MX2009001204A - Conjugado de un anticuerpo cointra ccr5 y un peptido antifusogenico. - Google Patents

Conjugado de un anticuerpo cointra ccr5 y un peptido antifusogenico.

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Erhard Kopetzki
Stephan Fischer
Michael Brandt
Ralf Schumacher
Suryanarayana Sankuratri
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Hoffmann La Roche
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Abstract

La presente invención se relaciona con un conjugado que comprende uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gp120 de VIH, caracterizado porque uno a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gp120 de VIH y con el uso farmacéutico de tal conjugado.

Description

CONJUGADO DE UN ANTICUERPO CONTRA CCR5 Y UN PEPTIDO ANTIFUSOGENICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un anticuerpo contra CCR5 y con un péptido antifusogénico, en donde uno a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo anti-CCR5. Los péptidos antifusogénicos pueden ser diferentes, similares o idénticos en el nivel del aminoácido.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La infección de las células por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) se efectúa por un proceso en el que se fusionan la membrana de las células a infectarse y la membrana viral. Se propone un esquema general para este propósito: El complejo de glucoproteina de envoltura viral (gpl20/gp41) interactúa con un receptor de superficie celular localizado en la membrana de la célula a infectarse. La unión de gpl20 a, por ejemplo el receptor CD4 en combinación con un co-receptor tal como CCR-5 o CXCR-4 causa un cambio en la conformación del complejo de gpl20/gp41. Como consecuencia de esta cambio conformacional la proteina de gp41 es capaz de insertarse en la membrana de la célula objetivo. Esta inserción es el comienzo del proceso de fusión de membrana. REF. : 198967 Es conocido que la secuencia de aminoácido de la proteina gp41 varia en diferentes cepas de VIH debido a los polimorfismos que se presentan naturalmente. Pero puede reconocerse la misma arquitectura de dominio, más precisamente, una señal de fusión, dos dominios de repetición de siete (HRl, HR2 ) y un dominio de transmembrana (en la dirección del término N a C) . Se sugiere que el dominio de fusión (o fusogénico) esté participando en la inserción y la desintegración de la membrana celular. Las regiones de HR se construyen de múltiples tramos que comprenden siete aminoácidos ("de siete") (ver, por ejemplo, Shu, W. , et al., Biochemistry 38 (1999) 5378-5385). Además de los séptimos, están presentes uno o más radicales similares a cremallera de leucina. Esta composición representa la formación de una estructura de bobina enrollada de proteínas gp41 y también como péptidos derivados de estos dominios. Las bobinas enrolladas en general son oligómeros que consisten de dos o más hélices que interactúan. .Los péptidos con las secuencias de aminoácidos deducidas del dominio HRl o el dominio HR2 de gp41 son efectivos en los inhibidores in vitro e in vivo de la captación de VIH in las células (por ejemplo, para los péptidos ver US 5,464,933, US 5,656,480, US 6,258,782, US 6,348,568 o US 6,656,906). Por ejemplo, T20 (también conocido como DP178, Fuzeon®, un péptido de HR2 ) , T651 (US ^ 6,*479, 055) , y T2635 ( O 2004/029074) son inhibidores muy potentes de la infección por VIH. Se ha intentado mejorar la eficiencia de los péptidos derivados de HR2 con, por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos o reticulación química (Sia, S.K., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669; Otaka, A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940) . La conjugación de los péptidos a. ciertas moléculas puede cambiar sus propiedades farmacocinéticas, por ejemplo, puede aumentarse la vida media del suero de tales conjugados peptídicos. Las conjugaciones se reportan, por ejemplo, para el polietilenglicol (PEG) e interleucina-6 (EP 0 442 724), para PEG y eritropoyetina (WO 01/02017), para las moléculas quiméricas que comprenden endostatina e inmunoglobulinas (US 2005/008649), para las proteínas de fusión a base de anticuerpos secretados (US 2002/147311), para los polipéptidos de fusión que comprenden albúmina (US 2005/0100991; albúmina de suero de humano (US 5,876,969), para polipéptidos PEGilados (US 2005/0114037) y para fusiones r de interferón. También se describen en el estado de la técnica las inmunotoxinas que comprenden gelonina y un anticuerpo (WO 94/26910) , proteínas de fusión de anticuerpo de transferrina modificadas (US 2003/0226155) , proteínas de fusión de anticuerpo-citosina (US 2003/0049227) y proteínas de fusión que consisten de un péptido con actividad inmuno-estimuladora, transporte de membrana u homofílica y un anticuerpo (US 2003/0103984). En O 2004/085505, se ' reportan los conjugados biológicamente activos de acción duradera que consisten de compuestos biológicamente activos enlazados químicamente a macromoléculas . El co-receptor CCR5 se usa para la mayoría de los aislados primarios de VIH-1 y es crítico para el establecimiento .y mantenimiento de 'la infección. Además, la función de CCR5 es indispensable para la salud humana. Un alelo de CCR5 mutante, "CCR5 ? 32", codifica una proteína no funcional, truncada (Samson, M . , et al., Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M . , et al., Science 273 (1996) 1856-1862). Los individuos homocigotos para la mutación carecen de la expresión de CCR5 y están fuertemente protegidos de la infección por VIH-1. Estos demuestran una consecuencia fenotípica no evidente y son altamente resistentes a la infección por VIH M-trópica, mientras que los individuos heterocigotos presentan una progresión retrasada de la enfermedad (Schwarz, M.K. and Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358). La carencia de CCR5 es sin consecuencias adversas evidentes, probablemente porque CCR5 es parte de una red de quimiocina altamente redundante como el receptor para las a-quimiocinas ???-?a, ???-?ß, y RANTES, que comparten muchas funciones de traslape y la mayoría de la cuales tiene receptores alternativos (Rossi, D. and Zlotnik, A., Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242) . La identificación de CCR5 como un co- receptor de VIH-1 se basó en la capacidad de sus ligandos, MIP-l , MIP-?ß y RANTES, de bloquear la infección por R5 pero no aislados de R5X4 o X4 (Cocchi, F. , et al., Science 270 (1995) 1811-1815) . CCR5 también es un receptor de las quimiocinas de "racimo", que se producen principalmente durante las respuestas inflamatorias y controlan el restablecimiento de los neutrófilos (quimiocinas de CXC) , macrófagos y un subgrupo de células T (células Thl y Th2 auxiliares T) . Las respuestas de Thl son por lo regular las involucradas en la inmunidad mediada por células efectivas contra los virus y tumores, respuestas pro-inflamatorias responsables de la muerte de parásitos intracelulares y perpetuar las respuestas autoinmunitarias , por ejemplo, mientras que las respuestas de Th2 se cree que son fundamentales en las alergias. Por lo tanto, los inhibidores de estos receptores de quimiocina pueden ser útiles como inmunomoduladores . Para las respuestas de Thl, las respuestas sobreactivas se disminuyen, por ejemplo, en la autoinmunidad que incluye artritis reumatoide, o, para las respuestas Th2, se disminuyen los ataques de asma o las respuestas alérgicas que incluyen dermatitis atópica (ver, por ejemplo, Schols, D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller, A., y Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38; Kazmierski, W.M., et al., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, T., Trends Immunol. 23 (2002) 347- Los anticuerpos contra CCR5 humano son, por ejemplo, PRO 140 (Olson, W.C., et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155), y/ó 2D7 (Samson, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941) . Los anticuerpos adicionales se mencionan en US 2004/0043033, US 6,610,834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003 40, US 6,528,625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241 , EP 1 322 332 , EP 1 263 791 , EP 1 207 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308 y EP 05007138.0. Los conjugados de polietilenglicol de anticuerpos contra CCR5 son conocidos en US 2003/0228306. US 2003/0215421 se relaciona con conjugados de quimiocina-toxina . WO 01/43779 se relaciona con los conjugados de anticuerpos anti-CD4 y anticuerpos anti-CCR5 y con conjugados de anticuerpos anti-CD4 y un péptido que inhibe la fusión de VIH-1. Los conjugados de CCR5 y las toxinas se mencionan en EP 1 346 731.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención reporta un conjugado que comprende de uno a ocho péptidos antifusogénicos y un anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de VIH, caracterizado porque uno a ocho, de preferencia dos o cuatro, péptidos antifusogénicos cada uno se conjugan a un término de las cadenas pesada y/o ligera de tal anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de VIH un número de ocho péptidos antifusogénicos por anticuerpo es únicamente posible si el anticuerpo comprende ocho términos, es decir, está compuesto, por ejemplo, de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; si el anticuerpo comprende un número más pequeño de término C y N, por ejemplo, como un scFv, también se reduce el número correspondiente de péptidos antifusogénicos posible como máximo en el conjugado, es decir, se reduce a menos de ocho) . La invención comprende además un conjugado que comprende uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo anti-CCR5 (mAb CCR5) caracterizado porque a lo más uno a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras de tal anticuerpo anti-CCR5 (un número de ocho péptidos antifusogénicos por mAb CCR5 sólo es posible si el mAb CCR5 comprende ocho términos, es decir, está compuesto, por ejemplo, de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; si mAb CCR5 comprende un número más pequeño de término C y N, por ejemplo, como un scFv, también se reduce el número correspondiente de péptidos antifusogénicos posible como máximo en el conjugado, es decir, se reduce a menos de ocho) . De preferencia, el aminoácido carboxi terminal de una cadena de anticuerpo anti-CCR5 se conjuga al aminoácido amino terminal del péptido antifusogénico o el aminoácido carboxi terminal del péptido antifusogénico se conjuga al aminoácido amino terminal de la cadena de anticuerpo, de preferencia por un enlace peptidico con o sin un enlazador intermedio. De preferencia, el conjugado se caracteriza por la fórmula general: mAb CCR5 - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] n en donde m es independientemente para cada péptido antifusogénico ya sea 0 (es decir, un enlace peptidico entre mAb CCR5 y el péptido antifusogénico ) ó 1 (es decir un enlazador entre mAb CCR5 y el péptido antifusogénico) y n es un entero de 1 a 8. Un conjugado preferido de una cadena pesada y/o ligera de mAb CCR5 y un péptido antifusogénico ("conjugado de cadena") se selecciona del grupo que consiste de: (1) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] (2) [cadena pesada] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (3) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] - [péptido antifusogénico] (4) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] (5) [cadena ligera] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (6) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] - [péptido antifusogénico] (7) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (8) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] En donde el enlazador puede ser el mismo o diferente en (dentro y entre) los conjugados de cadena, en donde m es un entero de 1 ó 0 y m puede ser independientemente el mismo o diferente en (dentro y entre) tales conjugados de cadena. (El lado izquierdo del péptido o cadena de mAb CCR5 significa término N, el lado derecho significa término C. En (1) por lo tanto el término C del péptido antifusogénico se enlaza mediante un enlace peptidico o un enlazador al término N de la cadena pesada de mAb CCR5) . De preferencia, los conjugados de cadena se montan a los conjugados de acuerdo con la invención que comprenden un mAb CCR5 (por ejemplo, que consiste de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que incluyen los dominios de Fe constantes, un fragmento de scFv o un fragmento de Fab) . Los conjugados de cadena especialmente preferidos son (2), (3), (4) y (7). Los conjugados especialmente preferidos de acuerdo con la invención comprenden 2x [cadena ligera de mAb CCR5] y 2x (2), 2 x [cadena ligera de mAb CCR5] y 2 x (3) ó 2 x [cadena pesada de mAb CCR5] y 2 x (4) ó 2 x [cadena ligera de mAb CCR5] y 2 x (7) . La cadena pesada y/o ligera comprende de preferencia una región constante (Fe) . De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de cadena pesada de la SEC ID NO: 16, 17. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de CDR3 SEC ID NO: 13, 14, 15 y una región de CDR1 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de CDR1 SEC ID NO: 9, 10, 11, 12. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo de dominios variables de cadena pesada que comprenden la SEC ID NO: 1, 3, 5 y 7. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena ligera variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR1 seleccionada de la SEC ID NO: 18, 19, 20, una región de CDR2 seleccionada de la SEC ID NO: 21, 22, 23 y una región de CDR3 seleccionada de la SEC ID NO: 24, 25. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 1 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 2, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 3 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 4, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 5 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 6, o como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 7 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 8. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena pesada y ligera variable seleccionado independientemente del grupo que consiste de: a) el dominio variable de cadena pesada (VH) definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera (VL) definido por secuencia de aminoácido SEC ID NO: 2 ; b) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 4; c) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO : 6 ; d) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 8. De preferencia, 1 conjugado se caracteriza porque comprende el dominio variable de cadena pesada (VH) definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera (VL) variable definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 2; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 4; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 6; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 8; un enlazador seleccionado del grupo que consiste de los aminoácidos glicina (G) y asparagina (N) , el tripéptido GST y la SEC ID NO: 36-62 y la SEC ID NO: 67-70; y un péptido antifusogénico seleccionado del grupo de los péptidos definidos por la SEC ID NO: 29 a 35 y la SEC ID NO: 73. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico seleccionado del grupo de péptidos que comprenden C34, T20, T1249, T651, T2635, N36, DP107 y afp-1. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico en cada término C de las cadenas pesadas o en cada término N de las cadenas ligeras (dos péptidos antifusogénicos ) . De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico en cada término C de las cadenas pesadas y en cada término N de las cadenas ligeras (cuatro péptidos antifusogénicos ) . De preferencia, el conjugado se «caracteriza porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 1, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 4, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 3, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 5, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, o que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 8, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 7, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque el anticuerpo anti-CCR5 es de la subclase de IgGl. También se prefiere que el anticuerpo anti-CCR5 no sea de la subclase de IgG4, o de la subclase de IgGl o IgG2, con una mutación en la posición de aminoácido S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque el anticuerpo anti-CCR5 de la subclase de IgG4 tiene una mutación S228P y el anticuerpo anti-CCR5 de la subclase de IgGl tiene las mutaciones L234A y L235A. La invención comprende además un conjugado que comprende dos o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo anti-CD4 (mAb CD4) caracterizado porque dos a ocho péptidos antifusogénicos , de preferencia dos o cuatro, se conjugan cada uno a un término de cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo anti-CD4 (un número de ocho péptidos antifusogénicos por mAb CD4 sólo es posible si el mAb CD4 comprende ocho términos, es decir, está compuesto, por ejemplo, de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; si mAb CD4 comprende un número menor de términos C- y N-, por ejemplo, como un scFv, también se reduce el número correspondiente de péptidos antifusogénicos posible como máximo en el conjugo, es decir, se reduce a menos de ocho) . De preferencia, el aminoácido terminal carboxi de una cadena de anticuerpo se conjuga al aminoácido amino terminal del péptido antifusogénico o el aminoácido carboxi terminal del péptido antifusogénico se conjuga al aminoácido amino terminal de la cadena de anticuerpo, de preferencia, mediante un enlace peptidico con o sin un enlazador intermediario. De preferencia, el' conjugado se caracteriza por la fórmula general: anticuerpo - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] n en donde m es independientemente para cada péptido antifusogénico ya sea 0 (es decir, un enlace peptidico entre el anticuerpo y el péptido antifusogénico) ó 1 (es decir, un enlazador entre el anticuerpo y el péptido antifusogénico) y n es un entero de 2 a 8 , de preferencia un entero exacto de 2 a 8, más preferentemente 2 ó 4. De preferencia, el anticuerpo es mAb CD4. Un conjugado más preferido de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo y un péptido antifusogénico ("conjugado de cadena") se selecciona del grupo que consiste de (en la dirección N-terminal a C-terminal): (1) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] (2) [cadena pesada] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (3) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] - [péptido antifusogénico] (4) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] (5) [cadena ligera] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (6) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] - [péptido antifusogénico] (7) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (8) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] en donde el enlazador puede ser el mismo o diferente en (dentro y entre) los conjugados de la cadena, en donde m es un entero de 1 ó 0, y m puede ser independientemente el mismo o diferente en (dentro y entre) los conjugados de cadena. (El lado izquierdo del péptido o cadena de anticuerpo significa el término N, el lado derecho significa el término C. En (1) por lo tanto el término C del péptido antifusogénico se enlaza mediante un enlace peptidico o un enlazador al término N de la cadena pesada del anticuerpo) . De preferencia, los conjugados de cadena se montan a los conjugados de acuerdo con la invención, que comprenden un mAb CD4 (por ejemplo, que consiste de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que incluyen los dominios de Fe constantes, un fragmento de scFv o un fragmento de Fab) . Los conjugados de cadena especialmente preferidos son (2), (3), (4) y (7). Los conjugados especialmente preferidos de acuerdo con la invención comprenden 2x [cadena ligera de mAb CD4] y 2x (2), 2 x [cadena ligera de mAb CD4] y 2 x (3) ó 2 x [cadena pesada de mAb CD4] y 2 x (4) ó 2 x [cadena ligera de mAb CD4] y 2 x (7) . La cadena pesada y/o ligera comprende de preferencia una región constante. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR3 seleccionada de las secuencias CDR3 de cadena pesada de la SEC ID NO: 103, 104 ó 105. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR3 seleccionada de las secuencias de CDR3 de la SEC ID NO: 103, 104 ó 105, una región de CDR2 seleccionada de las secuencias de CDR2 de la SEC ID NO: 100, 101 ó 102, y una región de CDR1 seleccionada de las secuencias de CDR1 de la SEC ID NO: 97, 98 ó 99. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio variable de cadena pesada en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 82 u 83. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena ligera variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR1 seleccionada de la SEC ID NO: 87, 88, 89 ó 90, una región de CDR2 seleccionada de la SEC ID NO: 91, 92 ó 93, y una región seleccionada de CDR3 seleccionada de la SEC ID NO: 94, 95 ó 96. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende como las CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 81, y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 75, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 82, y como las CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 76, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 84, y- como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 78, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 85, y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 79, o como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 86, y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 80. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un dominio de cadena pesada o ligera variable seleccionado independientemente de: a) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 81, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 75; b) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 82, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO : 76 ; c) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 84, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 78; d) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 85, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 79, e) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 86, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 80. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 81, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 75; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 82, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 76; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 84, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 78; el dominio variable de cadena pesada definido ¦ por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 85, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 79, o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 86, y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 80; un enlazador seleccionado de los aminoácidos glicina (G) y asparagina (N) , el tripéptido GST, y la SEC ID NO:. 36 a 62 y la SEC ID NO: 67 a 70; y un péptido antifusogénico seleccionado de los péptidos antifusogénicos de la SEC ID NO: 29 a 35 o la SEC ID NO:73. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico seleccionado de los péptidos antifusogénicos C34, T20, T1249, T651, T2635, N36, DP107 o afp-1. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico en cada término C de las cadenas pesadas o en cada término N de las cadenas ligeras (dos péptidos antifusogénicos) . De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico en cada término C de las cadenas pesadas y en cada término N de las cadenas ligeras (cuatro péptidos antifusogénicos ) . De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende en los dos términos C de las cadenas pesadas y en los dos términos N de las cadenas ligeras (cuatro péptidos antifusogénicos ) . De preferencia, el conjugado se caracteriza porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 75, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 81, un enlazador de la SEC ID NO: 69, y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 73, que comprenden dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 76, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 82, un enlazador de la SEC ID NO: 69, y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 73, que comprenden dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 78, dos conjugados de tipo (2) que comprende- cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 84, un enlazador de la SEC ID NO: 69, y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 73, que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 79, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 85, un enlazador de la SEC ID NO: 69, y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 73, o que comprende cada uno dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 80, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 86, un enlazador de la SEC ID NO: 69, y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 73. De preferencia, el conjugado se caracteriza porque el anticuerpo es de la subclase IgGl o de la subclase IgG4. También se prefiere, que el anticuerpo sea de la subclase IgG4 o IgGl o IgG2, con una mutación en la posición del aminoácido S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. De preferencia el conjugado se caracteriza porque tal anticuerpo de la subclase IgG4 tiene una mutación S228P y el anticuerpo de la subclase IgGl tiene las mutaciones L234A y L235A. Se prefiere especialmente que el anticuerpo sea un anticuerpo anti-CD4 o un anticuerpo anti-CCR5. La invención comprende un método para la producción de un conjugado de acuerdo' con la invención, caracterizado porque el método comprende: a) cultivar una célula que contiene uno o más plásmidos que contienen una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un conjugado de acuerdo con la invención bajo condiciones apropiadas para la expresión del conjugado, b) recuperar el conjugado de la célula o el sobrenadante.
