ES2205849T3 - Conjugados para tratar alteraciones inflamatorias y asociadas con daños tisulares. - Google Patents

Conjugados para tratar alteraciones inflamatorias y asociadas con daños tisulares.

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ES2205849T3
ES2205849T3 ES99932572T ES99932572T ES2205849T3 ES 2205849 T3 ES2205849 T3 ES 2205849T3 ES 99932572 T ES99932572 T ES 99932572T ES 99932572 T ES99932572 T ES 99932572T ES 2205849 T3 ES2205849 T3 ES 2205849T3
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Abstract

Utilización de un conjugado para la formulación de un medicamento para el tratamiento de condiciones patológicas asociadas con respuestas inflamatorias y/o con daño tisular secundario asociado con la activación, proliferación y migración de células inmunoefectoras mediante la inhibición de la activación, proliferación o migración de las células inmunoefectoras, que comprende la administración de un conjugado a un animal mediante lo cual se inhibe la activación, proliferación o migración de las células inmunoefectoras, inhibiendo de este modo la respuestas inflamatoria y/o el daño tisular secundario, donde: el conjugado comprende los componentes siguientes: (agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas)n, (L)q y (agente citotóxico)m, en el que: L es un adaptador para ligar el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas a un agente citotóxico vectorizado; el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es cualquier resto que se una selectivamente a un receptor de quimioquinas; el agente citotóxico vectorizado o una porción del mismo, cuando es internalizado en una célula, altera el metabolismo o la expresión génica en la célula, regula o altera la síntesis de proteínas en la célula, inhibe la proliferación de la célula o destruye la célula; m y n, que son seleccionados independientemente, son al menos 1; q es 0 o más, siempre que el conjugado resultante se una al receptor diana, se internalice y suministre el agente citotóxico vectorizado; y el conjugado resultante se une a un receptor que interacciona con, e internaliza, una quimioquina, mediante lo cual el(los) agente(s) citotóxico(s) vectorizado(s) es(son) internalizado(s) en una célula portadora del receptor.

Description

Conjugados para tratar alteraciones inflamatorias y asociadas con daños tisulares.
Solicitudes relacionadas
Para fines internacionales se reivindica el beneficio de prioridad para la Solicitud de EE.UU. Nº de Serie 09/120.523, titulada "METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE", registrada el 22 de Julio de 1998 por McDonald, John R. y Coggins, Philip J.
Para EE.UU., esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de EE.UU Nº de Serie 09/120.523. Se reivindica el beneficio de prioridad bajo U.S.C 35 \NAK120.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones terapéuticas y a su utilización en el tratamiento de estados de enfermedad. Más particularmente, se proporcionan compuestos, composiciones y sus utilizaciones para tratar estados de enfermedad asociados con la proliferación, migración y actividad fisiológica de las células implicadas en las respuestas inflamatorias incluyendo, pero no limitándose a, el daño tisular secundario.
Quimioquinas
Las quimioquinas son una familia de cuarenta o más citoquinas proinflamatorias pequeñas (de 4 aproximadamente a 14 kDa aproximadamente) inducibles y secretadas que actúan primariamente como quimioatrayentes y activadoras de subtipos celulares de leucocitos específicos. Juntas, las quimioquinas se dirigen al espectro completo de subtipos de leucocitos; individualmente cada una se dirige solamente a parte del espectro. Las quimioquinas, que son proteínas básicas que se unen a heparina, tienen cuatro cisteínas compartidas por casi todos los miembros de la familia. Hay cuatro grupos principales de quimioquinas, tres de los cuales incluyen las cuatro cisteínas conservadas. Los grupos son definidos por la colocación de las dos primeras cisteínas. Si las dos primeras cisteínas están separadas por un único aminoácido son miembros de la familia CXC (también denominada \alpha); si las cisteínas están adyacentes, son clasificadas como de la familia CC (también denominada \beta). Si están separadas por tres aminoácidos CX_{3}C, son miembros del tercer grupo. El cuarto grupo de quimioquinas contiene dos cisteínas, que corresponden a la primera y a la tercera cisteína de los otros grupos. El análisis estructural demuestra que la mayoría de las quimioquinas funcionan como monómeros y que las dos regiones necesarias para la unión al receptor residen en los primeros 35 aminoácidos del extremo N flexible (Clark-Lewis y col. (1995) J. Leukoc. Biol., 57: 703-11; Beall y col. (1996) Biochem. J., 313: 633-40; y Steitz y col. (1998) FEBS Lett., 430: 158-64).
Las quimioquinas, en asociación con las moléculas de adhesión, reclutan subgrupos de leucocitos hacia sitios específicos de inflamación y de lesión tisular. Generalmente, la expresión de las quimioquinas y del receptor de quimioquinas está regulada por incremento en la enfermedad, actuando la quimioquinas de una manera autocrina o paracrina (Glabinski y col., Int. J. Dev. Neurosci., 13: 153-65, 1995; Furie y Randolph, Am. J. Pathol., 146: 1287-301, 1995; Benveniste, E.N., J. Mol. Med., 75: 165-73, 1997; Schall y col., Current Biol., 6: 865-73, 1994; Taub y col., Ther. Immunol., 1: 229-46, 1994; Baggliolini y col., Adv. Immunol., 55: 97-179, 1994 y Haelens y col., Immunobiol., 195: 499-521, 1996). Varias citoquinas y quimioquinas trabajan juntas para regular la mayoría de las funciones de los fagocitos mononucleares (MNPs; monocitos), incluyendo la liberación de factores neurotóxicos y citotóxicos.
Una vez secretadas por los fagocitos mononucleares (MNPs) que se infiltran, particularmente, tal como la microglía activada, una clase distinta de fagocitos mononucleares (MNPs) encontrada en el SNC, las quimioquinas son responsables de la quimioatracción de otros varios tipos celulares de leucocitos, incluyendo neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos T y células destructoras naturales. Estudios in vitro han demostrado que varios estímulos, incluyendo lipopolisacárido (LPS), IL-1, IFN-\gamma y TNF-\alpha inducen la expresión y la secreción de quimioquinas a partir de varios tipos celulares del sistema nervioso central (SNC) y de otros tipos celulares (Proost y col., J. Leukoc. Biol., 59: 67-74, 1996; Graves y col., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109-18, 1995; Hayashi y col., J. Neuroimmunol., 60: 143-50, 1995; y Hurwitz y col., J. Neuroimmunol., 57: 193-8, 1995). Por ejemplo, la producción de quimioquinas tales como la proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1), la proteína inflamatoria de macrófagos-1 (MIP-1\beta) y RANTES (Regulada tras la Activación, Expresada y Secretada por Células T Normales) puede ser inducida a partir de astrocitos, microglía y leucocitos (Proost y col., J. Leukoc. Biol., 59: 67-74, 1996; Graves y col., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109-18, 1995; Hayashi y col., J. Neuroimmunol., 60: 143-50, 1995; y Hurwitz y col., J. Neuroimmunol., 57: 193-8, 1995). Se ha demostrado que estas quimioquinas inducen la quimiotaxis y la activación de microglía y macrófagos en estudios con cultivos celulares (Graves y col., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109-18, 1995; Hayashi y col., J. Neuroimmunol., 60: 143-50, 1995; Hurwitz y col., J. Neuroimmunol., 57: 193-8, 1995; Sun y col., J. Neurosci. Res., 48: 192-200, 1997; y Peterson y col., J. Infect. Dis., 175: 478-81, 1997). Por tanto, se cree que las quimioquinas inducen la producción y la liberación de especies de oxígeno reactivas, enzimas degradantes y citoquinas inflamatorias y tóxicas a partir de varias poblaciones celulares de leucocitos y MNP (Glabinski y col., Int. J. Dev. Neurosci., 13: 153-65, 1995; Furie y Randolph, Am. J. Pathol., 146: 1287-301, 1995; Benveniste, E.N., J. Mol. Med., 75: 165-73, 1997; Schall y col., Current Biol., 6: 865-73, 1994; Taub y col., Ther. Immunol., 1: 229-46, 1994; Proost y col., J. Leukoc. Biol., 59: 67-74, 1996; Graves y col., Crit. Rev. Oral Biol. Med., 6: 109-18, 1995; Hayashi y col., J. Neuroimmunol., 60: 143-50, 1995; Hurwitz y col., J. Neuroimmunol., 57: 193-8, 1995; Sun y col., J. Neurosci. Res., 48: 192-200, 1997; Peterson y col., J. Infect. Dis., 175: 478-81, 1997; Leonard y col., Immunol. Today, 11: 97-103, 1990; Fahey y col., J. Immunol., 148: 2764-9, 1992; y Ali y col., Adv. Rheumatol., 81: 1-28, 1997).
Se ha demostrado que los miembros de quimioquinas MCP-1, MIP-1\beta y RANTES son expresados en astrocitos y macrófagos después de una lesión mecánica en el cerebro (Glabinski y col., Int. J. Dev. Neurosci., 13: 153-65, 1995; y Ghirnikar y col., J. Neurosci. Res., 46: 727-33, 1996). En estos estudios, la expresión de las quimioquinas bajo investigación se correlacionaba con el inicio de gliosis reactiva y con la aparición de MNPs en el lugar de la lesión. Se ha detectado la expresión de MCP-1 y MIP-1 en MNPs y astrocitos después de una isquemia cerebral focal en la rata (Kim y col., J. Neuroimmunol., 56: 127-34, 1995; Gourmala y col., J. Neuroimmunol., 74: 35-44, 1997; y Takami y col., Neurosci. Lett., 277: 173-6, 1997), y varios investigadores han estudiado la expresión de varias quimioquinas en EAE, un modelo animal de esclerosis múltiple (Berman y col., J. Immunol., 156: 3017-23, 1996; y Adamus y col., J. Neurosci. Res., 50: 531-8, 1997). Además, se ha demostrado que ratones transgénicos que sobreexpresan MCP-1 presentan una infiltración pronunciada de MNP y leucocitos en el SNC (Fuentes y col., J. Immunol., 155: 5769-76, 1995).
Se ha descrito que los niveles de expresión de numerosas citoquinas y quimioquinas están elevados en, y modulan, la progresión de incontables tipos de cáncer (Van Mier, Glia, 15: 264-88, 1995). Por ejemplo, mastocitos humanos leucémicos parecen ser la fuente de múltiples quimioquinas, incluyendo MCP-1; I-309; MIP-1\alpha; MIP-1\beta; RANTES e IL-8. Un estudio describe que tejidos humanos de adultos normales expresan niveles muy bajos de RANTES, pero la expresión estaba enormemente incrementada en numerosos tipos de cánceres, incluyendo linfomas (von Luettichau y col., Cytokine, 8: 89-98). De manera similar, los niveles de expresión de MCP-3 están incrementados en muchas líneas celulares tumorales (Murakami y col., DNA Cell Biol., 16: 173-83).
Las citoquinas (por ejemplo, IL-1, IL-6 y TNF-\alpha) y las quimioquinas (por ejemplo, IL-8, MCP-1, MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES) han sido implicadas en la patología de numerosas condiciones y enfermedades, incluyendo el daño celular secundario. Han sido implicadas en la patología de enfermedades inflamatorias de las articulaciones, incluyendo artritis reumatoide (Rathanaswami y col., J. Biol. Chem., 268: 5834-9, 1993; Badolato y Oppenhiem, Semin. Arthritis Rheum., 2: 526-38, 1996; De Benedetti y col., Curr. Opin. Rheumatol., 9: 428-33, 1997; Viliger y col., J. Immunol., 149: 722-27, 1992; Hosaka y col., Clin. Exp. Immunol., 97: 451-7, 1994; Kunkel y col., J. Leukoc. Biol., 59: 6-12, 1996). La liberación de mediadores inflamatorios, incluyendo especies de oxígeno reactivas, enzimas proteolíticos y una variedad de citoquinas procedentes de MNPs, está asociada con el inicio y el mantenimiento del daño tisular en el estado artrítico (Kunkel y col., J. Leukoc. Biol., 59: 6-12, 1996; Badolato y Oppenhiem, Semin. Arthritis Rheum., 2: 526-38, 1996).
Receptores de quimioquinas
Las quimioquinas median sus actividades a través de receptores en la superficie celular acoplados a proteína G. Se han identificado cinco receptores (CXCR1-5) a los que se unen las quimioquinas CXC y diez receptores (CCR1-9, incluyendo CCR-2A y CCR-2B) a los que se unen las quimioquinas CC. Un miembro, denominado receptor antígeno de Duffy, se une a las quimioquinas CC y CXC.
Las células inflamatorias, tales como la microglía, expresan varios receptores de quimioquinas, y más de una quimioquina puede unirse a un receptor. Por ejemplo, el receptor de \beta-quimioquinas CCR3 (He y col., Nature, 385: 645-49, 1997) se une no sólo a MCP-3, MCP-4 y RANTES, sino también a otras dos quimioquinas CC, eotaxina y eotaxina-2 (Jose y col., J. Exp. Med., 179: 881-7, 1994; Jose y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 788-94, 1994; Ponath y col., J. Clin. Invest., 97: 604-12, 1996; Daugherty y col., J. Exp. Med., 183: 2349-54, 1996; y Forssman y col., J. Exp. Med., 185: 2171-6, 1997). La eotaxina y la eotaxina-2 son específicas de CCR3 (Ponath y col., J. Clin. Invest., 97: 604-12, 1996; Daugherty y col., J. Exp. Med., 183: 2349-54, 1996; y Forssman y col., J. Exp. Med., 185: 2171-6, 1997).
Un segundo ejemplo es el correceptor del VIH CXCR4 (fusina) de \alpha-quimioquinas. Se han identificado tres quimioquinas (los factores derivados de células del estroma SDF-1\alpha, SDF-1\beta y SDF-2) que se unen específicamente a este receptor, que está presente en varios subgrupos de células inflamatorias y que atraen muy potentemente a células MNP (Ueda y col., J. Biol. Chem., 272: 24966-70, 1997; Yi y col., J. Virol., 72: 772-7, 1998; Shirozu y col., Genomics, 28: 495-500, 1995; Shirozu y col., Genomics, 37: 273-80, 1996; Bleul y col., J. Exp. Med., 184: 1101-9, 1996; Tanabe y col., J. Immunol., 159: 905-11, 1997; y Hamada y col., Gene, 176: 211-4, 1996).
