CN113717998A

CN113717998A - 重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法

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Publication number: CN113717998A
Application number: CN202111021701.XA
Authority: CN
Inventors: 何平; 戴柱; 李浪; 赵弘; 方欣; 樊卫; 岳亮; 宓鹏程; 廖立新; 丁小妹; 于铁妹; 潘俊锋; 刘建
Original assignee: Zhuhai Ruidelin Biology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Ruidelin Biology Co ltd
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法。本发明通过基因工程技术构建一株重组枯草芽孢杆菌，其能够利用酶法合成肌肽的废水进行发酵，并得到含四氢嘧啶的发酵液。经提取不仅可获得较多的四氢嘧啶，同时得到副产物菌渣蛋白饲料，而且排放的废水比原废水中COD、BOD、总磷、氨氮等下降70.4～96.2％，该方法还具有操作简便，节省资源，安全环保，成本低等优点，适合工业推广应用。

Description

重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoine)是许多耐盐和嗜盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜和核酸等提供保护作用。此外，四氢嘧啶对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，四氢嘧啶在精细化工和生物医药等行业将具有广泛的应用前景。

目前，四氢嘧啶的生产方法主要通过嗜盐微生物(特别是盐单胞菌)的高密度发酵来获得。也有专利报导了转基因大肠杆菌工程菌(CN105018403A、CN106754603B、CN112280726A等)和转基因谷氨酸棒杆菌工程菌(CN107142234B、CN 110699310 A等)发酵产生四氢嘧啶，还有采用克劳氏芽孢杆菌、盐单胞菌发酵产生四氢嘧啶的。

目前现有的生产菌株及使用其生产四氢嘧啶的方法，均需要高的NaCl浓度来刺激菌体积累更多的产物，发酵周期较长，而且高浓度的氯化钠溶液对发酵设备腐蚀严重，不适合大规模的工业化生产，同时高盐的发酵废液对环境造成了较大压力；酶催化法生产四氢嘧啶的底物为天冬氨酸钠，酶需要诱导表达并提取，因此操作比较复杂，生产成本较高。严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。

目前发酵法或酶催化法生产肌肽的高磷高盐废水很难处理，使肌肽生产成本较高。枯草芽孢杆菌不受发酵法或酶催化法肌肽废水成分抑制，经诱变或基因重组可在低到中盐度的协迫下产生四氢嘧啶，使四氢嘧啶生产成本大大降低，同时也解决了肌肽的高磷高盐废水难处理问题。目前的枯草芽孢杆菌多用于α淀粉酶和中性蛋白酶工业生产，尚未发现将其用于工业生产四氢嘧啶的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌在利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶中的应用，使其能够利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶；

本发明的另外一个目的在于提供利用上述重组枯草芽孢杆菌生产四氢嘧啶的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组枯草芽孢杆菌，能够表达来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilusDTY1的EctA、EctB和EctC。其中，EctA的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，EctB的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，EctC的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。

表达上述三个蛋白的编码基因可以是三个蛋白分别以独立的基因元件：启动子+EctA/B/C编码基因+终止子重组至枯草芽孢杆菌中进行表达，也可以以四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码基因方式一起表达，基因元件由启动子+EctA编码基因+间隔序列+EctB编码基因+间隔序列+EctC编码序列+终止子组成。作为优选，所述启动子为来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilus DTY1的天然启动子(如SEQ ID NO.4所示1-812bp序列)、P43启动子或pHY300PLK载体上的启动子。

在本发明具体实施方式中，本发明提供了来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillusalcalophilus DTY1的SEQ ID NO.4所示的四氢嘧啶合成基因簇EctABC编码基因，并将其重组到枯草芽孢杆菌工程菌中表达相关蛋白EctA、EctB和EctC，四氢嘧啶合成基因簇EctABC编码基因可以通过基因整合或者嵌合到载体上转化等方式实现表达或替换所需启动子。SEQ ID NO.4所示的四氢嘧啶合成酶的基因簇编码基因与常规方法中所用的序列不同，前端带有嗜碱芽胞杆菌(Bacillus alcalophilus DTY1)的天然启动子序列(1-812bp)，能实现四氢嘧啶的表达强度随盐浓度增加而增加；813-1322bp为EctA编码基因，1404-2693bp为EctB编码基因，2761-3159bp为EctC编码基因，1323-1403bp以及2694-2760bp为各编码基因之间的间隔序列，3160-3856bp为终止子序列。