En una modalidad, son los genes los que codifican las cadenas ligeras y pesadas de mAb CCR5 o mAb CD4 con o sin el péptido antifusogénico enlazado localizado en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión. La invención comprende una composición farmacéutica, que contiene un conjugado de acuerdo con la invención, junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención comprende el uso de un conjugado de acuerdo con la invención para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales. De preferencia, el uso se caracteriza porque la infección viral es una infección por VIH. La invención comprende el uso de un conjugado de acuerdo con la invención para el tratamiento de un paciente en necesidad de un tratamiento antiviral, de preferencia un tratamiento anti-VIH.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Mapa del plásmido del vector de expresión 4900 de cadena ligera ? de mAb CCR5 4900. Figura 2 : Mapa del plásmido del vector de expresión 4901 de cadena pesada mAb CCR5 ?? . Figura 3: Mapa del plásmido del vector de expresión 4995 del conjugado de cadena pesada mAb CCR5 ?? . Figura 4: Mapa del plásmido del vector de expresión 6310 de cadena ligera ? de mAb CD4. Figura 5: Mapa del plásmido del vector de expresión 6309 de cadena pesada mAb CD4 ?? . Figura 6: Mapa del plásmido del vector de expresión 6303 de cadena pesada de mAb CD4 ?? .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención es un conjugado que comprende uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo anti-CCR5 (mAb CCR5) caracterizado porque una a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas -y/o ligeras de tal anticuerpo anti-CCR5. Un número de ocho péptidos antifusogénicos por mAb CCR5 sólo es posible si el mAb CCR5 comprende ocho términos, es decir, está compuesto, por ejemplo, de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Si el mAb CCR5 comprende un número pequeño de términos C- y N, por ejemplo, como un scFv, el número correspondiente de péptidos antifusogénicos posible como máximo en el conjugado también se reduce, es decir, se reduce a menos de ocho. Otro aspecto de la presente invención es el conjugado que comprende dos o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo anti-CD4 (mAb CD4 ) caracterizado porque dos a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras de tal anticuerpo anti-CD4.
Cuando en lo siguiente se hace referencia en general, o a mAb CCR5 o a mAb CD4, también se incluye, cuando sea apropiado, la misma referencia al otro mAb y las secuencias correspondientes . Un "péptido antifusogénico" es un péptido que inhibe los eventos asociados con la fusión de membrana o el evento de fusión de membrana mismo, incluyendo, entre otras cosas, la infección de la infección de las células infectadas por un virus debido a la fusión de membrana. Estos péptidos antifusogénicos son de preferencia péptidos lineales. Por ejemplo, pueden derivarse del ectodominio gp41, por ejemplo, tal como DP107, DP178. Ejemplos de tales péptidos pueden encontrarse en US 5,464,933, US 5,656,480, US 6,013,263, US 6,017,536, US 6,020,459, US 6,093,794, US 6,060,065, US 6,258,782, US 6,348,568, US 6,479,055, US 6,656,906, O 1996/19495, WO 1996/40191, WO 1999/59615, WO 2000/69902 y WO 2005/067960. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de tales péptidos comprenden o pueden seleccionarse del grupo de la SEC ID NO: 1 a 10 de US 5,464,933; SEC ID NO: 1 a 15 de US 5,656,480; SEC ID NO: 1 a 10 y 16 a 83 de US 6,013,263; SEC ID NO: 1 a 10, 20 a 83 y 139 a 149 de US 6,017,536; SEC ID NO: 1 a 10, 17 a 83 y 210 a 214 de US 6,093,794; SEC ID NO: 1 a 10, 16 a 83 y 210 a 211 de US 6,060,065; SEC ID NO: 1286 y 1310 de US 6,258,782; SEC ID NO: 1129, 1278-1309, 1311 y 1433 de US 6, 348, 568; SEC ID NO: 1 a 10 y 210 a' 238 de US 6, 479,055; SEC ID NO: 1 a 171, 173 a 216, 218 a 219, 222 a 228, 231, 233 a 366, 372 a 398, 400 a 456, 458 a 498, 500 a 570, 572 a 620, 622 a 651, 653 a 736, 739 a 785, 787 a 811, 813 a 823, 825, 827 a 863, 865 a 875, 877 a 883, 885, 887 a 890, 892 a 981, 986 a 999, 1001 a 1003, 1006 a 1018, 1022 a 1024, 1026 a 1028, 1030 a 1032, 1037 a 1076, 1078 a 1079, 1082 a 1117, 1120 a 1176, 1179 a 1213, 1218 a 1223, 1227 a 1237, 1244 a 1245, 1256 a 1268, 1271 a 1275, 1277, 1345 a 1348, 1350 a 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374 a 1376, 1378 a 1379, 1381 a 1385, 1412 a 1417, .1421 a 1426, 1428 a 1430, 1432, 1439 a 1542, 1670 a 1682, 1684 a 1709, 1712 a 1719, 1721 a 1753, 1755 a 1757 de US 6,656,906; o la SEC ID NO: 5 a 95 de WO 2005/067960. El péptido antifusogénico tiene una secuencia de aminoácido que comprende de 5 a 100 aminoácidos, de preferencia de 10 a 75 aminoácidos y más preferido de 15 a 50 aminoácidos. Se prefieren especialmente los péptidos antifusogénicos C-34, T-20, T-1249, T-651, T-2635, N-36, (Root, M.J. , et al, Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825) y DP-107 (Wild, C, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680) y afp-1 (SEC ID NO: 29 a 35 y SEC ID NO: 73) . En una modalidad, comprende el conjugado de acuerdo con la invención uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo en donde i) los péptidos antifusogénicos son péptidos lineales con una secuencia de aminoácido de 5 a 100 aminoácidos y ii) uno a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras de tal anticuerpo. En otra modalidad, comprende el conjugado de acuerdo con la invención uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-CCR5 (mAb CCR5) , en donde i) los péptidos antifusogénicos se derivan del ectodominio gp41, y ii) uno a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras de tal anticuerpo. El término "ectodominio gp41" representa la secuencia de aminoácido que comienza con la posición de aminoácido 561 y que termina con la posición de aminoácido 620 de VIH-1 gpl60 o que comienza con la posición de aminoácido 50 y que termina con la posición de aminoácido 109 de VIH-1 gp41 (SEC ID NO: 66) (ver también, por ejemplo, Bar, S. and Alizon, M. J. Virol. 78 (2004) 811-820). El término "anticuerpo" abarca las diferentes formas de las estructuras de anticuerpos que incluyen los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo de acuerdo con la invención es de preferencia un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo agotado de antigeno de células T (WO 98/33523, WO 98/52976, y WO 00/34317). La ingeniería genética de los anticuerpos, por ejemplo, se describe en Morrison, S.L., et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes US Nos. 5,202,238 and 5,204, 244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323- 327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N . , Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud total, de preferencia los dominios variables del mismo o por lo menos la porción de unión del antigeno del mismo. Ejemplos de los fragmentos de anticuerpos son, por ejemplo, las moléculas de anticuerpos de cadena simple (scFv) , los fragmentos Fab, F(ab)2, y similares, con tal de que mantengan las características de un anticuerpo anti-CCR5. Los anticuerpos ScFv, por ejemplo, se describen en Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Huston también describe enlazadores ' y métodos para enlazar los polipéptidos útiles de la presente invención. "CCR5" significa CCR5 humano como se describe, por ejemplo, en Oppermann, M . , Cell Signal. 16 (2004) 1201-1210 y S issProt P51681. Los términos "anticuerpo que se une a CCR5", "anticuerpo anti-CCR5", o "mAb CCR5", que se usan de manera intercambiable dentro de esta solicitud, significan un anticuerpo que se une específicamente a CCR5 y de preferencia, que inhibe la fusión de VIH con una célula objetivo. La unión puede probarse en una célula basada en una prueba de ELISA in vítro (células CHO que expresan CCR5) . La unión se encuentra si el anticuerpo causa una relación de S/N (señal/ruido) de 5 o más, de preferencia 10 o más, a una concentración de anticuerpo de 100 ng/ml. El término "que inhibe la fusión de VIH con una célula objetivo" se refiere a la inhibición de la fusión de VIH con una célula objetivo medida en una. prueba que comprende poner en contacto la célula objetivo (por ejemplo, PBMC) con el virus en presencia del anticuerpo en una concentración efectiva para inhibir la fusión de membrana entre el virus y la célula y que mide, por ejemplo, la actividad del gen reportero de luciferasa o la concentración del antigeno p24 de VIH. El término "fusión de membrana" se refiere a la fusión entre una primera célula que co-expresa los polipéptidos CCR5 y CD4 y una segunda célula o virus que expresa una proteina env de VIH. La fusión de membrana se determina por las células y/o virus diseñados genéticamente por una prueba de gen reportero (por ejemplo, por la prueba del gen reportero de luciferasa) . Los anticuerpos ati-CCR5 preferidos se mencionan en US 2004/0043033, US 6,610,834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6,528,625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241, EP 1 322 332, EP 1 263 791, EP 1 207 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308 y WO 2006/103100. Los anticuerpos anti-CCR5 preferidos se describen en WO 2006/103100. Un anticuerpo anti-CCR5 especialmente preferido se caracteriza porque el anticuerpo comprende un dominio de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de cadena pesada SEC ID NO: 16, 17. Un anticuerpo preferido adicional comprende una región de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 SEC ID NO: 16, 17, una región CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 SEC ID NO: 13, 14, 15, y una región de CDR1 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR1 SEC ID NO: 9, 10, 11, 12. Los dominios variables de cadena pesada preferidos se muestran en la SEC ID NO: 1, 3, 5, 7. Un anticuerpo anti-CCR5 preferido comprende además un dominio de cadena ligera variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDRl seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDRl SEC ID NO: 18, 19, 20, una región de CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 SEC ID NO: 21, 22, 23, y una región de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 SEC ID NO: 24, 25. El anticuerpo anti-CCR5 se caracteriza de preferencia porque contiene como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 1 y como las CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 2, como las CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 3 y como las CDRs de cadena ligera las CDRs. de la SEC ID NO: 4, como las CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 5 y como las CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 6, o como las CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 7 y como las CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 8. Las secuencias de CDR pueden determinarse de acuerdo con la definición estándar de Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Las CDRs de la SEC ID NO: 1-8 se muestran en la SEC ID NO: 9-25. El anticuerpo anti-CCR5 comprende de preferencia un dominio de cadena pesada y ligera seleccionado independientemente del grupo que consiste de: a) el dominio variable de la cadena pesada (VH) definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera (VL) definido por la SEC ID NO: 2; b) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera definido por la SEC ID NO: 4; c) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera definido por la SEC ID NO: 6; d) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera definido por la SEC ID NO: 8. "CD4" significa CD4 humano como se describe, por ejemplo, en Brady, R.L. and Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18 y SwissProt PO 1730. Los términos "anticuerpo de unión a CD4", "anticuerpo anti-CD4", o "mAb CD4", que se usan de manera intercambiable .dentro de esta solicitud, representan un anticuerpo que se une específicamente a CD4 y que inhibe de preferencia la fusión de VIH con una célula objetivo. La unión puede probarse en una célula basada en una prueba ELISA in vitro (células CHO que expresan CCR5) . La unión se encuentra si el anticuerpo en cuestión causa una relación de S/N (señal/ruido) de 5 o más, de preferencia 10 o más, a una concentración de anticuerpo de 100 ng/ml. El término "que inhibe la fusión de VIH con una célula objetivo" se refiere a la inhibición de la fusión de VIH con una célula objetivo medida en una prueba que comprende poner en contacto la célula objetivo (por ejemplo, PB C) con el virus en presencia del anticuerpo en cuestión, en una concentración efectiva para inhibir la fusión de membrana entre el virus y la célula y que mide, por ejemplo, la actividad del gen reportero de luciferasa o la concentración del antígeno p24 de VIH. El término "fusión de membrana" se refiere a la fusión entre una primera célula que expresa los polipéptidos CD4 y una segunda célula o virus que expresa una proteína env de VIH. La fusión de membrana se determina por las células y/o virus diseñados genéticamente por una prueba de gen reportero (por ejemplo, por la prueba del gen reportero de luciferasa) . Los anticuerpos anti-CD4 ejemplares se mencionan en, por ejemplo, Reimann, K.A., et al, Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943, EP 0 512 112, US 5,871,732, EP 0 840 618, EP 0 854 885, EP 1 266 965, US '2006/0051346, O 97/46697, WO 01/43779, US 6,136,310, O 91/009966. "CXCR4" significa CXCR4 de humano como se describe, por ejemplo, en Feng, Y., et al., Science 272 (1996) 809-810, o Tamamura, H. and Fujii, N., Expert Opinión on Therapeutic Targets 9 (2005) 1267-1282. Los términos "anticuerpo de unión a CXCR4 " , "anticuerpo anti-CXCR4" o "mAb CXCR4", que se usan de manera intercambiable dentro de esta solicitud, representan un anticuerpo que se une específicamente a CXCR4 y que inhibe de preferencia la fusión de VIH con una célula objetivo. La unión puede probarse en una célula basada en la prueba de ELISA in vitro (células CHO que expresan CCR5) . La unión se encuentra si el anticuerpo en cuestión causa una relación de S/N (señal/ruido) de 5 o más, de preferencia 10 o más, a una concentración de anticuerpo de 100 ng/ml. El término "que inhibe la fusión de VIH con una célula objetivo" se refiere a la inhibición de la fusión de VIH con una célula objetivo medida en una prueba que comprende poner en contacto la célula objetivo (por ejemplo, PBMC) con el virus en presencia del anticuerpo en cuestión, en una concentración efectiva para inhibir la fusión de membrana entre el virus y la célula y que mide, por ejemplo, la actividad del gen reportero de luciferasa o la concentración del antigeno p24 de VIH. El término "fusión de membrana" se refiere a la fusión entre una primera célula que expresa los polipéptidos CXCR4 y una segunda célula o virus que expresa una proteina env de VIH. La fusión de membrana se determina por las células y/o virus diseñados genéticamente por una prueba de gen reportero (por ejemplo, por la prueba del gen reportero de luciferasa) . Ejemplos de los anticuerpos anti-CXCR4 se reportan en Strizki, J.M., et al., J. Virol. 71 (1997) 5678-5683 (Ab 12G5), US 7,138,496. Un "anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de HIV" representa dentro de la presente invención un anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular, que se usa por la subunidad gpl20 de VIH para mediar la unión del virus a la superficie celular de una célula, y de esta manera, previene la unión de gpl20 a tal receptor y también la unión de VIH a una superficie celular. El gpl20 de VIH se deriva de la división proteolitica de gpl60 de VIH (ver, por ejemplo, Brenneman, D.E., et al., Int. Rev. Neurobiol. 32 (1990) 305-353). El segundo fragmento de esta división es el gp41 de VIH. Estos dos fragmentos se asocian no covalentemente y median la unión y fusión celular de VIH y una célula. Ejemplos de los receptores de superficie celular son el receptor CD4 o los receptores de quimiocina, tales como el receptor CCR5, el receptor CXCR4 o el receptor CXCR5. Por lo tanto, en una modalidad, es el anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de VIH un anticuerpo anti-CD4 o un anticuerpo anti-CCR5 o un anticuerpo anti-CXCR4 o un anticuerpo anti-CXCR5. El anticuerpo usado en el conjugado de acuerdo con la invención se caracteriza de preferencia porque los dominios constantes son de origen humano. Tales dominios constantes son bien conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, descrito por Kabat (ver, por ejemplo, Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por ejemplo, una región constante de cadena pesada de IgGl de humano útil (CH1-Bisagra-CH2-CH3 ) comprende una secuencia de aminoácido seleccionada independientemente del grupo que consiste de la SEC ID NO: 26, 27. Por ejemplo, un dominio constante de cadena ligera útil de humano kappa (K) comprende una secuencia de aminoácido de un dominio constante de cadena ligera kappa (dominio constante de cadena ligera K, CL) de la SEC ID NO: 28. Se prefiere además que los dominios variables del anticuerpo sean de origen de ratón y comprendan el marco de la secuencia de dominio variable del anticuerpo de un anticuerpo de ratón de acuerdo con Kabat (ver, por ejemplo, Johnson, G., and u, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218) . Un anticuerpo anti-CCR5 muestra una unión al o a los mismos epitopos de CCR5 como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de los anticuerpos A a E o se inhibe en la unión a CCR5 por los anticuerpos A a E debido al impedimento estérico de la unión o unión competitiva. La unión del epitopo se investiga usando exploración de alanina de acuerdo con el método descrito por Olson, W.C., et al. (J. Virol. 