MXPA04008153A - Anticuerpo anti-ccr5. - Google Patents

Abstract

La invencion esta dirigida a un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende el producto de expresion de un plasmido denominado pVK:HuPRO140-VK (designacion de deposito ATCC PTA-4097), y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende un producto de expresion de cualquiera de un plasmido denominado pVg1:HuPRO140 HG2-VH (designacion de deposito ATCC PTA-4098) o un plasmido denominado pVg1:HuPRO140 (mut B+D+I) -VH (designacion de deposito ATCC PTA-4099) o un fragmento de los mismos que se una a CCR5 en la superficie de una celula de humano.

Description

ANTICUERPO ANTI-CCR5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION El virus de inmuno deficiencia humana tipo 1 (VIH-1) induce la fusión viral a membrana celular para ganar acceso al interior de las células objetivo (8, 15, 66) . La primera interacción de alta afinidad entre el virión y la superficie celular es la unión de la glucoproteína gpl20 de superficie viral al antígeno CD4 (13, 30, 41, 42) . Esto a su vez induce cambios conformacionales en gpl20, los que permiten que ésta interactúe con uno de varios receptores de quimiocina (4, 5, 21, 36) . El receptor de CC-quimiocina, CCR5, es el principal co-receptor para cepas "macrófago- trópicas" (R5) y juega un papel importante en la transmisión sexual de VIH-1 (4, 5, 21, 36) . Los virus "línea celular T-trópicos" (X4) utilizan a CXCR4 para entrar a las células objetivo, y normalmente, pero no siempre, surgen poste iormente al avanzar la enfermedad o como una consecuencia de la propagación viral en cultivo de tejidos (4, 5, 21, 36) . Algunos aislados de VIH-1 primarios son "dual -trópicos" (R5X4) debido a que éstos pueden usar ambos co-receptores , aunque no siempre con la misma eficiencia (11, 57) . Los estudios de mutagénesis acoplados con la resolución de la estructura cristalina del centro de gpl20 demuestran que el sitio de unión al co-receptor en gpl20 comprende varios residuos conservados (32, 53, 65) . Se ha demostrado que las tirosinas y los residuos cargados negativamente en el dominio amino-terminal (Nt) de CCR5 son esenciales para la unión de gpl20 al co-receptor, y para la fusión y entrada de VIH-1 (6 , 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54) . Los residuos en los bucles extracelulares (ECL) 1-3 de CCR5 son prescindibles para la función del co-receptor, sin embargo se debe mantener la configuración inter-dominio de CCR5 para la fusión y entrada viral óptima (24) . Esto conduce a la conclusión que gpl20 puede formar interacciones con una superficie difusa en los ECL, o que el Nt se mantiene en una conformación funcional mediante enlaces con residuos en los ECL. Los estudios con co- receptores quiméricos y anticuerpos monoclonales anti-CCR5 también han demostrado la importancia de los bucles extra-celulares para la entrada viral (5, 54, 64) . Las moléculas que se unen específicamente a CCR5 y CXCR4 y bloquean las interacciones con sus ligandos son una herramienta poderosa para sondear adicionalmente las relaciones estructura- función de los co-receptores . La caracterización de dichos compuestos también podría ayudar a diseñar agentes terapéuticos efectivos que seleccionen como objetivo los pasos mediados por co-receptor de la entrada viral. Los inhibidores de la función del co-receptor de CCR5 o CXCR4 identificados hasta la fecha son de naturaleza diversa e incluyen moléculas pequeñas, péptidos, quimiocinas y sus derivados, y anticuerpos monoclonales (mAbs) . Aún no se entienden bien los mecanismos de acción de las moléculas pequeñas que bloquean la entrada interfiriendo con la función del co-receptor de CXCR4 (17, 49, 55, 68) . Uno de dichos inhibidores, la molécula pequeña aniónica AMD3100, depende de los residuos en ECL2 y del cuarto dominio trans -membrana (TM) de CXCR4 para inhibir la entrada viral, pero aún no es claro si ésta lo hace alterando la unión de gpl20 a CXCR4 o alterando los pasos posteriores a la unión que conducen a la fusión a membrana (16, 34, 55) . Hasta la fecha, no se han reportado moléculas pequeñas que bloqueen específicamente la entrada de VIH-1 mediada por CCR5. La inhibición de la entrada de VIH-1 por quimiocinas es mediada por lo menos mediante dos mecanismos distintos: bloqueo de la interacción gpl20/co-receptor e internalizacion del complejo quimiocina/receptor (3, 26, 59, 63 ) . La variante AOP-RANTES también inhibe el reciclamiento de CCR5 hacia la superficie celular (40, 56) . Las variantes tales como RANTES 9-68 y Met-RANTES únicamente previenen la interacción de gpl20/CCR5 y no regulan en forma negativa a CCR5 (67) . Se cree que las variantes SDF-1 actúan a través de un mecanismo similar para bloquear la entrada viral mediada por CXCR4 (12, 27, 39) . Solamente un mAb anti-CXCR4, 12G5, ha sido caracterizado respecto a sus propiedades antivirales. Se reporta que la eficiencia de 12G5 para inhibir la entrada viral depende tanto de la célula como del aislado (43, 58) . Este mAb se une al ECL2 de CXCR4 , pero se desconoce el mecanismo mediante el cual éste inhibe la entrada (7) . Unos cuantos de los mAbs anti-CCR5 caracterizados hasta la fecha evitan de manera eficiente la entrada de VIH-1 (28, 64) . Como un aspecto interesante, los mAbs cuyos epítopes residen en el dominio Nt de CCR5 , el cual contiene el sitio de unión de gpl20, inhibe la fusión y entrada viral en una forma menos eficiente que el mAb 2D7 , cuyo epítope reside en ECL2. 2D7 también antagoniza la actividad de CC-quimiocina (64) . Se ha aislado y caracterizado un panel de seis mAbs de múrido, designados PA8, PA9 , PA10, PA11, PA12, y PA14. Todos los seis mAbs se unen específicamente a las células CCR5+ pero con eficiencias diferentes que dependen del tipo celular. Los estudios de mapeo de epítope identifican a los residuos que son importantes para la unión a mAb y también revelan información acerca del plegamiento y las interacciones de los dominios extracelulares de CCR5. Todos los mAbs inhiben la fusión y entrada de VIH-1, pero no existe una correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión y entrada y su capacidad para inhibir la unión de gpl20/sCD4 a las células CCR5+.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención provee un anticuerpo anti-CCR5 el cual comprende (i) dos cadenas ligeras, cada una de las cadenas ligeras comprende el producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) dos cadenas pesadas, cada una de las cadenas pesadas comprende el producto de expresión ya sea de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl:HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de dicho anticuerpo, el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano. Esta invención también provee un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, cada una de las cadenas comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácido se indica en SEQ ID NO: 6, y dos cadenas pesadas, cada una de las cadenas pesadas comprende aminoácidos consecu ivos, cuya secuencia se indica en SEQ ID NO: 9. Esta invención también provee un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, cada cadena comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 6, y dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende aminoácidos consecuti os, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 12. Esta invención también provee un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 6. En la modalidad actual, el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 5. Esta invención también provee un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 9. En la presente modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 8. Esta invención también provee un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO: 12. En la presente modalidad, el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 11. Esta invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo anti-CCR5, o un fragmento del mismo, como se describió anteriormente, junto con un vehículo. Esta invención también provee una composición que comprende al anticuerpo anti-CCR5, o un fragmento del mismo, que tiene unido al mismo un material tal como un radioisótopo, una toxina, pol iet i lengl icol , un agente citotóxico y/o una marca detectable . Esta invención también provee un método para inhibir la infección de una célula CD4+ que comprende poner en contacto la célula CD4+ con un anticuerpo que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende al producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPR0140 - VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión ya sea de un plásmido designado pVgl : HuPROl 40 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula CD4 + , en una cantidad y bajo condiciones tales que se inhiban la fusión de VIH-1 o de una célula infectada con VIH-1 a la célula CD4+, con lo cual se inhibe la infección por VIH-1 de la célula CD4+ . Esta invención también provee un método para tratar un individuo afligido con VIH-1 que comprende administrar al individuo una dosis efectiva para tratamiento de VIH-1 de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende al producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPROl 40 - VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión ya sea de un plásmido designado pVgl : HuPROl 40 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR01 0 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo, el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano, bajo condiciones efectivas para tratar al individuo infectado con VIH-1. Esta invención también provee un método para evitar que un individuo contraiga una infección por VIH-1 que comprende administrar al individuo una cantidad de dosis efectiva para evitar la infección por VIH-1 de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende al producto de expresión de un plásmido designado pVK: HuPRO140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende al producto de expresión ya sea de un plásmido designado pVgl : HuPR01 0 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo, el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano, bajo condiciones efectivas para evitar la infección por VIH-1 en el individuo. Esta invención también provee un conjugado de anticuerpo anti-CCR5 que comprende un anticuerpo anti-CCR5 el cual comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende al producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPROl 40 - VK (designación de depósito ATCC PTA-4097), y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende al producto de expresión ya sea de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099), o un fragmento de dicho anticuerpo que se una a CCR5 en la superficie de una célula de humano, conjugado por lo menos con un polímero. Esta invención también provee un método para inhibir la infección de una célula CCR5+ por VIH-1 que comprende administrar a un individuo en riesgo de infección por VIH-1 el conjugado antes descrito en una cantidad y bajo circunstancias efectivas para inhibir la infección por VIH-lde las células CCR5+ del individuo. Esta invención también provee un método para tratar una infección por VIH-1 en un individuo, que comprende administrar el conjugado antes descrito a un individuo infectado con VIH-1 en una cantidad y bajo condiciones efectivas para tratar la infección por VIH-1 del individuo. Esta invención también provee una célula hospedera transformada que comprende por lo menos dos vectores, por lo menos un vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CCR5, y por lo menos un vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5, en la cual el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 9, y dos cadenas ligeras que tienen la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 6. Esta invención también provee una célula hospedera transformada que comprende por lo menos dos vectores, por lo menos un vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CCR5, y por lo menos un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5, en el cual el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 12 y dos cadenas ligeras que tienen la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 6. Esta invención también provee un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9. Esta invención también provee un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 12. Esta invención también provee un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 el cual comprende cultivar una célula hospedera que contenga en la misma (i) un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR01 0 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) bajo condiciones que permitan la producción de un anticuerpo que comprenda dos cadenas ligeras codificadas por el plásmido designado pVK : HuPROl 40 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) y dos cadenas pesadas codificadas ya sea por el plásmido designado pVg1 : HuPROl 40 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o por el plásmido designado pVgl : HuPROl 40 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , para que de esta manera se produzca un anticuerpo anti-CC 5. Esta invención también provee un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR.5 que comprende a) transformar una célula hospedera con (i) un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) y (ii) cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2 -VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVg1 : HuPRO140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , y b) cultivar la célula hospedera transformada bajo condiciones que permitan la producción de un anticuerpo que comprenda dos cadenas ligeras codificadas por el plásmido designado pVK:HuPRO140-VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) y dos cadenas pesadas codificadas ya sea por el plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o por el plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , para que de esta manera se produzca un anticuerpo anti-CCR5. Esta invención también provee un estuche para ser utilizado en un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5. El estuche comprende a) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6, y b) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, o un vector que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 12.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 Unión de anticuerpos monoclonales anti-CCR5 a células CCR5* Se utiliza citometría de flujo para detectar la expresión de la proteína CCR5 en la superficie de células L1.2-CCR5+ y de PBMC recién aisladas, estimuladas con PHA/IL-2. Las células se incuban con concentraciones de saturación de cada mAb, el cual se detecta con un anticuerpo reportero anti-IgG de ratón marcado con PE. Se muestran los resultados provenientes de un experimento representativo. Los resultados para cada mAb se expresan tanto en intensidades de fluorescencia promedio (m. f. i.) como en % de células separadas. Debido que PA8-PA12 y PA14 son todos de la subclase IgGl, sus m. f . i. se pueden comparar directamente. 2D7 es una IgG2a.

Figura 2 Valores CI para combinaciones diferentes de mAbs e inhibidores virales Se efectúan experimentos similares a aquellos descritos en la leyenda de la Figura 7 para combinaciones diferentes de inhibidores de la entrada viral. Se evalúan mAbs anti-CCR5 en combinación uno con el otro, CC-quimiocinas, y CD4-IgG2, los cuales inhiben la unión de VIH-1 a las células objetivo. El intervalo de concentración de PA11 y PA12 es 0-250 yg/ml; el intervalo de concentración de 2D7 y PA14 es 0-25 yg/ml; el intervalo de concentración de RANTES es 0-250 ng/ml ; el intervalo de concentración de CD4 -IgG2 es 0-25 yg/ml. Las concentraciones de agentes individuales o sus mezclas requeridas para producir el 50% y el 90% de inhibición de fusión o de entrada se comparan cuantitativamente en un término conocido como el Indice de Combinación (IC) .

Figura 3 Valores de CI50 para la inhibición de la fusión célula-célula, entrada viral y unión gpl20/sCD4 mediante mAbs anti-CCR5 Para propósitos de comparación se muestra en forma resumida los valores de CI50 obtenidos en las diferentes pruebas en las que se evalúan los mAbs anti-CCR. Sólo se calculan valores de CI50 para mAbs que puedan inhibir más del 90% de fusión, entrada o unión.

Figura 4 Mapeo de epítope de mAbs anti-CCR Se utiliza un protocolo de tinción con dos colores para evaluar la unión de los mAbs a proteínas CCR5 mutantes, marcadas en el extremo C-terminal con un péptido HA. Se incuban células HeLa que expresan mutantes de punto de CCR5 con concentraciones de saturación de cada mAb seguido por detección con un anti-IgG de ratón marcado con PE. Se mide la expresión del co-receptor de superficie celular mediante tinción doble de las células con un mAb anti-HA marcado con FITC. Las cuatro retículas corresponden a los cuatro dominios extracelulares de CCR5. La primera hilera de cada retícula indica la secuencia de aminoácido del dominio extracelular de CCR5 correspondiente (SEQ ID NOS : 1-4) . La unión de los mAbs anti-CCR5 al mutante de alanina de cada residuo se expresa como un porcentaje de unión al CCR5 de tipo silvestre, como se describe en la Sección de Materiales y Métodos.

Figura 5 Inhibición de la movilización de calcio hacia el interior de las células CCR5"1" mediante mAbs anti-CCR5 Se cargan células L1.2-CCR5+ con Indo-IAM y se estimulan en forma secuencial con un mAb anti-CCR5 o con PBS, seguido con RANTES (a) . Los cambios de fluorescencia se miden con un espectrof luorómetro y los trazos provienen de un experimento representativo. Se evalúa la inhibición del flujo de calcio mediante PA14 y 2D7 para una amplia gama de concentraciones de mAb (b) . Los resultados se graf ican como % de inhibición del influjo de calcio = [1- (fluorescencia relativa en presencia de mAb ÷ fluorescencia relativa en ausencia de mAb)] x 100%, y son los promedios de valores provenientes de tres experimentos independientes .

Figura 6 Inhibición de la función del co-receptor de CCR5 mediante mAbs anti-CCR5 Se evalúa la inhibición de la fusión célula-célula mediante mAbs anti-CCR5 en la prueba RET. Se agregan 0-250 vq/ml de PA8-PA12, o 0-25 vq/ml de PA14 o 2D7, a una mezcla de células HeLa - EnvJR-FL+ y PM1 , marcadas con F18 y R18 respectivamente. Se mide la fluorescencia de RET después de 4 horas de incubación. Los resultados son los valores promedio provenientes de tres experimentos independientes y se expresan como % de inhibición de fusión [1 - (% de RET en presencia de mAb ÷ % de RET en ausencia de mAb) ] x 100%. Se evalúa la inhibición de la entrada de VIH-1 mediante mAbs anti-CCR5 en una sola ronda de prueba de entrada basada en luciferasa de replicación (b) . Se infectan células U87 -CD4+CCR5+ con virus reportero NLluc+env" que porta la cubierta JR-FL en presencia de 0-250 pg/ml de PA8-PA12, o 0-25 pg/ml de PA14 o 2D7. Se mide la actividad de luciferasa (unidades de luz relativas, r. 1. u.) en Usados celulares 72 horas después de la infección. Los resultados provienen de un experimento representativo y se expresan como % de inhibición de entrada = [ 1 - (r. 1. u. en presencia de mAb ÷ r. 1. u. en ausencia de mAb) ] x 100%. Unión de complejos gpl20, sCD4 y b-gpl20-CD4 tratados con biotina [b] a células L1.2-CCR5+ (c) . Se observa unión fuerte cuando se compleja gpl20 obtenida a partir del virus R5 VIH-1 JR-FL con una cantidad equimolar de sCD4. No se observa unión en ausencia de sCD4 o para gpl20 obtenida a partir del virus VIH-lLAi . Se resta la unión de fondo a células CCR5-L1.2 de todas las curvas. Se evalúa la inhibición de unión de gpl20/sCD4 a las células L1.2-CCR5+ en presencia de concentraciones variables de cada anticuerpo (d) . Las células se pre-incuban en placas de 96 cavidades con un mAb anti-CCR5 seguido por una incubación con una concentración de saturación de gpl20 -biotina/ sCD4. Por último, se mide la unión de estreptavidina marcada con PE a células utilizando una lectora de placas de fluorescencia. Los resultados provienen de un experimento representativo y se expresan como % de inhibición de unión de gpl20/sCD4 = [l-(m. f. i. en presencia de mAb ÷ m. f. i. en ausencia de mAb)] x 100%.