Enfermedad inflamatoria, daño tisular secundario y quimioquinas
Las quimioquinas tienen una variedad de actividades biológicas. Fueron aisladas inicialmente por su capacidad para estimular la migración y la activación de leucocitos. Se ha demostrado que regulan la proliferación de progenitores hematopoyéticos negativos y varias quimioquinas CXC pueden regular la angiogénesis. Pueden tener un papel en muchas enfermedades que implican la destrucción del tejido inflamatorio, tales como el síndrome del distrés respiratorio del adulto, el infarto de miocardio, la artritis reumatoide y la ateroesclerosis.
Las respuestas inflamatorias están mediadas por células de inmunodefensa que se acumulan en el lugar de la lesión o del trauma tisular para eliminar del organismo agentes exógenos (por ejemplo, microbios) o agentes endógenos (por ejemplo, clones de células cancerosas) no deseados; para eliminar los desechos celulares y para participar en la cicatrización de tejidos y heridas. Desgraciadamente, los mecanismos moleculares implicados en estos procesos reparadores (inflamatorios) pueden iniciar un daño tisular secundario que, a su vez, contribuye a la patogénesis y a la patología persistente de varias enfermedades inflamatorias. Los mecanismos moleculares y los mediadores celulares y químicos implicados en el daño tisular secundario son similares, si no idénticos, en la mayoría de la enfermedades inflamatorias del hombre. Como ejemplo, se esquematizan a continuación los procesos implicados en el daño tisular secundario de traumas y enfermedades del sistema nervioso central (SNC).
Estudios sobre lesiones de la médula espinal (SCI) y trauma generalizado del sistema nervioso central (SNC) han demostrado un claro inicio de daño tisular secundario que se observa en cuestión de horas, que puede continuar durante varias semanas y que es seguido por un periodo de recuperación parcial. Numerosos factores están implicados en la propagación del daño secundario en la médula espinal después de una lesión traumática, incluyendo isquemia, edema, aminoácidos excitatorios incrementados y daño oxidativo al tejido procedente de las especies de oxígeno reactivas. Los neutrófilos y los macrófagos pueden producir especies de oxígeno reactivas cuando son activados y pueden contribuir así a la peroxidación lipídica que tiene lugar después de una lesión de la médula espinal. El daño tisular secundario es detectable como muerte celular, astrogliosis que lleva a la formación de cicatrices gliales, neovascularización, desmielinización y pérdida de las funciones sensoriales y motoras, esto es, parálisis. La variación a lo largo del tiempo del daño secundario y la recuperación parcial están correlacionadas con el grado de inflamación en el lugar de la lesión (Blight, A.R., J. Neurol. Sci., 103: 156-71, 1991; Dusart y col., Eur. J. Neurosci., 6: 712-14, 1994; y Gehrmann y col., Brain Res. Rev., 20: 269-87, 1995), y los mecanismos moleculares subyacentes a estos acontecimientos parecen ser similares a los que median el daño asociado con otras enfermedades inflamatorias del SNC, incluyendo esclerosis múltiple (MS), encefalomielitis, enfermedad de Alzheimer (AD), complejo de demencia del SIDA, encefalopatías espongiformes y adrenoleucodistrofia (Raine, C.S., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 53: 328-37, 1994; Sobel, R.A., Neurol. Clin., 13: 1-21, 1995; Dickson y col., Glia, 7: 75-83, 1993; Benveniste, E.N., Res. Publ. Assoc. Res. Nerv. Ment. Dis., 72: 71-88, 1994; Benveniste, E.N., J. Mol. Med., 75: 165-73, 1997; Sippy y col., J. Acquir. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 511-21, 1995; Giulian y col., Neurochem. Int., 27: 119-37, 1995a; Christie y col., Am. J. Pathol., 148: 399-403, 1996; El Khoury y col., Nature, 382: 716-19, 1996; Powers, J.M., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 54: 710-9, 1995; y Ühleisen y col., Neuropathol. App. Neurobiol., 21: 505-517, 1995).
Se acepta generalmente que la microglía son las células inmunoefectoras residentes del SNC (Gehrmann y col., Brain Res. Rev., 20: 269-87, 1995; Giulian, D., J. Neurosci. Res., 18: 155-171, 1987; y Giulian y col., J. Neurosci., 15: 7712-26, 1995b). La microglía y los macrófagos infiltrantes, otra clase de MNP activados después de una lesión, conducen al daño celular secundario (Giulian y col., J. Neurosci., 9: 4416-29, 1989; Guilian y col., Ann. Neurol., 27: 33-42, 1990; Gehrmann y col., Brain Res. Rev., 20: 269-87, 1995; Sobel, R.A., Neurol. Clin., 13: 1-21, 1995; Dickson y col., Glia, 7: 75-83, 1993; Benveniste, E.N., Res. Publ. Assoc. Res. Nerv. Ment. Dis., 72: 71-88, 1994; Sippy y col., J. Acquir. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 511-21, 1995; y Giulian y col., Neurochem. Int., 27: 119-37, 1995a) mediante la producción y secreción de varias citoquinas proinflamatorias y de factores neurotóxicos y de otros factores citotóxicos, y por la expresión de novo de inmunomoléculas en la superficie celular.
La microglía produce y secreta la citoquina interleuquina-1 (IL-1), que estimula la proliferación de la astroglía in vitro (Giulian y col., J. Neurosci., 8: 709-14, 1988). Hay estudios que han demostrado que la infusión intracerebral de IL-1 puede estimular la astrogliosis y la neovascularización que pueden ser detectadas solamente después de la aparición de la microglía y de los macrófagos en el lugar de la lesión (Giulian y col., J. Neurosci., 8: 2485-90, 1988; y Giulian y col., J. Neurosci., 8: 709-14, 1988). El número más elevado de microglía y de macrófagos en sangre aparece 1-2 días después del trauma del SNC, que es el periodo de tiempo que ha sido asociado con la producción máxima de IL-1 (Giulian y col., J. Neurosci., 9: 4416-29, 1989). Colectivamente, esta evidencia sugiere que los MNPs son responsables de la estimulación de la astrogliosis a través de IL-1. Además, la microglía activada secreta factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), una citoquina que se ha demostrado que desempeña varias funciones destacadas en varias enfermedades inflamatorias del SNC (Gehrmann y col., Brain Res. Rev., 20: 269-87, 1995). El TNF-\alpha y la IL-1 inducen la producción y secreción de varias citoquinas por los astrocitos, incluyendo TNF-\alpha y el factor estimulante de colonias de granulocito-macrófagos (GM-CSF). La microglía reactiva, pero no los astrocitos, sintetiza y secreta también interleuquina-3 (IL-3). El GM-CSF, la IL-3 y la interleuquina-4 (IL-4) son potentes mitógenos para los MNPs (Giulian y col., J. Neurosci., 12: 4707-17, 1988; Giulian y col., Dev. Neurosci., 16: 128-36, 1994; Gebicke-Haerter y col., J. Neuroimmunol., 50: 203-14, 1994; Lee y col., Glia, 12: 309-18, 1994; y Suzumura y col., J. Neuroimmunol., 53: 209-18, 1994). Fisiológicamente, se establece un bucle de retroalimentación positiva por el que los MNPs proliferantes producen más factores astrogliales, lo cual conduce a la formación de una cicatriz glial en el lugar de la lesión. La cicatriz astroglial cierra la herida en el lugar de la lesión, pero eventualmente puede impedir la regeneración axonal de las neuronas circundantes.
Los MNPs secretan también varios agentes neurotóxicos que parecen ejercer sus efectos a través del receptor del aminoácido excitatorio N-metil-D-aspartato (NMDA). Estas neurotoxinas incluyen aspartato, glutamato y ácido quinolínico. Los dos primeros compuestos se encuentran en concentración elevada en modelos de daño cerebral traumático (Faden y col., Science, 244: 798-800, 1989; y Panter y col., Ann. Neurol., 27: 96-99, 1990), y el ácido quinolínico se encuentra en modelos de lesión de la médula espinal por contusión (Blight y col., Brain Res., 632: 314-16, 1993; y Popovich y col., Brain Res., 633: 348-52, 1994). Se ha descrito otro ligando neurotóxico del receptor de NMDA que parece ser específico de neuronas, pero que no tiene efecto sobre la astroglía ni sobre la oligodendroglía (Giulian y col., J. Neurosci., 13: 29-37, 1993; y Giulian y col., J. Neurosci. Res., 36: 681-93, 1993). Además, se ha demostrado que se produce una amina neurotóxica (Ntox) a partir de microglía y MNPs periféricos aislados de pacientes positivos para el VIH-1 (Giulian y col., J. Neurosci., 16: 3139-53, 1996).
La microglía y los MNPs activados liberan otras varias sustancias nocivas, incluyendo proteinasas, especies de oxígeno reactivas y óxido nítrico (NO) (Hartung y col., J. Neuroimmunol., 40: 197-210, 1992; Banati y col., Glia, 7: 111-8, 1993; y Ali y col., Adv. Rheumatol., 81: 1-28, 1997). Las proteinasas pueden degradar directamente la mielina y han sido implicadas en la proteolisis de proteínas de la matriz extracelular (Hartung y col., J. Neuroimmunol., 40: 197-210, 1992; y Romanic y col., Brain Pathol., 4: 145-46, 1994). Por tanto, la liberación elevada de proteasas derivadas de MNP parece contribuir a la degradación de la matriz extracelular y de la mielina, ensanchando de este modo la zona de daño tisular secundario. Además, productos intermedios de oxígeno reactivos son liberados por la microglía en respuesta a interferón gamma (IFN-\gamma) y TNF-\alpha. Estos radicales de oxígeno son responsables de la peroxidación lipídica, que conduce a la degradación de las membranas celulares, siendo las dianas específicas las neuronas, los oligodendrocitos y la propia vaina de mielina. La microglía humana puede regular la producción de NO por los astrocitos proporcionando IL-1, IFN-\gamma y TNF-\alpha (Chao y col., J. Leukoc. Biol., 1: 65-70, 1995).
Los MNPs producen, secretan y responden a varias citoquinas, incluyendo IL-1, TNF-\alpha, IL-3, IL-4, GM-CSF e IFN-\gamma. Estas citoquinas pueden modular la mayoría de las funciones de los MNPs, particularmente la expresión de marcadores de la superficie celular en MNPs. Estudios in vitro han demostrado que el TNF-\alpha es directamente citotóxico para los oligodendrocitos y estimula la fagocitosis microglial de la mielina (Zajicek y col., Brain, 115: 1611-31, 1992; y Soliven y Szuchet, Int. J. Dev. Neurosci., 13: 351-67, 1995). Además, el TNF-\alpha ha sido implicado en la patogénesis de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y de otras varias enfermedades desmielinizantes (Selmaj y col., J. Neuroimmunol., 56: 135-41, 1995; Renno y col., J. Immunol., 154: 944-53, 1995; Redford y col., Brain, 118: 869-78, 1995; Probert y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11294-8, 1995; y Probert y col., J. Leukoc. Biol., 59: 518-25, 1996).
El GM-CSF, la IL-3 y la IL-4 son potentes mitógenos para los MNPs (Giulian y col., J. Neurosci., 12: 4707-17, 1988c; Giulian y col., Dev. Neurosci., 16: 128-36, 1994; Gebicke-Haerter y col., J. Neuroimmunol., 50: 203-14, 1994; Lee y col., Glia, 12: 309-18, 1994; y Suzumura y col., J. Neuroimmunol., 53: 209-18, 1994) y se cree que inducen una fagocitosis más rápida de la mielina (Giulian y col., J. Neurosci., 12: 4707-17, 1988c y Smith, M.E., J. Neurosci. Res., 5: 480-487, 1993), que contribuye a la patogénesis de enfermedades inflamatorias autoinmunes (Giulian y col., J. Neurosci., 12: 4707-17, 1988c; Giulian y col., Dev. Neurosci., 16: 128-36, 1994; Gebicke-Haerter y col., J. Neuroimmunol., 50: 203-14, 1994; Lee y col., Glia, 12: 309-18, 1994; Suzumura y col., J. Neuroimmunol., 53: 209-18, 1994; y Smith, M.E., J. Neurosci. Res., 5: 480-487, 1993). Por ejemplo, se ha demostrado en pacientes de SIDA la regulación por incremento específica de MNP de los receptores de TNF-\alpha (Dickson y col., Glia, 7: 75-83, 1993; y Sippy y col., J. Acquir. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 511-21, 1995) y se ha demostrado la regulación por incremento de receptores del GM-CSF en un modelo animal de lesión nerviosa facial (Raivich y col., J. Neurosci. Res., 30: 682-6, 1991). Además, la microglía recién activada y los macrófagos infiltrantes incrementan la expresión del receptor secuestrador de lipoproteínas de baja densidad (LDL)/macrófagos en traumas o enfermedades del SNC (Christie y col., Am. J. Pathol., 148: 399-403, 1996; Elkhoury y col., Nature, 382: 716-19, 1996; Giulian, D., J. Neurosci. Res., 18: 155-171, 1987; Giulian y col., J. Neurosci., 13: 29-37, 1993a; y Bell y col., J. Neurocytol., 23: 605-13, 1994), que se cree que es el responsable de la actividad fagocítica incrementada en estas condiciones.
Los MNPs y los leucocitos están también implicados en la patofisiología (que implica el daño tisular secundario) asociada con varias enfermedades inflamatorias que no son del SNC, incluyendo varias enfermedades neoplásicas, cutáneas, oculares, renales, pulmonares e inflamatorias de las articulaciones. Las citoquinas y las quimioquinas contribuyen decisivamente a la modulación de estas respuestas (Furie y Randolph, Am. J. Pathol., 146: 1287-301, 1995; Baggiolini y col., Adv. Immunol., 55: 97-179, 1994; Schall y col., Current Biol., 6: 865-73, 1994; Howard y col., Trends Biotechnol., 14: 46-51, 1996; Strieter y col., J. Immunol., 156: 3583-86, 1997; Taub y col., Ther. Immunol., 1: 229-46, 1994; Driscoll y col., Environ. Health Perspect., 105: Suplemento 5: 64: 1159-64, 1997).
