PT1478738E - Anticorpo anti-ccr5 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPO ANTI-CCR5"

Ao longo desta candidatura referem-se várias publicações por numerais arábicos. As citações completas destas publicações podem encontrar-se no final da especificação imediatamente antes das reivindicações.

Contexto da Invenção 0 vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) induz a fusão membrana viral-celular para conseguir entrar em células-alvo (8, 15, 66). A primeira interacção de afinidade elevada entre o virião e a superfície celular é a ligação da glicoproteína da superfície virai gpl20 ao antigene CD4 (13, 30, 41, 42) . Por sua vez, isto induz alterações conformacionais na gpl20 que lhe permitem interagir com um de vários receptores de quimioquinas (4, 5, 21, 36). O receptor de quimioquinas CC CCR5 é o principal co-receptor para estirpes macrófago-trópicas (R5) e desempenha um papel crucial na transmissão sexual do HIV-1 (4, 5, 21, 36). Os vírus linha de células T-trópicos (X4) utilizam CXCR4 para entrarem em células-alvo, e habitualmente, mas nem sempre, emergem tardiamente na progressão da doença ou em consequência da propagação do vírus em cultura de tecidos (4, 5, 21, 36). Alguns isolados primários do HIV-1 são dual-trópicos (R5X4) pois podem utilizar ambos os co-receptores, apesar de nem sempre o fazerem com a mesma eficiência (11, 57). Estudos de mutagénese acoplados à resolução da estrutura cristalina do núcleo da gpl20 demonstraram que o sítio de ligação de co-receptores da gpl20 compreende vários resíduos conservados (32, 53, 65) . 2

Foi demonstrado que tirosinas e resíduos com carga negativa do domínio amino-terminal (Nt) do CCR5 são essenciais para a ligação da gpl20 ao co-receptor e para a fusão e entrada do HIV-1 (6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54). Os resíduos das alças extracelulares (ECL) 1-3 do CCR5 foram dispensáveis para a função do co-receptor, mas a configuração inter-domínios do CCR5 teve de ser mantida para a fusão e entrada virais óptimas (24). Isto conduziu à conclusão de que ou a gpl20 forma interacções com uma superfície difusa das ECLs ou o Nt é mantido numa conformação funcional por ligações com resíduos das ECLs. Estudos com co-receptores quiméricos e anticorpos monoclonais anti-CCR5 também mostraram a importância das alças extracelulares para a entrada virai (5, 54, 64).

Moléculas que se ligam especificamente ao CCR5 e CXCR4 e bloqueiam interacções com os seus ligandos são uma ferramenta poderosa para sondar suplementarmente as relações estrutura/função dos co-receptores. A caracterização desses compostos também pode ajudar a conceber agentes terapêuticos eficazes que abordem selectivamente passos da entrada virai mediados por co-receptores. Os inibidores da função do co-receptor CCR5 ou CXCR4 identificados até à data são de natureza diversa e incluem moléculas pequenas, péptidos, quimioquinas e seus derivados e anticorpos monoclonais (mAbs). Os mecanismos de acção das moléculas pequenas que bloqueiam a entrada interferindo na função do co-receptor CXCR4 não estão bem compreendidos (17, 49, 55, 68). Um desses inibidores, a molécula pequena aniónica AMD3100, depende de resíduos da ECL2 e do quarto domínio transmembranar (TM) do CXCR4 para inibir a entrada virai, mas não é claro se o faz destruindo a ligação da gpl20 ao CXCR4 ou passos pós-ligação 3 conducentes à fusão membranar (16, 34, 55). Até à data não foram relatadas moléculas pequenas que bloqueiem especificamente a entrada do HIV-1 mediada pelo CCR5. A inibição da entrada do HIV-1 por quimioquinas é mediada por pelo menos dois mecanismos distintos: bloqueio da interacção gpl20/co-receptor e interiorização do complexo quimioquina/receptor (3, 26, 59, 63). A variante AOP-RANTES também inibe a reciclagem do CCR5 para a superficie celular (40, 56). Variantes como RANTES 9-68 e Met-RANTES apenas previnem a interacção gpl20/CCR5 e não regulam negativamente o CCR5 (67) . Variantes SDF-1 actuam presumivelmente por um mecanismo semelhante para bloquearem a entrada virai mediada pelo CXCR4 (12, 27, 39) . Apenas um mAb anti-CXCR4, 12GS, foi caracterizado quanto às suas propriedades antivirais. Foi relatado que a eficiência da inibição pelo 1205 da entrada virai depende das células e isolados (43, 58). Este mAb liga-se à ECL2 do CXCR4, mas o mecanismo pelo qual inibe a entrada é desconhecido (7). Poucos dos mAbs anti-CCR5 caracterizados até à data previnem eficientemente a entrada do HIV-1 (28, 64). É interessante notar que mAbs cujos epítopos se situam no domínio Nt do CCR5, que contém o sítio de ligação da gpl20, inibem a fusão e entrada virais menos eficientemente do que o mAb 2D7, cujo epítopo se situa na ECL2. 0 2D7 também antagoniza a actividade de quimioquinas CC (64).

Foi isolado e caracterizado um painel de seis mAbs murinos, designados PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PAI4. Os seis mAbs ligaram-se especificamente a células com CCR5 mas com diferentes eficiências, que dependeram do tipo de células. Estudos de mapeamento de epítopos identificaram os resíduos que são importantes para a ligação de mAbs e também revelaram informações acerca do dobramento e 4 interacções dos domínios extracelulares do CCR5. Todos os mAbs inibiram a fusão e entrada do HIV-1, mas não se observaram correlações entre a capacidade de um mAb para inibir a fusão e entrada e a sua capacidade para inibir a ligação de gpl20/SCD4 a células com CCR5. (Ver Olson et al. (1999) Journal of Virology _7_3_(5) : 4145-4155 e WO 00/35409, publicada em 22 de Junho de 2000.) Ο PAI4 inibe a entrada do HIV-1 mediada pelo CCR5 a concentrações que não previnem a sinalização de quimioquinas CC, bloqueia uma gama ampla de isolados primários do HIV-1 e é mais activo do que a RANTES no bloqueio do HIV-1 em culturas de macrófagos. (Ver Trokla et al. (2001) Journal of Virology 7_5(2) : 579-588.) Técnicas de humanização são conhecidas na área. Ver, por exemplo, Steinberger et al. Journal of Biological Chemistry (2000) 275(46): 36073-36078, que revela a humanização de um anticorpo policlonal de coelho anti-CCR5.

Resumo da Invenção

Esta invenção proporciona um anticorpo anti-CCR5 que compreende: (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVK:HuPRO140-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmídeo designado pVg4:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), ou fragmento desse anticorpo, que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana.

Esta invenção também proporciona um anticorpo anti-CCR5 compreendendo duas cadeias leves, em que cada cadeia compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de 5 aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 6, e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 9.

Esta invenção também proporciona um anticorpo anti-CCR5 compreendendo duas cadeias leves, em que cada cadeia compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 6, e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 12.

Esta invenção também proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um polipéptido compreendendo aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 6. Na forma de realização do assunto, o ácido nucleico compreende a sequência apresentada na ID SEQ NO: 5.

Esta invenção também proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um polipéptido compreendendo aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 9. Na forma de realização do assunto, o ácido nucleico compreende a sequência apresentada na ID SEQ NO: 8.

Esta invenção também proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um polipéptido compreendendo aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 12. Na forma de realização do assunto, o ácido nucleico compreende a sequência apresentada na ID SEQ NO: 11. 6

Esta invenção também proporciona uma composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-CCR5, ou respectivo fragmento, como descrito acima, juntamente com um transportador.

Esta invenção também proporciona uma composição que compreende o anticorpo anti-CCR5, ou respectivo fragmento, ao qual está ligado um material como um isótopo radioactivo, uma toxina, polietilenoglicol, um agente citotóxico e/ou uma etiqueta detectável.

Esta invenção também proporciona um método para inibir a infecção de uma célula CD4+, que compreende contactar a célula CD4+ com um anticorpo que compreende (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVK:HuPRO140-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVg4:HuPROl40 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)- VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), ou um fragmento desse anticorpo, que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula CD4 + , numa quantidade e em condições tais que a fusão do HIV-1, ou de uma célula infectada com o HIV-1, à célula CD4+ é inibida, desse modo inibindo a infecção pelo HIV-1 das células CD4+. É revelado aqui um método para tratar um sujeito que padece do HIV-1, que compreende administrar ao sujeito uma dosagem de tratamento do HIV-1 eficaz de um anticorpo anti-CCR5 compreendendo (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um 7 plasmídeo designado pVK:HuPROl40-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende um produto de expressão de um plasmídeo designado pVgl:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmídeo designado pVgl:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), ou um fragmento desse anticorpo, que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana, em condições eficazes para tratar o sujeito infectado com o HIV-1.

Também é aqui revelado um método para prevenir que um sujeito contraia uma infecção pelo HIV-1, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade de dosagem de prevenção de infecção pelo HIV-1 eficaz de um anticorpo anti-CCR5 compreendendo (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVK:HuPROl40-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVgl:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmídeo designado pVgl:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), ou um fragmento desse anticorpo, que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana, em condições eficazes para prevenir a infecção pelo HIV-1 no sujeito.

Esta invenção também proporciona um conjugado de anticorpo anti-CCR5 compreendendo um anticorpo anti-CCR5 que compreende (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVK:HuPROl40-VK (Designação do Depósito da ATCC 8 PTA-4097) e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVgl:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmídeo designado pVgl:HuPRO140 (mut B+D+I)—VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), ou um fragmento desse anticorpo, que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana, conjugado a pelo menos um polímero.

Também é aqui revelado um método para inibir a infecção de uma célula CCR5+ pelo HIV-1, que compreende administrar a um sujeito em risco de contrair infecção pelo HIV-1 o conjugado acima descrito numa quantidade e em condições eficazes para inibir a infecção de células CCR5+ do sujeito pelo HIV-1.

Também é aqui revelado um método para tratar uma infecção pelo HIV-1 num sujeito, que compreende administrar o conjugado acima descrito a um sujeito infectado com o HIV-1 numa quantidade e em condições eficazes para tratar a infecção pelo HIV-1 do sujeito.

Esta invenção também proporciona uma célula-hospedeiro transformada compreendendo pelo menos dois vectores, em que pelo menos um vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica cadeias pesadas de um anticorpo anti-CCR5 e em que pelo menos um vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica cadeias leves do anticorpo anti-CCR5, em que o anticorpo anti-CCR5 compreende duas cadeias pesadas com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 9 e duas cadeias leves com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 6. 9

Esta invenção também proporciona uma célula-hospedeiro transformada compreendendo pelo menos dois vectores, em que pelo menos um vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica cadeias pesadas de um anticorpo anti-CCR5 e em que pelo menos um vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica cadeias leves do anticorpo anti-CCR5, em que o anticorpo anti-CCR5 compreende duas cadeias pesadas com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 12 e duas cadeias leves com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 6.

Esta invenção também proporciona um vector que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 9.

Esta invenção também proporciona um vector que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 12.

Esta invenção também proporciona um processo para produzir um anticorpo anti-CCR5, que compreende cultivar uma célula-hospedeiro que contém (i) um plasmídeo designado pVK:HuPRO140-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e (ii) ou um plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099) em condições que permitem a produção de um anticorpo compreendendo duas cadeias leves codificadas pelo plasmídeo designado pVK:HuPRO140-VK 10 (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e duas cadeias pesadas codificadas pelo plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), de modo a produzir um anticorpo anti-CCR5.

Esta invenção também proporciona um processo para produzir um anticorpo anti-CCR5, que compreende a) transformar uma célula-hospedeiro com (i) um plasmideo designado pVK:HuPRO140-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e (ii) ou um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou um plasmideo designado pVg4:HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), e b) cultivar a célula-hospedeiro transformada em condições que permitam a produção de um anticorpo compreendendo duas cadeias leves codificadas pelo plasmídeo designado pVK:HuPRO140-VK (Designação do Depósito da ATCC PTA-4097) e duas cadeias pesadas codificadas pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4098) ou pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH (Designação do Depósito da ATCC PTA-4099), de modo a produzir um anticorpo anti-CCR5.

Esta invenção também proporciona um estojo para utilização num processo de produção de um anticorpo anti-CCR5. O estojo compreende a) um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 6, e b) um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5, em 11 que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 9, ou um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 12.

Descrição Breve das Figuras

Figura 1

Ligação de anticorpos monoclonais anti-CCR5 a células CCR5 +

Utilizou-se citometria de fluxo para detectar a expressão da proteína CCR5 na superfície de células L1.2-CCR5+ e PBMCs estimulados com PHA/IL-2 isolados de fresco. As células foram incubadas com concentrações de saturação de cada mAb, que foram detectados com um anticorpo repórter IgG anti-ratinho etiquetado com PE. Apresentam-se os resultados de uma experiência representativa. Os resultados para cada mAb estão expressos em intensidades médias de fluorescência (m.f.i.) e em % de células controladas. Uma vez que PA8-PA12 e PA14 são da subclasse IgGl, as suas m.f.i. são directamente comparáveis. 0 2D7 é uma IgG2a.

Figura 2

Valores Cl para diferentes combinações de mAbs e inibidores virais

Realizaram-se experiências como as descritas na legenda da Fig. 7 para diferentes combinações de inibidores da entrada virai. Os mAbs anti-CCR5 foram testados em combinação entre si, com quimioquinas CC 12 e CD4-IgG2, que inibe o acoplamento do HIV-1 a células-alvo. A gama de concentrações do PA11 e PA12 foi 0 - 250 μg/mL; a gama de concentrações do 2D7 e PA14 foi 0-25 μg/mL; a gama de concentração de RANTES foi 0 - 250 ng/mL; a gama de concentrações de CD4-IgG2 foi 0-25 μg/mL. As concentrações dos agentes isolados ou das suas misturas necessárias para produzir 50% e 90% de inibição da fusão ou entrada foram quantitativamente comparadas num termo conhecido como índice de Combinação (Cl).

Figura 3

Valores IC50 para inibição da fusão célula-célula, entrada virai e ligação de gp!20/sCD4 por mAbs anti- CCR5

Para fins comparativos resumimos os valores IC50 obtidos nos diferentes ensaios onde foram testados os mAbs anti-CCR5. Só se calcularam valores IC50 para mAbs que conseguiram inibir > 90% da fusão, entrada ou ligação.

Figura 4

Mapeamento de epítopos de mAbs anti-CCR5 Utilizou-se um protocolo de coloração com duas cores para avaliar a ligação de mAbs a proteínas CCR5 mutantes, marcadas no terminal C com o péptido HA. Células HeLa que expressam mutantes pontuais do CCR5 foram incubadas com concentrações de saturação de cada mAb, seguido de detecção com uma IgG anti-ratinho etiquetada com PE. Mediu-se a expressão do co-receptor na superfície celular por coloração dupla das células com um mAb anti-HA etiquetado com FITC. 13

As quatro grelhas correspondem aos quatro domínios extracelulares do CCR5. A primeira linha de cada grelha indica a sequência de aminoácidos do domínio extracelular do CCR5 correspondente (ID SEQ NOs: 1- 4). A ligação de mAbs anti-CCR5 ao mutante alanina de cada resíduo está expressa em percentagem da ligação ao CCR5 de tipo selvagem, como descrito em Materiais e Métodos.

Figura 5

Inibição da mobilização de cálcio em células CCR5+ por mAbs anti-CCR5 Células L1.2-CCR5+ foram carregadas com Indo-IAM e estimuladas sequencialmente com um mAb anti-CCR5 ou PBS, seguido de estimulação com RANTES (a). Mediram-se alterações da fluorescência com um espectrofluorómetro e as curvas provêm de uma experiência representativa. Testou-se a inibição do fluxo de cálcio por PA14 e 2D7 para uma gama larga de concentrações dos mAbs (b). Os resultados estão apresentados em % de inibição do influxo de cálcio = [1 - (fluorescência relativa na presença de mAb / fluorescência relativa na ausência de mAb)] x 100%, e são médias de valores de três experiências independentes.