前述天然启动子对四氢嘧啶合成酶的表达有调控作用。当废水中盐的浓度达到一定的数量，启动子会启动四氢嘧啶合成酶的表达，并随盐度升高而调控EctABC表达升高。此外，本发明还可以用P43启动子代替原启动子，无需废水中盐浓度达到一定的数量才启动四氢嘧啶合成酶的表达；同时也用如pHY300PLK的市售载体搭载EctABC的编码基因转化到枯草芽孢杆菌中形成重组枯草芽孢杆菌。

为了进一步提高重组枯草芽孢杆菌生产四氢嘧啶的能力，所述重组枯草芽孢杆菌还包括使其无法表达四氢嘧啶跨膜转运蛋白OpuC，可以采用整个敲除OpuC编码基因的方法进行；为了尽量避免对OpuC基因簇下游其它基因的表达的影响，提高重组工程菌的稳定性，本发明优选通过GRISPR的方法在OpuC编码基因中引入终止密码子破坏其表达，具体通过在其每个单独基因(OpuCA、OpuCB、OpuCC、OpuCD)中间引入终止密码子(如TAA)，从而破坏蛋白的正常表达。

更进一步地，所述重组枯草芽孢杆菌还无法表达中性蛋白酶nprE、碱性蛋白酶aprE、淀粉酶amyE和芽孢形成转录因子spo0A，这些相关酶或蛋白可以通过整段敲除编码基因来实现

将本发明所构建的重组枯草芽孢杆菌应用到酶法合成肌肽的废水中发酵，每吨废水可以得到四氢嘧啶8.5-35.6kg，菌渣蛋白饲料23.0-26.5kg，不仅能够得到较多的目标产物四氢嘧啶，而且同时得到副产物菌渣蛋白饲料，且排放的废水比原废水中COD、BOD、总磷、氨氮等下降70.4～96.2％。基于此，本发明提出了所述重组芽孢杆菌在以酶法合成肌肽的废水为原料生产四氢嘧啶中的应用。

依据应用，本发明还提供了一种利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法，包括：

步骤1、提供酶法合成肌肽的废水；

步骤2、将所述重组枯草芽孢杆菌接入所述废水中发酵，得到胞内含四氢嘧啶的发酵液，离心或板框压滤发酵液获取湿菌体；

步骤3、所述湿菌体破壁后经膜过滤，滤液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，利用氨水洗脱四氢嘧啶；或

所述湿菌体用水搅拌洗涤，离心后上清液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，利用氨水洗脱四氢嘧啶；或

所述湿菌体用乙醇浸提，浸提液回收乙醇后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，利用氨水洗脱四氢嘧啶；

步骤4、洗脱后的四氢嘧啶经过精制得到四氢嘧啶成品。

作为优选，所述酶法合成肌肽的废水为利用微生物发酵生产L-氨基酸连接酶的酶液，催化肌肽合成原料合成肌肽工艺中产生的废水，包括L-氨基酸连接酶发酵废水和L-氨基酸连接酶反应纯化废水。

在本发明具体实施方式中，所述L-氨基酸连接酶发酵废水经由以下方法获得：

能够表达L-氨基酸连接酶的转基因微生物菌株发酵后的发酵液离心分离得菌体液和上清液；菌体液匀质破菌、膜过滤得菌体碎片；上清液和菌体碎片液合并作为酶的发酵废水。

在本发明具体实施方式中，所述L-氨基酸连接酶反应纯化废水经由以下方法获得：

肌肽合成原料(β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP)加入L-氨基酸连接酶的酶液进行反应，反应完成后得到肌肽粗品溶液，依次经过膜分离、离子交换柱层析、结晶工艺进行纯化获得肌肽纯品，被膜分离和离子交换柱层析截留的废液作为酶反应纯化废水。

作为优选，所述发酵为在pH7.0、32℃、溶氧控制在20-30％条件下发酵18-36h；

作为优选，所述精制包括活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥等操作步骤；

作为优选，步骤3中离心后或膜过滤后或乙醇浸提后的菌渣可以干燥为蛋白饲料。

由以上技术方案可知，本发明通过基因工程技术构建一株重组枯草芽孢杆菌，其能够利用酶法合成肌肽的废水进行发酵，并得到含四氢嘧啶的发酵液。经提取不仅可获得较多的四氢嘧啶，同时得到副产物菌渣蛋白饲料，而且排放的废水比原废水中COD、BOD、总磷、氨氮等下降70.4～96.2％，该方法还具有操作简便，节省资源，安全环保，成本低等优点，适合工业推广应用。

