JP2010500984A - Ｃｃｒ５に対する抗体と抗膜融合ペプチドとの抱合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、１〜８個の抗膜融合ペプチドが各々、ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端に抱合することを特徴とする、１つまたはそれ以上の抗膜融合ペプチドおよびＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する該抗体を含む抱合体、ならびに該抱合体の医薬的使用に関する。
Description
本発明は、１〜８個の抗膜融合ペプチドが各々、抗ＣＣＲ５抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端に抱合した、ＣＣＲ５に対する抗体と抗膜融合ペプチドとの抱合体に関するものである。抗膜融合ペプチドは、アミノ酸レベルで異別であり得、同様であり得または同一であり得る。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による細胞の感染は、感染されるべき細胞の膜およびウイルス膜が融合する過程によって影響される。この過程に関する一般的なスキームが提唱される：ウイルス外被糖タンパク質複合体（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）は、感染されるべき細胞の膜に局在する細胞表面受容体と相互作用する。例えば、ＣＣＲ−５またはＣＸＣＲ−４等の共受容体との組み合わせでのＣＤ４受容体へのｇｐ１２０の結合は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体の高次構造の変化を生じる。この高次構造変化の結果、ｇｐ４１タンパク質は、標的細胞の膜中へと挿入することができる。この挿入が、膜融合過程の始まりである。天然の多型性のため、ｇｐ４１タンパク質のアミノ酸配列が、異なるＨＩＶ系において変化することは公知である。しかし、同一のドメイン構造、より精確には、融合シグナル、２つの七つ組の反復ドメイン（ＨＲ１、ＨＲ２）および（Ｎ末端からＣ末端への方向における）膜貫通ドメインが認識されることが可能である。融合（または膜融合）ドメインが、細胞膜中への挿入および細胞膜の崩壊に関与していることが示唆される。ＨＲ領域は、７個のアミノ酸（「七つ組」）を含む多重ストレッチから構築される（例えば、Shu, W., et al., Biochemistry 38 (1999) 5378-5385参照）。七つ組のほかに、１つまたはそれ以上のロイシンジッパー様モチーフが存在する。この組成は、ｇｐ４１タンパク質のコイルドコイル構造の形成の主な原因となり、これらのドメインに由来するペプチドの形成とちょうど同様である。コイルドコイルは、２つまたはそれ以上の相互作用する螺旋からなる一般的なオリゴマー中にある。ｇｐ４１のＨＲ１またはＨＲ２ドメインから推定されるアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞中へのＨＩＶの取り込みのインビトロおよびインビボでの効果的な阻害剤である（例えば、ペプチド、例えば、米国特許第５，４６４，９３３号、米国特許第５，６５６，４８０号、米国特許第６，２５８，７８２号、米国特許第６，３４８，５６８号、または米国特許第６，６５６，９０６号参照）。例えば、Ｔ２０（ＤＰ１７８、Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）、ＨＲ２ペプチドとしても公知）、Ｔ６５１（米国特許第６，４７９，０５５号）、およびＴ２６３５（ＷＯ２００４／０２９０７４）は、ＨＩＶ感染の非常に強力な阻害剤である。例えば、アミノ酸置換または化学的架橋によってＨＲ２由来ペプチドの有効性を増大させることが試行されている（Sia, S.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669; Otaka, A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940）。
特定の分子へのペプチドの抱合は、前記ペプチドの薬物動態特性を変化させることが可能であり、例えば、このようなペプチド抱合体の血清半減期は、増大することが可能である。抱合は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびインターロイキン６に関して（欧州特許第０ ４４２ ７２４号）、ＰＥＧおよびエリスロポエチンに関して（ＷＯ０１／０２０１７）、エンドスタチンおよび免疫グロブリンを含むキメラ分子に関して（米国特許出願第２００５／００８６４９号）、分泌型抗体ベースの融合タンパク質に関して（米国特許出願第２００２／１４７３１１号）、アルブミンを含む融合ポリペプチドに関して（米国特許出願第２００５／０１００９９１号；ヒト血清アルブミンに関しては米国特許第５，８７６，９６９号）、ペグ化されたポリペプチドに関して（米国特許出願第２００５／０１１４０３７号）、およびインターフェロン融合に関して報告される。ゲロニンと抗体とを含む免疫毒素（ＷＯ９４／２６９１０）、修飾されたトランスフェリン−抗体融合タンパク質（米国特許出願第２００３／０２２６１５５号）、抗体−サイトカイン融合タンパク質（米国特許出願第２００３／００４９２２７号）、および免疫賦活性活性、膜輸送活性、または同種親和性活性を有するペプチドと抗体とからなる融合タンパク質（米国特許出願第２００３／０１０３９８４号）も、従来技術に記載される。ＷＯ２００４／０８５５０５において、巨大分子へ化学的に連結された生物活性化合物からなる持続性の生物活性のある抱合体が報告される。
共受容体ＣＣＲ５は、大部分のＨＩＶ−１主要単離物によって使用され、感染の確立および維持に重大である。さらに、ＣＣＲ５の機能は、ヒトの健康にとってなくても困らない。突然変異ＣＣＲ５アレル「ＣＣＲ５Δ３２」は、切断型の非機能性タンパク質をコードする（Samson, M., et al., Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M., et al., Science 273 (1996) 1856-1862）。突然変異のためのホモ接合型の個体は、ＣＣＲ５発現を欠失し、ＨＩＶ−１感染から強力に保護される。前記ホモ接合型は、明白な表現型の結果を示さず、Ｍ向性ＨＩＶ感染に対して非常に抵抗性があるのに対し、ヘテロ接合型の個体は、遅延した疾病の進行を呈する（Schwarz, M.K. and Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358）。ＣＣＲ５の欠失によって、明らかな逆の結果が生じず、おそらく、ＣＣＲ５が、多くの重複する機能を共有しそのほとんどが代替的な受容体を有するαケモカイン、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳのための受容体として非常に重複性のあるケモカインネットワークの一部であるからである（Rossi, D. and Zlotnik, A., Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242）。ＨＩＶ−１共受容体としてのＣＣＲ５の同定は、そのリガンドであるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳが、Ｒ５単離物によって感染を遮断するが、Ｒ５Ｘ４単離物によってもＸ４単離物によっても感染を遮断し能力をベースとしていた（Cocchi, F., et al., Science 270 (1995) 1811-1815）。ＣＣＲ５は、炎症反応中に主として生じ、および好中球（ＣＸＣケモカイン）、マクロファージおよびＴ細胞のサブセット（ＴヘルパーＴｈ１およびＴｈ２細胞）の動員を調節する「クラスター」ケモカインの受容体でもある。Ｔｈ１反応は典型的に、ウイルスおよび腫瘍に対して効果的な細胞仲介性免疫、例えば細胞内寄生体を殺滅しおよび例えば自己免疫反応を永続化させる原因である炎症誘発性反応を包含するものであるのに対し、Ｔｈ２反応は、アレルギーにおいて中心的であると考えられる。したがって、これらのケモカイン受容体の阻害剤は、免疫調節物質として有用であり得る。Ｔｈ１反応に関して、過敏性反応は、例えば、関節リウマチを含む自己免疫において減衰し、またはＴｈ２反応に関して、喘息発作またはアトピー性皮膚炎を含むアレルギー性反応が減少する（例えば、Schols, D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893, Mueller, A., and Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38, Kazmierski, W.M., et al., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278, Lehner, T., Trends Immunol. 23 (2002) 347-351参照）。
ヒトＣＣＲ５に対する抗体は、例えば、ＰＲＯ１４０（Olson, W.C., et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155）、および／または２Ｄ７（Samson, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941）である。さらなる抗体は、米国特許出願第２００４／００４３０３３号、米国特許第６，６１０，８３４号、米国特許出願第２００３／０２２８３０６号、米国特許出願第２００３／０１９５３４８号、米国特許出願第２００３／０１６６８７０号、米国特許出願第２００３／０１６６０２４号、米国特許出願第２００３／０１６５９８８号、米国特許出願第２００３／０１５２９１３号、米国特許出願第２００３／０１０００５８号、米国特許出願第２００３／００９９６４５号、米国特許出願第２００３／００４９２５１号、米国特許出願第２００３／００４４４１１号、米国特許出願第２００３／０００３４４０号、米国特許第６，５２８，６２５号、米国特許出願第２００２／０１４７１４７号、米国特許出願第２００２／０１４６４１５号、米国特許出願第２００２／０１０６３７４号、米国特許出願第２００２／００６１８３４号、米国特許出願第２００２／００４８７８６号、米国特許出願第２００１／００００２４１号、欧州特許第１ ３２２ ３３２号、欧州特許第１ ２６３ ７９１号、欧州特許第１ ２０７ ２０２号、欧州特許第１ １６１ ４５６号、欧州特許第１ １４４ ００６号、ＷＯ２００３／０７２７６６、ＷＯ２００３／０６６８３０、ＷＯ２００３／０３３６６６、ＷＯ２００２／０８３１７２、ＷＯ０２／２２０７７、ＷＯ０１／５８９１６、ＷＯ０１／５８９１５、ＷＯ０１／４３７７９、ＷＯ０１／４２３０８、および欧州特許第０５００７１３８．０号に記載される。
ＣＣＲ５に対する抗体のポリエチレングリコール抱合体は、米国特許出願第２００３／０２２８３０６号から公知である。米国特許出願第２００３／０２１５４２１号は、ケモカイン−毒素抱合体に言及する。ＷＯ０１／４３７７９は、抗ＣＤ４抗体と抗ＣＣＲ５抗体との抱合体に言及し、抗ＣＤ４抗体とＨＩＶ−１融合阻害ペプチドとの抱合体に言及する。ＣＣＲ５抗体と毒素との抱合体は、欧州特許第１ ３４６ ７３１号に記載される。
本発明は、１〜８個、好ましくは２または４個の抗膜融合ペプチドが、ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端に各々抱合することを特徴とする、１〜８個の抗膜融合ペプチドとＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体とを含む抱合体を報告する（抗体あたり８個の抗膜融合ペプチドの多くは、抗体が、８末端を含み、すなわち例えば２個の重鎖および２個の軽鎖から構成される場合に可能になるに過ぎず、抗体が、例えばｓｃＦｖとしてＣ末端およびＮ末端のより少数を含む場合、抱合体中で最大でも生じ得る抗膜融合ペプチドの対応する数も減少し、すなわち、８個未満まで減少する）。
本発明は、さらに一つまたはそれを超える抗膜融合性ペプチドおよび抗ＣＣＲ５抗体（ｍＡｂ ＣＣＲ５）を含み、１〜８個の抗膜融合性ペプチドが該抗ＣＣＲ５抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端に各々接合することを特徴とする（抗体あたり８個の抗膜融合ペプチドの多くは、抗体が、８末端を含み、すなわち例えば２個の重鎖および２個の軽鎖から構成される場合に可能になるに過ぎず、抗体が、例えばｓｃＦｖとしてＣ末端およびＮ末端のより少数を含む場合、抱合体中で最大でも生じ得る抗膜融合ペプチドの対応する数も減少し、すなわち、８個未満まで減少する）。
好ましくは、抗ＣＣＲ５抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸は、抗膜融合ペプチドのアミノ末端アミノ酸へ、または抗膜融合ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、抗体鎖のアミノ末端アミノ酸へ、好ましくは中間リンカーを有しまたは有さないペプチド結合によって抱合される。
好ましくは、抱合体は、一般式
ｍＡｂ ＣＣＲ５−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎ
を特徴とし、式中、ｍは、各抗膜融合ペプチドに関して独立して０（すなわち、ｍＡｂ ＣＣＲ５と抗膜融合ペプチドとの間のペプチド結合）または１（すなわち、ｍＡｂ ＣＣＲ５と抗膜融合ペプチドとの間のリンカー）のいずれかであり、ｎは、１〜８の整数である。
ｍＡｂ ＣＣＲ５−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎ
を特徴とし、式中、ｍは、各抗膜融合ペプチドに関して独立して０（すなわち、ｍＡｂ ＣＣＲ５と抗膜融合ペプチドとの間のペプチド結合）または１（すなわち、ｍＡｂ ＣＣＲ５と抗膜融合ペプチドとの間のリンカー）のいずれかであり、ｎは、１〜８の整数である。
ｍＡｂ ＣＣＲ５の重鎖および／または軽鎖と抗膜融合ペプチドとの好ましい抱合体（「鎖抱合体」）は、
（１）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（３）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（４）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（６）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（７）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（８）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
からなる群より選択され、式中、リンカーは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で同一または異別であり得、ｍは、１または０の整数であり、ｍは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で独立して同一または異別であり得る。
（１）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（３）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（４）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（６）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（７）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（８）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
からなる群より選択され、式中、リンカーは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で同一または異別であり得、ｍは、１または０の整数であり、ｍは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で独立して同一または異別であり得る。
（ペプチドまたはｍＡｂ ＣＣＲ５鎖の左側はＮ末端を意味し、右側はＣ末端を意味する。したがって、（１）において、抗膜融合ペプチドのＣ末端は、ペプチド結合またはリンカーによって、ｍＡｂ ＣＣＲ５の重鎖のＮ末端へ連結される）。
好ましくは、鎖抱合体は、（例えば、２つの軽鎖およびＦｃ定常部、ｓｃＦｖ断片、またはＦａｂ断片を含む２つの重鎖からなる）ｍＡｂ ＣＣＲ５を含む、本発明に従った抱合体へ構築される。
特に好ましい鎖抱合体は、（２）、（３）、（４）、および（７）である。本発明に従った特に好ましい抱合体は、２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］および２個の（２）、２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］および２個の（３）、２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５重鎖］および２個の（４）、または２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］および２個の（７）を含む。重鎖および／または軽鎖は、好ましくは定常部（Ｆｃ）を含む。
好ましくは、抱合体は、免疫グロブリンフレームワークと重鎖ＣＤＲ３配列番号１６、１７からなる群より選択されるＣＤＲ３領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、免疫グロブリンフレームワークと、重鎖ＣＤＲ３配列番号１６、１７からなる群より選択されるＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２配列番号１３、１４、１５からなる群より選択されるＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ１配列番号９、１０、１１、１２からなる群より選択されるＣＤＲ１領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、配列番号１、３、５、および７を含む重鎖可変ドメインの群より選択される重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、免疫グロブリンフレームワークと、配列番号１８、１９、２０より選択されるＣＤＲ１領域、配列番号２１、２２、２３より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号２４、２５より選択されるＣＤＲ３領域とからなる軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、重鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲを、または重鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、
ａ）アミノ酸配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびアミノ酸配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｂ）アミノ酸配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン
からなる群より独立して選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
ａ）アミノ酸配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびアミノ酸配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｂ）アミノ酸配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン
からなる群より独立して選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、アミノ酸配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびアミノ酸配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、またはアミノ酸配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、ならびに配列番号３６〜６２および配列番号６７〜７０からなる群より選択されるリンカー、ならびに配列番号２９〜３５および配列番号７３によって定義されるペプチドの群より選択される抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、Ｃ３４、Ｔ２０、Ｔ１２４９、Ｔ６５１、Ｔ２６３５、Ｎ３６、ＤＰ１０７、およびａｆｐ−１を含むペプチドの群より選択される抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、重鎖の各Ｃ末端にまたは軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチド（２個の抗膜融合ペプチド）を含むことを特徴とする。好ましくは、抱合体は、重鎖の各Ｃ末端におよび軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチド（４個の抗膜融合ペプチド）を含むことを特徴とする。
抱合体は、配列番号２の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号１の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、配列番号４の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号３の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、配列番号６の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号５の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、または配列番号８の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号７の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、該抗ＣＣＲ５抗体が、ＩｇＧ１サブクラスに属することを特徴とする。該抗ＣＣＲ５抗体が、アミノ酸Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／またはＤ２６５における突然変異を有するＩｇＧ４サブクラスまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスに属し、および／またはＰＶＡ２３６突然変異を含有することも好ましい。好ましくは、抱合体は、ＩｇＧ４サブクラスの該抗ＣＣＲ５抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐを有し、およびＩｇＧ１サブクラスの該抗ＣＣＲ５抗体が、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有することを特徴とする。
本発明はさらに、２〜８個、好ましくは２または４個の抗膜融合ペプチドが、抗ＣＤ４抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端に各々抱合することを特徴とする、２個またはそれ以上の抗膜融合ペプチドと該抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ ＣＤ４）とを含む抱合体を含む（ｍＡｂ ＣＤ４あたり８個の抗膜融合ペプチドの多くは、抗体が、８末端を含み、すなわち例えば２個の重鎖および２個の軽鎖から構成される場合に可能になるに過ぎず、ｍＡｂ ＣＤ４が、例えばｓｃＦｖとしてＣ末端およびＮ末端のより少数を含む場合、抱合体中で最大でも生じ得る抗膜融合ペプチドの対応する数も減少し、すなわち、８個未満まで減少する）。
好ましくは、抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸は、抗膜融合ペプチドのアミノ末端アミノ酸へ、または抗膜融合ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、抗体鎖のアミノ末端アミノ酸へ、好ましくは中間リンカーを有しまたは有さないペプチド結合によって抱合される。
好ましくは、抱合体は、一般式
［抗体］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎ
を特徴とし、式中ｍは、各抗膜融合ペプチドに関して独立して０（すなわち、抗体と抗膜融合ペプチドとの間のペプチド結合）または１（すなわち、抗体と抗膜融合ペプチドとの間のリンカー）のいずれかであり、ｎは、２〜８の整数であり、好ましくは、２〜８の偶数であり、より好ましくは、２または４である。好ましくは、該抗体は、ｍＡｂ ＣＤ４である。
［抗体］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎ
を特徴とし、式中ｍは、各抗膜融合ペプチドに関して独立して０（すなわち、抗体と抗膜融合ペプチドとの間のペプチド結合）または１（すなわち、抗体と抗膜融合ペプチドとの間のリンカー）のいずれかであり、ｎは、２〜８の整数であり、好ましくは、２〜８の偶数であり、より好ましくは、２または４である。好ましくは、該抗体は、ｍＡｂ ＣＤ４である。
抗体の重鎖および／または軽鎖と抗膜融合ペプチドとの好ましい抱合体（「鎖抱合体」）は、（Ｎ末端からＣ末端への方向で）
（１）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（３）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（４）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（６）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（７）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（８）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
からなる群より選択され、式中、リンカーは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で同一または異別であり得、ｍは、１または０の整数であり、ｍは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で独立して同一または異別であり得る。
（１）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（３）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（４）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（６）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（７）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（８）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
からなる群より選択され、式中、リンカーは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で同一または異別であり得、ｍは、１または０の整数であり、ｍは、該鎖抱合体中（該鎖抱合体内および該鎖抱合体間）で独立して同一または異別であり得る。
（ペプチドまたは抗体鎖の左側は、Ｎ末端を意味し、右側はＣ末端を意味する。したがって、（１）において、抗膜融合ペプチドのＣ末端は、ペプチド結合またはリンカーによって、抗体の重鎖のＮ末端へ連結される）。したがって、（１）において、抗膜融合ペプチドのＣ末端は、ペプチド結合またはリンカーによって、抗体の重鎖のＮ末端へ連結される）。
好ましくは、鎖抱合体は、（例えば、２つの軽鎖およびＦｃ定常部、ｓｃＦｖ断片、またはＦａｂ断片を含む２つの重鎖からなる）ｍＡｂ ＣＤ４を含む、本発明に従った抱合体へ構築される。
特に好ましい鎖抱合体は、（２）、（３）、（４）、および（７）である。本発明に従った特に好ましい抱合体は、２個の［ｍＡｂ ＣＤ４軽鎖］および２個の（２）、２個の［ｍＡｂ ＣＤ４軽鎖］および２個の（３）、２個の［ｍＡｂ ＣＤ４重鎖］および２個の（４）、または２個の［ｍＡｂ ＣＤ４軽鎖］および２個の（７）を含む。重鎖および／または軽鎖は、好ましくは定常部を含む。
好ましくは、抱合体は、免疫グロブリンフレームワークと、重鎖ＣＤＲ３配列番号１０３、１０４、または１０５より選択されるＣＤＲ３領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、免疫グロブリンフレームワークと、配列番号１０３、１０４、または１０５のＣＤＲ３配列より選択されるＣＤＲ３領域、配列番号１００、１０１、または１０２のＣＤＲ２配列より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号９７、９８、または９９のＣＤＲ１配列より選択されるＣＤＲ１領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、重鎖可変ドメインが、配列番号８２、または８３を含む、前記重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、免疫グロブリンフレームワークと、配列番号８７、８８、８９、または９０より選択されるＣＤＲ１領域、配列番号９１、９２、または９３より選択されるＣＤＲ２領域、および配列番号９４、９５、または９６より選択されるＣＤＲ３領域とからなる軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、重鎖ＣＤＲとして配列番号８１のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号７５のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号８２のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号７６のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号８４のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号７８のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号８５のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号７９のＣＤＲを、または重鎖ＣＤＲとして配列番号８６のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号８０のＣＤＲを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、