Figura 6

Inibição da função do co-receptor CCR5 por mAbs anti-CCR5

Testou-se a inibição da fusão célula-célula por mAbs anti-CCR5 no ensaio de RET (a) . Adicionaram-se 0 -250 μρ/πΛ de PA8-PA12, ou 0 - 25 μ9/ΐΓΛ de PAI 4 ou 2D7, a uma mistura de células HeLa-EnvjR-FL+ e PM1, 14 etiquetadas com F18 e R18, respectivamente. Mediu-se a fluorescência de RET após 4 horas de incubação. Os resultados são valores médios de três experiências independentes e estão expressos em % de inibição da fusão = [1 - (% RET na presença de mAb / % RET na ausência de mAb)] x 100%. Testou-se a inibição da entrada do HIV-1 por mAbs anti-CCR5 numa única ronda de ensaio de entrada à base de luciferase de replicação (b). Células U87-CD4+CCR5+ foram infectadas com o vírus repórter NLluc+env~ com o envelope JR-FL na presença de 0 - 250 μg/mL de PA8-PA12, ou 0 - 25 μρ/ιηΕ de PA14 ou 2D7. Mediu-se a actividade de luciferase (unidades de luz relativas, r.l.u.) em lisatos celulares às 72 horas pós-infecção. Os resultados provêm de uma experiência representativa e estão expressos em % de inibição da entrada = [1 - (r.l.u. na presença de mAb / r.l.u. na ausência de mAb)] x 100%. Ligação de gpl20, sCD4 biotinilados [b] e complexos b-gpl20-CD4 a células L1.2-CCR5+ (c) . Observa-se ligação forte quando a gpl20 derivada do vírus R5 HIV-1jr_Fl é complexada com uma quantidade equimolar de sCD4. Não se observa ligação na ausência de sCD4 ou para gpl20 derivada do vírus X4 HIV-Ilai· A ligação de fundo a células CCR5-L1.2 foi subtraída de todas as curvas. Testou-se a inibição da ligação de gpl20/sCD4 a células L1.2-CCR5+ na presença de concentrações variáveis de cada anticorpo (d). As células foram pré-incubadas em placas de 96 cavidades com um mAb anti-CCR5, seguido de uma incubação com uma concentração de saturação de gpl20/sCD4 biotinilado. Por fim mediu-se a ligação de estreptavidina etiquetada com PE a células utilizando um leitor de placas de fluorescência. Os resultados 15 provêm de uma experiência representativa e estão expressos em % de inibição da ligação de gpl20/sCD4 = [1 - (m.f.i. na presença de mAb / m.f.i. na ausência de mAb)] x 100%.

Figura 7

Inibição sinergética da fusão célula-célula por PA12 e 2D7

Obtiveram-se curvas de resposta à dose para os mAbs utilizados individualmente e em combinação. Adicionaram-se 0-50 μρ/ηϋΐ, de PAI2, 0-25 μρ/ηίί, de 2D7, ou uma combinação dos dois numa razão 2:1, a uma mistura de células HeLa-EnvJR_FL+ e PM1, etiquetadas com R18 e F18, respectivamente. Mediu-se a fluorescência de RET após 4 horas de incubação. Os resultados estão expressos em % de inibição da fusão e são as médias de valores de três experiências independentes. Analisaram-se os dados utilizando o principio do efeito da mediana, que pode ser escrito do modo seguinte: t * i/U + íK/eP] m em que f é a fracção afectada/inibida, c é a concentração, K é a concentração do agente necessária para produzir o efeito da mediana e m é um coeficiente empírico que descreve a forma da curva de resposta à dose. A equação (1) é uma forma generalizada das equações que descrevem a cinética enzimática de Michaelis-Menten, isotérmicas de adsorção de Langmuir e equilíbrios de ionização de Henderson-Hasselbalch, para os quais m = 1. No 16 presente caso, K é igual ao valor IC5o. Determinaram-se K e m por ajustamento das curvas de resposta à dose, e a Equação (1) foi rearranjada para permitir o cálculo de c para um dado f. Os parâmetros de melhor ajustamento para K e c são 8,8 μρ/ιτΛ e 0,54 para PAI2, 0,36 μρ/πΛ e 0,68 para 2D7 e 0,11 μρ/ιτΛ e 1,1 para a sua combinação. Estas curvas estão representadas graficamente e indicam uma qualidade razoável do ajustamento entre a experiência e a teoria.

Figura 8

Esta figura mostra a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de uma versão humanizada do anticorpo anti-CCR5 de ratinho PA14 (ID SEQ NO: 6) e a sequência de ácido nucleico que a codifica (ID SEQ NO: 5), de acordo com a invenção. A ID SEQ NO: 7 identifica a região da ID SEQ NO: 5 que codifica para a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 6. Esta região variável da cadeia leve está presente nos anticorpos aqui designados PRO 140 #1 e #2. As regiões determinantes de complementaridade ("CDRs") estão sublinhadas.

Figura 9

Esta figura mostra a sequência de aminoácidos de uma primeira região variável da cadeia pesada de uma versão humanizada do anticorpo anti-CCR5 de ratinho PA14 (ID SEQ NO: 9) e a sequência de ácido nucleico que a codifica (ID SEQ NO: 8), de acordo com a invenção. A ID SEQ NO: 10 identifica a região da ID SEQ NO: 8 que codifica para a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 9. Esta região 17 variável da cadeia pesada está presente no anticorpo aqui designado PRO 140 #2. As CDRs estão sublinhadas.

Figura 10

Esta figura mostra a sequência de aminoácidos de uma segunda região variável da cadeia pesada de uma versão humanizada do anticorpo anti-CCR5 de ratinho humanizado PA14 (ID SEQ NO: 12) e a sequência de ácido nucleico que a codifica (ID SEQ NO: 11), de acordo com a invenção. A ID SEQ NO: 13 identifica a região da ID SEQ NO: 11 que codifica para a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 12. Esta região variável da cadeia pesada está presente no anticorpo aqui designado PRO 140 #1. As CDRs estão sublinhadas.

Figura 11

Dose Única de anticorpo para CCR5 humanizado reduz de forma potente cargas virais in vivo

Ratinhos SCID foram reconstituídos com PBMCs humanas normais e foram infectados com HIV-1jr_Csf· Quando se atingiu um estado estacionário virai, os animais foram tratados com uma única dose i.p. de 1 miligrama de anticorpo para CCR5 humanizado (PRO 140), ou anticorpo de controlo do isotipo, e foram monitorizados quanto ao RNA do HIV no plasma (Ensaio Amplicor da Roche).

Figura 12

Redução Prolongada da Carga Virai

Ratinhos SCID foram reconstituídos com PBMCs humanas normais e foram infectados com HIV-1jR-Csf· Quando se atingiu um estado estacionário virai, os animais 18 foram tratados i.p. com doses de 0,1 mg de anticorpo para CCR5 humanizado (PRO 140) de três em três dias e foram monitorizados quanto ao RNA do HIV no plasma (Ensaio Amplicor da Roche).

Figura 13

Demonstra que não ocorreu depleção de linfócitos com a utilização do anticorpo para o CCR5 (PRO 140) preparado de acordo com a invenção.

Figura 14

Anticorpo para CCR5 Humanizado (PRQ140) Bloqueia de Forma Potente a Fusão Célula-Célula do HIV-1 Mediada pelo CCR5

Anticorpo para o CCR5 murino foi humanizado utilizando o método de enxerto de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e substituições de arcabouço. Os anticorpos para o CCR5 humanizados (PRO 140 #1 e PRO 140 #2) foram expressos em células Sp2/0, foram purificados por cromatografia em proteína A e testados quanto à capacidade para bloquear a replicação da fusão membranar mediada por env do HIV-1JR-fl como descrito (Litwin et al., J. Virol., 7_0: 6437, 1996).

Figura 15

Anticorpo para CCR5 Humanizado (PRO 140) Medeia Inibição Potente e Independente do Subtipo do HIV-1 Testaram-se anticorpos para o CCR5 (Pro 140 #1 e #2) de acordo com a invenção quanto à capacidade para bloquear a replicação do HIV-1 de tipo selvagem em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) como descrito (Trkola et al., J. Virol., 72: 396, 19 1998). Mediu-se a extensão da replicação virai avaliando o teor do antigene p24 em sobrenadantes de cultura de PBMCs com 7 dias.

Figura 16

Esta figura apresenta um mapa do plasmideo pVK-HuPRO140 que codifica a região variável da cadeia leve do plasmideo apresentada na Figura 8, bem como as regiões constantes Kapa humanas como descrito em Co et al., J. Immunol., 148: 1149, 1992.

Figura 17

Esta figura apresenta um mapa do plasmideo pVg4-HuPRO140 HG2 que codifica a região variável da cadeia pesada apresentada na Figura 9, bem como as regiões constantes da cadeia pesada humana CHI, conectora, CH2 e CH3 da IgG4 humana como descrito em He et al., J. Immunol. 160: 1029 (1998).

Figura 18

Esta figura apresenta um mapa do plasmideo pVg4-HuPRO140 (mut B+D+l) que codifica a região variável da cadeia pesada apresentada na Figura 10, bem como as regiões constantes da cadeia pesada humana CHI, conectora, CH2 e CH3 da IgG4 humana como descrito em He et al., J. Immunol. 160: 1029 (1998).

Figura 19

Hu PRQ140 Bloqueia a Sinalização do HIV-1 Mas Não de RANTES

Testaram-se anticorpos PR014 de acordo com a invenção quanto à capacidade para bloquear a mobilização de cálcio induzida por RANTES em células L1.2-CCR5 20 (Olson, et al., J. Virol., 72: 396, 1998). Esta figura mostra que um anticorpo para o CCR5 humanizado (huPRO140) bloqueia a sinalização do HIV-1 mas não de RANTES.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Os plasmideos designados HuPRO140-VK, HuPR014 (mut+B+D+I)-VH e HuPRO140 HG2-VH, referidos nas figuras 16, 18 e 17 como pVK-HuPRO140, pVg44-HuPRO140 (mut B+D+I) e pVg4-HuPRO140 HG2, respectivamente, foram depositados na American Type Culture Collection, Manassas, Va., E.U.A., 20108, em 22 de Fevereiro de 2002 com os N°s de Acesso da ATCC PTA 4097, PTA 4099 e PTA 4098, respectivamente. Estes depósitos foram feitos de acordo com as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes (Tratado de Budapeste).

Esta invenção proporciona uma composição para inibir uma infecção pelo HIV-1 que compreende pelo menos dois compostos em quantidades eficazes de forma sinergética para inibir uma infecção pelo HIV-1, em que pelo menos um dos compostos previne a interacção produtiva entre o HIV-1 e um co-receptor da fusão do HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "composição" designa uma mistura. As composições incluem mas não se limitam às adequadas para administração oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica ou parentérica a um sujeito. Tal como é aqui utilizado, "parentérica" inclui mas não se limita a injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares ou intra-esterno ou técnicas de infusão. 21

Tal como é aqui utilizado, "HIV-1" designa o vírus da imunodeficiência humana do tipo 1. 0 HIV-1 inclui mas não se limita a partículas de vírus extracelulares e às formas do HIV-1 presentes em células infectadas com o HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "infecção pelo HIV-1" significa a introdução de informação genética do HIV-1 numa célula-alvo, tal como por fusão da membrana da célula-alvo ao HIV-1 ou a uma célula com a glicoproteína de envelope do HIV-1. A célula-alvo pode ser uma célula corporal de um sujeito. Na forma de realização preferida, a célula-alvo é uma célula corporal de um sujeito humano.

Tal como é aqui utilizado, "inibir uma infecção pelo HIV-1" significa a redução da quantidade de informação genética do HIV-1 introduzida numa população de células-alvo em comparação com a quantidade que seria introduzida sem a referida composição.

Tal como é aqui utilizado, "composto" designa uma entidade molecular, incluindo mas nao se limitando a péptidos, polipéptidos e outras moléculas orgânicas ou inorgânicas e respectivas combinações.

Tal como é aqui utilizado, "eficaz de forma sinergética" significa que o efeito combinado dos compostos quando utilizados em combinação é maior do que os seus efeitos aditivos quando utilizados individualmente.

Tal como é aqui utilizado, "interacção produtiva" significa que a interacção do HIV-2 e do co-receptor do HIV-1 conduzirá à fusão do referido HIV-1 ou célula 22 glicoproteína de envelope do HIV-1+ e a membrana que contém o co-receptor.

Tal como é aqui utilizado, "previne a interacção produtiva" significa que a quantidade da interacção é reduzida em comparação com a quantidade que ocorreria sem o composto. As interacções podem ser prevenidas por mascaramento ou alteração das regiões interactivas do co-receptor ou HIV-1 ou por alteração da expressão, agregação, conformação ou estado de associação do co-receptor.

Tal como é aqui utilizado, "co-receptor de fusão do HIV-1" designa um receptor celular que medeia a fusão entre a célula-alvo que expressa o receptor e o HIV-1 ou uma célula com a glicoproteína de envelope do HIV-1. Co-receptores de fusão do HIV-1 incluem mas não se limitam a CCR5, CXCR4 e outros receptores de quimioquinas.

Esta invenção também proporciona uma composição que inibe a fusão do HIV-1, ou de uma célula com a glicoproteína de envelope do HIV-1, a uma célula-alvo, que compreende pelo menos dois compostos, em quantidades eficazes de forma sinergética, para inibir a fusão do HIV-1, ou de uma célula com a glicoproteína de envelope do HIV-1, a uma célula-alvo, em que pelo menos um dos compostos previne a interacção produtiva entre o HIV-1 e um co-receptor de fusão do HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "fusão" designa a reunião ou união das membranas da bicamada lipídica presentes em células de mamíferos ou vírus como o HIV-1. Este processo é distinto do acoplamento do HIV-1 a uma célula-alvo. 0 acoplamento é mediado pela ligação da glicoproteína 23 exterior do HIV-1 ao receptor CD4 humano, que não é um co-receptor de fusão.

Tal como é aqui utilizado, "inibe" siqnifica que a quantidade é reduzida em comparação com a quantidade que ocorreria sem a composição.

Tal como é aqui utilizado, "célula-alvo" designa uma célula apta a ser infectada ou a fundir-se ao HIV-1 ou células infectadas com o HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "quimioquina" designa uma citoquina que é capaz de estimular o movimento de leucócitos. Podem ser caracterizadas como cys-cys ou cys-X-cys, dependendo dos dois resíduos cisteína amino-terminais estarem imediatamente adjacentes ou separados por um aminoácido. Inclui mas não se limita a RANTES, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, SDF-1 ou outra quimioquina que bloqueie uma infecção pelo HIV-1.

Numa forma de realização das composições acima, o co-receptor é um receptor de quimioquinas. Na forma de realização preferida das composições acima, o receptor de quimioquinas é CCR5 ou CXCR4. Sabe-se que vários outros receptores de quimioquinas e relacionados funcionam como co-receptores do HIV, incluindo mas não se limitando a CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 e APJ (69).

Tal como é aqui utilizado, "receptor de quimioquinas" designa um membro de uma família homóloga de proteínas da superfície celular que abrangem sete transmembranas que se ligam a quimioquinas. 24

Tal como é aqui utilizado, "CCR5" é um receptor de quimioquinas que se liga a membros do grupo C-C de quimioquinas e cuja sequência de aminoácidos compreende a fornecida pelo Número de Acesso da Genbank 1705896 e variantes polimórficas relacionadas.

Tal como é aqui utilizado, "CXCR4" é um receptor de quimioquinas que se liga a membros do grupo C-X-C de quimioquinas e cuja sequência de aminoácidos compreende a fornecida pelo Número de Acesso da Genbank 400654 e variantes polimórficas relacionadas.

Numa forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos é uma molécula não peptidilo. Numa forma de realização, a molécula não peptidilo é o composto biciclame AMD3100. (16).

Tal como é aqui utilizado, "molécula não peptidilo" designa uma molécula que não consiste, na sua totalidade, numa sequência linear de aminoácidos ligados por ligações peptidicas. No entanto, uma molécula não peptidilo pode conter uma ou mais ligações peptidicas.

Numa forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos é um anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Noutra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo anti-receptor de quimioquinas. Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo anti-CXCR4. Noutra forma de realização, o anticorpo anti-CXCR4 é 12G5. (43). Numa forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo anti-CCR5. O anticorpo anti-CCR5 inclui mas nãos e limita a PA8, PA9, PAIO, PAI1, PAI2, PA14 e 2D7. Nesta composição, os 25 compostos estão numa razão apropriada. A razão varia desde 1:1 até 1000:1.