附图说明

图1所示为质粒载体pHT-Cpf1图谱；

图2所示为质粒载体pHT-opuC-Cpf1图谱。

具体实施方式

本发明公开了重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明重组枯草芽孢杆菌及其应用和相关方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文重组枯草芽孢杆菌及其应用和相关方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明实施例中，酶法合成肌肽的废水的收集过程如下：

酶催化法肌肽的方法是以一定的培养基发酵L-氨基酸连接酶电转基因到大肠杆菌中，以LB培养基获得含胞内酶发酵液，发酵液离心分离得菌体液，菌体液匀质破菌、膜过滤得粗酶液。离心上清液和膜过滤菌体碎片液合并作为废水外排(其特性指标为COD31500mg/L、总磷2800mg/L、氨氮1386mg/L、BOD13000mg/L)；肌肽原料(β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP)反应液加入粗酶液进行反应，反应完成后得到反应液粗品溶液依次经过膜分离、离子交换柱层析、结晶工艺进行纯化获得纯品，反应液中的COD、总磷、氨氮、BOD等将被膜分离和离子交换柱层析各自部分截留并富集，截留的废液作为粗酶液催化肌肽反应纯化废水，其特性指标为COD14500mg/L、总磷3240mg/L、氨氮962mg/L、BOD10650mg/L、氯化钠7％。

上述两种废水合并(其特性指标为COD23000mg/L、总磷3020mg/L、氨氮1174mg/L、BOD13100mg/L、氯化钠3.5％)经杀菌接入本发明重组枯草芽孢杆菌在pH7.0、32℃、溶氧控制在20～30％条件下发酵18～36h，具体发酵条件可以根据实际情况调整，此处仅作示例性描述。

本发明中所涉及英文缩写含义参见下表1；

表1

除前述已记载的序列信息，本发明中所涉及的其他一些序列信息如下：

OpuCA蛋白序列：SEQ ID NO.5；

OpuCA编码序列：SEQ ID NO.6；

OpuCB蛋白序列：SEQ ID NO.7；

OpuCB编码序列：SEQ ID NO.8；

OpuCC蛋白序列：SEQ ID NO.9；

OpuCC编码序列：SEQ ID NO.10；

OpuCD蛋白序列：SEQ ID NO.11；

OpuCD编码序列：SEQ ID NO.12；

nprE蛋白序列：SEQ ID NO.13；

aprE蛋白序列：SEQ ID NO.14；

amyE蛋白序列：SEQ ID NO.15；

Spo0A蛋白序列：SEQ ID NO.16；

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：重组枯草芽孢杆菌的构建

1)扩增四氢嘧啶合成基因簇ectABC的编码序列

以嗜碱芽胞杆菌(Bacillus alcalophilus DTY1)的基因组DNA为模板，用针对四氢嘧啶合成基因簇EctABC编码基因设计引物EctABC-P1、EctABC-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

EctABC-P1：5′-ATTAGTAAACAAATGACACTAG-3′

EctABC-P2：5′-TTACTACGTTTATTCTTCGC-3′

2)酶切、连接

用BamHI和SmaI双酶切PCR扩增产物，与预先使用BamH I和Sma I双酶切的pHY300PLK载体大片段进行连接，得到重组质粒。

3)转化、筛选以及序列验证

用热击的方法(Heat Shock)将上述制备的重组质粒转化至大肠杆菌DH5ɑ。阳性克隆记为DH5ɑ-pHY300PLK-EctABC。提取质粒，阳性质粒记为pHY300PLK-ectABC。通过基因测序确认序列正确。

4)重组表达菌株的构建

用电转染(Electroporation)的办法将重组质粒pHY300PLK-EctABC转入枯草芽孢杆菌ATCC6051(或者B.subtilis W800N)，获得重组BS-pHY300PLK-EctABC。

5)细胞改造

用CRISPR/Cas12a的方法敲除重组BS-pHY300PLK-EctABC的转运蛋白OpuC、nprE(中性蛋白酶)、aprE(碱性蛋白酶)、amyE(淀粉酶)、spo0A(芽孢形成转录因子)等基因。