Figura 7 Inhibición sinergística de la fusión célula-célula mediante PA12 y 2D7 Se obtienen curvas dosis-respuesta para los mAbs utilizados de manera individual y en combinación. Se agregan 0-50 g/ml de PA12, 0-25 g/ml de 2D7, o una combinación de los dos en una relación 2:1, a una mezcla de células HeLa - EnvJR_FL+ y PM1 , marcadas con R18 y F18 respectivamente. Se mide la fluorescencia de RET después de 4 horas de incubación. Los resultados se expresan como % de inhibición de fusión y son los promedios de valores provenientes de tres experimentos independientes . Los datos se analizan utilizando el principio del efecto de la mediana, la cual se puede escribir como: f = 1/ [1 + (K/c)m] (1) en la cual f es la fracción afectada/ inhibida , c es la concentración, K es la concentración del agente requerida para producir el efecto de la mediana, y m es un coeficiente empírico que describe la forma de la curva dosis-respuesta. La ecuación (1) es una forma generalizada de las ecuaciones que describen las cinéticas enzimáticas de Mic ael i s -Mentón , las isotermas de absorción de Langmuir, y los equilibrios de ionización de Henderson-Hasselbalch , para las cuales m = 1. En el presente caso, K es igual al valor de CI50. K y m se determinan mediante ajuste de curva de las curvas dosis-respuesta y la ecuación (1) se reordena para permitir el cálculo de c para una f determinada. Los parámetros de mejor ajuste para K y c son 8.8 yg/ml y 0.54 para PA12, 0.36 µ?/??? y 0.68 para 2D7, y 0.11 yg/ml y 1.1 para su combinación. Estas curvas se grafican e indican una bondad de ajuste razonable entre el experimento y la teoría.

Figura 8 Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de una versión humanizada del anticuerpo PA14 anti-CCR5 de ratón (SEQ ID NO: 6) y la secuencia de ácido nucleico que codifica para el mismo (SEQ ID NO: 5) , de conformidad con la invención. SEQ ID NO: 7 identifica la región de SEQ ID NO: 5 que codifica para la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6. Esta región variable de cadena ligera está presente en los anticuerpos designados en la presente invención. como PRO140 #1 y #2. Las regiones determinantes de complementariedad ("CDR") están subrayadas .

Figura 9 Esta figura muestra la secuencia de aminoácido de una primera región variable de cadena pesada de una versión humanizada del anticuerpo PA14 anti-CCR5 de ratón (SEQ ID NO: 9) , y la secuencia de ácido nucleico que codifica para el mismo (SEQ ID NO: 8), de conformidad con la invención. SEQ ID NO: 10 identifica la región de SEQ ID NO: 8 que codifica para la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9. Esta región variable de cadena pesada está presente en el anticuerpo designado en la presente invención como PRO 140 #2. Las CDR están subrayadas.

Figura 10 Esta figura muestra la secuencia de aminoácidos de una segunda región variable de cadena pesada de una versión humanizada de anticuerpo humanizado PA14 anti-CCR5 de ratón (SEQ ID NO: 12) y la secuencia de ácido nucleico que codifica para la misma (SEQ ID NO: 11) de conformidad con la invención. SEQ ID NO: 13 identifica la región de SEQ ID NO: 11 que codifica para la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12. Esta región variable de cadena pesada está presente en el anticuerpo designado en la presente invención como PRO 140 #1. Las CDR están subrayadas.

Figura 11 Dos i s individual de ant i cuerpo CC 5 humanizado reduce de manera potente las cargas virales in vivo Se reconstituyen ratones SCID con PBMC de humano normales y se infectan con VIH-1jr-CSF. Cuando se llega a un estado constante viral, los animales se tratan con una sola dosis de 1 mg intraperitoneal de anticuerpo CCR5 humanizado (PRO 140) o de anticuerpo de control de isotipo y se monitorea respecto al ARN de VIH (Prueba Amplicor de Roche) .

Figura 12 Reducción sostenida en carga viral Se recons ituyen ratones SCID con PBMC de humano normales y se infectan con VIH-1jr-CSF- Cuando se alcanza un estado constante viral, los animales se tratan por vía intraperitoneal con dosis de 0.1 mg de anticuerpo CCR5 humanizado (PRO 140) cada tres días y se monitorean respecto al ARN de VIH plasmático (Prueba Amplicor de Roche) .

Figura 13 Demuestra que no existe agotamiento nfocitos con el uso del anticuerpo CCR5 (PRO preparado de conformidad con la invención.

Figura 14 El anticuerpo CCR5 humanizado (PRO 140) bloquea potentemente la fusión célula - cé luí a de VIH-1 mediada por CCR5 Se humaniza el anticuerpo CCR5 de múrido utilizando el método de injerto y sustituciones de marco de trabajo de la región determinante de compl ementariedad- (CDR) . Los anticuerpos CCR5 humanizados (PRO 140 #1 y PRO 140 #2) se expresan en células Sp2-0, se purifican mediante cromatografía de proteína A y se evalúan respecto a la capacidad para bloquear la replicación de VIH-1JR-FL y la fusión a membrana mediada por env como se describe (Litwin, et al., J, Virol. , 70:6437, 1996) .

Figura 15 El anticuerpo CCR5 humanizado (PRO 140) media la inhibición potente, independiente de subtipo de VIH-1 Se evalúan los anticuerpos CCR5 (PRO 140 #1 y #2) de conformidad con la invención respecto a la capacidad de bloquear la replicación de VIH-1 de tipo silvestre en células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) como se describe (Trkola et al., J.

Virol., 72:396, 1998) . El grado de replicación viral se mide evaluando el contenido de antígeno p24 de los sobrenadantes de cultivo de PBMC de 7 días.

Figura 16 Esta figura provee un mapa del plásmido pVK-HuP O140 que codifica para la región variable de cadena ligera de plásmido mostrada en la Figura 8 así como las regiones constantes Kappa de humano como se describe en Co . et al., J. Immunol . , 148:1149, 1992.

Figura 17 Esta figura provee un mapa del plásmido pVg4 -HuPR0140 HG2 que codifica para la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 9 así como para las regiones constantes de la cadena pesada de humano, CH1, gozne, CH2 , y CH3 , de la IgG4 de humano como se describe en Co et al, supra .

Figura 18 Esta figura provee un mapa del plásmido pVg4 -HuPR0140 (mut B+D+I) que codifica para la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 10, así como las regiones constantes de la cadena pesada de humano, CH1, gozne, CH2 , y CH3 , de la IgG4 de humano como se describe en Co et al, supra.

Figura 19 Hu PRO140 bloquea la señalización de VIH-1 pero no la de RANTES Se evalúan los anticuerpos PRO140 de conformidad con la invención respecto a la capacidad para bloquear la movilización de calcio inducida por RANTES en células L1.2-CCR5 (Olson, et al., J. Vi rol., 72: 396, 1998) . Esta figura muestra que un anticuerpo CCR5 humanizado (huPRO140) bloquea la señalización de VIH-1 pero no la de RANTES.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Los plásmidos designados como HuPRO140-V , HuPRO140 (mut +B+D+ 1 ) - VH , y HuPRO140 HG2-VH, a los que se hace referencia en las figuras 16, 18, y 17 como pVK-HuPRO140 , pVg4 -HuPR0140 (mut B+D+I) y pVg4-HuPRO140 HG2 , respectivamente, se depositan en el Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC) , Manassas, Va., EE.UU: 20108 el 22 de febrero de 2002, bajo los números de acceso del ATCC PTA 4097, PTA 4099 y PTA 4098, respectivamente. Estos depósitos se efectúan de conformidad con las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de patente (Tratado de Budapest) . Esta invención provee una composición para inhibir la infección por VIH-1 que comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergí st icamente efectivas para inhibir la infección por VIH-1, en la cual por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusión de VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención, "composición" significa una mezcla. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas apropiadas para administración a un individuo por vía oral, rectal, int ravaginal , tópica, nasal, oftálmica, o parenteral . Tal como se utiliza en la presente invención, "parenteral" incluye pero no se limita a inyecciones por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular, o intra- esternón o técnicas de infusión. Tal como se utiliza en la presente invención, "VIH-1" significa el virus de inmuno deficiencia humana tipo 1. VIH-1 incluye pero no se limita a las partículas de virus extracelulares y a las formas de VIH-1 encontradas en células infectadas por VIH-1.

Tal como se utiliza en la presente invención, "infección por VIH-1" significa la introducción de información genética de VIH-1 dentro de una célula objetivo, tal como mediante fusión de la membrana de la célula objetivo con VIH-1 o una célula con glucoproteína+ de la cubierta de VIH-1. La célula objetivo puede ser una célula corporal de un individuo. En la modalidad preferida, la célula objetivo es una célula corporal de un sujeto humano. Tal como se utiliza en la presente invención, "inhibir la infección por VIH-1" significa la reducción de la cantidad de información genética de VIH-1 introducida en una población de células objetivo en comparación con la cantidad que se podría introducir sin dicha composición. Tal como se utiliza en la presente invención, "compuesto" significa una entidad molecular, incluyendo pero sin limitarse a péptidos, polipéptidos , y otras moléculas orgánicas o inorgánicas y combinaciones de las mismas. Tal como se utiliza en la presente invención, "sinergí sticamente efectiva" significa que el efecto combinado de los compuestos cuando se utilizan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan de manera individual .

Tal como se utiliza en la presente invención, "interacción productiva" significa que la interacción del VIH-1 y del co-receptor de VIH-1 puede conducir a la fusión de dicho VIH-1 o célula con glucoproteína+ de cubierta de VIH-1 y la membrana que porta al co-receptor . Tal como se utiliza en la presente invención, "evita la interacción productiva" significa que se reduce la cantidad de interacción en comparación con la cantidad que podría presentarse sin el compuesto. Las interacciones se pueden evitar enmascarando, o alterando regiones interactivas en el co-receptor o VIH-1 o alterando la expresión, agregación, conformación, o estado de asociación del co-receptor. Tal como se utiliza en la presente invención, "co-receptor de fusión de VIH-1" significa un receptor celular que media la fusión entre la célula objetivo que expresa al receptor y VIH-1 o una célula con glucoproteína+ de la cubierta de VIH-1. Los co-receptores de fusión de VIH-1 incluyen pero no se limitan a CCR5, CXCR4 y otros receptores de quimiocina . Esta invención también provee una composición que inhibe la fusión de VIH-1 o de una célula con glucoproteína+ de la cubierta de VIH-1 a una célula objetivo, que comprende por lo menos dos compuestos en cantidades s inergí st icamente efectivas para inhibir la fusión de VIH-1 o de una célula con glucoproteína+ de la cubierta de VIH-1 a una célula objetivo, en el cual por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusión de VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención, "fusión" significa la conexión o unión de las membranas de bicapa de lípido encontradas en las células de mamífero o de virus tales como VIH-1. Este proceso se distingue del acoplamiento de VIH-1 a una célula objetivo. El acoplamiento es mediado por la unión de la glucoprote ína exterior de VIH-1 al receptor CD4 de humano, el cual no es un co-receptor de fusión. Tal como se utiliza en la presente invención, "inhibe" significa que se reduce la cantidad en comparación con la cantidad que podría estar presente sin la composición. Tal como se utiliza en la presente invención, "célula objetivo" significa una célula susceptible de ser infectada por o que se pueda fusionar con VIH-1 o con células infectadas con VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención, "quimiocina" significa una citocina que puede estimular el movimiento de leucocitos. Estas se pueden caracterizar ya sea como cys-cys o cys-X-cys dependiendo de que los dos residuos de cisteína amino terminales estén inmediatamente adyacentes o separados por un aminoácido. Estas incluyen pero no se limitan a RANTES , ???-?a, ???-?ß, SDF-1 u otra quimiocina que bloquee la infección por VIH-1. En una modalidad de las composiciones anteriores, el co-receptor es un receptor de quimiocina. En la modalidad preferida de las composiciones anteriores, el receptor de quimiocina es CCR5 o CXCR4. Se sabe que muchas otras quimiocinas y co-receptores relacionados funcionan como co - receptores de VIH, incluyendo pero sin limitarse a CCR2 , CCR3 , CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 y APJ (69) . Tal como se utiliza en la presente invención, "receptor de quimiocina" significa un miembro de una familia homologa de siete proteínas de superficie celular con extensión de transmembrana que se unen a las quimiocinas. Tal como se utiliza en la presente invención, "CCR5" es un receptor de quimiocina que se une a miembros del grupo C-C de quimiocinas y cuya secuencia de aminoácidos comprende aquella suministrada en el número de acceso 1705896 de Genbank y las variantes polimórficas relacionadas. Tal como se utiliza en la presente invención, "CXCR4" es un receptor de quimiocina que se une a miembros del grupo C-X-C de quimiocinas y cuya secuencia de aminoácidos comprende aquella suministrada en el número de acceso 400654 de Genbank y las variantes polimórficas relacionadas. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos es una molécula de tipo no peptidilo. En una modalidad, la molécula de tipo no peptidilo es el compuesto bicyclam AMD3100. (16) . Tal como se utiliza en la presente invención, "molécula de tipo no peptidilo" significa una molécula que no consiste en su totalidad de una secuencia lineal de aminoácidos enlazados mediante enlaces peptídicos. Sin embargo, una molécula de tipo no peptidilo puede contener uno o más enlaces pept ídicos . En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de quimiocina.

En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CXCR4. En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-CXCR4 es 12G5. (43) . En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CCR5. El anticuerpo anti-CCR5 incluye, pero no se limita a, PA8 , PA9 , PA10, PA11, PA12 , PA14 y 2D7. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. La relación varía desde 1:1 hasta 1000:1. Los anticuerpos monoclonales PA8 , PA9 , PA10, PA11, PA12 y PA14 se depositaron de conformidad con y en cumplimiento de, los requerimientos del Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de patentes en el Depósito Americano de Cultivos tipo (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 el 2 de diciembre de 1998 bajo los siguientes números de acceso: No. de Acceso ATCC HB-12605 (PA8), No. de Acceso ATCC HB-12606 (PA9) , No. de Acceso ATCC HB-12607 (PA10) , No. de Acceso ATCC HB-12608 (Pll), No. de Acceso ATCC HB-12609 (PA12) , No. de Acceso ATCC HB-12610 (PA14) . En otra modalidad de las composiciones anteriores, dos o más de los compuestos son anticuerpos. En una modalidad de la invención, los anticuerpos incluyen pero no se limitan a PA8 , PA9, PAIO, PA11, PA12, PA14 y 2D7. En esta composición los anticuerpos están en una relación apropiada. La relación varía desde 1:1 hasta 50:1. Tal como se utiliza en la presente invención, "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobul ina que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y que reconozca un antígeno. La molécula de inmunoglobul ina se puede derivar a partir de cualquiera de las clases comúnmente conocidas, incluyendo pero sin limitarse a IgA, IgA de secreción, IgG e IgM. También son conocidas por los expertos en la técnica las subclases de IgG e incluyen pero no se limitan a IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4 de humano. Estas incluyen, a manera de ejemplo, anticuerpos naturalmente presentes y anticuerpos que no se presentan de manera natural. En específico, "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos monovalentes y divalentes de los mismos. Asimismo, "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente sintéticos, anticuerpos de cadena individual, y fragmentos de los mismos. De manera opcional, se puede marcar un anticuerpo con un marcador detectable. Los marcadores detectables incluyen, por ejemplo, marcadores radioactivos o fluorescentes. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen humano o no humano. El anticuerpo de origen no humano puede humanizarse mediante métodos recombinantes para reducir su carácter inmunogénico en el humano. Los métodos para humanizar anticuerpos son conocidos por los expertos en la técnica. Tal como se utiliza en la presente invención, "anticuerpo monoclonal", también denominado como mAb, se utiliza para describir moléculas de anticuerpo cuyas secuencias primarias son esencialmente idénticas y que presentan la misma especificidad antigénica. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante técnicas con hibridoma, recombinantes, transgénicas u otras técnicas conocidas por el experto en el campo. Tal como se utiliza en la presente invención, "anticuerpo anti -receptor de quimiocina" significa un anticuerpo que reconoce y se une a un epítope en un receptor de quimiocina. Tal como se utiliza en la presente invención, "anticuerpo anti-CC 5" significa un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a un epítope en el receptor CCR5 de quimiocina. Tal como se utiliza en la presente invención, "relación apropiada" significa relaciones en masa o molares en las cuales los compuestos son sinergí st icamente efectivos.