Os anticorpos monoclonais PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PA14 foram depositados, de acordo e satisfazendo os requisitos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes, na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209, em 2 de Dezembro de 1998 com os seguintes N°s de Acesso: N° de Acesso da ATCC HB-12605 (PA8), N° de Acesso da ATCC HB-12606 (PA9), N° de Acesso da ATCC HB-12607 (PAIO), N° de Acesso da ATCC HB-12608 (Pll), N° de Acesso da ATCC HB-12609 (PA12), N° de Acesso da ATCC HB-12610 (PAI 4) .

Noutra forma de realização das composições acima, dois ou mais dos compostos são anticorpos. Numa forma de realização da invenção, os anticorpos incluem mas não se limitam a PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12, PA14 e 2D7. Nesta composição, os compostos estão numa razão apropriada. A razão varia desde 1:1 até 50:1. nao natural.

Especificamente,

Tal como é aqui utilizado, "anticorpo" designa uma molécula de imunoglobulina compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves e que reconhece um antigene. A molécula de imunoglobulina pode derivar de qualquer uma das classes habitualmente conhecidas, incluindo mas não se limitando a IgA, IgA secretora, IgG e IgM. Subclasses de IgG também são bem conhecidas dos profissionais e incluem mas não se limitam a IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Inclui, a título exemplificativo, anticorpos de ocorrência natural e ocorrência 26 "anticorpo" inclui anticorpos policlonais e monoclonais, e respectivos fragmentos monovalentes e divalentes. Além disso, "anticorpo" inclui anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente sintéticos, anticorpos de cadeia simples e respectivos fragmentos. Opcionalmente, um anticorpo pode ser etiquetado com um marcador detectável. Marcadores detectáveis incluem, por exemplo, marcadores radioactivos ou fluorescentes. 0 anticorpo pode ser um anticorpo humano ou não humano. 0 anticorpo não humano pode ser humanizado por métodos recombinantes, para reduzir a sua imunogenicidade no homem. Métodos de humanização de anticorpos são conhecidos dos profissionais.

Tal como é aqui utilizado, "anticorpo monoclonal", também designado mAb, é utilizado para descrever moléculas de anticorpos cujas sequências primárias são essencialmente idênticas e que exibem a mesma especificidade antigénica. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelas técnicas de hibridoma, recombinante, transgénica ou outras conhecidas do profissional.

Tal como é aqui utilizado, "anticorpo anti-receptor de quimioquinas" designa um anticorpo que reconhece e se liga a um epitopo de um receptor de quimioquinas. Tal como é aqui utilizado, "anticorpo anti-CCR5" designa um anticorpo monoclonal que reconhece e se liga a um epitopo do receptor de quimioquinas CCR5.

Tal como é aqui utilizado, "razão apropriada" designa razões de massa ou molares às quais os compostos são eficazes de forma sinergética. 27

Numa forma de realização das composições acima, pelo menos um composto é uma quimioquina ou derivado de quimioquina. As quimioquinas incluem mas não se limitam a RANTES, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, SDF-1 ou uma combinação destas. Nesta composição, os compostos estão numa razão apropriada. Os derivados de quimioquinas incluem mas não se limitam a Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9-68 ou uma combinação destes.

Tal como é aqui utilizado, "derivado de quimioquina" desiqna uma quimioquina quimicamente modificada. As modificações químicas incluem mas não se limitam a substituições, adições ou deleções de aminoácidos, adições não peptidilo ou oxidações. 0 profissional consequirá preparar esses derivados.

Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um composto é um anticorpo e pelo menos um composto é uma quimioquina ou derivado de quimioquina. Nesta composição, os compostos estão numa razão apropriada. A razão varia desde 100:1 até 1000:1.

Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um composto liga-se à subunidade gp41 da glicoproteína de envelope do HIV-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é o inibidor peptídico T-20 da entrada do HIV-1 (70).

Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos inibe a ligação do HIV-1 a uma célula-alvo. Numa forma de realização, pelo menos um composto liga-se ao CD4. Numa forma de realização, pelo menos um composto é uma glicoproteína de envelope do HIV-1. 28

Numa forma de realização, pelo menos um composto é um anticorpo anti-CD4. Numa forma de realização, pelo menos um composto liga-se à glicoproteína de envelope do HIV-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é um anticorpo para a glicoproteína de envelope do HIV-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é uma proteína à base de CD4. Numa forma de realização, pelo menos um composto é CD4-IgG2.

Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um composto é um anticorpo e pelo menos um composto liga-se a uma glicoproteína de envelope do HIV-1. Numa forma de realização, o composto é uma proteína à base de CD4. Numa forma de realização, o composto é CD4-IgG2. Nesta composição, os compostos estão numa razão apropriada. A razão varia desde 1:1 até 10:1.

Tal como é aqui utilizado, "acoplamento" designa o processo que é mediado pela ligação da glicoproteína de envelope do HIV-1 ao receptor CD4 humano, que não é um co-receptor de fusão.

Tal como é aqui utilizado, "CD4" designa a proteína CD4 madura, nativa e ligada a membranas que compreende um domínio citoplasmático, um domínio transmembranar hidrófobo e um domínio extracelular que se liga à glicoproteína de envelope gpl20 do HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "glicoproteína de envelope do HIV-1" designa a proteína codificada pelo HIV-1 que compreende a proteína de superfície gpl20, a proteína transmembranar gp41 e respectivos oligómeros e precursores. 29

Tal como é aqui utilizado, "proteína à base de CD4" designa qualquer proteína compreendendo pelo menos uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente à porção da CD4 necessária para a CD4 formar um complexo com a glicoproteína de envelope gpl20 do HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "CD4-IgG2" designa uma proteína de fusão CD4-IgG2 humana heterotetramérica codificada pelos vectores de expressão depositados com os Números de Acesso da ATCC 75193 e 75194.

Numa forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos compreende um polipéptido que se liga a um epítopo do CCR5. Numa forma de realização, o epítopo está localizado no terminal N, uma das três regiões de alça extracelulares ou uma combinação destes. Numa forma de realização, o epítopo está localizado no terminal N. 0 epítopo pode compreender N13 e Y15 no terminal N. 0 epítopo pode compreender, compreende Q4 no terminal N. Noutra forma de realização, o epítopo inclui resíduos no terminal N e segunda alça extracelular. 0 epítopo pode compreender D2, Y3, Q4, S7, P8 e N13 no terminal N e Y176 e T177 na segunda alça extracelular. 0 epítopo pode compreender D2, Y3, Q4, P8 e N13 no terminal N e Y176 e T177 na segunda alça extracelular. 0 epítopo pode compreender D2 no terminal N e R168 e Y176 na segunda alça extracelular. Numa forma de realização, o epítopo está localizado na segunda alça extracelular. 0 epítopo pode compreender Q170 e K171 na segunda alça extracelular. 0 epítopo pode compreender Q170 e E172 na segunda alça extracelular. 30

Tal como é aqui utilizado, as seguintes abreviaturas padrão são empregues ao longo da especificação para indicar aminoácidos específicos: A = ala = alanina R = arg = arginina N = asn = asparagina D = asp = ácido aspártico C = cys = cisteína Q = gin = glutamina E = glu = ácido glutâmico G = gly = glicina H = his = histidina I = ile = isoleucina L = leu = leucina K = lys = lisina M = met = metionina F = phe = fenilalanina P = pro = prolina S = ser = serina T = thr = treonina W = trp = triptofano Y = tyr = tirosina V = vai = valina

Tal como é aqui utilizado, "polipéptido" designa dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.

Tal como é aqui utilizado, "epítopo" designa uma porção de uma molécula ou moléculas que forma uma superfície para a ligação de anticorpos ou outros compostos. O epítopo pode compreender aminoácidos contíguos ou não contíguos, fracções de hidratos de carbono ou outras não peptidilo ou superfícies específicas para oligómeros.

Tal como é aqui utilizado, "terminal N" designa a sequência de aminoácidos que abrange a metionina de iniciação e a primeira região transmembranar.

Tal como é aqui utilizado, "segunda alça extracelular" designa a sequência de aminoácidos que abrangem a quarta e quinta regiões transmembranares e estão apresentados na superfície. 31

Numa forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos compreende uma cadeia leve de um anticorpo. Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos compreende uma cadeia pesada de um anticorpo. Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos compreende a porção Fab de um anticorpo. Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos compreende o domínio variável de um anticorpo. Noutra forma de realização, o anticorpo é produzido na forma de um único polipéptido ou anticorpo de "cadeia simples" que compreende os domínios variáveis das cadeias pesada e leve geneticamente ligados via uma sequência intermediária de aminoácidos. Noutra forma de realização das composições acima, pelo menos um dos compostos compreende uma ou mais porções CDR de um anticorpo.

Tal como é aqui utilizado, "cadeia pesada" designa o polipéptido maior de uma molécula de anticorpo composto por um domínio variável (VH) e três ou quatro domínios constantes (CHI, CH2, CH3 e CH4), ou respectivos fragmentos.

Tal como é aqui utilizado, "cadeia leve" designa o polipéptido menor de uma molécula de anticorpo composto por um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), ou respectivos fragmentos.

Tal como é aqui utilizado, "Fab" designa um fragmento monovalente de ligação de antigenes de uma imunoglobulina que consiste numa cadeia leve e parte de uma cadeia pesada. Pode ser obtido por digestão breve com papaína ou por métodos recombinantes. 32

Tal como é aqui utilizado, "fragmento F(ab')2" designa um fragmento bivalente de ligação de antigenes de uma imunoglobulina que consiste em ambas as cadeias leves e parte de ambas as cadeias pesadas. Pode ser obtido por digestão breve com papaina ou por métodos recombinantes.

Tal como é aqui utilizado, "CDR" ou "região determinante de complementaridade" designa uma sequência altamente variável de aminoácidos do domínio variável de um anticorpo.

Esta invenção proporciona as composições acima e um transportador farmaceuticamente aceitável. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos profissionais. Esses transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir mas não se limitam a soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietileno-glicol, óleos vegetais, como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, como oleato de etilo. Transportadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, meios salinos e tamponados. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem regeneradores de fluidos e nutrientes, regeneradores de electrólitos, como os baseados em dextrose de Ringer, e afins. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e afins. 33

Esta invenção proporciona um método de tratamento de um sujeito afectado com o HIV-1, que compreende administrar ao sujeito uma dose eficaz das composições acima.

Tal como é aqui utilizado, "sujeito" designa qualquer animal ou animal artificialmente modificado capaz de ficar infectado pelo HIV. Animais artificialmente modificados incluem mas não se limitam a ratinhos SCID com sistemas imunológicos humanos. Os animais incluem mas não se limitam a ratinhos, ratos, cães, porquinhos-da-índia, furões, coelhos e primatas. Na forma de realização preferida, o sujeito é um humano.

Tal como é aqui utilizado, "tratar" refere-se a abrandar, terminar ou reverter a progressão de uma perturbação do HIV-1. Na forma de realização preferida, "tratar" significa reverter a progressão até ao ponto de eliminação da perturbação. Tal como é aqui utilizado, "tratar" também significa a redução do número de infecções virais, redução do número de partículas virais infecciosas, redução do número de células infectadas de forma virai ou a melhoria dos sintomas associados ao HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, "afectado com o HIV-1" significa que o sujeito tem pelo menos uma célula que foi infectada com o HIV-1.

Tal como é aqui utilizado, a "administração" pode ser efectuada ou realizada utilizando qualquer um dos métodos conhecidos do profissional. Os métodos podem compreender meios intravenosos, intramusculares ou subcutâneos. 34 A dose da composição da invenção irá variar dependendo do sujeito e da via particular de administração utilizada. As dosagens podem variar desde 0,1 até 100 000 Com base na composição, a dose pode ser distribuída continuamente, tal como por uma bomba contínua, ou em intervalos periódicos. Por exemplo, numa ou mais ocasiões separadas. Intervalos de tempo desejados de múltiplas doses de uma composição particular podem ser determinados pelo profissional sem experimentação indevida.

Tal como é aqui utilizado, "dose eficaz" designa uma quantidade em quantidades suficientes para tratar o sujeito ou prevenir que o sujeito fique infectado com o HIV-1. Um profissional pode realizar experiências simples de titulação para determinar a quantidade necessária para tratar o sujeito.

Esta invenção proporciona um método para prevenir que um sujeito contraia o HIV-1, que compreende administrar ao sujeito uma dose eficaz das composições acima.

Tal como é aqui utilizado, "contrair o HIV-1" significa ficar infectado com o HIV-1, cuja informação genética se replica e/ou incorpora nas células-hospedeiro.

Esta invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-CCR5. O anticorpo inclui mas não se limita aos seguintes: PA8 (N° de Acesso da ATCC HB-12605), PA9 (N° de Acesso da ATCC HB-12606), PAIO (N° de Acesso da ATCC HB-12607), PAI 1 (N° de Acesso da ATCC HB-12608), PA12 (N° de Acesso da ATCC HB-12609), e PA14 (N° de Acesso da ATCC HB-12610). 35

Esta invenção proporciona formas humanizadas dos anticorpos acima.

Tal como é aqui utilizado, "humanizado" descreve anticorpos em que alquns, a maior parte ou a totalidade dos aminoácidos fora das reqiões CDR são substituídos por aminoácidos correspondentes derivados de moléculas de imunoqlobulinas humanas. Numa forma de realização das formas humanizadas dos anticorpos, alquns, a maior parte ou a totalidade dos aminoácidos fora das regiões CDR foram substituídos por aminoácidos de moléculas de imunoglobulinas humanas, mas em que alguns, a maior parte ou a totalidade dos aminoácidos dentro de uma ou mais regiões CDR permanecem inalterados. São permissíveis pequenas adições, deleções, inserções, substituições ou modificações de aminoácidos, desde que não anulem a capacidade do anticorpo para se ligar a um dado antigene. Moléculas de imunoglobulinas humanas adequadas incluem moléculas IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Um anticorpo "humanizado" retém uma especificidade antigénica semelhante à do anticorpo original, isto é, na presente invenção, a capacidade para se ligar ao CCR5. 0 profissional sabe preparar os anticorpos humanizados da presente invenção. Várias publicações também descrevem o modo de preparar anticorpos humanizados. Por exemplo, os métodos descritos na Patente dos Estados Unidos N° 4,816,567 (71) compreendem a produção de anticorpos quiméricos com uma região variável de um anticorpo e uma região constante de outro anticorpo. A Patente dos Estados Unidos N° 5,225,539 (72) descreve outra abordagem para a produção de um anticorpo 36 humanizado. Esta patente descreve a utilização de tecnologia de DNA recombinante para produzir um anticorpo humanizado em que as CDRs de uma região variável de uma imunoglobulina são substituídas pelas CDRs de uma imunoglobulina com especificidade diferente, de modo que o anticorpo humanizado reconhece o alvo desejado mas não será reconhecido, de um modo significativo, pelo sistema imunológico do sujeito humano. Especificamente emprega-se mutagénese dirigida a sítios para enxertar as CDRs no arcabouço.

Outras abordagens para humanizar um anticorpo são descritas nas Patentes dos Estados Unidos N°s 5,585,089 (73) e 5,693, 761 (74) e WO 90/07861, que descrevem métodos para produzir imunoglobulinas humanizadas. Estas têm uma ou mais CDRs e possíveis aminoácidos adicionais de uma imunoglobulina dadora e uma região de arcabouço de uma imunoglobulina humana aceitadora. Estas patentes descrevem um método para aumentar a afinidade de um anticorpo para o antigene desejado. Alguns aminoácidos do arcabouço são escolhidos de modo a serem iguais aos aminoácidos naquelas posições no dador, em vez de no aceitador. Especificamente, estas patentes descrevem a preparação de um anticorpo humanizado que se liga a um receptor por combinação das CDRs de um anticorpo monoclonal de ratinho com regiões de arcabouço e constantes de uma imunoglobulina humana. As regiões de arcabouço humanas podem ser escolhidas de modo a maximizar a homologia com a sequência de ratinho. Pode utilizar-se um modelo computacional para identificar aminoácidos da região de arcabouço que é provável que interajam com as CDRs ou o antigene específico, e depois podem utilizar-se aminoácidos de ratinho nestas posições para criar o anticorpo humanizado. 37

As patentes acima 5,585,089 e 5,693,761 e WO 90/07861 (75) também propõem quatro critérios possíveis que podem ser utilizados na concepção de anticorpos humanizados. A primeira proposta foi, para um aceitador, utilizar um arcabouço de uma imunoglobulina humana particular que seja invulgarmente homóloga à imunoglobulina dadora a ser humanizada, ou utilizar um arcabouço de consenso de muitos anticorpos humanos. A segunda proposta foi a de que, se um aminoácido do arcabouço da imunoglobulina humana for invulgar e o aminoácido dador nessa posição for típico de sequências humanas, então pode seleccionar-se o aminoácido do dador em vez do aceitador. A terceira proposta foi a de que, nas posições imediatamente adjacentes às 3 CDRs da cadeia da imunoglobulina humanizada, se pode seleccionar o aminoácido do dador em vez do aminoácido do aceitador. A quarta proposta foi utilizar o resíduo de aminoácido do dador nas posições de arcabouço onde se prevê que o aminoácido tenha um átomo de cadeia lateral numa extensão de 3 A das CDRs num modelo tridimensional do anticorpo e se prevê que seja capaz de interagir com as CDRs. Os métodos acima são meramente ilustrativos de alguns dos métodos que o profissional poderá empregar para preparar anticorpos humanizados. A afinidade e/ou especificidade da ligação do anticorpo humanizado podem ser aumentadas utilizando métodos de evolução dirigida, como descrito em Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 284: 151 e Patentes U.S. N°s 6,165,793, 6,365,408 e 6,413,774.