73 (1999) 4145-4155) par el mapeo de epitopo. Una reducción de la señal de 75% o más muestra que el o los aminoácidos mutados contribuyen al epitopo reconocido por el anticuerpo. La unión del anticuerpo al mismo epitopo se encuentra, si los aminoácidos que contribuyen al epitopo se reconocen por el anticuerpo investigado y el anticuerpo A, B, C, D o E. El anticuerpo C, que muestra valores de IC5o menores que el anticuerpo 2D7 en las pruebas de VIH, se une a un epitopo que incluye los aminoácidos en el dominio ECL2 de CCR5 (Lee, B., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 9617-9626) que es diferentes del epitopo reconocido por el anticuerpo 2D7 (2D7 une a los aminoácidos K171 y E172 de ECL2A, pero no a los aminoácidos 184-189 de ECL2B) . La unión del epitopo para el anticuerpo C se encuentra que es de 20% para K171A o E172A mutante de CCR5 (glu 172 se muta a ala) . La unión de epitopo al 100% se define para CCR5 de tipo silvestre. Un anticuerpo de anti-CCR5 preferido adicional une al mismo epitopo como se une al anticuerpo C. El término "epitopo" significa un determinante de proteina capaz de la unión especifica a un anticuerpo. Los epitopos consisten usualmente de agrupaciones de superficie químicamente activa de las moléculas, tales como los aminoácidos de cadenas laterales de azúcar y tienen por lo regular características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epitopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al anterior, pero no al último, se pierde en presencia de los solventes desnaturalizados. De preferencia, un anticuerpo de acuerdo con la invención se une específicamente a CCR5 nativo, pero no desnaturalizado. Tal anticuerpo comprende de preferencia CDR3 de cadena pesada de la SEC ID NO: 17, y de preferencia además CDRs de cadena pesada seleccionados del grupo de CDRs de la SEC ID NO: 10, 11, 12, 14 y/ó 15. De preferencia, tal anticuerpo es el anticuerpo B, C, D o E, o comprende los dominios variables del anticuerpo B, C, D o E. De preferencia, un anticuerpo de unión a CCR5 desnaturalizado es el anticuerpo A o comprende los dominios variables del anticuerpo A. El término "dominio variable" (dominio variable de un dominio variables de cadena ligera (VL) , de una cadena pesada (VH) ) como se usa en la presente, representa cada dominio del par de dominios de cadena ligera y pesada que está involucrado directamente en la unión del anticuerpo al antigeno. Los dominios variables de la cadena ligera y pesada tienen la misma estructura general, es decir, poseen un "marco de inmunoglobulina" y cada dominio comprende cuatro "regiones de marco" (FR) , cuyas secuencias se conservan ampliamente, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones de determinación de complementariedad" (CDRs) . Las regiones del marco adoptan una conformación de película ß y las CDRs pueden formar espiras que conectan la estructura de película ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional por las regiones del marco y forman con las CDRs de otra cadena el sitio de unión del antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de los anticuerpos de acuerdo con la invención, y por lo tanto, proporcionan un objetivo adicional de la invención. Los términos "porción de unión de antígeno de un anticuerpo" o "sitio de unión de antígeno de un anticuerpo" cuando se usan en la presente se refieren a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. El sitio de unión del antígeno de un anticuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las "regiones de determinación de la complementariedad" o "CDRs". "Marco" o regiones de "FR" son las regiones de dominio variable además de los residuos de región hipervariable como se define en la presente. Por lo tanto, los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo comprenden de los términos N- a C-, las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3 y FR4 (marco de inmunoglobulina) . Especialmente, la región de CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión del antigeno y define el anticuerpo. De preferencia, el anticuerpo anti-CCR5 de acuerdo con la invención se caracteriza porque comprende en su dominio variable de cadena pesada la secuencia CDR3 de la SEC ID NO: 16 o la SEC ID NO: 17. Las regiones de determinación de la complementariedad (CDR) y marco (FR) se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D (1991) . La "parte Fe" de un anticuerpo anti-CCR5 no está involucrada directamente en la unión a CCR5, sino que exhibe diferentes funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácido de la región constante de sus cadenas pesadas, anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en las subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. De acuerdo con las regiones constantes de cadena pesada las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, ? y µ, respectivamente. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se de preferencia del tipo IgG. Una "parte Fe de un anticuerpo" de acuerdo con la invención es un término bien conocido para la persona experimentada y se define sobre la base de la división de papaina de los anticuerpos. Los anticuerpos de acuerdo con la invención contienen como parte la Fe una parte Fe de humano o una parte Fe derivada de origen humano. En una modalidad adicional de la invención, la parte Fe es una parte Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 o una parte Fe de un anticuerpo humano de la subclase IgGl, IgG2 o IgG3, que se modifica de tal manera que no puede detectarse la unión del receptor Fcy (por ejemplo, FcYRIIIa) y/o la unión de Clq como se define a continuación. De preferencia, la parte Fe es una parte Fe de humano y se prefiere especialmente de la subclase IgG4 de humano o una parte Fe mutada de la subclase IgGl de humano. Se prefieren adicionalmente las partes Fe de la subclase IgGl de humano con las mutaciones L234A y L235A. Se prefieren además las partes Fe mostradas en las SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 26 con las mutaciones L234A y L235A, SEC ID NO: 27 con la mutación S228P. Mientras que IgG4 muestra una unión del receptor Fcy reducida (FcYRIIIa) , los anticuerpos de otras subclases IgG muestran una fuerte unión. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida de carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que si se alteran también proporcionan una unión del receptor Fcy reducida (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591- 6604; Lund, J. , et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). De preferencia, un anticuerpo de acuerdo con la invención es, en este aspecto, la unión del receptor Fcy de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2, con una mutación en L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. Se prefieren las mutaciones S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236 (PVA236 significa que la secuencia de aminoácido ELLG (dada en el código de aminoácido de una letra) de la posición del aminoácido 233 a 236 de IgGl o EFLG de IgG4 se reemplaza por PVA) . Se prefieren especialmente las mutaciones S228P de IgG4, y L234A y L235A de IgGl. La parte Fe de un anticuerpo está involucrada directamente en ADCC (citotoxicidad mediada celular dependiente de anticuerpos) y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . La activación del complemento (CDC) se inicia por la unión del factor de complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de las subclases del anticuerpo de IgG. La unión de Clq a un anticuerpo es causada por las interacciones de proteína-proteína definidas en el llamado sitio de unión. Tales sitios de unión de la parte Fe son conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, por Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. , and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M . , et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; and EP 0 307 434. Tales sitios de unión de la parte de Fe, por ejemplo, se caracterizan porque los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de la subclase IgGl, IgG2 e IgG3 muestran usualmente la activación de complemento que incluye la unión de Clq y C3, mientras que IgG4 no activa el sistema de complemento y no une Clq y C3. Un anticuerpo anti-CCR5 que no une el receptor Fcy y/o el factor de complemento Clq no provoca una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . De preferencia, este anticuerpo se caracteriza porque enlaza CCR5, contiene una parte Fe derivada de origen humano y no une los receptores de Fcy y/o el factor de complemento Clq. Más preferentemente, este anticuerpo es un anticuerpo humano, o humanizado o agotado en el antígeno de células T. La unión de Clq puede medirse de acuerdo con Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. No se encuentra "unión de Clq" si en tal prueba la densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 492-405 nm es para el anticuerpo de prueba menor de 15% del valor para la unión de Clq humano de la parte Fe del anticuerpo de tipo silvestre no modificado a una concentración de anticuerpo de 8 pg/ml. ADCC puede medirse como la unión del anticuerpo a FcYRIIIa en células NK de humano a una concentración de anticuerpo de 20 yg/ml comparado con la unión del mismo anticuerpo como el IgGl humano (SEC ID NO: 26) . Un anticuerpo usado en un conjugado de acuerdo con la invención incluyen, además, tales anticuerpos que tienen "modificaciones de secuencia conservadora" (anticuerpos variantes), que son modificaciones de la secuencia de aminoácido que no afectan o alteran las características mencionadas anteriormente del anticuerpo de acuerdo con la invención. Las modificaciones pueden introducirse por las técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadores incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen los aminoácidos con las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) , y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-CCR5 humano puede reemplazarse de preferencia con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Por lo tanto, un anticuerpo anti-CCR5 "variante", se refiere en la presente a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácido de una secuencia de aminoácido del anticuerpo anti-CCR5 "padre" por hasta diez, de preferencia de aproximadamente dos a aproximadamente cinco, adiciones, eliminaciones y/o sustituciones en una o más de las regiones de dominio variable del anticuerpo padre fuera de la región CDR3 de la cadena pesada. Cada otra región de CDR de cadena pesada comprende como máximo una adición, eliminación y/o sustitución de aminoácido simple. La invención comprende un método para modificar la secuencia de aminoácido de un anticuerpo padre que une CCR5, caracterizado porque se selecciona un dominio variable de cadena pesada del grupo de los dominios variables de cadena pesada que consisten de la SEC ID N0:1, 3, 5, 7, 82, 83 y/o un dominio variable de cadena ligera del grupo de los dominios variables de cadena ligera que consisten de la SEC ID N0:2, 4, 6, 8, 76, 77 que proporcionan un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido de dominio variable, que modifica el ácido nucleico en que un ácido nucleico se modifica en CDR1 de cadena pesada, un aminoácido se modifica en CDR2 de cadena pesada, 1-3 aminoácidos se modifican en CDR1 de cadena ligera, 1-3 aminoácidos se modifican en CDR2 de cadena ligera y/o 1-3 aminoácidos se modifican en CDR3 de cadena ligera, expresando e incorporando la secuencia de aminoácido de dominio o dominios variables modificados en una estructura de anticuerpo, midiendo si el anticuerpo une a CCR5 y seleccionando el dominio (s) variable modificado/CDR ( s ) si el anticuerpo une a CCR5. De preferencia, tales modificaciones son modificaciones de secuencias conservadoras. Las modificaciones de la secuencia de aminoácido pueden realizarse por mutagénesis con base en el modelado molecular como se describe por Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327, y Queen, C, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033. El término "enlazador" o "enlazador peptidico" como se usa dentro de esta solicitud representa los enlazadores peptidicos de origen natural y/o sintético. Se elaboran de una cadena de aminoácido lineal, en donde los aminoácidos que se presentan naturalmente son los bloques de construcción monoméricos. La cadena tiene una longitud de 1 a 50 aminoácidos, se prefiere entre 1 y 28 aminoácidos, se prefiere especialmente entre 3 y 25 aminoácidos. El enlazador puede contener secuencias de aminoácido repetitivas o secuencias de polipéptidos que se presentan naturalmente, tales como los polipéptidos con una función de bisagra. El enlazador tiene la función de asegurar que un péptido conjugado a un anticuerpo anti-CCR5 pueda realizar su actividad biológica permitiendo que el péptido se pliegue correctamente y se presente apropiadamente. De preferencia, el enlazador es un "enlazador peptidico sintético" que se diseña para ser rico en residuos d glicina, glutamina y/o serina. Estos residuos se arreglan, por ejemplo, en pequeñas unidades repetitivas de hasta cinco aminoácidos, tales como GGGGS, QQQQG o SSSSG. Esta unidad repetitiva pequeña puede repetirse durante dos a cuatro veces para formar una unidad multimérica. En los extremos amino- y/o carboxi-terminales de la unidad multimérica pueden adicionarse hasta seis aminoácidos que se presentan naturalmente, arbitrarios, adicionales. Otros enlazadores peptidicos sintéticos están compuestos de un solo aminoácido, que se repite entre 10 a 20 veces, tales como, por ejemplo, serina en el enlazador SSSSSSSSSSSSSSS. En cada uno del extremo amino- y/o carboxi- terminal pueden estar presentes hasta seis aminoácidos que se presentan naturalmente, arbitrarios, adicionales. Los enlazadores preferidos se muestran en la Tabla 2. Se prefieren especialmente los enlazadores [GQ4]3GNN (SEC ID NO: 40), LSLSPGK (SEC ID NO: 36), LSPNRGEC (SEC ID NO: 37),· LSLSGG (SEC ID NO: 61), LSLSPGG (SEC ID NO: 62), G3[SG4]2SG (SEC ID NO: 69) . Todos los enlazadores peptidicos pueden codificarse por una molécula de ácido nucleico y, por lo tanto, pueden expresarse recombinantemente . Como los enlazadores son los péptidos mismos, el péptido antifusogénico se conecta al enlazador por medio de un enlace peptidico que se forma entre dos aminoácidos. El enlazador peptidico se introduce entre el péptido antifusogénico y la cadena del anticuerpo anti-CCR5 a la que el péptido antifusogénico va a conjugarse. Por lo tanto, dos o tres, respectivamente, secuencias posibles (en la dirección amino-a carboxi-terminal ) existen: a) péptido antifusogénico enlazador peptidico - cadena polipeptidica del anticuerpo anti-CCR5 o b) cadena polipeptidica del anticuerpo anti-CCR5 - enlazador peptidico - péptido antifusogénico o c) péptido antifusogénico - enlazador peptidico - cadena polipeptidica del anticuerpo anti-CCR5 - enlazador peptidico - péptido antifusogénico . En una modalidad de la invención, el conjugado mAb CCR5 se caracteriza porque comprende i) el dominio variable de la cadena pesada (VH) definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 1 y el dominio variable de la cadena ligera (VL) definido por la SEC ID NO: 2; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera definido por la SEC ID NO: 4; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera definido por la SEC ID NO: 6; o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera definido por la SEC ID NO: 8; ii) un enlazador seleccionado del grupo que consiste de los aminoácidos glicina (G) y asparagina (N) , el tripéptido GST, y la SEC ID NO: 36-62, y la SEC ID NO: 67-70; y iii) un péptido antifusogénico seleccionado del grupo que consiste de los péptidos definidos por la SEC ID NO: 29 a 35 ó 73. Un conjugado preferido de una cadena pesada y/o ligera de mAb CCR5 y un péptido (s) antifusogénico ( s ) ("conjugado de cadena") se selecciona del grupo que consiste de los conjugados (1) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m [cadena pesada], (2) [cadena pesada] - [enlazador]m [péptido antifusogénico] , (3) [péptido antifusogénico] [enlazador]m - [cadena pesada] - [péptido antifusogénico] , (4) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera], (5) [cadena ligera] - [enlazador]m - .