En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto es una quimiocina o derivado de quimiocina. Las quimiocinas incluyen pero no se limitan a RANTES, ???-?a, ???-?ß, SDF-1 o una combinación de los mismos. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. Los derivados de quimiocina incluyen pero no se limitan a Met - RANTES , AOP - RANTES , RANTES 9-68, o una combinación de los mismos. Tal como se utiliza en la presente invención "derivado de quimiocina" significa una quimiocina químicamente modificada. Las modificaciones químicas incluyen pero no se limitan a sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácido, adiciones u oxidaciones de tipo no peptidilo. Un experto en la técnica puede elaborar dichos derivados . En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto es un anticuerpo y por lo menos un compuesto es una quimiocina o un derivado de quimiocina. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. La relación varía desde 100:1 hasta 1000:1. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto se une a la subunidad gp41 de la glucoproteína de la cubierta de VIH-1. En una modalidad, por lo menos un compuesto es el péptido T-20 inhibidor de la entrada de VIH-1 (70). En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos inhibe la unión de VIH-1 a una célula objetivo. En una modalidad, por lo menos un compuesto se une a CD4. En una modalidad, por lo menos un compuesto es una glucoproteína de la cubierta de VIH-1. En una modalidad, por lo menos un compuesto es un anticuerpo anti-CD4. En una modalidad, por lo menos un compuesto se une a la glucoproteína de la cubierta de VIH-1. En una modalidad, por lo menos un compuesto es un anticuerpo para la glucoproteína de la cubierta de VIH-1. En una modalidad, por lo menos un compuesto es una proteína basada en CD4. En una modalidad, por lo menos un compuesto es CD4-IgG2. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto es un anticuerpo y por lo menos un compuesto se une a una glucoproteína de la cubierta de VIH-1. En una modalidad, el compuesto es una proteína basada en CD4. En una modalidad, el compuesto es CD4-IgG2. En esta composición, los compuestos están en una relación apropiada. La relación varía desde 1:1 hasta 10:1.

Tal como se utiliza en la presente invención, "acoplamiento" significa el proceso que es mediado por la unión de la glucoproteína de la cubierta de VIH-1 al receptor CD4 de humano, el cual no es un co-receptor de fusión. Tal como se utiliza en la presente invención, "CD4" significa la proteína CD4 unida a membrana, original, madura que comprende un dominio citoplasmático , un dominio de transmembrana hidrofóbico, y un dominio extracelular que se une a la glucoproteína gpl20 de la cubierta de VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención, "glucoproteína de la cubierta de VIH-1" significa la proteína codificada por VIH-1 que comprende a la proteína de superficie gpl20, la proteína de transmembrana gp41 y los oligómeros y precursores de las mi smas . Tal como se utiliza en la presente invención, "proteína basada en CD4" significa cualquier proteína que comprenda por lo menos una secuencia de los residuos de aminoácido correspondientes a aquella porción de CD4 que es requerida para que CD4 forme un complejo con la glucoproteína gpl20 de la cubierta de VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención "CD4-IgG2" significa una proteína de fusión CD4-IgG2 de humano heterotetramérica codificada por los vectores de expresión depositados bajo los números de acceso ATCC 75193 y 75194. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende un polipéptido que se une al epítope de CCR5. En una modalidad, el epítope está localizado en el extremo N-terminal, una de las tres regiones de bucle extracelular o una combinación de los mismos. En una modalidad, el epítope está localizado en el extremo N-terminal. El epítope puede comprender N13 e Y15 en el extremo N-terminal. El epítope puede comprender, comprende Q4 en el extremo N-terminal. En otra modalidad, el epítope incluye los residuos en el extremo N-terminal y un segundo bucle extracelular. El epítope puede comprender D2 , Y3 , Q4 , S7, P8 y N13 en el extremo N-terminal y Y176 y T177 en el segundo bucle extracelular. El epítope puede comprender D2 , Y3 , Q4 , P8 y N13 en el extremo N-terminal y Y176 y T177 en el segundo bucle extracelular. El epítope puede comprender D2 en el extremo N-terminal y R168 y Y176 en el segundo bucle extracelular. En una modalidad, el epítope está ubicado en el segundo bucle extracelular. El epítope puede comprender Q170 4 O y K171 en el segundo bucle extracelular . El epítope puede comprender Q170 y E172 en el segundo bucle extracelular . Tal como se utiliza en la presente invención, a lo largo de la descripción se utilizan las siguientes abreviaturas estándar para indicar aminoácidos específicos: ala = alanina R = arg = arginina asn = asparagina D = asp = ácido aspártico cys = cisteína Q = gln = glutamina glu = ácido glutámico G = gly = glicina his = histidina I = lie = isoleucina leu = leucina K = lys = lisina met = metionina F = phe = fenilalanina pro = prolina S = ser = serina thr = treonina W = trp = triptófano tyr = tirosina V = val = valina Tal como se utiliza en la presente invención, "pol ipépt ido" significa dos o más aminoácidos ligados mediante un enlace peptídico. Tal como se utiliza en la presente invención, "epítope" significa una porción de una molécula o moléculas que forman una superficie para unión de anticuerpos u otros compuestos. El epítope puede comprender aminoácidos contiguos o no contiguos, carbohidratos u otras porciones no peptidilo o superficies específicas de oligómero. Tal como se utiliza en la presente invención, "extremo N-terminal" significa la secuencia de aminoácidos que abarca a la metionina de inicio y a la primera región de transmembrana. Tal como se utiliza en la presente invención, "segundo bucle extracelular" significa la secuencia de aminoácidos que abarca la cuarta y quinta regiones de transmembrana y están expuestas sobre la superficie . En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende una cadena ligera de un anticuerpo. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende una cadena pesada de un anticuerpo. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende la porción Fab de un anticuerpo. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende el dominio variable de un anticuerpo. En otra modalidad, el anticuerpo se produce como un polipéptido individual o anticuerpo de "una sola cadena" el cual comprende los dominios variables de cadena pesada y ligera ligados genéticamente mediante una secuencia intercalada de aminoácidos. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende una o más porciones de CDR de un ant i cuerpo . Tal como se utiliza en la presente invención, "cadena pesada" significa el polipéptido más grande de una molécula de anticuerpo constituida por un dominio variable (VH) y tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2 , CH3 y CH4) , o fragmentos de los mi smos . Tal como se utiliza en la presente invención, "cadena ligera" significa el polipéptido más pequeño de una molécula de anticuerpo constituido por un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL) , o fragmentos de los mismos. Tal como se utiliza en la presente invención, "Fab" significa un fragmento de unión a antígeno monovalente de una inmunoglobul ina que consiste de una cadena ligera y parte de una cadena pesada. Este se puede obtener mediante digestión breve con papaína o mediante métodos recombinantes . Tal como se utiliza en la presente invención, "fragmento F(ab')2" significa un fragmento de unión a antígeno bivalente de una inmunoglobul ina que consiste de ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas . Este se puede obtener mediante digestión breve con pepsina o con métodos recombinantes . Tal como se utiliza en la presente invención, "CDR" o "región determinante de complementariedad" significa una secuencia altamente variable de aminoácidos en el dominio variable de un anticuerpo. Esta invención provee las composiciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir, pero no se limitan a, soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propi lengl icol , pol iet i 1 engl i col , aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, solución salina y medios regulados respecto al pH . Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluido y nutrientes, reabastecedores de electrolito tales como aquellos basados en la solución de dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Esta invención provee un método para tratar a un individuo afligido con VIH-1 que comprende administrar al individuo una dosis efectiva de las composiciones anteriores. Tal como se utiliza en la presente invención, "individuo" significa cualquier animal o animal modificado artificialmente que pueda quedar infectado por VIH. Los animales artificialmente modificados incluyen, pero no se limitan a, ratones SCID con sistemas inmunes de humano. Los animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, perros, cobayos, hurones, conejos, y primates. En la modalidad preferida, el individuo es un humano. Tal como se utiliza en la presente invención, "tratar" significa ya sea desacelerar, detener o revertir el avance de un trastorno por VIH-1. En la modalidad preferida, "tratar" significa revertir el avance hasta el punto de eliminar el trastorno. Tal como se utiliza en la presente invención, "tratar" también significa la reducción del número de infecciones virales, reducción del número de partículas virales infecciosas, reducción del número de células infectadas con virus, o el alivio de los síntomas asociados con VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención, "afligido con VIH-1" significa que el individuo tiene por lo menos una célula que ha sido infectada por VIH-1. Tal como se utiliza en la presente invención, "administrar" se puede efectuar o realizar utilizando cualquiera de los métodos conocidos por el experto en la técnica. Los métodos pueden comprender medios intravenosos, intramusculares o subcutáneos. La dosis de la composición de la invención varía dependiendo del individuo y de la vía de administración particular utilizada. Las dosis pueden variar desde 0.1 hasta 100, 000 Tomando como base la composición, la dosis se puede suministrar en forma continua, tal como mediante el uso de bombeo continuo, o a intervalos periódicos. El experto en la técnica puede determinar sin experimentación indebida los intervalos de tiempo deseados de las dosis múltiples de una composición particular. Tal como se utiliza en la presente invención, "dosis efectiva" significa una cantidad en cantidades suficientes ya sea para tratar al individuo o para evitar que el individuo se infecte con VIH-1. Un experto en la técnica puede efectuar experimentos de titulación sencillos para determinar cuál cantidad es la requerida para tratar al individuo. Esta invención provee un método para evitar que un individuo contraiga VIH-1 que comprende administrar al individuo una dosis efectiva de las composiciones anteriores. Tal como se utiliza en la presente invención, "contraer VIH-1" significa quedar infectado con VIH-1, cuya información genética se replica en y/o se incorpora en las células del hospedero. Esta invención provee un anticuerpo monoclonal anti-CCR5. El anticuerpo incluye pero no se limita a los siguientes: PA8 (No. de Acceso ATCC HB-12605) , PA9 (No. de Acceso ATCC HB-12606) . PA10 (No. de Acceso ATCC HB-12607), PA11 (No. de Acceso ATCC HB-12608) , PA12 (No. de Acceso ATCC HB-12609), y PA14 (No. de Acceso ATCC HB-12610) . Esta invención provee formas humanizadas de los anticuerpos anteriores.

Tal como se utiliza en la presente invención, "humanizado" describe anticuerpos en los cuales algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR son reemplazados con los aminoácidos correspondientes derivados a partir de moléculas de inmunoglobul ina de humano. En una modalidad de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de las regiones CDR han sido reemplazados con aminoácidos provenientes de moléculas de inmunoglobul ina de humano pero en los cuales algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR permanecen sin cambiar. Son permitidas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones pequeñas de aminoácidos en tanto que éstas no eliminen la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno determinado. Las moléculas de inmunoglubul ina de humano apropiadas podrían incluir las moléculas de IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo "humanizado" retendrá una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, es decir, en la presente invención, la capacidad de unirse a CCR5. El experto en la técnica sabe como elaborar los anticuerpos humanizados de la presente invención. Diversas publicaciones, varias de las cuales se incorporan en la presente invención para referencia, también describen la manera de elaborar anticuerpos humanizados. Por ejemplo, los métodos descritos en la patente E.U.A. No. 4,816,567 (71) comprende la producción de anticuerpos quiméricos que tienen una región variable de un anticuerpo y una región constante de otro anticuerpo. La patente E.U.A. No. 5,225,539 (72) describe otra estrategia para la producción de un anticuerpo humanizado. Esta patente describe el uso de tecnología de ADN recombinante para producir un anticuerpo humanizado en el cual las CDR de una región variable de la inmunoglobul ina se reemplazan con las CDR provenientes de una inmunoglobul ina con una especificidad diferente, de modo tal que el anticuerpo humanizado pueda reconocer el objetivo deseado pero no será reconocido de manera significativa por el sistema inmune del individuo humano. En específico, se utiliza mutagénesis dirigida a sitio para injertar las CDR en la estructura . Otras estrategias para humanizar un anticuerpo se describen en las patentes E.U.A. Nos. 5,585,089 (73) y 5,693,761 (74) y en el documento WO 90/07861 las cuales describen métodos para producir inmunoglobul inas humanizadas. Estas tienen una o más CDR y posibles aminoácidos adicionales proveniente de una inmunoglobul ina del donador y una región de estructura proveniente de una inmunoglobul ina de humano aceptora. Estas patentes describen un método para incrementar la afinidad de un anticuerpo hacia el antígeno deseado. Algunos aminoácidos en la estructura se eligen de modo tal que sean iguales a los aminoácidos en aquellas posiciones en el donador más que en el aceptor. De manera específica, estas patentes describen la preparación de un anticuerpo humanizado que se une a un receptor combinando las CDR de un anticuerpo monoclonal de ratón con la estructura de inmunoglobul ina de humano y las regiones constantes. Se pueden elegir las regiones de estructura de humano de modo tal que se lleve al máximo la homología con la secuencia de ratón. Se puede utilizar un modelo por computadora para identificar los aminoácidos en la región de estructura que tienen mayor probabilidad de interactuar con las CDR o el antígeno específico y después se pueden utilizar los aminoácidos de ratón en estas posiciones para crear el anticuerpo humani zado . Las patentes anteriores 5,585,089 y 5,693,761 y el documento WO 90/07861 (75) también proponen cuatro posibles criterios que se pueden utilizar en el diseño de los anticuerpos humanizados. La primera propuesta es que para un aceptor, se utiliza una estructura proveniente de una inmunoglobul ina de humano particular que normalmente no es homologa con la inmunoglobulina donadora que será humanizada, o se utiliza una estructura de consenso proveniente de muchos anticuerpos de humano. La segunda propuesta es que si un aminoácido en la estructura de la inmunoglobulina de humano no es común y el aminoácido donador en dicha posición es típico para secuencias de humano, entonces se puede seleccionar el aminoácido donador en lugar del aminoácido aceptor. La tercera propuesta es que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las tres CD en la cadena de inmunoglobulina humanizada, se puede seleccionar el aminoácido donador en lugar del aminoácido aceptor. La cuarta propuesta es utilizar el residuo de aminoácido donador en las posiciones de la estructura en las cuales se pronostica que el aminoácido tiene un átomo de cadena lateral dentro de 3A de las CDR en un modelo tridimensional del anticuerpo y se pronostica que es capaz de interactuar con las CDR. Los métodos anteriores son únicamente ilustrativos de algunos de los métodos que puede utilizar un experto en la técnica para elaborar anticuerpos humanizados. Se puede incrementar la afinidad y/o especificidad de la unión del anticuerpo humanizado utilizando métodos de evolución dirigida como los descritos en u et al. (1999) J. Mol. Biol . 284:151 y en las patentes E.U.A. Nos. 6,165,793; 6,365,408 y 6,413, 774. En una modalidad de la invención, la forma humanizada del anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera como la indicada en SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia variable de aminoácidos de cadena pesada como la indicada en SEQ ID NO : 9. En una modalidad adicional, el anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos variable de la cadena pesada como la indicada en SEQ ID NO: 12. En otra modalidad, el anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos variable de la cadena ligera como la indicada en SEQ ID NO: 6, y la secuencia de aminoácido variable de la cadena pesada como la indicada en SEQ ID NO: 9. De manera alternativa, el anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos variable de la cadena ligera como la indicada en SEQ ID NO: 6 y la secuencia de aminoácidos variable de la cadena pesada como la indicada en SEQ ID NO: 12. Las regiones variables del anticuerpo humanizado pueden estar ligadas a por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobul ina de una inmunoglobul ina de humano. En una modalidad, el anticuerpo humanizado contiene las regiones constantes tanto de cadena ligera como de cadena pesada. La región constante de cadena pesada normalmente incluye la región CH1, gozne, CH2 , CH3 y algunas veces CH4. En una modalidad, las regiones constantes del anticuerpo humanizado son del isotipo de IgG4 de humano. Esta invención provee moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para estos anticuerpos monoclonales anti-CCR5 o sus versiones humanizadas. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN, ADN o ADNc . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para la cadena ligera. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para la cadena pesada. En una modalidad, el ácido nucleico codifica para las cadenas tanto pesada como ligera. En una modalidad, una o más moléculas de ácido nucleico codifican para la porción Fab. En una modalidad, una o más moléculas de ácido nucleico codifican para las porciones de CD . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para el dominio variable. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para el dominio variable y uno o más dominios constantes. De preferencia, los análogos de los anticuerpos anti-CCR5 humanizados de ejemplo difieren de los anticuerpos anti-CCR5 humanizados ejemplificados por sustituciones de aminoácido conservadoras. Para los propósitos de clasificar las sustituciones de aminoácido como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se pueden agrupar de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas ) : met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutras) : cys , ser, thr; Grupo III (cadenas laterales con carácter ácido) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales con carácter básico) : asn, gln, his, lys, arg Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena) : gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas) : trp, tyr, phe . Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un elemento de una de estas clases por un elemento de la otra.

