서,
HLA 융합 단백질이 펩타이드 에피토프와 결합되지 않는,
방법 또는 단리된 HLA 융합 단백질. - 서열번호 016의 서열을 포함, 특히 서열번호 006의 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 구성되는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산.
- 세포, 특히 진핵 세포, 보다 특히 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터 서열의 제어 하에 제11항에 따른 핵산을 포함하는 핵산 발현 벡터.
- 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질 또는 제11항에 따른 단리된 핵산 또는 제12항에 따른 핵산 발현 벡터를 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제4항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 명시된 방법으로부터 얻은 HLA 융합 단백질, 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질, 제11항에 따른 핵산 또는 제12항에 따른 핵산 발현 벡터을 포함하는 악성 종양 질환(malignant neoplastic disease)의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
- 제14항에 있어서,
악성 종양 질환은 대장암 또는 폐암인,
약학 조성물. - 제14항에 있어서,
악성 종양 질환은 혈액암, 특히 백혈병, 림프종 또는 골수종인,
약학 조성물. - 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
- 약학 조성물은 체크포인트 억제제 투여 전, 체크포인트 억제제와 병용하여 또는 체크포인트 억제제 투여 후에 투여되고,
- 특히 상기 체크포인트 억제제는 항체, 항체 단편 또는 항체 유사 분자로부터 선택되며,
- 특히 상기 체크포인트 억제체는 10-7 mol/L이하의 해리 상수(친화도가 높음)로 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 중 하나에 결합할 수 있고,
- 특히 상기 체크포인트 억제제는 전신 전달을 위한 투여 형태로 제공되는,
약학 조성물. - 악성 종양 질환의 치료에 사용하기 위한 체크포인트 억제제로서,
상기 체크포인트 억제제는 제1항 내지 제4항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 얻은 HLA 융합 단백질, 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단리된 HLA 융합 단백질, 제11항에 따른 핵산 또는 제12항에 따른 핵산 발현 벡터 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물과 조합하여 투여되고,
- 특히 체크포인트 억제제가 항체, 항체 단편 또는 항체 유사 분자로부터 선택되고,
- 특히 상기 체크포인트 억제체는 10-7 mol/L이하의 해리 상수(친화도가 높음)로 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 중 하나에 결합할 수 있으며,
- 특히 상기 체크포인트 억제체는 전신 전달을 위한 투여 형태로 제공되는,
체크포인트 억제제.
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