[péptido antifusogénico] , (6) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m [cadena ligera] - [péptido antifusogénico] , (7) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] [enlazador]m - [péptido antifusogénico] , (8) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] [enlazador ] m - [péptido antifusogénico] , en donde el enlazador puede ser el mismo o diferente, ambo dentro y entre los conjugados de cadena, en donde m es un entero de 1 ó 0 y m puede ser independientemente el mismo o diferente, ambos dentro y entre tales conjugados. Por ejemplo, en un conjugado que comprende un conjugado de cadena (7) y una cadena ligera de mAb CCR5, los dos enlazadores en el conjugado de cadena (7) pueden ser los mismos, es decir, tienen la misma secuencia y longitud de aminoácidos, o pueden ser diferentes, es decir, tienen diferente secuencia y/o longitudes de aminoácidos, o uno o ambos pueden estar ausentes. Por ejemplo, en un conjugado que comprende los conjugados de cadena (2) y (4) el enlazador contenido en el conjugado de cadena (2) y el enlazador contenido en el conjugado de cadena (4) pueden ser los mismos, es decir, tienen la misma secuencia y longitud de aminoácido, o pueden ser diferentes, es decir, tienen diferente secuencia y/o longitud de aminoácidos, o uno o ambos pueden estar ausentes. En los conjugados de cadena el enlazador (es) pueden estar presentes (m = 1) o ausentes (m = 0) . Los conjugados preferidos de cadena son los conjugados de cadena (2), (3), (4) y (7). Una modalidad de la presente invención es un conjugado que comprende 2 x [cadena ligera de mAb CCR5] y conjugado de cadena 2 x (2) . Este conjugado comprende dos cadenas ligeras del anticuerpo anti-CCR5 no conjugadas y dos cadenas pesadas del anticuerpo anti-CCR5 conjugadas por medio del término C al término N de un péptido antifusogénico, opcionalmente con un enlazador intermedio. Otra modalidad de la presente invención es un conjugado que comprende dos cadenas ligeras de mAb CCR5 y dos conjugados de cadena (3) . Aún otra modalidad es un conjugado que comprende dos cadenas pesadas de mAb CCR5 y dos conjugados de cadena (4). Una modalidad adicional de la presente invención es un conjugado que comprende dos cadenas ligeras de mAb CCR5 y dos conjugados de cadena (7) . La cadena pesada y/o ligera comprende de preferencia una región constante (Fe) . La invención además proporciona un método para la manufactura de una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un conjugado de acuerdo con la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y el uso del conjugado de acuerdo con la invención para tal método. La invención además proporciona el uso de un conjugado de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva para la manufactura de un agente farmacéutico, de preferencia junto con una cantidad efectiva para la manufactura de un agente farmacéutico, de preferencia junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un paciente que sufre SIDA. El término "aminoácido" como se usa dentro de esta solicitud, representa el grupo de los -aminoácidos que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisteína (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I), leucina (leu, L) , lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptófano (trp, W) , tirosina (tyr, Y) y valina (val, V) . Los métodos y técnicas conocidos por un experimentado en la técnica, que son útiles para llevar a cabo la presente invención, se describen, por ejemplo, en Ausubel, F.M., ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . En los conjugados de acuerdo con la invención el aminoácido carboxi-terminal de una cadena de anticuerpo se conjuga por medio de un enlace peptídico al aminoácido amino terminal del péptido antifusogénico o el aminoácido carboxi terminal del péptido antifusogénico se conjuga por medio de un enlace peptidico al aminoácido amino terminal de una cadena de anticuerpo. En una modalidad, un enlazador intermediario está presente entre el péptido antifusogénico y la cadena de anticuerpo. De esta manera, el conjugado de acuerdo con la invención se caracteriza por la fórmula general : anticuerpo - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] n en donde m es independientemente para cada péptido antifusogénico ya sea 0 (es decir, un enlace peptidico directo entre el anticuerpo y el péptido antifusogénico) ó 1 (es decir, un enlazador está presente entre el anticuerpo y el péptido antifusogénico) y n es un entero de 1 a 8. En una modalidad n es un entero de 2 a 8. En otra modalidad n es un entero de 2 a 4. En otra modalidad n es un entero de 2 ó . Una modalidad de la invención comprende un conjugado caracterizado porque comprende un péptido antifusogénico en cada término C de las cadenas pesadas o en cada término N de las cadenas ligeras del anticuerpo. En esta modalidad dos péptidos antifusogénicos se conjugan a un anticuerpo. En otra modalidad, el conjugado se caracteriza porque comprende un péptido antifusogénico en cada término C de las cadenas pesadas y en cada término N de las cadenas ligeras. En esta modalidad se conjugan cuatro péptidos antifusogénicos a un anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es mAb CCR5 o mAb CD4.
El péptido antifusogénico que se introduce en un término de una cadena pesada y/o ligera (s) de mAb CCR5 es de tamaño pequeño comparado con mAb CCR5. Por ejemplo, las inmunoglobulinas más pequeñas, inmunoglobulinas de la clase G, tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kDa; un péptido antifusogénico tiene de preferencia un tamaño (peso molecular) menor de 12.5 kDa, que es equivalente a aproximadamente 100 aminoácidos, en general menor de 7.5 kDa, que es equivalente a aproximadamente 60 aminoácidos. El péptido antifusogénico tiene una secuencia de aminoácido de 5 a 100 residuos de aminoácidos, de preferencia de 10 a 75 residuos de aminoácidos, más preferentemente de 15 a 50 residuos de aminoácidos. Los conjugados de la presente invención son útiles para las aplicaciones farmacéuticas, terapéuticas o de diagnóstico. El número de péptidos antifusogénicos, que puede conjugarse a la cadena (s) ' pesada (s) y/o ligera (s) de mAb CCR5, es de uno al número combinado de términos amino- y carboxi de las cadenas polipeptidicas del anticuerpo anti-CCR5. Ya que la presente invención abarcar diferentes anticuerpos anti-CCR5 el número de péptidos antifusogénicos puede variar. En el caso de un anticuerpo anti-CCR5 que comprende dos cadenas pesadas y ligeras, el número combinado de término amino (términos N) y términos carboxi (términos C) es ocho, que es al mismo tiempo el número total máximo de péptidos antifusogénicos conjugados; en el caso, por ejemplo, de un fragmento de anticuerpo anti-CCR5 tal como un anticuerpo de cadena simple (scFv) el número combinado de términos y, por lo tanto, el número máximo de péptidos antifusogénicos capaces de conjugarse es de dos. Si un péptido antifusogénico simple se conjuga a mAb CCR5, el péptido puede ocupar cualquiera de los términos de las cadenas del anticuerpo anti-CCR5. Asimismo, si el número máximo posible de péptidos se conjuga a mAb CCR5, todos los términos se ocupan por un péptido simple. Si el número de péptidos, que se conjugan a mAb CCR5, es menor que el número máximo posible, son posibles las diferentes contribuciones de los péptidos en los términos de las cadenas del anticuerpo anti-CCR5. Por ejemplo, si se conjugan cuatro péptidos a una inmunoglobulina de la clase G o E, son posibles cinco diferentes combinaciones (ver la Tabla 1) . En dos combinaciones todos los términos de un tipo, es decir, los cuatro términos amino o los cuatro términos carboxi de las cadenas del anticuerpo anti-CCR5, se conjugan cada uno a un sólo péptido antifusogénico . Los otros términos no se conjugan. Esto resulta, en una modalidad, en una asignación de las modificaciones/conjugaciones en un área del anticuerpo anti-CCR5. En otros casos, los polipéptidos se conjugan a un número de ambos términos. Dentro de estas combinaciones los péptidos conjugados se asignan a diferentes áreas del anticuerpo anti-CCR5. En cualquier caso la suma de los términos conjugados es cuatro.
Tabla 1: Posible combinación para la conjugación de cuatro péptidos a los términos de un anticuerpo anti-CCR5 compuesto de cuatro cadenas polipeptidicas .
La presente invención comprende de preferencia conjugados en los que por lo menos dos de los términos se conjugan a un péptido antifusogénico . Las secuencias de aminoácido de los péptidos antifusogénicos pueden ser diferentes, similares o idénticas. En una modalidad, la identidad de la secuencia de aminoácido está en el intervalo de 90% a menos de 100%; estas secuencias de aminoácidos y los péptidos correspondientes se definen como similares. En una modalidad preferida los péptidos antifusogénicos son idénticos, es decir, tienen una identidad de aminoácidos de 100%. La presente invención comprende un conjugado que comprende uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo anti-CCR5 (mAb CCR5) en donde uno a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo anti-CCR5 por medio de un enlace peptidico. En una modalidad, el conjugado de acuerdo con la invención comprende por lo menos dos péptidos antifusogénicos y un anticuerpo anti-CCR5 en donde dos a ocho péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesadas y/o ligeras de tal anticuerpo anti-CCR5. En una modalidad, el conjugado de acuerdo con la invención se caracteriza i) porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, dos conjugados de cadena de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 1, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, ii) porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 4, dos conjugados de cadena de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 3, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, iii) porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, dos conjugados de cadena de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 5, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, o iv) porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 8, dos conjugados de cadena de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 7, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33. La conjugación entre el péptido antifusogénico y el anticuerpo anti-CCR5 se realiza a nivel del ácido nucleico. Por lo tanto, un enlace peptidico se forma entre el péptido antifusogénico y la cadena e anticuerpo anti-CCR5 con o sin un enlazador intermediario. De esta manera, cualquier aminoácido carboxi terminal del péptido antifusogénico se conjuga con el aminoácido amino terminal de una cadena de un anticuerpo anti-CCR5 con o sin un enlazador intermediario, o un aminoácido carboxi terminal de la cadena del' anticuerpo anti-CCR5 se conjuga al aminoácido amino terminal del péptido antifusogénico con o sin un enlazador intermediario o ambos términos de la cadena del anticuerpo anti-CCR5 se conjugan a un péptido antifusogénico cada uno con o sin un enlazador intermediario. Para la producción recombinante del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 de acuerdo con la invención, se requiere una o más moléculas de ácido nucleico que codifican diferentes polipéptidos , de preferencia se emplean dos a ocho moléculas de ácido nucleico.. Estas moléculas de ácido nucleico codifican las diferentes cadenas del anticuerpo anti-CCR5 del conjugado y se hace referencia en lo siguiente como genes estructurales. Se localizan en el mismo plásmido de expresión (vector) o pueden localizarse alternativamente en diferentes plásmidos de expresión (vectores) . El montaje del conjugado se lleva a cabo de preferencia antes de la secreción del conjugado y, de esta manera, dentro de las células de expresión. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas polipeptidicas del conjugado se expresan de preferencia en la misma célula hospedera. Si después de la expresión recombinante se obtiene una mezcla de conjugados, los conjugados pueden separarse y purificarse por los métodos conocidos por una persona experimentada en la técnica. Estos métodos están bien establecidos y se usan ampliamente para la purificación de inmunoglobulina y se emplean ya sea solos o en combinación. Tales métodos son, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando proteínas derivadas microbianas (por ejemplo, cromatografía de afinidad de la proteína A o la proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio catiónico (resinas de carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de amino etilo) y cromatografía de intercambio de modo mezclado) , adsorción tiofílica (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos de SH) , cromatografía de adsorción aromática o de interacción hidrofóbica (por ejemplo, con fenil-sefarosa, resinas aza- arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo, con un material de Ni (II) y Cu(II)), cromatografía de exclusión de tamaño y los métodos electroforéticos preparativos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, .A., Appl . Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Con los métodos de la ingeniería recombinante conocidos por un experimentado en la técnica, los conjugados pueden diseñarse a nivel del ácido nucleico/gen. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las inmunoglobulinas son conocidas y pueden obtenerse, por ejemplo, de las bases de datos genómicas. Asimismo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los péptidos antifusogénicos son conocidas o pueden deducirse fácilmente de su secuencia de aminoácido. Los elementos requeridos para la construcción de un plásmido de expresión para la expresión del conjugado de la presente invención son, por ejemplo, un cásete de expresión para la cadena ligera del anticuerpo anti-CCR5 en su versión natural y/o modificada y/o conjugada, un cásete de expresión para la cadena pesada del anticuerpo anti-CCR5 en su versión natural y/o modificada y/o conjugada (alternativamente, la cadena ligera del anticuerpo anti-CCR5 y la cadena pesada del anticuerpo anti-CCR5 pueden estar contenidas en el mismo cásete de expresión, por ejemplo, como un elemento de expresión bicistrónico) , un marcador de selección y una réplica de E. coli asi como la unidad de selección. Estos cásete de expresión comprenden un promotor, un segmento de ADN que codifica una secuencia de señal de secreción, el gen estructural y una señal de terminador/poliadenilación . Los elementos se montan en una forma unida operativamente ya sea en un plásmido que codifica todas las cadenas del conjugado, o en dos o más plásmidos que codifican cada uno una o más cadenas del conjugado. Para la expresión de los polipéptidos codificados el o los plásmidos se introducen en una célula hospedera apropiada. Las proteínas se producen de preferencia en células de mamíferos, tales como células CHO, células NSO, células Sp2/0, células COS, células HEK, células K562, cells BHK, cells PER.C6® y similares. Los elementos reguladores del plásmido tienen que seleccionarse de tal manera que sean funcionales en la célula hospedera seleccionada. Para la expresión de la célula hospedera que contiene el plásmido que codifica una o más cadenas del conjugado se cultiva bajo condiciones apropiadas para la expresión de las cadenas. Las cadenas conjugadas expresadas se montan funcionalmente . El conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 completamente procesado se secreta en el medio. Un "plásmido de expresión" es un ácido nucleico que codifica un polipéptido que va a expresarse en una célula hospedera. Típicamente, un plásmido de expresión comprende una unidad de propagación de plásmido procariota, por ejemplo, para E. coli, que comprende un origen de replicación y un gen de resistencia, un marcador de selección eucariota y uno o más casetes de expresión para la expresión del gen o los genes estructurales de interés, que comprende un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción que incluye una señal .de poliadenilación . La expresión del gen se coloca usualmente bajo el control de un promotor, y tal gen estructural se dice que se "enlaza operablemente" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor central se enlazan operablemente si el elemento regulador modula la actividad del promotor central. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un método para la producción de un conjugado de acuerdo con la invención, que comprende las siguientes etapas: a) cultivar una célula que contiene uno o más plásmidos de expresión que comprende cada uno una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un conjugado de acuerdo con la invención bajo condiciones apropiadas para la expresión del conjugado, b) recuperar el conjugado de la célula o sobrenadante. El término "bajo condiciones apropiadas para la expresión del conjugado" representa las condiciones que se usan para el cultivo de una célula que expresa un polipéptido y que se conocen o que pueden determinarse fácilmente por un experimentado en la técnica. Es conocido por un experimentado en la técnica que estas condiciones pueden variar dependiendo del tipo de célula cultivada y el tipo de polipéptido expresado. En general, la célula se cultiva a una temperatura, por ejemplo, entre 20°C y 40°C y durante un periodo suficiente para permitir la producción efectiva del polipéptido conjugado, por ejemplo durante 4 a 28 días. Como se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción/resorción y similares, que son fisiológicamente compatibles. De preferencia, el vehículo es apropiado para la inyección o infusión. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Además de agua, el vehículo puede ser, por ejemplo, una solución salina amortiguada isotónica. Sin considerar la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma* hidratada apropiada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en las formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por los métodos convencionales conocidos por los experimentados en la técnica . Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo, que es efectiva para obtener la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que es empleado, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que es tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. La invención comprende de preferencia el uso de un conjugado de acuerdo con la invención para el tratamiento de un paciente que sufre de los síndromes de inmunodeficiencia tal como SIDA. Los siguientes ejemplos, listado de secuencia, figuras y depósitos se proporciona para ayudar al entendimiento de la presente invención, el alcance real de los cuales se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que las modificaciones pueden hacerse en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención.
