抗CCR5抗体
本申请是2002年2月22日提交的美国申请序列号10/081,128的部分继续申请并要求其优先权,在此将其内容结合于本申请作为参考。
贯穿本申请,以阿拉伯数字提及了多份出版物。在紧邻权利要求之前的说明书末尾可以找到这些出版物的完整引述。在此将这些出版物的公开内容结合于本申请作为参考,从而更加完整的描述本发明所属领域。
发明背景
1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)诱导病毒-细胞膜融合,从而能够进入靶细胞(8,15,66)。病毒粒体与细胞表面之间的第一步高亲和力相互作用是病毒表面糖蛋白gp120结合CD4抗原(13,30,41,42),继而诱导gp120的构象变化,使之能够与几种趋化因子受体之一相互作用(4,5,21,36)。CC趋化因子受体CCR5是巨噬细胞向性(R5)毒株的主要辅助受体(co-receptor),并且在HIV-1的有性传播中发挥关键作用(4,5,21,36)。T细胞系向性(X4)病毒利用CXCR4进入靶细胞,并且常常而非总是在疾病进展中较晚显现或者作为组织培养中病毒繁殖的结果(4,5,21,36)。有些原代HIV-1分离株具有双重向性(R5X4),因为它们能够利用这两种辅助受体,尽管效率并非总是相同(11,57)。偶联gp120核晶体结构解析的诱变研究证明gp120上的辅助受体结合位点包含几个保守残基(32,53,65)。
已经证明CCR5氨基末端结构域(Nt)的酪氨酸和带负电残基是gp120结合辅助受体以及HIV-1融合和侵入所必需的(6,18,20,22,28,31,52,54)。CCR5胞外环(ECL)1-3中的残基不是辅助受体功能所必需的,然而,为了实现最佳病毒融合和侵入,必需维持CCR5结构域间构型(24)。从而得出结论:gp120与ECL的扩散表面形成相互作用,或者通过与ECL中残基的键合来维持Nt的功能构象。嵌合辅助受体与抗CCR5 单克隆抗体的研究也显示了胞外环对病毒侵入的重要性(5,54,64)。
特异结合CCR5和CXCR4并阻断与其配体相互作用的分子是进一步探查辅助受体结构/功能相互关系的有效工具。鉴定这些化合物也有助于设计靶向由辅助受体介导的病毒侵入步骤的有效治疗剂。至今鉴定的CCR5或CXCR4辅助受体功能抑制剂在本质上是多样的,包括小分子、肽、趋化因子及其衍生物、和单克隆抗体(mAb)。通过干预CXCR4辅助受体功能而阻断侵入的小分子的作用机制尚未深入理解(17,49,55,68)。这样的一种抑制剂即阴离子小分子AMD3100依赖CXCR4的ECL2和第四个跨膜(TM)结构域中的残基来抑制病毒侵入,但是尚不清楚它是通过破坏gp120结合CXCR4还是通过导致膜融合的结合后步骤来实现的(16,34,55)。至今尚无报道特异阻断由CCR5介导的HIV-1侵入的小分子。趋化因子抑制HIV-1侵入是由至少两种不同机制介导的:gp120/辅助受体相互作用的阻断和趋化因子/受体复合物的内在化(3,26,59,63)。变体AOP-RANTES也抑制CCR5循环至细胞表面(40,56)。变体诸如RANTES9-68和Met-RANTES只防止gp120/CCR5相互作用,而并不下调CCR5(67)。SDF-1变体大概通过相似机制作用而阻断由CXCR4介导的病毒侵入(12,27,39)。只有一种抗CXCR4单抗即12G5已经鉴定了其抗病毒特性。已经报道了12G5抑制病毒侵入的效率既依赖细胞又依赖分离株(43,58)。这种单抗结合CXCR4的ECL2,但是尚不知道它抑制侵入的机制(7)。至今鉴定的少数抗CCR5单抗有效预防HIV-1侵入(28,64)。有趣的是,表位位于CCR5Nt结构域(包含gp120结合位点)中的单抗抑制病毒融合和侵入的效率不如表位位于ECL2中的单抗2D7。2D7还拮抗CC趋化因子活性(64)。
已经分离和鉴定了一组六种鼠单抗,命名为PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14。所有六种单抗都特异结合CCR5+细胞,但是效率不同且依赖细胞类型。表位作图研究确定了对单抗结合重要的残基,还揭示了关于折叠和CCR5胞外结构域相互作用的信息。所有单抗都抑制HIV-1融合和侵入,但是在单抗抑制融合和侵入的能力与其抑制gp120/sCD4结合CCR5+ 细胞的能力之间没有关联。
发明概述
本发明提供了抗CCR5抗体或其结合人类细胞表面上CCR5的片段,所述抗体包含(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物。
本发明还提供了包含两条轻链和两条重链的抗CCR5抗体,其中每条轻链包含连续氨基酸,其氨基酸序列在SEQ ID NO:6中列出,每条重链包含连续氨基酸,其氨基酸序列在SEQ ID NO:9中列出。
本发明还提供了包含两条轻链和两条重链的抗CCR5抗体,其中每条轻链包含连续氨基酸,其氨基酸序列在SEQ ID NO:6中列出,每条重链包含连续氨基酸,其氨基酸序列在SEQ ID NO:12中列出。
本发明还提供了编码包含连续氨基酸的多肽的分离核酸,SEQ IDNO:6列出了其氨基酸序列。在本实施方案中,核酸包含SEQ ID NO:5所列出的序列。
本发明还提供了编码包含连续氨基酸的多肽的分离核酸,SEQ IDNO:9列出了其氨基酸序列。在本实施方案中,核酸包含SEQ ID NO:8所列出的序列。
本发明还提供了编码包含连续氨基酸的多肽的分离核酸,SEQ IDNO:12列出了其氨基酸序列。在本实施方案中,核酸包含SEQ ID NO:11所列出的序列。
本发明还提供了包含至少一种上文所述的抗CCR5抗体或其片段以及载体的组合物。
本发明还提供了包含抗CCR5抗体或其片段且其附着于诸如放射性同位素、毒素、聚乙二醇、细胞毒性试剂和/或可检测标记物等材料的组合物。
本发明还提供了抑制CD4+细胞的HIV-1感染的方法,包括使CD4+细胞接触抗CCR5抗体或其结合CD4+细胞表面上CCR5的片段,这些抗体包含(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO 140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒 pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO 140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,接触的数量和条件使得HIV-1或HIV-1感染细胞与CD4+细胞的融合得到抑制,从而抑制CD4+细胞的HIV-1感染。
本发明还提供了治疗受HIV-1之苦的受试者的方法,包括对受试者施用有效HIV-1治疗剂量的抗CCR5抗体或其结合人类细胞表面上CCR5的片段,这些抗体包含(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,施用的条件使得有效治疗HIV-1感染受试者。
本发明还提供了预防受试者免于感染HIV-1感染的方法,包括对受试者施用有效HIV-1感染预防剂量的抗CCR5抗体或其结合人类细胞表面上CCR5的片段,这些抗体包含(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(2)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,施用的条件使得在受试者中有效预防HIV-1感染。
本发明还提供了包含抗CCR5抗体或其结合人类细胞表面上CCR5的片段且其偶联至少一种聚合物的抗CCR5抗体偶联物,所述抗体包含(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物。
本发明还提供了抑制HIV-1感染CCR5+细胞的方法,包括对有HIV-1感染风险的受试者施用上文所述偶联物,施用的数量和条件有效抑制HIV-1感染受试者的CCR5+细胞。
本发明还提供了治疗受试者中的HIV-1感染的方法,包括对HIV-1感染受试者施用上文所述偶联物,施用的数量和条件有效治疗受试者的 HIV-1感染。
本发明还提供了包含至少两种载体的转化宿主细胞,其中至少一种载体包含编码抗CCR5抗体重链的核酸序列,且至少一种载体包含编码抗CCR5抗体轻链的核酸序列,其中抗CCR5抗体包含具有SEQ ID NO:9所列出的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:6所列出的氨基酸序列的两条轻链。
本发明还提供了包含至少两种载体的转化宿主细胞,其中至少一种载体包含编码抗CCR5抗体重链的核酸序列,且至少一种载体包含编码抗CCR5抗体轻链的核酸序列,其中抗CCR5抗体包含具有SEQ ID NO:12所列出的氨基酸序列的两条重链和具有SEQ ID NO:6所列出的氨基酸序列的两条轻链。
本发明还提供了包含编码抗CCR5抗体重链的核酸序列的载体,其中重链包含SEQ ID NO:9所列出的氨基酸序列。
本发明还提供了包含编码抗CCR5抗体重链的核酸序列的载体,其中重链包含SEQ ID NO:12所列出的氨基酸序列。
本发明还提供了用于生产抗CCR5抗体的方法,包括在容许生产抗体的条件下培养宿主细胞从而生产抗CCR5抗体,所述宿主细胞包含(i)质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097),和(ii)质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099),所述抗体包含由质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)编码的两条轻链和由质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)编码的两条重链。
本发明还提供了用于生产抗CCR5抗体的方法,包括:a)用(i)质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)和(ii)质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)转化宿主细胞;并b)在容许生产抗体的条件下培养转化宿主细胞从而生产抗CCR5抗体,所述抗体包含由质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号 PTA-4097)编码的两条轻链和由质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)编码的两条重链。
本发明还提供了用于生产抗CCR5抗体的方法中的试剂盒,包含:a)包含编码抗CCR5抗体轻链的核酸序列的载体,其中轻链包含SEQ ID NO:6所列出的氨基酸序列;和b)包含编码抗CCR5抗体重链的核酸序列的载体,其中重链包含SEQ ID NO:9所列出的氨基酸序列,或者包含编码抗CCR5抗体重链的核酸序列的载体,其中重链包含SEQ ID NO:12所列出的氨基酸序列。
附图简述
图1:抗CCR5单克隆抗体与CCR5+细胞的结合
使用流式细胞计量术来检测L1.2-CCR5+细胞和新鲜分离的PHA/IL-2刺激PBMC表面的CCR5蛋白质表达。将细胞与饱和浓度的每种mAb一起温育,并用PE标记的抗小鼠IgG报道抗体进行检测。显示了来自代表性实验的结果。每种mAb的结果表述成平均荧光强度(m.f.i.)和选通细胞%两种形式。由于PA8-PA12及PA14都属于IgG1亚类,因此可以直接比较它们的m.f.i.。2D7属于IgG2a。
图2:不同mAb与病毒抑制剂组合的CI值