A.下面以GRISPR的方法引入终止码“TAA”改造OpuCA为例说明详细步骤，该示例性方法不应对本发明有限定作用：

以Bacillus subtilis ATCC6051a为例，其基因组中的OpuCA序列CDS如下：

>NC_020507.1:c3470982-3469840Bacillus subtilis subsp.subtilis6051-HGW,complete sequence；

①PAM识别基序的确定及crRNA的设计：将opuCA序列中位于259-261的三个碱基(TTG)确定为PAM识别位点，设计crRNA序列如下：

Oligo top：5’-TTTCCCCCATATGACCATCCAGCAGAGT-3’

Oligo bottom：5’-TCTGCTGGATGGTCATATGGGGGAAATC-3’

②构建pAC-crRNA表达载体

将以上两条寡聚链进行磷酸化和退火(同时进行)，10μl反应体系如下：10X T4DNA ligase buffer 1μl；Oligo Top(100μM)1μl；Oligo Bottom(100μM)1μl；T4Polynucleotide Kinase(10U/μl)0.5μl；ddH2O 6.5μl。95℃孵育5min后，拿至室温自然降温到25℃左右，获得双链crRNA。

利用T4连接酶连接双链crRNA和经过Bpm I酶切的pAC质粒，经过热激转化E.coliTop10感受态细胞和阳性克隆子的菌落PCR鉴定以及测序鉴定，获得相应的pAC-crRNA(opuCA)表达载体。

③donor ssDNA的设计：

5’-T*G*AGGAGAAAAATCGGCTATGTGATACAGCAGATTGGTTAATTCCCCCATATGACCATCCAGCAGAACATCTCACTCGTACCAAAGC*T*G-3’，经Oligo合成获得donor ssDNA(opuCA)。

④BS-cpe01重组菌的获得：

将甘露醇诱导启动子PmtlA诱导cas12a表达的重组质粒pKD-cas12a-01热激转化至重组BS-pHY300PLK-EctABC菌中，30℃孵育24-36h，经菌落PCR及测序验证后，获得BS-cas12a-01-pHY300PLK-EctABC重组菌，命名为BS-cpe01。

⑤将100ng的pAC-crRNA(opuCA)和500ng donor ssDNA电转化至BS-cpe01电转感受态，电转条件为：电压2.1V，电容25u，电阻200Ω，电转后立即涂布于30℃预热的含相应抗生素和甘露醇的LB琼脂板中，30℃孵育24-36h，经菌落PCR验证，获得BS-cpe01opuCA重组菌。

⑥丢失BS-cpe01opuCA重组菌中的pAC-crRNA(opuCA)和pKD-cas12-01将重组单克隆置于100ul无抗LB中涂布于含相应抗生素和蔗糖的LB琼脂板，30℃孵育24-36h，挑转化子同时在无抗的和含有相应抗生素LB琼脂板上划线，只在无抗板上生长的克隆即为最终去除crRNA质粒的阳性克隆菌。将上述阳性克隆菌在42℃和相应蔗糖的LB培养条件培养，获得丢失pKD-cas12-01的重组菌落。

⑦通过提基因组和特异性引物的PCR扩增以及测序，最终获得△opuCA被终止表达菌株。

B.下面是GRISPR方法敲除目的基因详细步骤，该示例性方法不应对本发明有限定作用：

①PAM识别基序的确定及crRNA的设计：

请见下表中五个敲除基因序列中PAM识别位点，设计crRNA序列如下：

表2

②构建pHT-Cpf1载体质粒

利用SacI和BamHI限制性内切酶对质粒pHT01进行双酶切，获得6418bp和1538bp的两个片段，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收6418bp的片段。合成基因P43-FnCpf1，并利用Gibson

Cloning Kit同源重组至pHT01线性载体上，得到适用于Bacillus subtilis ATCC6051的CRISPR-FnCpf1载体质粒pHT-Cpf1(图谱见图1)。

③donor DNA的设计根据不同敲除目的基因的序列，位置。选择每个基因序列的上游750bp(RHA)),下游750bp(LHA).与crRNA一起构建可表达的crRNA和RHA,LHA基因片段。以opuC为例，具体设计为：Pveg-Direct repeat-opuC-crRNA-rrnB T1 terminator-opuC-RHA-LHA。此序列按顺序包含了以下基因元件：启动子，直接重复基因，目标基因中的crRNA，终止子，目标基因donor DNA(RHA-LHA)。