ａ）アミノ酸配列番号８１によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７５によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｂ）アミノ酸配列番号８２によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸配列番号８４によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７８によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸配列番号８５によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７９によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｅ）アミノ酸配列番号８６によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号８０によって定義される軽鎖可変ドメイン
より独立して選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
ａ）アミノ酸配列番号８１によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７５によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｂ）アミノ酸配列番号８２によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸配列番号８４によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７８によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸配列番号８５によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号７９によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｅ）アミノ酸配列番号８６によって定義される重鎖可変ドメイン、および配列番号８０によって定義される軽鎖可変ドメイン
より独立して選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、アミノ酸配列番号８１によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号７５によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号８２によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号７６によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号８４によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号７８によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号８５によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号７９によって定義される軽鎖可変ドメイン、アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、ならびに配列番号３６〜６２および配列番号６７〜７０より選択されるリンカー、ならびに配列番号２９〜３５または配列番号７３の抗膜融合ペプチドより選択される抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、抗膜融合ペプチドＣ３４、Ｔ２０、Ｔ１２４９、Ｔ６５１、Ｔ２６３５、Ｎ３６、ＤＰ１０７、またはａｆｐ−１より選択される抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、重鎖の各Ｃ末端にまたは軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチド（２個の抗膜融合ペプチド）を含むことを特徴とする。好ましくは、抱合体は、重鎖の各Ｃ末端におよび軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチド（４個の抗膜融合ペプチド）を含むことを特徴とする。好ましくは、抱合体は、重鎖の２つのＣ末端におよび軽鎖の２つのＮ末端に抗膜融合ペプチド（４個の抗膜融合ペプチド）を含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、配列番号７５の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号８１の重鎖可変ドメイン、配列番号６９のリンカーおよび配列番号７３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、配列番号７６の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号８２の重鎖可変ドメイン、配列番号６９のリンカーおよび配列番号７３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、配列番号７８の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号８４の重鎖可変ドメイン、配列番号６９のリンカーおよび配列番号７３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、配列番号７９の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号８５の重鎖可変ドメイン、配列番号６９のリンカーおよび配列番号７３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、または配列番号８０の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号８６の重鎖可変ドメイン、配列番号６９のリンカーおよび配列番号７３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とする。
好ましくは、抱合体は、該抗体が、ＩｇＧ１サブクラスまたはＩｇＧ４サブクラスに属することを特徴とする。該抗体が、アミノ酸位置Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／またはＤ２６５における突然変異を有するＩｇＧ４またはＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスに属し、および／またはＰＶＡ２３６突然変異を含有することも好ましい。好ましくは、抱合体は、ＩｇＧ４サブクラスの該抗体が、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有し、およびＩｇＧ１サブクラスの該抗体が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を有することを特徴とする。
該抗体が、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＣＲ５抗体であることが特に好ましい。
本発明は、
ａ）抱合体の発現に適した条件下で、本発明に従った抱合体をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子を含有する１つまたはそれ以上のプラスミドを含有する細胞を培養すること、
ｂ）細胞または上清から抱合体を回収すること
を含むことを特徴とする、本発明に従った抱合体の産生のための方法を含む。
ａ）抱合体の発現に適した条件下で、本発明に従った抱合体をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子を含有する１つまたはそれ以上のプラスミドを含有する細胞を培養すること、
ｂ）細胞または上清から抱合体を回収すること
を含むことを特徴とする、本発明に従った抱合体の産生のための方法を含む。
一実施態様において、同一の発現ベクター上にまたは異別の発現ベクター上に配置される連結された抗膜融合ペプチドを有しまたは有さないｍＡｂ ＣＣＲ５またはｍＡｂ ＣＤ４の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子がある。
本発明は、本発明に従った抱合体を医薬的に許容され得る賦形剤または担体とともに含有する医薬組成物を含む。
本発明は、ウイルス感染の処置のための薬物の製造のための、本発明に従った抱合体の使用を含む。好ましくは、使用は、ウイルス感染が、ＨＩＶ感染であることを特徴とする。
本発明は、抗ウイルス処置の必要とする患者の処置、好ましくは抗ＨＩＶ処置のための、本発明に従った抱合体の使用を含む。
発明の説明
発明の説明
本発明の一局面は、１〜８個の抗膜融合ペプチドが各々、抗ＣＣＲ５抗体（ｍＡｂ ＣＣＲ５）の重鎖および／または軽鎖の１末端へ抱合されることを特徴とする、１つまたはそれ以上の抗膜融合ペプチドと該ＣＣＲ５抗体とを含む抱合体である。ｍＡｂ ＣＣＲ５あたりの８個の抗膜融合ペプチドの多くは、ｍＡｂ ＣＣＲ５が、８末端を含み、すなわち例えば２個の重鎖および２個の軽鎖から構成される場合に可能になるに過ぎない。ｍＡｂ ＣＣＲ５が、例えばｓｃＦｖとしてＣ末端およびＮ末端のより少数を含む場合、抱合体中で最大でも生じ得る抗膜融合ペプチドの対応する数も減少し、すなわち、８個未満まで減少する本発明の別の局面は、２〜８個の抗膜融合ペプチドが各々、抗ＣＤ４抗体（ｍＡｂ ＣＤ４）の重鎖および／または軽鎖の１末端へ抱合されることを特徴とする、２つまたはそれ以上の抗膜融合ペプチドと該ＣＤ４抗体とを含む抱合体である。
一般的に抗体に対してまたはｍＡｂ ＣＣＲ５に対してもしくはｍＡｂ ＣＤ４に対して以下の参照がなされる場合、他のｍＡｂおよび対応する配列に対する同一の参照も適宜含まれる。
「抗膜融合ペプチド」とは、とりわけ、ウイルスによって感染されていない細胞の膜融合による感染の阻害を含む、膜融合または膜融合事象自体と関連した事象を阻害するペプチドである。これらの抗膜融合ペプチドは、好ましくは直鎖状ペプチドである。例えば、前記抗膜融合ペプチドは、例えばＤＰ１０７、ＤＰ１７８等のｇｐ４１外部ドメインに由来し得る。このようなペプチドの例は、米国特許第５，４６４，９３３号、米国特許第５，６５６，４８０号、米国特許第６，０１３，２６３号、米国特許第６，０１７，５３６号、米国特許第６，０２０，４５９号、米国特許第６，０９３，７９４号、米国特許第６，０６０，０６５号、米国特許第６，２５８，７８２号、米国特許第６，３４８，５６８号、米国特許第６，４７９，０５５号、米国特許第６，６５６，９０６号、ＷＯ１９９６／１９４９５、ＷＯ１９９６／４０１９１、ＷＯ１９９９／５９６１５、ＷＯ２０００／６９９０２、およびＷＯ２００５／０６７９６０において見出され得る。例えば、このようなペプチドのアミノ酸配列は、米国特許第５，４６４，９３３号の配列番号１〜１０、米国特許第５，６５６，４８０号の配列番号１〜１５、米国特許第６，０１３，２６３号の配列番号１〜１０および１６〜８３、米国特許第６，０１７，５３６号の配列番号１〜１０、２０〜８３および１３９〜１４９、米国特許第６，０９３，７９４号の配列番号１〜１０、１７〜８３および２１０〜２１４、米国特許第６，０６０，０６５号の配列番号１〜１０、１６〜８３および２１０〜２１１、米国特許第６，２５８，７８２号の配列番号１２８６および１３１０、米国特許第６，３４８，５６８号の配列番号１１２９、１２７８〜１３０９、１３１１および１４３３、米国特許第６，４７９，０５５号の配列番号１〜１０および２１０〜２３８、米国特許第６，６５６，９０６号の配列番号１〜１７１、１７３〜２１６、２１８〜２１９、２２２〜２２８、２３１、２３３〜３６６、３７２〜３９８、４００〜４５６、４５８〜４９８、５００〜５７０、５７２〜６２０、６２２〜６５１、６５３〜７３６、７３９〜７８５、７８７〜８１１、８１３〜８２３、８２５、８２７〜８６３、８６５〜８７５、８７７〜８８３、８８５、８８７〜８９０、８９２〜９８１、９８６〜９９９、１００１〜１００３、１００６〜１０１８、１０２２〜１０２４、１０２６〜１０２８、１０３０〜１０３２、１０３７〜１０７６、１０７８〜１０７９、１０８２〜１１１７、１１２０〜１１７６、１１７９〜１２１３、１２１８〜１２２３、１２２７〜１２３７、１２４４〜１２４５、１２５６〜１２６８、１２７１〜１２７５、１２７７、１３４５〜１３４８、１３５０〜１３６２、１３６４、１３６６、１３６８、１３７０、１３７２、１３７４〜１３７６、１３７８〜１３７９、１３８１〜１３８５、１４１２〜１４１７、１４２１〜１４２６、１４２８〜１４３０、１４３２、１４３９〜１５４２、１６７０〜１６８２、１６８４〜１７０９、１７１２〜１７１９、１７２１〜１７５３、１７５５〜１７５７、またはＷＯ２００５／０６７９６０の配列番号５〜９５の群を含み、または前記群より選択されることが可能である。抗膜融合ペプチドは、５〜１００個の、好ましくは１０〜７５個のおよびより好ましくは１５〜５０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。特に好ましい抗膜融合ペプチドは、Ｃ−３４、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−６５１、Ｔ−２６３５、Ｎ−３６（Root, M.J., et al., Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825)およびDP-107(Wild, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680）およびａｆｐ−１（配列番号２９〜３５および配列番号７３）である。一実施態様において、本発明に従った抱合体は、１個またはそれ以上の抗膜融合ペプチドと１個の抗体とを含み、その中で、ｉ）該抗膜融合ペプチドは、５〜１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する直鎖状ペプチドであり、およびｉｉ）１〜８個の抗膜融合ペプチドは各々、該抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端へ抱合される。別の実施態様において、本発明に従った抱合体は、１個またはそれ以上の抗膜融合ペプチドと１個の抗体、例えば、抗ＣＣＲ５抗体（ｍＡｂ ＣＣＲ５）とを含み、その中で、ｉ）該抗膜融合ペプチドは、ｇｐ４１外部ドメインに由来するものであり、およびｉｉ）１〜８個の抗膜融合ペプチドは各々、該抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端へ抱合される。「ｇｐ４１外部ドメイン」という用語は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０のアミノ酸位置５６１で始まり、アミノ酸位置６２０で終わり、またはＨＩＶ−１ ｇｐ４１のアミノ酸位置５０で始まり、アミノ酸位置１０９で終わるアミノ酸配列（配列番号６６）を示す（例えば、Bar, S. and Alizon, M. J. Virol. 78 (2004) 811-820も参照）。
「抗体」という用語は、抗体全体及び抗体断片を含む抗体構造の多様な形態を包含する。本発明に従った抗体とは、好ましくは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｔ細胞抗原枯渇抗体（ＷＯ９８／３３５２３、ＷＯ９８／５２９７６、およびＷＯ００／３４３１７）である。抗体の遺伝子工学は、例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855、米国特許第５，２０２，２３８号および第５，２０４，２４４号、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327, Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270, Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125に記載される。
「抗体断片」は、全長の抗体の一部を含み、好ましくは、前記抗体の可変ドメインまたは前記抗体の少なくとも抗原結合部分を含む。抗体断片の例は、例えば、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２断片、および抗ＣＣＲ５抗体の特徴を保持する限りの類似物である。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載される。Hustonは、本発明に有用なポリペプチドの連結のためのリンカーおよび方法も記載する。
「ＣＣＲ５」とは、例えば、Oppermann, M., Cell Signal. 16 (2004) 1201-1210およびSwissProt P51681に記載されるようなヒトＣＣＲ５を意味する。本願内で同じ意味で使用される「ＣＣＲ５に結合する抗体」、「抗ＣＣＲ５抗体」、または「ｍＡｂ ＣＣＲ５」という用語は、ＣＣＲ５に特異的に結合する抗体を意味し、好ましくは、標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害する抗体を意味する。結合は、細胞ベースのインビトロでのＥＬＩＳＡアッセイにおいて検査されることが可能である（ＣＣＲ５を発現させるＣＨＯ細胞）。結合は、１００ng／mLの抗体濃度で、抗体が、５またはそれ以上の、好ましくは１０またはそれ以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を生じる場合に見出される。「標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害する」という用語は、ウイルスと標的細胞との間の膜融合を阻害するのに効果的な濃度にある抗体の存在下で、標的細胞（例えば、ＰＢＭＣ）をウイルスと接触させること、および例えば、ルシフェラーゼリポーター遺伝子活性またはＨＩＶ ｐ２４抗原濃度を測定することを含むアッセイにおいて決定された標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害することを指す。「膜融合」という用語は、ＣＣＲ５およびＣＤ４ポリペプチドを同時発現させる第一の細胞と、ＨＩＶ外被タンパク質を発現させる第二の細胞またはウイルスとの間の融合を指す。膜融合は、リポーター遺伝子アッセイによって（例えば、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイによって）遺伝子工学的に処理された細胞および／またはウイルスによって決定される。
好ましい抗ＣＣＲ５抗体は、米国特許出願第２００４／００４３０３３号、米国特許第６，６１０，８３４号、米国特許出願第２００３／０２２８３０６号、米国特許出願第２００３／０１９５３４８号、米国特許出願第２００３／０１６６８７０号、米国特許出願第２００３／０１６６０２４号、米国特許出願第２００３／０１６５９８８号、米国特許出願第２００３／０１５２９１３号、米国特許出願第２００３／０１０００５８号、米国特許出願第２００３／００９９６４５号、米国特許出願第２００３／００４９２５１号、米国特許出願第２００３／００４４４１１号、米国特許出願第２００３／０００３４４０号、米国特許第６，５２８，６２５号、米国特許出願第２００２／０１４７１４７号、米国特許出願第２００２／０１４６４１５号、米国特許出願第２００２／０１０６３７４号、米国特許出願第２００２／００６１８３４号、米国特許出願第２００２／００４８７８６号、米国特許出願第２００１／００００２４１号、欧州特許第１ ３２２ ３３２号、欧州特許第１ ２６３ ７９１号、欧州特許第１ ２０７ ２０２号、欧州特許第１ １６１ ４５６号、欧州特許第１ １４４ ００６号、ＷＯ２００３／０７２７６６、ＷＯ２００３／０６６８３０、ＷＯ２００３／０３３６６６、ＷＯ２００２／０８３１７２、ＷＯ０２／２２０７７、ＷＯ０１／５８９１６、ＷＯ０１／５８９１５、ＷＯ０１／４３７７９、ＷＯ０１／４２３０８、およびＷＯ ２００６／１０３１００に記載される。特に好ましい抗ＣＣＲ５抗体は、ＷＯ２００６／１０３１００に記載される。特に好ましい抗ＣＣＲ５抗体は、前記抗体が、免疫グロブリンフレームワークと、重鎖ＣＤＲ３配列番号１６、１７からなる群より選択されるＣＤＲ３領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。さらに好ましい抗体は、免疫グロブリンフレームワークと、ＣＤＲ３配列番号１６、１７からなる群より選択されるＣＤＲ３領域、ＣＤＲ２配列番号１３、１４、１５からなる群より選択されるＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ１配列番号９、１０、１１、１２からなる群より選択されるＣＤＲ１領域とからなる重鎖可変ドメインを含む。好ましい重鎖可変ドメインは、配列番号１、３、５、７に示される。好ましい抗ＣＣＲ５抗体は、さらに、免疫グロブリンフレームワークと、ＣＤＲ１配列番号１８、１９、２０からなる群より選択されるＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２配列番号２１、２２、２３からなる群より選択されるＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３配列番号２４、２５の群より選択されるＣＤＲ３領域とからなる軽鎖可変ドメインを含む。抗ＣＣＲ５抗体は、好ましくは、重鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲを、重鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲを、または重鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲを含有することを特徴とする。
ＣＤＲ配列は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定されることが可能である。配列番号１〜８のＣＤＲは、配列番号９〜２５に示される。
抗ＣＣＲ５抗体は、好ましくは、
ａ）アミノ酸の配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｂ）アミノ酸の配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸の配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸の配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン
からなる群より独立して選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
ａ）アミノ酸の配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｂ）アミノ酸の配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸の配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸の配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン
からなる群より独立して選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む。
「ＣＤ４」とは、例えば、Brady, R.L. and Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18およびSwissProt P01730において記載されるようなヒトＣＤ４を意味する。本願内で同じ意味で使用される「ＣＤ４に結合する抗体」、「抗ＣＤ４抗体」、または「ｍＡｂ ＣＤ４」という用語は、ＣＤ４に特異的に結合する抗体を示し、好ましくは、標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害する抗体を示す。結合は、細胞ベースのインビトロでのＥＬＩＳＡアッセイにおいて検査されることが可能である（ＣＤ４を発現させるＣＨＯ細胞）。結合は、１００ng／mLの抗体濃度で、問題の抗体が、５またはそれ以上の、好ましくは１０またはそれ以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を生じる場合に見出される。「標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害する」という用語は、ウイルスと標的細胞との間の膜融合を阻害するのに効果的な濃度にある問題の抗体の存在下で、該標的細胞（例えば、ＰＢＭＣ）をウイルスと接触させること、および例えば、ルシフェラーゼリポーター遺伝子活性またはＨＩＶ ｐ２４抗原濃度を測定することを含むアッセイにおいて決定された標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害することを指す。「膜融合」という用語は、ＣＤ４ポリペプチドを発現させる第一の細胞と、ＨＩＶ外被タンパク質を発現させる第二の細胞またはウイルスとの間の融合を指す。膜融合は、リポーター遺伝子アッセイによって（例えば、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイによって）遺伝子工学的に処理された細胞および／またはウイルスによって決定される。典型的な抗ＣＤ４抗体は、例えば、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、欧州特許第０ ５１２ １１２号、米国特許第５，８７１，７３２号、欧州特許第０ ８４０ ６１８号、欧州特許第０ ８５４ ８８５号、欧州特許第１ ２６６ ９６５号、米国特許出願第２００６／００５１３４６号、ＷＯ ９７／４６６９７、ＷＯ ０１／４３７７９、米国特許第６，１３６，３１０号、ＷＯ ９１／００９９６６に記載される。
「ＣＸＣＲ４」とは、例えば、eng, Y., et al., Science 272 (1996) 809-810、またはTamamura, H. and Fujii, N., Expert Opinion on Therapeutic Targets 9 (2005) 1267-1282に記載されるようなヒトＣＸＣＲ４を意味する。本願内で同じ意味で使用される「ＣＸＣＲ４に結合する抗体」、「抗ＣＸＣＲ４抗体」、または「ｍＡｂ ＣＸＣＲ４」という用語は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体を示し、好ましくは、標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害する抗体を示す。結合は、細胞ベースのインビトロでのＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＸＣＲ４を発現させるＣＨＯ細胞）において検査されることが可能である。結合は、１００ng／mLの抗体濃度で、問題の抗体が、５またはそれ以上の、好ましくは１０またはそれ以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を生じる場合に見出される。「標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害する」という用語は、ウイルスと標的細胞との間の膜融合を阻害するのに効果的な濃度にある問題の抗体の存在下で、該標的細胞（例えば、ＰＢＭＣ）をウイルスと接触させること、および例えば、ルシフェラーゼリポーター遺伝子活性またはＨＩＶ ｐ２４抗原濃度を測定することを含むアッセイにおいて決定された標的細胞とのＨＩＶ融合を阻害することを指す。「膜融合」という用語は、ＣＸＣＲ４ポリペプチドを発現させる第一の細胞と、ＨＩＶ外被タンパク質を発現させる第二の細胞またはウイルスとの間の融合を指す。膜融合は、リポーター遺伝子アッセイによって（例えば、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイによって）遺伝子工学的に処理された細胞および／またはウイルスによって決定される。典型的な抗ＣＸＣＲ４抗体は、Strizki, J.M., et al., J. Virol. 71 (1997) 5678-5683 (Ab 12G5)、米国特許第７，１３８，４９６号に報告される。
本発明内で、「ＨＩＶ ｇｐ１２０を結合する細胞表面受容体に対する抗体」とは、ウイルスを細胞の細胞表面へ結合することを仲介するためにＨＩＶ ｇｐ１２０サブユニットによって使用され、したがって、該受容体に対するｇｐ１２０の結合を防止し、および細胞表面へのＨＩＶの結合も防止する、細胞表面受容体に結合している抗体を示す。ＨＩＶ ｇｐ１２０は、前駆体ＨＩＶ ｇｐ１６０のタンパク質分解性切断に由来する（例えば、Brenneman, D.E., et al., Int. Rev. Neurobiol. 32 (1990) 305-353参照）。この切断の第二の断片は、ＨＩＶ ｇｐ４１である。これら２つの断片は、非共有結合的に会合し、ＨＩＶと細胞との結合および細胞融合を仲介する。典型的な細胞表面受容体は、ＣＤ４受容体または、ＣＣＲ５受容体、ＣＸＣＲ４受容体、もしくはＣＸＣＲ５受容体等のケモカイン受容体である。したがって、一実施態様において、ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体は、抗ＣＤ４抗体、または抗ＣＣＲ５抗体、または抗ＣＸＣＲ４抗体、または抗ＣＸＣＲ５抗体である。