对病毒侵入抑制剂的不同组合进行像图7图例中所描述的实验。测试抗CCR5 mAb彼此、与CC趋化因子、和CD4-IgG2(抑制HIV-1附着于靶细胞)的组合。PA11和PA12浓度范围为0-250μg/ml;2D7和PA14浓度范围为0-25μg/ml;RANTES浓度范围为0-250ng/ml;CD4-IgG2浓度范围为0-25μg/ml。在数量上比较产生50%和90%融合或侵入抑制所需要的单一试剂或其混合物的浓度即称为联合指数(Combination Index,CI)的术语。
图3:抗CCR5mAb抑制细胞-细胞融合、病毒侵入和gp120/sCD4结合的IC50值
出于比较目的,我们总结了在测试抗CCR5 mAb的不同测定中获得的IC50值。只对能够抑制>90%融合、侵入或结合的mAb计算IC50值。
图4:抗CCR5 mAb的表位制图
将双色染色方案用于评估mAb与C末端以HA肽标记的突变体CCR5蛋白质的结合。将表达CCR5点突变体的HeLa细胞与饱和浓度的每种mAb一起温育,随后检测经PE标记的抗小鼠IgG。通过用FITC标记抗HA mAb双重染色细胞来测量细胞表面的辅助受体表达。四个栅格对应于CCR5的四个胞外结构域。每个栅格的第一行指示相应CCR5胞外结构域的氨基序列(SEQ ID NO:1-4)。抗CCR5 mAb与每个残基的丙氨酸突变体的结合表述成与野生型CCR5结合的百分比,正如测量和方法中所述。
图5:抗CCR5 mAb对进入CCR5+细胞的钙转移的抑制
将L1.2-CCR5+细胞加载吲哚-1AM继而用抗CCR5 mAb或PBS进行刺激,随后是RANTES(a)。使用分光荧光计测量荧光变化,追踪(tracing)来自代表性实验。对PA14和2D7测试广泛mAb浓度的钙流抑制(b)。将结果绘图钙流抑制%=[1-(存在mAb时的相对荧光÷不含mAb时的相对荧光)]x100%,并由三次独立试验取平均值。
图6:CCR5 mAb对CCR5辅助受体功能的抑制
在RET测定法中测试抗CCR5 mAb对细胞-细胞融合的抑制(a)。将0-250μg/ml PA8-PA12或0-25μg/ml PA14或2D7加到分别经F18和R18标记的HeLa-EnVJR-FL +细胞与PM1细胞混合物中。温育4小时后测量荧光RET。结果是来自三次独立试验的平均值,并表述成融合抑制%=[1-(存在mAb时的%RET÷不含mAb时的%RET)]x 100%。在单轮基于复制荧光素酶的侵入测定法中测试抗CCR5 mAb对HIV-1侵入的抑制(b)。在存在0-250μg/ml PA8-PA12或0-25μg/ml PA14或2D7时用携带JR-FL包膜的NLluc+env-报道病毒感染U87-CD4+CCR5+细胞。感染后72小时测量细胞裂解物中的荧光素酶活性(相对光单位,r.l.u.)。结果来自代表性试验,并表述成侵入抑制%=[1-(存在mAb时的r.l.u.÷不含mAb时的r.l.u.)]x 100%。生物素化[b]gp120、sCD4和b-gp120-CD4复合物与L1.2-CCR5+ 细胞的结合(c)。当衍生自R5病毒HIV-1JR-FL的gp120与等摩尔量的sCD4复合时观察到强结合。在不含sCD4或衍生自X4病毒HIV-1LAI的gp120时没有观察到结合。由所有曲线扣除CCR5-L.1.2细胞的背景结合。测试存在不同浓度每种抗体时对gp120/sCD4结合L1.2-CCR5+细胞的抑制(d)。 在96孔板中将细胞与抗CCR5 mAb一起预温育,随后与饱和浓度的生物素化gp120/sCD4一起温育。最后,使用荧光读板器测量PE标记链霉亲和素与细胞的结合。结果来自代表性试验,并表述成gp120/sCD4结合抑制百分比=[1-(存在mAb时的m.f.i.÷不含mAb时的m.fi.)]x100%。
图7:PA12和2D7对细胞-细胞融合的协同抑制
获得了mAb单独和联合使用时的剂量应答曲线。将0-50μg/ml PA12、0-25μg/ml 2D7、或这两种抗体的2∶1比例联合加到分别经R18和F18标记的HeLa-EnvJR-FL +细胞与PM1细胞混合物中。温育4小时后测量荧光RET。结果表述成融合抑制百分比,而且是三次独立试验的平均值。使用中值效应(median effect)原理分析数据,所述原理可以表述成:
f=1/[1+(K/c)m] (1)
其中f是受到影响/抑制的分数,c是浓度,K是产生中值效应所需要的试剂浓度,而m是描述剂量应答曲线形状的经验系数。方程(1)是描述Michaelis-Menton酶促动力学、Langmuir吸收等温线、和Henderson-Hasselbalch电离平衡的方程的广义形式,其中m=1。在目前的情况中,K等于IC50值。通过拟合曲线的剂量应答曲线测定K和m,并重排方程(1)以计算指定f的c。K和c的最佳拟合参数是8.8μg/ml和0.54(对于PA12而言)、0.36μg/ml和0.68(对于2D7而言)、以及0.11μg/ml和1.1(对于它们的联合而言)。将这些曲线绘图,并指示实验与理论之间的合理吻合度。
图8:
依照本发明,此图显示了人源化形式小鼠抗CCR5抗体PA14轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)以及编码其的核酸序列(SEQ ID NO:5)。SEQ ID NO:7鉴定了SEQ ID NO:5中编码SEQ ID NO:6所列出的氨基酸序列的区域。此轻链可变区存在于本文称为PRO 140#1和#2的抗体中。互补决定区(“CDR”)标有下划线。
图9:
依照本发明,此图显示了人源化形式小鼠抗CCR5抗体PA14重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)以及编码其的核酸序列(SEQ ID NO:8)。SEQ ID NO:10鉴定了SEQ ID NO:8中编码SEQ ID NO:9所列出 的氨基酸序列的区域。此轻链可变区存在于本文称为PRO 140#2的抗体中。CDR标有下划线。
图10:
依照本发明,此图显示了人源化形式小鼠抗CCR5抗体PA14重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)以及编码其的核酸序列(SEQ ID NO:11)。SEQ ID NO:13鉴定了SEQ ID NO:11中编码SEQ ID NO:12所列出的氨基酸序列的区域。此轻链可变区存在于本文称为PRO 140#1的抗体中。CDR标有下划线。
图11:有效减少体内病毒负荷的单剂量人源化CCR5抗体
用正常人PBMC重建SCID小鼠,并感染HIV-1JR-CSF。在达到病毒稳定状态时,用单剂1毫克i.p.剂量的人源化CCR5抗体(PRO 140)或同种型对照抗体处理动物,并监测血浆HIV RNA(Roche Amplicor Assay)。
图12:病毒负荷的持续减少
用正常人PBMC重建SCID小鼠,并感染HIV-1JR-CSF。在达到病毒稳定状态时,每三天用0.1mg剂量的人源化CCR5抗体(PRO 140)i.p.处理动物,并监测血浆HIV RNA(Roche Amplicor Assay)。
图13:
在使用依照本发明制备的CCR5抗体(PRO 140)时展示没有淋巴细胞损耗。
图14:有效阻断由CCR5介导的HIV-1细胞-细胞融合的人源化CCR5抗体(PRO 140)
使用互补决定区(CDR)移植和框架替代方法人源化鼠CCR5抗体。在Sp2/0细胞中表达人源化CCR5抗体(PRO 140#1和PRO 140#2),通过蛋白A层析进行纯化,并如Litwin等,J.Virol.,70:6437,1996中所述测试阻断由HIV-1JR-FL env介导的膜融合复制的能力。
图15:人源化CCR5抗体(PRO 140)介导有效的、不依赖亚型的HIV-1抑制
如Trkola等,J.Virol.,72:396,1998中所述对依照本发明的CCR5抗体(PRO 140#1和#2)测试阻断野生型HIV-1在外周血单核细胞(PBMC)中复制的能力。通过测定7天PBMC培养物上清液中的p24抗原含量来测量病毒复制程度。
原含量来测量病毒复制程度。
图16:
此图提供了编码图8中所示轻链可变区以及Co等,J.Immunol.,148:1149,1992中所述人κ恒定区的质粒pVK-HuPRO140的图谱。
图17:
此图提供了编码图9中所示重链可变区以及如He等,J.Immunol.160:1029(1998)所述,人IgG4的人重链恒定区、CH1、铰链、CH2、和CH3的质粒pVg4-HuPRO140HG2的图谱。
图18:
此图提供了编码图10中所示重链可变区以及如He等,J.Immunol.160:1029(1998)所述,人IgG4的人重链恒定区、CH1、铰链、CH2、和CH3的质粒pVg4-HuPRO140(mutB+D+I)的图谱。
图19:HuPRO140阻断HIV-1而非RANTES信号
对依照本发明的PRO140抗体测试在L1.2-CCR5细胞中阻断由RANTES诱导的钙转移的能力(Olson等人,J.Virol.,72:396,1998)。此图显示了人源化CCR5抗体(huPRO140)阻断HIV-1而非RANTES信号。
发明详述
分别命名为HuPRO140-VK、HuPRO140(mut+B+D+I)-VH和HuPRO140 HG2-VH且在图16、18和17中称为pVK-HuPRO140、pVg4-HuPRO140(mut B+D+I)-VH和pVg4-HuPRO140 HG2的质粒于2002年2月22日保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯(20108)的美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection),ATCC编号分别为PTA4097、PTA4099和PTA4098。这些保藏物遵循布达佩斯条约(Budapest Treaty)关于出于专利程序目的的微生物保藏物的国际公认的条款。
本发明提供了用于抑制HIV-1感染的组合物,所述组合物包含对于抑制HIV-1感染而言协同有效量的至少两种化合物,其中至少一种化合物预防HIV-1与HIV-1融合辅助受体之间的生产性相互作用。
在用于本文时,“组合物”指混合物。组合物包括但不限于那些适合于口服、直肠、阴道内、局部、鼻腔、视网膜、或肠胃外施用于受试者的组合物。在用于本文时,“肠胃外”包括但不限于皮下、静脉内、肌内、或膜内注射或输注技术。
在用于本文时,“HIV-1”指1型人类免疫缺陷病毒。HIV-1包括但不限于胞外病毒颗粒和在HIV-1感染细胞中找到的HIV-1形式。
在用于本文时,“HIV-1感染”指将HIV-1遗传信息导入靶细胞,诸如通过靶细胞膜与HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+细胞的融合。靶细胞可以是受试者的体细胞。在优选实施方案中,靶细胞是来自人类受试者的体细胞。
在用于本文时,“抑制HIV-1感染”指与不使用所述组合物时导入的量相比导入靶细胞群的HIV-1遗传信息的量得到减少。
在用于本文时,“化合物”指分子实体,包括但不限于肽、多肽、和其它有机或无机分子及其组合。
在用于本文时,“协同有效”指化合物联合使用时的联合效应大于它们分别使用时的效果的总和。
在用于本文时,“生产性相互作用”指HIV-1与HIV-1辅助受体的相互作用将导致所述HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+细胞与含有辅助受体的膜的融合。