Deposición del anticuerpo anti-CCR5 Las líneas celulares del hibridoma preferido que expresan mAb CCR5 útiles en los conjugados de acuerdo con la invención se depositaron con Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania.
Nomenclatura de anticuerpos <CCR5>Pz01.F3: Anticuerpo A SEC ID NO: 1, 2 <CCR5>Pz02.1C11 : Anticuerpo B SEC ID NO: 3, 4 <CCR5>Pz03.1C5 : Anticuerpo C SEC ID NO: 5, 6 <CCR5>F3.1H12.2E5: Anticuerpo D SEC ID NO: 7, 8 <CCR5>Pz04.1F6 : Anticuerpo E Los dominios variables 1 de mAb CD4 se reportan en la SEC ID NO: 10, 15, 45 y 56 de US 5,871,732. Los dominios variables 2 y 4 de mAb CD4 se reportan en Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943. Los dominios variables 3 de mAb CD4 se reportan en las Figuras 3, 4, 12 y 13 de WO 91/009966.
Secuencias de anticuerpos, secuencias de péptidos antifusogénicos y secuencias de enlazadores peptidicos SEC ID NO: 1 <CCR5>Pz01. F3 cadena pesada, dominio variable SEC ID NO: 2 <CCR5 > P z 01. F3 cadena ligera, dominio variable SEC ID NO: 3 <CCR5 > P z 02.1 C 11 cadena pesada, dominio variable SEC ID NO: 4 <CCR5>Pz02.1C11 cadena ligera, dominio variable SEC ID NO: 5 <CCR5>Pz03.1C5 cadena pesada, dominio variable SEC ID NO: 6 <CCR5>Pz03.1C5 cadena ligera, dominio variable SEC ID NO: 7 <CCR5>F3.1H12.2E5 cadena pesada, dominio variable SEC ID NO: 8 <CCR5>F3.1H12.2E5 cadena ligera, dominio variable SEC ID NO: 9 CDRl mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 10 CDRl mAb CCR5 de cadena pesada SEC. ID NO: 11 CDRl mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 12 CDRl mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 13 CDR2 mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 14 CDR2 mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 15 CDR2 mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 16 CDR3 mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 17 CDR3 mAb CCR5 de cadena pesada SEC ID NO: 18 CDR1 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 19 CDR1 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 20 CDR1 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 21 CDR2 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 22 CDR2 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 23 CDR2 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 24 CDR3 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 25 CDR3 mAb CCR5 de cadena ligera SEC ID NO: 26 Región constante de cadena pesada Yl SEC ID NO: 27 Región constante de cadena pesada Y4 SEC ID NO: 28 dominio constante de cadena ligera . K SEC ID NO: 29 C34 SEC ID NO: 30 T20 SEC ID NO: 31 T1249 SEC ID NO: 32 T651 SEC ID NO: 33 T2635 SEC ID NO: 34 N36 SEC ID NO: 35 DP107 SEC ID NO: 36--62, 67-70 péptidos enlazadores SEC ID NO: 63 Secuencia de aminoácido de cadena ligera ? de mAb CCR5 maduro SEC ID NO: 64 Secuencia de aminoácido de cadena pesada ?? de mAb CCR5 maduro SEC ID NO: 65 Secuencia de aminoácido de cadena pesada del conjugado mAb CCR5 SEC ID NO: 66 VIH-1 gp41 SEC ID NO: 71 Secuencia de aminoácido de cadena ligera ? de mAb CD4 maduro SEC ID NO: 72 Secuencia de aminoácido de cadena pesada ?? de mAb CD4 maduro SEC ID NO: 74 Secuencia de aminoácido de cadena pesada del conjugado mAb CD4 maduro SEC ID NO: 75 Dominio variable de cadena pesada de murino 1 de mAb CD4 SEC ID NO: 76 Dominio variable de cadena ligera quimérica 1 de mAb CD4 SEC ID NO: 77 cadena ligera quimérica 1 de mAb CD4 SEC ID NO: 78 dominio variable de cadena ligera quimérica 2 de mAb CD4 SEC ID NO: 79 dominio variable de cadena ligera quimérica 3 de mAb CD4 SEC ID NO: 80 dominio variable de cadena ligera quimérica 4 de mAb CD4 SEC ID NO: 81 dominio variable de cadena pesada 1 de mAb CD4 SEC ID NO: 82 dominio variable de cadena pesada quimérica 1 de mAb CD4 SEC ID NO: 83 cadena pesada quimérica 1 de mAb CD4 SEC ID NO: 84 dominio variable de cadena pesada quimérica 2 de mAb CD4 SEC ID NO: 85 dominio variable de cadena pesada quimérica 3 de mAb CD4 SEC ID NO: 86 dominio variable de cadena pesada quimérica 4 de mAb CD4 SEC ID NO: 87 CDRl mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 88 CDRl mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 89 CDRl mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 90 CDRl mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 91 CDR2 mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 92 CDR2 mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 93 CDR2 mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 94 CDR3 mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 95 CDR3 mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 96 CDR3 mAb CD4 de cadena ligera SEC ID NO: 97 CDRl mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 98 CDRl mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 99 CDRl mAb CD4 de cadena pesada SEQ ID NO: 100 CDR2 mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 101 CDR2 mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 102 CDR2 mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 103 CDR3 mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 104 CDR3 mAb CD4 de cadena pesada SEC ID NO: 105 CDR3 mAb CD4 de cadena pesada Tabla 2: Enlazador No. Péptidos enlazadores SEC ID NO: 1 LSLSPGK 36 2 LSPNRGEC 37 3 [GQ4]3 38 4 [GQ4]3G 39 [GQ4]3GNN 40 6 GGG [SG4] SGG 41 7 GGG[SG4]2SGN 42 8 [SG4]3 43 9 [SG4]3G 44 G[SG4]3T 45 11 [SG4]3GG 46 12 [SG4] 3GGT 47 13 [SG4] 3GGN 48 14 [SG4]3GAS 49 [SG4]5 50 16 [SG4]5G 51 17 [SG4]5GG 52 18 [SG4] 5GAS 53 19 G(S)15G 54 G(S)i5GAS 55 21 G — No. Péptidos enlazadores SEC ID NO: 22 N — 23 GST — 24 [ (G)4S]3GAS 56 25 [ (G)4S]3G 57 26 [ (G)4S]5G 58 27 [ (G)4S]3GG 59 28 [ (G)4S]5GG 60 29 LSLSGG 61 30 LSLSPGG 62 31 [G3S]5 67 32 [G4S] 5GGG 68 33 G3[SG4]2SG 69 34 G3[SG4]2SG2 70 EJEMPLOS Materiales y Métodos La información general con respecto a las secuencias nucleotídicas de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas se proporciona en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se numeran de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. , Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D, (1991) ) .
Técnicas de ADN recombinante : Se usaron los métodos estándares para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Síntesis génica: Los segmentos del gen deseados se prepararon de los oligonucleótidos elaborados por la síntesis química. Los segmentos del gen de 100-600 pb, que se flanquean por los sitios de división de endonucleasa de restricción singular, se montaron por recocido y ligación de los oligonucleótidos que incluyen la amplificación por PCR y subsecuentemente se clonaron en el vector de clonación pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., USA) por medio de salientes A. La secuencia de ADN de los fragmentos del gen subclonado se confirmaron por secuenciación del ADN.
Determinación proteinica : La concentración proteinica del conjugado se determinó valorando la densidad óptica (OD) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado sobre la base de la secuencia de aminoácido.
Ejemplo 1 Elaboración de los plásmidos de expresión del anticuerpo anti-CCR5 Los segmentos del gen que codifican un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CCR5 (VL) y el dominio constante de cadena ligera kappa de humano (CL) se unieron como los segmentos del gen para el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CCR5 (VH) y los dominios constantes de cadena pesada ?? de humano (CHl-bisagra-CH2-CH3) . En el caso de mAb CCR5 de la SEC ID NO: 63/64, los dominios variables de cadena pesada y ligera se derivan de un anticuerpo de ratón y los dominios constantes de cadena pesada y ligera se derivan de un anticuerpo humano (C-kappa e IgGl) . Subsecuentemente, el segmento del gen que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-CCR5 completa se unió al término N- y/o C- con un ácido nucleico que codifica un péptido antifusogénico que incluye un enlazador de conexión y/o el segmento del gen que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-CCR5 se unió al término N- y/o C con un ácido nucleico que codifica un péptido antifusogénico que incluye una secuencia del enlazador de conexión. a) Vector 4900 El vector 4900 es un plásmido de expresión para la expresión transiente de una cadena ligera de mAb CCR5 (cásete de expresión genómicamente organizado; organización exón-intrón) en las células HEK293. Además del cásete de expresión de cadena ligera mAb CCR5 K este vector contiene: - un gen de resistencia a higromicina como un marcador seleccionado, - un origen de replicación, oriP, del virus Epstein-Barr (EBV) , - un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y un gen de ß-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. La unidad de transcripción del gen de cadena ligera ? de mAb CCR5 está compuesta de los siguientes elementos: el mejorador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, - una región 5' no traducida sintética, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino que incluye un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [Ll-intrón-L2] ) , - la cadena ligera variable madura del anticuerpo anti-CCR5 de murino que codifica un segmento arreglado con un sitio de restricción Bsml único en el extremo 5' (secuencia de señal L2) y un sitio donante de unión y un sitio de restricción Notl único en el extremo 3' y un intrón 2 del híbrido de cadena ligera ? de humano/ratón, - el dominio constante del gen de cadena ligera ? de humano, la secuencia de señal de poliadenilación ? de inmunoglobulina de humano ("poli A"), y - los sitios de restricción únicos AscI y Fsel en el extremo 5'- y 3'-, respectivamente. El mapa del plásmido del vector de expresión 4900 de la cadena ligera de mAb CCR5 se muestra en la Figura 1. La secuencia de aminoácido de la cadena ligera ? de mAb CCR5 madura (sin la secuencia de señal) se muestra en la SEC ID NO: 63. b) Vector 4991 El vector 4991 es un plásmido de expresión para la expresión transiente de una cadena pesada ?? de mAb CCR5 (cásete de expresión genómicamente organizado; organización exón-intrón) en células HEK293. Además del cásete de expresión de cadena pesada ?? de mAb CCR5 este vector contiene: - un gen de resistencia a higromicina como un marcador seleccionado, - un origen de replicacion, oriP, del virus Epstein-Barr (EBV) , - un origen de replicacion' del vector pUC18 que permite la replicacion de este plásmido en E. coli, y - un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a amplicilina en E. coli. La unidad de transcripción de la cadena pesada ?? de mAb CCR5 está compuesta de los siguientes elementos: el mejorador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, - una región 5' no traducida sintética, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino que incluye' un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [Ll-intrón-L2] ) , la cadena pesada ? variable madura del anticuerpo anti-CCR5 de murino que codifica el segmento arreglado con un sitio de restricción Bsml único en el extremo 5' (secuencia de señal L2) y un sitio donante de unión y un sitio de restricción Notl único en el extremo 3' y un intrón 2 del híbrido de cadena pesada ? de humano/ratón, que incluye el elemento mej orador de cadena pesada de. ratón (parte JH3, JH4) (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), - los dominios constantes del gen pesado ?? de humano genómicos , - la secuencia de señal ("poli A") de poliadenilación de inmunoglobulina ?? de humano, y los sitios de restricción únicos AscI y SgrAI en el extremo 5' y 3' , respectivamente. El mapa del plásmido del vector 4901 de expresión de cadena pesada ?? de mAb CCR5 se muestra en la Figura 2. La secuencia de aminoácido de la cadena pesada ?? de mAb CCR5 madura (sin la secuencia de señal) se muestra en la SEC ID NO: 64. c) Vector 4995 El vector 4995 es un plásmido de expresión para la expresión transiente de un conjugado de cadena pesada ?? del anticuerpo anti-CCR5 (cásete de expresión genómicamente organizado; organización exón-intrón) en células HEK293. El vector 4995 se deriva del plásmido 4991 en la manera en que la cadena pesada ?? de mAb CCR5 se une en el término C con un ácido nucleico que codifica el péptido antifusogénico T-2635 (SEC ID NO: 33) y la secuencia del enlazador peptidico [GQ4]3GNN (SEC ID NO: 40).