本発明に従った抱合体において使用される抗体は、好ましくは、定常部が、ヒト起源であることを特徴とする。このような定常部は、本分野で周知であり、例えば、Ｋａｂａｔによって記載される（例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218参照）。例えば、有用なヒトＩｇＧ１重鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、配列番号２６、２７からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒトカッパ（κ）軽鎖定常部は、配列番号２８のカッパ軽鎖定常部（κ軽鎖定常部、ＣＬ）のアミノ酸配列を含む。２８．抗体の可変ドメインが、マウス起源であり、およびＫａｂａｔに従ったマウス抗体の抗体可変ドメイン配列フレームを含むことがさらに好ましい（例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218参照）。
好ましい抗ＣＣＲ５抗体は、抗体Ａ〜Ｅからなる群より選択される抗体が結合するのと同一の、ＣＣＲ５のエピトープへの結合を示し、または結合の立体障害もしくは競合的結合による抗体Ａ〜ＥによるＣＣＲ５への結合において阻害される。エピトープの結合は、エピトープマッピングに関してOlson, W.C., et al.(J. Virol. 73 (1999) 4145-4155）によって記載される方法に従ったアラニン走査を使用することによって研究される。７５％またはそれ以上のシグナル低下は、突然変異されたアミノ酸が、該抗体によって認識されるエピトープに関与することを示す。同一エピトープに対する抗体の結合は、エピトープに関与するアミノ酸が、研究された抗体および抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥによって認識される場合に見出される。ＨＩＶアッセイにおいて抗体２Ｄ７よりも低いＩＣ５０値を示す抗体Ｃは、抗体２Ｄ７によって認識されるエピトープとは異なるＣＣＲ５のＥＣＬ２ドメイン上のアミノ酸を含むエピトープに結合する（Lee, B., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 9617-9626）（２Ｄ７は、ＥＣＬ２Ａのアミノ酸Ｋ１７１およびＥ１７２へ結合するが、ＥＣＬ２Ｂアミノ酸１８４〜１８９には結合しない）。抗体Ｃに対するエピトープの結合は、ＣＣＲ５突然変異体Ｋ１７１ＡまたはＥ１７２Ａに関して２０％であることが見出される（ｇｌｕ１７２は、ａｌａへ突然変異される）。１００％のエピトープ結合は、野生型ＣＣＲ５に関して定義される。さらに好ましい抗ＣＣＲ５抗体は、抗体Ｃが結合するのと同一のエピトープへ結合する。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性のある表面集団からなり、通常、特異的な三次元構造特徴および特異的な荷電特徴を有する。高次構造的および非高次構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で失われる点で区別される。好ましくは、本発明に従った抗体は、未変性ＣＣＲ５に特異的に結合するが、変性したＣＣＲ５には結合しない。このような抗体は、好ましくは、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ３を含み、好ましくはさらに、配列番号１０、１１、１２、１４および／または１５のＣＤＲの群より選択される重鎖ＣＤＲを含む。好ましくは、このような抗体は、抗体Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥであり、または抗体Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥの可変ドメインを含む。好ましくは、変性したＣＣＲ５に対して結合する抗体は、抗体Ａであり、または抗体Ａの可変ドメインを含む。
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））という用語は、抗原に対する抗体の結合において直接的に関与する軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの対の各ドメインを示す。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、同一の一般的構造を有し、すなわち、前記可変ドメインは、「免疫グロブリンフレームワーク」を有し、および各ドメインは、配列が広範に保存され、３つの「高頻度可変領域」（または「相補性決定領域」）によって接続された４つの「フレームワーク領域」（ＦＲ）を含む。フレームワーク領域は、βシート高次構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造に接続するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造で保持され、他の鎖由来のＣＤＲとともに、抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に従った抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を担っており、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
「抗体の抗原結合部分」または「抗体の抗原結合部位」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域とは、本明細書で定義される高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へと領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４（免疫グロブリンフレームワーク）を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３領域は、抗原結合に最も関与する領域であり、抗体を規定する。好ましくは、本発明に従った抗ＣＣＲ５抗体は、その重鎖可変ドメイン中に配列番号１６または配列番号１７のＣＤＲ３配列を含むことを特徴とする。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。
抗ＣＣＲ５抗体の「Ｆｃ部分」は、ＣＣＲ５への結合に直接的に関与しないが、多様な効果器機能を呈する。前記抗体の重鎖の定常部のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンは、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分類され、これらのいくつもが、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分類され得る。重鎖定常部に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、α、δ、ε、γ、およびμトそれぞれ呼ばれる。本発明に従った抗体は、好ましくは、ＩｇＧタイプに属する。「抗体のＦｃ部分」とは、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断を基にして定義される。本発明に従った抗体は、Ｆｃ部分としてヒトＦｃ部分またはヒト起源由来のＦｃ部分を含有する。本発明のさらなる実施態様において、Ｆｃ部分は、サブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分または、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）および／または以下に定義されるＣ１ｑ結合が検出できないような方法で修飾されるサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部分のいずれかである。好ましくは、Ｆｃ部分は、ヒトＦｃ部分であり、特に好ましくは、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のヒトＦｃ部分でありまたはヒトＩｇＧ１サブクラス由来の突然変異されたＦｃ部分のいずれかである。さらに好ましいのは、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス由来のＦｃ部分である。さらに好ましいのは、配列番号２６、配列番号２７、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する配列番号２６、突然変異Ｓ２２８Ｐを有する配列番号２７において示されるＦｃ部分である。ＩｇＧ４が、低下したＦｃγ状態（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合を示すのに対し、他のＩＧＧサブクラスの抗体は、強力な結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の損失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、およびＨｉｓ４３５は、変化した場合、低下したＦｃγ受容体結合も提供する残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604, Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324、欧州特許第０ ３０７ ４３４号）。好ましくは、本発明に従った抗体は、ＩｇＧ４サブクラスの、またはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスのＦｃγ受容体結合に関して、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／またはＤ２６５において突然変異を有し、および／またはＰＶＡ２３６突然変異を含有する。好ましいのは、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、および／またはＰＶＡ２３６である（ＰＶＡ２３６とは、ＩｇＧ１のアミノ酸位置２３３〜２３６由来の（１文字アミノ酸コードにおいて付与される）アミノ酸配列ＥＬＬＧまたはＩｇＧ４のＥＦＬＧが、ＰＶＡによって置換される）。特に好ましいのは、ＩｇＧ４の突然変異Ｓ２２８Ｐ、ならびにＩｇＧ１の突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体のサブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって惹起される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での定義されたタンパク質間相互作用によって生じる。このようなＦｃ部分の結合部位は、従来技術で公知であり、例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324および欧州特許第０ ３０７ ４３４号によって記載される。このようなＦｃ部分の結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵ ｉｎｄｅｘに従って付番）を特徴とする。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、Ｃ１ｑおよびＣ３結合を含む補体の活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体の系を活性化せず、Ｃ１ｑおよびＣ３を結合しない。Ｆｃγ受容体を結合しない抗ＣＣＲ５抗体および／または補体因子Ｃ１ｑは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しない。好ましくは、この抗体は、ＣＣＲ５を結合し、ヒト起源由来のＦｃ部分を含有し、およびＦｃγ受容体および／または補体因子Ｃ１ｑを結合しないことを特徴とする。より好ましくは、この抗体は、ヒト抗体、またはヒト化抗体、またはＴ細胞抗原枯渇抗体である。Ｃ１ｑの結合は、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に従って測定されることが可能である。このようなアッセイにおいて、検査抗体に関する４９２〜４０５nmでの光学密度（ＯＤ）が、８μg／mLの抗体濃度での修飾されていない野生型抗体のＦｃ部分のヒトＣ１ｑ結合に関する値の１５％よりも低い場合には、「Ｃ１ｑ結合」は、見出されない。ＡＤＣＣは、ヒトＮＫ細胞におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する抗体の結合として測定されることが可能である。結合は、２０μg／mLの抗体濃度で測定される。「Ｆｃγ受容体結合がない」または「ＡＤＣＣがない」とは、ヒトＩｇＧ１（配列番号２６）と同一の抗体の結合と比較して、２０μg／mLの抗体濃度でヒトＮＫ細胞におけるヒトＦｃγＲＩＩＩａに対して３０％まで結合することを意味する。
さらに、本発明に従った抱合体において使用される抗体には、本発明に従った抗体の上述の特徴に影響しないまたは前記特徴を変化させないアミノ酸配列修飾である「保存的配列修飾」を有するこのような抗体（突然変異形抗体）が含まれる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発等の、本分野で公知の標準的な技術によって導入されることが可能である。保存的なアミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれるしたがって、ヒト抗ＣＣＲ５抗体において予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換されることが可能である。したがって、本明細書において、「突然変異形」の抗ＣＣＲ５抗体とは、アミノ酸配列において、重鎖ＣＤＲ３領域以外の親抗体の可変ドメインの１つまたはそれ以上における１０個まで、好ましくは約２〜約５までの付加、欠失および／または置換によって、「親」抗ＣＣＲ５抗体のアミノ酸配列とは異なる分子を指す。互いに、重鎖ＣＤＲ領域は、最大でも１個の単一アミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。本発明は、初期の可変ドメインアミノ酸配列をコードする核酸を提供する配列番号１、３、５、７、８２、８３からなる重鎖可変ドメインの群由来の重鎖可変ドメインおよび／または配列番号２、４、６、８、７６、７７からなる軽鎖可変ドメインの群由来の軽鎖可変ドメインを選択し、１個のアミノ酸が重鎖ＣＤＲ１において修飾され、１個のアミノ酸が重鎖ＣＤＲ２において修飾され、１〜３個のアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ１において修飾され、１〜３個のアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ２において修飾され、および／または１〜３個のアミノ酸が、軽鎖ＣＤＲ３において修飾されるよう該核酸を修飾し、抗体構造中で該修飾された可変ドメインアミノ酸配列を発現させおよび組み込み、該抗体が、ＣＣＲ５に結合するかどうかを測定し、ならびに抗体がＣＣＲ５に結合する場合、該修飾された可変ドメイン／ＣＤＲを選択することを特徴とする、ＣＣＲ５に結合する親抗体のＣＤＲアミノ酸配列を修飾する方法を含む。好ましくは、このような修飾は、保存的配列修飾である。アミノ酸配列修飾は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327、およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記載される分子モデリングに基づいた突然変異誘発によって実施されることが可能である。
本願内で使用される「リンカー」または「ペプチドリンカー」という用語は、天然および／または合成の起源のペプチドリンカーを示す。前記リンカーまたはペプチドリンカーは、２０個の天然アミノ酸がモノマー構成要素である直鎖状アミノ酸を構築している。鎖は、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜２８個のアミノ酸、特に好ましくは３〜２５個のアミノ酸の長さを有する。リンカーは、反復性アミノ酸配列またはヒンジ機能を有するポリペプチド等の天然ポリペプチドを含有し得る。リンカーは、ペプチドが、正確に折りたたまれ、適切に提示されることができることによって、抗ＣＣＲ５抗体へ抱合されたペプチドが、その生物活性を発揮することが可能であることを確実にするための機能を有する。好ましくは、リンカーは、グリシン、グルタミン、および／またはセリン残基が豊富であるよう指定された「合成ペプチドリンカー」である。これらの残基は、例えば、ＧＧＧＧＳ、ＱＱＱＱＧ、またはＳＳＳＳＧ等の５個までのアミノ酸の小さな反復性単位で配置される。この小さな反復性単位は、多量体単位を形成するために２〜５回反復され得る。多量体単位のアミノ末端および／またはカルボキシ末端で、６個までのさらなる任意の天然アミノ酸が付加され得る。他の合成ペプチドリンカーは、例えば、リンカーＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳ中のセリン等の１０〜２０回反復された単一のアミノ酸から構成される。アミノ末端および／またはカルボキシ末端の各々で、６個までのさらなる任意の天然アミノ酸が提示され得る。好ましいリンカーは、表２に示される。特に好ましいのは、リンカー［ＧＱ４］３ＧＮＮ（配列番号４０、ＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３６）、ＬＳＰＮＲＧＥＣ（配列番号３７）、ＬＳＬＳＧＧ（配列番号６１）、ＬＳＬＳＰＧＧ（配列番号６２）、Ｇ３［ＳＧ４］２ＳＧ（配列番号６９）である。すべてのペプチドリンカーは、核酸分子によってコードされることが可能であり、したがって、組換え発現されることが可能である。リンカーは、それ自体がペプチドであるので、抗膜融合ペプチドは、２個のアミノ酸間に形成されるペプチド結合を介してリンカーへ接続される。ペプチドリンカーは、抗膜融合ペプチドと、抗膜融合ペプチドが抱合されるべき抗ＣＣＲ５抗体鎖との間に導入される。したがって、それぞれ（アミノ末端からカルボキシ末端への方向で）２個または３個の起こり得る配列、すなわち、ａ）抗膜融合ペプチド−ペプチドリンカー−抗ＣＣＲ５抗体ポリペプチド鎖、またはｂ）抗ＣＣＲ５抗体ポリペプチド鎖−ペプチドリンカー−抗膜融合ペプチド、またはｃ）抗膜融合ペプチド−ペプチドリンカー−抗ＣＣＲ５抗体ポリペプチド鎖−ペプチドリンカー−抗膜融合ペプチドが存在する。
本発明の一実施態様において、ｍＡｂ ＣＣＲ５抱合体は、ｉ）アミノ酸配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびアミノ酸配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、またはアミノ酸配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン、ｉｉ）アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、ならびに配列番号３６〜６２および配列番号６７〜７０からなる群より選択されるリンカー、ならびにｉｉｉ）配列番号２９〜３５または配列番号７３によって定義されるペプチドの群より選択される抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。
ｍＡｂ ＣＣＲ５の重鎖および／または軽鎖と抗膜融合ペプチドとの好ましい抱合体（「鎖抱合体」）は、抱合体（１）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］、（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］、（３）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合ペプチド］、（４）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］、（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］、（６）［抗膜融合ペプチド］−［ｌｉｎｋｅｒ］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合ペプチド］、（７）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］、（８）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］からなる群より選択され、この中で、リンカーは、該鎖抱合体内および該鎖抱合体間で同一または異別であり得、ｍは、１または０の整数であり、およびｍは独立して、該抱合体内および該抱合体間の両者で同一または異別であり得る。例えば、鎖抱合体（７）およびｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖を含む抱合体において、鎖抱合体（７）中の２個のリンカーは、同一であり得、すなわち、同一のアミノ酸配列および長さを有し、または異別であり得、すなわち、異なるアミノ酸配列および／または長さを有し、または一方もしくは両方が欠失し得る。例えば、鎖抱合体（２）および（４）を含む抱合体において、鎖抱合体（２）中に含有されるリンカーおよび鎖抱合体（４）中に含有されるリンカーは、同一であり得、すなわち、同一のアミノ酸配列および長さを有し、または異別であり得、すなわち、異なるアミノ酸配列および／または長さを有し、または一方もしくは両方が欠失し得る。鎖抱合体において、リンカーは、存在し得（ｍ＝１）または欠失し得る（ｍ＝０）。好ましい鎖抱合体は、鎖抱合体（２）、（３）、（４）、および（７）である。本発明の一実施態様は、２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］と２個の鎖抱合体（２）とを含む抱合体である。この抱合体は、２個の抱合されていない抗ＣＣＲ５抗体軽鎖と、場合により中間リンカーとともに抗膜融合ペプチドのＣ末端からＮ末端を介して抱合された２個の抗ＣＣＲ５抗体重鎖とを含む。本発明の別の実施態様は、２個のｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖と２個の鎖抱合体（３）とを含む抱合体である。さらに別の実施態様は、２個のｍＡｂ ＣＣＲ５重鎖と２個の鎖抱合体（４）とを含む抱合体である。本発明のさらなる実施態様は、２個のｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖と２個の鎖抱合体（７）とを含む抱合体である。重鎖および／または軽鎖は、好ましくは定常部（Ｆｃ）を含む。
本発明はさらに、本発明に従った抱合体の有効量を医薬的に許容され得る担体とともに含む医薬組成物の製造のための方法、およびこのような方法のための本発明に従った抱合体の使用を提供する。
本発明はさらに、エイズを罹患している患者の処置のための、好ましくは医薬的に許容され得る担体とともに、医薬品の製造のための有効量における本発明に従った抱合体の使用を提供する。
本願内で使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然カルボキシαアミノ酸の群を示す。
本発明を実施するのに有用な当業者に公知の方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載される。
本発明に従った抱合体において、抗体鎖のカルボキシ末端アミノ酸は、抗膜融合ペプチドのアミノ末端アミノ酸へのペプチド結合を介して抱合され、または抗膜融合ペプチドのカルボキシ末端は、抗体鎖のアミノ末端アミノ酸へのペプチド結合を介して抱合される。一実施態様において、中間リンカーは、抗膜融合ペプチドと抗体鎖との間に存在する。したがって、本発明に従った抱合体は、一般式
［抗体］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎ
を特徴とし、式中、ｍは、各抗膜融合ペプチドに関して独立して、０（すなわち、抗体と抗膜融合ペプチドとの間の直接的なペプチド結合）または１（すなわちリンカーが、抗体と抗膜融合ペプチドとの間に存在する）であり、およびｎは、１〜８の整数である。一実施態様において、ｎは、２〜８の整数である。別の実施態様において、ｎは、２〜４の整数である。別の実施態様において、ｎは、２〜４の整数である。本発明の一実施態様は、抗体の重鎖の各Ｃ末端に、または軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする抱合体を含む。本実施態様において、２個の抗膜融合ペプチドが、１個の抗体へ抱合される。他の実施態様において、抱合体は、重鎖の各Ｃ末端におよび軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。本実施態様において、４個の抗膜融合ペプチドが、１個の抗体へ抱合される。一実施態様において、該抗体ｍＡｂ ＣＣＲ５またはｍＡｂ ＣＤ４が存在する。
［抗体］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎ
を特徴とし、式中、ｍは、各抗膜融合ペプチドに関して独立して、０（すなわち、抗体と抗膜融合ペプチドとの間の直接的なペプチド結合）または１（すなわちリンカーが、抗体と抗膜融合ペプチドとの間に存在する）であり、およびｎは、１〜８の整数である。一実施態様において、ｎは、２〜８の整数である。別の実施態様において、ｎは、２〜４の整数である。別の実施態様において、ｎは、２〜４の整数である。本発明の一実施態様は、抗体の重鎖の各Ｃ末端に、または軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする抱合体を含む。本実施態様において、２個の抗膜融合ペプチドが、１個の抗体へ抱合される。他の実施態様において、抱合体は、重鎖の各Ｃ末端におよび軽鎖の各Ｎ末端に抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする。本実施態様において、４個の抗膜融合ペプチドが、１個の抗体へ抱合される。一実施態様において、該抗体ｍＡｂ ＣＣＲ５またはｍＡｂ ＣＤ４が存在する。
ｍＡｂ ＣＣＲ５重鎖および／または軽鎖の１末端において導入される抗膜融合ペプチドは、ｍＡｂ ＣＣＲ５と比較して大きさが小さい。例えば、最小の免疫グロブリンであるＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０kDaの分子量を有し、抗膜融合ペプチドは、好ましくは、約１００個のアミノ酸と等価である１２．５kDa未満の、一般的には、約６０個のアミノ酸と等価の７．５kDa未満の大きさ（分子量）を有する。抗膜融合ペプチドは、５〜１００個のアミノ酸残基、好ましくは１０〜７５個のアミノ酸残基、より好ましくは１５〜５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。本発明の抱合体は、医薬の、処置の、または診断の適用に有用である。ｍＡｂ ＣＣＲ５重鎖および／または軽鎖と抱合されることが可能である抗膜融合ペプチドの数は、１から、抗ＣＣＲ５抗体ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端の組み合わされた数までである。本発明が、異なる抗ＣＣＲ５抗体を包含するので、抗膜融合ペプチドの数は変動し得る。２個の重鎖と２個の軽鎖とを含む抗ＣＣＲ５抗体の場合、アミノ末端（Ｎ末端）とカルボキシ末端（Ｃ末端）との組み合わされた数は８であり、前記数は同時に、抱合された抗膜融合ペプチドの合計最大数であり、例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗ＣＣＲ５抗体断片の場合、末端の組み合わされた数およびしたがって抱合可能な抗膜融合ペプチドの最大数は２である。単一の抗膜融合ペプチドが、ｍＡｂ ＣＣＲ５へ抱合される場合、ペプチドは、抗ＣＣＲ５抗体鎖の末端のいずれか１つを占有することが可能である。同様に、ペプチドの起こり得る最大数が、ｍＡｂ ＣＣＲ５へ抱合される場合、すべての末端は、単一ペプチドによって占有される。ｍＡｂ ＣＣＲ５へ抱合されるペプチドの数が、起こり得る最大数よりも小さな場合、抗ＣＣＲ５抗体鎖の末端におけるペプチドの異なる分布が可能である。例えば、４個のペプチドが、ＧまたはＥクラスの免疫グロブリンへ抱合される場合、５個の異なる組み合わせが可能である（表１参照）。２つの組み合わせにおいて、１種類のすべての末端、すなわち、抗ＣＣＲ５抗体鎖のすべての４個のアミノ末端またはすべての４個のカルボキシ末端は各々、１個の抗膜融合ペプチドへ抱合される。他の末端は、抱合されない。このことは、一実施態様において、抗ＣＣＲ５抗体の一領域中の修飾／抱合の割当を生じる。他の場合、ポリペプチドは、多くの両末端へ抱合される。これらの組み合わせ内で、抱合されたペプチドは、抗ＣＣＲ５抗体の異なる領域へ割り当てられる。いずれかの場合において、抱合された末端の合計は４である。
本発明は、好ましくは、末端の少なくとも２個が、抗膜融合ペプチドへ抱合された抱合体を含む。抗膜融合ペプチドのアミノ酸配列は、異別であり得、同様であり得、または同一であり得る。一実施態様において、アミノ酸配列同一性は、９０％から１００％未満の範囲であり、これらのアミノ酸配列および対応するペプチドは、同様に定義される。好ましい実施態様において、抗膜融合ペプチドは、同一であり、すなわち、１００％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、１〜８個の抗膜融合ペプチドが各々、抗ＣＣＲ５抗体（ｍＡｂ ＣＣＲ５）の重鎖および／または軽鎖の１末端へペプチド結合を介して抱合される、１つまたはそれ以上の抗膜融合ペプチドと該ＣＣＲ５抗体とを含む抱合体を含む。一実施態様において、本発明に従った抱合体は、２〜８個の抗膜融合ペプチドが各々、抗ＣＣＲ５抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端へ抱合される、少なくとも２個の抗膜融合ペプチドと抗ＣＣＲ５抗体とを含む。