在用于本文时,“预防生产性相互作用”指与不使用化合物时存在的量相比相互作用的量得到了降低。可以通过掩饰或改变辅助受体或HIV-1上的相互作用区域或者通过改变辅助受体的表达、聚集、构象、或联合状态来预防相互作用。
在用于本文时,“HIV-1融合辅助受体”指介导表达受体的靶细胞与HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+细胞之间融合的细胞受体。HIV-1融合辅助受体包括但不限于CCR5、CXCR4和其它趋化因子受体。
本发明还提供了抑制HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+细胞与靶细胞融合的组合物,所述组合物包含对于抑制HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+细胞与靶细胞融合而言协同有效量的至少两种化合物,其中至少一种化合物预防HIV-1与HIV-1融合辅助受体之间的生产性相互作用。
在用于本文时,“融合”指在哺乳动物细胞或诸如HIV-1的病毒上发现的脂双层膜的连接或联合。该过程不同于HIV-1附着于靶细胞。附着是由 HIV-1外部糖蛋白结合人CD4受体(并非融合辅助受体)介导的。
在用于本文时,“抑制”指与不使用组合物时存在的量相比量得到了降低。
在用于本文时,“靶细胞”指能够被HIV-1或HIV-1感染细胞感染或融合的细胞。
在用于本文时,“趋化因子”指能够刺激白细胞运动的细胞因子。根据两个氨基末端半胱氨酸残基是直接毗邻或是由一个氨基酸分开,它们可以表征为cys-cys或cys-X-cys。它包括但不限于RANTES、MIP-1α、MIP-1β、SDF-1或阻断HIV-1感染的另一种趋化因子。
在上述组合物的一个实施方案中,辅助受体是趋化因子受体。在上述组合物的优选实施方案中,趋化因子受体是CCR5或CXCR4。已知发挥HIV辅助受体功能的其它几种趋化因子和相关受体包括但不限于CCR2、CCR3、CCR8、STRL33、GPR-15、CX3CR1和APJ(69)。
在用于本文时,“趋化因子受体”指结合趋化因子的七个跨膜细胞表面蛋白同源家族的成员。
在用于本文时,“CCR5”指结合趋化因子C-C组的成员且其氨基酸序列包含Genbank编号1705896所提供的氨基酸序列的趋化因子受体及其相关多态性变体。
在用于本文时,“CXCR4”指结合趋化因子C-X-C组的成员且其氨基酸序列包含Genbank编号400654所提供的氨基酸序列的趋化因子受体及其相关多态性变体。
在上述组合物的一个实施方案中,至少一种化合物是非肽分子。在一个实施方案中,非肽分子是双磺酸钠(bicyclam)化合物AMD3100(16)。
在用于本文时,“非肽分子”指不是完全由通过肽键相连的氨基酸线性序列构成的分子。然而,非肽分子可以包含一个或多个肽键。
在上述组合物的一个实施方案中,至少一种化合物是抗体。在一个实施方案中,抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中,抗体是抗趋化因子受体抗体。在一个实施方案中,抗体是抗-CXCR4抗体。在另一个实施方案中,抗CXCR4抗体是12G5(43)。在一个优选实施方案中,抗体是抗CCR5抗体。抗CCR5抗体包括但不限于PA8、PA9、PA10、PA11、PA12、 PA14和2D7。在此组合物中,化合物处于适当比例中。比例范围是1∶1至1000∶1。
单克隆抗体PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14于1998年12月2日保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号(20110-2209)的美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection),ATCC编号分别为:ATCC编号HB-12605(PA8)、ATCC编号HB-12606(PA9)、ATCC编号HB-12607(PA10)、ATCC编号HB-12608(PA11)、ATCC编号HB-12609(PA12)和ATCC编号HB-12610(PA14),保藏遵循且满足布达佩斯条约(Budapest Treaty)关于出于专利程序目的的微生物保藏物的国际公认的要求。
在上述组合物的另一个实施方案中,两种或多种化合物是抗体。在本发明的一个实施方案中,抗体包括但不限于PA8、PA9、PA10、PA11、PA12、PA14和2D7。在此组合物中,抗体处于适当比例中。比例范围是1∶1至50∶1。
在用于本文时,“抗体”指包含两条重链和两条轻链并识别抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子可以衍生自任何普遍知道的类型,包括但不限于IgA、分泌性IgA、IgG和IgM。IgG亚类同样是本领域众所周知的,包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。作为例示,它包括天然发生的和非天然发生的两类抗体。具体而言,“抗体”包括多克隆和单克隆抗体及其单价和双价片段。另外,“抗体”包括嵌合抗体、完全合成的抗体、单链抗体及其片段。任选的是,可以用可检测标记物标记抗体。例如,可检测标记物包括放射性或荧光标记物。抗体可以是人的或非人的抗体。可以通过重组法将非人抗体人源化以降低其在人体内的免疫原性。本领域技术人员知道用于人源化抗体的方法。
在用于本文时,“单克隆抗体”也称为mAb,用于描述一级序列基本上相同且展示相同抗原特异性的抗体分子。可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员知道的其它技术来生产单克隆抗体。
在用于本文时,“抗趋化因子受体抗体”指识别并结合趋化因子受体上的表位的抗体。在用于本文时,“抗CCR5抗体”指识别并结合CCR5趋化因子受体上的表位的单克隆抗体。
在用于本文时,“适当比例”指协同有效的化合物的质量或摩尔比例。
在上述组合物的一个实施方案中,至少一种化合物是趋化因子或趋化因子衍生物。趋化因子包括但不限于RANTES、MIP-1α、MIP-1β、SDF-1或其组合。在此组合物中,化合物处于适当比例中。趋化因子衍生物包括但不限于Met-RANTES、AOP-RANTES、RANTES 9-68或其组合。
在用于本文时,“趋化因子衍生物”指经过化学修饰的趋化因子。化学修饰包括但不限于氨基酸替代、添加或删除、非肽添加或氧化。本领域技术人员将能够生产这些衍生物。
在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物是抗体且至少一种化合物是趋化因子或趋化因子衍生物。在此组合物中,化合物处于适当比例中。比例范围是100∶1至1000∶1。
在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物结合HIV-1包膜糖蛋白的gp41亚基。在一个实施方案中,至少一种化合物是HIV-1侵入的T-20肽抑制剂(70)。
在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物抑制HIV-1附着于靶细胞。在一个实施方案中,至少一种化合物结合CD4。在一个实施方案中,至少一种化合物是HIV-1包膜糖蛋白。在一个实施方案中,至少一种化合物是抗CD4抗体。在一个实施方案中,至少一种化合物结合HIV-1包膜糖蛋白。在一个实施方案中,至少一种化合物是针对HIV-1包膜糖蛋白的抗体。在一个实施方案中,至少一种化合物是基于CD4的蛋白质。在一个实施方案中,至少一种化合物是CD4-IgG2。
在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物是抗体且至少一种化合物结合HIV-1包膜糖蛋白。在一个实施方案中,化合物是基于CD4的蛋白质。在一个实施方案中,化合物是CD4-IgG2。在此组合物中,化合物处于适当比例中。比例范围是1∶1至10∶1。
在用于本文时,“附着”指由HIV-1包膜糖蛋白结合人CD4受体(并非融合辅助受体)介导的过程。
在用于本文时,“CD4”指包含一个胞质结构域、一个疏水跨膜结构域和一个结合HIV-1 gp120包膜糖蛋白的胞外结构域的成熟、天然、膜结合的CD4蛋白质。
在用于本文时,“HIV-1包膜糖蛋白”指包含gp120表面蛋白、gp41跨膜蛋白及其寡聚物和前体的HIV-1编码蛋白质。
在用于本文时,“基于CD4的蛋白质”指包含对应于CD4中CD4与HIV-1 gp120包膜糖蛋白形成复合物所必需的那部分的至少一段氨基酸残基序列的任何蛋白质。
在用于本文时,“CD4-IgG2”指由以ATCC编号75193和75194保藏的表达载体编码的CD4与人IgG2融合蛋白异四聚物。
在上述组合物的一个实施方案中,至少一种化合物包含结合CCR5表位的多肽。在一个实施方案中,表位位于N末端、三个胞外环区域之一或其组合。在一个实施方案中,表位位于N末端。表位可以包含N末端的N13和Y15。表位可以包含N末端的Q4。在另一个实施方案中,表位包含N末端和第二个胞外环中的残基。表位可以包含N末端的D2、Y3、Q4、S7、P8和N13以及第二个胞外环的Y176和T177。表位可以包含N末端的D2、Y3、Q4、P8和N13以及第二个胞外环的Y176和T177。表位可以包含N末端的D2以及第二个胞外环的R168和Y176。在一个实施方案中,表位位于第二个胞外环。表位可以包含第二个胞外环的Q170和K171。表位可以包含第二个胞外环的Q170和E172。
在用于本文时,贯穿说明书全文使用下列标准缩写来指示特定氨基酸:
A=ala=丙氨酸 R=arg=精氨酸
N=asn=天冬酰胺 D=asp=天冬氨酸
C=cys=半胱氨酸 Q=gln=谷氨酰胺
E=glu=谷氨酸 G=gly=甘氨酸
H=his=组氨酸 I=ile=异亮氨酸
L=leu=亮氨酸 K=lys=赖氨酸
M=met=甲硫氨酸 F=phe=苯丙氨酸
P=pro=脯氨酸 S=ser=丝氨酸
T=thr=苏氨酸 W=trp=色氨酸
Y=tyr=酪氨酸 V=val=缬氨酸
在用于本文时,“多肽”指通过肽键相连的两个或多个氨基酸。
在用于本文时,“表位”指分子中形成结合抗体或其它化合物的表面的那部分。表位可以包含连续或不连续的氨基酸、碳水化合物或其它非肽部分或寡聚物特异表面。
在用于本文时,“N末端”指横跨起始甲硫氨酸和第一个跨膜区的氨基酸序列。
在用于本文时,“第二个胞外环”指横跨第四个和第五个跨膜区且位于表面的氨基酸序列。
在上述组合物的一个实施方案中,至少一种化合物包含抗体的轻链。在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物包含抗体的重链。在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物包含抗体的Fab片段。在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物包含抗体的可变结构域。在另一个实施方案中,抗体是作为单一多肽或“单链”抗体生产的,它包含经间隔氨基酸序列遗传连锁的重链和轻链可变结构域。在上述组合物的另一个实施方案中,至少一种化合物包含抗体的一个或多个CDR片段。
在用于本文时,“重链”指抗体分子中由一个可变结构域(VH)和三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3、和CH4)构成的较大多肽或其片段。
在用于本文时,“轻链”指抗体分子中由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)构成的较小多肽或其片段。