Además del cásete de expresión del conjugado de cadena pesada ?? del anticuerpo anti-CCR5 del péptido quimérico, este vector contiene: - un gen de resistencia a higromicina como un marcador seleccionado, - un origen de replicacion, oriP, del virus Epstein-Barr (EBV) , - un origen de replicacion del vector pUC18 que permite la replicacion de este plásmido en E. coli, y - un gen de ß-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. La unidad de transcripción del conjugado de cadena pesada ?? del anticuerpo anti-CCR5 quimérico está compuesta de los siguientes elementos: - el mejorador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, - una región 5' no traducida sintética, una secuencia de señal de cadena pesada ' de inmunoglobulina de murino que incluye un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [Ll-intrón-L2 ] ) , - la cadena pesada variable madura del anticuerpo anti-CCR5 de murino que codifica el segmento arreglado con un sitio de restricción Bsml único en el extremo 5' (secuencia de señal L2 ) y un sitio donante de unión y un sitio de restricción Notl único en el extremo 3' , un intrón 2 del híbrido de cadena pesada de humano/ratón, que incluye el elemento mej orador de cadena pesada de ratón (parte JH3, JH4) (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), - los dominios constantes del gen pesado ?? de humano genómicos, - el péptido antifusogénico T-2635, - la secuencia del enlazador peptídico [GQ4]3GNN, - la secuencia de señal de poliadenilación de inmunoglobulina ?? de humano ("poli A") , y - los sitios de restricción únicos AscI y SgrAI en el extremo 5' y 3' , respectivamente. El mapa del plásmido del vector 4995 de expresión conjugado de cadena pesada ?? de mAb CCR5 se muestra en la Figura 3. La secuencia de aminoácido de la cadena pesada del conjugado maduro (sin secuencia de señal) se muestra en la SEC ID NO: 65.
Ejemplo 2 Elaboración de los plásmidos de expresión del anticuerpo anti-CCR5 finales Los genes de fusión (genes de fusión del anticuerpo de cadena pesada y/o ligera) que comprenden un segmento del gen mAb CCR5, un segmento del gen enlazador opcional y un segmento del gen del péptido antifusogénico se han montado con los métodos y las técnicas recombinantes conocidos mediante la conexión de los segmentos de ácido nucleico correspondientes. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los enlazadores peptidicos y los polipéptidos antifusogénicos se sintetizaron cada uno por la síntesis química y después se ligaron en un plásmido de E. coli para la amplificación. Las secuencias del ácido nucleico subclonado se verificaron por secuenciación de ADN.
Ejemplo 3 Expresión transiente de inmunoglobulinas y variantes de inmunoglobulinas en las células HEK293 EBNA Los anticuerpos anti-CCR5 recombinantes y las variantes del anticuerpo anti-CCR5 se generaron por transfección transiente de células HEK293 EBNA (línea celular de riñon embriónico de humano 293 que expresa el antígeno nuclear el virus de Epstein-Barr ; colección de cultivo de tipo Americano depósito número ATCC # CRL-10852) cultivada en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco, Gibco) suplementado con 10% de IgG FCS ultra bajo (suero de carnero fetal, Gibco) , Glutamina 2 mM (Gibco) , aminoácidos no esenciales al 1% volumen por volumen (v/v) (Gibco) y 250 g/ml de G418 (Roche Molecular Biochemicals) . Para la transfección se usó FuGENE™ 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Biochemicals) en una relación de reactivo (µ?) a ADN (µg) que oscila de 3:1 a 6:1. Las cadenas ligera y pesada que incluyen las cadenas pesada y ligera del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 se expresaron de dos diferentes plásmidos usando una relación molar de cadena ligera a cadena pesada que codifica el plásmido que oscila de 1:2 a 2:1, respectivamente. Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 que contienen los sobrenadantes del cultivo celular se cosecharon en el día 4 a 11 después de la transíección . La información general con respecto a la expresión recombinante de las inmunoglobulinas de humano en, por ejemplo, células HEK293 se da en: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.
Ejemplo 4 Análisis de expresión usando SDS PAGE, transferencia y detección de Western blotting con conjugados del anticuerpo especifico de inmunoglobulina Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 expresados y secretados se procesaron por electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE) , y las cadenas del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 se transfirieron a una membrana del gel y se detectaron subsecuentemente por un método inmunológico .
SDS-PA6E: El amortiguador de muestra, concentrado cuatro veces (4x) : 4 g de glicerol, 0.682 g de base TRIS, 0.666 g de clorhidrato de TRIS, 0.8 g de LDS (dodecil sulfato de sodio), 0.006 g de EDTA (ácido tetra etilendiamina) , 0.75 mi de una solución al 1% en peso (p/p) de Serva Blue G250 en agua, 0.75 mi de una solución al 1% en peso (p/p) de rojo de fenol, adicionar agua para hacer un volumen total de 10 mi. El caldo de cultivo que contiene el conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 secretado se centrifugó para remover las células y los residuos celulares. Una alícuota del sobrenadante clarificado se mezcló con 1/4 volúmenes (v/v) del amortiguador de muestra 4xLDS y 1/10 volumen (v/v) de 1 , 4-ditiotreitol (DTT.) 0.5 M . Luego, las muestras se incubaron durante 10 minutos a 70°C y la proteína se separó por SDS-PAGE. El sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usó 10% de los geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6.4) y un amortiguador de corrida NuPAGE® MOPS.
Western blot: Amortiguador de transferencia: glicina 39 mM, clorhidrato de TRIS 48 mM, 0.04% en peso (p/p) de SDS y 20% en volumen de metanol (v/v) .
Después de SDS-PAGE, las cadenas del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 separadas se transfirieron electroforéticamente a una membrana de filtro de nitrocelulosa (tamaño de poro: 0.45 µp?) de acuerdo con "Semidry-Blotting-Method" de Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).
Detección inmunológica : Amortiguador TBS: Clorhidrato de TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 7.5 Solución de bloqueo: 1% (p/v) de Western Blocking Reactive (Roche Molecular Biochemicals ) en amortiguador TBS Amortiguador TBST: Amortiguador TBS lx con 0.05% en volumen (v/v) de Tween-20. Para la detección inmunológica las membranas de western blotting se incubaron con agitación a temperatura ambiente dos veces durante 5 minutos en amortiguador TBS y una vez durante 90 minutos en solución de bloqueo.
Detección de las cadenas del conjugado de inmunoglobulina peptidico : Cadena pesada: Para la detección de la cadena pesada del conjugado de péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5, se usó un anticuerpo de IgG anti-humano de conejo purificado a una peroxidasa (DAKO, Código No. P 0214) .
Cadena ligera: La cadena ligera del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 se detectó con un anticuerpo de cadena ligera kappa anti-humano de conejo conjugado con peroxidasa purificada (DAKO, Código No. P 0129) . Para la visualización de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, las membranas Western blot lavadas y bloqueadas se incubaron primero en el caso de una cadena pesada con un anticuerpo IgG anti-humano de conejo conjugado a una peroxidasa o en el caso de una cadena ligera con un anticuerpo de cadena ligera kappa anti-humano de conejo conjugado de peroxidasa purificada en una dilución 1:10,000 en 10 mi de solución de bloqueo a 4°C con agitación durante la noche. Después de lavar las membranas tres veces con el amortiguador TBTS y una vez con el amortiguador TBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, las membranas Western-blot se revelaron con un solución de Luminol/peróxido que genera quimioluminiscencia (Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals ) . Por lo tanto, las membranas se incubaron en 10 mL de solución de Luminol/peróxido durante 10 segundos a 5 minutos y la luz emitida se detectó después . de esto con un Analizador LUMI-Imager Fl (Roche Molecular Biochemicals) y/o se registró con una película de rayos X. La intensidad de las manchas se cuantificó con los elementos de programación LumiAnalyst (Versión 3.1).
Teñido múltiple de las inmunomanchas : El conjugado del anticuerpo marcado con peroxidasa secundario usado para la detección puede removerse de la mancha teñida incubando la membrana durante una hora a 70 °C en el amortiguador de clorhidrato de TRIS 1 M (pH 6.7) que contiene beta-mercaptoetanol 100 mM y 20% (p/v) de SDS. Después de este tratamiento, la mancha puede teñirse con un anticuerpo secundario diferente una segunda vez. Antes de la segunda detección, la mancha se lava tres veces a temperatura ambiente con agitación en el Amortiguador TBS durante 10 minutos cada una.
Ejemplo 5 Purificación de afinidad, diálisis y concentración de los conjugados del inmunoglobulina peptidicos Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 expresados y secretados se purificaron por cromatografía de afinidad usando Protein A-Sepharose™ CL-4B (GE Healthcare anteriormente Amersham Bioscience, Suecia) de acuerdo con los métodos conocidos. En forma breve, después de la centrifugación (10 , 000 g durante 10 minutos) y la filtración a través de un filtro de 0.45 µp?, el conjugado de inmunoglobul ina peptidico que contiene los sobrenadantes del cultivo clarificado se aplicaron en una columna de Protein A-Sepharose™ CL-4B equilibrada con el amortiguador PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2.7 mM , pH 7.4) . Las proteínas no unidas se lavaron con el amortiguador de equilibrio PBS y amortiguador de citrato 0.1 M, pH 5.5. Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 se eluyeron con amortiguador de citrato 0.1 M, pH 3.0, y el conjugado que contiene las fracciones se neutralizó con base TRIS 1 M. Luego, los conjugados del péptido ant i f us ogéni coanticuerpo anti-CCR5 se dializaron extensivamente contra el amortiguador PBS a 4°C, se concentraron con una unidad de filtrado centrífuga ültrafree®-CL equipada con una membrana Biomax-SK (Millipore Corp., USA) y se almacenaron en un baño de hielo-agua a 0°C. La integridad de los conjugados se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor y por teñido con azul brillante Coomassie como se describió en el Ejemplo 4. la agregación de los conjugados del péptido ant ifusogénico-ant icuerpo anti-CCR5 se analizó por cromatografía de exclusión de tamaño analítica.
Ejemplo 6 Desglucosilación de los conjugados de inmunoglobulina peptidicos Los carbohidratos enlazados a N de los anticuerpos anti-CCR5 y los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 se dividieron por tratamiento enzimático con Pept ide-N-Glycosidase F (PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals , Mannheim, Alemania o Prozyme, San Leandro, CA) . Por lo tanto, los anticuerpos anti-CCR5 y los conjugados del péptido antif usogénico-anticuerpo anti-CCR5 se incubaron a 37 °C durante 12-24 h usando 50 mU de PNGaseF' por mg de proteina N-glucosilada en el amortiguador PBS a una concentración proteinica de aproximadamente 2 mg/ml. Posteriormente, el Pept ide -N -Gl yco s ida s e F se separó por filtración en gel preparativa de acuerdo con los métodos conocidos. En forma breve, los anticuerpos anti-CCR5 tratados con PNGaseF y los conjugados del péptido ant i fu s ogén i co - ant i cue rpo anti-CCR5 se aplicaron en una columna Superóse™ 12 10/300 GL (GE Healthcare anteriormente Amersham Bioscience, Suecia) equilibrada con amortiguador PBS (Na2HP04 10 mM , KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2.7 mM, pH 7.4) y luego se eluyeron con el amortiguador de equilibrio a una velocidad de fl.ujo de 0.5-1.0 ml/min usando el sistema de cromatografía explorador Akta de Amersham Bioscience (GE Healthcare anteriormente Amersham Bioscience, Suecia) .
Ejemplo 7 Prueba de actividad antiviral de ciclo simple Para la producción de los virus NL-Bal pseudoclasificados, el plásmido pNL4-3Aenv (construcción genómica pNL4-3 de VIH con una eliminación dentro del gen env) y pCDNA3.1 /NL-BAL env [plásmido pcDNA3.1 que contiene el gen NL-Bal env (obtenido de NIBSC Centralized Facility for AIDS Reagents) ] se co - t r an s fe c t a ron en la línea celular HEK 293FT ( Invit rogen ) , cultivada en medio mínimo modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero de carnero fetal (FCS) , 100 U/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM y 0.5 mg/mL de geniticina (todos los medios de Invitrogen/Gibco) . Los sobrenadantes que contienen los virus pseudoclasificados se cosecharon dos días después de la transfección, y el residuo celular se removió por filtración a través de un filtro de PES ( pol ié t er sul f ona ) de 0.45 µp? de tamaño de poro (Nalgene) y se almacenaron a -80°C en alícuotas. Para la normalización en el desempeño de la prueba, las alícuotas patrón del virus se usaron para infectar células JC53-BL (US NIH Aids Reagent Program) para producir aproximadamente 1.5 x 105 RLU (unidades de luz relativa) por pozo. Los conjugados de prueba del péptido ant i fu s ogéni co - ant i cue rpo anti-CCR5, los anticuerpos de referencia y los péptidos antifusogénicos de referencia (T-20, T-1249, T-651 y T-2635) se diluyeron serialmente en placas de 96 pozos. La prueba se llevó a cabo en cuadruplicados. Cada placa contuv.o los pozos de control celular y el control de virus. El equivalente de 1.5 x 105 RLU de los patrones del virus se adicionaron a cada pozo, luego 2.5 x 104 de células JC53-BL se adicionaron a cada pozo, con un volumen de prueba final de 200 µ? por pozo. Después de 3 días de incubación a 37 °C, 90% de humedad relativa y 5% de C02, los medios se aspiraron y se adicionaron a cada pozo 50 µ? del sistema de prueba Steady-Glo® Luciferase (Promega) . Las placas de prueba se leyeron en un luminómetro (Luminoskan, Thermo Electron Corporation) después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se calculó el por ciento de inhibición de la actividad de luciferasa para cada punto de dosis después de sustraer el fondo, y los valores de IC50 e IC90 se determinaron usando los elementos de programación de la curva de ajuste XLfit para Excel (versión 3.0.5 Buildl2; Microsoft). Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Actividad antiviral de polipéptidos antifusogénicos , anticuerpos y conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 Ejemplo 8 Prueba de fusión celular-celular En el día 1, las células HeLa que expresan gpl60 (2 x 104 ??1??33/50µ1/????) se siembran en una placa de microtitulación de 96 blanca en medio DMEM suplementado con 10% de FCS y 2 µg/ml de doxiciclina. En el día 2, 100 µ? de la muestra de sobrenadante o el control de anticuerpo por pozo se adiciona en una placa de microtitulación de 96 clara. Luego se adicionan 100 µ? que contiene 8xl04 células de suspensión CEM-NKr-Luc en el medio y se incuban 30 minutos a 37°C. El medio de cultivo de células HeLa se aspira de la placa de 96 pozos, 100 µ? de los 200 µ? de la mezcla de anticuerpo/CEM-NKr-Luc se adiciona y se incuba durante la noche a 37°C. En el día 3, 100 µ?/???? del sustrato de prueba de Bright-Glo™ Luciferase ( 1 , 4-ditiotreitol y ditionita de sodio; Promega Corp., USA) se adiciona y se mide la luminiscencia después de un mínimo de 15 minutos de incubación a RT (temperatura ambiente) .
Materiales : Las células HeLa-R5-16 (línea celular para expresar gpl60 de VIH en inducción de doxiciclina) se cultivan en medio DMEM que contiene nutrientes y 10% de FCS con 400 µg/ml de G418 y 200 µg/ml de higromicina B. CE . KR-CCR5-LUC (Catálogo Número: 5198, una línea de células T disponible en NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA) . Tipo celular: CE . NKR-CCR5 (Cat. #4376) se transfecta (electroporación) para expresar el gen de luciferasa bajo el control transcripcional de VIH-2 LTR y se propaga en RPMI 1640 que contiene 10% de suero de bovino fetal, glutamina 4 mM, penicilina/estreptomicina (100 U/mL de penicilina, 100 yg/mL de estreptomicina) y 0.8 mg/ml de sulfato de geniticina (G418). Características de crecimiento: células linfoides redondas, morfología no muy variable. Crecimiento de células en suspensión como células simples, que pueden formar grupos pequeños. División 1:10 dos veces por semana. Características especiales: Expresar la actividad de luciferasa después de la transactivación de VIH-2 LTR. Apropiado para la infección con aislados de VIH primarios, para las pruebas de neutralización y sensibilidad del fármaco (Spenlehauer, C, et al., Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966- 8974) . La línea celular se obtuvo por medio de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH from Drs. John Moore y Catherine Spenlehauer. El amortiguador de prueba Bright-Glo™ Luciferase (Promega Corp. USA, Parte No. E2264B) , sustrato de prueba Bright-Glo™, Luciferase (Promega Corp. USA, parte No EE26B) .