④构建pHT-opuC-Cpf1质粒：

以敲除opuC为例，具体实施步骤为：(1)利用BamHI限制性内切酶对质粒pHT-Cpf1进行单酶切，获得线性化的载体片段。(2)合成上一步③中基因片段。(3)利用Gibson

Cloning Kit将合成好的Pveg-Direct repeat-opuC-crRNA-rrnB T1terminator-opuC-RHA-LHA同源重组至pHT-Cpf1线性载体上，得到用于敲除Bacillussubtilis ATCC6051基因opuC的质粒pHT-opuC-Cpf1(图谱见图2)

⑤将表达FnCpf1和opuC-crRNA-opuC-RHA-LHA的重组质粒pHT-opuC-Cpf1热激转化至重组BS-pHT01-EctABC菌中，30℃孵育24-36h，经菌落PCR及测序验证后，获得BS-cas12a-01-opuC crRNA-pHT01-EctABC重组菌，命名为BS-cpe01opuCA重组菌。

⑥通过提基因组和特异性引物的PCR扩增以及测序验证，最终获得△opuCA敲除菌株。

⑦选择出丢失了pHT-opuC-Cpf1质粒的BS-cpe01opuCA重组菌。将重组单克隆接种到无抗LB培养液，37℃培养1-2小时后，培养液做分批稀释(1000倍-100倍-10倍)。取各稀释液到1000ul无抗LB中，37℃孵育24-36h。培养液在无抗LB琼脂板上划线，再次获得单克隆。然后挑单克隆同时在无抗的和含有相应抗生素(氨苄)的LB琼脂板上划线，只在无抗板上生长的克隆即为最终去除了pHT-opuC-Cpf1的质粒的阳性克隆菌。将上述阳性克隆菌保种，进行下一个敲除实验。

其它四个目标敲除基因按照同样的设计构建方法，在此不再赘述。

实施例2：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入该重组枯草芽孢杆菌(接入四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒，从而在菌体细胞内产生四氢嘧啶)在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，得到胞内含四氢嘧啶的发酵液。该发酵液经蝶片离心机分离得菌体浆液和发酵上清液，菌体浆液经纯水搅拌洗涤在10～30min，菌体内四氢嘧啶释放到胞外，二次蝶片离心机分离，上清液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。二次分离菌体浆液经板框压滤机过滤的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体8.6kg，菌渣蛋白饲料23.0kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为8250mg/L、702mg/L、288.9mg/L、76.1mg/L、3.14％，比原废水下降83.5％、94.6％、85.7％、93.5％、10.4％。

实施例3：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入该重组枯草芽孢杆菌(接入P43启动子和四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒)在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，得到胞内含四氢嘧啶的发酵液。该发酵液经蝶片离心机分离得菌体浆液和发酵上清液，菌体浆液经均质机破壁后经陶瓷膜过滤去除菌体碎片、大部分蛋白和部分色素，膜过滤液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。过滤的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体8.5kg，菌渣蛋白饲料23.4kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为6118mg/L、995.6mg/L、555.7mg/L、85.7mg/L、3.18％，比原废水下降73.4％、92.4％、81.6％、92.7％、9.2％。

实施例4：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入该重组枯草芽孢杆菌(接入pHY300PLK启动子和四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒)在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，得到胞内含四氢嘧啶的发酵液。该发酵液经板框压滤机过滤去除发酵液中的部分蛋白和部分色素，得到的菌体滤渣用1:2乙醇分3次逆流溶胀浸提，使细胞中的四氢嘧啶物质达到最大限度的释放，从而获得高浓度的四氢嘧啶物质。浸提液减压回收乙醇再用。回收乙醇后浸提液利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。浸提后的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体8.9kg，菌渣蛋白饲料23.8kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为5106mg/L、720.5mg/L、510.4mg/L、62mg/L、3.11％，比原废水下降77.8％、94.5％、83.1％、94.7％、11.2％。

实施例5：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入重组枯草芽孢杆菌(接入P43启动子和四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒，敲除敲除转运蛋白OpuC)在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，得到含四氢嘧啶的发酵液。该发酵液经板框压滤机过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。过滤的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体9.9kg，菌渣蛋白饲料24.2kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为6417mg/L、1362mg/L、703.7mg/L、100.9mg/L、3.17％，比原废水下降72.1％、89.6％、76.7％、91.4％、9.3％。