在用于本文时,“Fab”指免疫球蛋白中由一条轻链和一条重链的一部分构成的单价抗原结合片段。它可以通过简单的木瓜蛋白酶消化或者通过重组法来获得。
在用于本文时,“F(ab’)2”指免疫球蛋白中由两条轻链和两条重链的一部分构成的二价抗原结合片段。它可以通过简单的胃蛋白酶消化或重组法来获得。
在用于本文时,“CDR”或“互补决定区”指抗体可变结构域中高度可变的氨基酸序列。
本发明提供了上述组合物和药用载体。药用载体对于本领域技术人员而言是众所周知的。这些药用载体可以包括但不限于水性或非水性溶液、悬浮液和乳状液。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如 橄榄油、和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水性溶液、乳状液或悬浮液、盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化Ringer氏或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充物、电解质补充物诸如基于Ringer氏右旋糖的补充物、诸如此类。还可以存在防腐剂和其它添加剂,诸如例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、诸如此类。
本发明提供了治疗受HIV-1之苦的受试者的方法,包括对受试者施用有效剂量的上述组合物。
在用于本文时,“受试者”指能够遭受HIV-1感染的任何动物或经过人工修饰的动物。经过人工修饰的动物包括但不限于具有人类免疫系统的SCID小鼠。动物包括但不限于小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔、和灵长类动物。在优选实施方案中,受试者是人。
在用于本文时,“治疗”指减缓、终止或逆转HIV-1病症的进展。在优选实施方案中,“治疗”指将进展逆转至消除病症的点。在用于本文时,“治疗”也指减少病毒感染的数目、减少感染性病毒颗粒的数目、减少病毒感染细胞的数目、或改善与HIV-1有关的症状。
在用于本文时,“受HIV-1之苦”指受试者具有至少一个已经受到HIV-1感染的细胞。
在用于本文时,“施用”可以使用本领域技术人员知道的任何方法来实现和进行。所述方法可以包括静脉内、肌肉内或皮下途径。
本发明组合物的剂量将根据受试者和所用具体施用途径而变化。剂量范围可以是0.1-100,000μg/kg。可以根据组合物连续传递剂量,诸如通过连续泵,或者以定期间隔传递剂量。例如,在一个或多个分开的情形传递剂量。本领域技术人员无需过度试验就可以确定多剂量特定组合物的期望时间间隔。
在用于本文时,“有效剂量”指足以治疗受试者或预防受试者免于HIV-1感染的数量。本领域普通技术人员能够进行简单的滴定实验来确定治疗受试者所需要的数量。
本发明提供了预防受试者免于感染HIV-1的方法,包括对受试者施用有效剂量的上述组合物。
在用于本文时,“感染HIV-1”指受到HIV-1感染,其遗传信息在宿主细胞中复制和/或掺入。
本发明提供了抗CCR5单克隆抗体。所述抗体包括但不限于:PA8(ATCC登记号HB-12605)、PA9(ATCC登记号HB-12606)、PA10(ATCC登记号HB-12607)、PA11(ATCC登记号HB-12608)、PA12(ATCC登记号HB-12609)和PA14(ATCC登记号HB-12610)。
本发明提供了上述抗体的人源化形式。
在用于本文时,“人源化”描述了其中CDR区域外的一些、大多数或所有氨基酸被衍生自人免疫球蛋白分子的对应氨基酸替代的抗体。在人源化形式抗体的一个实施方案中,CDR区域外的一些、大多数或所有氨基酸已经被来自人免疫球蛋白分子的氨基酸替代,但是一个或多个CDR区域内的一些、大多数或所有氨基酸未曾改变。小型氨基酸添加、删除、插入、替代或修饰是允许的,只要它们不会消除抗体结合指定抗原的能力。合适的人免疫球蛋白分子将包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子。“人源化”抗体将保留与原始抗体相似的抗原特异性,即本发明中的结合CCR5的能力。
本领域技术人员将知道如何生产本发明的人源化抗体。多种出版物(由此将其中一些结合于本申请作为参考)也描述了如何生产人源化抗体。例如,美国专利号4,816,567(71)中描述的方法包括生产具有一种抗体的可变区和另一种抗体的恒定区的嵌合抗体。
美国专利号5,225,539(72)描述了用于生产人源化抗体的另一种方法。此专利描述了重组DNA技术用于生产人源化抗体的用法,其中一种免疫球蛋白的可变区的CDR被来自具有不同特异性的另一种免疫球蛋白的CDR替代,使得人源化抗体将识别期望靶而不会以显著地方式被人类受试者的免疫系统所识别。具体而言,将定点诱变用于将CDR移植到框架上。
用于人源化抗体的其它方法描述于美国专利号5,585,089(73)和5,693,761(74)以及WO 90/07861,它们描述了用于生产人源化免疫球蛋白的方法。这些人源化抗体具有来自供体免疫球蛋白的一个或多个CDR和可能的额外氨基酸以及来自受体人免疫球蛋白的框架区。这些专利描述了用于提高抗体对期望抗原的亲合力的方法。框架中的有些氨基酸选择与 供体中而非受体中那些位置的氨基酸相同。具体而言,这些专利描述了通过联合小鼠单克隆抗体的CDR与人免疫球蛋白框架和恒定区来制备结合受体的人源化抗体。可以选择人框架区使与小鼠序列的同源性最大化。可以使用计算机模型来鉴定框架区中有可能与CDR或特异抗原相互作用的氨基酸,然后可以在这些位置使用小鼠氨基酸以生产人源化抗体。
上述专利5,585,089和5,693,761以及WO 90/07861(75)还提出了可用于设计人源化抗体的四条可能标准。第一条建议是对于受体而言,使用来自与待人源化的供体免疫球蛋白异常同源的特定人免疫球蛋白的框架,或者使用来自许多人抗体的保守框架。第二条建议是如果人免疫球蛋白框架中的氨基酸是异常的且该位置的供体氨基酸对人序列而言是典型的,那么可以选择供体氨基酸而非受体。第三条建议是在紧挨着人源化免疫球蛋白链中3个CDR的位置可以选择供体氨基酸而非受体氨基酸。第四条建议是在预测抗体三维模型中氨基酸有侧链原子位于CDR的3A以内且预测能够与CDR相互作用的框架位置使用供体氨基酸残基。上述方法仅仅是本领域技术人员能够用来生产人源化抗体的一些方法的例示。可以使用Wu等,J.Mol.Biol.,284:151,1999和美国专利号6,165,793、6,365,408和6,413,774中描述的定向进化来提高人源化抗体的结合亲合力和/或特异性。
在本发明的一个实施方案中,人源化形式抗体包含SEQ ID NO:6所列出的轻链可变氨基酸序列。在另一个实施方案中,抗体包含SEQ ID NO:9所列出的重链可变氨基酸序列。在又一个实施方案中,抗体可以包含SEQID NO:12所列出的重链可变氨基酸序列。
在另一个实施方案中,人源化抗体包含SEQ ID NO:6所列出的轻链可变氨基酸序列和SEQ ID NO:9所列出的重链可变氨基酸序列。备选地,抗体可以包含SEQ ID NO:6所列出的轻链可变氨基酸序列和SEQ ID NO:12所列出的重链可变氨基酸序列。
人源化抗体的可变区可以连接人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一个实施方案中,人源化抗体包含轻链和重链恒定区二者。重链恒定区通常包含CH1、铰链、CH2、CH3和有时的CH4区。在一个实施方案中,人源化抗体的恒定区属于人IgG4同种型。
本发明提供了编码这些抗CCR5单克隆抗体或其人源化形式的分离的核酸分子。核酸分子可以是RNA、DNA或cDNA。在一个实施方案中,核酸分子编码轻链。在一个实施方案中,核酸分子编码重链。在一个实施方案中,核酸编码重链和轻链二者。在一个实施方案中,一个或多个核酸分子编码Fab片段。在一个实施方案中,一个或多个核酸分子编码CDR片段。在一个实施方案中,核酸分子编码可变结构域。在另一个实施方案中,核酸分子编码一个可变结构域和一个或多个恒定结构域。
优选的是,例示人源化抗CCR5抗体类似物因保守氨基酸替代而不同于例示人源化抗CCR5抗体。为了将氨基酸替代分类成保守的或非保守的,可以将氨基酸如下分组:第一组(疏水性侧链):met、ala、val、leu、ile;第二组(中性亲水性侧链):cys、ser、thr;第三组(酸性侧链):asp、glu;第四组(碱性侧链):asn、gln、his、lys、arg;第五组(影响链取向的残基):gly、pro;和第六组(芳香组侧链):trp、tyr、phe。保守替代涉及相同类型氨基酸之间的替代。非保守替代构成这些类型之一的成员与另一类的成员之间的交换。
人源化抗CCR5抗体类似物显示与本文例示的人源化PRO 140#1或人源化PRO 140#2的基本的氨基酸序列同一性。编码类似物重链和轻链可变区的核酸序列能够与编码人源化PRO 140#1或人源化PRO 140#2重链和轻链可变区的核酸或其简并形式在严谨条件下杂交。
由于遗传密码的简并性,多种核酸序列编码本发明的人源化抗CCR5抗体。在某些实施方案中,抗体是由与前述核酸分子高度同源的核酸分子编码的。优选的是,同源核酸分子包含与本文提供的核苷酸序列至少大约90%同一的核苷酸序列。更优选的是,核苷酸序列与本文提供的核苷酸序列至少大约95%同一,至少大约97%同一,至少大约98%同一,或者至少大约99%同一。可以使用本领域普通技术人员众所周知的多种公用软件工具来计算同源性。例示性工具包括可以由位于(美国)全国卫生研究所(National Institute of Health)的(美国)国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,NCBI)的网站获得的BLAST系统。
鉴定高度同源核苷酸序列的一种方法经由核酸杂交。因此,本发明还包括由在高严谨度条件下与前述核酸分子杂交的核酸分子编码的、具有 CCR5结合特性和本文所述其它功能特性的人源化CCR5抗体。还可以使用聚合酶链式反应(PCR)和适用于克隆相关核酸序列的其它扩增技术来实现相关序列的鉴定。优选的是,选择PCR引物来扩增目的核酸序列的片段,诸如CDR。
术语“高严谨度条件”在用于本文时指本领域所熟悉的参数。可以在编辑这些方法的参考文献中找到核酸杂交参数,如J.Sambrook等编辑的《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》即分子克隆:实验室指南,第2版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989,或者F.M.Ausubel等编辑的《Current Protocols in Molecular Biology》即分子生物学现行方案,John Wiley父子公司,纽约。高严谨度条件的一个实例是于65℃在杂交缓冲液(3.5XSSC、0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清清蛋白、2.5mM NaH2PO4 pH7、0.5%SDS、2mM EDTA)中杂交。SSC即0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠pH7;SDS即十二烷基磺酸钠;而EDTA即乙二胺四乙酸。杂交后,例如于室温用2XSSC,然后在高达68℃的温度用0.1-0.5XSSC/0.1XSDS,清洗核酸转移其上的膜。