一実施態様において、本発明に従った抱合体は、ｉ）配列番号２の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号１の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、ｉｉ）配列番号４の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号３の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、ｉｉｉ）配列番号６の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号５の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とし、またはｉｖ）配列番号８の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号７の重鎖可変ドメイン、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体を含むことを特徴とする。
抗膜融合ペプチドと抗ＣＣＲ５抗体との間の抱合は、核酸レベルに関して実施される。したがって、ペプチド結合は、中間リンカーを伴ってまたは伴わずに、抗膜融合ペプチドと抗ＣＣＲ５抗体鎖との間に形成される。したがって、抗膜融合ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸が、中間リンカーを有してまたは有さずに、抗ＣＣＲ５抗体鎖のアミノ末端アミノ酸へ抱合され、または抗ＣＣＲ５抗体鎖のカルボキシ末端が、中間リンカーを有してまたは有さずに、抗膜融合ペプチドのアミノ末端アミノ酸へ抱合されるかのいずれかであり、または抗ＣＣＲ５抗体鎖の両末端は各々、中間リンカーを有してまたは有さずに、抗膜融合ペプチドへ抱合される。本発明に従った抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体−抱合体の組換え産生のために、異なるポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の核酸分子が必要とされ、好ましくは、２〜８個の核酸分子が採用される。これらの核酸分子は、抱合体の異なる抗ＣＣＲ５抗体ポリペプチド鎖をコードし、以下において構造遺伝子と呼ばれる。前記核酸分子は、同一の発現プラスミド（ベクター）上に配置され得、またはそれに代わるものとして、異なる発現プラスミド（ベクター）上に配置され得る。抱合体の集合は、好ましくは、抱合体の分泌前に、したがって、発現させている細胞内で生じる。それゆえ、抱合体のポリペプチド鎖をコードする核酸分子は、好ましくは、同一の宿主細胞において発現する。組換え発現後に抱合体の混合物が得られる場合、抱合体は、当業者に公知の方法によって分離および精製されることが可能である。これらの方法は、十分確立されており、免疫グロブリン精製のために広範に使用され、単独でまたは組み合わせでのいずれかで採用される。このような方法は、例えば、微生物由来のタンパク質を使用するアフィニティクロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合様式の交換クロマトグラフィー）、チオール基吸着（例えば、β−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドを使用）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレーン吸着（aza-arenophilic）樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸を使用）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−およびＣｕ（ＩＩ）−親和性材料を使用）、分子ふるいクロマトグラフィー、および（ゲル電気泳動、毛細管電気泳動等の）プレパラティブ電気泳動法である（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。当業者に公知の組換え工学方法を使用して、抱合体は、核酸／遺伝子レベルで個別化されることが可能である。免疫グロブリンをコードする核酸配列は、公知であり、例えば、ゲノムデータベースから得られることが可能である。同様に、抗膜融合ペプチドをコードする核酸配列は、公知であり、または抗膜融合ペプチドのアミノ酸配列から容易に推定されることが可能である。本発明の抱合体の発現のための発現プラスミドの構築のために必要とされる要素は、例えば、前記発現プラスミドの天然および／または修飾されたおよび／または抱合されたバージョンの抗ＣＣＲ５抗体軽鎖のための発現カセット、前記発現プラスミドの天然および／または修飾されたおよび／または抱合されたバージョンの抗ＣＣＲ５抗体重鎖のための発現カセット（あるいは、抗ＣＣＲ５抗体軽鎖および抗ＣＣＲ５抗体重鎖は、例えばバイシストロン性発現要素と同一の発現カセット中に含有されることが可能である）、選択マーカー、ならびにイー・コリ（E. coli）複製および選択単位である。これらの発現カセットは、プロモーター、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメント、構造遺伝子、およびターミネーター／ポリアデニル化シグナルを含む。これらの要素は、抱合体のすべての鎖をコードする１個のプラスミド上で、または抱合体の１個またはそれ以上の鎖を各々コードする２個またはそれ以上のプラスミド上のいずれかで、作用可能に連結された形態で集合する。コードされたポリペプチドの発現のために、プラスミドは、適切な宿主細胞中へと導入される。タンパク質は好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０ 細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞等の哺乳動物細胞中で産生される。プラスミドの調節エレメントは、前記調節エレメントが、選択された宿主細胞中で機能的である方法で選択されなければならない。発現のために、抱合体の１個またはそれ以上の鎖をコードするプラスミドを含有する宿主細胞は、鎖の発現に適した条件下で培養される。発現した抱合体鎖は、機能的に集合する。完全に処理された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体−抱合体は、培地中へと分泌される。
「発現プラスミド」とは、宿主細胞中で発現するべきポリペプチドをコードする核酸である。典型的には、発現プラスミドは、例えばイー・コリのための複製起点および抵抗性遺伝子を含む原核生物プラスミド増殖単位、真核生物選択マーカー、ならびに、プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写終結因子を含む関心対象の構造遺伝子の発現のための１個またはそれ以上の発現カセットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの調節下に置かれ、このような構造遺伝子は、プロモーターへ「作用可能に連結される」といわれる。同様に、調節エレメントおよび中心プロモーターは、調節エレメントが、中心プロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
本発明の一局面はしたがって、以下の工程、すなわち
ａ）抱合体の発現に適した条件下で、本発明に従った抱合体をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子を各々含有する１つまたはそれ以上の発現プラスミドを含有する細胞を培養すること、
ｂ）細胞または上清から抱合体を回収すること
を含む、本発明に従った抱合体の産生のための方法である。
ａ）抱合体の発現に適した条件下で、本発明に従った抱合体をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子を各々含有する１つまたはそれ以上の発現プラスミドを含有する細胞を培養すること、
ｂ）細胞または上清から抱合体を回収すること
を含む、本発明に従った抱合体の産生のための方法である。
「抱合体の発現に適した条件下で」という用語は、ポリペプチドを発現させる細胞の培養に使用され、および当業者に公知でありまたは当業者によって容易に決定されることが可能である条件を示す。これらの条件が、培養される細胞の種類および発現するポリペプチドの種類に応じて変動し得ることは、当業者に公知である。一般的に、細胞は、例えば、２０〜４０℃の温度で、ポリペプチド抱合体の効果的な産生が可能となるのに十分な時間、例えば、４〜２８日間培養される。
本明細書で使用されるように、「医薬的に許容され得る担体」には、いずれかのおよびすべての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張性および吸収／再吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性のある類似物が含まれる。好ましくは、担体は、注射または注入に適している。医薬的に許容され得る担体には、滅菌水溶液または分散液および注射可能な滅菌溶液または分散液の調製のための滅菌粉末が含まれる。医薬的に活性のある物質のためのこのような培地および薬剤の使用は、本分野で公知である。水に加えて、担体は、例えば等張性緩衝塩類溶液であり得る。
選択された投与の経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物、および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来法によって医薬的に許容され得る剤形中へ製剤される。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の薬用量レベルは、患者に対して毒性を持たずに、特定の患者、組成物、および投与の様式に対して望ましい処置反応を達成するのに効果的な活性成分の量を得るよう変動し得る。選択された薬用量レベルは、採用される本発明の具体的な組成物の活性、投与の経路、投与の時刻、採用されている具体的な化合物の排泄率、採用される具体的な組成物とともに使用される他の薬物、化合物および／または材料、年齢、性別、体重、状態、処置されている患者の一般的な健康および先行病歴、ならびに医学において周知の同様の因子を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。
本発明は、好ましくは、エイズ等の免疫不全症候群に罹患している患者の処置のための、本発明に従った抱合体の使用を含む。
以下の例、配列リスト、図および寄託物は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、付随する特許請求の範囲において説明される。改変は、本発明の精神から逸脱せずに説明される手法においてなされ得ることは理解される。
抗ＣＣＲ５抗体寄託
本発明に従った抱合体において有用なｍＡｂ ＣＣＲ５を発現させる好ましいハイブリドーマ細胞系を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託した。
本発明に従った抱合体において有用なｍＡｂ ＣＣＲ５を発現させる好ましいハイブリドーマ細胞系を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託した。
抗体の命名
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０１．Ｆ３： 抗体Ａ 配列番号１、２
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０２．１Ｃ１１： 抗体Ｂ 配列番号３、４
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３．１Ｃ５ ： 抗体Ｃ 配列番号５、６
＜ＣＣＲ５＞Ｆ３．１Ｈ１２．２Ｅ５： 抗体Ｄ 配列番号７、８
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０４．１Ｆ６： 抗体Ｅ
ｍＡｂ ＣＤ４の可変ドメイン１は、米国特許第５，８７１，７３２号の配列番号１０、１５、４５、および５６において報告される。
ｍＡｂ ＣＤ４の可変ドメイン２および４は、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943において報告される。
ｍＡｂ ＣＤ４の可変ドメイン３は、ＷＯ９１／００９９６６の図３、４、１２、および１３において報告される。
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０１．Ｆ３： 抗体Ａ 配列番号１、２
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０２．１Ｃ１１： 抗体Ｂ 配列番号３、４
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３．１Ｃ５ ： 抗体Ｃ 配列番号５、６
＜ＣＣＲ５＞Ｆ３．１Ｈ１２．２Ｅ５： 抗体Ｄ 配列番号７、８
＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０４．１Ｆ６： 抗体Ｅ
ｍＡｂ ＣＤ４の可変ドメイン１は、米国特許第５，８７１，７３２号の配列番号１０、１５、４５、および５６において報告される。
ｍＡｂ ＣＤ４の可変ドメイン２および４は、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943において報告される。
ｍＡｂ ＣＤ４の可変ドメイン３は、ＷＯ９１／００９９６６の図３、４、１２、および１３において報告される。
抗体の配列、抗膜融合ペプチドの配列およびペプチドリンカーの配列
配列番号１ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０１．Ｆ３重鎖、可変ドメイン
配列番号２ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０１．Ｆ３軽鎖、可変ドメイン
配列番号３ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０２．１Ｃ１１重鎖、可変ドメイン
配列番号４ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０２．１Ｃ１１軽鎖、可変ドメイン
配列番号５ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３．１Ｃ５重鎖、可変ドメイン
配列番号６ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３．１Ｃ５軽鎖、可変ドメイン
配列番号７ ＜ＣＣＲ５＞Ｆ３．１Ｈ１２．２Ｅ５重鎖、可変ドメイン
配列番号８ ＜ＣＣＲ５＞Ｆ３．１Ｈ１２．２Ｅ５軽鎖、可変ドメイン
配列番号９ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１０ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１１ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１２ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１３ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１４ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１５ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１６ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１７ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１８ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１９ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２０ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２１ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２２ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２３ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２４ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２５ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２６ γ１重鎖定常領域
配列番号２７ γ４重鎖定常領域
配列番号２８ κ軽鎖定常ドメイン
配列番号２９ Ｃ３４
配列番号３０ Ｔ２０
配列番号３１ Ｔ１２４９
配列番号３２ Ｔ６５１
配列番号３３ Ｔ２６３５
配列番号３４ Ｎ３６
配列番号３５ ＤＰ１０７
配列番号３６〜６２、６７〜７０ リンカーペプチド
配列番号６３ 成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５κ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６４ 成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号６５ 成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５抱合体重鎖のアミノ酸配列
配列番号６６ ＨＩＶ−１ ｇｐ４１
配列番号７１ 成熟ｍＡｂ ＣＤ４κ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号７２ 成熟ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号７３ ａｆｐ−１
配列番号７４ 成熟ｍＡｂ ＣＤ４抱合体重鎖のアミノ酸配列
配列番号７５ ネズミ軽鎖可変ドメイン１ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７６ キメラ軽鎖可変ドメイン１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７７ キメラ軽鎖１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７８ キメラ軽鎖可変ドメイン２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７９ キメラ軽鎖可変ドメイン３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８０ キメラ軽鎖可変ドメイン４ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８１ ネズミ重鎖可変ドメイン１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８２ キメラ重鎖可変ドメイン１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８３ キメラ重鎖１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８４ キメラ重鎖可変ドメイン２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８５ キメラ重鎖可変ドメイン３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８６ キメラ重鎖可変ドメイン４ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８７ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８８ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８９ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９０ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９１ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９２ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９３ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９４ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９５ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９６ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９７ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９８ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９９ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１００ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０１ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０２ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０３ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０４ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０５ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０１．Ｆ３重鎖、可変ドメイン
配列番号２ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０１．Ｆ３軽鎖、可変ドメイン
配列番号３ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０２．１Ｃ１１重鎖、可変ドメイン
配列番号４ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０２．１Ｃ１１軽鎖、可変ドメイン
配列番号５ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３．１Ｃ５重鎖、可変ドメイン
配列番号６ ＜ＣＣＲ５＞Ｐｚ０３．１Ｃ５軽鎖、可変ドメイン
配列番号７ ＜ＣＣＲ５＞Ｆ３．１Ｈ１２．２Ｅ５重鎖、可変ドメイン
配列番号８ ＜ＣＣＲ５＞Ｆ３．１Ｈ１２．２Ｅ５軽鎖、可変ドメイン
配列番号９ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１０ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１１ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１２ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１３ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１４ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１５ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１６ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１７ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１８ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号１９ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２０ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２１ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２２ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２３ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２４ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２５ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＣＲ５
配列番号２６ γ１重鎖定常領域
配列番号２７ γ４重鎖定常領域
配列番号２８ κ軽鎖定常ドメイン
配列番号２９ Ｃ３４
配列番号３０ Ｔ２０
配列番号３１ Ｔ１２４９
配列番号３２ Ｔ６５１
配列番号３３ Ｔ２６３５
配列番号３４ Ｎ３６
配列番号３５ ＤＰ１０７
配列番号３６〜６２、６７〜７０ リンカーペプチド
配列番号６３ 成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５κ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６４ 成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号６５ 成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５抱合体重鎖のアミノ酸配列
配列番号６６ ＨＩＶ−１ ｇｐ４１
配列番号７１ 成熟ｍＡｂ ＣＤ４κ軽鎖のアミノ酸配列
配列番号７２ 成熟ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号７３ ａｆｐ−１
配列番号７４ 成熟ｍＡｂ ＣＤ４抱合体重鎖のアミノ酸配列
配列番号７５ ネズミ軽鎖可変ドメイン１ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７６ キメラ軽鎖可変ドメイン１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７７ キメラ軽鎖１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７８ キメラ軽鎖可変ドメイン２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号７９ キメラ軽鎖可変ドメイン３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８０ キメラ軽鎖可変ドメイン４ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８１ ネズミ重鎖可変ドメイン１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８２ キメラ重鎖可変ドメイン１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８３ キメラ重鎖１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８４ キメラ重鎖可変ドメイン２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８５ キメラ重鎖可変ドメイン３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８６ キメラ重鎖可変ドメイン４ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８７ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８８ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号８９ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９０ 軽鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９１ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９２ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９３ 軽鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９４ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９５ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９６ 軽鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９７ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９８ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号９９ 重鎖ＣＤＲ１ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１００ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０１ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０２ 重鎖ＣＤＲ２ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０３ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０４ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
配列番号１０５ 重鎖ＣＤＲ３ ｍＡｂ ＣＤ４
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示される。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ付番に従って付番される（Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示される。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ付番に従って付番される（Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるとおり、標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。製造元の説明書に従って、分子生物学的試薬を使用した。