Numa forma de realização da invenção, a forma humanizada do anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos variável da cadeia leve como apresentada na ID SEQ NO: 6. Noutra forma de realização, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos variável da cadeia 38 pesada como apresentado na ID SEQ NO: 9. Noutra forma de realização, o anticorpo pode compreender a sequência de aminoácidos variável da cadeia pesada como apresentado na ID SEQ NO: 12.

Noutra forma de realização, o anticorpo humanizado compreende a sequência de aminoácidos variável da cadeia leve como apresentada na ID SEQ NO: 6 e a sequência de aminoácidos variável da cadeia pesada como apresentado na ID SEQ NO: 9. Alternativamente, o anticorpo pode compreender a sequência de aminoácidos variável da cadeia leve como apresentada na ID SEQ NO: 6 e a sequência de aminoácidos variável da cadeia pesada como apresentado na ID SEQ NO: 12.

As regiões variáveis do anticorpo humanizado podem ser ligadas a pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina de uma imunoglobulina humana. Numa forma de realização, o anticorpo humanizado contém regiões constantes da cadeia leve e cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada inclui habitualmente a região CHI, conectora, CH2, CH3 e, por vezes, CH4. Numa forma de realização, as regiões constantes do anticorpo humanizado são do isotipo IgG4 humana.

Esta invenção proporciona moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificam estes anticorpos monoclonais anti-CCR5, ou suas versões humanizadas. A molécula de ácido nucleico pode ser RNA, DNA ou cDNA. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica a cadeia leve. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica a cadeia pesada. Numa forma de realização, o ácido nucleico codifica ambas as cadeias 39 pesada e leve. Numa forma de realização, uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificam a porção Fab. Numa forma de realização, uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificam porções de CDRs. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica o domínio variável. Noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica o domínio variável e um ou mais domínios constantes.

Preferivelmente, análogos de anticorpos anti-CCR5 humanizados exemplificados diferem de anticorpos anti-CCR5 humanizados exemplificados por substituições de aminoácidos conservativas. Com a finalidade de classificar substituições de aminoácidos como conservativas ou não conservativas, os aminoácidos podem ser agrupados do modo seguinte: Grupo I (cadeias laterais hidrófobas): met, ala, vai, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais acídicas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam a orientação da cadeia): gly, pro, e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. Substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos da mesma classe. Substituições não conservativas consistem em alterar um membro de uma destas classes por um membro de outra.

Análogos de anticorpos anti-CCR5 humanizados exibem identidade substancial de sequências de aminoácidos com o PRO 140 #1 humanizado ou PRO 140 #2 humanizado, exemplificados aqui. Regiões variáveis das cadeias pesada e leve de análogos são codificadas por sequências de ácidos nucleicos que hibridizam com os ácidos nucleicos que 40 codificam as regiões variáveis da cadeia pesada ou leve do PRO 140 #1 humanizado, ou PRO 140 #2 humanizado, ou respectivas formas degeneradas, em condições restritas.

Devido à degenerescência do código genético, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codifica o anticorpo anti-CCR5 humanizado da presente invenção. Em certas formas de realização, o anticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucleico que é altamente homóloga às anteriores moléculas de ácidos nucleicos. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico homóloga compreende uma sequência de nucleótidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de nucleótidos aqui fornecida. Mais preferivelmente, a sequência de nucleótidos é pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de nucleótidos aqui fornecida. A homologia pode ser calculada utilizando várias ferramentas de "software" publicamente disponíveis bem conhecidas do profissional. Ferramentas exemplificativas incluem o sistema BLAST disponível no sítio da "internet" do National Center for Biotechnology Information (NCBI) do National Institutes of Health.

Um método para identificar sequências de nucleótidos altamente homólogas é via hibridização de ácidos nucleicos.

Assim, a invenção também inclui anticorpos para o CCR5 humanizados com as propriedades de ligação ao CCR5, e outras propriedades funcionais descritas aqui, que são codificados por moléculas de ácidos nucleicos que hibridizam, em condições de restrição elevada, para as moléculas de ácidos nucleicos anteriores. Também podem identificar-se sequências relacionadas utilizando reacção 41 em cadeia de polimerase (PCR) e outras técnicas de amplificação adequadas para a clonagem de sequências de ácidos nucleicos relacionadas. Preferivelmente seleccionam-se "primers" de PCR para amplificar porções de uma sequência de ácido nucleico de interesse, como uma CDR. 0 termo "condições de restrição elevada", tal como é aqui utilizado, refere-se a parâmetros com os quais os profissionais estão familiarizados. Podem encontrar-se parâmetros de hibridização de ácidos nucleicos em referências que compilam esses métodos, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", J. Sambrook, et al., editores, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, ou "Current Protocols in Molecular Biology", F. M. Ausubel, et al., editores, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. Um exemplo de condições de restrição elevada é hibridização a 65 graus centígrados em tampão de hibridização (3,5 X SSC, Ficoll 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, Albumina do Soro Bovino 0,02%, NaH2P04 2,5 mM (pH 7), SDS 0,5%, EDTA 2 mM) . SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,015 M, pH 7; SDS é dodecilsulfato de sódio, e EDTA é ácido etileno-diaminotetracético. Após a hibridização, uma membrana para onde é transferido o ácido nucleico é lavada, por exemplo, em 2 X SSC à temperatura ambiente e depois em 0,1 - 0,5 X SSC/0,1 X SDS a temperaturas até 68 graus centígrados.

As sequências de ácidos nucleicos são expressas em hospedeiros depois das sequências terem sido operativamente ligadas a (isto é, posicionadas para assegurar o funcionamento de) uma sequência de controlo da expressão. Estes vectores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros, quer na forma de epissomas quer 42 como parte integrante do DNA cromossómico do hospedeiro. Habitualmente, vectores de expressão conterão marcadores de selecção, por exemplo, tetraciclina ou neomicina, para permitir a detecção daquelas células transformadas com as sequências de DNA desejadas (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4,704,362). E. coli é um hospedeiro procariótico útil particularmente para a clonagem das sequências de DNA da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para serem utilizados incluem bacilos, como Bacillus subtilus, e outras enterobacteriaccae, como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos também é possivel preparar vectores de expressão, que tipicamente conterão sequências de controlo da expressão compatíveis com a célula-hospedeiro (por exemplo, uma origem da replicação). Adicionalmente, estará presente qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos, como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores controlarão tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências de sítios de ligação de ribossomas, e afins, para iniciar e completar a transcrição e tradução.

Outros micróbios, como leveduras, também podem ser úteis para a expressão. Saccharomyces é um hospedeiro preferido, com vectores adequados tendo sequências de controlo da expressão, como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, e 43 uma origem da replicação, sequências de terminação e afins, consoante desejado.

Para além de microrganismos, também podem utilizar-se culturas de células de tecidos de mamíferos para expressar e produzir os polipéptidos da presente invenção (ver, Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, Nova Iorque, Nova Iorque (1987)). De facto, são preferidas células eucarióticas, pois foram desenvolvidas na área algumas linhas de células-hospedeiro adequadas capazes de segregarem imunoglobulinas intactas, e incluem as linhas de células CHO, várias linhas de células COS, células HeLa, preferivelmente linhas de células de mieloma, etc., e células B transformadas ou hibridomas. Vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo da expressão, como uma origem da replicação, um promotor, um intensificador (Queen, et al., Immunol. Rev., 89, 49-68 (1986)), e sítios de informação do processamento necessários, como sítios de ligação de ribossomas, sítios de processamento de RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras da transcrição. Sequências preferidas de controlo da expressão são promotores derivados de genes de imunoglobulinas, SV40, Adenovírus, citomegalovírus, Vírus Papiloma Bovino e afins.

Os vectores que contêm os segmentos de DNA de interesse (por exemplo, as sequências codificadoras da cadeia pesada e leve e sequências de controlo da expressão) podem ser transferidos para a célula-hospedeiro por métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção com cloreto de cálcio é habitualmente utilizada para células procarióticas, ao passo que o tratamento com fosfato de cálcio ou 44 electroporação podem ser utilizados para outros hospedeiros celulares (ver, genericamente, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1982)) .

Depois de expressos, os anticorpos completos, seus dímeros, cadeias leve e pesada individuais ou outras formas de imunoglobulinas da presente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos comuns na área, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gel e afins (ver, genericamente, R. Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, Nova Iorque (1982)). São preferidas imunoglobulinas substancialmente puras com pelo menos cerca de 90 até 95% de homogeneidade, e é muito preferido 98 até 99% ou mais de homogeneidade, para aplicações farmacêuticas. Depois de purificados, parcialmente ou até à homogeneidade, consoante desejado, os polipéptidos podem então ser utilizados terapeuticamente (incluindo de forma extracorporal) ou para desenvolver e realizar procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes e afins (ver, genericamente, "Immunological Methods", Volumes I e II, Lefkovits e Pernis, editores, Academic Press, Nova Iorque, Nova Iorque (1979 e 1981)) .

Para fins de diagnóstico ou detecção, os anticorpos podem estar etiquetados ou não etiquetados. Anticorpos não etiquetados podem ser utilizados em combinação com outros anticorpos etiquetados (segundos anticorpos) que são reactivos com o anticorpo humanizado, como anticorpos específicos para regiões constantes de imunoglobulinas humanas. Alternativamente, os anticorpos podem ser 45 etiquetados directamente. Pode empregar-se uma grande variedade de etiquetas, como radionuclidos, flúores, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, ligandos (particularmente haptenos), etc. Numerosos tipos de imunoensaios estão disponíveis e são bem conhecidos dos profissionais para a detecção de células que expressam o CCR5 ou detecção da modulação do CCR5 em células capazes de expressarem o CCR5. A presente invenção também proporciona conjugados fragmento de anticorpo-polímero com uma dimensão ou peso molecular efectivo que proporciona um aumento do tempo de semi-vida no soro, um aumento do tempo médio de permanência na circulação (MRT) e/ou um decréscimo da velocidade de eliminação do soro relativamente a fragmentos de anticorpo não derivatizados.

Os conjugados fragmento de anticorpo-polímero da invenção podem ser preparados por derivatização do fragmento de anticorpo desejado com um polímero inerte. Será apreciado que qualquer polímero inerte que origine o conjugado com a dimensão aparente desejada ou que tenha o peso molecular real seleccionado é adequado para utilização na construção dos conjugados fragmento de anticorpo-polímero da invenção.

Muitos polímeros inertes são adequados para utilização em agentes farmacêuticos. Ver, por exemplo, Davis et al., "Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use", páginas 441-451 (1980) . Em todas as formas de realização da invenção utiliza-se um polímero não proteináceo. 0 polímero não proteináceo é habitualmente um polímero sintético 46 hidrófilo, isto é, um polímero que não se encontra na natureza. No entanto, também são úteis polímeros que existem na natureza e que são produzidos por métodos recombinantes ou in vitro, pois são polímeros que são isolados de fontes nativas. Polímeros de polivinilo hidrófilos caiem no âmbito desta invenção, por exemplo, álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. São particularmente úteis éteres de polialquileno, como polietilenoglicol (PEG); polioxialquilenos, como polioxietileno, polioxipropileno e copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polissacáridos ramificados ou não ramificados que compreendem os monómeros sacarídicos D-manose, D- e L-galactose, fucose, frutose, D-xilose, L-arabinose, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por exemplo, ácido polimanurónico, ou ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucose e ácido neuramínico, incluindo homopolissacáridos e heteropolissacáridos como lactose, amilopectina, amido, hidroxietilamido, amilose, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glicogénio, ou a subunidade polissacarídica de mucopolissacáridos ácidos, por exemplo, ácido hialurónico, polímeros de álcoois de açúcares, como polissorbitol e polimanitol, heparina ou heparona. Antes da formação de ligações cruzadas, não é necessário que o polímero seja, mas preferivelmente é solúvel em água, mas o conjugado final deve ser solúvel em água. Preferivelmente, o conjugado exibe uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 0,01 mg/mL e mais preferivelmente pelo menos cerca de 0,1 mg/mL e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 1 mg/mL. Adicionalmente, o polímero não deve ser altamente imunogénico na forma conjugada, nem deve possuir viscosidade que seja incompatível com a infusão ou injecção 47 intravenosa se for destinado a ser administrado por essas vias.

Numa forma de realização, o polímero contém apenas um único grupo que é reactivo. Isto ajuda a evitar a formação de ligações cruzadas de moléculas proteicas. No entanto, pertence ao âmbito da invenção maximizar as condições reaccionais para reduzir a formação de ligações cruzadas, ou para purificar os produtos reaccionais por filtração em gel ou cromatografia de permuta iónica, para recuperar derivados substancialmente homogéneos. Noutras formas de realização, o polímero tem dois ou mais grupos reactivos para a ligação de múltiplos fragmentos de anticorpo à coluna vertebral do polímero.

Mais uma vez, pode utilizar-se filtração em gel ou cromatografia de permuta iónica para recuperar o derivado desejado em forma substancialmente homogénea. 0 peso molecular do polímero pode variar até cerca de 500 000 D e preferivelmente é pelo menos cerca de 20 000 D ou pelo menos cerca de 30 000 D ou pelo menos cerca de 40 000 D. O peso molecular escolhido pode depender da dimensão efectiva do conjugado que se pretende obter, da natureza (por exemplo, estrutura, como linear ou ramificada) do polímero e do grau de derivatização, isto é, o número de moléculas de polímero por fragmento de anticorpo e do sítio ou sítios de acoplamento do polímero ao fragmento de anticorpo. O polímero pode ser ligado de forma covalente ao fragmento de anticorpo através de um agente de formação de ligações cruzadas multifuncional que reage com o polímero e 48 um ou mais resíduos de aminoácidos do fragmento de anticorpo a ser ligado. Todavia, também pertence ao âmbito da invenção ligar o polímero directamente de forma cruzada fazendo reagir um polímero derivatizado com o fragmento de anticorpo, ou vice-versa. 0 sítio de formação de ligações covalentes cruzadas no fragmento de anticorpo inclui o grupo amino N-terminal e grupos épsilon amino presentes em resíduos lisina, bem como outros grupos amino, imino, carboxilo, sulfidrilo, hidroxilo ou outros grupos hidrófilos. 0 polímero pode ser ligado de forma covalente directamente ao fragmento de anticorpo sem a utilização de um agente de formação de ligações cruzadas multifuncional (habitualmente bifuncional), como descrito na Patente U.S. N° 6,458,355. 0 grau de substituição com esse polímero irá variar, dependendo do número de sítios reactivos do fragmento de anticorpo, do peso molecular, hidrofilicidade e outras características do polímero, e dos sítios particulares de derivatização do fragmento de anticorpo escolhidos. Em geral, o conjugado tem desde 1 até cerca de 10 moléculas de polímero, mas também são contemplados números maiores de moléculas de polímero acopladas aos fragmentos de anticorpo da invenção. A quantidade desejada de derivatização é facilmente obtida utilizando uma matriz experimental em que se varia o tempo, temperatura e outras condições reaccionais para alterar o grau de substituição, após o que se determina o nível de substituição de polímero dos conjugados por cromatografia por exclusão de tamanhos ou outros meios conhecidos na área. 49

Polímeros de PEG funcionalizados para modificar os fragmentos de anticorpo da invenção são disponibilizados pela Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)· Esses derivados de PEG comercialmente disponíveis incluem mas não se limitam a amino-PEG, ésteres de PEG-aminoácidos, PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG-succinato, PEG carboximetilado, PEG-ácido propiónico, PEG-aminoácidos, PEG-succinato de succinimidilo, PEG-propionato de succinimidilo, éster de succinimidilo de PEG carboximetilado, carbonato de succinimidilo de PEG, ésteres de succinimidilo de aminoácido-PEGs, PEG-oxicarbonilimidazolo, PEG-carbonato de nitrofenilo, PEG-tresilato, PEG-éter de glicidilo, PEG-aldeído, PEG-vinilsulfona, PEG-maleimida, PEG-dissulfureto de ortopiridilo, PEGs heterofuncionais, PEG-derivados de vinilo, PEG-silanos e PEG-fosfoletos. As condições reaccionais para acoplamento destes derivados de PEG irão variar dependendo da proteína, do grau desejado de PEGuilação e do derivado de PEG utilizado. Alguns factores envolvidos na escolha dos derivados de PEG incluem: o ponto desejado de acoplamento (como R-grupos lisina ou cisteína), estabilidade hidrolítica e reactividade dos derivados, estabilidade, toxicidade e antigenicidade da ligação, adequação a análise, etc. Instruções específicas para a utilização de qualquer derivado particular são disponibilizadas pelo fabricante. Os conjugados desta invenção são separados dos materiais de partida que não reagiram por filtração em gel ou HPLC de permuta iónica. 0 anticorpo anti-CCR5 ou respectivos fragmentos podem ser utilizados em combinação com um ou mais agentes antivirais adicionais seleccionados do grupo que consiste em inibidores da transcriptase reversa não nucleosídicos (NNRTIs), um inibidor da transcriptase reversa 50 nucleosídico, um inibidor da protease do HIV-1, um inibidor da entrada virai e respectivas combinações.