将核酸序列可操作连接表达控制序列(即为了确保后者发挥功能而安置前者)后,在宿主中表达序列。这些表达载体通常能够在宿主生物体中复制,或是作为游离体或是作为宿主染色体DNA的整合部分。通常,表达载体将包含选择标记,如四环素或新霉素,从而容许检测经期望DNA序列转化的那些细胞(参阅如美国专利号4,704,362,收入本文作为参考)。
大肠杆菌(E.coli)是对于克隆本发明DNA序列而言特别有用的一种原核宿主。适于使用的其它微生物宿主包括杆菌(bacilli),诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus substilus),以及其它肠杆菌科(enterobacteriaccae),诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和多种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中,也可以构建表达载体,它通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(如复制起点)。另外,可以存在任何数目的多种众所周知的启动子,诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统、或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常将控制表达,任选与操纵子序列一起,而且具有核糖体结合位点序列诸如此类,用于启动和完成转录和翻译。
其它微生物,诸如酵母,也可用于表达。酵母属是优选的宿主,且合适载体具有表达控制序列,诸如启动子,包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶以及复制起点、终止序列诸如此类。
除了微生物以外,哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和生产本发明的多肽(参阅Winnacker著的《From Genes to Clones》即由基因到克隆,VCH出版社,纽约州,纽约市,1987)。真核细胞实际上是优选的,因为本领域已经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的许多合适宿主细胞系,包括CHO细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、优选的骨髓瘤细胞系等,以及转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列,诸如复制起点、启动子、增强子(Queen等,Immunol.Rev.,89:49-68,1986,收入本文作为参考)、以及必需的加工信息位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、细胞肥大病毒、牛乳头瘤病毒、诸如此类的启动子。
根据细胞宿主的类型,可以通过众所周知的方法将包含目的DNA区段(如重链和轻链编码序列以及表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中。例如,氯化钙转染常用于原核细胞,而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主(一般参阅Maniatis等,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》及分子克隆:实验室指南,冷泉港出版社,1982,收入本文作为参考)。
一旦表达,可以依照本领域标准方法来纯化本发明的完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链、或其它免疫球蛋白形式,包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳、诸如此类(一般参阅R.Scopes,《ProteinPurification》即蛋白质纯化,Springer-Verlag,纽约,1982)。制药学用途优选至少大约90-95%同质、最优选98-99%或更高均质的基本纯的免疫球蛋白。一旦根据需要部分纯化或纯化至均质,可以将多肽用于治疗(包括体外的),或者用于开发和执行测定流程、免疫荧光染色、诸如此类(一般参阅Lefkovits和Pernis编辑的《Immunological Methods》即免疫学方法,第1和2卷,Academic出版社,纽约州,纽约市,1979和1981)。
出于诊断或检测目的,抗体可以是经标记的或是未标记的。未标记抗体在使用时可以联合能够与人源化抗体反应的其它经标记抗体(二抗),诸如对人免疫球蛋白恒定区特异的抗体。备选地,可以直接标记抗体。可 以采用广泛的标记物,诸如放射性核素、荧光染料、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、配体(特别半抗原)、等。本领域技术人员众所周知且可以利用多种免疫测定法来检测CCR5表达细胞或检测能够表达CCR5的细胞上的CCR5调控。
本发明还提供了具有有效大小或分子量且相对于未衍生化抗体片段而言赋予血清半衰期延长、平均循环滞留时间(MRT)延长和/或血清清除率减小的抗体片段-聚合物偶联物。
可以通过用惰性聚合物衍生期望抗体片段来生产本发明的抗体片段-聚合物偶联物。应当理解为偶联物提供期望表观大小或具有所选真实分子量的任何惰性聚合物都适用于构建本发明的抗体片段-聚合物偶联物。
许多惰性聚合物都适用于药品。参阅如Davis等,《BiomedicalPolymers:Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use》即生物医学聚合物:用于生物医学用途的聚合材料和药品,第441-451页,1980。在本发明的所有实施方案中,使用了非蛋白质聚合物。非蛋白质聚合物通常是亲水性合成聚合物,即在其它情况中在自然界不会找到的聚合物。然而,天然存在且可通过重组或体外方法生产的聚合物也是有用的,正如由天然来源分离的聚合物。亲水性聚乙烯聚合物属于本发明的范围内,如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚烷撑醚诸如聚乙二醇(PEG);聚氧化烯诸如聚氧乙烯、聚氧丙烯以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics即聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物);聚甲基丙烯酸酯;卡波姆;包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、海藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如聚甘露糖醛酸或褐藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸的支链或无支链多糖,包括同多糖和杂多糖,诸如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸右旋糖酐、右旋糖酐、糊精、糖原、或酸性粘多糖的多糖亚基,如透明质酸,糖醇聚合物诸如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇、肝素或类肝素(heparon)。聚合物在交联前不必但优选是水溶性的,但是最终的偶联物必须是水溶性的。优选的是,偶联物展示至少大约0.01mg/ml的水溶解度,更优选至少大约0.1mg/ml,仍更优选至少大约1mg/ml。另外,聚合物在偶联物形式中不应当是高度免疫原性的,而且它不应答具有 与静脉内输注或注射不相容的粘度,如果偶联物意欲通过这些途径施用的话。
在一个实施方案中,聚合物只包含一个反应性基团。这有助于避免蛋白质分子的交联。然而,优化反应条件以减少交联或者通过凝胶过滤或离子交换层析来纯化反应产物以回收基本同质的衍生物属于本发明的范围之内。在另一个实施方案中,为了将多个抗体片段连接到聚合物主链上,聚合物包含两个或多个反应性基团。此外,凝胶过滤或离子交换层析可用于回收基本同质形式的期望衍生物。
聚合物分子量的范围可以高达大约500,000D,且优选至少大约20,000D,或至少大约30,000D,或至少大约40,000D。选择的分子量可能取决于待达到的偶联物有效大小、聚合物的本质(如结构诸如线性或分支)和衍生度即每个抗体片段的聚合物分子数目以及抗体片段上的聚合物附着位点。
可以通过能够与待连接的聚合物和抗体片段的一个或多个氨基酸残基反应的多功能交联剂将聚合物共价连接抗体片段。然而,通过衍生聚合物与抗体片段反应而直接交联也属于本发明的范围之内,反之亦然。
抗体片段上的共价交联位点包括N末端氨基和赖氨酸残基的ε-氨基,以及其它氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其它亲水性基团。聚合物可以直接与抗体片段共价结合而无需使用多功能(通常是双功能)交联剂,正如美国专利号6,458,355中所述。
这种聚合物的替代程度将随着抗体片段上反应位点数目、分子量、亲水性和聚合物的其它特征、以及所选择的具体抗体片段衍生位点而变化。一般而言,偶联物包含1-大约10个聚合物分子,但是也设想了将更多数目的聚合物分子附着到本发明的抗体片段上。通过使用实验矩阵轻松实现了期望的衍生数量,其中改变时间、温度和其它反应条件以改变替代程度,其后通过大小排阻层析或本领域知道的其它手段测定了偶联物的聚合物替代水平。
可以由Shearwater聚合物公司(亨茨维尔,阿拉巴马州)获得用于修饰本发明抗体片段的功能化PEG聚合物。这些商品化PEG衍生物包括但不限于氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、 羧甲基化PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG琥珀酰亚胺丙酸酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺酯、PEG的琥珀酰亚胺碳酸酯、氨基酸PEG的琥珀酰亚胺酯、PEG-氧羰基咪唑、PEG-硝基苯基碳酸酯、PEG tresylate、PEG-缩水甘油基醚、PEG-醛、PEG-乙烯砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-正吡啶基-二硫化物、杂功能PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEG phospholide。用于偶联这些PEG衍生物的反应条件将随着蛋白质、期望的PEG化程度和所使用的PEG衍生物而变化。涉及PEG衍生物选择的一些因素包括:衍生物的期望附着点(诸如赖氨酸或半胱氨酸R-基团)、水解稳定性和反应性,接头的稳定性、毒性和抗原性,分析的适用性,等等。可以由制造商获得使用任何具体衍生物的具体指示。通过凝胶过滤或离子交换HPLC将本发明的偶联物与未反应的起始材料分开。
抗CCR5抗体或其片段可以在使用时联合选自下组的一种或多种额外抗病毒试剂:非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、核苷逆转录酶抑制剂、HIV-1蛋白酶抑制剂、病毒侵入抑制剂及其组合。