实施例6：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入重组枯草芽孢杆菌(接入P43启动子和四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒，通过GRISPR的方法引入终止码“TAA”到OpuC基因簇中每个单独基因OpuCA,OpuCB,OpuCC,OpuCD中间，从而破坏蛋白的正常表达)，在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，得到含四氢嘧啶的发酵液。该发酵液经板框压滤机过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。过滤的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体19.3kg，菌渣蛋白饲料23.0kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为5451mg/L、812.2mg/L、546.6mg/L、115.1mg/L、3.12％，比原废水下降76.3％、93.8％、81.9％、90.2％、10.8％。

实施例7：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入重组枯草芽孢杆菌(接入pHY300PLK启动子和四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒，通过GRISPR的方法引入终止码“TAA”到OpuC基因簇中每个单独基因OpuCA,OpuCB,OpuCC,OpuCD中间，从而破坏蛋白的正常表达)，在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，发酵中当碳源不足时适当补加碳源，充分利用各组分，得到含四氢嘧啶更多的发酵液。该发酵液经板框压滤机过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。过滤的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体21.4kg，菌渣蛋白饲料26.5kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为6808mg/L、1244.5mg/L、655.3mg/L、113.9mg/L、3.16％，比原废水下降70.4％、90.5％、78.3％、90.3％、9.6％。

实施例8：酶催化法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶

将酶法合成肌肽的发酵废水和酶反应纯化废水合并，经巴氏杀菌接入重组枯草芽孢杆菌(接入P43启动子和四氢嘧啶合成基因簇ectABC的重组质粒，通过GRISPR的方法引入终止码“TAA”到OpuC基因簇中每个单独基因OpuCA,OpuCB,OpuCC,OpuCD中间，从而破坏蛋白的正常表达，直接敲除nprE、aprE、amyE、spoIIAC的编码基因)，在pH7.0、32℃、溶氧控制在30％条件下发酵36h，发酵中当碳源不足时适当补加碳源，充分利用各组分，得到含四氢嘧啶更多的发酵液。该发酵液经板框压滤机过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后利用阳离子交换树脂吸附四氢嘧啶，再用氨水将四氢嘧啶洗脱后，经过活性炭脱色、浓缩醇沉、重结晶、干燥成品等操作步骤得到四氢嘧啶产品。过滤的菌渣干燥得蛋白饲料。每吨废水得到四氢嘧啶白色固体35.6kg，菌渣蛋白饲料25.2kg。排放的废水中COD、BOD、总磷、氨氮、氯化钠分别为3818mg/L、851.5mg/L、486.2mg/L、68.1mg/L、3.05％，比原废水下降83.4％、93.5％、83.9％、96.2％、12.7％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 珠海瑞德林生物有限公司

<120> 重组枯草芽孢杆菌的应用和利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法

<130> S21P001367

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> Bacillus alcalophilus DTY1

<400> 1

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<212> DNA

<213> ATCC6051

<400> 10

ttgaaaatga caaaaatcaa atggcttggc gcgtttgctc tcgtctttgt catgctgcta 60

ggcggctgct ctctgccggg tctcggcggc gcttctgacg acacgatcaa aatcggggcg 120

cagagcatga cagaatcaga aattgtagcg aatatgatcg cgcagcttat tgaacacgat 180

acagatttga ataccgcttt agtgaaaaac ctcggctcaa actatgttca gcaccaagcg 240

atgctgggcg gtgacattga tatttcagcc acgcgctatt ccggaacaga tttaacaagc 300

accctcggca aggaagcgga gaaagatccg aaaaaagcgc tgaacattgt gcagaatgag 360

tttcaaaagc gcttttctta taaatggttt gattcctacg gctttgataa cacatatgcc 420

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gggtataaag gctttgtcag cacatatggc tttgaattcg gcacaactta tccaatgcag 600

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<210> 11

<211> 224

<212> PRT

<213> ATCC6051

<400> 11

Met Glu Val Leu Gln Gln Leu Gly Thr Tyr Tyr Ser Gln Asn Gly Gly

1 5 10 15

Tyr Val Leu Gln Glu Phe Cys Arg His Phe Leu Met Ser Val Tyr Gly

20 25 30

Val Leu Phe Ala Ala Ile Val Gly Ile Pro Leu Gly Ile Leu Ile Ala

35 40 45

Arg Tyr Arg Arg Leu Ser Gly Trp Val Phe Ala Val Thr Asn Val Ile

50 55 60

Gln Thr Ile Pro Ala Leu Ala Met Leu Ala Val Leu Met Leu Val Met

65 70 75 80

Gly Leu Gly Ala Asn Thr Val Ile Leu Ser Leu Phe Leu Tyr Ser Leu

85 90 95

Leu Pro Ile Ile Arg Asn Thr Tyr Thr Gly Ile Ile Ser Ile Glu His

100 105 110

Ala Tyr Leu Glu Ser Gly Lys Ala Met Gly Met Thr Lys Phe Gln Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Glu Leu Pro Leu Ala Leu Ser Val Ile Met Ala Gly