En las enfermedades de tumores sólidos, se ha demostrado que los MNPs inducen la angiogénesis tumoral (Leek y col., J. Leukoc. Biol., 56: 423-35, 1994; Sunderkotter y col., J. Leukoc. Biol., 55: 410-22, 1994) y se ha encontrado que son el componente principal del infiltrado linforreticular de varias formas de tumores sólidos, y que constituyen cerca del 50% de la masa celular en carcinomas mamarios (Lewis y col., J. Leukoc. Biol., 57: 747-51, 1995).
Los MNPs, incluyendo la microglía, están también implicados en la patogénesis de enfermedades oculares incluyendo retinopatías vitreorretinales proliferativas (Weller y col., Exp. Eye Res., 53: 275-81, 1991; Charteris y col., Ophthalmology, 100: 43-46, 1993) como lo están los niveles elevados de citoquinas y quimioquinas, incluyendo IL-2, IL-6, IFN-\gamma, IL-8 y MCP-1 (Abu el Asrar y col., Am. J. Ophthalmol., 123: 599-606, 1997; Aksunger y col., Ophthalmologica, 211: 223-5, 1997; Kernova y col., Eur. J. Ophthalmol., 7: 64-67, 1997). Las observaciones descritas anteriormente demuestran que varios estados de enfermedad inflamatoria, incluyendo la patología de las lesiones de la médula espinal, están asociados con la proliferación, migración o actividad fisiológica de tipos celulares que estimulan el daño tisular secundario.
Tratamiento del daño tisular secundario y de otras patologías inflamatorias
El tratamiento actual del daño tisular secundario y de otros estados de enfermedad asociados y de los estados de enfermedades inflamatorias no está bien desarrollado. Modelos animales han demostrado que el tratamiento con colchicina disminuye el número de MNPs en el tejido dañado y ayuda a bloquear la astrogliosis y la neovascularización además de la inhibición de la fagocitosis y de las funciones secretoras (Giulian y col., J. Neurosci., 9: 4416-29, 1989; Giulian y col., Ann. Neurol., 27: 33-42, 1990; y Giulian y col., J. Neurosci., 13: 29-37, 1993). La colchicina, sin embargo, no es una toxina selectiva y, por consiguiente, no se considera un producto terapéutico viable para el tratamiento de humanos. Las aproximaciones farmacológicas actuales al tratamiento de SCI y a la prevención del daño tisular secundario se centran alrededor de acontecimientos bioquímicos individuales que tienen lugar a nivel celular, por ejemplo, la inhibición de las acciones citotóxicas de los aminoácidos excitatorios o de las especies reactivas de oxígeno utilizando antagonistas de NMDA y secuestradores de radicales libres (Faden y col., Trends Pharmacol. Sci., 13: 29-35, 1992; y McIntosh, T.K., J. Neurotrauma, 10: 215-61, 1993). Pocos fármacos han demostrado un efecto profundo sobre el daño tisular secundario. Los fármacos utilizados actualmente para tratar el daño secundario en SCI son el esteroide metilprednisolona y sus derivados 21 aminoesteroides sintéticos (lazaroides) (por ejemplo, trisilazad), que actúan como secuestradores de radicales libres de oxígeno. Estos fármacos son utilizados para inhibir la peroxidación de los lípidos de la membrana. Se cree, sin embargo, que los efectos colaterales no deseados de los lazaroides incluyen la inducción de gliosis, que ha sido observada en un modelo animal de SCI (Gonzalez-Deniselle y col., Cell Mol. Neurobiol., 16: 61-72, 1996), y la pérdida de la función motora y sensorial según se observó en humanos con heridas penetrantes en la médula espinal (Prendergast y col., J. Trauma, 37: 576-9, 1994). Los esteroides son también el fármaco terapéutico de elección para la mayoría de enfermedades inflamatorias, pero sus efectos beneficiosos están ampliamente dificultados por los efectos colaterales debilitantes, de tal manera que un tratamiento con esteroides de larga duración no es una opción clínica viable. Por tanto, ninguno de los tratamientos disponibles trata satisfactoriamente estas enfermedades y trastornos.
Por tanto, existe la necesidad de una aproximación más lograda para tratar eficazmente estados de enfermedades inflamatorias asociados con la proliferación, migración y/o actividad fisiológica de células que estimulan las respuestas inflamatorias, incluyendo el daño tisular secundario, y para tratar el daño tisular secundario.
Roby y col. (Oncology Reports Vol. 3, 1996, páginas 175-179) describen la conjugación de MGSA/GRO\alpha a daunorrubicina y proponen su utilización para quimioterapia del melanoma. En particular, Roby y col. proponen la utilización de MGSA/GRO\alpha para la administración vectorizada de un agente quimioterapéutico a células de melanoma, que son células tumorales. Sin embargo, Roby y col. no describen ni sugieren la administración vectorizada a leucocitos.
WO 95/12414 proporciona conjugados de PF4 con una citotoxina para el tratamiento de enfermedades angiogénicas mediante la vectorización de una toxina hacia células endoteliales e, inhibiendo presumiblemente de este modo la angiogénesis no deseada. Sin embargo, WO 95/12414 no sugiere la utilización de quimioquinas para vectorizar agentes hacia leucocitos activados o hacia otras células inmunoefectoras activadas.
Es por tanto un objeto de la presente proporcionar composiciones para tales tratamientos.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona conjugados como los referidos en la reivindicación 65. Se proporcionan también usos como los referidos en las reivindicaciones 1, 55, 61. Más específicamente, en la presente se proporcionan composiciones para tratar estados de enfermedad asociados con la activación, proliferación y migración de células inmunoefectoras, incluyendo células que estimulan el daño tisular secundario. En particular, las composiciones proporcionadas en la presente son para el tratamiento de estos estados de enfermedad mediante la administración de una cantidad eficaz de un agente terapéutico que inhibe la activación, proliferación y/o migración de estas células inmunoefectoras diana. Preferiblemente, el agente terapéutico es directamente tóxico para tales células. Las células inmunoefectoras diana incluyen, pero no se limitan a, fagocitos mononucleares (MNPs), tales como células dendríticas, microgliales, monocitos y macrófagos; leucocitos tales como basófilos, neutrófilos y eosinófilos; y linfocitos tales como las células destructoras naturales y los linfocitos T y B.
Se proporcionan también agentes terapéuticos que pueden ser utilizados en estos métodos. Estos agentes son conjugados ligando-toxina que contienen un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas y un agente vectorizado. El agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se dirige a células que expresan receptores de quimioquinas. Tales células incluyen células inmunoefectoras implicadas en las respuestas inflamatorias, incluyendo las células que estimulan el daño tisular secundario. En una realización, el ligando-toxina quimérico incluye una toxina celular y un resto ligando proteináceo, o un fragmento biológicamente funcional de los mismos, tal como una quimioquina o una citoquina no quimioquina específica para una o más células estimulantes del daño tisular secundario. Se proporcionan también los conjugados que contienen un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas.
Se proporcionan conjugados que contienen uno o más agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas ligados, directamente o a través de un adaptador, a uno o más agentes vectorizados. En particular, los conjugados proporcionados en la presente contienen los componentes siguientes: (agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas)_{n}, (L)_{q} y (agente vectorizado)_{m} en los que al menos un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, tal como un péptido quimioquina o un anticuerpo específico del receptor de quimioquinas, o una porción eficaz de los mismos, está unido directamente o a través de uno o más adaptadores (L) a al menos un agente vectorizado. L se refiere a un adaptador. Se contempla cualquier asociación adecuada entre los elementos del conjugado, siempre que el conjugado resultante interaccione con un receptor diana de tal manera que tenga lugar la internalización de un agente vectorizado asociado. Además de un agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas, estos conjugados pueden contener también una citoquina que no sea una quimioquina. Tales citoquinas que no son quimioquinas son seleccionadas generalmente de entre aquéllas que se unen a células inmunoefectoras, particularmente a las poblaciones de leucocitos, a las cuales se une un tipo de quimioquina.
Las variables n y m son números enteros, 1 o mayor, y q es 0 o cualquier número entero. Las variables n, q y m son seleccionadas de tal manera que el conjugado resultante interacciona con el receptor diana y un agente vectorizado es internalizado por una célula a la que ha sido dirigido. Típicamente, n está entre 1 y 3; q es 0 o mayor, dependiendo del número de agentes vectorizantes y vectorizados unidos y/o de las funciones del adaptador, q es generalmente de 1 a 4; m es 1 o más, generalmente 1 ó 2. Cuando está presente más de un agente vectorizado en un conjugado, los agentes vectorizados pueden ser los mismos o diferentes. De manera similar, cuando está presente en los conjugados más de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, pueden ser iguales o diferentes.
Los conjugados proporcionados en la presente pueden ser producidos como proteínas de fusión, pueden ser acoplados químicamente o incluir una porción de una proteína de fusión y una porción unida químicamente, o cualquier combinación de los mismos. Para los fines de la presente, el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es cualquier agente, típicamente un polipéptido, que interaccione específicamente con un receptor de quimioquinas, tal como los presentes en leucocitos, y que después de la interacción con el receptor, internalice un agente vectorizado unido o asociado de otro modo, tal como un agente citotóxico u otro producto terapéutico destinado a ser internalizado por la célula diana. Los agentes vectorizantes dirigidos a receptores de quimioquinas actualmente preferidos incluyen, pero no se limitan a, los mostrados en la Tabla 1 más adelante. Los conjugados proporcionados en la presente aprovechan la distribución limitada de los receptores de quimioquinas y su localización en células asociadas con respuestas inflamatorias, particularmente las asociadas con el daño tisular secundario, y las respuestas patológicas asociadas con ciertos estados de enfermedad. Las ventajas de los conjugados proporcionados en la presente incluyen la selección de las quimioquinas y de otros agentes semejantes como los agentes vectorizantes, que se unen a poblaciones celulares relativamente pequeñas que están asociadas con trastornos inflamatorios o con procesos inflamatorios. En virtud de la distribución y especificidad de tales receptores en tales poblaciones celulares, los conjugados pueden ser utilizados para proporcionar la administración dirigida a células y tejidos seleccionados de cualquier agente ligado, incluyendo agentes tóxicos para producir la muerte de las células, inhibir la proliferación o incrementar o facilitar la supervivencia de las células diana. Se comprende que la descripción anterior no representa el orden en el que cada componente es ligado ni la manera en la que cada componente es ligado. El agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas y el agente vectorizado (o el adaptador y el agente vectorizado) pueden ser ligados en cualquier orden y mediante cualquier enlace apropiado, siempre que el conjugado resultante se una a un receptor al que se une una quimioquina e internalice el(los) agente(s) vectorizado(s) en las células que llevan el receptor. El agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas es típicamente un polipéptido y puede ser ligado al agente vectorizado o al adaptador en o cerca de su extremo N, o en o cerca de su extremo C, o en cualquier locus interno. Actualmente, se prefieren los conjugados en los que el agente vectorizado está unido, directamente o a través de un adaptador, en o cerca, a una distancia de veinte aproximadamente, preferiblemente diez aminoácidos, del extremo amino de la quimioquina. Un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas puede estar ligado a más de un agente vectorizado; alternativamente, más de un agente vectorizado puede estar ligado a más de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas. Cuando se ligan múltiples agentes vectorizantes y/o agentes vectorizados, pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, cuando una quimioquina es un agente vectorizante, el agente vectorizado está unido al extremo C de la quimioquina.
Se proporcionan conjugados que contienen una pluralidad de agentes vectorizantes y/o agentes vectorizados. Se proporcionan también, por tanto, conjugados que contienen una pluralidad, generalmente al menos dos, agentes vectorizantes quimioquinas ligados a uno o más agentes vectorizados. Estos conjugados que contienen varios agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas y varios agentes vectorizados pueden ser producidos uniendo múltiples copias del ácido nucleico que codifica el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas como una proteína de fusión, preferiblemente cabeza con cabeza y/o cola con cola, bajo el control transcripcional de una única región promotora. Por ejemplo, (ver, por ejemplo, la Figura 1), se proporcionan proteínas de fusión en las que una toxina está unida en su extremo amino al extremo carboxi de un resto quimioquina, representadas por la fórmula: agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas-adaptador-toxina. Se proporcionan también, por ejemplo, proteínas de fusión en las que una toxina está unida en su extremo amino y en su extremo carboxi al extremo carboxi de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas. Los dos agentes vectorizantes dirigidos al receptor de quimioquinas pueden ser iguales o diferentes. Estas proteínas de fusión están representadas por la fórmula: agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas-adaptador-toxina-agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas. Actualmente se prefieren los conjugados que contienen una o dos proteínas que se unen al receptor de quimioquinas. Cuando se emplea una segunda proteína que se une al receptor de quimioquinas, ésta es ligada a través de su extremo carboxi al extremo vacante de la toxina. Se proporciona otra combinación de elementos en la que uno o una pluralidad de agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas están unidos a uno o a una pluralidad de agentes vectorizados. Según se señaló anteriormente, los conjugados pueden incluir además una citoquina que no sea una quimioquina.
Los conjugados pueden ser producidos mediante conjugación química o por la expresión de proteínas de fusión en las cuales, por ejemplo, ADN que codifica un agente vectorizado, tal como una proteína inactivadora de ribosomas (RIP), con o sin una región adaptadora, está unido a ADN que codifica un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas. Los conjugados pueden ser también producidos mediante acoplamiento químico, típicamente a través de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína presentes o añadidos a los componentes, o a través de enlaces amida o de otros enlaces adecuados. Se contemplan también enlaces iónicos u otros enlaces. Son de particular interés los conjugados de la forma agente vectorizado-(L)_{q}-resto que se une al receptor de quimioquinas-(L)_{q}-resto que se une al receptor de quimioquinas.
El agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas es cualquier agente que se una específicamente a un receptor al que se unen específicamente quimioquinas. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, quimioquinas, anticuerpos y fragmentos de quimioquinas y anticuerpos que conservan la capacidad de interaccionar con el receptor y efectuar la internalización de un agente vectorizado asociado o unido. Estos agentes no incluyen citoquinas que no sean quimioquinas, tales como IL-4, CSFs y otras citoquinas que no se unen típicamente de manera específica a los receptores de quimioquinas. Cuando los agentes vectorizantes son anticuerpos, los anticuerpos son seleccionados de entre aquéllos que son específicos para receptores de quimioquinas, y preferiblemente de entre aquéllos que antagonizan la unión de una quimioquina a un receptor de quimioquinas, sirviendo de este modo no sólo para internalizar agentes ligados, sino también para inhibir competitivamente la unión de una quimioquina.
El agente vectorizado es cualquier agente para el que se desea la administración dirigida a una población seleccionada de células o a un tejido seleccionado. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, un agente citotóxico, particularmente proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs), nucleasas de ADN y ARN, incluyendo ciertas RIPs y bacteriocinas, tales como las colicinas de E. coli y otras toxinas, o un ácido nucleico, o un fármaco tal como metotrexato, destinados a ser internalizados por una célula que expresa un receptor al que se une un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas e internaliza un agente vectorizado unido o asociado, cualquier molécula que cuando es internalizada altere el metabolismo o la expresión génica en la célula, regule o altere la síntesis de proteínas, inhiba la proliferación o destruya la célula. Otros agentes semejantes incluyen, pero no se limitan a, porfirinas activadas por luz y ácidos nucleicos antisentido que tienen como resultado la inhibición del crecimiento o la muerte de las células; y ARN antisentido, ADN y proteínas truncadas que alteren la expresión génica a través de interacciones con el ADN, o la cosupresión u otro mecanismo. En ciertas realizaciones, el agente citotóxico es una proteína inactivadora de ribosomas (RIP), tal como, por ejemplo, saporina, ricina, toxina de Shiga, aunque pueden ser también utilizados de manera ventajosa otros agentes citotóxicos. Por tanto, el agente vectorizado es cualquier agente destinado a ser internalizado por una célula seleccionada que expresa un receptor con el que interacciona, típicamente se une, un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, y después de tal interacción realiza la internalización del agente vectorizado unido o asociado.
Los agentes vectorizados pueden ser también modificados para convertirlos en más adecuados para la conjugación con el adaptador y/o con el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, o para incrementar su actividad intracelular. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, la introducción de un residuo de Cys en o cerca del extremo N o del extremo C, la derivatización para introducir grupos reactivos, tales como grupos tiol, y la adición de señales de selección, tales como (XaaAspGluLeu)_{n} (SEC ID Nº 68, en la que Xaa es Lys o Arg, preferiblemente Lys, y n es de 1 a 6, preferiblemente 1-3, en, preferiblemente, el extremo carboxi (ver, por ejemplo, Seetharam y col. (1991) J. Biol. Chem., 266: 17376-17381; y Buchner y col. (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270), que dirigen el agente vectorizado al retículo endoplásmico.
El adaptador es un péptido o un no péptido y puede ser seleccionado para suprimir o disminuir el impedimento estérico causado por la proximidad del agente vectorizado al agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas y/o para incrementar o alterar otras propiedades del conjugado tales como la especificidad, toxicidad, solubilidad, estabilidad en suero y/o disponibilidad intracelular del resto vectorizado y/o para incrementar la flexibilidad del enlace entre el resto polipeptídico que se une al receptor de quimioquinas y el agente vectorizado, o para reducir el impedimento estérico.
Cuando se contemplan proteínas de fusión, el adaptador es seleccionado de tal manera que el nucleótido resultante codifique una proteína de fusión que se una a, y que sea internalizada por, células que expresan un receptor de quimioquinas y toda o una porción de la proteína internalizada se dirige preferiblemente hacia el citoplasma. Se contempla también que pueden unirse varios adaptadores con el fin de utilizar las propiedades ventajosas de cada adaptador. El tal caso, la porción de adaptador del conjugado puede contener más de 50 residuos de aminoácidos. El número de residuos no es importante siempre que la proteína de fusión resultante se una a un receptor de quimioquinas e internalice el agente vectorizado ligado a través de una ruta que conduzca al agente vectorizado hacia el citoplasma y/o hacia el núcleo.
Los adaptadores más preferidos son aquéllos que pueden ser incorporados en proteínas de fusión y expresados en una célula huésped, tal como E. coli. Tales adaptadores incluyen: sustratos enzimáticos, tales como el sustrato de catepsina B, el sustrato de catepsina D, un sustrato de tripsina, un sustrato de trombina, un sustrato de subtilisina, un sustrato del Factor Xa y un sustrato de enteroquinasa; los adaptadores que incrementan la solubilidad, flexibilidad y/o la susceptibilidad de corte intracelular incluyen adaptadores tales como (gly_{m}ser)_{n} y (ser_{m}gly)_{n}, en los cuales m es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 2 a 4 y n es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 2 a 4 (ver, por ejemplo, la Solicitud de PCT Internacional Nº WO 96/06641, que proporciona ejemplos de adaptadores para ser utilizados en conjugados). En algunas realizaciones, pueden incluirse varios adaptadores con el fin de aprovechar las propiedades deseadas de cada adaptador.
Se proporcionan también conjugados en los que los agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas, tales como quimioquinas, han sido modificados tal como mediante eliminación de uno o más residuos de cisteína. En general, las cisteínas conservadas cerca de los extremos N de las quimioquinas son importantes para la actividad; otras cisteínas pueden ser sustituidas. Debe tenerse cuidado para evitar alterar la especificidad de la quimioquina modificada resultante, a no ser que se desee tal alteración. En todos los casos, pueden determinarse empíricamente modificaciones particulares.
Las composiciones que contienen tales conjugados deben presentar una agregación reducida. Se proporcionan también conjugados en los que el resto vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas y/o el agente vectorizado han sido modificados por la adición de una cisteína (Cys)3, en o cerca de un extremo, que es unida a un adaptador o a un agente vectorizado mediante métodos químicos.
Se proporcionan métodos para la preparación de los conjugados. Estos métodos incluyen métodos de conjugación química y métodos que se basan en la producción recombinante de los conjugados. Los métodos químicos se basan en la derivatización del agente vectorizado con el agente de unión deseado, y la reacción posterior con un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas. Los métodos químicos de derivatización son particularmente útiles para unir un resto de proteína vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas a ADN o a ARN, y para producir conjugados de la forma agente vectorizado-(L)_{q}-agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas. En la práctica del método químico, un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas que es producido por cualquier medio, típicamente por la expresión de ADN en un huésped bacteriano o eucariótico, es acoplado químicamente con el agente vectorizado. Si el agente vectorizante o el agente vectorizado no contiene restos adecuados para llevar a cabo un enlace químico, puede ser derivatizado. Por ejemplo, el agente, tal como la toxina de Shiga, gelonina u otro agente semejante, puede ser derivatizado tal como por reacción con un agente de unión tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP). En otras realizaciones, el agente vectorizado, tal como la cadena A de Shiga, es modificado en o cerca del extremo N para que incluya un residuo de cisteína, de tal manera que el agente modificado resultante puede reaccionar con el resto proteico que se une al receptor de quimioquinas sin derivatización posterior.
El método recombinante para la producción de conjugados se basa en la expresión de un ácido nucleico que codifica un agente peptídico vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas unido a un ácido nucleico que codifica un adaptador, o, en los casos en los que el agente vectorizante es una proteína o un polipéptido, a un ácido nucleico que codifica el agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas unido directamente o a través de un ácido nucleico que codifica un adaptador a un ácido nucleico que codifica un agente vectorizado. Después de la introducción en un huésped adecuado y de la expresión del ácido nucleico, se expresa el agente polipeptídico vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas, el agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas con un adaptador o el agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas unido a través de un adaptador o directamente a un agente proteico o polipeptídico vectorizado. La combinación de la proteína vectorizante dirigida al receptor de quimioquinas, el adaptador y el agente ligado, o cualquier subgrupo o variación de la misma, es preparada como una quimera utilizando técnicas de ADN recombinante. La molécula de la proteína de fusión es diseñada y producida de tal manera que la porción del agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas está disponible para el reconocimiento de su receptor respectivo en la superficie celular y puede dirigir el conjugado hacia las células que llevan tal receptor en la superficie celular y efectuar la internalización de cualquier agente vectorizado ligado o asociado. Cuando se emplea expresión recombinante, particularmente cuando se utilizan huéspedes bacterianos, la forma preferida de los conjugados es agente vectorizante quimioquina-(L)_{q}-agente vectorizado (esto es, ligando-adaptador opcional-toxina), en la que el agente vectorizado está unido al extremo C de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, con o sin uno o más restos adaptadores, y con o sin uno o más agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas adicionales ligados al agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas y/o al agente vectorizado. En un ejemplo de realización, un conjugado con una pluralidad de agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas y/o de agentes vectorizados, es de la forma N-ligando-C-(adaptador opcional)-N-agente vectorizado-C-(adaptador opcional)-C-ligando-N, donde N y C se refieren al extremo amino y al extremo carboxi de un polipéptido, respectivamente, y el ligando se refiere al agente vectorizante quimioquina.
Los conjugados resultantes proporcionados en la presente pueden ser utilizados en composiciones farmacéuticas y en métodos de tratamiento. Los trastornos preferidos para ser tratados son condiciones inflamatorias patofisiológicas. En tales condiciones los conjugados, en virtud del agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas unido, son dirigidos hacia células que llevan receptores de quimioquinas seleccionados. Si es vectorizado un resto citotóxico, la internalización del conjugado tiene como resultado la inhibición de la proliferación o la muerte de las células. Tales condiciones patofisiológicas incluyen, por ejemplo, leucocitos asociados con el daño tisular secundario, leucocitos asociados con tumores sólidos y leucocitos y células asociados con otras respuestas inflamatorias indeseables. En particular, el daño tisular secundario y los estados de enfermedad asociados pueden ser tratados mediante la administración a sujetos que lo necesiten de una cantidad eficaz de los conjugados proporcionados en la presente que inhiba la proliferación, migración o actividad fisiológica de las células que estimulan el daño tisular secundario, tales como los fagocitos mononucleares (MNP), los leucocitos, las células destructoras naturales, las células dendríticas y los linfocitos T y B. Los conjugados proporcionados en la presente pueden ser diseñados para que sean directamente tóxicos para tales células y específicos para un receptor diana similar a rodopsina, de siete dominios transmembranales, acoplado a proteína G, particularmente un receptor de quimioquinas seleccionado, en la superficie de tales células. Los conjugados se unen a estos receptores y son captados por las células diana. Una vez dentro de las células, el agente terapéutico puede desorganizar las actividades celulares normales y suprimir de este modo las actividades biológicas de tales células, o producir la muerte celular. Se proporcionan métodos de tratamiento utilizando tales conjugados.
El tratamiento es efectuado mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado en, por ejemplo, un excipiente fisiológicamente aceptable. Los conjugados pueden ser utilizados también en métodos de terapia génica para administrar un ácido nucleico que codifique copias correctas de genes defectuosos o agentes terapéuticos, tal como TNF, a células portadoras de receptores de quimioquinas.
Un conjugado típico es una proteína de fusión que contiene un resto que es un ligando que se une a un receptor conectado a una toxina celular a través de un adaptador peptídico. El ligando puede estar unido al extremo carboxi o al extremo amino de la toxina. Al unirse al receptor de la superficie celular apropiado, la proteína de fusión es internalizada y el resto toxina es liberado enzimáticamente para destruir a la célula huésped. La proteína de fusión debe alcanzar el dominio intracelular para presentar citotoxidad, y la toxina libre no tiene capacidad funcional inherente para atravesar la membrana celular.
Los estados de enfermedad adecuados para tratamiento utilizando los métodos y conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, lesiones del SNC, enfermedades inflamatorias del SNC, trastornos neurodegenerativos, enfermedades inflamatorias de los ojos, enfermedades intestinales inflamatorias, enfermedades inflamatorias de las articulaciones, enfermedades inflamatorias del riñón o renales, enfermedades inflamatorias pulmonares, enfermedades inflamatorias nasales, enfermedades inflamatorias del tiroides, cánceres regulados por citoquinas. Es de particular interés el tratamiento de lesiones y traumas de la médula espinal.
Por consiguiente, en un aspecto de las composiciones y de sus utilizaciones terapéuticas aquí proporcionadas, los agentes terapéuticos utilizados son quimeras ligando-toxina que incluyen un resto que es un ligando proteináceo tal como una quimioquina, interleuquina, linfoquina, monoquina, factor estimulante de colonias o una proteína asociada a un receptor que reconoce específicamente los receptores contemplados, unido a una toxina celular tal como un agente que corta ADN, un antimetabolito o una toxina celular proteinácea, por ejemplo una toxina bacteriana, vegetal, de insecto, serpiente o araña. Las quimeras ligando-toxina son formuladas para vías de administración seleccionadas incluyendo, pero no limitándose a, tópicamente, intraarticularmente, intracisternalmente, intraocularmente, intraventicularmente, intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, intratraquealmente, intraperitonealmente e intradérmica-
mente.
Por tanto, en la presente se proporcionan conjugados agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas-toxina, referidos en la presente como conjugados quimioquina-toxina, en los que el resto ligando es preferiblemente una quimioquina o un fragmento biológicamente activo de la misma, que está unida a un agente vectorizado que es preferiblemente una toxina celular. Por ejemplo, el conjugado puede ser una proteína de fusión que tiene un ligando quimioquina unido a una toxina celular proteinácea mediante un adaptador polipeptídico de un tamaño seleccionado, de tal manera que el conjugado interacciona con el receptor seleccionado y efectúa la internalización de los agentes vectorizados ligados. Tal adaptador peptídico tiene típicamente de 2 aproximadamente a 60 residuos de aminoácidos aproximadamente.