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるとおり、標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。製造元の説明書に従って、分子生物学的試薬を使用した。
遺伝子合成
化学合成によって作製されるオリゴヌクレオチドから、望ましい遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結によって、特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位によって隣接される長さ１００〜６００塩基対の遺伝子セグメントを集合させた後、Ａ−オーバーハングを介してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp., USA）中へクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
化学合成によって作製されるオリゴヌクレオチドから、望ましい遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結によって、特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位によって隣接される長さ１００〜６００塩基対の遺伝子セグメントを集合させた後、Ａ−オーバーハングを介してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングベクター（Invitrogen Corp., USA）中へクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
タンパク質の測定
アミノ酸配列に基づいて算出されるモル吸光係数を使用して、２８０nmで光学密度（ＯＤ）を測定することによって、抱合体のタンパク質濃度を測定した。
アミノ酸配列に基づいて算出されるモル吸光係数を使用して、２８０nmで光学密度（ＯＤ）を測定することによって、抱合体のタンパク質濃度を測定した。
実施例１
抗ＣＣＲ５抗体発現プラスミドの作製
抗ＣＣＲ５抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常部（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを、抗ＣＣＲ５抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトγ１重鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に関する遺伝子セグメントと同様に接合した。
抗ＣＣＲ５抗体発現プラスミドの作製
抗ＣＣＲ５抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常部（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを、抗ＣＣＲ５抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトγ１重鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に関する遺伝子セグメントと同様に接合した。
配列番号６３／６４のｍＡｂ ＣＣＲ５の場合、重鎖および軽鎖可変ドメインは、マウス抗体に由来し、重鎖および軽鎖定常部は、ヒト抗体に由来する（ＣκおよびＩｇＧ１）。
その後、完全な抗ＣＣＲ５抗体軽鎖をコードする遺伝子セグメントをＮ末端および／またはＣ末端で、接続リンカー配列を含む抗膜融合ペプチドをコードする核酸と接合し、および／または完全な抗ＣＣＲ５抗体重鎖をコードする遺伝子セグメントをＮ末端および／またはＣ末端で、接続リンカー配列を含む抗膜融合ペプチドをコードする核酸と接合した。
ａ）ベクター４９００
ベクター４９００は、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター４９００は、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ｍＡｂ ＣＣＲ５κ軽鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
− 選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
− 選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
ｍＡｂ ＣＣＲ５κ軽鎖遺伝子の転写単位は、以下の要素から構成される。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ５’末端の独特なＢｓｍＩ制限部位（Ｌ２シグナル配列）および３’末端の独特なＮｏｔＩ制限部位とともに配置されるセグメントをコードするネズミ抗ＣＣＲ５抗体成熟可変κ軽鎖、
− ヒト／マウスκ軽鎖ハイブリッドイントロン２、
− ヒトκ軽鎖遺伝子定常部、
− ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ５’末端および３’末端にそれぞれある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ５’末端の独特なＢｓｍＩ制限部位（Ｌ２シグナル配列）および３’末端の独特なＮｏｔＩ制限部位とともに配置されるセグメントをコードするネズミ抗ＣＣＲ５抗体成熟可変κ軽鎖、
− ヒト／マウスκ軽鎖ハイブリッドイントロン２、
− ヒトκ軽鎖遺伝子定常部、
− ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ５’末端および３’末端にそれぞれある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩ。
ｍＡｂ ＣＣＲ５κ軽鎖発現ベクター４９００のプラスミドマップを図１に示す。（シグナル配列を有さない）成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５κ軽鎖のアミノ酸配列を配列番号６３に示す。
ｂ）ベクター４９９１
ベクター４９９１は、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター４９９１は、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ｍＡｂ ＣＣＲ５γＩ重鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
− 選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。
− 選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。
ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖の転写単位は、以下の要素から構成される。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ５’末端の独特なＢｓｍＩ制限部位（Ｌ２シグナル配列）およびスプライスドナー部位および３’末端の独特なＮｏｔＩ制限部位とともに配置されるセグメントをコードするネズミ抗ＣＣＲ５抗体成熟可変重鎖、
− マウス重鎖エンハンサー要素（ＪＨ３、ＪＨ４部分）を含むヒト／マウス重鎖ハイブリッドイントロン２（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
− ゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常部、
− ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ５’末端および３’末端にそれぞれある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ５’末端の独特なＢｓｍＩ制限部位（Ｌ２シグナル配列）およびスプライスドナー部位および３’末端の独特なＮｏｔＩ制限部位とともに配置されるセグメントをコードするネズミ抗ＣＣＲ５抗体成熟可変重鎖、
− マウス重鎖エンハンサー要素（ＪＨ３、ＪＨ４部分）を含むヒト／マウス重鎖ハイブリッドイントロン２（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
− ゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常部、
− ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ５’末端および３’末端にそれぞれある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖発現ベクター４９０１のプラスミドマップを図２に示す。（シグナル配列を有さない）成熟ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
ｃ）ベクター４９９５
ベクター４９９５は、ＨＥＫ２９３細胞中のキメラペプチド−抗ＣＣＲ５抗体γ１重鎖抱合体（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター４９９５は、ＨＥＫ２９３細胞中のキメラペプチド−抗ＣＣＲ５抗体γ１重鎖抱合体（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター４９９５は、ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖が、抗膜融合ペプチドＴ−２６３５をコードする核酸（配列番号３３）およびペプチドリンカー配列［ＧＱ４］３ＧＮＮ（配列番号４０）を有するＣ末端で接合するような方法で、プラスミド４９９１に由来する。
キメラペプチド抗ＣＣＲ５抗体γ１重鎖抱合体発現カセットのほかに、このベクターは、
− 選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。
− 選択可能なマーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子、
− エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点ｏｒｉＰ、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。
キメラペプチド抗ＣＣＲ５抗体γ１重鎖抱合体の転写単位は、以下の要素から構成される。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ５’末端の独特なＢｓｍＩ制限部位（Ｌ２シグナル配列）およびスプライスドナー部位および３’末端の独特なＮｏｔＩ制限部位とともに配置されるセグメントをコードするネズミ抗ＣＣＲ５抗体成熟可変重鎖、
− マウス重鎖エンハンサー要素（ＪＨ３、ＪＨ４部分）を含むヒト／マウス重鎖ハイブリッドイントロン２（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
− ゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常部、
− 抗膜融合ペプチドＴ−２６３５、
− ペプチドリンカー配列［ＧＱ４］３ＧＮＮ、
− ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ５’末端および３’末端にそれぞれある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ５’末端の独特なＢｓｍＩ制限部位（Ｌ２シグナル配列）およびスプライスドナー部位および３’末端の独特なＮｏｔＩ制限部位とともに配置されるセグメントをコードするネズミ抗ＣＣＲ５抗体成熟可変重鎖、
− マウス重鎖エンハンサー要素（ＪＨ３、ＪＨ４部分）を含むヒト／マウス重鎖ハイブリッドイントロン２（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
− ゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常部、
− 抗膜融合ペプチドＴ−２６３５、
− ペプチドリンカー配列［ＧＱ４］３ＧＮＮ、
− ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ５’末端および３’末端にそれぞれある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
ｍＡｂ ＣＣＲ５γ１重鎖抱合体発現ベクター４９９５のプラスミドマップを図３に示す。（シグナル配列を有さない）成熟抱合体重鎖のアミノ酸配列を配列番号６５に示す。
実施例２
最終的な抗ＣＣＲ５抗体発現プラスミドの作製
ｍＡｂ ＣＣＲ５遺伝子セグメント、任意のリンカー遺伝子セグメントおよび抗膜融合ペプチド遺伝子セグメントを含む融合遺伝子（重鎖および／または軽鎖抗体融合遺伝子）は、公知の組換え方法および技術を使用して、従った核酸セグメントの接続によって集合した。ペプチドリンカーおよび抗膜融合ポリペプチドをコードする核酸配列を、化学合成によって各々合成した後、増幅のためのイー・コリプラスミド中へ連結した。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
最終的な抗ＣＣＲ５抗体発現プラスミドの作製
ｍＡｂ ＣＣＲ５遺伝子セグメント、任意のリンカー遺伝子セグメントおよび抗膜融合ペプチド遺伝子セグメントを含む融合遺伝子（重鎖および／または軽鎖抗体融合遺伝子）は、公知の組換え方法および技術を使用して、従った核酸セグメントの接続によって集合した。ペプチドリンカーおよび抗膜融合ポリペプチドをコードする核酸配列を、化学合成によって各々合成した後、増幅のためのイー・コリプラスミド中へ連結した。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
実施例３
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における免疫グロブリンおよび免疫グロブリン変異形の一過性発現
１０％超低濃度ＩｇＧのＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ）、２mMグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％（v/v）非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および２５０μg／mL Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals）を補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養された接着増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現させるヒト胚性腎細胞系２９３；米国培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションによって、組換え抗ＣＣＲ５抗体および抗ＣＣＲ５抗体突然変異形を生じた。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals）を、３：１〜６：１の範囲の試薬（μL）：ＤＮＡ（μg）の比で使用した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体軽鎖および重鎖を含む軽鎖および重鎖を２個の異なるプラスミドから、それぞれ１：２〜２：１の範囲の軽鎖：重鎖をコードするプラスミドのモル比を使用して発現させた。細胞培養上清を含有する抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体をトランスフェクション後第４〜１１日目に回収した。例えばＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に付与される。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における免疫グロブリンおよび免疫グロブリン変異形の一過性発現
１０％超低濃度ＩｇＧのＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ）、２mMグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％（v/v）非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および２５０μg／mL Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals）を補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養された接着増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現させるヒト胚性腎細胞系２９３；米国培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションによって、組換え抗ＣＣＲ５抗体および抗ＣＣＲ５抗体突然変異形を生じた。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals）を、３：１〜６：１の範囲の試薬（μL）：ＤＮＡ（μg）の比で使用した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体軽鎖および重鎖を含む軽鎖および重鎖を２個の異なるプラスミドから、それぞれ１：２〜２：１の範囲の軽鎖：重鎖をコードするプラスミドのモル比を使用して発現させた。細胞培養上清を含有する抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体をトランスフェクション後第４〜１１日目に回収した。例えばＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に付与される。
実施例４
ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングトランスファーおよび免疫グロブリン特異的抗体抱合体による検出を使用する発現分析
発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって処理し、分離された抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体−抱合体鎖をゲルからメンブレンへ転移させた後、免疫学的方法によって検出した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングトランスファーおよび免疫グロブリン特異的抗体抱合体による検出を使用する発現分析
発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって処理し、分離された抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体−抱合体鎖をゲルからメンブレンへ転移させた後、免疫学的方法によって検出した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＤＳ試料バッファー、４倍濃縮物（４×）：４ｇのグリセロール、０．６８２ｇのトリス塩基、０．６６６ｇのトリス塩酸、０．８ｇのＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、水中のＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ２５０の１％（w/w）溶液０．７５mL、フェノールレッドの１重量％（w/w）溶液０．７５mL、水を添加して、１０mLの全体容積にする。
ＬＤＳ試料バッファー、４倍濃縮物（４×）：４ｇのグリセロール、０．６８２ｇのトリス塩基、０．６６６ｇのトリス塩酸、０．８ｇのＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、水中のＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ２５０の１％（w/w）溶液０．７５mL、フェノールレッドの１重量％（w/w）溶液０．７５mL、水を添加して、１０mLの全体容積にする。
分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を含有する培養ブロスを遠心分離して、細胞および細胞デブリを除去した。清澄化された上清の一定分量を、４×ＬＤＳ試料バッファー１／４容積（v/v）および０．５Ｍ １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１／１０容積（v/v）と混合した。次に、試料を７０℃で１０分間インキュベートし、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）プレキャストゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書に従って使用した。特に、１０％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−トリスプレキャストゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ泳動バッファーを使用した。
ウェスタンブロット
トランスファーバッファー：３９mMグリシン、４８mMトリス塩酸、０．０４重量％（w/w）ＳＤＳ、および２０容積％（v/v）メタノール。
トランスファーバッファー：３９mMグリシン、４８mMトリス塩酸、０．０４重量％（w/w）ＳＤＳ、および２０容積％（v/v）メタノール。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、分離された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体鎖を、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの「セミドライブロテッィング法」（Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）に従って、電気泳動でニトロセルロースフィルターメンブレン（孔サイズ：０．４５μm）へ転移させた。
免疫学的検出
ＴＢＳバッファー：５０mMトリス塩酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に調整した。
ブロッキング溶液：ＴＢＳバッファー中の１％（w/v）ウェスタンブロッキング試薬（Roche Molecular Biochemicals）
ＴＢＳＴバッファー：０．０５容積％（v/v）トゥイーン２０を有する１×ＴＢＳバッファー
免疫学的検出のために、ウェスタンブロッティングメンブレンを室温でＴＢＳバッファー中で５分間を２回、およびブロッキング溶液中で９０分間を１回、振盪しながらインキュベートした。
ＴＢＳバッファー：５０mMトリス塩酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に調整した。
ブロッキング溶液：ＴＢＳバッファー中の１％（w/v）ウェスタンブロッキング試薬（Roche Molecular Biochemicals）
ＴＢＳＴバッファー：０．０５容積％（v/v）トゥイーン２０を有する１×ＴＢＳバッファー
免疫学的検出のために、ウェスタンブロッティングメンブレンを室温でＴＢＳバッファー中で５分間を２回、およびブロッキング溶液中で９０分間を１回、振盪しながらインキュベートした。
ペプチド免疫グロブリン抱合体鎖の検出
重鎖：抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体の重鎖の検出のために、ペルオキシダーゼへ抱合された精製済みウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ ０２１４）。
重鎖：抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体の重鎖の検出のために、ペルオキシダーゼへ抱合された精製済みウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ ０２１４）。
軽鎖：精製済みペルオキシダーゼにより抱合されたウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ ０１２９）を使用して、抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体の軽鎖を検出した。
洗浄およびブロッキングされた抗体軽鎖および重鎖の可視化のために、ウェスタンブロットメンブレンをまず、重鎖の場合にはペルオキシダーゼへ抱合された精製済みウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とともに、または軽鎖の場合、精製済みペルオキシダーゼにより抱合されたウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体とともに、１０mLブロッキング溶液中で１：１０，０００希釈中で、４℃で一晩振盪しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＴＳバッファーで３回洗浄した後、ＴＢＳバッファーで１回１０分間室温で洗浄した後、化学発光を生じるルミノール／ペルオキシド溶液（Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳウェスタンブロッティング基質、Roche Molecular Biochemicals）を使用して、ウェスタンブロットメンブレンを発光させた。したがって、メンブレンを１０mLのルミノール／ペルオキシド溶液中で１０秒間〜５分間インキュベートした後、放射された光をＬＵＭＩ−Ｉｍａｇｅｒ Ｆ１ Ａｎａｌｙｓａｔｏｒ（Roche Molecular Biochemicals）で検出し、および／またはＸ線フィルムで記録した。スポットの強度をＬｕｍｉＡｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（第３．１版）で定量化した。
イムノブロットの多重染色
検出に使用されるペルオキシダーゼ標識二次抗体抱合体は、１００mMβ−メルカプトエタノールと２０％（w/v）ＳＤＳとを含有する１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ６．７）中で、メンブレンを７０℃で１時間インキュベートすることによって、染色されたブロットから除去することが可能である。この処理の後、ブロットを異なる二次抗体で、第二の時間、染色することが可能である。二次検出の前に、ＴＢＳバッファー中で各１０分間振盪しながら、ブロットを室温で３回洗浄する。
検出に使用されるペルオキシダーゼ標識二次抗体抱合体は、１００mMβ−メルカプトエタノールと２０％（w/v）ＳＤＳとを含有する１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ６．７）中で、メンブレンを７０℃で１時間インキュベートすることによって、染色されたブロットから除去することが可能である。この処理の後、ブロットを異なる二次抗体で、第二の時間、染色することが可能である。二次検出の前に、ＴＢＳバッファー中で各１０分間振盪しながら、ブロットを室温で３回洗浄する。
実施例５
ペプチド免疫グロブリン抱合体のアフィニティ精製、透析および濃縮
公知の方法に従ってプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を精製した。簡潔には、遠心分離（１０，０００ｇで１０分間）および０．４５μmフィルターによる濾過の後、清澄化された培養上清を含有するペプチド免疫グロブリン抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂカラムへ適用した。結合していないタンパク質を、ＰＢＳ平衡化バッファーおよび０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）で洗い流した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、抱合体を含有する画分を１Ｍトリス塩基で中和した。次に、抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体をＰＢＳバッファーに対して４℃で大規模に透析し、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫメンブレン（Millipore Corp., USA）を装備したＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＣＬ遠心分離フィルターユニットで濃縮し、氷水槽中に０℃で保存した。還元剤の存在下および非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、抱合体の完全性を実施例４に記載のとおり分析した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体の凝集体を分析用分子ふるいクロマトグラフィーによって分析した。
ペプチド免疫グロブリン抱合体のアフィニティ精製、透析および濃縮