130 135 140

Leu Arg Thr Ala Leu Val Ile Ala Ile Gly Ile Thr Ala Ile Gly Thr

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Phe Val Gly Ala Gly Gly Leu Gly Asp Ile Ile Val Arg Gly Ser Asn

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Ala Thr Asn Gly Thr Ala Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Pro Thr Ala

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Leu Met Ala Val Ile Ala Asp Leu Val Met Gly Trp Leu Glu Arg Ala

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Leu Ser Pro Ile Lys Lys Arg Lys Lys Lys Asn Leu Ala Gly Ala Ala

210 215 220

<210> 12

<211> 675

<212> DNA

<213> ATCC6051

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atggaagtac tacagcagct tggcacatac tattcgcaaa acggcggtta tgtgctgcag 60

gagttttgcc gccattttct gatgtcggtg tacggcgttt tatttgccgc cattgttgga 120

attccgctcg gcatcctgat agccagatac agaagattaa gcggatgggt ttttgcggtc 180

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<211> 521

<212> PRT

<213> ATCC6051

<400> 13

Met Gly Leu Gly Lys Lys Leu Ser Val Ala Val Ala Ala Ser Phe Met

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Ser Leu Pro Gly Val Gln Ala Ala Glu Gly His Gln

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Leu Lys Glu Asn Gln Thr Asn Phe Leu Ser Lys Asn Ala Ile Ala Gln

35 40 45

Ser Glu Leu Ser Ala Pro Asn Asp Lys Ala Val Lys Gln Phe Leu Lys

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Lys Asn Ser Asn Ile Phe Lys Gly Asp Pro Ser Lys Arg Leu Lys Leu

65 70 75 80

Val Glu Ser Thr Thr Asp Ala Leu Gly Tyr Lys His Phe Arg Tyr Ala

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Pro Val Val Asn Gly Val Pro Ile Lys Asp Ser Gln Val Ile Val His

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Val Asp Lys Ser Asp Asn Val Tyr Ala Val Asn Gly Glu Leu His Asn

115 120 125

Gln Ser Ala Ala Lys Thr Asp Asn Ser Gln Lys Val Ser Ser Glu Lys

130 135 140

Ala Leu Ala Leu Ala Phe Lys Ala Ile Gly Lys Ser Pro Asp Ala Val

145 150 155 160

Ser Asn Gly Ala Ala Lys Asn Ser Asn Lys Ala Glu Leu Lys Ala Ile

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Glu Thr Lys Asp Gly Ser Tyr Arg Leu Ala Tyr Asp Val Thr Ile Arg

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Tyr Val Glu Pro Glu Pro Ala Asn Trp Glu Val Leu Val Asp Ala Glu

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Thr Gly Ser Ile Leu Lys Gln Gln Asn Lys Val Glu His Ala Ala Ala

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Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Thr Gln Tyr Asn Asn Ala Ala

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Ser Pro Leu Ser Gly Ser Leu Asp Val Thr Ala His Glu Met Thr His

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<212> PRT

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Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

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Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys

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Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser

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Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly

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Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu

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Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr

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Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser

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His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu

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Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly

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Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro

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<212> PRT

<213> ATCC6051

<400> 15

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

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Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser

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His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr

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Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met

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Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala

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Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn

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Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys Asn Trp Ser Asp Arg Trp Asp

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Thr Gln Val Gln Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Leu Asp Arg Ala Leu Asn

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Pro Asp Asp Gly Ser Tyr Gly Ser Gln Phe Trp Pro Asn Ile Thr Asn

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Asn Ile Ser His Tyr Ala Ser Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Thr

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Trp Val Glu Ser His Asp Thr Tyr Ala Asn Asp Asp Glu Glu Ser Thr

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Trp Met Ser Asp Asp Asp Ile Arg Leu Gly Trp Ala Val Ile Ala Ser