En los métodos de la presente pueden utilizarse también conjugados de citoquinas que no sean quimioquinas. Estas citoquinas que no son quimioquinas son seleccionadas de entre aquéllas que se unen a receptores presentes en células, tales como leucocitos, implicadas en respuestas inflamatorias indeseables, tales como el daño tisular secundario, cuyo tratamiento se contempla en la presente.
Además, los conjugados que contienen los agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas pueden ser administrados en combinación con otras terapias para la respuesta inflamatoria y/o el trastorno subyacente. Por ejemplo, un conjugado proporcionado en la presente, que está dirigido a leucocitos que se infiltran en tumores puede ser administrado en combinación con un conjugado, tal como un conjugado IL-4-toxina, que sirve para tratar los tumores. La terapia de combinación puede ser efectuada simultáneamente, secuencialmente o intermitentemente.
Las composiciones y sus utilizaciones terapéuticas aquí proporcionadas poseen numerosas ventajas, entre éstas está la ventaja de que la toxina celular es dirigida específicamente a las células responsables de los estados de enfermedad inflamatoria, tal como el daño tisular secundario, minimizando de este modo el daño y la toxicidad para las células no implicadas. Como las composiciones pueden ser administradas localmente y específicamente, puede conseguirse una concentración mayor y más eficaz de la toxina celular en la región a tratar que mediante la administración sistémica de una toxina celular.
Según se señaló anteriormente, los conjugados proporcionados en la presente pueden ser utilizados también para administrar otros agentes a células que expresan receptores de quimioquinas o receptores a los que se unen selectivamente quimioquinas y efectuar o facilitar la internalización de los agentes asociados.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un dibujo esquemático que muestra una proteína de fusión proporciona en la presente, en la que el "Ligando" es un ligando proteináceo seleccionado de una de las secuencias de aminoácidos del tipo enumerado en la Tabla 3, el "Adaptador" es un resto adaptador proteináceo que tiene la secuencia de aminoácidos Ala-Met, o es seleccionado de polipéptidos tales como los descritos en la presente como SEC ID N^{os}: 1-12, (ver también la Solicitud de PCT Internacional Nº WO 96/06641, que proporciona ejemplos de adaptadores para ser utilizados en conjugados), y la "Toxina" es una toxina celular proteinácea, tal como una toxina celular cuya secuencia de aminoácidos está mostrada en la Tabla 4.
La Figura 2 es un mapa esquemático de un plásmido ejemplar denominado pGEMEX-SAP que codifica un Saporina clonada en una proteína de fusión del vector pGEMEX según se describe en los Ejemplos.
La Figura 3 es un mapa esquemático de un conjugado MCP-3-AM-Shiga-A1 clonado en un vector pGEMEX según se describe en los Ejemplos.
La Figura 4 es un mapa esquemático de un conjugado MCP-1-AM-SAP clonado en un vector pET11c (ver los Ejemplos y la Tabla 6).
La Figura 5 es un mapa esquemático de un conjugado MCP-3-AM-Shiga-A1 clonado en un vector pET11c (ver los Ejemplos y la Tabla 6).
Descripción detallada de la invención Contenido
A. Definiciones
B. La respuesta inflamatoria
C. Componentes de los conjugados
1.
Resumen
2.
Restos vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas
a.
Quimioquinas
b.
Selección de una quimioquina
c.
Citoquinas que no son quimioquinas
d.
Restos ligando que son anticuerpos
3.
Agentes vectorizados
a.
Restos que son toxinas celulares
(1)
Agentes que cortan ADN
(2)
Antimetabolitos
(3)
Toxinas celulares proteináceas
(4)
Toxinas bacterianas
(5)
Porfirinas y otras toxinas activadas por luz
b.
Ácidos nucleicos para administración vectorizada
(1)
Nucleótidos antisentido, incluyendo: oligonucleótidos antisentido; moléculas tricatenarias; oligonucleótidos con forma de pesa; ADN; oligonucleótidos que se unen a proteínas extracelulares y moléculas de nucleótidos pequeñas
(2)
Ribozimas
(3)
Ácidos nucleicos que codifican productos terapéuticos para su administración vectorizada
(4)
Acoplamiento de ácidos nucleicos a proteínas
4.
Restos adaptadores
a.
Reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales
b.
Adaptadores susceptibles de ser cortados por ácido, fotocortables y sensibles al calor
c.
Otros adaptadores
d.
Adaptadores peptídicos
D. Preparación de conjugados
1.
Producción de proteínas de fusión
a.
Plásmidos y células huésped para la expresión de construcciones que codifican agentes peptídicos vectorizantes que están dirigidos a un receptor de quimioquinas, conjugados, adaptadores, proteínas de fusión y agentes vectorizados peptídicos
b.
Clonaje y expresión de una proteína de fusión ligando-toxina quimérica
c.
Construcción y expresión de genes de fusión de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas-toxina ejemplares
2.
Producción de conjugados químicos
E. Modelos animales para analizar los conjugados
F. Formulación y administración de composiciones que contienen los conjugados
G. Estados de enfermedad asociados con la respuesta inflamatoria y el daño tisular secundario
A. Definiciones
A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es comprendido comúnmente por una persona con experiencia en la técnica a la que pertenece la materia en cuestión descrita en la presente.
Según se utiliza en la presente, un conjugado se refiere a los compuestos aquí proporcionados que incluyen uno o más agentes vectorizantes que están dirigidos a un receptor de quimioquinas (referidos también en la presente como agentes que se unen a un receptor de quimioquinas) y un agente vectorizado. Estos conjugados son también referidos en la presente como quimioquina-toxinas, e incluyen los producidos por medios recombinantes como proteínas de fusión, los producidos por medios químicos y los producidos por cualquier otro método mediante el cual al menos un resto que se une a un receptor de quimioquinas es ligado, directa o indirectamente, a un agente vectorizado, por lo que después de la unión a un receptor de quimioquinas el agente vectorizado es internalizado en la célula diana. Por tanto, un conjugado se refiere a una molécula que contiene al menos un resto vectorizante que está dirigido a un receptor de quimioquinas y al menos un agente vectorizado que están unidos directamente o a través de un adaptador y que son producidos por métodos de acoplamiento químico o por la expresión recombinante de moléculas quiméricas de ácido nucleico para producir proteínas de fusión.
Según se utiliza en la presente, un agente vectorizante que está dirigido a un receptor de quimioquinas se refiere a cualquier molécula o ligando que se une específicamente a un receptor de quimioquinas en una célula y efectúa la internalización de un agente vectorizado unido o asociado de otro modo. Los restos que se unen al receptor de quimioquinas incluyen, pero no se limitan a, cualquier polipéptido que sea capaz de unirse a una proteína de la superficie celular a la que se dirigiría una quimioquina, y que sea capaz de facilitar la internalización de una proteína de fusión que contiene el ligando en la célula. Tales ligandos incluyen factores de crecimiento, anticuerpos o fragmentos de los mismos, hormonas, quimioquinas, anticuerpos que se unen específicamente a receptores de quimioquinas y efectúan la internalización de cualquier agente vectorizado ligado, y fragmentos de quimioquinas o anticuerpos que realicen esto. La identificación de fragmentos o porciones de anticuerpos que sean eficaces para unirse a los receptores e internalizar los agentes vectorizados ligados puede realizarse empíricamente analizando, por ejemplo, un fragmento ligado a un agente citotóxico y buscando muerte celular utilizando cualquiera de los ensayos para ello descritos en la presente o conocidos por los expertos en la técnica. Por tanto, un agente vectorizante que está dirigido a un receptor de quimioquinas incluye todos los péptidos caracterizados y denominados como citoquinas incluyendo, pero no limitándose a, las clases descritas en la presente y versiones truncadas y porciones de los mismos que sean suficientes para dirigir un agente vectorizado ligado hacia un receptor o proteína de la superficie celular al cual se une específicamente el péptido de longitud completa, y para facilitar o permitir la internalización por la célula sobre la que está presente el receptor o proteína.
Según se utiliza en la presente, la referencia a quimioquinas tiene la intención de incluir las citoquinas quimioatrayentes (quimiotácticas) que se unen a los receptores de quimioquinas e incluye proteínas aisladas de fuentes naturales así como aquéllas producidas sintéticamente, tal como por medios recombinantes o por síntesis química. Ejemplos de quimioquinas incluyen, pero no se limitan a, IL-8, GCP-2, GRO-\alpha, GRO-\beta, GRP-\gamma, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG, PF4, IP-10, SDF-1\alpha, SDF-1\beta, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1\alpha, MIP- 1\beta, MIP-1\gamma, MIP-2, MIP-2\alpha, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, Tim-1, eotaxina-1, eotaxina-2, I-309, SCYA17, TARC, RANTES, DC-CK-1, linfotactina, ALP, lungquina y fractalquina, y otras conocidas por los expertos en la técnica.
Quimioquina incluye también muteínas de quimioquinas que poseen la capacidad de dirigir un agente vectorizado ligado hacia células portadoras de receptores de quimioquinas. Se contemplan también para ser utilizadas en los conjugados muteínas de los agentes vectorizantes que están dirigidos a un receptor de quimioquinas. Tales muteínas tendrán cambios de aminoácidos conservadores, tales como los mostrados a continuación en la Tabla siguiente. El ácido nucleico que codifica tales muteínas se hibridará, a no ser que esté modificado por sustitución de codones degenerados, a ADN bajo condiciones de al menos baja severidad, generalmente de alta severidad, a ADN que codifica una proteína de tipo salvaje. Las muteínas y las modificaciones de las proteínas incluyen también, pero no se limitan a, variaciones alélicas o de especie secundarias e inserciones o deleciones de residuos, particularmente de residuos de cisteína. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos adecuadas son conocidas por los expertos en esta técnica y pueden ser realizadas generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson y col., Molecular Biology of the Gene, 4ª Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224). Tales sustituciones son realizadas preferiblemente de acuerdo con las mostradas a continuación:
Residuo original Sustitución conservadora
Ala (A) Gly; Ser
Arg (R) Lys
Asn (N) Gln; His
Cys (C) Ser; aminoácido neutro
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Ala; Pro
His (H) Asn; Gln
Ile (I) Leu; Val
Leu (L) Ile; Val
Lys (K) Arg; Gln; Glu
Met (M) Leu; Tyr; Ile
Phe (F) Met; Leu; Tyr
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe
Val (V) Ile; Leu
Son permisibles también otras sustituciones y pueden ser determinadas empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservadoras conocidas. Cualquiera de tales modificaciones del polipéptido puede ser realizada por cualquier medio conocido por los expertos en esta técnica.
Están también contempladas muteínas producidas mediante la sustitución de una o más de las cisteínas por serina igual que en la presente, o aquéllas que tienen cualquier otro aminoácido eliminado o sustituido, con la condición de que la proteína resultante tenga la capacidad, como monómero o como dímero, de unirse a células portadoras de receptores de quimioquinas y de ser internalizada después de tal unión o de internalizar un agente vectorizado ligado. Típicamente, tales muteínas tendrán cambios de aminoácidos conservadores, tales como los mostrados en la Tabla anterior. El ácido nucleico que codifica tales muteínas hibridará, a no ser que esté modificado por la sustitución de codones degenerados, bajo condiciones de al menos baja severidad, generalmente de alta severidad, con ADN que codifica una quimioquina, tal como el mostrado en las SEC ID N^{os} 25-28 o un exón del mismo (SEC ID N^{os} 16-24).
Los expertos en la técnica conocen varios ensayos in vitro para la identificación de quimioquinas y de la actividad de quimioquinas, particularmente actividades quimiotácticas (ver, por ejemplo, Walz y col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 149: 755 para identificar quimiotaxis de neutrófilos; Larsen y col. (1989) Science, 243: 1464 y Carr y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3652 para analizar la quimiotaxis de linfocitos; ver también la Solicitud de PCT Internacional Nº WO 99/33990, que describe numerosos ensayos y ejemplifica medios para identificar quimioquinas). Tales ensayos pueden ser utilizados para identificar quimioquinas, quimioquinas modificadas y fragmentos activos de las mismas. Pueden utilizarse ensayos de unión, como los descritos en la presente y conocidos por los expertos en la técnica, para identificar restos que reconocerán específicamente receptores de quimioquinas, y pueden utilizarse ensayos citotóxicos para identificar aquéllas que internalizan también agentes vectorizados ligados o asociados.
Se hace hincapié en que los agentes vectorizantes que son quimioquinas no incluyen agentes tales como citoquinas no quimioquinas, tales como CSFs, TFNs, IL-2, IL-3, IL4 y otros, que no tienen las propiedades de las quimioquinas.
Según se utiliza en la presente, una porción de una quimioquina se refiere a un fragmento o porción de quimioquina que es suficiente, solo o como un dímero con otro fragmento o monómero de quimioquina, para unirse a un receptor al que se unen dímeros de quimioquinas e internalizar un agente vectorizado ligado.
Según se utiliza en la presente, un residuo de aminoácido de una quimioquina es no esencial si un dímero de quimioquina en el que uno o ambos monómeros de quimioquina han sido modificados por deleción del residuo, posee sustancialmente la misma capacidad para unirse a un receptor de quimioquinas e internalizar un agente ligado que el dímero con el(los) aminoácido(s).
Según se utiliza en la presente, un ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido quimioquina se refiere a cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico mostrados en la presente como codificadores de tales péptidos, a cualquiera de tales fragmentos de ácido nucleico conocido por los expertos en la técnica, a cualquier fragmento de ácido nucleico que codifique una quimioquina que se una a un receptor de quimioquinas y que sea internalizada de este modo y puede ser aislado de una biblioteca de células humanas utilizando cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico precedentes como sonda, o cualquier fragmento de ácido nucleico que codifique cualquiera de los péptidos quimioquinas conocidos, incluyendo los mostrados en las SEC ID N^{os} 25-28, y cualquier fragmento de ADN que pueda ser producido a partir de cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico precedentes por sustitución de codones degenerados. Se comprende que una vez que están disponibles para los expertos en esta técnica la secuencia de aminoácidos completa de un péptido, tal como un péptido quimioquina, y un fragmento de ácido nucleico que codifica tal péptido, es rutinario el sustituir codones degenerados y producir cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico posibles que codifican tal péptido. Es también generalmente posible sintetizar el ácido nucleico que codifica tal péptido sobre la base de la secuencia de aminoácidos.