Os compostos NNRTI conhecidos que podem ser utilizados na composição da presente invenção incluem mas não se limitam ao efavirenz, UC-781, HBY 097, nevirapina (11-ciclopropil-5,ll-di-hidro-4-metil-6H-dipirido[3,2 —b:2'3'—] [1,4]diazepino-6-ona), delavirdina ((Rescriptor™; Pharmacia Upjohn) (piperazina, monometanossulfonato de 1— [3— [ (1 — metiletil)amino]-2-piridinil]-4-[[5-[(metilsulfonil)amino]-lH-indolo-2-il]carbonilo]), SJ-3366 (1-(3-ciclopenteno-l- il)metil-6-(3,5-dimetilbenzoí1)-5-etil-2,4-pirimidino-diona), MKC-442 (6-benzil-l-(etoximetil)-5-isopropil- uracilo), GW420867x (S-3-etil-6-fluro-4-isopropoxicarbonil-3, 4-di-hidroquinoxalino-2(1H)-ona; Glaxo), HI-443 (Ν'-[2- (2-tiofeno)etil]-N'-[2-(5-bromopiridil)]tiourea) e afins.

Os inibidores da transcriptase reversa nucleosidicos que podem ser utilizados na composição em combinação com pelo menos um anticorpo anti-CCR5 ou respectivo fragmento da presente invenção incluem mas não se limitam a abacavir (Ziagen™, GlaxoSmithKline) (sulfato (sal) de (IS,cis)-4-[2-amino-6-(ciclopropilamino)-9H-purino-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol), lamivudina (Epivir™, GlaxoSmitKline) ((2R,cis)- 4-amino-l-(2-hidroximetil-l,3-oxatiolano-5-il)-(1H)-pirimidino-2-ona), zidovudina (Retrovir™; GlaxoSmitKline) (3'azido-3'-desoxitimidina), estavudina (Zerit; Bristol-Miers Squibb) (2',3'-didesidro-3'desoxitimidina), zalcitabina (Hivid™; Roche Laboratories) (4-amino-l-beta-D2',3Z-didesoxirribofuranosil-2-(1H)-pirimidona), didanosina e afins. 51

Os inibidores da protease do HIV-1 que podem ser utilizados na composição em combinação com o anticorpo anti-CCR5 ou respectivos fragmentos da presente invenção incluem mas não se limitam a lopinavir (IS-[IR*,(R*),3R*, 4R*]]-N-4-[[(2,6-dimetilfenoxi)acetil]amino]-3-hidroxi-5-fenil-1-(fenilmetil)pentil]tetra-hidro-alfa-(1-metiletil)-2-oxolo-(2H)-pirimidinacetamida), saquinavir (N-tert-butil-deca-hidro-2-[2(R)-hidroxi-4-fenil-3(S)-[[N-(2-quinolil-carbonil)-L-asparaginil]amino]butil]-(4aS,8aS)-isoquinolino-(3 S)-carboxamida), mesilato de nelfinavir (monometanossulfonato de [ 3 S — [2(2S*,3S*),3a,4β,8 aP]]-N- (1,1-dimetietil)deca-hidro-2[2-hidroxi-3-[(3-hidroxi-2-metilbenzoíl)amino]-4-(feniltio)butil]-3-isoquinolino-carboxamida), sulfato de indinavir (sal sulfato (1:1) de ([ 1(IS,2R),5(S))]— 2,3,5-tridesoxi-N-(2,3-di-hidro-2-hidroxi-lH-indeno-l-il) - 5- [ 2 - [ [ (1, 1-dimet ilet il) amino] carbonil]-4-(3-piridinilmetil)-1-piperazinil]-2-(fenil-metil)-D-eritropentonamida), amprenavir (A7-[(lS,2R)-3-(4-amino-iV-isobutilbenzenossulf onamido)-l-benzil-2-hidroxi-propil]carbamato de (3S)-tetra-hidro-3-furilo), ritonavir ([5 S —(5R*,8R*,10R*,11R*)] éster de 5-tiazolilmetilo do ácido (10-hidroxi-2-metil-5-(1-metiletil)-1-[2-(1-metil- etil)-4-tiazolil]-3,6-dioxo-8,11-bis(fenilmetil)-2,4,7,12-tetra-azatridecano-13-óico) e afins.

Os inibidores da fusão do HIV-1 ou da entrada virai que podem ser utilizados em combinação com o anticorpo anti-CCR5 ou respectivos fragmentos da presente invenção incluem PRO 542 (Progénies Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NI), 1-20 (Trimeris, Inc., Durham, NC) (Patentes US N°s 5,464,933, 6,133,418, 6,020,459), T-1249 (Patentes US N°s 6,345,568, 6,258,782) e afins. 52

Para terapia de combinação, o anticorpo anti-CCR5 ou respectivo fragmento da presente invenção pode ser administrado ao sujeito antes, subsequentemente ou de forma concorrente com um ou mais agentes antivirais convencionais.

Pormenores Experimentais

Exemplo 1 A. Materiais e Métodos 1) Reagentes 0 mAb 2D7 foi adquirido à Pharmingen (San Diego, CA) e as quimioquinas CC e CXC foram obtidas da R&D Systems (Minneapolis, MN). 0 CD4-IgG2 (1), CD4 solúvel(solúveis) (2) e gpl20 de HIV-1JR_FL recombinante foram produzidos pela Progénies Pharmaceuticals, Inc. (59). 2) Isolamento e purificação de mAbs anti-CCR5 Células L1.2-CCR5+ (63) foram incubadas durante 16 horas na presença de butirato de sódio 5 mM, que activa a transcrição a partir do promotor do citomegalovirus (CMV) que controla a expressão do CCR5, originando um aumento de 10 vezes da densidade do co-receptor na superfície celular. Ratinhos Balb/c fêmeas foram imunizados intraperitonealmente com 107 células L1,2-CCR5+ com intervalos de 3 semanas, e receberam um reforço intravenoso de 107 células L1.2-CCR57 três dias antes da esplenectomia. Fundiram-se esplenócitos com a linha de células Sp2/0. Num rastreio primário testaram-se sobrenadantes de dez mil culturas de hibridoma; cento e vinte destes inibiram a fusão mediada pelo envelope do HIV-1 entre células PM1 (10), que expressam naturalmente o CCR5 e CD4, e células 53

HeLa-EnvjR_FL+ num ensaio de transferência de energia de ressonância (RET), como previamente descrito (19, 38). Os hibridomas que produziram os sobrenadantes inibidores de forma mais potente e que também coraram células CCR5+ foram subclonados por diluição limitante. Fluidos de ascites foram preparados pela Harlan Bioproducts for Science, Inc. (Indianápolis, IN) a partir de ratinhos Balb/c que foram injectados com hibridomas produtores dos mAbs anti-CCR5 PA8, PA9, PAIO, PAI 1, PA12 e PAI 4. Os mAbs foram purificados individualmente, até > 95% de homogeneidade, por precipitação com sulfato de amónio seguida de cromatografia com proteína A. Todos os mAbs foram novamente suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração final de 5 mg/mL. 3) Análise de triagem de células activadas por fluorescência (FACS) e mapeamento de epítopos de mAbs anti-CCR5

Utilizou-se citometria de fluxo para detectar a reactividade na superfície celular dos mAbs PA8-PA12 e PA14 com o CCR5. Células Ll.2-CCR5+ (106) tratadas com butirato de sódio foram incubadas com 0,25 μρ de anticorpo durante 20 minutos a 4°C em azida de sódio (NaN3) 0,1% em 50 μΕ de PBS de Dulbecco (DPBS) . Utilizou-se o mAb para o CCR5 2D7 como controlo positivo, como controlo negativo utilizou-se uma IgGl murina inespecífica. As células foram submetidas a vórtice, foram lavadas e incubadas com IgG de cabra anti-ratinho etiquetada com ficoeritrina (PE) (Caltag, Burlingame, CA) diluída 1:100, nas mesmas condições da incubação com o primeiro anticorpo. Por fim, as células foram analisadas por citometria de fluxo. Isolaram-se PBMCs, tendo sido estimuladas como previamente descrito (60) e coradas utilizando métodos semelhantes. 54

Utilizou-se um procedimento semelhante para o mapeamento de epítopos dos mAbs anti-CCR5. Foi descrito um painel de setenta mutantes pontuais do CCR5 (20, 24, 52) . As sequências codificadoras destas proteínas são subclonadas no vector pcDNA3.1 (Stratagene) de onde a transcrição pode ser conduzida por um promotor de 5' T7-polimerase. Os mutantes do CCR5 têm uma cauda de 9 resíduos de hemaglutinina (HA) no terminal C para a detecção de proteína em lisatos celulares ou por citometria de fluxo. Células HeLa (2 x 106) foram incubadas durante 5 horas com 20 μρ/πΛ de lipofectina e uma quantidade igual de plasmídeo que expressa o CCR5 de tipo selvagem ou mutante em OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Em seguida, as células foram infectadas durante 12 horas com 2 x 107 p.f.u. de vTF7 (23), para reforçar a expressão do CCR5, foram separadas com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM em PBS e lavadas uma vez com tampão de ligação (BSA 1%, NaN3 0,05% em DPBS). A superfície de células (1 x 106) foi etiquetada com mAbs como descrito no parágrafo anterior, as células foram lavadas uma vez com o tampão de incubação e foram novamente suspensas em 1 mL de 1 x FACSlyse em água (Becton Dickinson) durante 30 minutos à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas celulares. Em seguida, as células foram submetidas a vórtice, foram lavadas com o tampão de incubação e incubadas durante 1 hora a 37°C com 4 pg/mL de um mAb anti-HA de ratinho etiquetado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BabCo, Richmond, CA) para etiquetagem intracelular. Por fim, as células foram lavadas uma vez com tampão de ligação e uma vez com DPBS, foram novamente suspensas em formaldeído 1% em PBS e analisadas por citometria de fluxo. Determinou-se a extensão da ligação de um mAb ao CCR5 mutante pela equação (m.f.i. de CCR5 mutante PE / m.f.i. de 55 CCR5 de tipo selvagem PE) / (m.f.i. de CCR5 mutante FITC / m.f.i. de CCR5 de tipo selvagem FITC) x 100%. Isto normaliza a ligação de mAbs quanto aos níveis de expressão do co-receptor mutante. 4) Ensaio de ligação de gpl20/sCD4 A gpl20 foi biotinilada utilizando NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante, e a biotina não acoplada foi removida por diafiltração. Células L1.2-CCRS+ tratadas com butirato de sódio foram incubadas com diluições variáveis de uma mistura equimolar de sCD4 e gpl20 biotinilada, ou 1,25 μρ/ιηΕ de sCD4 e 2,5 μρ/ιηΕ de gpl20 biotinilada na presença de concentrações variáveis dos mAbs anti-CCR5 PA8-PA12, PAI4, 2D7 ou uma IgGl murina inespecífica, durante 1 hora à temperatura ambiente em NaN3 0,1% em DPBS. As células foram lavadas com o tampão de incubação e foram incubadas com estreptavidina-PE (Becton Dickinson) diluída 1:50, durante 1 hora à temperatura ambiente. Por fim, as células foram lavadas com tampão de ligação e foram analisadas utilizando um leitor de placas de fluorescência (Perspective Biosystems, Framingham, MA). 5) Inibição da fusão célula-célula mediada pelo envelope e entrada do HIV-1 por mAbs anti-CCR5

Detectou-se a fusão mediada pelo envelope do HIV-1 entre células HeLa-EnvJR_FL+ e PM1 utilizando o ensaio RET. Números iguais (2 x 104) de células que expressam o envelope etiquetadas com éster de octadecilo de fluoresceína (F18) e células PM1 etiquetadas com octadecil-rodamina (R18) foram plaqueados em placas de 96 cavidades em soro fetal de vitelo 15% em DPBS e foram incubadas, durante 4 horas a 37°C, na presença de concentrações 56 variáveis dos mAbs anti-CCR5 PA8-PA12, PAI4, 2D7 ou uma IgGl murina inespecifica. Mediu-se a fluorescência de RET com um leitor de placas Cytofluor (PerSeptive Biosystems) e determinou-se a % de RET como previamente descrito (38). Vírus NLluc+env" complementados em trans por glicoproteínas de envelope de JR-FL ou Gun-1 foram produzidos como previamente descrito (20). Células U87MG-CD4+CCRS+ (14) foram infectadas com vírus repórter quiméricos contendo 50-100 ng/mL de p24 na presença de concentrações variáveis dos mAbs individuais. Após 2 horas a 37°C, os meios que continham vírus foram substituídos por meios frescos contendo mAb. Adicionaram-se novamente meios frescos sem anticorpos passadas 12 horas. Após um total de 72 horas, adicionaram-se às células 100 μΕ de tampão de lise (Promega) e mediu-se a actividade de luciferase (r.l.u.) como descrito (20). A % de inibição da infecção pelo HIV-1 é definida como [1 - (r.l.u. na presença de anticorpo / r.l.u. na ausência de anticorpo)] x 100%. 57 variando entre 0 - 100 μg/mL. Os níveis de cálcio intracelular foram monitorizados utilizando um espectrofotómetro de fluorescência Perkin-Elmer LS-50S medindo a razão entre as emissões de fluorescência a 402 nm (corante ligado) e 486 nm (corante livre) após excitação a 358 nm. B. Resultados e Discussão 1) Isolamento dos anticorpos monoclonais anti-CCR5 PA8, PA9, PAIO, PAI1, PA12 e PAI4

Verificou-se que péptidos correspondentes aos domínios extracelulares do CCR5 são ineficazes em dirigir respostas de anticorpos específicas em títulos elevados contra o receptor nativo da superfície celular (50) . Em consequência, ratinhos Balb/C foram imunizados com células L1.2-CCR5+ e testaram-se sobrenadantes da cultura de hibridoma quanto à sua capacidade para inibir a fusão membranar mediada pelo envelope JR-FL com células PM1 CD4+CCR5+ no ensaio de RET (19, 38). Apesar de bem mais de cem sobrenadantes terem inibido a fusão célula-célula em > 50%, apenas seis - designados PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PA14 - coraram de forma específica e intensa L1.2-CCR5+ mas não as células L1.2 paternas, como demonstrado por citometria de fluxo (dados não mostrados). Com base em experiências anteriores presumiu-se que os outros mAbs capazes de inibir a fusão célula-célula foram provavelmente dirigidos contra moléculas de adesão da superfície celular, como LFA-1 (37). Por ELISA de isotipagem (Cappell, Durham, NC) determinou-se que os hibridomas PA8-PA12 e PA14 segregam mAbs IgGl. Prepararam-se fluidos de ascites a partir de ratinhos Balb/C que foram injectados com os seis hibridomas e purificaram-se as fracções de IgGl. PA8, PA9, 58 PAIO, PAI1, PA12 e PA14 exibiram perfis distintos de focagem isoeléctrica, ao passo que o PAIO exibiu um perfil muito semelhante ao do PA9 e, assim, pode ser um segundo isolado do mesmo mAb (dados não mostrados). 2) Ligação de mAbs a células CCR5+

Nenhum dos mAbs anti-CCR5 purificados corou a linha de células paterna L1.2 (dados não mostrados). No entanto, os mAbs PA9-PA12 e PA14 coraram > 90% e PA8 corou -70% de células Ll.2-CCR5+, determinado por citometria de fluxo, mostrando que reconheceram o CCR5 (Figura 1). O mAb anti-CCR5 2D7, que foi um controlo positivo nas nossas experiências, também corou > 90% de células L1.2-CCR5+.