Ejemplo 9 Prueba de actividad antiviral en células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) . PBMC de humano se aislaron de recubrimientos brillantes (obtenidos de Stanford Blood Center) mediante una centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Paque (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En forma breve, la sangre se transfiere de los recubrimientos brillantes en tubo cónicos de 50 mL y se diluye con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco estéril (Invitrogen/Gibco) hasta un volumen final de 50 mi. Veinticinco mi de la sangre diluida se transfieren a dos tubos cónicos de 50 mi, se refuerzan cuidadosamente con 12.5 mi de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) y se centrifugan a temperatura ambiente durante 20 minutos a 450 x g sin frenado. La capa de leucocitos se transfiere cuidadosamente a un nuevo tubo cónico de 50 mi y se lava dos veces con PBS. Para remover las células de glóbulos rojos restantes, las células se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente con amortiguador de lisis ACK (Biosource) y se lavan una vez más con PBS. PBMC se cuentan y se incuban a una concentración de 2-4 x 106 células/ml en RPMI1640 que contiene 10% de FCS (Invitrogen/Gibco), 1% de penicilina/estreptomicina, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 2 µg/ml de fitohemaglutinina (Invitrogen) durante 24 h a 37 °C. Las células se incuban con 5 unidades/ml de IL-2 de humano (Roche Molecular Biochemicals ) durante un mínimo de 48 h antes de la prueba. En una placa de fondo redondo de 96 pozos, se infectan 1 x 105 de PBMC con el virus VIH-1 JR-CSF (Koyanagi, Y., et al., Science 236 (1987) 819-822) en presencia de los conjugados del péptido-inmunoglobulina de la prueba diluida serialmente, las inmunoglobulinas de referencia y los péptidos de referencia (?-20, ?-1249, ?-651 y ?-2635) . La cantidad de virus usada es equivalente a 1.2 ng de VIH-1 p24 antigeno/pozo. Las infecciones se establecen por cuadriplicados. Las placas se incuban durante 6 días a 37°C. La producción del virus se mide al final de la' infección usando p24 ELISA (VIH-1 p24 ELISA #NEK050B, Perkin Elmer/NEN) usando el modelo de dosis-respuesta sigmoide con un sitio de unión en Microsoft Excel Fit (versión 3.0.5 Build 12; ecuación 205; Microsoft).
Ejemplo 10 Elaboración de los plásmidos de expresión del anticuerpo anti-CD4 Los segmentos del gen que codifican un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD4 (VL) y el dominio constante de cadena ligera kappa (CL) se unieron como los segmentos del gen para el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD4 (VH) y los dominios constantes de cadena pesada de humano ?? (CHl-bisagra-CH2-CH3) . En el caso de mAb CD4 de la SEC ID NQ: 71/72 los dominios variables de cadena pesada y ligera se derivan de un anticuerpo de ratón que se humanizaron como se describe, por ejemplo, por Reimann, K.A., et al., Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943 o en US 5,871,732, y dominios constantes de cadena pesada y ligera se derivan de un anticuerpo humano (C-kappa e IgGl ) .
Subsecuentemente, el segmento del gen que codifica una cadena ligera del anticuerpo anti-CD4 completa se unió en el término N y/o C con un ácido nucleico que codifica un péptido antifusogénico que incluye una secuencia de enlazador de conexión y/o el segmento del gen que codifica una cadena pesada del anticuerpo anti-CD4 completa se unió en el término N y/o C con un ácido nucleico que codifica un péptido antifusogénico que incluye una secuencia del enlazador de conexión. a) Vector 6310 El vector 6310 es un plásmido de expresión, por ejemplo, para la expresión transiente de una cadena ligera de mAb CD4 (cásete de expresión genómicamente organizado; organización exón-intrón) en células HEK293. Además del cásete de expresión de la cadena ligera ? de mAb CD4 este vector contiene: - un gen de resistencia a neomicina como un marcador seleccionado, - un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación deteste plásmido en E. coli, y un gen de ß-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. La unidad de transcripción del gen de cadena ligera ? de mAb CD4 está compuesta de los siguientes elementos: - el mej orador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, - una región 5' no traducida de un gen de la linea germinal del anticuerpo humano, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino que incluye un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [Ll-intrón-L2 ] ) , - la cadena ligera ? variable madura del anticuerpo anti-CD4 humanizado que codifica el segmento arreglado con un sitio donante de unión y un sitio de restricción BamHI único en el extremo 3' , - un intrón 2 de cadena ligera ? truncada de humano - un dominio constante del gen ligero ? de humano, - -la secuencia de señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento de bovino (bGH) ("poli A") , y - los sitios de restricción únicos Ascl y SgrAI en el extremo 3' . El mapa del plásmido del vector de expresión 6310 de cadena ligera ? de mAb CD4 se muestra en la Figura 4. La secuencia de aminoácido de la cadena ligera ? de mAb CD4 madura (sin secuencia de señal) se muestra en la SEC ID NO: 71. b) Vector 6309 El vector 6309 es un plásmido de expresión, por ejemplo, para la expresión transiente de una cadena pesada ?? de mAb CD4 (cásete de expresión genómicamente organizado; organización exón-intrón) en células HEK293. Además del cásete de expresión de cadena pesada ?? de mAb CD4 este vector contiene: - un origen de replicacion del vector pUC18 que permite la replicacion de este plásmido en E. coli, y un gen de ß-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. La unidad de transcripción de la cadena pesada ?? de mAb CD4 está compuesta de los siguientes elementos: el mej orador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, - una región 5' no traducida de un gen de la linea germinal del anticuerpo humano, - una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino que incluye un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [Ll-intrón-L2] ) , - la cadena pesada variable madura del anticuerpo anti-CD4 humanizado que codifica el segmento arreglado con' un sitio donante de unión y un sitio de restricción Xhol único en el extremo 3' , un intrón 2 del híbrido de cadena pesada de ratón/humano, - los dominios constantes del gen pesado ?? de humano genómico que contiene la mutación L234A y L235A, - la secuencia de señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento de bovino (bGH) ("poli A") , y - el sitio de restricción único SgrAI en el extremo 3' . El mapa del plásmido del vector de expresión 6309 de cadena pesada ?? de mAb CD4 se muestra en la Figura 3. La secuencia de aminoácido de la cadena pesada ?? de mAb CD4 madura (sin secuencia de señal) se muestra en la SEC ID NO: 72. c) Vector 6303 El vector 6303 es un plásmido de expresión, por ejemplo, para la expresión transiente de un conjugado de cadena pesada ?? del péptido quimérico-anticuerpo anti-CD4 (cásete de expresión genómicamente organizado; organización exón-intrón) en células HEK293. El vector 6303 se deriva del vector 6309 en la manera en que la cadena pesada ?? de mAb CD4 se une a la última, pero se remueve un aminoácido C-terminal, es decir, el residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada, con un ácido nucleico que codifica el péptido antifusogénico afp-1 (SEC ID NO: 73) y el enlazador de glicina-serina peptidico de la SEC ID NO: 69.
Además del cásete de expresión del conjugado de la cadena pesada ?? del anticuerpo anti-CD4 del péptido quimérico este vector contiene: - un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y - un gen de beta ( ß ) -lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. La unidad de transcripción del conjugado de cadena pesada ?? del péptido quimérico-anticuerpo anti-CD4 está compuesta de los siguientes elementos: el mejorador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano, - una región 5' no traducida de un gen de la línea germinal del anticuerpo humano, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina de murino que incluye un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [Ll-intrón-L2] ) , - la cadena pesada variable madura del anticuerpo anti-CD4 humanizado que codifica el segmento arreglado con un sitio donante de unión y un sitio de restricción Xhol único en el extremo 3' , - un intrón del híbrido de cadena pesada de ratón/humano que contiene las mutaciones L234A y L235A, - la secuencia del enlazador de serina-glicina peptídica de la SEC ID NO: 69, - el péptido antifusogénico afp-1 de la SEC ID NO: 73, - la secuencia de señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento de bovino (bGH) ("poli A") , y - el sitio de restricción único SgrAI en el extremo 3' . El mapa del plásmido del vector de expresión 6303 de cadena pesada ?? de mAb CD4 se muestra en la Figura 6. La secuencia de aminoácido de la cadena pesada del conjugado maduro (sin secuencia de señal) se muestra en la SEC ID NO: 74.
Ejemplo 11 Elaboración de los plásmidos de expresión del anticuerpo anti-CD4 final Los genes de fusión (genes de fusión del anticuerpo cadena pesada y/o ligera) que comprenden un segmento del gen de mAb CD4, un segmento del gen enlazador opcional y un segmento del gen del péptido antifusogénico se han montado con los métodos y técnicas recombinantes por conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes . Las secuencias de ácido nucleico que codifican los enlazadores peptidicos y los polipéptidos antifusogénicos se sintetizaron cada uno por la síntesis química y luego se ligaron en un plásmido de E. coli para la amplificación. Las secuencias de ácido nucleicos subclonadas se verificaron por secuenciación de ADN.
Ejemplo 12 Expresión transiente de inmunoglobulinas y variantes de inmunoglobulinas en células HEK293 EBNA Los anticuerpos anti-CD4 recombinantes y las variantes del anticuerpo anti-CD4 se genera por transfección transiente de células HEK293-EBNA de crecimiento adherente (linea celular 293 de células de riñon embriónico de humano que expresa el antigeno nuclear del virus Epstein-Barr ; Colección de cultivo de tipo Americano depósito número ATCC # CRL-10852) cultivado en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco, Gibco) suplementado con 10% de IgG FCS ultra bajo (suero de carnero fetal, Gibco) , Glutamina 2 mM (Gibco) , 1% en volumen por volumen (v/v) de aminoácidos no esenciales (Gibco) y 250 ug/ml de G418 (Roche Molecular Biochemicals ) . Para la transfección se usó FuGENE™ 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Biochemicals) en una relación de reactivo (µ?) a ADN i ig ) que oscila de 3:1 a 6:1. Las cadenas ligera y pesada que incluyen las cadenas ligera y pesada del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se expresaron de dos diferentes plásmidos usando una relación molar de cadena ligera a cadena pesada que codifica el plásmido que oscila de 1:2 a 2:1, respectivamente. Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 que contienen los sobrenadantes del cultivo celular se cosecharon en el día 4 a 11 después de la transfección. La información general con respecto a la expresión recombinante de las inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293 se proporciona en: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.
Ejemplo 13 Análisis de expresión usando SDS PAGE, transferencia de Western blotting y detección con conjugados del anticuerpo específicos de- inmunoglobulina Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 expresados y secretados se procesaron por electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS) (SDS-PAGE) y las cadenas del conjugado del anticuerpo anti-CD4 y el péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se transfirieron a una membrana del gel y se detectaron subsecuentemente por un método inmunológico.
SDS-PAGE : Amortiguador de muestra de LDS, concentrado cuatro veces (4x) : 4 g de glicerol, 0.682 g de base TRIS, 0.666 g de clorhidrato de TRIS, 0.8 g de LDS (dodecil sulfato de sodio), 0.006 g de EDTA (ácido tetraetilen diamin) , 0.75 mi de una solución al 1% en peso (p/p) de Serva Blue G250 en agua, 0.75 mi de una solución al 1% en peso (p/p) de rojo de fenol, adicionar agua hasta hacer un volumen total de 10 mi. El caldo de cultivo que contiene el conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 secretado se centrifugó para remover las células y los residuos celulares. Una alícuota del sobrenadante clarificado se mezcló con 1/4 volúmenes (v/v) del amortiguador de muestra 4xLDS y 1/10 volumen (v/v) de 1, 4-ditiotreitol (DTT) 0.5 M. Luego, las •muestras se incubaron durante 10 minutos a 70°C y la proteina se separó por SDS-PAGE. El sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) se . usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usó 10% de los geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6.4) y un amortiguador de corrida NuPAGE® MOPS.
Western blot: Amortiguador de transferencia: glicina 39 mM, clorhidrato de TRIS 48 mM, 0.04% en peso (p/p) de SDS y 20% en volumen de metanol (v/v) . Después de SDS-PAGE, las cadenas del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 separadas se transfirieron electroforéticamente a una membrana de filtro de nitrocelulosa (tamaño de poro: 0.45 µp?) de acuerdo con "Semidry-Blotting-Method" de Burnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203) .
Detección inmunológica : Amortiguador TBS: Clorhidrato de TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 7.5 Solución de bloqueo: 1% (p/v) de Western Blocking Reactive (Roche Molecular Biochemicals ) en amortiguador TBS Amortiguador TBST: Amortiguador TBS lx con 0.05% en volumen (v/v) de Tween-20. Para la detección inmunológica las membranas de western blotting se incubaron con agitación a temperatura ambiente dos veces durante 5 minutos en amortiguador TBS y una vez durante 90 minutos en solución de bloqueo.
Detección de las cadenas del conjugado de inmunoglobulina peptidico : Cadena pesada: Para la detección de la cadena pesada del conjugado de péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4, se usó un anticuerpo de IgG anti-humano de conejo purificado a una peroxidasa (DAKO, Código No. P 0214) . Cadena ligera: La cadena ligera del conjugado del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se detectó con un anticuerpo de cadena ligera kappa anti-humano de conejo conjugado con peroxidasa purificada (DAKO, Código No. P 0129) . Para la visualización de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, las membranas Western blot lavadas y bloqueadas se incubaron primero en el caso de una cadena pesada con un anticuerpo IgG anti-humano de conejo conjugado a una peroxidasa o en el caso de una cadena ligera con un anticuerpo de cadena ligera kappa anti-humano de conejo conjugado de peroxidasa purificada en una dilución 1:10,000 en 10 mi de solución de bloqueo a 4°C con agitación durante la noche. Después de lavar las membranas tres veces con el amortiguador TBTS y una vez con el amortiguador TBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, las membranas Western-blot se revelaron con un solución de Luminol/peróxido que genera quimioluminiscencia (Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals ) . Por lo tanto, las membranas se incubaron en 10 mL de solución de Luminol/peróxido durante 10 segundos a 5 minutos y la luz emitida se detectó después de esto con un Analizador LUMI-Imager Fl (Roche Molecular Biochemicals) y/o se registró con una película de rayos X. La intensidad de las manchas se cuantificó con los elementos de programación LumiAnalyst (Versión 3.1).
Teñido múltiple de las inmunomanchas: El conjugado del anticuerpo marcado con peroxidasa secundario usado para la detección puede removerse de la mancha teñida incubando la membrana durante una hora a 70 °C en el amortiguador de clorhidrato de TRIS 1 M (pH 6.7) que contiene beta-mercaptoetanol 100 mM y 20% (p/v) de SDS. Después de este tratamiento, la mancha puede teñirse con un anticuerpo secundario diferente una segunda vez. Antes de la segunda detección, la mancha se lava tres veces a temperatura ambiente con agitación en el amortiguador TBS durante 10 minutos cada una.
Ejemplo 14 Purificación de afinidad, diálisis y concentración de los conjugados del inmunoglobulina peptidicos Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 expresados y secretados se purificaron por cromatografía de afinidad usando Protein A-Sepharose™ CL-4B (GE Healthcare anteriormente Amersham Bioscience, Suecia) de acuerdo con los métodos conocidos. En forma breve, después de la centrifugación (10,000 g durante 10 minutos) y la filtración a través de un filtro de 0.45 µp?, el conjugado de inmunoglobulina peptídico que contiene los sobrenadantes del cultivo clarificado se aplicaron en una columna de Protein A-Sepharose™ CL-4B equilibrada con el amortiguador PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2.7 mM, pH 7.4). Las proteínas no unidas se lavaron con el amortiguador de equilibrio PBS y amortiguador de citrato 0.1 M, pH 5.5. Los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se eluyeron con amortiguador de citrato 0.1 M, pH 3.0, y el conjugado que contiene las fracciones se neutralizó con base TRIS 1 M. Luego, los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se dializaron extensivamente contra el amortiguador PBS a 4°C, se concentraron con una unidad de filtrado centrífuga Ultrafree®-CL equipada con una membrana Biomax-SK (Millipore Corp., USA) y se almacenaron en un baño de hielo-agua a 0°C. La integridad de los conjugados se analizó por SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor y por teñido con azul brillante Coomassie como se describió en el Ejemplo 13. la agregación de los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se analizó por cromatografía de exclusión de tamaño analítica.