Según se utiliza en la presente, condición patofisiológica mediada por quimioquinas se refiere a una condición nociva caracterizada o causada por la proliferación de células que son sensibles a la estimulación mitogénica, a la estimulación proliferativa y/o a la actividad atrayente de quimioquinas.
Según se utilizan en la presente, los receptores de quimioquinas se refieren a receptores que interaccionan específicamente con un miembro que existe de manera natural de la familia de proteínas quimioquinas y lo transportan a una célula portadora de tales receptores. Éstos incluyen, pero no se limitan a, los cinco receptores (CXCR1-5) a los que se unen las quimioquinas CXC y los nueve receptores (CCR1-9) a los que se unen las quimioquinas CC, y cualquier otro receptor al que se unirá específicamente cualquier quimioquina y facilitará la internalización de un agente vectorizado ligado.
Según se utiliza en la presente, un agente vectorizado es cualquier agente que se desea internalizar mediante unión a un resto vectorizante, según se define en la presente, y que después de la internalización altera o influye de alguna manera sobre el metabolismo celular, el crecimiento, la actividad, la viabilidad u otra propiedad o característica de la célula. Los agentes vectorizados son preferiblemente agentes terapéuticos, incluyendo agentes citotóxicos, e incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polipéptidos, moléculas orgánicas, fármacos, ácidos nucleicos y otras moléculas similares. Las marcas, tales como restos fluorescentes unidos a una quimioquina o a una porción de la misma, no están contempladas como incluidas en la definición de un agente vectorizado contemplado en la presente.
Según se utiliza en la presente, dirigir un agente vectorizado significa dirigirlo a una célula que expresa un receptor seleccionado mediante la unión del agente a un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas. Después de la unión al receptor, el agente vectorizado o el agente vectorizado unido al resto que se une al receptor de quimioquinas es internalizado por la célula.
Según se utiliza en la presente, un agente vectorizado es cualquier agente que se desea internalizar mediante unión a un resto vectorizante, según se define en la presente, y que después de la internalización altera o influye de alguna manera sobre el metabolismo celular, el crecimiento, la actividad, la viabilidad u otra propiedad o característica de la célula. Los agentes vectorizados incluyen proteínas, polipéptidos, molécula orgánicas, fármacos, ácidos nucleicos y otras moléculas similares.
Según se utiliza en la presente, aunque se reconoce que las quimioquinas son una familia de citoquinas, con las propiedades estructurales y las propiedades biológicas anteriormente descritas, para los fines de la presente, la referencia a "citoquinas" como ligando se refiere a citoquinas que no son quimioquinas. El agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se refiere a quimioquinas, a citoquinas que se unen selectivamente a receptores de quimioquinas, a anticuerpos específicos para tales receptores y a cualquier otro resto que remede la selectividad y la capacidad del receptor para facilitar la internalización de un agente vectorizado ligado de cualquier quimioquina.
Según se utiliza en la presente, el término agente citotóxico se refiere a un agente vectorizado que es capaz de inhibir la función celular. El agente puede inhibir la proliferación o puede ser tóxico para las células. Cualquier agente que cuando es internalizado por una célula interfiera con, o altere nocivamente, el metabolismo celular o inhiba de cualquier manera el crecimiento o la proliferación celular, está incluido dentro del ámbito de este término, incluyendo, pero no limitándose a, agentes cuyos efectos tóxicos están mediados cuando son transportados al interior de la célula y también aquéllos cuyos efectos tóxicos están mediados en la superficie celular. Puede utilizarse una variedad de agentes citotóxicos e incluyen aquéllos que inhiben la síntesis de proteínas y aquéllos que inhiben la expresión de ciertos genes esenciales para el crecimiento o la supervivencia celular. Los agentes citotóxicos incluyen los que tienen como resultado la muerte celular y los que inhiben el crecimiento, la proliferación y/o la diferenciación celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, aquéllos mostrados en las Tablas y Listados de Secuencias de la presente, gelonina, saporina, las ricinas, abrina y otras proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs), citotoxinas derivadas de plantas acuáticas, exotoxina de Pseudomonas, inhibidores de ADN, ARN o de la síntesis de proteínas, tales como ácidos nucleicos antisentido, y otros inhibidores metabólicos, tales como moléculas que cortan ADN y porfirinas activadas por luz, que son conocidos por los expertos en esta técnica. La toxina de Shiga, particularmente la subunidad catalítica de Shiga modificada según es aquí proporcionada, es una toxina preferida en la presente, pero otras RIPs adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Shiga-A1, ricina, cadena A de ricina, saporina, colicinas producidas por E. coli, toxinas similares a Shiga, RIP de maíz, gelonina, toxina diftérica, cadena A de la toxina diftérica, tricosantina, tritina, proteína antiviral de fitolaca (PAP), proteína antiviral de mirabilis (MAP), Diantinas 32 y 30, abrina, monordina, briodina, un inhibidor catalítico de la biosíntesis de proteínas aislado de semillas de pepino (ver, por ejemplo, WO 93/24620), fragmentos citotóxicamente activos de estas citotoxinas y toxinas, y otros conocidos por los expertos en esta técnica. El término RIP es utilizado en la presente para que incluya en general tales citotoxinas, así como otras moléculas citotóxicas que inhiban procesos metabólicos celulares, incluyendo la transcripción, la traducción, rutas biosintéticas o de degradación, síntesis de ADN y otros procesos semejantes, o que destruyan células o inhiban la proliferación celular.
Según se utiliza en la presente, un adaptador es un péptido u otra molécula que une un polipéptido quimioquina al agente vectorizado. El adaptador puede ser unido a través del extremo N o del extremo C o a través de un residuo interno próximo a, típicamente a una distancia de 20 aminoácidos aproximadamente, de cualquier extremo de una quimioquina y/o de un agente vectorizado, si el agente es un polipéptido o un péptido. Los adaptadores utilizados en la presente pueden servir meramente para ligar los componentes del conjugado, para incrementar la disponibilidad intracelular, la estabilidad en suero, la especificidad y la solubilidad del conjugado o para proporcionar una flexibilidad incrementada o para suprimir el impedimento estérico en el conjugado. Por ejemplo, puede conferirse especificidad o disponibilidad intracelular al agente vectorizado mediante la inclusión de un adaptador que sea sustrato para ciertas proteasas, tal como una proteasa que esté presente a niveles más elevados en las células tumorales que en las células normales.
Según se utiliza en la presente, una mitotoxina es una molécula citotóxica vectorizada hacia células específicas por un mitógeno, tal como una quimioquina.
Según se utiliza en la presente, una proteína de fusión se refiere a un polipéptido que contiene al menos dos componentes, tales como un monómero de quimioquina y un agente vectorizado, o un monómero de quimioquina y un adaptador, y que es producida por la expresión de ADN en células huésped.
Según se utiliza en la presente, una modificación que es efectuada sustancialmente cerca del extremo N o del extremo C de un agente citotóxico, tal como la subunidad A de Shiga, o de un monómero de quimioquina, se efectúa generalmente a una distancia de veinte, o preferiblemente de diez, residuos desde el extremo. Tales modificaciones incluyen la adición o eliminación de residuos, tal como la adición de una cisteína para facilitar la conjugación entre el polipéptido reactivo con un receptor de quimioquinas o un fragmento del polipéptido y la porción del agente vectorizado para formar conjugados que contienen una relación molar definida, preferiblemente una relación de 1:1, de agente vectorizado y polipéptido reactivo con un receptor de quimioquina o un fragmento del polipéptido.
Según se utiliza en la presente, el término ácidos nucleicos se refiere a ARN o ADN que se desea sean agentes vectorizados, incluyendo, pero no limitándose a, ADN que codifica proteínas terapéuticas, fragmentos de ADN para cosupresión, ADN que codifica proteínas citotóxicas, ácidos nucleicos antisentido y otras moléculas semejantes. La referencia a ácidos nucleicos incluye ADN bicatenario, ADN de hebra sencilla, ARN de cualquier forma incluyendo ARN tricatenario, bicatenario o de hebra sencilla, ARN antisentido, polinucleótidos, oligonucleótidos, nucleótidos individuales y derivados de los mismos.
Según se utiliza en la presente, un ácido nucleico terapéutico se refiere a un ácido nucleico que es utilizado para llevar a cabo una terapia génica sirviendo como sustituto de un gen defectuoso o codificando un producto terapéutico tal como una hormona, una citoquina, incluyendo citoquinas que no son quimioquinas, y/o un factor de crecimiento. El ácido nucleico terapéutico puede codificar todo un gen o una porción del mismo, y puede funcionar mediante recombinación con el ADN ya presente en una célula, sustituyendo de este modo una porción defectuosa de un gen. Puede codificar también una porción de una proteína y ejercer su efecto en virtud de la cosupresión de un producto génico.
Según se utiliza en la presente, antisentido describe cualquiera de varios métodos y los ácidos nucleicos utilizados en los métodos, que emplean ácidos nucleicos específicos de una secuencia para modificar la transcripción o la traducción de genes. Este término incluye también ácidos nucleicos y métodos que proporcionan ácidos nucleicos que se unen a sitios sobre proteínas y a receptores. Antisentido incluye, pero no se limita a, los tipos siguientes de ácidos nucleicos: ARNm antisentido, ADN destinado a formar moléculas tricatenarias, oligonucleótidos que se unen a proteínas extracelulares y moléculas de nucleótidos pequeñas, que se describen a continuación. Según se utiliza en la presente, antisentido incluye las moléculas siguientes:
(a) ARNm y ADN antisentido
Los ácidos nucleicos antisentido son construcciones de ácido nucleico de hebra sencilla que se unen específicamente a ARNm que tiene secuencias complementarias, impidiendo de este modo la traducción del ARNm (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.168.053 para Altman y col., la Patente de EE.UU. Nº 5.190.931 para Inouye, la Patente de EE.UU. Nº 5.135.917 para Burch y la Patente de EE.UU. Nº 5.087.617 para Smith).
Los ácidos nucleicos antisentido incluyen también oligonucleótidos cíclicos de doble hebra, tales como los oligonucleótidos en cabeza de martillo o pesa, que se ha demostrado que inhiben específicamente la síntesis de ARN (ver, por ejemplo, Clusel y col., (1993) Nucl. Acids Res., 21: 3405-3411).
(b) Moléculas tricatenarias
Las moléculas tricatenarias se refieren a hebras individuales de ADN que se dirigen a ADN bicatenario, formando moléculas tríplices colineales mediante la unión a la hendidura principal, e impidiendo o alterando de este modo la transcripción (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.176.996 para Hogan y col.). Se ha diseñado ADN tricatenario que se une estrechamente y específicamente a sitios de ADN seleccionados.
(c) Ribozimas
Un ribozima es un enzima que está formado por ARN y que actúa primariamente sobre sustratos de ARN. Según se utilizan en la presente, los ribozimas se refieren a construcciones de ARN (o de análogos de ARN) que cortan específicamente ARN mensajero (ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.180.818, 5.116.742 y 5.093.246 para Cech y col.) y en particular se refieren a ribozimas que están diseñados para que se dirijan a moléculas de ARN para cortarlas y de este modo inhiben o interfieren de alguna manera con el crecimiento celular o con la expresión de un ARNm o una proteína diana.
(d) Oligonucleótidos que se unen a proteínas extracelulares
Los oligonucleótidos que se unen a proteínas extracelulares se refieren a oligonucleótidos que se unen específicamente a proteínas.
(e) Moléculas de nucleótidos pequeñas
Las moléculas de nucleótidos pequeñas se refieren a ácidos nucleicos que se dirigen a un sitio de un receptor.
Según se utilizan en la presente, los términos ácidos nucleico heterólogo o ácido nucleico foráneo se emplean indistintamente y se refieren a un ADN o ARN que no existe de manera natural como parte del genoma en el que está presente, o que se encuentra en una posición o posiciones del genoma que difieren de aquéllas en las que está presente en la naturaleza. El ácido nucleico heterólogo no es endógeno generalmente para la célula en la que es introducido, pero ha sido obtenido de otra célula o ha sido preparado sintéticamente. Generalmente, aunque no necesariamente, tal ácido nucleico codifica ARN y proteínas que no son normalmente producidos por la célula en la que se expresa. Cualquier ARN o ADN que una persona experta en la técnica reconozca o considere como heterólogo o foráneo para la célula en la que se expresa, está incluido en la presente por el término ADN heterólogo. Ejemplos de ADN heterólogo incluyen, pero no se limitan a, ADN que codifica secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción y proteínas marcadoras seleccionables o trazables, tal como una proteína que confiere resistencia a un fármaco. El ADN heterólogo puede codificar también ADN que medie o codifique mediadores que alteren la expresión del ADN endógeno influyendo sobre la transcripción, la traducción u otros procesos bioquímicos regulables.
Según se utiliza en la presente, un vector o un plásmido se refiere a elementos discretos que son utilizados para introducir ADN heterólogo en las células para la expresión del ADN heterólogo o para la replicación del ADN heterólogo clonado. La selección y utilización de tales vectores y plásmidos está dentro del nivel de experiencia en la técnica.
Según se utiliza en la presente, expresión se refiere al proceso por el cual un ácido nucleico es transcrito a ARNm y traducido a péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico deriva de ADN genómico la expresión puede incluir, si se selecciona una célula u organismo huésped eucariótico apropiado, el ayuste del ARNm.