可用于本发明组合物的已知NNRTI化合物包括但不限于依法韦仑、UC-781、HBY097、奈韦拉平(11-环丙基-5,11-二氢-4-甲基-6H-二吡啶[3,2-b:2’3’-][1,4]二氮杂草-6-酮)、地位韦啶((RescriptorTM;PharmaciaUpjohn)(哌嗪,1-[3-[(1-甲基-乙基)氨基]-2-吡啶基]-4-[[5-[(甲磺酰)氨基]-1H-吲哚-2-基]羰基]-单甲基磺酸酯)、SJ-3366(1-(3-环戊烯-1-基)甲基-6-(3,5-二甲基苯甲酰基)-5-乙基-2,4-嘧啶二酮)、MKC-442(6-苯甲基-1-(乙氧基甲基)-5-异丙基尿嘧啶)、GW420867x(S-3-乙基-6-氟-4-异丙氧基羰基-3,4-二氢-喹啉-2(1H)-酮;Glaxo)、HI-443(N’-[2-(2-噻吩)乙基]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲)、诸如此类。
可用于本发明组合物并联合至少一种本发明抗CCR5抗体或其片段的核苷逆转录酶抑制剂包括但不限于阿巴卡韦(ZiagenTM,GlaxoSmithKline)((1S,顺)-4-[2-氨基-6-(环丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-环戊烯-1-甲醇硫酸(盐))、拉米夫定(EpivirTM,GlaxoSmithKline)((2S,顺)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-氧硫烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮)、齐多夫定(RetrovirTM;GlaxoSmithKline)(3’叠氮-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷)、司他夫定(Zerit; Bristol-Myers-Squibb)(2’,3’-双脱氢-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷)、zacitabine(HividTM;Roche Laboratories)(4-氨基-1-β-D2’,3’-双脱氧核糖呋喃糖基-2-(1H)-嘧啶酮)、去羟肌苷、诸如此类。
可以在组合物中联合本发明抗CCR5抗体或其片段使用的HIV-1蛋白酶抑制剂包括但不限于洛匹那韦(1S-[1R*,(R*),3R*,4R*]-N-4-[[(2,6-二甲苯氧基)乙酰基]氨基]-3-羟基-5-苯基-1-(苯甲基)戊基)]四氢-α-(1-甲基乙基)-2-氧桥(2H)-嘧啶乙酰胺)、沙奎那韦(N-叔丁基-十氢-2-[2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-[[N-(2-喹啉基羰基)-L-天冬酰胺酰]氨基]丁基]-(4aS,8aS)-异喹啉-(3S)-羧酰胺)、奈非那韦甲磺酸盐([3S-[2(2S*,3S*),3α,4β,8αβ]]-N-(1,1-二甲基乙基)十氢-2[2-羟基-3-[(3-羟基-3-甲基苯甲酰基)氨基]-4-(苯基硫)丁基]-3-异喹啉氨甲酰单甲烷磺酸酯)、硫酸茚地那韦(([1(1S,2R),5(S)]-2,3,5-三脱氧-N-(2,3-二氢-2-羟基-1H-茚-1-基)-5-[2-[[(1,1-二甲基乙基)氨基]羰基]-4-(3-嘧啶基甲基)-1-哌嗪基]-2-(苯甲基)-D-赤型缬烯酰胺硫酸(1∶1)盐)、氨普奈韦((3S)-四氢-3-呋喃基N-[(1S,2R)-3-(4-氨基-N-异丁基苯亚磺酰氨基)-1-苯甲基-2-羟丙基]氨基甲酸酯)、利托那韦((10-羟基-2-甲基-5-(1-甲基乙基)-1-[2-(1-甲基乙基)-4-噻唑基]-3,6-二氧-8,11-双(苯基甲基)-2,4,7,12-四氮十三烷-13-酸,5-噻唑基甲酯,[5S-(5R*,8R*,10R*,11R*)])、诸如此类。
可以联合本发明抗CCR5抗体或其片段使用的HIV-1融合或病毒侵入抑制剂包括PRO 542(Progenics药品公司,塔利顿,纽约州)、T-20(Trimeris公司,达勒姆,北卡罗来纳州)(美国专利号5,464,933;6,133,418;6,020,459)、T-1249(美国专利号6,345,568;6,258,782)、诸如此类。
对于联合疗法,可以给受试者在一种或多种常规抗病毒试剂之前、随后、或同时提供本发明的抗CCR5抗体或其片段。
借助随后的试验详述将更好的理解本发明。然而,本领域技术人员将易于认识到所讨论的特定方法和结果仅仅是本发明的例示,本发明在其后权利要求书中更完整地描述。
试验详述
实施例1
A.材料和方法
1)试剂
MAb 2D7购自Pharmingen(圣迭哥,加利福尼亚州),而CC-和CXC-趋化因子得自R&D Systems(明尼阿波利斯,明尼苏达州)。CD4-IgG2(1)、可溶性(s)CD4(2)和重组HIV-1JR-FLgp120是由Progenics Pharmaceuticals公司生产的(59)。
2)抗CCR5mAb的分离和纯化
将L1.2-CCR5+细胞(63)在存在5mM丁酸钠时温育16小时,它激活来自控制CCR5表达的细胞肥大病毒(CMV)启动子的表达,导致细胞表面辅助受体密度增长了10倍。将雌性Balb/c小鼠腹膜内免疫107个L1.2-CCR5+细胞,以3周为间隔,并在脾切除前三天施行107个L1.2-CCR5+ 细胞的静脉内加强。将脾细胞与Sp2/0细胞系融合。在初步筛选中,测试来自104份杂交瘤培养物的上清液;这其中的120份在共振能转移(RET)测定法中抑制天然表达CCR5和CD4的PM1细胞与HeLa-EnvJR-FL +细胞之间由HIV-1包膜介导的融合(10),正如先前所述(19,38)。通过有限稀释亚克隆生产最有效抑制性上清液和还将CCR5+细胞染色的杂交瘤。通过Harlan Bioproducts for Science公司(印第安纳波利斯,印第安纳州)给Balb/c小鼠注射生产抗CCR5mAb PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14的杂交瘤来制备腹水。通过硫酸铵沉淀及随后的蛋白A层析将mAb个别纯化至>95%同质。将所有mAb重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS),终浓度5mg/ml。
3)抗CCR5mAb的荧光激活细胞分类(FACS)分析和表位作图
将流式细胞计量术用于检测mAb PA8-PA12和PA14对CCR5的细胞表面反应性。将经丁酸钠处理的L1.2-CCR5+细胞(106个)与0.25μg抗体一起在溶于50μl Dulbecco氏PBS(DPBS)的0.1%叠氮钠(NaN3)中于4℃温育20分钟。将CCR5mAb 2D7用作阳性对照,将非特异性鼠IgG1用作阴性对照。将细胞离心沉降下来,清洗,并与1∶100稀释的经藻红蛋白(PE)标记的山羊抗小鼠IgG(Caltag,伯林格姆,加利福尼亚州)一起在与第一次抗体温育相同的条件下温育。最后,通过流式细胞计量术分析细胞。分离PBMC,如先前所述(60)进行刺激,并使用相似方法进行染色。
将相似流程用于抗CCR5mAb的表位作图。已经描述了一组70种CCR5点突变体(20,24,52)。将这些蛋白质的编码序列亚克隆到pcDNA3.1载体(Stratagene)中,其中可以由5′T7-聚合酶启动子驱动转录。CCR5突变体在C端携带9个残基的血球凝集素(HA)标签以便于检测细胞裂解物中的蛋白质,或者通过流式细胞计量术进行检测。将HeLa细胞(2x106 个)与20μg/ml lipofectin和等量的野生型或突变型CCR5表达质粒一起在OPTI-MEM(Life Technologies,盖瑟斯堡,马里兰州)中温育5小时。然后用2x107p.f.u.vTF7(23)感染细胞12小时以加强CCR5表达,用溶于PBS的2mM乙二胺四乙酸(EDTA)分离,并用结合缓冲液(溶于DPBS的1%BSA、0.05%NaN3)清洗一次。如前面段落中所述用mAb表面标记细胞(1x106个),用温育缓冲液清洗一次,并重悬于溶于水的1ml 1xFACSlyse(Becton Dickinson),于室温温育30分钟以渗透细胞膜。然后将细胞离心沉降下来,用温育缓冲液进行清洗,并与4μg/ml经荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记的小鼠抗-HA mAb(BabCo,里士满,加利福尼亚州)一起于37℃温育1小时以进行胞内标记。最后,将细胞用结合缓冲液清洗一次,用DPBS清洗一次,重悬于溶于PBS的1%甲醛,并通过流式细胞计量术进行分析。通过下面的方程来确定mAb结合突变型CCR5的程度:(突变型CCR5PE m.f.i./野生型CCR5PE m.f.i.)/(突变型CCR5 FITCm.f.i./野生型CCR5FITC m.f.i.)x 100%。这将突变型辅助受体表达水平的mAb结合标准化。
4)gp120/sCD4结合测定法
使用NHS-生物素(Pierce,罗克福德,伊利诺斯州)依照制造商的指示生物素化gp120,并通过渗滤除去未偶联的生物素。将经丁酸钠处理的L1.2-CCR5+细胞与不同稀释度的sCD4与生物素化gp120的等摩尔混合物或1.25μg/ml sCD4和2.5μg/ml生物素化gp120一起在存在不同浓度的抗CCR5mAb PA8-PA12、PA14、2D7或非特异性鼠IgG1时在溶于DPBS的0.1%NaN3中于室温温育1小时。用温育缓冲液清洗细胞,并与1∶50稀释的链霉亲和素-PE(Becton Dickinson)一起于室温温育1小时。最后,用结合缓冲液清洗细胞,并使用荧光读板器进行分析(PerspectiveBiosystems,弗雷明汉,马萨诸塞州)。
5)抗CCR5mAb对由包膜介导的细胞-细胞融合和HIV-1侵入的抑制
使用RET测定法检测HeLa-EnvJR-FL +与PM1细胞之间由HIV-1包膜介导的融合。将相同数目(2x104个)的经荧光素十八烷醇酯(F18)标记的包膜表达细胞与经十八烷基若丹明(R18)标记的PM1细胞分布到96孔板中溶于DPBS中的15%胎牛血清中,并在存在不同浓度的抗CCR5mAb即PA8-PA12、PA14、2D7或非特异性鼠IgG1时于37℃温育4小时。使用Cytofluor读板器(PerSeptive Biosystems)测量荧光RET,并如先前所述(38)确定RET百分比。
如先前所述(20),通过来自JR-FL或Gun-1的包膜糖蛋白生产反式补充的NLluc+env-病毒。在存在不同浓度的单个mAb时,用包含50-100ng/ml p24的嵌合型报道病毒感染U87MG-CD4+CCR5+细胞(14)。于37℃温育2小时后,用新鲜的含mAb的培养基替代含病毒的培养基。12小时后再次加入不含抗体的新鲜培养基。总共72小时后,向细胞中加入100μl裂解缓冲液(Promega),并如(20)所述测量萤光素酶活性(r.l.u.)。HIV-1感染抑制百分比定义为[1-(存在抗体时的r.l.u./不含抗体时的r.l.u.)]x100%。
6)钙信号测定法
向经丁酸钠处理的L1.2-CCR5+细胞中加入荧光染料吲哚-1AM(Molecular Probes,尤金,俄勒冈州)至终浓度5μM。于37℃温育30分钟后,将细胞清洗一次,并重悬于Hank氏缓冲盐水。用抗CCR5mAb或PBS刺激细胞(106个),60秒后继以RANTES。MAb PA8-PA12和PA14的使用浓度是100μg/ml,2D7是20μg/ml,而RANTES是250ng/ml。还对PA14和2D7测试广泛mAb浓度的钙流抑制,范围为0-100μg/ml。使用Perkin-Elmer LS-50S荧光分光光度计通过测量358nm激发后402nm(所结合的染料)和486nm(游离的染料)的荧光发射比例来监测胞内钙水平。