Los análogos de anticuerpos anti-CCR5 humanizados presentan identidad de secuencia de aminoácidos sustancial con PRO 140 #1 humanizado o PRO 140 #2 humanizado, ejemplificados en la presente invención. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los análogos son codificadas por secuencias de ácido nucleico que se hibridan con los ácidos que nucleicos codifican para las regiones variables de cadena pesada o ligera de PRO 140 #1 humanizado, o PRO 140 #2 humanizado, o formas degeneradas de los mismos, bajo condiciones astringentes . Debido a la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ácido nucleico codifican para el anticuerpo anti-CCR5 humanizado de la presente invención. En algunas modalidades, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que es altamente homologa con las moléculas de ácido nucleico anteriores. De preferencia, la molécula de ácido nucleico homologa comprende una secuencia de nucleótido que es por lo menos 90% idéntica aproximadamente a la secuencia de nucleótido provista en la presente invención. De manera más preferida, la secuencia de nucleótido es por lo menos 95% idéntica aproximadamente, por lo menos 97% idéntica, por lo menos 98% idéntica o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos provista en la presente invención. La homología se puede calcular utilizando varias herramientas de software, públicamente disponibles, bien conocidas por el experto en la técnica. Las herramientas de ejemplo incluyen el sistema BLAST disponible del sitio web del Centro Nacional para Información sobre Biotecnología (NCBI) en los Institutos Nacionales de Salud. Un método para identificar secuencias de nucleótido altamente homologas es mediante hibridación de ácido nucleico. Por lo tanto, la invención también incluye anticuerpos para CCR5 humanizados que tienen las propiedades de unión a CCR5 y otras propiedades funcionales descritas en la presente invención, los cuales son codificados por moléculas de cido nucleico que se hibridan bajo condiciones de alta astringencia a las moléculas de ácido nucleico anteriores. La identificación de secuencias relacionadas también se puede lograr utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y otras técnicas de amplificación apropiadas para clonar secuencias de ácido nucleico relacionadas. De preferencia, se seleccionan iniciadores de PCR para amplificar porciones de una secuencia de ácido nucleico de interés, tal como una CDR . El término "condiciones de alta astringencia" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a los parámetros con los cuales está familiarizada la técnica. Los parámetros de hibridación de ácido nucleico se pueden encontrar en referencias que compilen dichos métodos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds . , 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Un ejemplo de condiciones de alta astringencia es la hibridación a 65°C en solución reguladora para hibridación (3.5X SSC, 0.02% de Ficoll, 0.02% de polivinilpirrolidona, 0.02% de seroalbúmina de bovino, 2.5 mM de NaH2P04 (pII7), 0.5% de SDS, 2 mM de EDTA) . SSC es cloruro de sodio 0.15 M/citrato de sodio 0.15M, pH7 ; SDS es dodecilsulfato de sodio; y EDTA es ácido et i lendi mint etra - ac i co . Después de la hibridación, se lava una membrana sobre la cual se transfiere el ácido nucleico, por ejemplo, en 2X SSC a temperatura ambiente y después a 0.1-0.5X SSC/0.1X SDS a temperaturas de hasta 68°C.

Las secuencias de ácido nucleico se expresan en hospederos después que las secuencias se han ligado en forma operable a (es decir, se posicionan para asegurar el funcionamiento de) una secuencia de control de expresión. Estos vectores de expresión se pueden replicar típicamente en los organismos hospederos, ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del hospedero. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 4,704,362, la cual se incorpora en la presente invención para referencia) . E. coli es un hospedero procariota útil particularmente para clonar las secuencias de ADN de la presente invención. Otros hospederos microbianos apropiados para ser utilizados incluyen bacilos tales como Bacillus subtilis , y otras enterobacterias , tales como Salmonella , Serratia, y varias especies de Pseudomonas. En estos hospederos procariotas, también se pueden elaborar vectores de expresión, los cuales contienen típicamente secuencias de control de expresión compatibles con la célula hospedera (por ejemplo, un origen de replicación) . Además, estará presente un número de una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp) , un sistema de promotor de beta- lactamasa , o un sistema promotor proveniente del fago lambda. Los promotores típicamente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador, y tienen secuencias de sitio de unión a ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción. También pueden ser útiles para la expresión otros microbios tales como levaduras. Saccharomyces es un hospedero preferido, con vectores apropiados que tengan secuencias de control de expresión, tales como promotores, incluyendo 3 - fos fogl i cera o cinasa u otras enzimas glucolíticas y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee . Además de los microorganismos, también se puede utilizar cultivo celular de tejido de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (véase, innacker, "From Genes to Clones,", VCH Publishers, New York, New York (1987)) . De hecho se prefieren las células eucariotas debido a que en la técnica se han desarrollado un número de líneas celulares de hospedero apropiadas que puedan secretar inmunoglobul inas intactas, e incluyen las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, de preferencia líneas celulares de mieloma, etc., y células B transformadas o hibridomas . Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un fomentador (Queen, et al., Immunol . Rev., 89, 49-68 (1986) el cual se incorpora en la presente invención para referencia, y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador de transcripción. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores obtenidos a partir de genes de inmunoglobul ina, SV40, adenovirus, citomegalovirus , virus del papiloma bovino, y similares. Los vectores que contienen a los segmentos de ADN de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican para las cadenas pesada y ligera y las secuencias de control de expresión) se pueden transferir hacia la célula hospedera utilizando métodos bien conocidos, los cuales pueden variar dependiendo del tipo de hospedero celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporac ión se puede utilizar para otros hospederos celulares (véase en términos generales, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982) , el cual se incorpora en la presente invención para referencia) . Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, se pueden purificar de conformidad con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (véase en general, R. Scopes, "Protein Purif ication" , Springer-Verlag , New York (1982)) . Para usos farmacéuticos se prefieren inmunoglobul inas sustancialmente puras con por lo menos 90 a 95% de homogeneidad aproximadamente, y son más preferidas las inmunoglobul inas con 98 a 99% o más de homogeneidad. Una vez purificadas, parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, los polipéptidos se pueden utilizar después en forma terapéutica (incluyendo en forma extracorpórea ) o en el desarrollo y ejecución de procedimientos de prueba, tinciones inmunof luorescentes y similares (véase en términos generales, Immunological Methods, Vols. I and II, Lefkovits and Pernis, eds . , Academic Press, New York, New York (1979 y 1981)) . Para propósitos de diagnóstico o detección, los anticuerpos pueden estar marcados o sin marcar. Se pueden utilizar anticuerpos no marcados en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que sean reactivos con el anticuerpo humanizado, tales como los anticuerpos específicos para las regiones constantes de la inmunoglobul ina de humano. De manera alternativa, los anticuerpos se pueden marcar directamente. Se puede utilizar una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos , flúors, enzimas, substratos para enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, ligandos (en particular haptenos), etc. Se dispone de numerosos tipos de pruebas inmunológicas y son bien conocidas por los expertos en la técnica para detección de células que expresen CC 5 o para la detección de la modulación de CCR5 en células con capacidad para expresar a CCR5. La presente invención también provee conjugados de fragmento de ant icue rpo - pol ímero que tienen un tamaño efectivo o peso molecular que confiere un incremento en la vida media en suero, un incremento en el tiempo de residencia promedio en circulación (MRT) y/o un decremento en la velocidad de eliminación en suero con respecto a los fragmentos de anticuerpo no convertidos en derivados. Los conjugados de fragmento de anticuerpo-polímero de la presente invención se pueden elaborar convirtiendo en derivado el fragmento de anticuerpo deseado con un polímero inerte. Se apreciará que cualquier polímero inerte que provea al conjugado el tamaño aparente deseado o que tenga el peso molecular real seleccionado es apropiado para ser utilizado en la construcción de los conjugados de fragmento de anticuerpo-polímero de la invención. Son apropiados muchos polímeros inertes para ser utilizados en productos farmacéuticos. Véase, por ejemplo, Savis et al., Biomedical Polymers : Polymeric Materials and Pharmaceut i cal s for Biomedical Use, pp . 441-451 (1980) . En todas las modalidades de la invención, se utiliza un polímero no proteínico. El polímero no proteínico por lo general es un polímero sintético hidrofílico, es decir, un polímero que de otra manera no se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, también son útiles los polímeros que existen en la naturaleza y que son producidos mediante métodos recombinantes o in vi tro, tales como polímeros que se aislan a partir de fuentes originales. Los polímeros de polivinilo hidrofílicos caen dentro del campo de esta invención, por ejemplo, alcohol polivinílico y pol ivini lpirrol idona . Son particularmente útiles los éteres de pol ialquileno tales como polietilenglicol (PEG) pol ioxialqui leños tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros en bloque de polioxietileno y poli-oxiproprileno (Pluronics) polimetracrilatos ; carbómeros; pol isácaridos ramificados o sin ramificar que comprenden los monómeros de sácarido D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico , ácido siálico, ácido D-galacturónico , ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido pol imanurónico o ácido algínico) , D-glucosamina , D-galactosamina , D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopol i sácaridos y heteropolisácaridos tales como lactosa, amilopectina , almidón, hidroxiet ilalmidon , amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisácarido de muco-polisácaridos ácidos, por ejemplo ácido hialurónico, polímeros de alcoholes de azúcar tales como poli-sorbitol y polimanitol, heparina o heparón. No es necesario que antes del entrelazamiento el polímero sea, pero de preferencia es, soluble en agua pero el conjugado final debe ser hidrosoluble . De preferencia, el conjugado presenta una solubilidad en agua de por lo menos 0.01 mg/ml aproximadamente y de manera más preferida por lo menos 0.1 mg/ml aproximadamente, e incluso más preferido por lo menos aproximadamente 1 mg/ml. Además, el polímero no debe ser altamente inmunogénico en la forma conjugada, ni tampoco debe poseer viscosidad que sea incompatible con la infusión o inyección intravenosa si se pretende que el conjugado se administre mediante dichas vías. En una modalidad, el polímero contiene únicamente un grupo individual que sea reactivo. Esto ayuda a evitar el entrelazamiento de las moléculas de proteína. Sin embargo, está dentro del campo de la invención llevar al máximo las condiciones de reacción para reducir el entrelazamiento, o para purificar los productos de reacción a través de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar derivados sustancialmente homogéneos. En otras modalidades, el polímero contiene dos o más grupos reactivos con el propósito de enlazar fragmentos múltiples de anticuerpo a la estructura base del polímero. De nuevo, se puede utilizar filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico para recuperar el derivado deseado en forma sustancialmente homogénea. El peso molecular del polímero puede variar hasta 500,000 D aproximadamente, y de preferencia es de por lo menos 20,000 D aproximadamente, o por lo menos 30,000 D aproximadamente, o por lo menos 40,000 D aproximadamente. El peso molecular elegido puede depender del tamaño efectivo del conjugado que se va a obtener, la naturaleza (por ejemplo, estructura tal como lineal o ramificada) del polímero y el grado de conversión en derivado, es decir, el número de moléculas de polímero por fragmento de anticuerpo, y el sitio o sitios de unión a polímero en el fragmento de anticuerpo. El polímero se puede ligar covalentemente al fragmento de anticuerpo a través de un agente entrelazador muít i fune ional que reaccione con el polímero y uno o más residuos de aminoácido del fragmento de anticuerpo que será ligado. Sin embargo, está dentro del campo de la invención entrelazar directamente el polímero haciendo reaccionar un polímero, convertido en derivado, con el fragmento de anticuerpo, o viceversa. El sitio de entrelazamiento covalente en el fragmento de anticuerpo incluye el grupo amino N-terminal y los grupos epsilon-amino encontrados en los residuos de lisina, así como otros grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo u otros grupos hidrofí lieos . El polímero se puede unir covalentemente en forma directa al fragmento de anticuerpos sin el uso de un agente entrelazador multifuncional (por lo general bifuncional ) , como se describe en la patente E.U.A. No. 6,458,355. El grado de sustitución con dicho polímero variará en función del número de sitios reactivos en el fragmento de anticuerpo, del peso molecular, del carácter hidrofílico y de otras características del polímero, y los sitios elegidos para conversión en derivado del fragmento de anticuerpo particular. En general, el conjugado contiene desde 1 hasta 10 moléculas de polímero aproximadamente, pero también se contemplan números más grandes de moléculas de polímero unidas a los fragmentos de anticuerpo de la invención. La cantidad deseada de conversión en derivado se puede lograr fácilmente utilizando una matriz experimental en la cual se varían el tiempo, temperatura y otras condiciones de reacción para cambiar el grado de sustitución, después de lo cual se determina el nivel de sustitución polimérica de los conjugados mediante cromatografía por exclusión de tamaño u otros medios conocidos en la técnica. Los polímeros de PEG funcional i zados para modificar los fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden conseguir de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.) . Dichos derivados de PEG comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, amino-PEG, ésteres de PEG- aminoácido , PEG-hidrazida, PEG-tiol, PEG- succ inato , PEG carboxi-metilado, ácido PEG-priopiónico , PEG - aminoác idos , succinimidil succinato de PEG, succinimidil propionato de PEG, éster succinimidil ico de PEG carboximetilado , succinimidil carbonato de PEG, ésteres succ inimidí 1 icos de aminoácido-PEG, PEG-oxicarbonilimidazol, PEG-nitrofenilcarbonato , PEG-tresilato, éter PEG-gl icidí 1 ico , PEG - al dhe ído , PEG-vinilsulfona, PEG-maleimida , PEG-ortopiridil -disul furo , PEGs heterofuncionales , derivados vinílicos de PEG, PEG-silanos y PEG- fosfól idos . Las condiciones de reacción para acoplar estos derivados de PEG variarán en función de la proteína, el grado deseado de PEG-ilación, y el derivado de PEG utilizado. Algunos factores implicados en la elección de los derivados de PEG incluyen: el punto deseado de unión (tal como los grupos R de lisina o cisteína) , la estabilidad hidrolítica y la reactividad de los derivados, la estabilidad, toxicidad y carácter antigénico del enlace, el qué tan apropiado es para análisis, etc. Las instrucciones específicas para el uso de cualquier derivado particular se pueden conseguir a partir del fabricante. Los conjugados de esta invención se separan de los materiales de partida sin reaccionar mediante filtración en gel o HPLC de intercambio iónico. Se pueden utilizar el anticuerpo anti-CCR5 o fragmentos del mismo en combinación con uno o más agentes anti-virales adicionales que se seleccionan a partir del grupo que consiste de inhibidores de la transcriptasa inversa de tipo no nucleósido (NNRTI), un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido, un inhibidor de proteasa de VIH-1, un inhibidor de la entrada viral, y combinaciones de los mismos. Los compuestos conocidos de tipo NNRTI que se pueden utilizar en la composición de la presente invención incluyen pero no se limitan a efavirenz, UC-781, HBY 097, nevirapina ( 11 - c ic lopropi 1 - 5 , 11 , -dihidro-4 -metil - 6H-dipirido [3 , 2 -b : 2 ' 3 ' - ] [1,4] diazepin-6-ona) , delavirdina ( (Rescriptor™ ; Pharmacia Upjohn) (piperazina, 1- [3- [ ( 1 -metil -etil ) amino] - 2 -piridini 1 ] -4-[[5-[(metilsulfonil)amino]- 1H- indol - 2 - il ] carbonil] -, monometansul fonato) , SJ-3366 ( 1 - ( 3 - c i c 1 openten -1 -il ) met il - 6 - ( 3 , 5 - dimet i lbenzoi 1 ) -5-etil-2 , 4-pirimidin-diona), MKC-442 (6-bencil-l- (etoximetil ) -5- isopropil-uracilo) , GW420867x (S-3 et i 1 - 6 - f luro - 4 - i sopropoxi -carbonil - 3 , 4 -dihidro -quinoxal in- 2 ( 1H) - ona ; Glaxo), HI-443 (N'-[2- (2-tiofen) etil] -N 1 - [2 - ( 5 -bromopiridil ) ] -tiourea), y similares. Los inhibidores de transcript asa inversa tipo nucleósido que se pueden utilizar en la composición en combinación con por lo menos un anticuerpo anti-CCR5 o fragmento del mismo de la presente invención, incluyen pero no se limitan a, abacavir (Ziagen™, GlaxoSmithKl ine ) ( ( 1 S , c i s ) - 4 - [2 -amino-6- (ciclopropí lamino) - 9H-purin- 9 - il ] -2-ciclo-penten- 1 -met anol sulfato (sal)), lamivudina (Epivir™, GlaxoSmithKline) ((2R, c i s ) - 4 - amino - 1 - ( 2 -hidroxi -metil-1,3- oxat iolan- 5-il) - (1H) -pirimidin-2-ona) , zidovudina (Ret rovir ; Gl axoSmi thKl ine ) ( 31 a z ido - 3 ' - desoxi t imidina ) , stavudina (Zerit; Bristol-Myers Squibb) ( 21 , 3 ' - dideshidro - 31 desoxi -timidina) , zacitabina (Hivid™; Roche Laboratories) (4 -amino- l-beta-D2',3' -didesoxirribofuranosil - 2 - ( 1H) -pirimidona), didanosina, y similares. Los inhibidores de proteasa de VIH-1 que se pueden utilizar en la composición en combinación con el anticuerpo anti-CCR5 o fragmentos del mismo de la presente invención, incluyen pero no se limitan a lopinavir (1S-[1R*, (R*), 3R* , 4R*]] -N-4-[[(2,6-dimetilfenoxi ) acetil] amino] - 3 - hidroxi - 5 - fenil - 1 - (fenil-metil ) pentilo] tetrahidro-alfa- ( 1-metiletil ) -2-oxol (2H) -pirimidinacetamida) , saquinavir (N-ter-butil-decahidro-2- [2 (R) -hidroxi - - feni 1 - 3 (S) - [ [N- (2-quinolilcarbonil ) -L-asparaginil] amino) butil] - (4aS , 8aS) -isoquinolin- (3S) - carboxamida ) , mesilato de nelfinavir ([3S-[2(2S*,3S*),3a,4p,8aP]] -N- (1, 1 -dimetile il ) -deca-hidro-2 [2 -hidroxi -3 - [ ( 3 -hidroxi - 2 -metílbenzoil ) amino] - 4 - ( feni 11 io) but il ] - 3 - i soquinol incarboxamida monometan-sulfonato) , sulfato de indinavir ( ( [ 1 ( 1S , 2R) , 5 ( S ) ) ] -2,3,5 - 1ridesoxi -N- (2 , 3-dihidro-2 -hidroxi -lH-inden-1-il)-5-[2-[[(l, 1 -dimetiletil) amino] carbonil] -4- (3-piridini lmet i 1 ) - 1 -piperazini 1 ] -2- (fenilmetil) -D-eritro-pentonamida, sal sulfato (1:1)), amprenavir (N- [(lS,2R)-3-(4- amino-N- i sobut i lbencensul fonamido ) - 1 -bencil -2 -hidroxipropil] carbamato de ( 3 S ) - tet rahidro-3-furilo), ritonavir ((ácido 10 - hidroxi - 2 -metí 1 - 5 -( 1 -metiletil) -1- [2- (1-metiletil) -4-tiazolil] -3, 6 -dioxo-8 , 11-bis (fenilmetil) -2, 4 , 7, 12-tetra-azatridecan-13-óico, éster 5 - iazol i lmet í 1 i co , [5S-(5R*, 8R* , 10R*, 11R*)])/ y similares. Los inhibidores de la entrada viral o de la fusión de VIH-1 que se pueden utilizar en combinación con el anticuerpo anti-CCR5 o fragmentos del mismo de la presente invención incluyen PRO 542 (Progenies Pharmaceuticals , Inc., Tarrytown, NY) , T-20 (Trímeras, Inc., Durham, NC) (patentes E.U.A. Nos. 5,464,933; 6,133,418; 6,020,459), T-1249 (patentes E.U.A. Nos. 6,345,568; 6,258,782), y similares. Para la terapia de combinación, el anticuerpo anti-CCR5 o fragmento del mismo, de la presente invención se puede suministrar al individuo antes de, después de, o en forma concurrente con uno o más agentes antivirales convencionales. Esta invención se entenderá mejor a partir de la siguiente sección de detalles experimentales. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos discutidos son únicamente ilustrativos de la invención como se describe con mayor detalle en las reivindicaciones que siguen después de ésta.