Según se utiliza en la presente, el término vector de expresión incluye vectores capaces de expresar fragmentos de ADN que están en unión operativa con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de llevar a cabo la expresión de tales fragmentos de ADN. Por tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, después de la introducción en una célula huésped apropiada, tiene como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos para las personas con experiencia en la técnica, e incluyen aquéllos que son replicables en células eucarióticas y/o en células procarióticas y aquéllos que permanecen episómicos o que pueden integrarse en el genoma de la célula huésped.
Según se utiliza en la presente, unión operativa o asociación operativa de ADN heterólogo a secuencias de nucleótidos reguladoras y efectoras, tales como promotores, intensificadores, sitios de parada de la transcripción y de la traducción y otras secuencias señal, se refiere a la relación funcional entre tal ADN y tales secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la unión operativa de ADN heterólogo a un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el ADN y el promotor, de tal manera que la transcripción de tal ADN se inicia a partir del promotor por una ARN polimerasa que reconoce, se une y transcribe específicamente el ADN en el marco de lectura.
Según se utiliza en la presente, una región promotora se refiere a la porción de ADN de un gen que controla la transcripción del ADN al que está unida operativamente. Una porción de la región promotora incluye secuencias de ADN específicas que son suficientes para el reconocimiento, la unión y el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa. Esta porción de la región promotora es referida como promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan esta actividad de reconocimiento, unión e inicio de la transcripción de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden estar actuando en cis o pueden ser sensibles a factores que actúan en trans. Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la regulación, pueden ser constitutivos o regulados. Para utilización en la presente se prefieren los promotores inducibles. Los promotores son reconocidos por una ARN polimerasa que es expresada por el huésped. La ARN polimerasa puede ser endógena del huésped o puede ser introducida mediante ingeniería genética en el huésped, ya sea como parte del cromosoma del huésped o en un elemento episómico, incluyendo un plásmido que contenga el ADN que codifica el polipéptido que contiene la subunidad A de Shiga. Los promotores más preferidos para ser utilizados en la presente están regulados estrechamente, de tal manera que si está ausente la inducción, el ADN que codifica la proteína que contiene saporina no se expresa.
Según se utiliza en la presente, una región terminadora de la transcripción tiene (a) un subsegmento que codifica una señal de poliadenilación y un sitio de poliadenilación en el transcrito, y/o (b) un subsegmento que proporciona una señal de terminación de la transcripción que finaliza la transcripción por la polimerasa que reconoce el promotor seleccionado. El terminador de la transcripción completo puede ser obtenido a partir de un gen que codifique una proteína, que puede ser el mismo o diferente del gen que es el origen del promotor. Las regiones terminadoras de la transcripción preferidas son aquéllas que son funcionales en E. coli. Los terminadores de la transcripción son componentes opcionales de los sistemas de expresión de la presente, pero se emplean en las realizaciones preferidas.
Según se utiliza en la presente, el término "secuencia de nucleótidos que codifica la expresión de" un polipéptido se refiere a una secuencia que, después de la transcripción y de la traducción posterior del ARNm resultante, produce el polipéptido. Ésta puede incluir secuencias que contengan, por ejemplo, intrones.
Según se utiliza en la presente, el término "secuencias para el control de la expresión" se refiere a secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico a la que están unidas operativamente. Las secuencias para el control de la expresión están unidas operativamente a una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias para el control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, cuando es apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por tanto, las secuencias para el control de la expresión pueden incluir promotores apropiados, intensificadores, terminadores de la transcripción, un codon de inicio (esto es, ATG) delante de un gen que codifique una proteína, señales de ayuste para intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto de un gen que codifique una proteína para permitir la traducción correcta del ARNm, y codones de parada. Además, pueden incluirse secuencias de ADN que codifiquen un polipéptido indicador fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde o azul, para seleccionar los clones positivos (esto es, aquellas células huésped que expresan el polipéptido deseado).
Según se utiliza en la presente, "células huésped" son células en las que puede propagarse un vector y expresarse su ácido nucleico. El término incluye también cualquier progenie de la célula huésped en cuestión. Se comprende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental, ya que puede haber mutaciones que tienen lugar durante la replicación. Tal progenie está incluida cuando se utiliza el término "célula huésped".
Según se utiliza en la presente, una señal de secreción se refiere a una región peptídica dentro de la proteína precursora que dirige la secreción de la proteína precursora desde el citoplasma del huésped al espacio periplásmico o al medio de crecimiento extracelular. Tales señales pueden estar en el extremo amino o en el extremo carboxi de la proteína precursora. La señal de secreción preferida está ligada al extremo amino y puede ser heteróloga para la proteína a la que está unida. Las secuencias señal típicas son cortadas durante el tránsito a través de la ruta de secreción celular. El corte no es esencial ni necesita estar situado de manera precisa, siempre que la proteína secretada conserve su actividad deseada.
Según se utiliza en la presente, una secuencia de translocación o vectorización nuclear (NTS) es una secuencia de aminoácidos de una proteína que es requerida para la translocación de la proteína a un núcleo celular. La comparación con NTSs conocidas, y si es necesario el análisis de las secuencias candidato, permitiría a las personas con experiencia en la técnica identificar fácilmente otras secuencias de aminoácidos que funcionen como NTSs.
Según se utiliza en la presente, NTS heteróloga se refiere a una NTS que es diferente de la NTS que está presente en el péptido, polipéptido o proteína de tipo salvaje. Por ejemplo, la NTS puede derivar de otro polipéptido, puede ser sintetizada o puede derivar de otra región del mismo polipéptido.
Según se utiliza en la presente, transfección se refiere a la captación de ADN o ARN por una célula huésped. Transformación se refiere a este proceso realizado de tal manera que el ADN sea replicable, como un elemento extracromosómico o como parte del ADN cromosómico del huésped. Los métodos y medios para llevar a cabo la transfección y la transformación son bien conocidos por los expertos en esta técnica (ver, por ejemplo, Wigler y col. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1373-1376; Cohen y col., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110).
Según se utiliza en la presente, actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o a las respuestas fisiológicas que resultan de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. La actividad biológica incluye, por tanto, los efectos terapéuticos y la actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas. Tal actividad biológica puede ser definida, sin embargo, con referencia a actividades in vitro particulares, como las medidas en un ensayo definido. Así, por ejemplo, la referencia en la presente a la actividad biológica de una quimioquina, un dímero de la misma, un monómero, o un fragmento de la misma, u otra combinación de monómeros y fragmentos de quimioquinas, se refiere a la capacidad de la quimioquina para unirse a células portadoras de receptores de quimioquinas e internalizar un agente ligado. Tal actividad es determinada típicamente in vitro ligando la quimioquina (dímero, monómero o fragmento) a un agente citotóxico, tal como la subunidad A de Shiga, poniendo en contacto las células portadoras de receptores de quimioquinas, tales como leucocitos, con el conjugado y determinando la proliferación o el crecimiento celular. Tal actividad in vitro debe ser extrapolable a la actividad in vivo. Más adelante se hace referencia y se describen numerosos modelos animales.
Según se utiliza en la presente, el término biológicamente activo, o la referencia a la actividad biológica de un conjugado de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, tal como un conjugado que contiene una quimioquina y un agente vectorizado, tal como la subunidad A de Shiga, se refiere en ese caso a la capacidad de tal polipéptido para inhibir enzimáticamente la síntesis de proteínas por la inactivación de los ribosomas in vivo o in vitro, o para inhibir el crecimiento de las células, o para destruir las células después de la internalización del polipéptido que contiene la toxina por las células. Tal actividad biológica o citotóxica puede ser analizada mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, los ensayos in vitro que miden síntesis de proteínas y los ensayos in vivo que determinan la citotoxicidad midiendo el efecto de un compuesto de ensayo sobre la proliferación celular o sobre la síntesis de proteínas. Son particularmente preferidos, sin embargo, los ensayos que determinan la citotoxicidad en las células diana.
Según se utiliza en la presente, unirse a un receptor se refiere a la capacidad de un ligando para reconocer específicamente y unirse de manera detectable, según se determina mediante ensayos in vitro estándar, a tales receptores. Por ejemplo, la unión, según se utiliza en la presente, mide la capacidad de un conjugado de quimioquina, de un monómero de quimioquina o de otra mezcla para reconocer un receptor de quimioquinas en subtipos celulares de leucocitos tales como microglía, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y células T utilizando ensayos de unión ligando-receptor bien descritos, ensayos de quimiotaxis, análisis histopatológicos, análisis por citometría de flujo y microscopía confocal, y otros ensayos conocidos por los expertos en la técnica y/o ejemplificados en la presente.
Según se utiliza en la presente, sustancialmente puro significa suficientemente homogéneo para aparecer libre de impurezas fácilmente detectables determinadas por métodos estándar de análisis, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizados por los expertos en la técnica para determinar tal pureza, o suficientemente puro de tal manera que una purificación posterior no alteraría de manera detectable las propiedades físicas y químicas, tales como las actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los métodos de purificación de compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros son conocidos por los expertos en la técnica. Un compuesto sustancialmente químicamente puro puede ser, sin embargo, una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, una purificación posterior podría incrementar la actividad específica del compuesto.
Según se utiliza en la presente, ADN aislado sustancialmente puro se refiere a fragmentos de ADN purificados de acuerdo con las técnicas estándar empleadas por los expertos en el oficio (ver, por ejemplo, Maniatis y col. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY y Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Según se utiliza en la presente, el término "hibridar bajo condiciones de severidad especificada" describe la estabilidad de los híbridos formados entre dos fragmentos de ADN de hebra sencilla y se refiere a las condiciones de fuerza iónica y temperatura a las que tales híbridos son lavados después de la hibridación bajo condiciones de severidad menores que o iguales a las de la etapa de lavado. Típicamente, las severidades alta, media y baja incluyen las condiciones siguientes o condiciones equivalentes a las mismas:
1) alta severidad: SSPE o SSC 0,1 X, SDS 0,1%, 65ºC
2) severidad media: SSPE o SSC 0,2 X, SDS 0,1%, 50ºC
3) baja severidad: SSPE o SSC 1,0 X, SDS 0,1%, 50ºC.
Las condiciones equivalentes se refieren a condiciones que seleccionan sustancialmente el mismo porcentaje de apareamiento erróneo en los híbridos resultantes. La adición de ingredientes tales como formamida, Ficoll y solución de Denhardt afectan a parámetros tales como la temperatura bajo la cual debe llevarse a cabo la hibridación y la velocidad de la reacción. De este modo, la hibridación en SSC 5 X, en formamida al 20% a 42ºC es sustancialmente la misma que en las condiciones enumeradas anteriormente de hibridación bajo condiciones de baja severidad.
Las recetas de SSPE, SSC y de la solución de Denhardt y la preparación de formamida desionizada están descritas en, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Capítulo 8; ver, Sambrook y col., vol. 3, p. B.13, ver también numerosos catálogos que describen soluciones utilizadas comúnmente en el laboratorio. SSPE es NaCl 0,18 tamponado con fosfato, pH 7,4.
Según se utiliza en la presente, un cultivo significa una propagación de células en un medio que conduce a su crecimiento, y todos los subcultivos del mismo. El término subcultivo se refiere a un cultivo de células cultivado a partir de células de otro cultivo (cultivo de origen), o a cualquier subcultivo del cultivo de origen, independientemente del número de subcultivos que hayan sido realizados entre el subcultivo de interés y el cultivo original. El término "cultivar" se refiere al proceso mediante el cual se propaga tal cultivo.
Según se utiliza en la presente, una cantidad eficaz de un compuesto para tratar una enfermedad particular, es una cantidad que es suficiente para aliviar, o reducir de alguna manera, los síntomas asociados con la enfermedad. Tal cantidad puede ser administrada como una única dosis o puede ser administrada de acuerdo con un régimen, mediante lo cual es eficaz. La cantidad puede curar la enfermedad pero, típicamente, es administrada con el fin de aliviar los síntomas de la enfermedad. Puede requerirse una administración repetida para conseguir el alivio deseado de los síntomas.
Según se utilizan en la presente, sales, ésteres u otros derivados farmacéuticamente aceptables de los conjugados incluyen cualquier sal, éster o derivado que pueda ser fácilmente preparado por los expertos en esta técnica utilizando métodos conocidos para tal derivatización y que producen compuestos que pueden ser administrados a animales o humanos sin efectos tóxicos sustanciales y que son farmacéuticamente activos o bien son profármacos.
Según se utiliza en la presente, tratamiento significa cualquier manera mediante la cual los síntomas de una condición, trastorno o enfermedad son aliviados o alterados beneficiosamente de otro modo. El término tratamiento incluye también cualquier uso farmacéutico de las composiciones de la presente.
Según se utiliza en la presente, el alivio de los síntomas de un trastorno particular mediante la administración de una composición farmacéutica particular se refiere a cualquier disminución, permanente o temporal, duradera o transitoria, que puede ser atribuida a, o estar asociada con, la administración de la composición.
Según se utiliza en la presente, un profármaco es un compuesto que después de la administración in vivo es metabolizado o convertido de otro modo en la forma del compuesto biológicamente, farmacéuticamente o terapéuticamente activa. Para producir un profármaco, el compuesto farmacéuticamente activo es modificado de tal manera que el compuesto activo será regenerado por procesos metabólicos. El profármaco puede ser diseñado para que altere la estabilidad metabólica o las características del transporte de un fármaco, para que enmascare efectos colaterales o toxicidad, para que mejore el sabor de un fármaco o para que altere otras características o propiedades de un fármaco. En virtud del conocimiento de los procesos farmacodinámicos y del metabolismo de fármacos in vivo, los expertos en esta técnica, una vez que se conoce un compuesto farmacéuticamente activo, pueden diseñar profármacos del compuesto (ver, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press New York, páginas 388-392).
Según se utiliza en la presente, DE_{50} se refiere a la concentración a la cual el 50% de las células son destruidas después de un periodo de tiempo de incubación estipulado con un conjugado proporcionado en la presente.
Según se utiliza en la presente, DI_{50} se refiere a la concentración de un conjugado proporcionado en la presente requerida para reducir el número o eliminar el 50% de las células expuestas al conjugado en comparación con células no tratadas después de un periodo de tiempo estipulado.