B.结果和讨论
1)分离抗CCR5单克隆抗体PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14
发现对应于CCR5胞外结构域的肽不足以引发针对天然细胞表面受体的特异性、高滴度抗体应答(50)。因此,用L1.2-CCR5+细胞免疫Balb/c 小鼠,并在RET测定法中对杂交瘤培养物上清液测试它们抑制与CD4+CCR5+PM1细胞进行由JR-FL包膜介导的膜融合的能力(19,38)。尽管超过100个孔的上清液将细胞-细胞融合抑制了>50%,然而只有6份-命名为PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14-特异且强烈染色L1.2-CCR5+细胞而非亲本L1.2细胞,正如流式细胞计量术所证明的(未展示数据)。根据先前的经验,假设能够抑制细胞-细胞融合的其它mAb有可能针对细胞表面粘附分子诸如LFA-1(37)。通过同种型ELISA(Cappell,达勒姆,北卡罗来纳州)确定了杂交瘤PA8-PA12和PA14分泌IgG1mAb。由注射了六种杂交瘤的Balb/c小鼠制备腹水,并纯化IgG1级分。PA8、PA9、PA11、PA12和PA14展示不同的等电聚焦特性,而PA10具有与PA9非常相似的特性,因此可能是相同mAb的第二个分离株(未显示数据)。
2)结合CCR5+细胞的mAb
所有纯化的抗CCR5mAb都不能将亲本L1.2细胞系染色(未显示数据)。然而,根据流式细胞计量术的测定,mAb PA9-PA12和PA14将L1.2-CCR5+细胞染色>90%,而PA8将细胞染色约70%,显示它们识别CCR5(图1)。在我们的实验中作为阳性对照的抗CCR5mAb 2D7也将L1.2-CCR5+细胞染色>90%。PA8-PA12和PA14都是IgG1,而且与山羊抗小鼠IgG的反应同样良好,而2D7是IgG2a,而且与报道抗体的反应可能不同。因此,只有用mAb PA8-PA12和PA14测量的平均荧光强度(m.f.i.)直接可比。平均荧光强度(m.f.i.)的排列顺序是PA12~PA11>(2D7=)PA14~PA10~PA9>PA8。PA12m.f.i.与PA8m.f.i.之间的差异是3倍。PA8与其它mAb之间在染色强度中的差异在广泛浓度上保持恒定(未显示数据),而且有可能不符合mAb对CCR5亲和力的差异。这暗示PA8只与L1.2-CCR5+细胞表面上存在的CCR5分子的一个子集相互作用。
与L1.2-CCR5+细胞相比,经促细胞分裂原刺激的PBMC对CCR5mAb展示不同的染色模式。2D7和PA14将PBMC染色>20%,PA11和PA12染色约10%,PA8、PA9和PA10染色<5%(图1)。染色PBMC的平均荧光强度比每种mAb对L1.2-CCR5+细胞的染色低大约10倍;它们的排列顺序是(2D7>)PA14>PA12~PA11~PA10~PA9~PA8。此外,这在一定程 度上不同于在CCR5转染子上观察到的反应性。PA9m.f.i.与PA14m.f.i.之间的差异是7倍。其它小组在抗CCR5抗体将稳定的CCR5+细胞系与PBMC染色的能力中观察到相似差异(28)。这可能归于CCR5构象、翻译后修饰或寡聚化的细胞特异性差异。备选地,与其它细胞表面分子的关联在细胞之间可能是不同的。由于这种分子的一个明显选择是L1.2-CCR5+ 细胞上不存在的而PBMC上存在的CD4细胞表面抗原,因此我们还测试了PA8-PA12、PA14和2D7将瞬时表达CCR5(单独或与CD4一起)的HeLa细胞染色的能力。在存在CD4时在任何mAb将细胞表面CCR5染色的能力中都没有观察到差异(未显示数据)。如果这两种蛋白质之间存在关联,那么它不包括我们能够得到的抗CCR5mAb识别的表位。或者,CCR5与CD4之间的关联可能只发生在原代淋巴细胞上。
3)使用CCR5丙氨酸突变体的mAb表位作图
所有抗体都不能通过Western印迹来检测还原和变性CCR5蛋白质,指示它们识别构象敏感性表位(未显示数据)。使用CCR5Nt和ECL中残基的一组70种丙氨酸点突变体进行mAb表位作图研究。用附加了C末端HA标签的突变型或野生型CCR5表面序列脂转染HeLa细胞,并感染vTF7(23)以加强辅助受体表达。然后将细胞与抗-CCR5mAb一起温育,并通过将PE标记的山羊抗小鼠IgG揭示它们的结合。使用经FITC标记的抗HAmAb(BabCo)进行第二轮胞内染色。这种内部对照容许我们将抗CCR5mAb对细胞表面上突变型感受态表达水平的染色直接标准化。由此,将每种突变体的mAb结合表述成与野生型CCR5的结合百分比(图4)。
某些点突变将所有抗体与CCR5的结合降低>50%。一般而言,PA8-PA12受到此类突变体的影响最大,PA14和2D7受到的影响最小,这类突变体包括半胱氨酸对C110A和C178A;Nt突变体Y10A、D11A、K25A;ECL1突变体D95A;ECL2突变体K171A/E172A、Q188A、K191A/N192A;和ECL3突变体F263A和F264A(图1)。一种解释是这些残基本质上不是mAb表位的一部分,但是将它们变成丙氨酸引起对所有mAb结合具有共同效果的构象扰动。我们假设,如果突变将个别mAb的结合降低>75%,但是不降低大多数其它抗体的结合,那么该残基可能是由该mAb识别的表位的直接贡献者。使用这些严谨方针,得出下面的结论:7种抗CCR5 mAb识别交叠但不同的表位(图4)。MAb PA8与CCR5的结合依赖Nt中的N13和Y15。MAb PA9和PA10需要Nt中的D2、Y3、Q4、P8和N13以及ECL2中的Y176和T177。Mab PA9还需要Nt中的S7。MAb PA11和PA12结合依赖Nt中的Q4。PA14需要Nt中的D2以及ECL2中的R168和Y176。最后,mAb 2D7为了结合CCR5需要ECL2中的Q170和K171/E172。
4)存在抗CCR5mAb时的趋化因子信号
趋化因子受体结合剂可以是由受体介导的胞内信号的拮抗剂或(更少见的)激动剂。或者,它们可能对信号没有影响。CCR5能够结合3种CC-趋化因子即RANTES、MIP-1α和MIP-1β,并转导调控胞质钙水平的信号。因此,我们测试了多种浓度的mAb PA8-PA12、PA14和2D7的激动剂/拮抗剂活性。在加载了1-吲哚的L1.2-CCR5+细胞中测量胞内钙浓度(Ca2+)i的变化。所有mAb都不能刺激(Ca2+)i变化,指示它们不是CCR5的激动剂。甚至在高到100μg/ml的浓度,PA8-PA12同样不能抑制由RANTES诱导的Ca2+流(图5A和未显示数据),显示它们也不是拮抗剂。这些浓度提供了mAb对L1.2-CCR5+细胞的饱和结合,正如流式细胞计量术和gp120/CCR5结合测定法所显示的(图6D和未显示数据)。然而,MAb PA14和2D7阻断由RANTES诱导的钙转移,尽管效力不同(图5A、5B)。PA14钙流抑制的IC50是50μg/ml,比2D7的IC50高大约8倍(图5B)。由RANTES、MIP-1α和MIP-1β诱导的钙流都被相似浓度的PA14所抑制(未显示数据)。所有mAb都不能在内源表达CXCR4的L1.2-CCR5+细胞中影响由SDF-1诱导的钙转移(未显示数据)。最后,mAb或CC趋化因子都不能在亲本L1.2细胞中影响胞质钙水平(未显示数据)。
5)mAb对CCR5辅助受体功能的抑制
最初是根据它们抑制由HIV-1包膜介导的细胞-细胞融合的能力而选择了mAb PA8-PA12和PA14。对纯化的mAb的这种能力进行了确认和定量。正如预料的,所有六种mAb以及mAb 2D7都在RET测定法中阻断CD4+CCR5+PM1细胞与HeLa-EnvJR-FL +细胞之间的融合。效力的排列顺序是2D7~PA14>PA12>PA11>PA10~PA9~PA8(图6A)。PA14和2D7的IC50值分别是1.7μg/ml和1.6μg/ml,PA11和PA12分别是25.5μg/ml和 10.0μg/ml(图3)。PA8、PA9和PA10在300μg/ml将融合抑制了只有10-15%。所有mAb都不能抑制PM1细胞与表达来自X4病毒的全长包膜蛋白的HeLa-EnvLAI+细胞之间的融合(未显示数据)。
还测试了不同抗CCR5mAb在单轮复制、基于荧光素酶的侵入测定法中抑制原型R5病毒、JR-FL、和R5X4病毒Gun-1的能力。在侵入测定法中的效力的排列顺序与在细胞-细胞融合测定法中测定得到的相似(图6B)。使用PA8-PA11不能得到对JR-FL或Gun-1侵入的>50%抑制。PA12的IC50值是2.5μg/ml。然而,对于这种mAb不能得到>60%的侵入抑制。PA14和2D7抑制JR-FL侵入的IC50值分别测定为0.024和0.026μg/ml(图3),比在融合测定法中获得的低60倍。双重向性Gun-1的侵入对抗CCR5mAb的抑制比JR-FL侵入敏感2-3倍(未显示数据)。
抗辅助受体mAb可能或是通过直接影响gp120/CCR5相互作用或是通过阻止涉及活性融合复合物形成的结合后步骤来抑制由包膜介导的融合。为了确定PA8-PA12和PA14抑制病毒融合和侵入的机制,还测试了不同mAb阻断gp120/CCR5相互作用的能力。为此,使用了检测复合了sCD4的生物素化HIV-1JR-FL gp120结合L1.2-CCR5+细胞的测定法。在缺乏sCD4或CCR5时,或者在使用HIV-1LAI gp120时,没有观察到生物素化gp120的结合(图6C)。
除了PA8以外,所有mAb都能消除gp120/sCD4结合L1.2-CCR5+(图6D)。PA8的抑制在约40%时饱和,这与流式细胞计量术的数据一致(图1),说明这种mAb只结合L1.2-CCR5+细胞上CCR5分子的一个子集。mAbPA9、PA10、PA11和PA12抑制结合,IC50值分别为0.24、0.13、0.33和0.24μg/ml(图3)。令人惊讶的是,mAb PA14和2D7是gp120/sCD4结合的两种最低效率的抑制剂,IC50值分别为1.58和1.38μg/ml(图3)。因此,mAb抑制由gp120/CD4/CCR5介导的融合和侵入的能力与其阻断gp120/sCD4结合辅助受体的能力之间没有关联。
6)抗CCR5mAb与其它病毒侵入抑制剂联合对HIV-1融合的协同抑制
辅助受体特异性试剂可以在侵入过程的多个阶段发挥作用,并在联合使用时展示非添加效应。从临床观点上说,重要的是要测定辅助受体特异性药物候选物与可能提供某种水平针对疾病进展起保护作用的内源趋化 因子的相互作用。因此,测试CCR5mAb彼此、或与RANTES、或与结合HIV-1gp120而抑制附着于靶细胞的CD4-IgG2的联合。在病毒融合和侵入测定法中获得试剂单独和联合使用时的剂量应答曲线。使用中值效应原理(9)分析数据。在数量上比较产生指定效应所需要的单一试剂或其混合物的浓度即称为联合指数(CI)的术语。CI值超过1指示拮抗剂,CI约为1指示添加效应,而CI低于1指示协同效应即一种试剂的存在增强另一种试剂的效果。
PA12和2D7的联合具有最强协同效力,根据抗体比例CI值的范围在0.02-0.29之间(图7和图2)。已知协同程度随着试剂的化学计量而变化。病毒侵入和融合测定法在鉴定高度协同的PA12和2D7、中度协同的PA12和PA14、添加的PA11和PA12、以及微弱拮抗的PA14和2D7mAb联合时是一致的。考虑到根据流式细胞计量术的测定(未显示数据)PA14与2D7交叉竞争与CCR5+细胞的结合,这两种mAb之间缺乏协同并不出人意料。PA11与PA12之间添加效应的观察结果可能指示CCR5中略微不同的表位,它们共享对Nt中残基Q4的依赖型。