公知の方法に従ってプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を精製した。簡潔には、遠心分離（１０，０００ｇで１０分間）および０．４５μmフィルターによる濾過の後、清澄化された培養上清を含有するペプチド免疫グロブリン抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂカラムへ適用した。結合していないタンパク質を、ＰＢＳ平衡化バッファーおよび０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）で洗い流した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、抱合体を含有する画分を１Ｍトリス塩基で中和した。次に、抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体をＰＢＳバッファーに対して４℃で大規模に透析し、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫメンブレン（Millipore Corp., USA）を装備したＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＣＬ遠心分離フィルターユニットで濃縮し、氷水槽中に０℃で保存した。還元剤の存在下および非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、抱合体の完全性を実施例４に記載のとおり分析した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体の凝集体を分析用分子ふるいクロマトグラフィーによって分析した。
実施例６
ペプチド免疫グロブリン抱合体の脱グリコシル化
抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体のＮ架橋された炭水化物を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, GermanyまたはProzyme, San Leandro, CA）による酵素処理によって切断した。したがって、約２mg／mLのタンパク質濃度で、ＰＢＳバッファー中で１mgのＮ−グリコシル化タンパク質あたり５０mUのＰＮＧａｓｅＦを使用して、抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を３７℃で１２〜２４時間インキュベートした。その後、公知の方法に従った調製用ゲル濾過によって、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを分離した。簡潔には、ＰＮＧａｓｅＦで処理された抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１ mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７ mM ＮａＣｌおよび２．７ mM ＫＣｌ、ｐＨ ７．４）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）に適用した後、Amersham Bioscience（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）製のＡｋｔａエクスプローラークロマトグラフィーシステムを使用して、０．５〜１．０mL／分の流速で平衡化バッファーを使用して溶出した。
ペプチド免疫グロブリン抱合体の脱グリコシル化
抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体のＮ架橋された炭水化物を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, GermanyまたはProzyme, San Leandro, CA）による酵素処理によって切断した。したがって、約２mg／mLのタンパク質濃度で、ＰＢＳバッファー中で１mgのＮ−グリコシル化タンパク質あたり５０mUのＰＮＧａｓｅＦを使用して、抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を３７℃で１２〜２４時間インキュベートした。その後、公知の方法に従った調製用ゲル濾過によって、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを分離した。簡潔には、ＰＮＧａｓｅＦで処理された抗ＣＣＲ５抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１ mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７ mM ＮａＣｌおよび２．７ mM ＫＣｌ、ｐＨ ７．４）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）に適用した後、Amersham Bioscience（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）製のＡｋｔａエクスプローラークロマトグラフィーシステムを使用して、０．５〜１．０mL／分の流速で平衡化バッファーを使用して溶出した。
実施例７
単一周期の抗ウイルス活性アッセイ
偽型ＮＬ−Ｂａｌウイルスの産生のために、プラスミドｐＮＬ４−３Δｅｎｖ（ｅｎｖ遺伝子内に欠失を有するＨＩＶ ｐＮＬ４−３ゲノムコンストラクト）およびｐＣＤＮＡ３．１／ＮＬ−ＢＡＬ ｅｎｖ［（エイズ試薬に関してＮＩＢＳＣ Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得られる）ＮＬ−Ｂａｌ ｅｎｖ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド］をＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へトランスフェクトし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミンおよび０．５mg／mLジェネテシン（すべての培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製）を含有するダルベッコ変法最小培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。偽型ウイルスを含有する上清をトランスフェクションの２日後に回収し、０．４５μmの孔サイズのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）による濾過によって細胞デブリを除去し、分注して−８０℃で保存した。アッセイの性能における標準化のために、ウイルスストックの一定分量を使用して、ＪＣ５３−ＢＬ（ＵＳ ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）細胞を感染させると、１個のウェルあたり約１．５×１０５ＲＬＵ（相対的光単位）を生じた。検査用抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体、参照抗体および参照抗膜融合ペプチド（Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）を９６ウェルプレート中に連続希釈した。アッセイを四つ組で実施した。各プレートは、細胞コントロールおよびウイルスコントロールのウェルを含有した。ウイルスストックの１．５×１０５ＲＬＵの等量を各ウェルに添加した後、２．５×１０４個のＪＣ５３−ＢＬ細胞を各ウェルに添加し、１ウェルあたり２００μLの最終アッセイ容積にした。３７℃、９０％相対湿度、および５％ＣＯ２で３日間のインキュベーションの後、培地を吸引し、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μLを各ウェルへ添加した。室温でインキュベーションを１０分間した後、アッセイプレートをルミノメーター（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。バックグラウンドを減算した後、各用量地点に関してルシフェラーゼ活性の％阻害を算出し、エクセル（第３．０．５版ビルド１２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）用のＸＬｆｉｔ曲線適合ソフトウェアを使用することによって、ＩＣ５０およびＩＣ９０値を決定した。
単一周期の抗ウイルス活性アッセイ
偽型ＮＬ−Ｂａｌウイルスの産生のために、プラスミドｐＮＬ４−３Δｅｎｖ（ｅｎｖ遺伝子内に欠失を有するＨＩＶ ｐＮＬ４−３ゲノムコンストラクト）およびｐＣＤＮＡ３．１／ＮＬ−ＢＡＬ ｅｎｖ［（エイズ試薬に関してＮＩＢＳＣ Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得られる）ＮＬ−Ｂａｌ ｅｎｖ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド］をＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へトランスフェクトし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミンおよび０．５mg／mLジェネテシン（すべての培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製）を含有するダルベッコ変法最小培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。偽型ウイルスを含有する上清をトランスフェクションの２日後に回収し、０．４５μmの孔サイズのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）による濾過によって細胞デブリを除去し、分注して−８０℃で保存した。アッセイの性能における標準化のために、ウイルスストックの一定分量を使用して、ＪＣ５３−ＢＬ（ＵＳ ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）細胞を感染させると、１個のウェルあたり約１．５×１０５ＲＬＵ（相対的光単位）を生じた。検査用抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体、参照抗体および参照抗膜融合ペプチド（Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）を９６ウェルプレート中に連続希釈した。アッセイを四つ組で実施した。各プレートは、細胞コントロールおよびウイルスコントロールのウェルを含有した。ウイルスストックの１．５×１０５ＲＬＵの等量を各ウェルに添加した後、２．５×１０４個のＪＣ５３−ＢＬ細胞を各ウェルに添加し、１ウェルあたり２００μLの最終アッセイ容積にした。３７℃、９０％相対湿度、および５％ＣＯ２で３日間のインキュベーションの後、培地を吸引し、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μLを各ウェルへ添加した。室温でインキュベーションを１０分間した後、アッセイプレートをルミノメーター（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。バックグラウンドを減算した後、各用量地点に関してルシフェラーゼ活性の％阻害を算出し、エクセル（第３．０．５版ビルド１２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）用のＸＬｆｉｔ曲線適合ソフトウェアを使用することによって、ＩＣ５０およびＩＣ９０値を決定した。
実施例８
細胞−細胞融合アッセイ
第１日目に、白色９６マイクロタイタープレート中で、１０％ＦＣＳおよび２μg／mLのドキシサイクリンを補充したＤＭＥＭ培地中にｇｐ１６０を発現させるＨｅＬａ細胞（２×１０４個／５０μL／ウェル）を播種する。第２日目に、上清試料または抗体コントロール１００μL／ウェルを、透明な９６マイクロタイタープレート中に添加する。次に、培地中に８×１０４個のＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ懸濁細胞を含有する１００μLを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＨｅＬａ細胞培地を９６ウェルプレートから吸引し、２００μLの抗体／ＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ混合物由来の１００μLを添加し、３７℃で一晩インキュベートする。第３日目に、１００μL／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（１，４−ジチオスレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム；Promega Corp., USA）を添加し、室温で最低でも１５分間インキュベートした後、発光を測定する。
細胞−細胞融合アッセイ
第１日目に、白色９６マイクロタイタープレート中で、１０％ＦＣＳおよび２μg／mLのドキシサイクリンを補充したＤＭＥＭ培地中にｇｐ１６０を発現させるＨｅＬａ細胞（２×１０４個／５０μL／ウェル）を播種する。第２日目に、上清試料または抗体コントロール１００μL／ウェルを、透明な９６マイクロタイタープレート中に添加する。次に、培地中に８×１０４個のＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ懸濁細胞を含有する１００μLを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＨｅＬａ細胞培地を９６ウェルプレートから吸引し、２００μLの抗体／ＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ混合物由来の１００μLを添加し、３７℃で一晩インキュベートする。第３日目に、１００μL／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（１，４−ジチオスレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム；Promega Corp., USA）を添加し、室温で最低でも１５分間インキュベートした後、発光を測定する。
材料
栄養素と、４００μg／mLのＧ４１８および２００μg／mLのハイグロマイシンＢを有する１０％ＦＣＳとを含有するＤＭＥＭ培地中で、ＨｅＬａ−Ｒ５−１６細胞（ドキシサイクリン誘導の際にＨＩＶ ｇｐ１６０を発現させるための細胞系）を培養する。ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５−Ｌｕｃ（カタログ番号：５１９８、NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手可能なＴ細胞系）。細胞種：ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５（カタログ番号４３７６）をトランスフェクトして（電気穿孔法）、ＨＩＶ−２ ＬＴＲの転写調節下でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ、１０％ウシ胎仔血清、４mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン）、および０．８mg／mL硫酸ジェネテシン（Ｇ４１８）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。増殖特徴：丸いリンパ球系細胞、形態はほとんど変化しない。単一細胞として懸濁液中で細胞が増殖し、小さな凝集塊を形成し得る。１週間に２回分裂１：１０。特別な特徴：ＨＩＶ−２ＬＴＲのトランス活性化後にルシフェラーゼ活性を発現。初代ＨＩＶ単離物による感染、中和および薬物感受性アッセイに適している（Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300, Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974）。NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHを通じてJohn Moore博士およびCatherine Spenlehauer博士から細胞系を得た。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイバッファー（Promega Corp. USA、部分番号Ｅ２２６４Ｂ）、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Promega Corp. USA、部分番号ＥＥ２６Ｂ）。
栄養素と、４００μg／mLのＧ４１８および２００μg／mLのハイグロマイシンＢを有する１０％ＦＣＳとを含有するＤＭＥＭ培地中で、ＨｅＬａ−Ｒ５−１６細胞（ドキシサイクリン誘導の際にＨＩＶ ｇｐ１６０を発現させるための細胞系）を培養する。ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５−Ｌｕｃ（カタログ番号：５１９８、NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手可能なＴ細胞系）。細胞種：ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５（カタログ番号４３７６）をトランスフェクトして（電気穿孔法）、ＨＩＶ−２ ＬＴＲの転写調節下でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ、１０％ウシ胎仔血清、４mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン）、および０．８mg／mL硫酸ジェネテシン（Ｇ４１８）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。増殖特徴：丸いリンパ球系細胞、形態はほとんど変化しない。単一細胞として懸濁液中で細胞が増殖し、小さな凝集塊を形成し得る。１週間に２回分裂１：１０。特別な特徴：ＨＩＶ−２ＬＴＲのトランス活性化後にルシフェラーゼ活性を発現。初代ＨＩＶ単離物による感染、中和および薬物感受性アッセイに適している（Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300, Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974）。NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHを通じてJohn Moore博士およびCatherine Spenlehauer博士から細胞系を得た。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイバッファー（Promega Corp. USA、部分番号Ｅ２２６４Ｂ）、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Promega Corp. USA、部分番号ＥＥ２６Ｂ）。
実施例９
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における抗ウイルス活性アッセイ
製造元のプロトコールに従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham, Piscataway, New Jersey, USA）密度勾配遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを（Stanford Blood Centerから得られる）バフィーコートから単離する。簡潔には、５０mLコニカルチューブ中のバフィーコートから血液を転移させ、滅菌済みダルベッコリン酸塩類バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）で５０mLの最終容積に希釈する。希釈した血液２５mLを２本の５０mLコニカルチューブへ転移させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Amersham Biosciences）１２．５mLを注意深く下層に敷き、４５０×ｇでブレーキをかけずに室温で２０分間遠心分離する。白色細胞層を新しい５０mLコニカルチューブへ注意深く転移させ、ＰＢＳで２回洗浄する。残存する赤血球細胞を除去するために、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）とともに室温で５分間インキュベートし、ＰＢＳでもう１回洗浄する。ＰＢＭＣを計数し、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、および２μg／mL植物性血球凝集素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中に２〜４×１０６個／mLの濃度で３７℃で２４時間インキュベートする。９６ウェル丸底プレート中で、連続希釈した検査用ペプチド−免疫グロブリン抱合体、参照免疫グロブリンおよび参照ペプチド（Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）の存在下で、１×１０５個のＰＢＭＣにＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦウイルス（Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822）を感染させる。使用されるウイルスの量は、ウェルあたり１．２ｎｇのＨＩＶ−１ ｐ２４抗原と等価である。感染を四つ組で設定する。プレートを３７℃で６日間インキュベートする。感染終了時に、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（第３．０．５版ビルド１２；等式２０５、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）において１個の結合部位を有するＳ字形用量反応モデルを使用するｐ２４ ＥＬＩＳＡ（ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ＃ＮＥＫ０５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）を使用することによって、ウイルス産生を測定する。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における抗ウイルス活性アッセイ
製造元のプロトコールに従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham, Piscataway, New Jersey, USA）密度勾配遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを（Stanford Blood Centerから得られる）バフィーコートから単離する。簡潔には、５０mLコニカルチューブ中のバフィーコートから血液を転移させ、滅菌済みダルベッコリン酸塩類バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）で５０mLの最終容積に希釈する。希釈した血液２５mLを２本の５０mLコニカルチューブへ転移させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Amersham Biosciences）１２．５mLを注意深く下層に敷き、４５０×ｇでブレーキをかけずに室温で２０分間遠心分離する。白色細胞層を新しい５０mLコニカルチューブへ注意深く転移させ、ＰＢＳで２回洗浄する。残存する赤血球細胞を除去するために、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）とともに室温で５分間インキュベートし、ＰＢＳでもう１回洗浄する。ＰＢＭＣを計数し、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、および２μg／mL植物性血球凝集素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中に２〜４×１０６個／mLの濃度で３７℃で２４時間インキュベートする。９６ウェル丸底プレート中で、連続希釈した検査用ペプチド−免疫グロブリン抱合体、参照免疫グロブリンおよび参照ペプチド（Ｔ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−６５１およびＴ−２６３５）の存在下で、１×１０５個のＰＢＭＣにＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦウイルス（Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822）を感染させる。使用されるウイルスの量は、ウェルあたり１．２ｎｇのＨＩＶ−１ ｐ２４抗原と等価である。感染を四つ組で設定する。プレートを３７℃で６日間インキュベートする。感染終了時に、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（第３．０．５版ビルド１２；等式２０５、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）において１個の結合部位を有するＳ字形用量反応モデルを使用するｐ２４ ＥＬＩＳＡ（ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ＃ＮＥＫ０５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）を使用することによって、ウイルス産生を測定する。
実施例１０
抗ＣＤ４抗体発現プラスミドの作製
抗ＣＤ４抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常部（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを、抗ＣＤ４抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトγ１重鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に関する遺伝子セグメントと同様に接合した。
抗ＣＤ４抗体発現プラスミドの作製
抗ＣＤ４抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常部（ＣＬ）をコードする遺伝子セグメントを、抗ＣＤ４抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトγ１重鎖定常部（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に関する遺伝子セグメントと同様に接合した。
配列番号７１／７２のｍＡｂ ＣＤ４の場合、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、例えば、Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943または米国特許第５，８７１，７３２号に記載されるようにヒト化されるマウス抗体に由来し、重鎖定常部および軽鎖定常部はヒト抗体（Ｃ−κおよびＩｇＧ１）に由来する。
その後、完全な抗ＣＤ４抗体軽鎖をコードする遺伝子セグメントをＮ末端および／またはＣ末端で、接続リンカー配列を含む抗膜融合ペプチドをコードする核酸と接合し、および／または完全な抗ＣＤ４抗体重鎖をコードする遺伝子セグメントをＮ末端および／またはＣ末端で、接続リンカー配列を含む抗膜融合ペプチドをコードする核酸と接合した。
ａ）ベクター６３１０
ベクター６３１０は、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＤ４軽鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター６３１０は、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＤ４軽鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ｍＡｂ ＣＤ４κ軽鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
− 選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抵抗性遺伝子、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
− 選択可能なマーカーとしてのネオマイシン抵抗性遺伝子、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
ｍＡｂ ＣＤ４κ軽鎖遺伝子の転写単位は、以下の要素から構成される。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− ヒト抗体生殖系列遺伝子の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ３’末端でスプライスドナー部位および独特なＢａｍＨＩ制限部位とともに配置されたヒト化抗ＣＤ４抗体成熟κ軽鎖可変ドメインをコードするセグメント
− 切断型ヒトκ軽鎖イントロン２、
− ヒトκ軽鎖遺伝子定常部、
− ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ３’末端にある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− ヒト抗体生殖系列遺伝子の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ３’末端でスプライスドナー部位および独特なＢａｍＨＩ制限部位とともに配置されたヒト化抗ＣＤ４抗体成熟κ軽鎖可変ドメインをコードするセグメント
− 切断型ヒトκ軽鎖イントロン２、
− ヒトκ軽鎖遺伝子定常部、
− ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ３’末端にある独特な制限部位ＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ。
ｍＡｂ ＣＤ４κ軽鎖発現ベクター６３１０のプラスミドマップを図４に示す。（シグナル配列を有さない）成熟ｍＡｂ ＣＤ４κ軽鎖のアミノ酸配列を配列番号７１に示す。
ｂ）ベクター６３０９
ベクター６３０９は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター６３０９は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ｍＡｂ ＣＤ４γＩ重鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖の転写単位は、以下の要素から構成される。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− ヒト抗体生殖系列遺伝子の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ３’末端でスプライスドナー部位および独特なＸｈｏＩ制限部位とともに配置されたヒト化抗ＣＤ４抗体成熟重鎖可変ドメインをコードするセグメント、
− マウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２、
− Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含有するゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常部、
− ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ３’末端にある独特な制限部位ＳｇｒＡＩ。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− ヒト抗体生殖系列遺伝子の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ３’末端でスプライスドナー部位および独特なＸｈｏＩ制限部位とともに配置されたヒト化抗ＣＤ４抗体成熟重鎖可変ドメインをコードするセグメント、
− マウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン２、
− Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含有するゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常部、
− ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ３’末端にある独特な制限部位ＳｇｒＡＩ。
ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖発現ベクター６３０９のプラスミドマップを図３に示す。（シグナル配列を有さない）成熟ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖のアミノ酸配列を配列番号７２に示す。
ｃ）ベクター６３０３
ベクター６３０３は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のキメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖抱合体（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター６３０３は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のキメラペプチド−抗ＣＤ４抗体γ１重鎖抱合体（ゲノム的に組織された発現カセット；エクソン−イントロン組織）の一過性発現のための発現プラスミドである。
ベクター６３０３は、ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖が、最後だが１つのＣ末端アミノ酸で接合するようベクター６３０９に由来し、すなわち、重鎖のＣ末端リジン残基が、抗膜融合ペプチドａｆｐ−１をコードする核酸（配列番号７３）および配列番号６９のペプチド性グリシン−セリンリンカーとともに除去される。
キメラペプチド抗ＣＤ４抗体γ１重鎖抱合体発現カセットのほかに、このベクターは、
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
− イー・コリ中でのこのプラスミドの複製が可能となるベクターｐＵＣ１８由来の複製起点、および
− イー・コリ中でアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
キメラペプチド抗ＣＤ４抗体γ１重鎖抱合体の転写単位は、以下の要素から構成される。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− ヒト抗体生殖系列遺伝子の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ３’末端でスプライスドナー部位および独特なＸｈｏＩ制限部位とともに配置されたヒト化抗ＣＤ４抗体成熟重鎖可変ドメインをコードするセグメント、
− Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含有するマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン、
− 配列番号６９のペプチド性セリン−グリシンリンカー配列、
− 配列番号７３の抗膜融合ペプチドａｆｐ−１、
− ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ３’末端にある独特な制限部位ＳｇｒＡＩ。
− ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
− ヒト抗体生殖系列遺伝子の５’非翻訳領域、
− シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列（シグナル配列１、イントロン、シグナル配列２［Ｌ１−イントロン−Ｌ２］）、
− ３’末端でスプライスドナー部位および独特なＸｈｏＩ制限部位とともに配置されたヒト化抗ＣＤ４抗体成熟重鎖可変ドメインをコードするセグメント、
− Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含有するマウス／ヒト重鎖ハイブリッドイントロン、
− 配列番号６９のペプチド性セリン−グリシンリンカー配列、
− 配列番号７３の抗膜融合ペプチドａｆｐ−１、
− ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、および
− ３’末端にある独特な制限部位ＳｇｒＡＩ。
ｍＡｂ ＣＤ４γ１重鎖抱合体発現ベクター６３０３のプラスミドマップを図６に示す。（シグナル配列を有さない）成熟抱合体重鎖のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
実施例１１
最終的な抗ＣＤ４抗体発現プラスミドの作製
ｍＡｂ ＣＤ４遺伝子セグメント、任意のリンカー遺伝子セグメントおよび抗膜融合ペプチド遺伝子セグメントを含む融合遺伝子（重鎖および／または軽鎖抗体融合遺伝子）は、公知の組換え方法および技術を使用して、従った核酸セグメントの接続によって集合した。ペプチドリンカーおよび抗膜融合ポリペプチドをコードする核酸配列を、化学合成によって各々合成した後、増幅のためのイー・コリプラスミド中へ連結した。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
最終的な抗ＣＤ４抗体発現プラスミドの作製
ｍＡｂ ＣＤ４遺伝子セグメント、任意のリンカー遺伝子セグメントおよび抗膜融合ペプチド遺伝子セグメントを含む融合遺伝子（重鎖および／または軽鎖抗体融合遺伝子）は、公知の組換え方法および技術を使用して、従った核酸セグメントの接続によって集合した。ペプチドリンカーおよび抗膜融合ポリペプチドをコードする核酸配列を、化学合成によって各々合成した後、増幅のためのイー・コリプラスミド中へ連結した。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
実施例１２
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における免疫グロブリンおよび免疫グロブリン変異形の一過性発現
１０％超低濃度ＩｇＧのＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ）、２mMグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１容積％（v/v）非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および２５０μg／mL Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals）を補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養された接着増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現させるヒト胚性腎細胞系２９３；米国培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションによって、組換え抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ４抗体突然変異形を生じた。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Roche Molecular Biochemicals）を、３：１〜６：１の範囲の試薬（μL）：ＤＮＡ（μg）の比で使用した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体軽鎖および重鎖を含む軽鎖および重鎖を２個の異なるプラスミドから、それぞれ１：２〜２：１の範囲の軽鎖：重鎖をコードするプラスミドのモル比を使用して発現させた。細胞培養上清を含有する抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体をトランスフェクション後第４〜１１日目に回収した。例えばＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に示される。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における免疫グロブリンおよび免疫グロブリン変異形の一過性発現
１０％超低濃度ＩｇＧのＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ）、２mMグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１容積％（v/v）非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および２５０μg／mL Ｇ４１８（Roche Molecular Biochemicals）を補充されたＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養された接着増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現させるヒト胚性腎細胞系２９３；米国培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＃ ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションによって、組換え抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ４抗体突然変異形を生じた。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Roche Molecular Biochemicals）を、３：１〜６：１の範囲の試薬（μL）：ＤＮＡ（μg）の比で使用した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体軽鎖および重鎖を含む軽鎖および重鎖を２個の異なるプラスミドから、それぞれ１：２〜２：１の範囲の軽鎖：重鎖をコードするプラスミドのモル比を使用して発現させた。細胞培養上清を含有する抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体をトランスフェクション後第４〜１１日目に回収した。例えばＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に示される。
実施例１３
ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングトランスファーおよび免疫グロブリン特異的抗体抱合体による検出を使用する発現分析
発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって処理し、分離された抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体−抱合体鎖をゲルからメンブレンへ転移させた後、免疫学的方法によって検出した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングトランスファーおよび免疫グロブリン特異的抗体抱合体による検出を使用する発現分析
発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって処理し、分離された抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体−抱合体鎖をゲルからメンブレンへ転移させた後、免疫学的方法によって検出した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＬＤＳ試料バッファー、４倍濃縮物（４×）：４ｇのグリセロール、０．６８２ｇのトリス塩基、０．６６６ｇのトリス塩酸、０．８ｇのＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、水中のＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ２５０の１％（w/w）溶液０．７５mL、フェノールレッドの１％（w/w）溶液０．７５mL、水を添加して、１０mLの全体容積にする。
ＬＤＳ試料バッファー、４倍濃縮物（４×）：４ｇのグリセロール、０．６８２ｇのトリス塩基、０．６６６ｇのトリス塩酸、０．８ｇのＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）、０．００６ｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、水中のＳｅｒｖａ Ｂｌｕｅ Ｇ２５０の１％（w/w）溶液０．７５mL、フェノールレッドの１％（w/w）溶液０．７５mL、水を添加して、１０mLの全体容積にする。
分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を含有する培養ブロスを遠心分離して、細胞および細胞デブリを除去した。清澄化された上清の一定分量を、４×ＬＤＳ試料バッファー１／４容積（v/v）および０．５Ｍ １，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）１／１０容積（v/v）と混合した。次に、試料を７０℃で１０分間インキュベートし、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書に従って使用した。特に、１０％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ泳動バッファーを使用した。
ウェスタンブロット
トランスファーバッファー：３９mMグリシン、４８mMトリス塩酸、０．０４重量％（w/w）ＳＤＳ、および２０容積％（v/v）メタノール。
トランスファーバッファー：３９mMグリシン、４８mMトリス塩酸、０．０４重量％（w/w）ＳＤＳ、および２０容積％（v/v）メタノール。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、分離された抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体鎖を、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの「セミドライブロテッィング法」（Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203）に従って、電気泳動でニトロセルロースフィルターメンブレン（孔サイズ：０．４５μm）へ転移させた。
免疫学的検出
ＴＢＳバッファー：５０mMトリス塩酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に調整。
ブロッキング溶液：ＴＢＳバッファー中の１％（w/v）ウェスタンブロッキング試薬（Roche Molecular Biochemicals）。
ＴＢＳＴバッファー：０．０５容積％（v/v）トゥイーン２０を有する１×ＴＢＳバッファー。
免疫学的検出のために、ウェスタンブロッティングメンブレンを室温でＴＢＳバッファー中で５分間を２回、およびブロッキング溶液中で９０分間を１回、振盪しながらインキュベートした。
ＴＢＳバッファー：５０mMトリス塩酸、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に調整。
ブロッキング溶液：ＴＢＳバッファー中の１％（w/v）ウェスタンブロッキング試薬（Roche Molecular Biochemicals）。
ＴＢＳＴバッファー：０．０５容積％（v/v）トゥイーン２０を有する１×ＴＢＳバッファー。
免疫学的検出のために、ウェスタンブロッティングメンブレンを室温でＴＢＳバッファー中で５分間を２回、およびブロッキング溶液中で９０分間を１回、振盪しながらインキュベートした。
ペプチド免疫グロブリン抱合体鎖の検出
重鎖：抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体の重鎖の検出のために、ペルオキシダーゼへ抱合された精製済みウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ ０２１４）。
重鎖：抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体の重鎖の検出のために、ペルオキシダーゼへ抱合された精製済みウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ ０２１４）。
軽鎖：精製済みペルオキシダーゼにより抱合されたウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ ０１２９）を使用して、抗膜融合ペプチド−抗ＣＣＲ５抗体抱合体の軽鎖を検出した。
洗浄およびブロッキングされた抗体軽鎖および重鎖の可視化のために、ウェスタンブロットメンブレンをまず、重鎖の場合にはペルオキシダーゼへ抱合された精製済みウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とともに、または軽鎖の場合、精製済みペルオキシダーゼにより抱合されたウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体とともに、１０mLブロッキング溶液中で１：１０，０００希釈中で、４℃で一晩振盪しながらインキュベートした。メンブレンをＴＢＴＳバッファーで３回洗浄した後、ＴＢＳバッファーで１回１０分間室温で洗浄した後、化学発光を生じるルミノール／ペルオキシド溶液（Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳウェスタンブロッティング基質、Roche Molecular Biochemicals）を使用して、ウェスタンブロットメンブレンを発色させた。したがって、メンブレンを１０mLのルミノール／ペルオキシド溶液中で１０秒間〜５分間インキュベートした後、放射された光をＬＵＭＩ−Ｉｍａｇｅｒ Ｆ１ Ａｎａｌｙｓａｔｏｒ（Roche Molecular Biochemicals）で検出し、および／またはＸ線フィルムで記録した。スポットの強度をＬｕｍｉＡｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（第３．１版）で定量化した。
イムノブロットの多重染色
検出に使用されるペルオキシダーゼ標識二次抗体抱合体は、１００mMβ−メルカプトエタノールと２０％（w/v）ＳＤＳとを含有する１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ６．７）中で、メンブレンを７０℃で１時間インキュベートすることによって、染色されたブロットから除去することが可能である。この処理の後、ブロットを異なる二次抗体で、第二の時間、染色することが可能である。二次検出の前に、ＴＢＳバッファー中で各１０分間振盪しながら、ブロットを室温で３回洗浄する。
検出に使用されるペルオキシダーゼ標識二次抗体抱合体は、１００mMβ−メルカプトエタノールと２０％（w/v）ＳＤＳとを含有する１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ６．７）中で、メンブレンを７０℃で１時間インキュベートすることによって、染色されたブロットから除去することが可能である。この処理の後、ブロットを異なる二次抗体で、第二の時間、染色することが可能である。二次検出の前に、ＴＢＳバッファー中で各１０分間振盪しながら、ブロットを室温で３回洗浄する。
実施例１４
ペプチド免疫グロブリン抱合体のアフィニティ精製、透析および濃縮
公知の方法に従ってプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を精製した。簡潔には、遠心分離（１０，０００ｇで１０分間）および０．４５μmフィルターによる濾過の後、清澄化された培養上清を含有するペプチド免疫グロブリン抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂカラムへ適用した。結合していないタンパク質を、ＰＢＳ平衡化バッファーおよび０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）で洗い流した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、抱合体を含有する画分を１Ｍトリス塩基で中和した。次に、抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体をＰＢＳバッファーに対して４℃で大規模に透析し、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫメンブレン（Millipore Corp., USA）を装備したＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＣＬ遠心分離フィルターユニットで濃縮し、氷水槽中に０℃で保存した。還元剤の存在下および非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、抱合体の完全性を実施例１３に記載のとおり分析した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体の凝集体を分析用分子ふるいクロマトグラフィーによって分析した。
ペプチド免疫グロブリン抱合体のアフィニティ精製、透析および濃縮
公知の方法に従ってプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂ（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、発現および分泌された抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を精製した。簡潔には、遠心分離（１０，０００ｇで１０分間）および０．４５μmフィルターによる濾過の後、清澄化された培養上清を含有するペプチド免疫グロブリン抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌおよび２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化されたプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂカラムへ適用した。結合していないタンパク質を、ＰＢＳ平衡化バッファーおよび０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．５）で洗い流した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、抱合体を含有する画分を１Ｍトリス塩基で中和した。次に、抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体をＰＢＳバッファーに対して４℃で大規模に透析し、Ｂｉｏｍａｘ−ＳＫメンブレン（Millipore Corp., USA）を装備したＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＣＬ遠心分離フィルターユニットで濃縮し、氷水槽中に０℃で保存した。還元剤の存在下および非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルーでの染色によって、抱合体の完全性を実施例１３に記載のとおり分析した。抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体の凝集体を分析用分子ふるいクロマトグラフィーによって分析した。
実施例１５
ペプチド免疫グロブリン抱合体の脱グリコシル化
抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体のＮ架橋された炭水化物を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, GermanyまたはProzyme, San Leandro, CA）による酵素処理によって切断した。したがって、約２mg／mLのタンパク質濃度で、ＰＢＳバッファー中で１mgのＮ−グリコシル化タンパク質あたり５０mUのＰＮＧａｓｅＦを使用して、抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を３７℃で１２〜２４時間インキュベートした。その後、公知の方法に従った調製用ゲル濾過によって、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを分離した。簡潔には、ＰＮＧａｓｅＦで処理された抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１ mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７ mM ＮａＣｌおよび２．７ mM ＫＣｌ、ｐＨ ７．４）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）に適用した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）製のＡｋｔａエクスプローラークロマトグラフィーシステムを使用して、０．５〜１．０mL／分の流速で平衡化バッファーを使用して溶出した。
ペプチド免疫グロブリン抱合体の脱グリコシル化
抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体のＮ架橋された炭水化物を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, GermanyまたはProzyme, San Leandro, CA）による酵素処理によって切断した。したがって、約２mg／mLのタンパク質濃度で、ＰＢＳバッファー中で１mgのＮ−グリコシル化タンパク質あたり５０mUのＰＮＧａｓｅＦを使用して、抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を３７℃で１２〜２４時間インキュベートした。その後、公知の方法に従った調製用ゲル濾過によって、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦを分離した。簡潔には、ＰＮＧａｓｅＦで処理された抗ＣＤ４抗体および抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体を、ＰＢＳバッファー（１０ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１ mM ＫＨ２ＰＯ４、１３７ mM ＮａＣｌおよび２．７ mM ＫＣｌ、ｐＨ ７．４）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）に適用した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden）製のＡｋｔａエクスプローラークロマトグラフィーシステムを使用して、０．５〜１．０mL／分の流速で平衡化バッファーを使用して溶出した。
実施例１６
単一サイクルの抗ウイルス活性アッセイ
偽型ＮＬ−Ｂａｌウイルスの産生のために、プラスミドｐＮＬ４−３Δｅｎｖ（ｅｎｖ遺伝子内に欠失を有するＨＩＶ ｐＮＬ４−３ゲノムコンストラクト）およびｐＣＤＮＡ３．１／ＮＬ−ＢＡＬ ｅｎｖ［（エイズ試薬に関してＮＩＢＳＣ Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得られる）ＮＬ−Ｂａｌ ｅｎｖ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド］をＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞系（Invitrogen Corp.）中へトランスフェクトし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミンおよび０．５mg／mLジェネテシン（すべての培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製）を含有するダルベッコ変法最小培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。偽型ウイルスを含有する上清をトランスフェクションの２日後に回収し、０．４５μmの孔サイズのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）による濾過によって細胞デブリを除去し、分注して−８０℃で保存した。アッセイの性能における標準化のために、ウイルスストックの一定分量を使用して、ＪＣ５３−ＢＬ（US NIH Aids Reagent Program）細胞を感染させると、１個のウェルあたり約１．５×１０５ＲＬＵ（相対的光単位）を生じた。検査用抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体、親抗ＣＤ４抗体、参照抗体および参照抗膜融合ペプチド（Ｔ−６５１）を、９６ウェルプレート中に連続希釈した。アッセイを四つ組で実施した。各プレートは、細胞コントロールおよびウイルスコントロールのウェルを含有した。ウイルスストックの１．５×１０５ＲＬＵの等量を各ウェルに添加した後、２．５×１０４個のＪＣ５３−ＢＬ細胞を各ウェルに添加し、１ウェルあたり２００μLの最終アッセイ容積にした。３７℃、９０％相対湿度、および５％ＣＯ２で３日間のインキュベーションの後、培地を吸引し、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μLを各ウェルへ添加した。室温でインキュベーションを１０分間した後、アッセイプレートをルミノメーター（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。バックグラウンドを減算した後、各用量地点に関してルシフェラーゼ活性の％阻害を算出し、エクセル（第３．０．５版ビルド１２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）用のＸＬｆｉｔ曲線適合ソフトウェアを使用することによって、ＩＣ５０およびＩＣ９０値を決定した。結果を表４および５にそれぞれ示す。