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Arg Ser Gly Ser Thr Pro Leu Phe Phe Ser Arg Pro Glu Gly Gly Gly

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Asn Gly Val Arg Phe Pro Gly Lys Ser Gln Ile Gly Asp Arg Gly Ser

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Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp

420 425 430

Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp

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Pro Asp Asp Ile Ala Lys Ala Pro His Val Phe Leu Glu Asn Tyr Lys

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Thr Gly Val Thr His Ser Phe Asn Asp Gln Leu Thr Ile Thr Leu Arg

485 490 495

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Gly Val Thr Arg Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Val Lys Arg Asp Pro Ala

545 550 555 560

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Leu Pro His

<210> 16

<211> 267

<212> PRT

<213> ATCC6051

<400> 16

Met Glu Lys Ile Lys Val Cys Val Ala Asp Asp Asn Arg Glu Leu Val

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Ser Leu Leu Ser Glu Tyr Ile Glu Gly Gln Glu Asp Met Glu Val Ile

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Gly Val Ala Tyr Asn Gly Gln Glu Cys Leu Ser Leu Phe Lys Glu Lys

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Asp Pro Asp Val Leu Val Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu Asp Gly

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Leu Ala Val Leu Glu Arg Leu Arg Glu Ser Asp Leu Lys Lys Gln Pro

65 70 75 80

Asn Val Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asp Val Thr Lys Lys

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Ala Val Asp Leu Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Pro Phe Asp Met

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Glu Asn Leu Val Gly His Ile Arg Gln Val Ser Gly Asn Ala Ser Ser

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Val Thr His Arg Ala Pro Ser Ser Gln Ser Ser Ile Ile Arg Ser Ser

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Gln Pro Glu Pro Lys Lys Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ser Ile

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Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Leu Tyr Leu

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Arg Glu Ala Ile Ser Met Val Tyr Asn Asp Ile Glu Leu Leu Gly Ser

180 185 190

Ile Thr Lys Val Leu Tyr Pro Asp Ile Ala Lys Lys Phe Asn Thr Thr

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Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp

210 215 220

Ser Arg Gly Asn Ile Asp Ser Ile Ser Ser Leu Phe Gly Tyr Thr Val

225 230 235 240

Ser Met Thr Lys Ala Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val

245 250 255

Ala Asp Lys Leu Arg Leu Glu His Lys Ala Ser

260 265

Claims

1.重组枯草芽孢杆菌在以酶法合成肌肽的废水为原料生产四氢嘧啶中的应用，所述重组枯草芽孢杆菌能够表达来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilus DTY1的EctA、EctB和EctC。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述EctA、EctB和EctC的编码基因为四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码基因，由启动子+EctA编码基因+间隔序列+EctB编码基因+间隔序列+EctC编码序列+终止子组成。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述启动子为P43启动子、pHY300PLK载体上的启动子或来源于嗜碱芽胞杆菌Bacillus alcalophilus DTY1的天然启动子。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌无法表达四氢嘧啶跨膜转运蛋白OpuC。

5.根据权利要求1或4所述应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌无法表达中性蛋白酶nprE、碱性蛋白酶aprE、淀粉酶amyE和芽孢形成转录因子spo0A。

6.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述无法表达通过敲除蛋白编码基因或通过GRISPR的方法在蛋白编码基因中引入终止密码子破坏其表达。

7.一种利用酶法合成肌肽的废水生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，包括：

步骤1、提供酶法合成肌肽的废水；

步骤2、将权利要求1中的重组枯草芽孢杆菌接入所述废水中发酵，得到胞内含四氢嘧啶的发酵液，离心或板框压滤发酵液获取湿菌体；

步骤4、洗脱后的四氢嘧啶经过精制得到四氢嘧啶成品。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述酶法合成肌肽的废水为利用微生物发酵生产L-氨基酸连接酶的酶液，催化肌肽合成原料合成肌肽工艺中产生的废水，包括L-氨基酸连接酶发酵废水和L-氨基酸连接酶反应纯化废水。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述L-氨基酸连接酶发酵废水经由以下方法获得：

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述L-氨基酸连接酶反应纯化废水经由以下方法获得：

肌肽合成原料加入L-氨基酸连接酶的酶液进行反应，反应完成后得到肌肽粗品溶液，依次经过膜分离、离子交换柱层析、结晶工艺进行纯化获得肌肽纯品，被膜分离和离子交换柱层析截留的废液作为酶反应纯化废水。