还测试了mAb PA12、PA14和2D7与RANTES协同阻断细胞-细胞融合的能力。PA12与RANTES的联合展示中度协同(图2)。PA14和2D7展示与RANTES没有协同,这与这些mAb抑制RANTES结合和信号是一致的(图5A、5B)。最后,我们测试了mAb PA12、PA14、2D7和与gp120相互作用的CD4-IgG2之间的协同。我们观察到PA12与CD4-IgG2之间的中度协同,而PA14或2D7与CD4-IgG2之间没有协同(图2)。
C.试验讨论
分离并表征了六种鼠抗CCR5IgG1mAb。尽管PA8、PA9、PA11、PA12和PA14属于不同的分子种类,而PA9和PA10通过分析不能区分,因而可能是相同的mAb。分离的所有mAb都识别复杂的构象表位,正如针对天然的细胞表面蛋白质所生产的mAb的常见情况。使用一组CCR5丙氨酸点突变体对所有mAb进行了表位作图。假设相似影响所有mAb结合的残基引起辅助受体的构象扰动但不构成mAb表位的一部分。只有两个这样的残基即Y10和D11显示影响HIV-1侵入(20,52)。PA8、PA11和PA12表位完全位于Nt结构域内。与此结果一致,PA8能够在ELISA中结合包 含残基D2至R31的生物素化Nt肽(未显示数据)。然而,其结合只强烈依赖Q4的PA11和PA12在溶液中不结合Nt肽(未显示数据)。一种可能性是Nt肽不采取PA11和PA12所识别的正确构象,而PA8结合可能不太依赖构象。或者,PA11和PA12可能与我们尚未突变的残基相互作用,或者位于CCR5其它结构域中的氨基酸形成弱键,或者结合其呈现未曾因诱变而改变的肽主链原子。抗体PA9、PA10和PA14识别包含CCR5 Nt和ECL2两个结构域中的残基的表位,而2D7表位完全位于ECL2中。
PA14表位包含Nt中的D2和ECL2中的R168二者,指示这两个残基在mAb足迹(footprint)图谱的内容中彼此邻近。它们甚至可能通过它们的相反电荷而彼此直接相互作用。
mAb PA8-PA12和PA14以不同强度且以依赖细胞类型的方式将CCR5+细胞染色。除了PA8以外,所有mAb将染色>90%的L1.2-CCR5+ 细胞,使用PA11和PA12时观察到最高平均荧光强度。然而,PA14和2D7将最高百分比的PBMC染色,也在这些细胞上产生最高平均荧光强度。Hill等人(28)最近鉴定了将转染细胞相似染色的一组抗CCR5 mAb,但是八种中只有两种将PBMC染色,而且都不能将原代单核细胞染色。对CCR5的低亲和力可能是这两种mAb与原代细胞没有反应性的原因,但是这不可能是其它四种不能反应的解释。在我们的mAb组中,我们观察到mAb 2D7和PA14对PBMC的最大强度染色,它们的表位完全或部分位于ECL2的前十个残基中。然而,Hill等人报道了对Nt和ECL1特异的mAb将PBMC染色,而针对ECL2和ECL3的mAb不能将PBMC染色,因而尚未鉴定反应性的一致模式。mAb的细胞类型特异性染色的一种解释是激活后的PBMC(和单核细胞)分泌CC-趋化因子,它们结合细胞表面CCR5而掩盖有些mAb表位。然而,希望这对PA14和2D7尤其正确,它们是由趋化因子诱导的钙转移的拮抗剂,并且大概与CC-趋化因子竞争CCR5结合。至今这些mAb将PBMC染色的强度最大。或者,不同CCR5表位暴露可能反映了细胞类型特异性受体的寡聚化、与其它细胞表面分子的关联、或不同翻译后修饰诸如糖基化。我们已经显示了mAb结合的差异可能不反映CD4/CCR5相互作用中的细胞类型特异性差异。
MAb PA8-PA12在CCR5+细胞中不抑制由CC-趋化因子诱导的钙转 移,它们也不介导经由CCR5的信号。MAb 2D7和PA14是由CC-趋化因子诱导的钙转移的抑制剂,但是2D7的效力几乎比PA14高一个数量级。这可能是因为PA14表位与CCR5上CC-趋化因子结合结构域的重叠程度低于2D7表位。所有mAb也都阻断HIV-1侵入和由包膜介导的膜融合,但是在某些情况中细胞-细胞融合抑制所需要的抗体比阻断病毒侵入的需要几乎高两个数量级。与病毒-细胞融合相比,大概在细胞-细胞融合过程中建立了更多的gp120/CD4/CCR5相互作用以及粘附分子之间的相互作用并且协同作用,使之更难以抑制。在使用针对LFA-1或HIV-1包膜糖蛋白的抗体时常常观察到这种现象(45,51)。甚至在最高抗体浓度,PA8、PA9和PA10也不能将细胞-细胞融合阻断>15%,而且不能将病毒侵入阻断>40%。然而,使用PA11、PA12和PA14能够获得>90%的融合抑制,而且使用PA14能够获得>90%的侵入抑制。六种mAb中阻断融合和侵入效力最大的是PA14,它像2D7一样有效。令人惊讶的是,PA14和2D7是gp120/sCD4结合L1.2-CCR5+细胞的最小效力抑制剂,而PA9-PA12的阻断效力相似,而PA8不能将gp120/sCD4结合阻断>40%。这些观察结果提出了关于不同细胞上展示的CCR5分子的本质以及病毒融合和侵入的抑制机制的问题。可能mAb和gp120结合测定法中所使用的L1.2细胞上的CCR5与mAb结合测定法中所使用的PBMC上的CCR5或者与融合和侵入测定法中所使用的PM1和U87MG细胞上的CCR5并非处于相同构象。
我们的一些mAb对PBMC的低染色以及对融合和侵入的部分抑制指示它们只能够结合原代淋巴细胞、PM1和U87MG-CD4+CCR5+细胞系上表达的CCR5分子的一个子集。然而,除了PA8以外,所有mAb都能够将L1.2-CCR5+细胞染色>90%,而且能够完全阻断gp120/sCD4复合物与这些细胞的结合。L1.2-CCR5+细胞与我们已经使用的其它细胞之间的至少一个差异是细胞表面辅助受体蛋白质的密度。事实上,我们估计L1.2-CCR5+ 细胞比PM1和U87MG-CD4+CCR5+细胞多表达10-100倍细胞表面辅助受体。但是,在改造HeLa细胞瞬时表达与L1.2-CCR5+细胞系同样多的辅助受体后,我们仍然不能检测到与它们结合的gp120/sCD4(未显示数据)。因此,L1.2上CCR5的过度表达以及其它细胞特异性因子可能促成显著暴露Nt使之更易于mAb和gp120二者接近的辅助受体构象。这种构象可能 是由受体寡聚化、细胞表面蛋白质关联的减少或改变、或者受体与G蛋白的相互作用所诱导的(25,62)。细胞表面是否共存多种CCR5构象,而且它们是否都容许病毒侵入?mAb的反应性模式将回答它,因为在mAb浓度饱和gp120结合L1.2-CCR5+细胞所需要的表位时,HIV-1侵入和融合也能够发生,尽管水平降低。我们支持下面的假说:L1.2-CCR5+细胞上存在的辅助受体分子具有HIV-1侵入受纳构象,而PBMC、PM1和CCR5+ U87MG上的CCR5分子存在展示不同mAb反应性的多种侵入受纳状态。虽然PA14和2D7可能识别所有构象,但是其它mAb可能不行。为什么L1.2细胞有助于特定融合受纳构象仍然有待确定。
最近证明了gp120结合结构域位于CCR5Nt结构域的前20个残基中。针对CCR5上gp120结合结构域的mAb有效阻断这种相互作用,但是在抑制HIV-1融合和侵入靶细胞方面几乎不像表位位于该区域以外的PA14和2D7那样有效。PA14识别Nt尖端和ECL2中的残基,而2D7表位完全位于ECL2中。只能推测这些mAb的作用机制。可能它们与ECL2前几个残基的结合诱导辅助受体构象变化而防止膜融合。或者,ECL2表位位阻可能阻碍了辅助受体寡聚化和融合受纳蛋白质复合物的形成。还有另一种可能性是ECL2中的残基面向融合核的内部,而且mAb的结合阻碍gp41将融合肽插入质膜。相反,mAb PA8-PA12可能只是通过直接竞争与gp120/CD4复合物的结合来抑制融合和侵入。我们不知道表位暴露和CCR5亲和力以外的参数是否决定这些mAb抑制病毒侵入的功效。尚不清楚为什么gp120/辅助受体相互作用之后的抑制步骤比直接阻断该相互作用更加有效。一种解释方式是假设与CCR5结合的gp120的解离速率比与CCR5结合的mAb的结合速率低得多。因此,每次mAb将自身与辅助受体分子脱离,病毒粒相关gp120分子就以准不可逆方式替代它,因为这种相互作用导致膜融合。
抗-CCR5mAb联合之间的协同可能是它们与参与HIV-1侵入相互依赖性连续步骤的不同表位相互作用的结果。在PA12与2D7之间观察到的协同程度(在许多情形下CI<0.1)是异常的,因为对于抗HIV-1抗体(33,35,61)、逆转录酶抑制剂(29)、或蛋白酶抑制剂(44)的联合很少观察到CI值<0.2。由于其效力,在多种测定方式和浓度比例中检查PA12∶2D7 联合,观察到一贯高水平的协同。对于与PA14联合的PA12观察到中度协同。我们还观察到PA12与CD4-IgG2之间的中度协同。CD4/gp120复合物是亚稳定的,而且若它不能与辅助受体相互作用则衰退成非融合原状态(45-48)。由于PA12直接阻断CCR5上的gp120结合位点,因此它的存在可能将平衡转向gp120/CD4复合物的失活。这将解释为什么我们观察到CD4-IgG2与mAb PA12之间在抑制融合和侵入方面的协同。mAb PA14与CD4-IgG2之间缺乏协同说明它们作用于病毒侵入过程中两个不连续的且独立的步骤。将需要联合进一步的研究来确定不同化合物在抑制病毒融合和侵入方面的协同的精确机制。
上述结果与HIV-1侵入以三个不同步骤发生的模型一致,即受体结合、辅助受体结合和由辅助受体介导的膜融合。单克隆抗体阻断gp120结合以及HIV-1融合/侵入的能力之间缺乏联系说明辅助受体结合与融合事件是分开的。观察到的协同模式进一步说明了融合过程中各个事件的顺序。有效抑制该过程中间步骤即gp120结合的试剂诸如PA12与其之前和之后步骤的抑制剂协同作用。
实施例2
背景:
日益增多的多药抗性HIV-1要求寻找新型抗逆转录病毒试剂。CCR5是原代HIV-1分离株的必需融合辅助受体,而且为抗病毒疗法提供了有希望的靶。PRO140是在体外在不影响CCR5趋化因子受体活性的浓度下有效抑制HIV-1侵入和复制的抗-CCR5单克隆抗体。在本研究中,我们使用HIV-1感染的治疗性动物模型评估了PRO 140的体内治疗潜力。
方法:
用正常人PBMC重建CD-17SCID小鼠,并感染R5分离株HIV-1JR-CSF。在达到病毒稳定状态时,用PRO 140或对照抗体腹膜内处理动物,并使用Roche Amplicor测定法监测病毒负荷。初步研究检验了单剂1mg剂量的PRO 140。在多剂量研究中,每三天施用一次PRO 140达三周,剂量范围0.1-1.0mg。在分开的试验中,使用流式细胞计量术来检验PRO140注射后淋巴细胞损耗的可能性。
结果:
单剂和多剂PRO 140都将所有经处理动物中的病毒负荷降低至检测不到的水平,而且病毒负荷降低的范围达到1.8log10。单次注射PRO 140后观察到病毒复制的暂时控制,而多次注射导致控制延长,而且没有证据表明治疗过程中发生病毒反弹。在由PRO 140介导的病毒负荷降低的动力学中观察到依赖剂量的差异。流式细胞计量术分析显示PRO 140处理不导致淋巴细胞损耗,确认了对体内病毒复制的影响只是归于CCR5阻断。
结论:
PRO 140在控制HIV-1感染hu-PBL-SCID小鼠模型中建立的HIV-1感染方面高度有效。这些发现为概念即具体而言的PRO 140疗法和一般而言的CCR5抑制剂疗法提供了体内证据。
实施例3
方法:
使用本文描述的方法,对人源化CCR5抗体(huPRO 140)测试在L1.2-CCR5细胞中阻断由RANTES诱导的钙转移的能力和在人PBMC中阻断HIV-1CASEC 1/85复制的能力。
结果:
图19中所示结果显示了人源化CCR5抗体有效阻断HIV-1而非RANTES。
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