単一サイクルの抗ウイルス活性アッセイ
偽型ＮＬ−Ｂａｌウイルスの産生のために、プラスミドｐＮＬ４−３Δｅｎｖ（ｅｎｖ遺伝子内に欠失を有するＨＩＶ ｐＮＬ４−３ゲノムコンストラクト）およびｐＣＤＮＡ３．１／ＮＬ−ＢＡＬ ｅｎｖ［（エイズ試薬に関してＮＩＢＳＣ Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得られる）ＮＬ−Ｂａｌ ｅｎｖ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミド］をＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞系（Invitrogen Corp.）中へトランスフェクトし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミンおよび０．５mg／mLジェネテシン（すべての培地はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製）を含有するダルベッコ変法最小培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。偽型ウイルスを含有する上清をトランスフェクションの２日後に回収し、０．４５μmの孔サイズのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）による濾過によって細胞デブリを除去し、分注して−８０℃で保存した。アッセイの性能における標準化のために、ウイルスストックの一定分量を使用して、ＪＣ５３−ＢＬ（US NIH Aids Reagent Program）細胞を感染させると、１個のウェルあたり約１．５×１０５ＲＬＵ（相対的光単位）を生じた。検査用抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体、親抗ＣＤ４抗体、参照抗体および参照抗膜融合ペプチド（Ｔ−６５１）を、９６ウェルプレート中に連続希釈した。アッセイを四つ組で実施した。各プレートは、細胞コントロールおよびウイルスコントロールのウェルを含有した。ウイルスストックの１．５×１０５ＲＬＵの等量を各ウェルに添加した後、２．５×１０４個のＪＣ５３−ＢＬ細胞を各ウェルに添加し、１ウェルあたり２００μLの最終アッセイ容積にした。３７℃、９０％相対湿度、および５％ＣＯ２で３日間のインキュベーションの後、培地を吸引し、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μLを各ウェルへ添加した。室温でインキュベーションを１０分間した後、アッセイプレートをルミノメーター（Luminoskan, Thermo Electron Corporation）で読み取った。バックグラウンドを減算した後、各用量地点に関してルシフェラーゼ活性の％阻害を算出し、エクセル（第３．０．５版ビルド１２、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）用のＸＬｆｉｔ曲線適合ソフトウェアを使用することによって、ＩＣ５０およびＩＣ９０値を決定した。結果を表４および５にそれぞれ示す。
実施例１７
細胞−細胞融合アッセイ
第１日目に、白色９６マイクロタイタープレート中で、１０％ＦＣＳおよび２μg／mLのドキシサイクリンを補充したＤＭＥＭ培地中にｇｐ１６０を発現させるＨｅＬａ細胞（２×１０４個／５０μL／ウェル）を播種する。第２日目に、上清試料または抗体コントロール１００μL／ウェルを、透明な９６マイクロタイタープレート中に添加する。次に、培地中に８×１０４ 個のＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ懸濁細胞を含有する１００μLを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＨｅＬａ細胞培地を９６ウェルプレートから吸引し、２００μLの抗体／ＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ混合物由来の１００μLを添加し、３７℃で一晩インキュベートする。第３日目に、１００μL／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（１，４−ジチオスレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム；Promega Corp., USA）を添加し、室温で最低でも１５分間インキュベートした後、発光を測定する。
細胞−細胞融合アッセイ
第１日目に、白色９６マイクロタイタープレート中で、１０％ＦＣＳおよび２μg／mLのドキシサイクリンを補充したＤＭＥＭ培地中にｇｐ１６０を発現させるＨｅＬａ細胞（２×１０４個／５０μL／ウェル）を播種する。第２日目に、上清試料または抗体コントロール１００μL／ウェルを、透明な９６マイクロタイタープレート中に添加する。次に、培地中に８×１０４ 個のＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ懸濁細胞を含有する１００μLを添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＨｅＬａ細胞培地を９６ウェルプレートから吸引し、２００μLの抗体／ＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ混合物由来の１００μLを添加し、３７℃で一晩インキュベートする。第３日目に、１００μL／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（１，４−ジチオスレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム；Promega Corp., USA）を添加し、室温で最低でも１５分間インキュベートした後、発光を測定する。
材料
栄養素と、４００μg／mLのＧ４１８および２００μg／mLのハイグロマイシンＢを有する１０％ＦＣＳとを含有するＤＭＥＭ培地中で、ＨｅＬａ−Ｒ５−１６細胞（ドキシサイクリン誘導の際にＨＩＶ ｇｐ１６０を発現させるための細胞系）を培養する。ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５−Ｌｕｃ（カタログ番号：５１９８、NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手可能なＴ細胞系）。細胞種：ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５（カタログ番号４３７６）をトランスフェクトして（電気穿孔法）、ＨＩＶ−２ ＬＴＲの転写調節下でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ、１０％ウシ胎仔血清、４mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン）、および０．８mg／mL硫酸ジェネテシン（Ｇ４１８）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。増殖特徴：丸いリンパ球系細胞、形態はほとんど変化しない。単一細胞として懸濁液中で細胞が増殖し、小さな凝集塊を形成し得る。１週間に２回分裂１：１０。特別な特徴：ＨＩＶ−２ＬＴＲのトランス活性化後にルシフェラーゼ活性を発現。初代ＨＩＶ単離物による感染、中和および薬物感受性アッセイに適している（Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300, Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974）。NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHを通じてJohn Moore博士およびCatherine Spenlehauer博士から細胞系を得た。Ｊｏｈｎ Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｓｐｅｎｌｅｈａｕｅｒ．Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイバッファー（Promega Corp. USA、部分番号Ｅ２２６４Ｂ）、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Promega Corp. USA、部分番号ＥＥ２６Ｂ）。
栄養素と、４００μg／mLのＧ４１８および２００μg／mLのハイグロマイシンＢを有する１０％ＦＣＳとを含有するＤＭＥＭ培地中で、ＨｅＬａ−Ｒ５−１６細胞（ドキシサイクリン誘導の際にＨＩＶ ｇｐ１６０を発現させるための細胞系）を培養する。ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５−Ｌｕｃ（カタログ番号：５１９８、NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手可能なＴ細胞系）。細胞種：ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５（カタログ番号４３７６）をトランスフェクトして（電気穿孔法）、ＨＩＶ−２ ＬＴＲの転写調節下でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ、１０％ウシ胎仔血清、４mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／mLペニシリン、１００μg／mLストレプトマイシン）、および０．８mg／mL硫酸ジェネテシン（Ｇ４１８）を含有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させる。増殖特徴：丸いリンパ球系細胞、形態はほとんど変化しない。単一細胞として懸濁液中で細胞が増殖し、小さな凝集塊を形成し得る。１週間に２回分裂１：１０。特別な特徴：ＨＩＶ−２ＬＴＲのトランス活性化後にルシフェラーゼ活性を発現。初代ＨＩＶ単離物による感染、中和および薬物感受性アッセイに適している（Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300, Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974）。NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHを通じてJohn Moore博士およびCatherine Spenlehauer博士から細胞系を得た。Ｊｏｈｎ Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｓｐｅｎｌｅｈａｕｅｒ．Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイバッファー（Promega Corp. USA、部分番号Ｅ２２６４Ｂ）、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Promega Corp. USA、部分番号ＥＥ２６Ｂ）。
実施例１８
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における抗ウイルス活性アッセイ
製造元のプロトコールに従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham, Piscataway, New Jersey, USA）密度勾配遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを（Stanford Blood Centerから得られる）バフィーコートから単離する。簡潔には、５０mLコニカルチューブ中のバフィーコートから血液を転移させ、滅菌済みダルベッコリン酸塩類バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）で５０mLの最終容積に希釈する。希釈した血液２５mLを２本の５０mLコニカルチューブへ転移させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Amersham Biosciences）１２．５mLを注意深く下層に敷き、４５０×ｇでブレーキをかけずに室温で２０分間遠心分離する。白色細胞層を新しい５０mLコニカルチューブへ注意深く転移させ、ＰＢＳで２回洗浄する。残存する赤血球細胞を除去するために、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）とともに室温で５分間インキュベートし、ＰＢＳでもう１回洗浄する。ＰＢＭＣを計数し、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、および２μg／mL植物性血球凝集素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中に２〜４×１０６個／mLの濃度で３７℃で２４時間インキュベートする。９６ウェル丸底プレート中で、連続希釈した検査用抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体、参照免疫グロブリン、親抗ＣＤ４抗体および参照ペプチド（Ｔ−６５１）の存在下で、１×１０５個のＰＢＭＣにＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦウイルス（Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822）を感染させる。使用されるウイルスの量は、ウェルあたり１．２ngのＨＩＶ−１ ｐ２４抗原と等価である。感染を四つ組で設定する。プレートを３７℃で６日間インキュベートする。感染終了時に、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（第３．０．５版ビルド１２；等式２０５、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）において１個の結合部位を有するＳ字形用量反応モデルを使用するｐ２４ ＥＬＩＳＡ（ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ＃ＮＥＫ０５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）を使用することによって、ウイルス産生を測定する。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における抗ウイルス活性アッセイ
製造元のプロトコールに従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham, Piscataway, New Jersey, USA）密度勾配遠心分離によって、ヒトＰＢＭＣを（Stanford Blood Centerから得られる）バフィーコートから単離する。簡潔には、５０mLコニカルチューブ中のバフィーコートから血液を転移させ、滅菌済みダルベッコリン酸塩類バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）で５０mLの最終容積に希釈する。希釈した血液２５mLを２本の５０mLコニカルチューブへ転移させ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Amersham Biosciences）１２．５mLを注意深く下層に敷き、４５０×ｇでブレーキをかけずに室温で２０分間遠心分離する。白色細胞層を新しい５０mLコニカルチューブへ注意深く転移させ、ＰＢＳで２回洗浄する。残存する赤血球細胞を除去するために、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）とともに室温で５分間インキュベートし、ＰＢＳでもう１回洗浄する。ＰＢＭＣを計数し、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２mM Ｌ−グルタミン、１mMピルビン酸ナトリウム、および２μg／mL植物性血球凝集素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中に２〜４×１０６個／mLの濃度で３７℃で２４時間インキュベートする。９６ウェル丸底プレート中で、連続希釈した検査用抗膜融合ペプチド−抗ＣＤ４抗体抱合体、参照免疫グロブリン、親抗ＣＤ４抗体および参照ペプチド（Ｔ−６５１）の存在下で、１×１０５個のＰＢＭＣにＨＩＶ−１ ＪＲ−ＣＳＦウイルス（Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822）を感染させる。使用されるウイルスの量は、ウェルあたり１．２ngのＨＩＶ−１ ｐ２４抗原と等価である。感染を四つ組で設定する。プレートを３７℃で６日間インキュベートする。感染終了時に、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ Ｆｉｔ（第３．０．５版ビルド１２；等式２０５、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）において１個の結合部位を有するＳ字形用量反応モデルを使用するｐ２４ ＥＬＩＳＡ（ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ＃ＮＥＫ０５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）を使用することによって、ウイルス産生を測定する。
DSM ACC 2681
DSM ACC 2682
DSM ACC 2683
DSM ACC 2684
DSM ACC 2682
DSM ACC 2683
DSM ACC 2684
Claims (26)
- １〜８つの抗膜融合ペプチドが各々、ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体の重鎖および／または軽鎖の１末端に抱合することを特徴とする、１つまたはそれ以上の抗膜融合ペプチドと該ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体とを含む抱合体。
- ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体が、２つまたは４つの抗膜融合ペプチドに抱合することを特徴とする、請求項１に記載の抱合体。
- ＨＩＶ ｇｐ１２０結合性細胞表面受容体に対する抗体が、抗ＣＣＲ５抗体（ｍＡｂＣＣＲ５）であることを特徴とする、請求項１に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体の末端の少なくとも２つが各々、抗膜融合ペプチドに抱合することを特徴とする、請求項３に記載の抱合体。
- 抗膜融合ペプチドが、直鎖状ペプチドであり、および５〜１００アミノ酸のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抱合体。
- 一般式ｍＡｂ ＣＣＲ５−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］ｎであり、式中ｍが、各抗膜融合ペプチドに関して独立して０または１のいずれかであり、およびｎが、最大でも１〜８の整数であることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抱合体。
- （１）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］
（２）［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（３）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（４）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］
（５）［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（６）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［抗膜融合ペプチド］
（７）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［重鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（８）［抗膜融合ペプチド］−［リンカー］ｍ−［軽鎖］−［リンカー］ｍ−［抗膜融合ペプチド］
（式中、リンカーが、同一または異別であり得、ｍが、１または０の整数であり、およびｍが、独立して同一または異別であり得る）
からなる群より選択され、ｍＡｂ ＣＣＲ５の重鎖および／または軽鎖と抗膜融合ペプチドとの抱合体を含むことを特徴とする、請求項６に記載の抱合体。 - 鎖抱合体（２）、（３）、（４）、または（７）を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抱合体。
- ２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］および２個の（２）、２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］および２個の（３）、２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５重鎖］および２個の（４）、または２個の［ｍＡｂ ＣＣＲ５軽鎖］および２個の（７）を含むことを特徴とする、請求項７に記載の抱合体。
- 抗膜融合ペプチドが、配列番号２９〜３５および配列番号７３によって定義されるペプチドの群より選択されることを特徴とする、請求項３〜９のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、免疫グロブリンフレームワークと重鎖ＣＤＲ３配列番号１６および１７からなる群より選択されるＣＤＲ３領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、免疫グロブリンフレームワークと、重鎖ＣＤＲ３配列番号１６および１７からなる群より選択されるＣＤＲ３領域と、重鎖ＣＤＲ２配列番号１３、１４、および１５からなる群より選択されるＣＤＲ２領域と、ならびに重鎖ＣＤＲ１配列番号９、１０、１１、および１２からなる群より選択されるＣＤＲ１領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、配列番号１、３、５、および７の群より選択される重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、免疫グロブリンフレームワークと、配列番号１８、１９、および２０より選択されるＣＤＲ１領域と、配列番号２１、２２、および２３より選択されるＣＤＲ２領域と、ならびに配列番号２４、および２５より選択されるＣＤＲ３領域とからなる重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、重鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲを含むか、重鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲを含むか、重鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲを含むか、または重鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲを、および軽鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲを含むことを特徴とする、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、重鎖可変ドメインと、
ａ）アミノ酸配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
ｂ）アミノ酸配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）アミノ酸配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）アミノ酸配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン
からなる群より独立して選択される軽鎖可変ドメインとを含むことを特徴とする、請求項３〜１５のいずれか一項に記載の抱合体。 - 抗ＣＣＲ５抗体が、アミノ酸配列番号１によって定義される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびアミノ酸番号２によって定義される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、アミノ酸配列番号３によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号４によって定義される軽鎖可変ドメイン、アミノ酸配列番号５によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号６によって定義される軽鎖可変ドメイン、またはアミノ酸配列番号７によって定義される重鎖可変ドメインおよびアミノ酸配列番号８によって定義される軽鎖可変ドメイン；
アミノ酸グリシン（Ｇ）およびアスパラギン（Ｎ）、トリペプチドＧＳＴ、および配列番号３６〜６２、および配列番号６７〜７０からなる群より選択されるリンカー；ならびに
配列番号２９〜３５および配列番号７３によって定義されるペプチドの群より選択される抗膜融合ペプチド
を含むことを特徴とする、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の抱合体。 - 配列番号２９〜３５および配列番号７３の群より選択される抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の抱合体。
- 配列番号２の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号１の重鎖可変ドメインを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とするか、配列番号４の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号３の重鎖可変ドメインを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とするか、配列番号６の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号５の重鎖可変ドメインを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とするか、または配列番号８の２つの軽鎖可変ドメイン、配列番号７の重鎖可変ドメインを各々含むタイプ（２）の２つの抱合体、配列番号４０のリンカーおよび配列番号３３の抗膜融合ペプチドを含むことを特徴とする、請求項３〜１８のいずれか一項に記載の抱合体。
- 抗ＣＣＲ５抗体が、アミノ酸Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／またはＤ２６５における突然変異を有し、ＩｇＧ４サブクラスまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスであり、および／またはＰＶＡ２３６突然変異を含有することを特徴とする、請求項３〜１９のいずれか一項に記載の抱合体。
- ＩｇＧ４サブクラスの抗ＣＣＲ５抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐを有し、およびＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＣＲ５抗体が、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有することを特徴とする、請求項２０に記載の抱合体。
- ａ）請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抱合体の発現に適した条件下で、請求項１〜２１に記載の抱合体をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子を含有する１つまたはそれ以上のプラスミドを含有する細胞を培養すること、
ｂ）細胞または細胞培養上清から抱合体を回収すること
を含むことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抱合体の産生のための方法。 - 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抱合体を、医薬的に許容され得る賦形剤または担体と共に含有する、医薬組成物。
- ウイルス感染の処置のための薬物の製造のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抱合体の使用。
- ウイルス感染が、ＨＩＶ感染であることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
- 抗ウイルス処置の必要のある患者の処置のための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抱合体の使用。
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| EP06017156 | 2006-08-17 | ||
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