DETALLES EXPERIMENTALES EJEMPLO 1 A . Materiales y métodos 1 ) React i os El mAb 2D7 se adquiere de Pharmingen (San Diego, CA) y las CC-quimiocinas y CXC-quimiocinas se obtienen a partir de R&D Systems (Minneapolis , MN) . CD4-IgG2 (1), CD4 (2) y gpl20 de VIH-1JR-FL recombinante soluble (s), son producidos por Progenies Pharmaceut ical s , Inc. (59) . 2 ) Aislamiento y purificación de mAbs anti-CCR5 Se incuban células L1.2-CCR5+ (63) durante 16 horas en presencia de butirato de sodio 5m , lo cual activa la trascripción a partir del promotor de citomegalovirus (CMV) que controla la expresión de CCR5, lo que da como resultado un incremento de 10 veces en la densidad del co-receptor de superficie celular. Se inmunizan ratones Balb/c hembras por vía intraperitoneal con 107 células L1.2-CCR5+ a intervalos de 3 semanas, y se administra un refuerzo intravenoso de 107 células L1.2-CCR5+ tres días antes de la esplenectomí a . Los esplenocitos se fusionan con la línea celular Sp2/0. En una selección primaria, se evalúan los sobrenadantes provenientes de 10,000 cultivos de hibridoma; 120 de éstos inhiben la fusión mediada por la cubierta de VIH-1 entre las células PM1 (10) , las cuales expresan de manera natural a CCR5 y CD4 , y células HeLa - EnvJR-FL+ en una prueba de transferencia de energía de resonancia (RET) , como se describió previamente (19, 38) . Los hibridomas que producen los sobrenadantes inhibidores más potentes y que también tiñen a las células CCR5+ se subclonan mediante dilución limitativa. La empresa Harían Bioproducts for Science, Inc. ( Indianapolis , IN) prepara fluidos de ascitis provenientes de ratones Balb/c que se inyectan con hibridomas que producen los mAbs anti-CCR5 PA8 , PA9 , PA10, PA11, PA12 y PA14. Los mAbs se purifican individualmente hasta > 95% de homogeneidad mediante precipitación con sulfato de amonio seguido por cromatografía de proteína-A. Todos los mAbs se vuelven a suspender en solución salina regulada con fosfatos (PBS) a una concentración final de 5 mg/mi . 3) Análisis de clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS) y mapeo de epítopes de mAbs anti-CCR5 Se utiliza citometría de flujo para detectar la reactividad de superficie celular de los mAbs PA8- PA12 y PA14 con CCR5. Se incuban células L1.2-CCR5+ (106), tratadas con butirato de sodio, con 0.25 µg de anticuerpo, durante 20 minutos a 4°C en azida de sodio (NaN3) al 0.1% en 50 µ? de PBS de Dulbecco (DPBS) . Se utiliza el mAb 2D7 contra CCR5 como un control positivo, se utiliza una IgGl de múrido no específica como control negativo. Las células se centrifugan, se lavan e incuban con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcada con ficoeritrina (PE) (Caltag, Burlingame, CA) diluido 1:100, bajo las mismas condiciones que la primera incubación de anticuerpo. Por último, las células se analizan mediante citometría de flujo. Se aislan PBMC y se estimulan como se describió previamente (60) y se tiñen utilizando métodos similares. Se utiliza un procedimiento similar para el mapeo de epítope de los mAbs anti-CCR5. Se ha descrito un panel de setenta mutantes de punto de CCR5 (20, 24, 52) . Las secuencias codificadoras de estas proteínas se subclonan en el vector pcDNA3.1 (Stratagene) a partir del cual se puede controlar la transcripción mediante un promotor 5' de polimerasa D7. Los mutantes de CCR5 portan una marca de hemaglut inina (HA) de 9 residuos en el extremo C- terminal para detección de la proteína en lisados celulares o mediante citometría de flujo. Se incuban células HeLa (2xl06) durante 5 horas con 20 µg/ml de lipofectina y una cantidad igual de plásmido de tipo silvestre o mutante que exprese a CCR5 en OPTI-ME (Life Technologies, Gaithersburg , MD) . Las células se infectan después durante 12 horas con 2xl07 u.f.p. de vTF7 (23) para reforzar la expresión de CCR5 , se desprenden con ácido etilendiamintetra-acético (EDTA) 2mM en PBS y se lavan una vez con solución reguladora para unión (1% de BSA, 0.05% de NaN3 en DPBS) . Las células (lxlO6) se marcan en superficie con mAbs como se describió en el párrafo anterior, se lavan una vez con la solución reguladora para incubación y se vuelven a suspender en 1 mi de lxFACSlyse en agua (Becton Dickinson) durante 30 minutos a temperatura ambiente, para permeabil i zar las membranas celulares. Las células se centrifugan después, se lavan con la solución reguladora para incubación y se incuban durante 1 hora a 37°C con 4 µg/ml de un mAb anti-HA de ratón marcado con FITC ( i sot ioc ianato de f luoresceína) (BabCo, Richmond, CA) para el marcado intracelular . Por último, las células se lavan una vez con solución reguladora para unión y una vez con DPBS, se vuelven a suspender en formaldehído al 1% en PBS y se analizan mediante citometría de flujo. El grado de unión de un mAb al CCR5 mutante se determina mediante la ecuación (m.f.i. de CCR5 PE mutante/m . f . i . de CCR5 PE de tipo s i 1ve st re ) / (m . f . i . de CCR5 FITC mutante/m . f . i . de CCR5 FITC de tipo silvestre) xl00%. Esto normaliza la unión de mAb para los niveles de expresión de co-receptor mutante. 4) Prueba de unión de gpl20/sCD4 La gpl20 se convierte en derivado de biotina utilizando NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) de conformidad con las instrucciones del fabricante, y la biotina no copulada se elimina mediante diaf iltración . Se incuban células L1.2-CCR5+ tratadas con butirato de sodio, con diluciones variables de una mezcla equimolar de sCD4 y gpl20 -biot ina , o 1.25 µ9/p?1 de sCD4 y 2.5 µ9/t?1 de gp 120 - biot i na en presencia de concentraciones variables de los mAbs anti-CCR5 PA8-PA12, PA14 , 2D7 o una IgGl de múrido no específica, durante 1 hora a temperatura ambiente en NaN3 al 0.1% en DPBS . Las células se lavan con la solución reguladora para incubación y se incuban con estreptavidina- PE (Becton Dickinson) diluida 1:50, durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, las células se lavan con la solución reguladora para unión y se analizan utilizando una lectora de placas de fluorescencia (Perspective Biosystems, Framingham, MA) . 5) Inhibición de la fusión célula-célula mediada por cubierta y de la entrada de VIH-1 utilizando mAbs anti-CCR5 Se detecta la fusión mediada por cubierta de VIH-1 entre células HeLa-EnvJR_FL+ y células PM1 utilizando la prueba RET. Se siembran números iguales (2 x 104) de células que expresan la cubierta marcada con éster octadecílico de f luoresceína (F18) y células PM1 marcadas con octadecil rodamina (R18) en placas de 96 cavidades en suero fetal de bovino al 15% en DPBS y se incuban durante 4 horas a 37°C en presencia de cantidades variables de los mAbs anti-CCR5, PA8-PA12, PA14 , 2D7 , o una IgGl de múrido no específica. Se mide la fluorescencia RET con una lectora de placas Cytofluor (PerSeptive Biosystems) y se determina el % de RET como se describió previamente (38) . Se producen virus NLluc+env" complementados en trans mediante glucoproteíñas de cubierta provenientes de JR-FL o Gun-1 como se describió previamente (20) . Se infectan células U87MG-CD4+CCR5+ (14) con virus reportero quiméricos que contienen 50-100 ng/ml de p24 en presencia de concentraciones variables de los mAbs individuales. Después de 2 horas a 37°C, los medios que contienen virus se reemplazan por medio nuevo, que contiene mAb . Después de 12 horas, de nuevo se agregan medios nuevos, sin anticuerpos. Después de un total de 72 horas, se agregan 100 µ? de solución reguladora para lisis (Promega) a las células y se mide la actividad de luciferasa (r.l.u.) como se describió (20) . El % de inhibición de infección por VIH-1 se define como [1-(r.l.u en presencia del ant icuerpo/r .1. u en ausencia del anticuerpo)] x 100%. 6) Pruebas de señalización de calcio Se agrega el fluorocromo Indo-IAM (Molecular Probes, Eugene, OR) a células L1.2-CCR5+ tratadas con butirato de sodio a una concentración final de 5 µ? . Después de incubar a 37°C durante 30 minutos, las células se lavan una vez y se vuelven a suspender en solución salina regulada de Hank . Las células (106) se estimulan en forma secuencial con un mAb anti-CCR5 o PBS, seguido por RANTES 60 segundos después. Se utilizan los mAbs PA8-PA12, PA1 , a una concentración de 100 µg/ml, 2D7 a 20 µg/ml y RANTES a 250 ng/ml . También se evalúa la inhibición del flujo de calcio mediante PA14 y 2D7 para una gama amplia de concentraciones de mAb, que varían desde 0-100 µg/ml . Se monitorean los niveles de calcio intracelular utilizando un espectrofotómet ro de fluorescencia Perkin-Elmer LS-50S midiendo la relación de emisiones de fluorescencia a 402 nm (colorante unido) y 486 nm (colorante libre) después de excitación a 358 nm .

B . Resultados y discusión 1 ) Aislamiento de los anticuerpos monoclonales anti-CCR5 PA8 , PA9 , PA10, PA11, PA12 y PA14 Se descubrió que los péptidos correspondientes a los dominios extracelulares de CCR5 son ineficientes para inducir respuestas de anticuerpo específicas, de título alto contra el receptor de superficie celular, original (50) . Por lo tanto, se inmunizan ratones Balb/C con células L1.2-CCR5+ y se evalúan los sobrenadantes de cultivo de hibridoma respecto a su capacidad para inhibir la fusión a membrana mediada por la cubierta de JR-FL con células P 1 CD4+CCR5+ en la prueba RET (19, 38) . Aún cuando más de un ciento de sobrenadantes inhiben la fusión célula - célula en más del 50%, únicamente 6 designados PA8 , PA9 , PA10, PA11, PA12 y PA14, tiñen en forma específica e intensamente las células L1.2-CCR5+ pero no las células Ll .2 progeni toras , como queda demostrado mediante citometría de flujo (datos no mostrados) . Tomando como base la experiencia anterior, se asume que los otros mAbs con capacidad para inhibir la fusión célula-célula probablemente están dirigidos contra las moléculas de adhesión de superficie celular tales como LFA-1 (37) . Mediante isotipificacion de ELISA (Cappell, Durham, NC) se determina que los hibridomas PA8-PA12 y PA14 secretan mAbs contra IgGl . Se preparan fluidos de ascitis provenientes de ratones Balb/C a los que se les inyectan los seis hibridomas y se purifican las fracciones de IgGl. PA8 , PA9 , PA11, PA12 y PA14 presentan perfiles de focalización isoeléctricos distintos, mientras que PA10 tiene un perfil muy similar al de PA9 y por lo tanto puede ser un segundo aislado del mismo mAb (datos no mostrados) . 2) Unión de MAb a células CCR5 + Ninguno de los mAbs anti-CCR5 purificados tiñen la línea celular Ll .2 progenitora (datos no mostrados) . Sin embargo, los mAbs PA9-PA12 y PA14 tiñen más del 90%, y PA8 tiñe aproximadamente 70% de las células L1.2-CCR5+ según se determina mediante citometría de flujo, lo que demuestra que éstos reconocen a CCR5 (Figura 1) . El mAb anti-CCR5 2D7, el cual es un control positivo en los experimentos, también tiñe más del 90% de las células L1.2-CCR5+.