Ejemplo 15 Desglucosilación de los conjugados de inmunoglobulina peptídicos Los carbohidratos enlazados a N de los anticuerpos anti- CD4 y los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se dividieron por tratamiento enzimático con Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals , Mannheim, Alemania o Prozyme, San Leandro, CA) . Por lo tanto, los anticuerpos anti-CD4 y los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 se incubaron a 37 °C durante 12-24 h usando 50 mU de PNGaseF por mg de proteína N-glucosilada en el amortiguador PBS a una concentración proteínica de aproximadamente 2 mg/ml. Posteriormente, el Peptide-N-Glycosidase F se separó por filtración en gel preparativa de acuerdo con los métodos conocidos. En forma breve, los anticuerpos anti-CCR5 tratados con PNGaseF y los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CCR5 se aplicaron en una columna Superóse™ 12 10/300 GL (GE Healthcare anteriormente Amersham Bioscience, Suecia) equilibrada con amortiguador PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KC1 2.7 mM, pH 7.4) y luego se eluyeron con el amortiguador de equilibrio a una velocidad de flujo de 0.5-1.0 ml/min usando el sistema de cromatografía explorador Akta de Amersham Bioscience (GE Healthcare anteriormente Amersham Bioscience, Suecia) .
Ejemplo 16 Prueba de actividad antiviral de ciclo simple Para la producción de los virus NL-Bal pseudoclasificados , el plásmido pNL4-3Aenv (construcción genómica pNL4-3 de VIH con una eliminación dentro del gen env) y pCDNA3.1 /NL-BAL env [plásmido pcDNA3.1 que contiene el gen NL-Bal env (obtenido de NIBSC Centralized Facility for AIDS Reagents)] se co-transfectaron en la línea celular HEK 293FT ( Invitrogen) , cultivada en medio mínimo modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero de carnero fetal (FCS) , 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM y 0.5 mg/mL de geniticina (todos los medios de Invitrogen/Gibco) . Los sobrenadantes que contienen los virus pseudoclasificados se cosecharon dos días después de la transfección, y el residuo celular se removió por filtración a través de un filtro de PES (poliétersulfona) de 0.45 µp? de tamaño de poro (Nalgene) y se almacenaron a -80°C en alícuotas. Para la normalización en el desempeño de la prueba, las alícuotas patrón del virus se usaron para infectar células JC53-BL (US NIH Aids Reagent Program) para producir aproximadamente 1.5 x 105 RLU (unidades de luz relativa) por pozo. Los conjugados de prueba del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4, el anticuerpo anti-CD4 padre, los anticuerpos de referencia y el péptido antifusogénico de referencia (T-651) se diluyeron serialmente en placas de 96 pozos. La prueba se llevó a cabo en cuadruplicados. Cada placa contuvo los pozos de control celular y el control de virus. El equivalente de 1.5 x 105 RLU de los patrones del virus se adicionaron a cada pozo, luego 2.5 x 104 de células JC53-BL se adicionaron a cada pozo, con un volumen de prueba final de 200 µ? por pozo. Después de 3 días de incubación a 37 °C, 90% de humedad relativa y 5% de C02, los medios se aspiraron y se adicionaron a cada pozo 50 µ? del sistema de prueba Steady-Glo® Luciferase (Promega). Las placas de prueba se leyeron en un luminómetro (Luminoskan, Thermo Electron Corporation) después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se calculó el por ciento de inhibición de la actividad de luciferasa para cada punto de dosis después de sustraer el fondo, y los valores de IC50 e IC90 se determinaron usando los elementos de programación de la curva de ajuste XLfit para Excel (versión 3.0.5 Buildl2; Microsoft). Los resultados se muestran en las Tablas 4 y 5, respectivamente.
Tabla 4: Actividad antiviral de polipéptidos antifusogénicos , anticuerpos y conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 (en peso) .
Tabla 5: Actividad antiviral de polipéptidos antifusogénicos , anticuerpos y conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 (por molaridad) . Actividad antiviral NL-BAL (R5) NL-4-3 (X4) Compuesto IC50 [nM]/IC90 [nM] IC50 [nM]/IC90 [nM] Anticuerpo de referencia 1 Inactivo/inactivo Inactivo/Inactivo (inerte) Anticuerpo de referencia 2 Inactivo/inactivo Inactivo/Inactivo ( inerte ) T-651 5.4/45 42/275 mAb CD4 (6310/6309) Inhibición máxima = Inhibición máxima 50% = 20% Conjugado péptido 0.038/0.201 0.275/0.774 antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 (6310-6303) Ejemplo 17 Prueba de fusión celular-celular En el día 1, las células HeLa que expresan gpl60 (2 x 104 células/50 l/pozo) se siembran en una placa de microtitulación de 96 blanca en medio DMEM suplementado con 10% de FCS y 2 µ?/p?? de doxiciclina. En el día 2, 100 µ? de la muestra de sobrenadante o el control de anticuerpo por pozo se adiciona en una placa de microtitulación de 96 clara. Luego se adicionan 100 µ? que contiene 8xl04 células de suspensión CEM-NKr-Luc en el medio y se incuban 30 minutos a 37°C. El medio de cultivo de células HeLa se aspira de la placa de 96 pozos, 100 µ? de los 200 µ? de la mezcla de anticuerpo/CEM-NKr-Luc se adiciona y se incuba durante la noche a 37°C. En el día 3, 100 µ?/???? del sustrato de prueba de Bright-Glo™ Luciferase (1, 4-ditiotreitol y ditionita de sodio; Promega Corp., USA) se adiciona y se mide la luminiscencia después de un mínimo de 15 minutos de incubación a RT (temperatura ambiente) .
Materiales: Las células HeLa-R5-16 (línea celular para expresar gpl60 de VIH en inducción de doxiciclina) se cultivan en medio DMEM que contiene nutrientes y 10% de FCS con 400 µg/ml de G418 y 200 µg/ml de higromicina B. CEM . NKR-CD4-Luc (Catálogo Número: 5198, una línea de células T disponible en NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA) . Tipo celular: CEM.NKR-CD4 (Cat. #4376) se transfecta (electroporación) para expresar el gen de luciferasa bajo el control transcripcional de VIH-2 LTR y se propaga en RPMI 1640 que contiene 10% de suero de bovino fetal, glutamina 4 mM, penicilina/estreptomicina (100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina) y 0.8 mg/ml de sulfato de geniticina (G418) . Características de crecimiento: células linfoides redondas, morfología no muy variable. Crecimiento de células en suspensión como células simples, que pueden formar grupos pequeños. División 1:10 dos veces por semana. Características especiales: Expresar la actividad de luciferasa después de la transactivación de VIH-2 LTR. Apropiado para la infección con aislados de VIH primarios, para las pruebas de neutralización y sensibilidad del fármaco (Spenlehauer, C, et al., Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966- 8974). La línea celular se obtuvo por medio de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH from Drs. John Moore y Catherine Spenlehauer. El amortiguador de prueba Bright-Glo™ Luciferase (Promega Corp. USA, Parte No. E2264B) , sustrato de prueba Bright-Glo™, Luciferase (Promega Corp. USA, parte No EE26B) .
Ejemplo 18 Prueba de actividad antiviral en células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) . PBMC de humano se aislaron de recubrimientos brillantes (obtenidos de Stanford Blood Center) mediante una centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Paque (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En forma breve, la sangre se transfiere de los recubrimientos brillantes en tubos cónicos de 50 mL y se diluye con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco estéril (Invitrogen/Gibco) hasta un volumen final de 50 mi. Veinticinco mi de la sangre diluida se transfieren °a dos tubos cónicos de 50 mi, se refuerzan cuidadosamente con 12.5 mi de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) y se centrifugan a temperatura ambiente durante 20 minutos a 450 x g sin frenado. La capa de leucocitos se transfiere cuidadosamente a un nuevo tubo cónico de 50 mi y se lava dos veces con PBS. Para remover las células de glóbulos rojos restantes, las células se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente con amortiguador de lisis ACK (Biosource) y se lavan una vez más con PBS. PBMC se cuentan y se incuban a una concentración de 2-4 x 106 células/ml en RP I1640 que contiene 10% de FCS (Invitrogen/Gibco), 1% de penicilina/estreptomicina, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 2 µg/ml de fitohemaglutinina (Invitrogen) durante 24 h a 37°C. Las células se incuban con 5 unidades/ml de IL-2 de humano (Roche Molecular Biochemicals) durante un mínimo de 48 h antes de la prueba. En una placa de fondo redondo de 96 pozos, se infectan 1 x 105 de PBMC con el virus VIH-1 JR-CSF (Koyanagi, Y . , et al., Science 236 (1987) 819- 822) en presencia de los conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 de la prueba diluida serialmente, las inmunoglobulinas de referencia y el anticuerpo anti-CD4 padre y los péptidos de referencia (T- 651) . La cantidad de virus usada es equivalente a 1.2 ng de VIH-1 p24 antigeno/pozo. Las infecciones se establecen por cuadriplicados. Las placas se incuban durante 6 días a 37°C.
La producción del virus se mide al final de la infección usando p24 ELISA (VIH-1 p24 ELISA #NEK050B, Perkin Elmer/NEN) usando el modelo de dosis-respuesta sigmoide con un sitio de unión en Microsoft Excel Fit (versión 3.0.5 Build 12; > ecuación 205; Microsoft).
Tabla 6: Actividad antiviral de los polipéptidos antifusogénicos, anticuerpos y conjugados del péptido antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 (en peso) . Actividad antiviral NL-BAL NL-4-3 Compuesto IC50 [nM/mL] /IC90 IC50 [nM/mL] /IC90 [nM/mL] [nM/mL] Anticuerpo de referencia 1 Inactivo/inactivo Inactivo/Inactivo (inerte) Anticuerpo de referencia 2 Inactivo/inactivo Inacti o/Inactivo (inerte) T-651 * 14.1/57.8 41.4/79.6 Anticuerpo anti-CD4 917.6/54% 35.6/1117.0 (6310/6309) inhibición máxima Actividad antiviral NL-BAL NL-4-3 Compuesto IC50 [n /mL] /IC90 IC50 [nM/mL] /IC90 [nM/mL] [nM/mL] Conjugado péptido 5.3/18.2 3.2/25.1 antifusogénico-anticuerpo anti-CD4 (6310-6303) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Conjugado que comprende uno o más péptidos antifusogénicos y un anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de VIH, caracterizado porque dos o cuatro péptidos antifusogénicos se conjugan cada uno a un término de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de VIH. 2. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo contra un receptor de superficie celular de unión de gpl20 de VIH es un anticuerpo anti-CCR5 (mAb CCR5) .
  3. 3. Conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque por lo menos dos de los términos del anticuerpo anti-CCR5 se conjugan cada uno a un péptido antifusogénico .
  4. 4. Conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los péptidos antifusogénicos son péptidos lineales y comprenden una secuencia de aminoácido de 5 a 100 aminoácidos.
  5. 5. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la fórmula general mAb CCR5 - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] n, en donde m es independientemente para cada péptido antifusogénico ya sea 0 ó 1 y n es un entero de a lo más 1 a 8.
  6. 6. Conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende un conjugado de cadena pesada y/o ligera del o los péptidos antifusogénicos de mAb CCR5 ("conjugado de cadena") seleccionado del grupo que consiste de: (1) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] (2) [cadena pesada] - [enlazador ] m - [péptido antifusogénico] (3) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] - [péptido antifusogénico] (4) [péptido antifusogénico] - [enlazador ] m - [cadena ligera] (5) [cadena ligera] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (6) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] - [péptido antifusogénico] (7) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena pesada] - [enlazador]m - [péptido antifusogénico] (8) [péptido antifusogénico] - [enlazador]m - [cadena ligera] - [enlazador ] m - [péptido antifusogénico] , en donde el enlazador puede ser el mismo o diferente, en donde m es un entero de 1 ó 0 y puede ser independientemente el mismo o diferente .
  7. 7. Conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un conjugado de cadena (2), (3) , (4) ó (7) .
  8. 8. Conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende 2x [cadena ligera de mAb CCR5] y 2x (2), 2 x [cadena ligera de mAb CCR5] y 2 x (3) ó 2 x [cadena pesada de mAb CCR5] y 2 x (4) ó 2 x [cadena ligera de mAb CCR5] y 2 x (7) .
  9. 9. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado porque el péptido antifusogénico se selecciona del grupo de péptidos definidos por la SEC ID NO: 29 a 35 y SEC ID NO: 73.
  10. 10. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende un dominio de cadena variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de cadena pesada SEC ID NO: 16, 17.
  11. 11. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende un dominio de cadena pesada variable que consiste de un marco de inmunoglobulina y una región de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR3 de cadena pesada SEC ID NO: 16 y 17, una región de CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDR2 de cadena pesada SEC ID NO: 13, 14 y 15 y una región de CDRl seleccionada del grupo que consiste de las secuencias CDRl de cadena pesada SEC ID NO: 9, 10, 11 y 12.
  12. 12. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo de la SEC ID NO: 1, 3, 5 y 7.
  13. 13. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende un dominio de cadena ligera variable de un marco de inmunoglobulina y una región CDRl seleccionada de la SEC ID NO: 18, 19 y 20, una región CDR2 seleccionada de la SEC ID NO: 21, 22 y 23 y una región CDR3 seleccionada de SEC ID NO: 24 y 25.
  14. 14. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 1 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 2, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 3 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 4, como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 5 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 6, o como CDRs de cadena pesada las CDRs de la SEC ID NO: 7 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de la SEC ID NO: 8.
  15. 15. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende un dominio de cadena pesada variable y un dominio de cadena ligera variable seleccionado independientemente del grupo que consiste de: a) el dominio variable de cadena pesada (VH) definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera (VL) definido por secuencia de aminoácido SEC ID NO: 2; b) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO : 4 ; c) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO : 6 ; d) el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 8.
  16. 16. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 comprende el dominio variable de cadena pesada (VH) definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 1 y el dominio variable de cadena ligera (VL) definido por secuencia de aminoácido SEC ID NO: 2; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 3 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 4; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 5 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 6 o el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 7 y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEC ID NO: 8, Un enlazador seleccionado del grupo que consiste de los aminoácidos glicina (G) y asparagina (N) , el tripéptido GST y la SEC ID NO: 36-62 y la SEC ID NO: 67-70; y un péptido antifusogénico seleccionado del grupo de los péptidos definidos por la SEC ID NO: 29 a 35 y la SEC ID NO: 73.
  17. 17. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, caracterizado porque comprende un péptido antifusogénico seleccionado del grupo de la SEC ID NO:' 29 a 35 y SEC ID NO: 73.
  18. 18. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17, caracterizado porque comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 2, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 1, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 4, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 3, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33, que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 6, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 5, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33 o que comprende dos dominios variables de cadena ligera de la SEC ID NO: 8, dos conjugados de tipo (2) que comprende cada uno un dominio variable de cadena pesada de la SEC ID NO: 7, un enlazador de la SEC ID NO: 40 y un péptido antifusogénico de la SEC ID NO: 33.
  19. 19. Conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 es de 'la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2, con una mutación en el aminoácido S228, L234, L235 y/o D265 y/o contiene la mutación PVA236.
  20. 20. Conjugado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCR5 de la subclase IgG4 tiene la mutación S228P y el anticuerpo anti-CCR5 de la subclase IgGl tiene las mutaciones L234A y L235A.
  21. 21. Método para la producción de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende: a) cultivar una célula que contiene uno o más plásmidos que contienen una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican un conjugado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 20 bajo condiciones apropiadas para la expresión del conjugado, b) recuperar el conjugado de la célula o el sobrenadante del cultivo celular.
  22. 22. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  23. 23. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales.
  24. 24. Uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde la infección viral es una infección por VIH.
  25. 25. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para el tratamiento de un paciente en necesidad de un tratamiento antiviral.
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