Todos os PA8-PA12 e PA14 são IgGl e reagem igualmente bem com uma IgG anti-ratinho de cabra, ao passo que o 2D7 é uma IgG2a e pode reagir diferentemente com o anticorpo repórter. Em consequência, apenas intensidades médias de fluorescência (m.f.i.) medidas com os mAbs PA8-PA12 e PA14 são directamente comparáveis. A ordenação hierárquica das intensidades médias da fluorescência (m.f.i.) foi PA12 ~ PA11 > (2D7 =) PA14 ~ PAIO ~ PA9 > PA8. A diferença entre a m.f.i. do PA12 e m.f.i. do PA8 foi três vezes. As diferenças da intensidade da coloração entre ο PA8 e os outros mAbs permaneceu constante numa gama ampla de concentrações (dados não mostrados) e provavelmente não correspondem a diferenças de afinidades dos mAbs para o CCR5. Isto implica que ο PA8 interage apenas com um subconjunto de moléculas CCR5 presentes na superfície de células L1.2-CCR5+.

Em comparação com células L1.2-CCR5+, PBMCs estimuladas com mitogenes exibiram diferentes padrões de coloração pelos mAbs anti-CCR5. 2D7 e PA14 coraram > 20%, 59 ΡΑ11 e PA12 coraram -10%, PA8, PA9 e PAIO coraram < 5% das PBMCs (Figura 1). As intensidades médias da fluorescência das PBMCs coradas foram cerca de dez vezes mais baixas do que as obtidas com células L1.2-CCR5+ para cada mAb; a sua ordenação hierárquica foi (2D7 >) PA14 > PA12 ~ PA11 - PAIO PA9 - PA8. Mais uma vez, isto diferiu um pouco da ordenação de reactividades observadas em transfectantes de CCR5. A diferença entre a m.f.i. do PA9 e m.f.i. do PA14 foi sete vezes. Outros grupos observaram diferenças semelhantes da capacidade de mAbs anti-CCR5 para corarem linhas de células CCR5+ estáveis versus PBMC (28) . Isto pode dever-se a diferenças especificas para células quanto à conformação, modificação pós-tradução ou oligomerização do CCR5. Alternativamente, a associação a outras moléculas da superfície celular pode diferir entre células. Uma vez que uma escolha óbvia para essa molécula seria o antigene da superfície celular CD4, que está ausente em células L1.2-CCR5+ e presente em PBMCs, também testámos a capacidade do PA8-PA12, PA14 e 2D7 para corarem células HeLa que expressam de forma transitória o CCR5 isoladamente ou com CD4. Não se observaram diferenças da capacidade de qualquer um dos mAbs para corarem o CCR5 da superfície celular na presença de CD4 (dados não mostrados). Se existir uma associação entre estas duas proteínas, ela não envolve epítopos reconhecidos pelos mAbs anti-CCR5 de que dispomos. Alternativamente, poderá ocorrer uma associação entre o CCR5 e CD4 apenas em linfócitos primários. 3) Mapeamento de epítopos dos mAbs utilizando mutantes de alanina do CCR5

Nenhum dos anticorpos conseguiu detectar a proteína CCR5 reduzida e desnaturada por coloração "Western", indicando que reconhecem epítopos sensíveis quanto à 60 conformação (dados não mostrados). Os estudos do mapeamento de epítopos dos mAbs foram realizados utilizando um painel de setenta mutantes pontuais de alanina de resíduos do Nt e ECLs do CCR5. Células HeLa foram submetidas a lipofecção com sequências codificadoras do CCR5 mutantes ou de tipo selvagem com apêndices de caudas HA C-terminais e foram infectadas com vTF7 (23) para reforçar a expressão do co-receptor. Em seguida, as células foram incubadas com os mAbs anti-CCR5 e a sua ligação foi revelada por uma IgG de cabra anti-ratinho etiquetada com PE. Efectuou-se uma segunda coloração intracelular com um mAb anti-HA etiquetado com FITC (BabCo). Este controlo interno permitiu-nos normalizar directamente a coloração pelos mAbs anti-CCR5 quanto aos níveis de expressão do co-receptor mutante na superfície celular. Assim, a ligação do mAb a cada mutante é expressa em percentagem da ligação ao CCR5 de tipo selvagem (Figura 4).

Certas mutações pontuais reduziram a ligação de todos os anticorpos ao CCR5 em > 50%. Em geral, PA8-PA12 foram os mais afectados, PA14 e 2D7 os menos afectados por esta classe de mutantes, que incluiu o par de cisteínas C101A e C178A, os mutantes no Nt Y10A, D11A, K25A, o mutante na ECL1 D95A, os mutantes na ECL2 K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A e os mutantes na ECL3 F263A e F264A (Fig. 1) . Uma interpretação é que estes resíduos não fazem parte dos epítopos dos mAbs per se, mas a alteração para alaninas provoca perturbações conformacionais que têm um efeito comum na ligação de todos os mAbs. Presumimos que, se uma mutação diminuiu a ligação de um mAb individual em > 75% e também não diminuiu a ligação da maior parte dos outros anticorpos, o resíduo provavelmente contribuiu directamente para o epítopo reconhecido pelo mAb. Utilizando estas 61 directrizes de restrição concluiu-se que os sete mAbs anti-CCR5 reconhecem epitopos sobrepostos mas distintos (Figura 4) . A ligação do mAb PA8 ao CCR5 dependeu de N13 e Y15 do

Nt. Os mAbs PA9 e PAIO necessitaram de D2, Y3, Q4, P8 e N13 do Nt e Y176 e T177 da ECL2. 0 mAb PA9 também necessitou de S7 do Nt. A ligação dos mAbs PA11 e PA12 dependeu de Q4 do

Nt. 0 PA14 necessitou de D2 do Nt e R168 e Y176 da ECL2.

Por fim, o mAb 2D7 necessitou de Q170 e K171/E172 da ECL2 para se ligar ao CCR5. 4) Sinalização de quimioquinas na presença de mAbs anti- CCR5

Agentes de ligação a receptores de quimioquinas podem ser antagonistas ou, mais raramente, agonistas da sinalização intracelular mediada por receptores.

Alternativamente, podem não ter nenhum efeito na sinalização. 0 CCR5 é capaz de se ligar a três quimioquinas, RANTES, ΜΙΡ-Ια e MIP- 1β, e proceder à transdução de um sinal que modula os níveis de cálcio citosólicos. Em consequência, testámos a actividade agonista/antagonista de várias concentrações dos mAbs PA8-PA12, PAI 4 e 2D7. Mediram-se alterações das concentrações de cálcio intracelulares, (Ca2+)i, em células L1.2-CCR5+ carregadas com Indo-1. Nenhum dos mAbs estimulou uma alteração de (Ca2+)i, indicando que não são agonistas para o CCR5. PA8-PA12 também foram incapazes de inibir fluxos de Ca2+ induzidos por RANTES (Fig. 5A e dados não mostrados), mesmo as concentrações tão elevadas quanto 100 μg/mL, mostrando que também não são antagonistas. Estas concentrações originam ligação de saturação dos mAbs a células L1.2-CCR5+, como mostrado por citometria de fluxo e o ensaio de ligação de gpl20/CCR5 (Fig. 6D e dados não mostrados) . No entanto, os mAbs PA14 e 2D7 bloquearam a 62 mobilização de cálcio induzida pela RANTES, apesar de com diferentes potências (Fig. 5A, 5B). 0 IC5o para a inibição do influxo de cálcio pelo PA14 foi 50 μρ/πΛ, que foi aproximadamente 8 vezes mais elevado do que o IC50 para o 2D7 (Fig. 5B) . Cada um dos fluxos de cálcio induzidos por RANTES, ΜΙΡ-Ια e MIP-Ιβ foi inibido por concentrações semelhantes de PA14 (dados não mostrados) . Nenhum dos mAbs afectou a mobilização de cálcio induzida pelo SDF-1 em células L1.2-CCR5+, que expressam endogenamente o CXCR4 (dados não mostrados) . Por fim, nem mAbs nem quimioquinas CC afectaram os níveis de cálcio citosólicos em células L1.2 paternas (dados não mostrados). 5) Inibição da função do co-receptor CCR5 pelos mAbs

Os mAbs PA8-PA12 e PA14 foram inicialmente seleccionados com base na sua capacidade para inibir a fusão célula-célula mediada pelo envelope do HIV-1. Esta actividade foi confirmada e quantificada para os mAbs purificados. Como esperado, todos os seis mAbs, bem como o mAb 2D7, bloquearam a fusão entre células PM1 CD4+CCR5+ e células HeLa-EnvJR_FL+ no ensaio de RET. A ordenação hierárquica da potência foi 2D7 ~ PA14 > PA12 > PA11 > PAIO ~ PA9 ~ PA8 (Fig. 6A) . Os valores IC50 para PA14 e 2D7 foram 1,7 μρ/πΛ e 1,6 μg/mLr respectivamente, para PA11 e PA12 estes foram 25,5 μg/mL e 10,0 μg/mL, respectivamente (Figura 3). PA8, PA9 e PAIO inibiram a fusão em apenas 10-15% a 300 μρ/πΛ. Nenhum dos mAbs afectou a fusão entre células PM1 e células HeLa-EnvLAi+, que expressam a proteína de envelope completa de um vírus X4 (dados não mostrados).

Também se testou a capacidade dos diferentes mAbs anti-CCR5 para inibir a entrada de um vírus R5 prototípico, 63 JR-FL, e um vírus R5X4, Gun-1, numa única ronda de ensaio de entrada à base de luciferase, de replicação. A ordenação hierárquica da potência no ensaio de entrada foi semelhante à determinada no ensaio de fusão célula-célula (Fig. 6B) . Não foi possível obter uma inibição > 50% da entrada de JR-FL ou Gun-1 com PA8-PA11. O valor IC50 para ο PA12 foi 2,5 μρ/πΛ. No entanto, não foi possível obter inibição da entrada em > 60% com este mAb. Determinaram-se os valores IC5o para a inibição pelo PA14 e 2D7 da entrada de JR-FL, que foram 0,024 e 0,026 μρ/mL, respectivamente (Figura 3), e foram 60 vezes mais baixos do que os obtidos no ensaio de fusão. A entrada de Gun-1 dual-trópico foi 2-3 vezes mais sensível à inibição por mAbs anti-CCR5 do que a entrada de JR-FL (dados não mostrados).

Os mAbs anti-co-receptores poderão inibir a fusão mediada pelo envelope quer afectando directamente a interacção gpl20/CCR5 ou impedindo passos pós-ligação envolvidos na formação de um complexo de fusão activo. Para determinar o mecanismo da inibição da fusão e entrada virais pelos PA8-PA12 e PA14 testou-se a capacidade dos diferentes mAbs para bloquear a interacção gpl20/CCR5. Para esta finalidade utilizou-se um ensaio que detecta a ligação a células L1.2-CCR5+ de gpl20 de HIV-1JR-fl biotinilada complexada com sCD4. Não se observou ligação de gpl20 biotinilada na ausência de sCD4 ou CCR5, ou quando se utilizou gpl20 de HIV-1LAI (Fig. 6C) .

Exceptuando ο PA8, todos os mAbs anularam a ligação de gpl20/sCD4 a L1.2-CCR5+ (Fig. 6D). A inibição pelo PA8 ficou saturada a ~ 40%, o que está de acordo com os dados de citometria de fluxo (Figura 1) ao sugerir que este mAb se liga apenas a um subconjunto de moléculas CCR5 em 64 células L1.2-CCR5+. Os mAbs PA9, PAIO, PA11 e PA12 inibiram a ligação com valores IC5o de 0,24, 0,13, 0,33, 0,24 μg/mL, respectivamente (Figura 3). Surpreendentemente, os mAbs PA14 e 2D7 foram os dois inibidores menos eficientes da ligação de gpl20/sCD4, com valores IC5o de 1,58 e 1,38 μg/mL, respectivamente (Figura 3). Em consequência, não se observou nenhuma correlação entre a capacidade de um mAb para inibir a fusão membranar e entrada mediadas por gpl20/CD4/CCR5 e a sua capacidade para bloquear a ligação de gpl20/sCD4 ao co-receptor. 6) Inibição sinergética da fusão do HIV-1 por combinações de mAbs anti-CCR5 e outros inibidores da entrada virai

Agentes específicos para co-receptores podem actuar em múltiplas fases do processo de entrada e exibir efeitos não aditivos quando utilizados em combinação. De uma perspectiva clinica, é importante determinar as interacções de candidatos a fármacos específicos para co-receptores com quimioquinas endógenas, que podem conferir algum nível de protecção contra a progressão de doença. Em consequência, testaram-se os mAbs para o CCR5 em combinação entre si ou com a RANTES, ou com CD4-IgG2, que se liga à gpl20 do HIV-1 para inibir o acoplamento a células-alvo. Obtiveram-se curvas de resposta à dose para os agentes utilizados individualmente e em combinação com ensaios de fusão e entrada virais. Os dados foram analisados utilizando o princípio do efeito da mediana (9) . As concentrações dos agentes isolados ou suas misturas necessárias para produzir um dado efeito foram quantitativamente comparadas num termo conhecido como índice de Combinação (Cl). Um valor Cl superior a 1 indica antagonismo, Cl - 1 indica um efeito aditivo e Cl < 1 indica um efeito sinergético, em que a presença de um agente intensifica o efeito de outro. 65

Combinações de PA12 e 2D7 foram as mais potentes do ponto de vista sinergético, com valores Cl variando entre 0,02 e 0,29, dependendo da razão dos anticorpos (Fig. 7 e Figura 2) . Sabe-se gue o grau de sinergia varia com a estequiometria dos agentes. Os ensaios de entrada e fusão virais foram geralmente consistentes na identificação de combinações de mAbs que são altamente sinergéticas, PA12 e 2D/; moderadamente sinergéticas, PA12 e PA14; aditivas, PAI 1 e PAI 2, e fracamente antagonistas, PA14 e 2D7. A ausência de sinergia entre ο PA14 e 2D7 não é surpreendente, uma vez que estes mAbs competem de forma cruzada para a ligação a células CCR5+, como determinado por citometria de fluxo (dados não mostrados). A observação de um efeito aditivo do PA11 e PA12 pode ser uma indicação de que estes mAbs se ligam a epítopos ligeiramente diferentes do CCR5 partilhando uma dependência do resíduo Q4 do Nt.

Também se testou a capacidade dos mAbs PAI2, PA14 e 2D7 para actuarem de forma sinergética com RANTES no bloqueio da fusão célula-célula. Combinações de PA12 e RANTES exibiram sinergia moderada (Figura 2). Ο PA14 e 2D7 não exibiram sinergia com RANTES, o que é consistente com o facto destes mAbs serem inibidores da ligação e sinalização de RANTES (Fig. 5A, 5B). Por fim, testámos a ocorrência de sinergia entre os mAbs PAI2, PAI 4, 2D7 e CD4-IgG2, que interage com a gpl20. Observámos sinergia moderada entre PA12 e CD4-IgG2, mas nenhuma sinergia entre PA14 ou 2D7 e CD4-IgG2 (Figura 2).