PA8-PA12 y PA14 son todos IgGl, y reaccionan igualmente bien con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón, mientras que 2D7 es una IgG2a y puede reaccionar en forma diferente con el anticuerpo reportero. Por lo tanto, se pueden comparar directamente solo las intensidades de fluorescencia promedio (m.f.i.) medidas con los mAbs PA8-PA12 y PA14. El orden de rango de las intensidades de fluorescencia promedio (m.f.i.) es PA12- PA11> (2D7=) PA14- PA10- PA9> PA8. La diferencia entre la m.f.i. de PA12 y la m.f.i. de PA8 es de tres veces. Las diferencias en intensidad de tinción entre PA8 y los otros mAbs permanecen constantes a través de un intervalo amplio de concentraciones (datos no mostrados) y probablemente no corresponden a las diferencias en las afinidades de mAb para CCR5. Esto implica que PA8 interactúa únicamente con un subconjunto de moléculas de CCR5 presentes en la superficie de las células L1.2-CCR5+. En comparación con las células L1.2-CCR5+, las PBMC estimuladas con mitógeno presentan patrones de tinción diferentes utilizando los mAbs anti-CCR5. 2D7 y PA14 tiñen más del 20%, PA11 y PA12 tiñen aproximadamente el 10%, PA8 , PA9 y PA10 tiñen menos del 5% de las PBMC (Figura 1) . Las intensidades de fluorescencia promedio de las PBMC teñidas son aproximadamente 10 veces menores que aquellas obtenidas con las células L1.2-CCR5+ para cada mAb ; su orden de rango es (2D7>) PA14> PA12- PA11- PA10-PA9- PA8. De nuevo, esto difiere un poco del orden de reactividades observado en los transí ectantes de CCR5. La diferencia entre la m.f.i. de PA9 y la m.f.i. de PA14 es de siete veces. Se han observado diferencias similares en otros grupos respecto a la capacidad de los mAbs anti-CCR5 para teñir líneas de células CCR5+ estables contra PBMC (28) . Esto puede deberse a las diferencias específicas de célula en la conformación de CCR5, modificación post - traducción u ol igomeri zación . De manera alternativa, la asociación con otras moléculas de superficie celular puede diferir entre células. Debido a que una elección evidente para dicha molécula podría ser el antígeno de superficie celular CD4 , el cual está ausente en las células L1.2-CCR5+ y presente en las PBMC, también se evalúa la capacidad de PA8-PA12, PA14 y 2D7 para teñir células HeLa que expresan en forma transitoria a CCR5 sólo o con CD4. No se observan diferencias en la capacidad de cualquiera de los mAbs para teñir al CCR5 de superficie celular en presencia de CD4 (datos no mostrados) . Si existiera una asociación entre estas dos proteínas, ésta no implica los epítopes reconocidos por los mAbs anti-CCR5 disponibles. De manera alternativa, una asociación entre CCR5 y CD4 podría presentarse únicamente en los linfocitos primarios. 3) Mapeo de epítopes de los mAbs utilizando mutantes de alanina de CCR5 Ninguno de los anticuerpos tiene la capacidad para detectar a la proteína CCR5 reducida y desnaturalizada mediante Western blotting lo que indica que éstas reconocen epítopes conformacxonalmente sensibles (datos no mostrados) . Los estudios de mapeo de epítope de mAb se efectúan utilizando un panel de 70 mutantes de punto de alanina de residuos en el Nt y los ECL de CCR5. Se lipofectan células HeLa con secuencias que codifican para CCR5 mutantes o de tipo silvestre a las que se anexan marcas HA en el extremo C- terminal, y se infectan con vTF7 (23) para estimular la expresión de co-receptor. Las células se incuban después con los mAbs anti-CCR5 y se revela su unión mediante un anticuerpo de cabra anti IgG de ratón marcado con PE. Se efectúa una segunda tinción intracelular con un mAb anti-HA marcado con FITC (BabCo) . Este control interno permite normalizar directamente la tinción por parte de los mAbs anti-CCR para los niveles de expresión de co-receptor mutante en la superficie celular. Por lo tanto, la unión de mAb a cada mutante se expresa como un porcentaje de unión a CCR5 de tipo silvestre (Figura 4) . Algunas mutaciones de punto reducen la unión de todos los anticuerpos a CCR5 en más del 50%. En general, PA8-PA12 son los más afectados, PA14 y 2D7 los menos afectados por esta clase de mutantes, los cuales incluyen el par de cisteína C101A y C178A, los mutantes de Nt Y10A, D11A, K25A, el mutante de ECL1 D95A, los mutantes de ECL2 K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A, y los mutantes de ECL3 F263A y F264A (Figura 1) . Una interpretación es que estos residuos no son parte de los epítopes del mAb per se, pero al cambiarlos a alanina ocasionan perturbaciones conformacionales que tienen un efecto común sobre la unión de todos los mAbs. Se cree que si una mutación reduce la unión de un mAb individual en más del 75% y además no reduce la unión de la mayoría de los otros anticuerpos, el residuo probablemente contribuye directamente a que el epítope sea reconocido por el mAb. Utilizando estos lineamientos estrictos, se concluye que los siete mAbs anti-CCR reconocen epítopes que se traslapan pero que son distintos (Figura 4) . La unión del mAb PA8 a CCR5 depende de N13 y Y15 en el Nt . Los mAb PA9 y PA10 requieren de D2, Y3 , Q4, P8 y N13 en el N , y de Y176 y T177 en ECL2. El mAb PA9 también requiere de S7 en el Nt . La unión de los mAb PA11 y PA12 de pende de Q4 en el Nt . PA14 requiere D2 en el Nt , y R168 y Y176 en ECL2. Por último, el mAb 2D7 requiere de Q170 y K171/E172 en ECL2 para que se una a CCR5. 4) Señalización de quimiocina en presencia de mAbs anti-CCR5 Los agentes de unión a receptor de quimiocina pueden ser antagonistas o, más raramente, agonistas de la señalización intracelular mediada por receptor. De manera alternativa, éstos podrían no tener efecto sobre la señalización. CCR5 tiene capacidad para unirse a tres CC - quimioc inas , RANTES, ???-?a y ???-?ß, y transducir una señal que module los niveles de calcio citosólicos. Por lo tanto se evalúa la actividad agonista/antagonista de diversas concentraciones de los mAbs PA8-PA12, PA14 y 2D7. Los cambios en las concentraciones de calcio intracelular, (Ca2+)i, se miden en células L1.2-CCR5+ cargadas con Indo-1. Ninguno de los mAbs estimulan un cambio en (Ca + )i, lo que indica que éstos no son agonistas para CCR5. PA8-PA12 tampoco pueden inhibir los flujos de Ca2+ inducidos por RANTES (Figura 5A y datos no mostrados) , incluso a concentraciones tan altas como 100 µg/ml , lo que muestra que éstos no son antagonistas tampoco. Estas concentraciones proveen la unión hasta saturación de los mAbs a células L1.2-CCR5+, como se demuestra mediante citometría de flujo y la prueba de unión gpl20/CCR5 (Figura 6D y datos no mostrados) . Sin embargo, los MAbs PA14 y 2D7 bloquean la movilización de calcio inducida por RANTES, aunque con diferentes potencias (Figura 5A, 5B) . La CI5o para la inhibición de influjo de calcio por PA14 es de 50 ug/ml, la cual es aproximadamente 8 veces más alta que la CI50 para 2D7 (Figura 5B) . Los flujos de calcio inducidos por RANTES, ???-?a y MIP-?ß son inhibidos, cada uno, por concentraciones similares de PA14 (datos no mostrados) . Ninguno de los mAbs afectan la movilización de calcio inducida por SDF-1 en células L1.2-CCR5+, las cuales expresan en forma endógena a CXCR4 (datos no mostrados) . Por último, ni los mAbs ni las CC - quimiocinas afectan los niveles de calcio citosólicos en células L1.2 progenitoras (datos no mostrados) . 5) Inhibición de la función de co-receptor de CCR5 por los mAbs Inicialmente se seleccionan los mAbs PA8-PA12 y PA14 en base a su capacidad para inhibir la fusión célula-célula mediada por la cubierta de VIH-1. Esta actividad se confirma y cuantifica para los mAbs purificados. Como es de esperar, todos los seis mAbs, así como mAb 2D7, bloquean la fusión entre células P 1 CD4 +CCR5+ y células HeLa - EnvJR_FL+ en la prueba RET . El orden de rango de potencia es 2D7-PA14> PA12> PA11> PA10- PA9- PA8 (Fig. 6A) . Los valores de CI50 para PA14 y 2D7 son 1.7 µ9/??1 y 1.6 µ9/?t?1 respectivamente, para PA11 y PA12 éstos son 25.5 µ9/p?1 y 10.0 µ9/?t?1 respectivamente (Figura 3) . PA8 , PA9 y PA10 inhiben la fusión únicamente en un 10-15% a 300 µ9/??1. Ninguno de los mAbs afecta la fusión entre las células PM1 y células HeLa-EnvLAi+, las cuales expresan la proteína de cubierta de longitud completa proveniente de un virus X4 (datos no mostrados) . También se evalúa la capacidad de los diferentes mAbs anti-CCR5 para inhibir la entrada de un virus R5 prototípico, JR-FL, y un virus R5 X4 , Gun-1, en una prueba de entrada basada en luciferasa, de ronda individual de replicación. El orden de rango de potencia en la prueba de entrada es similar al determinado en la prueba de fusión célula-célula (Figura 6B) . No se puede obtener una inhibición mayor al 50% de la entrada de JR-FL o Gun-1 con PA8-PA11. El valor de CI50 para PA12 es de 2.5 µ9/t?1. Sin embargo, tampoco se puede obtener la inhibición de la entrada en un 60% con este mAb . Se determina que los valores de CI50 para la inhibición de PA14 y 2D7 de la entrada de JR-FL son de 0.024 y 0.026 µ9/p?1 respectivamente (Figura 3), y son 60 veces más bajos que aquellos obtenidos en la prueba de fusión. La entrada de un Gun-1 dual-trópico es 2-3 veces más sensible a la inhibición por parte de mAbs anti-CCR5 que la entrada de JR-FL (datos no mostrados) . Los mAbs anti-co-receptor podrían inhibir la fusión mediada por cubierta ya sea afectando directamente la interacción gpl20/CCR5 o impidiendo los pasos posteriores a la unión implicados en la formación de un complejo de fusión activo. Para determinar el mecanismo de inhibición de la fusión y entrada viral mediante PA8-PA12 y PA14, se evalúa la capacidad de los diferentes mAbs para bloquear la interacción gpl20/CCR5. Para esto se utiliza una prueba que detecta la unión a las células L1.2-CCR5+ de gpl20 de VIH-1JR-FL con biotina complejada con sCD4. No se observa unión de gpl20 -biot ina en ausencia de sCD4 o CCR5, o cuando se utiliza gpl20 de VIH-1LAI (Figura 6C) . Con excepción de PA8 , todos los mAbs impiden la unión de gpl20/sCD4 a L1.2-CCR5+ (Fig. 6D) . La inhibición mediante PA8 saturada aproximadamente al 40%, lo cual se presenta en forma concomitante con los datos de citometría de flujo (Figura 1) sugieren que este mAb se une únicamente a un subconjunto de moléculas CCR5 en células L1.2-CCR5+. Los mAbs PA9 , PA10, PA11 y PA12 inhiben la unión con valores de CI50 de 0.24, 0.13, 0.33, 0.24 µg/ml respectivamente (Figura 3) . De manera sorpresiva, los mAbs PA14 y 2D7 son los inhibidores menos eficientes de la unión de gpl20/sCD4, con valores de CI50 de 1.58 y 1.38 µg/ml respectivamente (Figura 3) . Por lo tanto, no existe correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión a membrana y entrada mediada por gpl20 /CD4 /CCR5 y su capacidad para bloquear la unión de gpl20/sCD4 al co-receptor. 6) Inhibición sinergística de fusión de VIH- 1 mediante combinaciones de mAbs anti-CCR5 y otros inhibidores de la entrada viral Los agentes específicos de co-receptor pueden actuar en etapas múltiples del proceso de entrada y presentar efectos no aditivos cuando se utilizan en combinación. Desde una perspectiva clínica, es importante determinar las interacciones de candidatos de fármaco específicos de co-receptor con quimiocinas endógenas, las cuales pueden permitir obtener cierto nivel de protección contra el avance de la enfermedad. Por lo tanto, se evalúan los mAbs de CCR5 en combinación uno con el otro o con RANTES, o con CD4-IgG2, los cuales se unen a gpl20 de VIH-1 para inhibir la unión a las células objetivo. Se obtienen curvas dos i s - respues t a para los agentes utilizados de manera individual y en combinación en las pruebas de fusión y entrada viral . Los datos se analizan utilizando el principio de efecto de la mediana (9) . Se comparan cuantita ivamente las concentraciones de agentes individuales o de sus mezclas requeridas para producir un efecto determinado en un término conocido como el Indice de Combinación (IC) . Un valor de IC mayor de 1 indica antagonismo, IC - 1 indica un efecto aditivo, e IC < 1 indica un efecto sinergístico en el cual la presencia de un agente incrementa el efecto del otro. Las combinaciones de PA12 y 2D7 presentan efecto sinergístico más potente, con valores de IC que varían entre 0.02 y 0.29, dependiendo de la relación de los anticuerpos (Figura 7 y Figura 2) . Se sabe que el grado de sinergia varía con la estequiometrí a de los agentes. Las pruebas de entrada y fusión viral son generalmente consistentes para identificar combinaciones de mAb que sean altamente sinergí sticas , PA12 y 2D7; moderadamente sinergístico , PA12 y PA14; aditivos, PA11 y PA12 ; y débilmente antagonistas, PA14 y 2D7. La falta de sinergia entre PA14 y 2D7 no es de sorprender dado que estos mAbs presentan competencia cruzada para la unión a células CCR5+ según se determina mediante citometría de flujo (datos no mostrados) . La observación de un efecto aditivo de PA11 y PA12 podría ser una indicación que estos mAbs se unen a epítopes ligeramente diferentes en CCR5 , al tiempo que comparten una dependencia en el residuo Q4 en el Nt. También se evalúa la capacidad de los mAbs PA12, PA14 y 2D7 para presentar sinergia con RANTES en el bloqueo de la fusión célula-célula. Las combinaciones de PA12 y RANTES presentan sinergia moderada (Figura 2) . PA14 y 2D7 no presentan sinergia con RANTES, lo cual es consistente con que estos mAbs sean inhibidores de la unión y señalización de RANTES (Figura 5A, 5B) . Por último, se evalúa la sinergia entre los mAbs PA12 , PA14 , 2D7 y CD4-IgG2, los cuales interactúan con gpl20. Se observa sinergia moderada entre PA12 y CD4-IgG2 pero no se observa sinergia entre PA14 o 2D7 y CD4-IgG2 (Figura 2) .

Discusión experimental Se aislan y caracterizan seis mAbs IgGl anti-CCR5 de múrido. Mientras que PA8 , PA9 ; PA11, PA12 y PA14 son especies moleculares distintas, PA9 y PA10 son indistinguibles mediante los análisis y por lo tanto probablemente son el mismo mAb . Todos los mAbs que se aislan reconocen epítopes conformacionales complejos, como es con frecuencia el caso con los mAbs creados contra proteínas de superficie celular, nativa. Se efectúa el mapeo de epítope para todos los mAbs utilizando un panel de imitantes puntuales de alanina de CCR5. De igual manera se asume que los residuos que afectan la unión de todos los mAbs ocasionan perturbaciones conformacionales en el co-receptor y no constituyen parte de los epítopes del mAb. Se ha demostrado que solamente dos de dichos residuos, Y10 y Dll, afectan la entrada de VIH-1 (20, 52) . Los epítopes de PA8 , PA11 y PA12 se ubican exclusivamente en el dominio Nt . Consistente con estos resultados, PA8 se puede unir a un péptido de Nt-biotina, que contiene los residuos D2 a R31, en una prueba ELISA (datos no mostrados) . Sin embargo, PA11 y PA12, cuya unión depende fuertemente sólo de Q4 , no se une al péptido del Nt en solución (datos no mostrados) . Una posibilidad es que el péptido del Nt no asume la conformación apropiada para reconocimiento por PA11 y PA12, mientras que la unión de PA8 puede ser menos dependiente de la conformación. De manera alternativa, PA11 y PA12 podrían interactuar con residuos que no han sido mutados, o formar enlaces débiles con aminoácidos ubicados en otros dominios de CCR5, o unirse a los átomos de la estructura base del péptido cuya presentación puede quedar sin cambio por la mutagénesis. Los anticuerpos PA9 , PA10 y PA14 reconocen epítopes que incluyen residuos en los dominios tanto del Nt como del ECL de CCR5 , mientras que el epítope 2D7 se ubica exclusivamente en ECL2. El epítope de PA14 comprende tanto a D2 en el Nt como a R168 en ECL2 lo que indica que estos dos residuos están próximos uno al otro dentro del contexto de una huella de mAb . Incluso éstos podrían interactuar directamente uno con el otro a través de sus cargas opuestas. Los mAbs PA8-PA12 y PA14 tiñen las células CCR5+ con intensidades diferentes y en una forma que depende del tipo celular. Todos los mAbs excepto PA8 tiñen más del 90% de células L1.2-CCR5+, observándose la intensidad de fluorescencia promedio más alta con PA11 y PA12. Sin embargo, PA14 y 2D7 tiñen el porcentaje más alto de PBMC y también producen las intensidades de fluorescencia promedio más altas en estas células. Hill et al. (28) han caracterizado recientemente un panel de mAbs anti-CCR5 que de igual manera tiñen células transfectadas , pero únicamente dos de las ocho PBMC teñidas, y ningún monocito primario teñido. Probablemente una razón es una baja afinidad para CCR5 para la no reactividad de dos de los mAbs con células primarias, pero es poco probable que esto sea la explicación para la falla de los otros cuatro para reaccionar. En el panel de mAb , se observa la tinción más intensa de PBMC con los mAbs 2D7 y PA14 que tienen epítopes ubicados completa o parcialmente en los primeros 10 residuos de ECL2. Sin embargo, Hill et al., reportan que los mAbs específicos para el Nt y ECL1 tiñen a las PBMC, mientras que los mAbs para ECL2 y ECL3 no tiñen a las PBMC, de modo que aún no se identifica un patrón consistente de reactividad. Una explicación para la tinción específica de tipo celular por los mAbs podría ser que las PBMC activadas (y los monocitos) secretan CC-quimiocinas que se unen al CCR5 de la superficie celular, enmascarando algunos epítopes para mAb . Sin embargo, se podría esperar que esto sea especialmente cierto para PA14 y 2D7, los cuales son antagonistas de la movilización de calcio inducido por quimiocina y posiblemente compiten con las CC-quimiocinas para unirse a CCR5. No obstante estos mAbs tiñen más intensamente a las PBMC . De manera alternativa, la exposición diferencial de epítope de CCR5 podría reflejar la ol igomeri zación de receptor específico de tipo celular, asociación con otras moléculas de superficie celular, o modificaciones post-traducción diferentes tales como glucosilació . Se ha demostrado que las diferencias en la unión a mAb probablemente no reflejan las diferencias específicas de tipo celular en las interacciones CD4/CCR5. Los mAbs PA8-PA12 no inhiben la movilización de calcio inducida por CC-quimiocina en células CCR5+, ni tampoco median la señalización a través de CCR5. Los mAbs 2D7 y PA14 son inhibidores de la movilización de calcio inducida por CC-quimiocina, pero 2D7 es casi un orden de magnitud más potente que PA1 . Esto se debe quizás a que el epítope de PA14 se traslapa menos con el dominio de unión a CC-quimiocina en CCR5 que el epítope de 2D7. Todos los mAbs también bloquean la entrada de VIH-1 y la fusión de membrana mediada por cubierta, pero la inhibición de la fusión célula - célula requiere en la mayoría de los casos casi dos órdenes de magnitud más anticuerpo que el que es necesario para bloquear la entrada viral. Presumiblemente, se establecen más interacciones gpl20 / CD4 /CCR5 así como interacciones entre moléculas de adhesión y actúan de manera cooperativa durante la fusión cé luí a - cé luí a , en comparación con la fusión virus - célul a , haciendo que ésta sea más difícil de inhibir. Esto se observa comúnmente con anticuerpos para LFA-1 o para la glucoproteína de cubierta de VIH-1 (45, 51) . PA8 , PA9 y PA10 no pudieron bloquear la fusión célula-célula en más del 15% y la entrada viral en más del 40%, incluso a las concentraciones más altas de anticuerpo. Sin embargo, se puede obtener más del 90% de inhibición de la fusión con PA11, PA12 y PA14 , y se puede obtener más del 90% de inhibición de la entrada con PA14. El más potente de los seis mAbs para bloquear la fusión y la entrada es PA14, el cual es tan efectivo como 2D7. De manera sorpresiva, PA14 y 2D7 están entre los inhibidores menos potentes de la unión de gpl20/sCD4 a las células L1.2-CCR5+, mientras que PA9-PA12 bloquean con potencias similares, y PA8 no puede bloquear más del 40% de la unión de gpl20/sCD4. Estas observaciones hacen surgir dudas acerca de la naturaleza de las moléculas CCR5 presentadas en células diferentes y acerca de los mecanismos de inhibición de fusión viral y de entrada de la misma. Es posible que CCR5 en las células Ll .2 , utilizadas en las pruebas de mAb y de unión a gpl20, no esté en una conformación idéntica a CCR5 en las PBMC, utilizadas en la prueba de unión a anticuerpo, o a CCR5 en las células PM1 y U87MG utilizadas en las pruebas de fusión y entrada. La baja tinción de las PBMC y la inhibición parcial de fusión y entrada por parte de algunos de los mAbs indican que éstos sólo son capaces de unirse a un subconjunto de moléculas CCR5 expresadas en linfocitos primarios, líneas de células PM1 y U87MG-CD4+CCR5". No obstante, aparte de PA8 , todos los mAbs son capaces de teñir más del 90% de las células L1.2-CCR5+ y de bloquear completamente la unión del complejo gpl20/sCD4 a estas células. Por lo menos una diferencia entre L1.2-CCR5+ y las otras células utilizadas es la densidad de la proteína de co- receptor en la superficie celular. En efecto, se estima que las células L1.2-CCR5+ expresan 10 a 100 veces más co-receptores de superficie celular que las células P 1 y U87MG-CD4 +CCR5+ . Pero cuando se manipulan genéticamente células HeLa para expresar en forma transitoria una cantidad de co-receptor similar a la de la linea de células L1.2-CCR5+, se sigue sin poder detectar la unión de gpl20/sCD4 a las mismas (datos no mostrados) . Por lo tanto, la sobre-expresión de CCR5 en L1.2, junto con otros factores específicos de célula, podría favorecer una conformación de co-receptor que de manera predominante exponga al Nt , haciéndolo más accesible tanto a los mAbs como a gpl20. Dicha conformación se podría inducir mediante ol igomeri zac ión de receptor, mediante asociaciones reducidas o alteradas con las proteínas de superficie celular o mediante interacciones de receptor con las proteínas G (25, 62) . ¿Coexisten conformaciones múltiples de CCR5 en la superficie celular, y todas éstas pueden permitir la entrada viral? Los patrones de reactividad de mAb podrían sugerirlo así, debido a que se puede presentar la entrada y fusión de VIH-1, aunque a niveles reducidos, en presencia de concentraciones de mAb que saturan los epítopes requeridos para la unión de gpl20 a las células L1.2-CCR5+. Se favorece la hipótesis de que las moléculas de co-receptor presentes en las células L1.2-CCR5+ poseen una conformación competente para la entrada de VIH-1 mientras que las moléculas de CCR5 en las PBMC, PM1 y CCR5+ U87MG existen en estados múltiples, competentes en cuanto a entrada que despliegan reacti idades de mAb diferentes. Mientras que PA14 y 2D7 pueden reconocer todas las conformaciones, otros mAbs no lo hacen. Aún falta determinar el por qué las células Ll .2 conducen a una conformación competente en cuanto a fusión particular. Recientemente se ha demostrado que el dominio de unión a gpl20 reside en los primeros 20 residuos del dominio Nt de CCR5. Los mAbs para el dominio de unión a gpl20 en CCR5 bloquean potentemente esta interacción pero no son lo suficientemente eficientes para inhibir la fusión y entrada de VIH-1 a las células objetivo como PA14 y 2D7, cuyos epítopes residen fuera de esta región. PA14 reconoce la punta del Nt y los residuos en ECL2 , mientras que el epítope para 2D7 está ubicado exclusivamente en ECL2. En cuanto al mecanismo de acción de estos mAbs solamente se pueden hacer especulaciones. Es posible que su unión a los primeros cuantos residuos de ECL2 induzca cambios conformacionales en el co-receptor que eviten la fusión a membrana. De manera alternativa, la obstrucción de los epítopes de ECL2 podría impedir la ol igomeri zación del co-receptor y la formación de un complejo proteínico competente en cuanto a fusión. Incluso otra posibilidad es que los residuos en ECL2 estén de frente al interior del poro de fusión y la unión de los mAbs impide que gp41 inserte el péptido de fusión dentro de la membrana plasmática. En contraste, los mAbs PA8-PA12 probablemente inhiben la fusión y entrada únicamente compitiendo directamente por la unión con los complejos gpl20/CD4. Se desconoce si parámetros diferentes a la exposición y afinidad del epítope para CCR5 determinan la eficacia de la inhibición de la entrada viral por parte de estos mAbs. Aún no es claro el por qué el inhibir los pasos posteriores a la interacción gpl20/co-receptor podría ser más eficiente que bloquear directamente dicha interacción. Una manera de explicar esto sería suponer que la velocidad de desacoplamiento de la unión de gpl20 a CCR5 es mucho más baja que la velocidad de acoplamiento de la unión de mAb a CCR5. Por lo tanto, cada vez que un mAb se desprende por sí mismo de una molécula de co-receptor, una molécula de gpl20 asociada al virión la remplaza en un modo casi irreversible debido a que esta interacción conduce a la fusión a membrana. La sinergia entre combinaciones de mAbs anti-CCR posiblemente es un resultado de sus interacciones con epítopes distintos que están implicados en los pasos consecutivos inter-dependientes de la entrada de VIH-1. El grado de sinergia observado entre PA12 y 2D7 (IC<0.1 bajo muchas circunstancias) es extraordinario debido a que los valores de IC menores de 0.2 raramente . se observan para combinaciones de anticuerpos anti-VIH-1 (33, 35, 61) , inhibidores de transcr iptasa inversa (29) , o inhibidores de proteasa (44) . Debido a su potencia, se examina la combinación PA12:2D7 en formatos de prueba y relaciones de concentración múltiples, para los cuales se observan niveles consistentemente elevados de sinergia. Se observa sinergia moderada para PA12 combinado con PA14. También se observa sinergia moderada entre PA12 y CD4-IgG2. El complejo CD4/gpl20 es metaestable y si no puede interactuar con un co-receptor, se degrada a un estado en el que ya no se pueda fusionar (45-48) . Debido a que PA12 directamente bloquea el sitio de unión a gpl20 en CCR5 , su presencia puede desplazar el equilibrio hacia la inactivación del complejo gpl20/CD4. Esto podría explicar el por qué se observa sinergia entre CD4-IgG2 y el mAb PA12 con respecto a la inhibición de fusión y entrada. La falta de sinergia entre el mAb PA14 y CD4-IgG2 sugiere que éstos actúan sobre dos pasos no consecutivos e independientes de la entrada viral. Será necesaria una combinación de estudios adicionales para determinar los mecanismos precisos de sinergia de los diferentes compuestos con respecto a la inhibición de fusión y entrada viral. Los resultados anteriores son consistentes con un modelo en el cual la entrada de VIH-1 se presenta en tres pasos distintos que implican unión a receptor, unión a co-receptor, y fusión a membrana mediada por co-receptor. Los eventos de unión a co-receptor y fusión separados son sugeridos por la falta de correlación entre las capacidades de los anticuerpos monoclonales para bloquear la unión a gpl20 y la fusión/entrada de VIH-1. La cronología de eventos durante la fusión también es sugerida por los patrones de sinergias observadas. Los agentes, tales como PA12, que inhiben en forma potente el paso intermedio del proceso, en específico la unión a gpl20, actúan de manera sinergista con inhibidores de los pasos anteriores y subsiguientes.

EJEMPLO 2 Antecedentes La incidencia cada vez mayor de VIH-1 resistente a fármacos múltiples hace necesaria la investigación respecto a clases novedosas de agentes anti-retrovirales . CCR5 es un co-receptor de fusión necesario para los aislados primarios de VIH-1 y provee un objetivo promisorio para terapia antiviral. PRO140 es un anticuerpo monoclonal anti-CCR5 que inhibe potentemente la entrada y replicacion de VIH-1 a concentraciones que no afectan la actividad del receptor de quimiocina de CCR5 in vitro. En el presente estudio, se evalúa el potencial terapéutico de PRO140 in vivo utilizando un modelo terapéutico animal de infección por VIH-1.

Métodos Se reconstituyen ratones SCID CD-17 con PBMC de humano normales y se infectan con el aislado R5 de VIH-1 JR-CSF. Cuando se llega al estado constante viral, el animal se trata por vía int raperi toneal con PRO140 o con anticuerpo de control y se monitorea respecto a la carga viral utilizando la prueba Amplicor de Roche. Los estudios iniciales examinan una dosis individual de 1 mg de PRO140. En estudios de dosis múltiples, se administra PRO140 una vez cada tres días durante 3 semanas a dosis que varían desde 0.1-1.0 mg . En un experimento separado, se utiliza citometría de flujo para examinar el potencial respecto al agotamiento de linfocitos después de la inyección de PRO 140.

Resultados Tanto la dosis individual como la dosis múltiple de PRO 140 reducen las cargas virales hasta niveles indetectables en todos los animales tratados, y las reducciones de carga viral varían hasta 1.8 log 10. Se observa un control transitorio de replicación viral después de la inyección individual de PRO 140, mientras que las inyecciones múltiples conducen a un control prolongado sin evidencia de rebote viral durante la terapia. Se observan diferencias dependientes de dosis en la cinética de las reducciones mediadas por PRO 140 en la carga viral. El análisis de citometría de flujo demuestra que el tratamiento con PRO 140 no conduce al agotamiento de linfocitos, confirmando que el impacto sobre la replicación viral in vivo es únicamente debido al bloqueo de CCR5.

Conclusiones PRO 140 es altamente efectivo para controlar la infección de VIH-1 establecida en el modelo de infección de VIH-1 de ratón hu-PBL-SCID. Estos hallazgos proveen prueba de concepto in vivo para la terapia de PRO 140 en particular y para la terapia con inhibidores de CCR5 en general.

EJEMPLO 3 Métodos Se evalúa un anticuerpo contra CCR5 humanizado (huPRO 140) respecto a la capacidad para bloquear la movilización de calcio inducida por RANTES en células L1.2-CCR5 y la capacidad para bloquear la replicación de CASE C 1/85 de VIH-1 en PBMC de humano utilizando los métodos descritos en la presente invención.