Discussão Experimental

Seis mAbs IgGl anti-CCR5 murinos foram isolados e caracterizados. Enquanto PA8, PA9, PA11, PA12 e PA14 são 66 espécies moleculares distintas, ο PA9 e PAIO são indistinguíveis pelas análises e, em consequência, provavelmente serão o mesmo mAb. Todos os mAbs que foram isolados reconhecem epítopos conformacionais complexos, como é muitas vezes o caso de mAbs dirigidos contra proteínas nativas da superfície celular. Efectuou-se mapeamento de epítopos para todos os mAbs utilizando um painel de mutantes pontuais de alanina do CCR5. Presumiu-se que os resíduos que afectaram a ligação de todos os mAbs de forma semelhante causam perturbações conformacionais no co-receptor e não são uma parte constituinte dos epítopos dos mAbs. Foi mostrado que apenas dois desses resíduos, Y10 e Dll, afectam a entrada do HIV-1 (20, 52). Os epítopos de PA8, PA11 e PA12 estão localizados exclusivamente no domínio Nt. Consistente com este resultado, ο PA8 foi capaz de se ligar a um péptido do Nt biotinilado, contendo os resíduos D2 até R31, num ensaio ELISA (dados não mostrados). No entanto, ο PA11 e PAI2, cuja ligação dependeu fortemente apenas do Q4, não se ligaram ao péptido do Nt em solução (dados não mostrados). Uma possibilidade é que o péptido do Nt não adopta a conformação apropriada para o reconhecimento pelo PA11 e PAI 2, ao passo que a ligação do PA8 pode depender menos da conformação. Alternativamente, ο PA11 e PA12 podem interagir com resíduos que não foram mutados por nós, ou formar ligações fracas com aminoácidos localizados noutros domínios do CCR5, ou ligar-se a átomos da coluna vertebral peptídica cuja apresentação pode permanecer inalterada por mutagénese. Os anticorpos PA9, PAIO e PA14 reconheceram epítopos que incluíam resíduos dos domínios Nt e ECL2 do CCR5, ao passo que o epítopo de 2D7 estava localizado exclusivamente na ECL2. 67 0 epítopo de PA14 compreende D2 do Nt e R168 da ECL2, indicando que estes dois resíduos estão próximos um do outro no contexto de uma pegada do mAb. Podem mesmo interagir directamente um com o outro através das suas cargas opostas.

Os mAbs PA8-PA12 e PA14 coraram células CCR5+ com diferentes intensidades e de uma forma dependente do tipo de células. Todos os mAbs, exceptuando PA8, coraram > 90% das células L1.2-CCR5+, tendo a maior intensidade média da fluorescência sido observada com PA11 e PAI2. Todavia, PA14 e 2D7 coraram a percentagem mais elevada de PBMCs e também originaram as maiores intensidades médias da fluorescência nestas células. Hill et al. (28) caracterizaram recentemente um painel de mAbs anti-CCR5 que coraram de modo semelhante células transfectadas, mas apenas dois em oito coraram PBMCs e nenhum corou monócitos primários. Uma baixa afinidade para o CCR5 foi provavelmente responsável pela ausência de reactividade de dois dos mAbs com células primárias, mas era improvável que isto explicasse a falha dos outros quatro em reagir. No nosso painel de mAbs, observamos a coloração mais intensa de PBMCs pelos mAbs 2D7 e PAI4, que têm epítopos localizados inteiramente ou parcialmente nos primeiros dez resíduos da ECL2. Contudo, Hill et al. relatam que mAbs específicos para o Nt e ECL1 coram PBMCs, ao passo que mAbs para a ECL2 e ECL3 não coram PBMCs; assim, não se identificou um padrão consistente de reactividade. Uma explicação para a coloração específica para tipos de células por mAbs pode ser que PBMCs (e monócitos) activadas segregam quimioquinas CC que se ligam ao CCR5 da superfície celular, mascarando alguns epítopos de mAbs. No entanto, seria de esperar que isto fosse especialmente verdade para PA14 e 2D7, que são antagonistas 68 da mobilização de cálcio induzida por quimioquinas e presumivelmente competem com quimioquinas CC para a ligação ao CCR5. Ainda assim, estes mAbs coram PBMCs da forma mais intensa. Alternativamente, uma exposição diferencial de epitopos do CCR5 pode reflectir oligomerização de receptores especifica para tipos de células, associação com outras moléculas da superfície celular ou diferentes modificações pós-tradução, como glicosilação. Mostrámos que diferenças na ligação de mAbs provavelmente não reflectem diferenças específicas para tipos de células em interacções CD4/CCR5.

Os mAbs PA8-PA12 não inibiram a mobilização de cálcio induzida por quimioquinas CC em células CCR5+, nem mediaram a sinalização através do CCR5. Os mAbs 2D7 e PA14 foram inibidores da mobilização de cálcio induzida por quimioquinas, mas o 2D7 foi quase uma ordem de grandeza mais potente do que o PAI4. Isto pode dever-se ao epítopo do PA14 se sobrepor menos ao domínio de ligação de quimioquinas CC do CCR5 do que o epítopo do 2D7. Todos os mAbs também bloquearam a entrada do HIV-1 e fusão membranar mediada pelo envelope, mas a inibição da fusão célula-célula requereu, nalguns casos, uma quantidade de anticorpo quase duas ordens de grandeza maior do que o necessário para bloquear a entrada virai. Presumivelmente estabelecem-se mais interacções gpl20/CD4/CCR5, bem como interacções entre moléculas de adesão, que actuam de forma cooperativa durante a fusão célula-célula, em comparação com fusão vírus-célula, dificultando mais a inibição. Isto é habitualmente observado com anticorpos para LFA-1 ou para a glicoproteína de envelope do HIV-1 (45, 51) . 0 PA8, PA9 e PAIO foram incapazes de bloquear a fusão célula-célula em > 15% e a entrada virai em > 40%, mesmo às concentrações mais 69 elevadas dos anticorpos. No entanto, foi possível obter > 90% de inibição da fusão com PA11, PA12 e PAI4, e pôde obter-se > 90% de inibição da entrada com o PAI4. O mais potente dos seis mAbs no bloqueio da fusão e entrada foi o PAI4, que foi tão eficaz quanto o 2D7. Surpreendentemente, o PAI4 e 2D7 encontram-se entre os inibidores menos potentes da ligação de gpl20/sCD4 a células L1.2-CCR5+, ao passo que PA9-PA12 bloquearam com potências semelhantes e o PA8 foi incapaz de bloquear > 40% da ligação de gpl20/sCD4. Estas observações levantam questões acerca da natureza das moléculas de CCR5 apresentadas em diferentes células e acerca dos mecanismos de inibição da fusão e entrada virais. Pode dar-se o caso do CCR5 em células L1.2, utilizadas nos ensaios de ligação dos mAbs e gpl20, não estar numa conformação idêntica ao CCR5 em PBMCs, utilizadas no ensaio de ligação de mAbs, ou ao CCR5 em células PMl e U87MG, utilizadas nos ensaios de fusão e entrada. A baixa coloração de PBMCs e a inibição parcial da fusão e entrada por alguns dos nossos mAbs indicam que só são capazes de se ligar a um subconjunto de moléculas CCR5 expressas em linfócitos primários e linhas de células PMl e U87MG-CD4+CCR5+. Ainda assim, não contando com ο PA8, todos os mAbs conseguem corar > 90% das células L1.2-CCR5+ e bloquear completamente a ligação do complexo gpl20/sCD4 a estas células. Pelo menos uma diferença entre células L1.2-CCR5+ e as outras células que empregámos é a densidade da proteína do co-receptor na superfície celular. De facto, estimámos que as células L1.2-CCR5+ expressam 10 até 100 vezes mais co-receptor da superfície celular do que células PMl e U8 7MG-CD4+CCR5+. Mas quando células HeLa são manipuladas para expressar de forma transitória tanto co- 70 receptor quanto a linha de células L1.2-CCR5+, ainda não conseguimos detectar ligação de gpl20/sCD4 a elas (dados não mostrados). A super-expressão de CCR5 em L1.2, juntamente com outros factores específicos para células, poderá favorecer uma conformação do co-receptor que expõe o Nt de forma acentuada, tornando-o mais acessível a mAbs e gpl20. Essa conformação poderá ser induzida por oligomerização do receptor, por associações diminuídas ou alteradas a proteínas da superfície celular ou por interacções do receptor com proteínas G (25, 62). Será que coexistem na superfície celular múltiplas conformações do CCR5, e serão todas elas permissivas para a entrada virai? Os padrões de reactividade dos mAbs sugerem-no, uma vez que pode ocorrer entrada e fusão do HIV-1, apesar de em níveis reduzidos, na presença de concentrações de mAbs que saturam epítopos necessários para a ligação da gpl20 a células Ll.2-CCR5+. Favorecemos a hipótese das moléculas do co-receptor presentes em células L1.2-CCR5+ possuírem uma conformação competente para a entrada do HIV-1, ao passo que moléculas de CCR5 em PBMCs, PM1 e CCR5+ U87MG existem em múltiplos estados competentes para a entrada que exibem diferentes react ividades com mAbs. Ο PA14 e 2D7 podem reconhecer todas as conformações; outros mAbs poderão não o fazer. Ainda não foi determinado o motivo por que células L1.2 conduzem a uma conformação particular competente para a fusão.

Foi recentemente demonstrado que o domínio de ligação da gpl20 se situa nos primeiros vinte resíduos do domínio Nt do CCR5. Os mAbs para o domínio de ligação da gpl20 do CCR5 bloqueiam de forma potente esta interacção, mas não são tão eficazes, nem de perto, na inibição da fusão e entrada do HIV-1 em células-alvo quanto ο PA14 e 2D7, cujos 71 epítopos se situam fora desta região. 0 PA14 reconhece a ponta do Nt e resíduos da ECL2, ao passo que o epítopo do 2D7 está localizado exclusivamente na ECL2. 0 mecanismo de acção destes mAbs só pode ser especulado. Pode dar-se o caso da sua ligação aos primeiros resíduos da ECL2 induzir alterações conformacionais no co-receptor que previnem a fusão membranar. Alternativamente, a obstrução de epítopos da ECL2 poderá impedir a oligomerização do co-receptor e a formação de um complexo de proteína competente para a fusão. Ainda outra possibilidade é os resíduos da ECL2 se encontrarem de frente para o interior do poro da fusão e a ligação dos mAbs impedir a gp41 de inserir o péptido de fusão na membrana plasmática. Em contraste, os mAbs PA8-PA12 provavelmente inibem a fusão e entrada apenas por competição directa para a ligação a complexos gpl20/CD4. Desconhecemos se parâmetros diferentes da exposição e afinidade de epítopos para o CCR5 determinam a eficácia da inibição da entrada virai por estes mAbs. Não é claro o motivo por que passos de inibição subsequentes à interacção gpl20/co-receptor seriam mais eficientes do que o bloqueio directo dessa interacção. Um modo de explicá-lo consistiria em presumir que a velocidade de dissociação da ligação da gpl20 ao CCR5 é muito mais baixa do que a velocidade de associação da ligação do mAb ao CCR5. Assim, de cada vez que um mAb se separa de uma molécula do co-receptor, uma molécula gpl20 associada a viriões substitui-o de um modo quase irreversível, pois esta interacção conduz a fusão membranar. A sinergia existente entre combinações de mAbs anti-CCR5 resulta provavelmente das suas interacções com epítopos distintos que estão envolvidos em passos interdependentes e consecutivos da entrada do HIV-1. 0 grau 72 de sinergia observado entre ο PA12 e 2D7 (Cl < 0,1 em muitas circunstâncias) é extraordinário, pois valores Cl < 0,2 são raramente observados para combinações de anticorpos anti-HIV-1 (33, 35, 61), inibidores da transcriptase reversa (29) ou inibidores de proteases (44). Devido à sua potência, examinou-se a combinação PA12:2D7 em múltiplos formatos de ensaios e razões de concentrações, para os quais se observaram consistentemente niveis elevados de sinergia. Observou-se sinergia moderada para PA12 combinado com PAI4. Também observámos sinergia moderada entre PA12 e CD4-IgG2. O complexo CD4/gpl20 é metastável e, se for incapaz de interagir com um co-receptor, decai para um estado não fusogénico (45-48). Uma vez que ο PA12 bloqueia directamente o sitio de ligação da gpl20 no CCR5, a sua presença pode desviar o equilíbrio para inactivação do complexo gpl20/CD4. Isto explicaria o motivo porque observamos sinergia entre CD4-IgG2 e o mAb PA12 relativamente à inibição da fusão e entrada. A ausência de sinergia entre o mAb PA14 e CD4-IgG2 sugere que actuam em dois passos não consecutivos e independentes da entrada virai. Será necessária uma combinação de mais estudos para determinar os mecanismos precisos da sinergia dos diferentes compostos relativamente à inibição da fusão e entrada virais.

Os resultados acima são consistentes com um modelo em que a entrada do HIV-1 se dá em três passos distintos envolvendo a ligação do receptor, ligação do co-receptor e fusão membranar mediada pelo co-receptor. Os acontecimentos separados de ligação do co-receptor e fusão são sugeridos pela ausência de correlação entre as capacidades dos anticorpos monoclonais para bloquearem a ligação da gpl20 e fusão/entrada do HIV-1. A cronologia dos acontecimentos 73 durante a fusão é suplementarmente sugerida pelos padrões de sinergia observados. Agentes, como o PAI2, que inibem de forma potente o passo intermédio do processo, nomeadamente a ligação da gpl20, actuam de forma sinergética com inibidores dos passos anterior e subsequente.

Exemplo 2

Contexto. A incidência crescente de HIV-1 resistente a múltiplos fármacos impõe a pesquisa de novas classes de agentes antiretrovirais. 0 CCR5 é um co-receptor da fusão necessário para isolados primários do HIV-1 e proporciona um alvo promissor para terapia antiviral. 0 PRO140 é um anticorpo monoclonal anti-CCR5 que inibe de forma potente a entrada e replicação do HIV-1 a concentrações que não afectam a actividade do receptor de quimioquinas de CCR5 in vitro. No presente estudo avaliámos o potencial terapêutico do PRO 140 in vivo utilizando um modelo de animal terapêutico de infecção pelo HIV-1. Métodos. Ratinhos CD-17 SCID foram reconstituídos com PBMCs humanas normais e infectados com o isolado R5 do HIV-1 JR-CSF. Quando se atingiu o estado estacionário virai, os animais foram tratados intraperitonealmente com PRO 140 ou anticorpo de controlo e foram monitorizados quanto à carga virai utilizando o ensaio Amplicor da Roche. Em estudos iniciais examinámos uma única dose de 1 mg de PRO140. Em estudos de múltiplas doses, o PRO 140 foi administrado uma vez de três em três dias durante três semanas a doses que variaram entre 0,1 - 1,0 mg. Numa experiência separada utilizou-se citometria de fluxo para examinar o potencial de depleção de linfócitos após injecção do PRO 140. 74

Resultados. 0 PRO 140 numa única dose e em múltiplas doses reduziu as cargas virais para níveis indetectáveis em todos os animais tratados, e as reduções da carga virai perfizeram 1,8 log 10. Observou-se um controlo transitório da replicação virai após uma única injecção de PRO 140, ao passo que múltiplas injecções conduziram a controlo prolongado sem evidências de exacerbação virai durante a terapia. Observaram-se diferenças dependentes da dose da cinética das reduções da carga virai mediadas pelo PRO 140. A análise de citometria de fluxo revelou que o tratamento com PRO 140 não conduziu a depleção de linfócitos, confirmando que o impacto na replicação virai in vivo se deveu apenas ao bloqueio do CCR5.

Conclusões. O PRO 140 é altamente eficaz no controlo de infecção pelo HIV-1 estabelecida no modelo de ratinho hu-PBL-SCID de infecção pelo HIV-1. Estas descobertas proporcionam prova de conceito in vivo para a terapia com PRO 140 em particular e para terapia com inibidores do CCR5 em geral.

Exemplo 3 Métodos

Testou-se um anticorpo para o CCR5 humanizado (huPRO 140) quanto à capacidade para bloquear a mobilização de cálcio induzida pela RANTES em células L1.2-CCR5 e a capacidade para bloquear a replicação de HIV-1 CASE C 1/85 em PBMCs humanas utilizando métodos descritos aqui.