Resul tados Los resultados, como se muestra en la Figura 19, muestran que el anticuerpo contra CCR5 humanizado bloquea a VIH-1 pero no a RANTES.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> PROGENICS PHARMACEUTICALS , INC. ET AL. <120> ANTICUERPO ANTI-CCR5 130> 204B/57906-D-PCT <140> AUN DESCONOCIDO <141> CON LA PRESENTE <160> 13 <170> Patentln versión 3.1 c210> 1 <211> 31 <212? PRT <213s HUMANO <4009 1 Mee Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro lie Tyr Aep lie Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Glu Pro Cys Gln Lys He Asn Lys Gln lie Ala Ala Ala Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> HUMANO <400> 2 His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gln 1 5 10 15 «210? 3 <211> 27 <212> PRT 213> HUMANO <400? 3 Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro 1 5 10 16 Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln 20 25 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> HUMANO <213> HUMANO <400> 4 Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp 1 5 10 15 Gln «210> 5 <211> 429 <212> AON c213 > Homo sapiens <400> 5 cctagaccac catgaagttg cctgttaggc tgttggtgct gatgttctgg attcctgctt 60 ccagcagtga tattgcgatg acccaatctc cactctccct gcctgtcact cctggagagc 120 cagcctccat ctcttgcaga tctagtcagc gccttctgag cagttatgga catacctatt 180 tacattggta cctacageag ccaggccagt ctccacagct cctgatctac gaagtttcca 240 accgaccttc tggggtccca gacaggttca gtggcagtgg gtcagggaca gatttcacac 300 ttaagatcag tagagtggag gctgaggatg cgggagttta ttactgctct caaagtacac 360 atgttcctct cacgttcgga caggggacca aggtggaaat aaaacgtaag tagtcttctc 420 aactctaga 42 <210> 6 <:211> 129 <212> PRT < 13 > Homo sapiens <400> 6 Het Lys Leu Pro val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp He Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Arg Leu Leu 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly His Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser 100 105 110 Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 Lys <210> 7 «211> 393 «c212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 acgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat attgtgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggagagcc agcctccatc tcttgcagat ctagtcagcg ccttctgagc agttatggac atacctattt acactggtac ctacagaagc caggccagtc tccacagctc ctgatctacg aagtttccaa ccgattttct ggggtcccag acaggttcag tggcagtggg tcagggacag atttcacact taagatcagt agagtggagg ctgaggatgt gggagtttat tactgctctc aaagtacaca tgttcctctc acgtccggac sggggaccaa ggtggaaata aaa <210> 8 <211> 457 <212> ADN <213 Homo sapiens <400> 6 acgcgtccac catggaatgg agcggagtct ttatctttct cctgtcagta actgcaggtg 60 tccactccga ggtgcagctg gtggagtctg gtggaggctt ggtaaagcct ggaggttccc 120 ttagactctc ctgtgcagcc tctggttaca ctttcagtaa ctattggatc ggatgggtcc 180 gccaggctcc aggcaaaggg ctggagtgga ttggcgatat ctaccctgga gggaactaca 240 tcaggaacaa tgagaagttc aaggacaaga ccaccctgtc agcagatact tccaagaaca 300 cagcctatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac agccgtgtat tactgtggaa 3(0 gcagcttcgg tagtaactac gtgttcgcct ggtttactta ctggggccaa gggactctgg 420 tcacagtctc ctcaggtgag tccttaaaac ctctaga 457 <210> 9 c211> 141 <212> PRT «213? Homo sapiens <400> 9 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 25 40 45 Ser Asn Tyr Trp lie Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 S5 60 Glu Trp lie Gly Asp lie Tyr Pro Gly Gly Asn Tyr lie Arg Asn Asn 65 70 75 60 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn B5 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ser Asn Tyr Val Phe Ala Trp Phe 115 120 125 Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 10 <211> 412 <212> ADN <213> Homo sapiens <400a 10 atggaatgga gcggagtctt tatctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactccgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg tggaggcttg gtaaagcctg gaggttccct tagactctcc 120 tgtgcagcct ctggttacac tttcagtaac tattggatcg gatgggtccg ccaggctcca 180 ggcaaagggc tggagtggat tggcgatatc taccctggag ggaactacat caggaacaat 240 gagaagttca aggacaagac caccctgtca gcagatactt ccaagaacac agcctatccg 300 caaatgaaca gcctgaaaac cgaggacaca gccgtgtatt actgtggaag cagcttcggt agtaactacg tgttcgcctg gtttacttac tggggccaag ggactctggt ca < 210 > 11 < 211 > 457 < 212 > ADN < 213 > Homo sapiens < 400> 11 tctagaccac catggaatgg sgcggggtct ttatctttct cctgtcagta actgcaggtg 60 tccactccca ggtccacctg gtgcagtctg gacctgatgt gaaaaagcct gggacttcaa 120 tgaagatgtc ctgcaagacg tctggataca ccttcagtaa ctattggatc ggatgggtta 180 ggcaggcgcc tggacaaggc cttgagtgga ttggagatat ttaccctgga gggaactata 240 tcaggaacaa tgagaagttc aaggacaaga ccacactgac ggcagacaca tcgaccagca 300 cggcctacat gcaacttggc agcctgagat ctgaagacac tgccgtctat tactgtggaa 360 gcagcctcgg tagtaactac gtgttcgccc ggtttactta ctggggccaa gggactctgg 420 tcacagtctc ctcaggtgag tccttaaaac ctctaga 45-7 <210> 12 • 2U > 141 < 212> PRT < 213 Homo sapiens < 400> 12 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly . 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu val Gln Ser Gly Pro Asp Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Trp lie Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp lie Gly Asp lie Tyr Pro Gly Gly Asn Tyr lie Arg Asn Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ser Asn Tyr Val Phe Ala Trp Phe 115 120 125 Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 13 <211> 423 <212> ADN <213¾ Homo sapiens <AO0> 13 atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gtccacctgg tgcagtctgg acctgatgtg aaaaagcctg ggacttcaat gaagatgtcc 120 tgcaagacgt ctggatacac cttcagtaac tattggatcg gatgggttag gcaggcgcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagatatt taccctggag ggaactatat caggaacaat 240 gagaagttca aggacaagac cacactgacg gcagacacat cgaccagcac ggcctacatg 300 caacttggca gcctgagatc tgaagacact gccgtctatt actgtggaag cagcttcggt 360 agtaactacg tgttcgcctg gtttacttac tggggccaag ggactctggt cacagtctcc 420 tea 423

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. - Un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende el producto de expresión de un plásmido designado pVK:HuPRO140-VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión de cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo, el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano. 2. - El anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las cadenas pesadas son expresadas por el plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) . 3. - El anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las cadenas pesadas son expresadas por el plásmido designado pVgl : HuPR01 0 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) . 4. - Un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, cada cadena comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 6 , y dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 9. 5. - Un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 6 , y dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende aminoácidos consecuti os, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 12. 6.- Un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 6. 7.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los aminoácidos consecutivos son los aminoácidos expresados por un plásmido designado pVK : HuPR01 0 - K (designación de depósito ATCC PTA-4097) . 8. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO : 5. 9. - El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 8, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN, ADN o ADNc . 10. - Un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 9. 11. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los aminoácidos consecutivos son los aminoácidos expresados por un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) . 12. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO : 8. 13. - El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 o 12, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN, ADN o ADNc . 14.- Un ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que comprende aminoácidos consecutivos, cuya secuencia de aminoácidos se indica en SEQ ID NO : 12. 15. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracte izado porque los aminoácidos consecutivos son los aminoácidos expresados por un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) . 16. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ácido nucleico comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO : 11. 17. - El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 y 16, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN, ADN o ADNc . 18. - Una composición que comprende por lo menos uno de los anticuerpos anti-CCR5 o un fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo. 19. - Una composición que comprende al anticuerpo anti-CCR5 o un fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que tiene acoplado al mismo un material que se selecciona a partir del grupo que consiste de un radioisótopo, una toxina, polietilenglicol , un agente citotóxico y una marca detectable. 20. - Un método para inhibir la infección por VIH-1 de una célula CD4+ que comprende poner en contacto la célula CD4+ con un anticuerpo que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende el producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097), y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión de cualquiera de un plásmido designado pVg 1 : HuPROl 40 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo que se une a CCR5 en la superficie de la célula CD4+, en una cantidad y bajo condiciones tales que se inhiba la fusión de VIH-1 o de una célula infectada con VIH-1 a la célula CD4 + , con lo cual se inhibe la infección por VIH-1 de la célula CD4+. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la célula CD4+ expresa a CCR5. 22. - Un método para tratar a un individuo afligido con VIH-1 que comprende administrar al individuo una cantidad de dosis de tratamiento de VIH-1 efectiva de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende el producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097), y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión de cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo, el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano, bajo condiciones efectivas para tratar a dicho individuo afligido con VIH-1. 23.- Un método para evitar que un individuo contraiga una infección por VIH-1 que comprende administrar al individuo una cantidad de dosis efectiva para prevenir la infección de VIH-1 de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende el producto de expresión de un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097), y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión de cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo, el cual se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano, bajo condiciones efectivas para evitar dicha infección por VIH-1 en dicho individuo. 24. - El método de la reivindicación 22 o 23, en el cual el anticuerpo anti-CCR5 se administra al individuo utilizando un método que se selecciona a partir del grupo que consiste de medios intravenosos, intramusculares y subcutáneos. 25. - El método de la reivindicación 22 o 23, en el cual el anticuerpo anti-CCR5 se administra a dicho individuo en forma continua. 26. - El método de la reivindicación 22 o 23, en el cual el anticuerpo anti-CCR5 se administra a dicho individuo a intervalos periódicos predeterminados. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, que comprende también marcar el anticuerpo anti-CCR5 con un marcador detectable. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el marcador detectable es un marcador radioactivo o un marcador fluorescente. 29. - El método de la reivindicación 22 o 23, en el cual la dosis de dicho anticuerpo anti-CCR5 varía desde 0.1 aproximadamente hasta aproximadamente 100,000 µ?/Kg de peso corporal de dicho individuo. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la dosis de dicho anticuerpo anti-CCR5 no inhibe una actividad de quimiocina endógena en CCR5 de dicho individuo. 31.- Un conjugado de anticuerpo anti-CCR5 que comprende un anticuerpo anti-CCR5 que comprende (i) dos cadenas ligeras, cada cadena ligera comprende el producto de expresión de un plásmido designado pVK:HuPRO140-VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende el producto de expresión de cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , o un fragmento de dicho anticuerpo que se une a CCR5 en la superficie de una célula de humano, conjugado por lo menos con un pol ímero . 32. - El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el polímero se selecciona a partir del grupo que consiste de polímeros de polivinilo hidrof í 1 i eos , éteres de pol ialqui leño , pol ioxi alqui 1 enos , poli-metacrilatos , carbómeros, pol isacáridos ramificados, pol isacáridos sin ramificar, polímeros de alcoholes de azúcar, heparina y heparón. 33. - El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el éter de pol i alqui leño es pol i et i 1 engl i col (PEG) o un derivado del mismo. 34.- El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque por lo menos un PEG tiene un peso molecular promedio de por lo menos 20kD. 35. - El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el tamaño aparente de conjugado es de por lo menos 500 kD aproximadamente. 36. - El conjugado de anticuerpo anti-CCR5 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el conjugado tiene por lo menos uno de un incremento en la vida media en suero, un incremento en el tiempo de residencia promedio en circulación y una reducción en la velocidad de eliminación sérica, en comparación con un anticuerpo anti-CCR5 no conjugado o fragmento del mismo. 37. - Un método para inhibir la infección de una célula CCR5+ con VIH-1, cuyo método comprende administrar a un individuo en riesgo de infección por VIH-1 el conjugado de la reivindicación 31 en una cantidad y bajo condiciones efectivas para inhibir la infección de las células CCR5+ de dicho individuo por VIH-1. 38. - Un método para tratar una infección por VIH-1 en un individuo, cuyo método comprende administrar a un individuo infectado con VIH-1 el conjugado de la reivindicación 31, en una cantidad y bajo condiciones efectivas para tratar la infección por VIH-1 del individuo. 39. - El método de la reivindicación 38, en el cual la cantidad del conjugado es efectiva para reducir una carga viral en el individuo. 40. - El método de la reivindicación 38, en el cual la cantidad del conjugado es efectivo para incrementar una cuenta de células CD4+ en el individuo . 41. - El método de la reivindicación 38, que también comprende administrar a dicho individuo por lo menos un agente antiviral convencional. 42. - El método de la reivindicación 37 o 38, en el cual el conjugado se administra al individuo mediante un método que se selecciona a partir del grupo que consiste de medios intravenosos, intramusculares y subcutáneos. 43. - El método de la reivindicación 37 o 38, en el cual el conjugado se administra en forma continua a dicho individuo. 44. - El método de la reivindicación 37 o 38, en el cual el conjugado se administra a intervalos periódicos predeterminados a dicho individuo. 45.- El método de la reivindicación 37 o 38, que también comprende marcar el conjugado con un marcador detectable. 46. - El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el marcador detectable es un marcador radiactivo o un marcador fluorescente . 47. - Una célula hospedera transformada que comprende por lo menos dos vectores, por lo menos un vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CCR5, y por lo menos un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5, caracterizada porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 9 , y las dos cadenas ligeras tienen la secuencia de aminoácido indicado en SEQ ID NO : 6. 48. - Una célula hospedera transformada que comprende por lo menos dos vectores, por lo menos un vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CCR5, y por lo menos un vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5, caracterizada porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12, y las dos cadenas ligeras tienen la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO : 6. 49. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47 o 48, caracterizada porque la célula es una célula de mamí fero . 50.- La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la célula es una célula COS, una célula CHO o una célula de mieloma . 51.- La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47 o 48, caracterizada porque la célula secreta al anticuerpo anti-CCR5. 52. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el vector que codifica para las cadenas pasadas se denomina pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) . 53. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el vector que codifica para las cadenas pesadas se denomina pVgl : HuPRO 140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) . 54. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47 o 48, caracterizada porque el vector que codifica para las cadenas ligeras se denomina pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) . 55.- La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el vector que codifica para las cadenas pesadas se denomina pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) y el vector que codifica para las cadenas ligeras se denomina pVK : HuPR01 0 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) . 56. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el vector que codifica para las cadenas pesadas se denomina pVgl : HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) y el vector que codifica para las cadenas ligeras se denomina pVK: HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) . 57. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO : 8. 58. - La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO: 11. 59.- La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 47 o 48, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para las cadenas ligeras tiene la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO : 5. 60. - Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 9. 61. - El vector de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el vector se denomina pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC No. PTA-4098) . 62. - Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:12. 63. - El vector de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el vector se denomina pVgl : HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC No. PTA-4099) . 64. - Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCR5, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 6. 65.- El vector de conformidad con la reivindicación 64, caracte izado porque el vector se denomina pVK : HuPR01 0 -VK (designación de depósito ATCC No. PTA-4097) . 66.- Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende cultivar una célula hospedera que contiene en la misma (i) un plásmido designado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) , y (ii) cualquiera de un plásmido designado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido designado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) bajo condiciones que permitan la producción de un anticuerpo que comprenda dos cadenas ligeras codificadas por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 HG2 -VH (designación de depósito ATCC PTA-4097) y dos cadenas pesadas codificadas ya sea por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , para producir de esta manera un anticuerpo anti-CCR5. 67.- Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende: a) transformar una célula hospedera con (i) un plásmido designado pVK : HuPROl 40 - VK (designación de depósito ATCC PTA-4097), y (ii) cualquiera de un plásmido denominado pVgl : HuPROl 40 HG2 -VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o un plásmido denominado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) ; y b) cultivar la célula hospedera transformada bajo condiciones que permitan la producción de un anticuerpo que comprenda dos cadenas ligeras codificadas por el plásmido denominado pVK : HuPR0140 -VK (designación de depósito ATCC PTA-4097) y dos cadenas pesadas codificadas ya sea por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) o por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+D-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) , para de esta manera producir un anticuerpo anti-CCR5. 68. - El método de conformidad con la reivindicación 66 o 67, que comprende también recuperar en forma aislada el anticuerpo anti-CCR5 producido de esta manera. 69. - El método de conformidad con la reivindicación 66 o 67, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de mamífero. 70.- El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la célula hospedera de mamífero es una célula COS, una célula CHO o una célula de mieloma. 71. - El método de conformidad con la reivindicación 66 o 67, caracterizado porque las cadenas pesadas del anticuerpo anti-CCR5 son codificadas por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 HG2-VH (designación de depósito ATCC PTA-4098) . 72. - El método de conformidad con la reivindicación 66 o 67, caracterizado porque las cadenas pesadas del anticuerpo anti-CCR5 son codificadas por el plásmido denominado pVgl : HuPR0140 (mut B+D+I)-VH (designación de depósito ATCC PTA-4099) . 73.- Un estuche para ser utilizado en un procedimiento para producir un anticuerpo anti-CCR5 que comprende: a) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo anti-CCR5, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6; y b) un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 9 , o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-CCR5, en el cual la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO : 12.