Resultados 75

Os resultados, apresentados na Figura 19, mostram que o anticorpo para o CCR5 humanizado bloqueia de forma potente o HIV-1 mas não a RANTES.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS Λ O \—1 \—1 V Progénies Pharmaceuticals, Inc. et al. <120> Anticorpo Anti-CCR5 <130> 2048/57906-D-PCT <140> PCT/US03/05500 <141> 21.02.2003 <150> 10/081,128 <151> 22.02.2002 <16 0> 13 <17 0> Patent In versão 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> HUMANA <40 0> 1

Het A$p Tyr Gin vai Ser Ser Pro II® Tyr Asp 11® Asn Tyx Tyr Thr i S 10 15

Ser 61 u Pro Cys Gin Lys lie Aso Lys Gin Xle Ala Ala Ala Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> HUMANA <40 0> 2

His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gin 15 10 15 85

<210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> HUMANA <400> 3

Arg Ser Gin Lys Glu Gly Leu Bis Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro

Arg Ser Gin Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro 1 S 10 IS

Tyr Ser Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn Phe Gin 20 25

<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> HUMANA <400> 4

Gin GI« Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp 1 S 10 IS

Gin

<210> 5 <211> 429 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tctagsceae estgaagttg cctgttaggc tgttggtgct gatgttctgg attcctgett €0 ceagcagtga tattgtgatg aeecaatete eaetefceeet gectgtcsct ectggaçagç 120 cagcctccat ctcttgcaga tetagtcsgc gccttetgag cagttatgga catacctatt 180

Eacatfcggta ectacagaag ccaggccagt ctccecaçct eetgatctse gaagt.ttcca 240 accgsttttc tggggtceea gaçaggfetca gtggçagtgg gicagggaea gatttcaeac 300 ttaagatcag tagagtggag gctgaggatg tgggagttta ttactçctct caaagtacac 360 atgttectet eacgttcgga eaggggacea aggtggaaat aaaacgfcaag tagtcttcte 430 sactctaga 4Í4 <210> 6 86

<211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 i4et Lys Leu Fr© Vai Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Fr© Ala l 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Fr© Val 20 25 30 Tbr Fr o Gly Giu Fro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Arg Leu 35 40 45 heu Ser Ser Tyr Gly Ms Tbr Tyr Leu Hís Trp Tyr Leu Gin Lys Pr© 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Vai Fr© Asp Ar 9 Phe Ser Gly Ser Gly Ser GXy Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys ile Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 1ÔS 110 Ser Gin Ser Thr Hia Val Fro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai 115 120 125 Glu Ile Lys 130

<210> 7 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atg*agttgc ctgttaggct gttggtge-tg atgttetgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 afctgtgafcga eeesstctec actcteeeíg ectgtcscte etggagagcc agcctceate 120 tcttgcagst ctagtcagcg ccttctgagc agttatggae atacctattt acattggtac 180 ctacagaagc caggccagtc tccacagctc ctgatctacg aagtttecaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtggg tcagggacag acttcacact ta&gatc&gt 300 agagtggagg ctgaggatgt gggagtttat fcactgctcte aaagtacaea tgttcetctc 360 acgttcggac aggggaccas ggtggasata asa 333 87

<210> 8 <211> 457 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 acgcgtccac eafcggaatgg ageggagtet ttatetttct cctgtcagta actgcsggfcg 60 gfcggagtctg gtggaggctt ggtaasgcct ggaggttccc íxtggttaca ctttçâgtaa ctattggatc ggatgagícc 120 ISO 240 300 3£0 420 teeactccga ggtfcagctg ttagactctç ctgtgcagcc gccaggetcc sggeaaaggg tcaggaacaa tgagaagttc cscfcctatct geaaacgaae gcegettcgg fcagtaaetae ctggagtgga ttggcgarat aaggacaaga ceaccctg-tc agcctgasaa ccgaggacac gtgttcgcct ggtttactta ctaccctgga gggsaersça sgcagatact tccaagaaca agccgtgtat tactgtggaa ctggggccaa gggactctgg tcacagtctc ctcaggtgag tccttaaaac ctctaga <57

<210> 9 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Glu Trp Ser Gly Vai Phe Ile pbe Lee Leu Ser vai Thr Ala Gly l 5 10 15

Vai Ris Ser Glu Vai Gin Leu Vai Giu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys 20 25 30

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Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Aso Tyr Ils Arg Asm Asn ¢5 70 ?5 S0

Glu Lys Phe Lys Asp Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asm 85 SC 95

Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Âsp Thr Ala Vai 100 .105 iTO

Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ser Asn Tyr Vai Phe Ala Trp Fhe 115 120 125

Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr v®l Ser Ser 130 135 140 88

<210> 10 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <40 0> 10 atggaatgga gcggagfcett tatcttcctc etgteagtas ctgcaggtgt ccactccgsç ¢0 gtgeagctgg tggagtctgg tggaggcttg gtaaagectg gaggttccet tsgactctec 120 tgtgcagcct ctggttacae tttcagtaac tattgfâtcg gatgggtcçg ccaggctcca 160 ggcaaagggc tggagtggat tggegstatc taecetggag ggaectscat ceggaacaat 240 gagaagfctea aggacaagat: caccctgtca gcagatactt ccaagaaeac ageetatctg 300 cs&atgaaca gcctgaaaac cgaggaeaea gecgtgtatt actgtggaag cagcttcggc 360 agtasetacg tgttcgcctg gtttacttac tggggceaag ggactctggt cacagtctcc 420 tca 423

<210> 11 <211> 457 <212> DNA <213> Homo sapiens <40 0> 11 tctagaccac catggaatgg agcggggtet ttatctttct cctgteagta actgcaggCg 60 tccactccea ggtccaactg gtgcagtctg gacctçatgt gaaaaagcct gggacttcaa 120 tgaagatgte ctgcaagaeg tctggataea cettcagtaa ctattggste ggatgggtta 180 ggcaggcgce tggaceaggc ettgagtgga ttggagatst ttacectgga gggaactata 240 tcaggaacas tgagsagttç aaggacâag® ccaesçtgaç ggçagaçaca cçgaçcagca 300 cggcctacat gcaacttggc agcetgagat ctgaagacae tgccgtctat tactgtggaa 360 gcagcttegg tagteaetae gtgttegcct ggtttsctta ctggggecas gggaetctgg 420 tcacagtctc ctcaggtgag tccttaaaac ctctaga 457

<210> 12 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens 89 <400> 12 Vâl His Sei Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pio Asp Vai Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Thr ser «et Lys Met Ser cys Lys Thr ser Gly Tyr Thr Phe 3$ 40 45

Ser Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Vai ftrg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 S5 60

Glu Trp Xle Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asn Tyr He Arg Asn Asn 65 70 75 80

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Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Bhe Gly Ser Asn Tyr Vai Phe Ala Trp Phe 115 ISO 125

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<210> 13 <211> 423 <212> DNA <213> Homo sapiens <40 0> 13 atgesâtgga geggggtctt t&tctttctc ctgtcsgtáa ctgeaggtgt ceàctee&sg 60 gtccaactgg tgeagtctgg acctgatgtg aaaaagcctg ggaettcaat gaagatgtee 120

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Lisboa, 5 de Fevereiro de 2009

Claims (46)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-CCR5 que compreende (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVK:HuPROl40-Vk, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou de um plasmideo designado pVg4: HuPROl40 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, ou um fragmento desse anticorpo anti-CCR5 que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana e inibe a fusão e entrada do HIV-1.

2. Anticorpo anti-CCR5 da Reivindicação 1, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão do plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098.

3. Anticorpo anti-CCR5 da Reivindicação 1, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão do plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099.

4. Anticorpo anti-CCR5 compreendendo duas cadeias leves, em que cada cadeia compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 6, e duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na ID SEQ NO: 9 ou ID SEQ NO: 12. 2

5. Anticorpo cadeia pesada apresentada na

6. Anticorpo cadeia pesada apresentada na anti-CCR5 da compreende ID SEQ NO: 9. anti-CCR5 da compreende ID SEQ NO: 12 Reivindicação a sequência Reivindicação a sequência 4, em que cada de aminoácidos 4, em que cada de aminoácidos

7. Ácido nucleico seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende aminoácidos consecutivos, cuja sequência de aminoácidos está apresentada nas ID SEQ NOs: 6, 9 ou 12; (b) um ácido nucleico que compreende a sequência apresentada nas ID SEQ NOs: 5, 8 ou 11, e (c) um ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende aminoácidos consecutivos, em que os aminoácidos consecutivos são os aminoácidos expressos por um plasmideo designado pVK:HuPRO140-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, um plasmideo designado pVg4:HuPROl40 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099.

8. Ácido nucleico da Reivindicação 7, em que o ácido nucleico é RNA, DNA ou cDNA.

9. Composição que compreende pelo menos um de entre o anticorpo anti-CCR5 ou o fragmento desse anticorpo anti-CCR5 de qualquer uma das Reivindicações 1-6 e pelo menos um agente anti-HIV. 3

10. Composição da Reivindicação 9, em que o agente anti-HIV é seleccionado do grupo que consiste em inibidores da transcriptase reversa não nucleotidicos, inibidores da transcriptase reversa nucleotidicos, inibidores de proteases e inibidores da entrada virai.

11. Composição que compreende pelo menos um de entre o anticorpo anti-CCR5 ou o fragmento desse anticorpo anti-CCR5 de qualquer uma das Reivindicações 1-6 e um transportador.

12. Composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-CCR5 ou fragmento desse anticorpo anti-CCR5 de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-6 ao qual está ligado um material seleccionado do grupo que consiste em isótopos radioactivos, toxinas, polietilenoglicol, agentes citotóxicos e etiquetas detectáveis.

13. Método in vitro para inibir infecção pelo HIV-1 de uma célula CD4+, que compreende contactar a célula CD4+ com um anticorpo que compreende (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVK:HuPRO140-Vk, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou de um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, ou um fragmento desse anticorpo anti-CCR5 que se liga ao CCR5 na superfície da célula CD4+ e inibe a fusão e entrada do HIV-1, numa quantidade e em condições tais que a fusão do HIV-1, ou de uma célula infectada com o HIV-1, à célula CD4+ é inibida, desse modo inibindo infecção pelo HIV-1 da célula CD4+. 4

14. Utilização de um anticorpo anti-CCR5 que compreende (i) duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVK:HuPRO140-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou de um plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, ou um fragmento desse anticorpo anti-CCR5 que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana e inibe a fusão e entrada do HIV-1, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de um sujeito infectado com o HIV-1 ou destinada a prevenir que um sujeito fique infectado com o HIV-1.

15. Utilização da Reivindicação 14, que também compreende administrar ao sujeito pelo menos um agente anti-HIV.

16. Utilização da Reivindicação 14, que também compreende administrar ao sujeito a composição farmacêutica de forma concomitante ou subsequente à administração ao sujeito de pelo menos um agente anti-HIV.

17. Utilização da Reivindicação 14, em que a dosagem do referido anticorpo anti-CCR5 varia desde 0,1 até 100 000 μq/'kq de peso do corpo do sujeito.

18. Utilização da Reivindicação 14, em que a dosagem do anticorpo anti-CCR5 não inibe a actividade de quimioquinas endógenas no receptor CCR5 do sujeito.

19. Conjugado de anticorpo anti-CCR5 compreendendo um anticorpo anti-CCR5 que compreende (i) duas cadeias leves, 5 em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVK:HuPROl40-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou de um plasmídeo designado pVg4:HuPR0140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, ou um fragmento desse anticorpo anti-CCR5 que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana e inibe a fusão e entrada do HIV-1, conjugado a pelo menos um polímero.

20. Conjugado de anticorpo anti-CCR5 da Reivindicação 19, em que o polímero é seleccionado do grupo que consiste em polímeros de polivinilo hidrófilos, éteres de polialquileno, polioxialquilenos, polimetacrilatos, carbómeros, polissacáridos ramificados, polissacáridos não ramificados, polímeros de álcoois de açúcares, heparina e heparona.

21. Conjugado de anticorpo anti-CCR5 da Reivindicação 20, em que o polímero é polietilenoglicol (PEG) ou respectivo derivado.

22. Conjugado de anticorpo anti-CCR5 da Reivindicação 21, em que o PEG tem um peso molecular médio de pelo menos 20 kD.

23. Conjugado de anticorpo anti-CCR5 de qualquer uma das Reivindicações 19 até 22, em que o peso molecular médio do conjugado é pelo menos 500 kD.

24. Utilização de um conjugado de anticorpo anti-CCR5 compreendendo um anticorpo anti-CCR5 que compreende (i) 6 duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende o produto de expressão de um plasmídeo designado pVK:HuPRO 140-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e (ii) duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende o produto de expressão de um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou de um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, ou um fragmento desse anticorpo anti-CCR5 que se liga ao CCR5 na superfície de uma célula humana e inibe a fusão e entrada do HIV-1, conjugado a pelo menos um polimero, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a inibir infecção pelo HIV-1 de uma célula CCR5+ de um sujeito em risco de contrair infecção pelo HIV-1, ou destinada ao tratamento de uma infecção pelo HIV-1 num sujeito.

25. Utilização da Reivindicação 24, em que a composição farmacêutica se destina a ser administrada ao sujeito com pelo menos outro agente anti-HIV.

26. Utilização da Reivindicação 24, em que a composição farmacêutica se destina a ser administrada ao sujeito de forma concomitante ou subsequente à administração de outro agente anti-HIV.

27. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 14 até 18 ou 24 até 26, em que a composição farmacêutica se destina a ser administrada ao sujeito por um método intravenoso, intramuscular ou subcutâneo.

28. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 14 até 18 ou 24 até 27, em que a composição farmacêutica se 7 destina a ser administrada ao sujeito de forma contínua ou em intervalos periódicos predeterminados.

29. Célula-hospedeiro transformada compreendendo pelo menos dois vectores, em que pelo menos um vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5 e pelo menos um vector compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-CCR5, em que o anticorpo anti-CCR5 compreende duas cadeias pesadas, cada uma com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 9 ou 12, e duas cadeias leves, cada uma com a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 6.

30. Célula-hospedeiro transformada da Reivindicação 29, em que a célula é uma célula de mamífero.

31. Célula-hospedeiro transformada da Reivindicação 30, em que a célula de mamífero é uma célula COS, uma célula CHO ou uma célula de mieloma.

32. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 31, em que a célula segrega o anticorpo anti-CCR5.

33. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 32, em que o vector que codifica uma cadeia pesada é designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH , N° do Depósito da ATCC PTA-4098.

34. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 32, em que o vector que codifica uma cadeia pesada é designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099.

35. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 32, em que o vector que codifica uma cadeia leve é designado pVK:HuPROl40 -VK , N° do Depósito da ATCC PTA-4097.

36. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 32, em que a sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada tem a sequência de ácido nucleico apresentada na ID SEQ NO: 8.

37. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 32, em que a sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada tem a sequência de ácido nucleico apresentada na ID SEQ NO: 11.

38. Célula-hospedeiro transformada de qualquer uma das Reivindicações 29 até 3 2, em que a sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve tem a sequência de ácido nucleico apresentada na ID SEQ NO: 5.

39. Vector que compreende o ácido nucleico da Reivindicação 7 ou 8.

40. Processo para a produção de um anticorpo anti-CCR5, que compreende cultivar uma célula-hospedeiro que contém (i) um plasmideo designado pVK:HuPROl40-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097 e (ii) um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou um plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, em condições que permitam a 9 produção de um anticorpo compreendendo duas cadeias leves, cada uma codificada pelo plasmideo designado pVK:HuPRO140-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e duas cadeias pesadas, cada uma codificada pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, de modo a produzir um anticorpo anti-CCR5.

41. Processo para a produção de um anticorpo anti-CCR5, que compreende: (a) transformar uma célula-hospedeiro com (i) um plasmideo designado pVK:HuPRO140-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097 e (ii) um plasmideo designado pVg4:HuPROl40 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou um plasmideo designado pVg4:HuPR014 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, e (b) cultivar a célula-hospedeiro transformada em condições que permitam a produção de um anticorpo compreendendo duas cadeias leves, cada uma codificada pelo plasmideo designado pVK:HuPROl40-VK, N° do Depósito da ATCC PTA-4097, e duas cadeias pesadas, cada uma codificada pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 HG2-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4098, ou pelo plasmideo designado pVg4:HuPRO140 (mut B+D+I)-VH, N° do Depósito da ATCC PTA-4099, de modo a produzir um anticorpo anti-CCR5.

42. Método da Reivindicação 40 ou 41, que também compreende recuperar o anticorpo anti-CCR5 produzido desse modo. 10

43. Processo de qualquer uma das Reivindicações 40 até 42, em que a célula-hospedeiro é uma célula de mamifero.

44. Processo da Reivindicação 43, em que a célula de mamifero é uma célula COS, uma célula CHO ou uma célula de mieloma.

45. Polipéptido codificado pelo ácido nucleico da Reivindicação 7 ou 8 ou que pode ser obtido pelo processo de qualquer uma das Reivindicações 40 até 44.

46. Estojo para utilização num processo de produção de um anticorpo anti-CCR5, que compreende: (a) um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 6, e (b) um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 9, ou um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CCR5, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na ID SEQ NO: 12. Lisboa, 5 de Fevereiro de 2009