Según se utiliza en la presente, el término "citoquina" incluye interleuquinas, quimioquinas, linfoquinas, monoquinas, factores estimulantes de colonias y proteínas asociadas a receptores, y fragmentos funcionales de los mismos. Para los fines de la presente, las citoquinas que no son quimioquinas se refieren a todas las citoquinas, excepto las quimioquinas, que tienen actividad quimioatrayente no presentada generalmente por otras citoquinas.
Según se utiliza en la presente, una quimioquina se refiere a un miembro de la superfamilia de cuarenta o más polipéptidos proinflamatorios pequeños (de 6 aproximadamente a 14 kDa aproximadamente) inducibles y secretados, que actúan primariamente como quimioatrayentes y activadores de subtipos celulares de leucocitos específicos. Juntas, las quimioquinas se dirigen al espectro completo de subtipos de leucocitos; individualmente cada una se dirige solamente a parte del espectro. Las quimioquinas, que son proteínas básicas que se unen a heparina, típicamente, aunque no necesariamente, tienen cuatro cisteínas compartidas entre casi todos los miembros de la familia. Hay cuatro grupos principales de quimioquinas, tres de los cuales incluyen las cuatro cisteínas conservadas; otros grupos pueden ser identificados. Los grupos están definidos por la disposición de las dos primeras cisteínas. Si las dos primeras cisteínas están separadas por un solo aminoácidos, son miembros de la familia CXC (también denominada \alpha); si las cisteínas son adyacentes, son clasificadas como de la familia CC (también llamada \beta). Si están separadas por tres aminoácidos CX_{3}C, son miembros del tercer grupo. El cuarto grupo de quimioquinas contiene dos cisteínas, que corresponden a la primera y a la tercera cisteína de los demás grupos. Para los fines de la presente, las quimioquinas no incluyen citoquinas tales como GM-CSF, IL-1, IL-4, que no interaccionan con los receptores de CC, CXC, CX_{3}C y XC, que no actúan primariamente como quimioatrayentes de leucocitos y que presentan efectos reguladores sobre el crecimiento, diferenciación y función de la mayoría de los tipos celulares. Como algunas citoquinas se unen a receptores que están presentes en células que expresan también receptores de quimioquinas, ciertos conjugados de citoquina-agente vectorizado, tales como conjugados de IL-4, pueden ser utilizados en los métodos de tratamiento de condiciones inflamatorias, particularmente de la inflamación asociada con el daño tisular secundario, proporcionados en la presente.
Según se utiliza en la presente, una quimioquina-toxina es un conjugado que contiene una quimioquina y una toxina.
Según se utiliza en la presente, el término "fragmento funcional" se refiere a un polipéptido que posee una función o actividad biológica que es identificada mediante un ensayo funcional definido y que está asociada con una alteración biológica, morfológica o fenotípica particular de una célula o de un mecanismo celular.
Según se utiliza en la presente, el término "subunidad enzimática" se refiere a la subunidad A de una toxina dada que es responsable de la actividad N-glicosidasa o de la actividad ADP-ribosilación de la toxina (Pastan y col., Annu. Rev. Biochem., 61: 331-54, 1992; Stirpe y col., Bio/Technology, 10: 405-12, 1992; y Sandvig y Van Deurs, Physiol. Rev., 76: 949-66, 1996).
Según se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" según se utiliza en la presente incluye moléculas intactas así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2} y Fv, que son capaces de unirse al determinante epitópico. Estos fragmentos funcionales del anticuerpo conservan cierta capacidad para unirse selectivamente a su antígeno o receptor respectivo y se definen según sigue:
(1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de una molécula de anticuerpo que se une al antígeno monovalente, puede ser producido por digestión del anticuerpo completo con el enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;
(2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo que puede ser obtenido mediante el tratamiento del anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para dar una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;
(3) F(ab')_{2}, el fragmento del anticuerpo que puede ser obtenido mediante tratamiento del anticuerpo completo con el enzima pepsina sin reducción posterior; F(ab')_{2} es un dímero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos por dos enlaces disulfuro;
(4) Fv, definido como un fragmento obtenido por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y
(5) Anticuerpo de cadena sencilla ("SCA"), una molécula obtenida por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas mediante un adaptador polipéptido adecuado, como una molécula de una sola cadena fusionada genéticamente.
Los métodos para producir estos fragmentos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988).
Según se utiliza en la presente, el término "epítopo" indica cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos contienen agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos o cadenas laterales carbohidratadas y tienen normalmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
Según se utiliza en la presente, péptido y/o polipéptido indica un polímero en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que están unidos entre sí mediante enlaces amida, referido alternativamente como polipéptido. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, puede utilizarse el isómero óptico L o el isómero óptico D, prefiriéndose los isómeros L. Adicionalmente, se tiene la intención de incluir aminoácidos no naturales tales como beta-alanina, fenilglicina y homoarginina. Pueden utilizarse también en las quimeras ligando-toxina proporcionadas en la presente aminoácidos comúnmente encontrados que no están codificados por un gen, aunque los aminoácidos preferidos son aquellos que son codificables.
Según se utiliza en la presente, una cantidad eficaz es la cantidad de un agente terapéutico necesaria para prevenir, curar, aliviar o al menos detener parcialmente un síntoma del daño tisular secundario en un sujeto o de un estado de enfermedad asociado con el mismo. Un sujeto es cualquier mamífero, preferiblemente un humano.
B. La respuesta inflamatoria
La inflamación se inicia por la activación y el reclutamiento de varios grupos de células de defensa del sistema inmune (leucocitos) hacia el lugar de la lesión o trauma. Los leucocitos proinflamatorios incluyen macrófagos, monocitos y microglía (conocidos colectivamente como fagocitos mononucleares, MNPs), neutrófilos, eosinófilos y subtipos del linaje de linfocitos T. Estas células sirven para eliminar del organismo agentes exógenos no deseados (por ejemplo, microbios) o agentes endógenos no deseados (por ejemplo, clones de células cancerosas), para eliminar los desechos celulares y para participar en la reparación de tejidos y heridas.
Los leucocitos son activados y posteriormente liberan un amplio conjunto de mediadores inflamatorios, como respuesta a factores solubles liberados por las células dañadas que experimentan necrosis. Los mediadores derivados de leucocitos son esenciales para el proceso de cicatrización, pero parecen ser también responsables del daño tisular secundario que puede conducir finalmente a una disfunción orgánica. La primera oleada de mediadores derivados de leucocitos incluye numerosos miembros de la superfamilia de citoquinas y varios quimioatrayentes de leucocitos potentes de la superfamilia de quimioquinas.
Las citoquinas y las quimioquinas perpetúan su propia producción y son liberadas de los leucocitos a través de mecanismos autocrinos y paracrinos. Inducen también la síntesis y liberación de una segunda oleada de mediadores inflamatorios por las células a las que están dirigidas. Esta segunda oleada de mediadores inflamatorios incluye, pero no se limita a, neurotoxinas, enzimas proteolíticos, proteínas catiónicas, metabolitos del ácido araquidónico y especies reactivas de oxígeno. Las citoquinas y quimioquinas inducen también la expresión de moléculas de adhesión celular y antígenos de la superficie celular en leucocitos, células endoteliales y células gliales, y ambos acontecimientos son componentes integrantes de la respuesta inflamatoria.
Lesiones de la médula espinal y del SNC
Los acontecimientos precipitados, tales como los accidentes con vehículos de motor, que conducen a lesiones de la médula espinal son definidos útilmente como el daño inicial o primero. La médula espinal traumatizada responde rápidamente invocando una respuesta inflamatoria normal, que está diseñada para eliminar del lugar del daño cualquier material foráneo invasor como bacterias o virus, para obturar la herida y estimular la reparación tisular. Hasta este punto la respuesta inflamatoria espinal es similar a la respuesta de la piel a un pequeño corte o abrasión, y en ambos casos puede formarse una cicatriz permanente.
Mientras que la respuesta periférica al daño puede ser considerada como un único acontecimiento contenido, la respuesta espinal se desarrolla hasta un punto en el que lo "normal" se convierte en "inapropiado" y en esencia se causa produce un segundo daño. Brevemente, la respuesta inflamatoria espinal construye un entorno en el lugar de la lesión que es demasiado hostil para soportar la regeneración o la reparación nerviosa, extiende el perímetro de esta región para incluir áreas no dañadas de la médula y destruye realmente neuronas y oligodendrocitos sanos. Por consiguiente, la SCI es un proceso de dos etapas compuesto por un daño inicial o precipitante que es seguido por un daño tisular secundario.
Según se describe en la presente, la progresión inapropiada de la inflamación espinal es el principal contribuyente al grado de parálisis y a las condiciones médicas secundarias que son el resultado típico de la SCI. Desde una perspectiva clínica, esto significa que al paciente con una lesión espinal le podría haber ido mucho mejor si la respuesta inflamatoria no se hubiera iniciado nunca. Debido a la inflamación espinal en curso, las perspectivas de una intervención terapéutica con éxito son nada prometedoras.
Estudios sobre SCI y sobre traumas generalizados del SNC han demostrado un claro inicio de daño tisular secundario que se observa en cuestión de horas, puede continuar durante varias semanas, y es seguido por un periodo de recuperación parcial. El daño secundario es detectable como muerte celular, astrogliosis, que conduce a la formación de cicatrices gliales, neovascularización, desmielinización y pérdida de la función sensorial y motora (esto es parálisis). La variación a lo largo del tiempo del daño secundario y de la recuperación parcial está bien correlacionada con el grado de inflamación en el lugar de la lesión.
Los acontecimientos tempranos en la inflamación del SNC incluyen la activación y proliferación de la microglía residente y de los MNPs infiltrantes. La microglía son una clase distinta de MNPs y son las células inmunoefectoras residentes del SNC. Son las actividades inflamatorias de estas células las que causan el daño secundario a nivel celular. Además, las citoquinas y quimioquinas derivadas de los MNPs colaboran en la activación y reclutamiento de monocitos, neutrófilos y linfocitos T hacia el sitio de la lesión, un proceso que se inicia como consecuencia de la regulación por incremento de antígenos de la superficie celular y de moléculas de adhesión celular, incluyendo integrinas, selectinas y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), en los subtipos de leucocitos, en las células endoteliales y en los astrocitos. Los neutrófilos y las células T contribuyen al daño secundario mediante la liberación de sus propias citoquinas, quimioquinas, especies reactivas de oxígeno y proteinasas al medio inflamatorio. Estos acontecimientos inflamatorios conducen a la muerte focal de neuronas y oligodendrocitos (las células productoras de mielina del SNC) combinada con la desmielinización de los axones circundantes.
Papel de las citoquinas en el daño secundario del SNC
Los MNPs, los neutrófilos, los linfocitos T y los astrocitos producen, secretan y responden a varias citoquinas, incluyendo IL-1, TNF-\alpha, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF e IFN. Estas citoquinas modulan la mayoría de las funciones de los leucocitos incluyendo la actividad fagocítica, la expresión de antígenos en la superficie celular y de moléculas de adhesión celular, y la producción de radicales de oxígeno. Además, estas citoquinas pueden estar ligadas directamente al proceso de formación de cicatrices gliales, o en algunos casos, ligadas a través de la liberación inducida de factores neurotóxicos y citotóxicos. El TNF-\alpha ha sido implicado en la patogénesis de EAE y de otras varias enfermedades desmielinizantes. Por ejemplo, se ha demostrado una regulación por incremento de TNF-\alpha y de receptores de TNF-\alpha específica de MNP en el sistema nervioso de pacientes con SIDA. Estudios in vitro demuestran que el TNF-\alpha es directamente citotóxico para los oligodendrocitos y estimula la fagocitosis microglial de la mielina. Además, el TNF-\alpha potencia la muerte celular inducida por IFN-\gamma de células progenitoras de oligodendrocitos.
El GM-CSF y la IL-3 de leucocitos y de la astroglía, junto con la IL-4 de linfocitos T, son potentes mitógenos y activadores de los MNPs. Estos factores, junto con otros, contribuyen a la patogénesis de enfermedades inflamatorias autoinmunes, muy probablemente por medio de la fagocitosis más rápida de la mielina discutida anteriormente. En varios estudios interesantes, se diseñaron ratones transgénicos para que produjeran crónicamente niveles bajos de IL-3, IL-6 o TNF-\alpha en el SNC, lo cual conducía a la proliferación y activación de MNPs en la sustancia blanca del SNC y, posteriormente, a la desmielinización primaria y a la enfermedad motora.
Papel de las quimioquinas en el daño secundario del SNC
Las quimioquinas, según se indicó anteriormente, son una superfamilia de citoquinas quimioatrayentes pequeñas (de 6 aproximadamente a 14 kDa aproximadamente), inducibles y secretadas, que actúan primariamente sobre subtipos de leucocitos. La superfamilia está dividida en cuatro subfamilias basadas en la posición (o existencia) de cuatro residuos de cisteína conservados en las secuencias primarias. Los miembros de la familia CXC o familia "\alpha", poseen un aminoácido intermedio entre las dos primeras cisteínas conservadas, mientras que la familia CC o "\beta" no lo tienen. Las quimioquinas C o "\gamma" tienen solamente el segundo y el cuarto residuo de cisteína conservados. Se ha descrito una cuarta familia, "\delta". Esta familia comparte tres aminoácidos intermedios entre las dos primeras cisteínas conservadas (de aquí que sea referida como la familia CX_{3}C). La quimioquina CX_{3}C fractalquina es diferente de los miembros de las demás familias en cuanto a que existe en forma soluble y en forma unida a la membrana.
La unión de las quimioquinas al receptor de sus células diana es un área de investigación compleja y en evolución constante. Se ha demostrado que la familia de quimioquinas \alpha se une a uno o más de cinco receptores de CXC (CXCR1-5), mientras que las quimioquinas de la familia \beta se unen a uno o más de diez receptores de CC (CCR1-9). Los perfiles de unión a los receptores de un grupo no limitante ejemplar seleccionado de quimioquinas \alpha y \beta están presentados en la Tabla 1. A pesar de la presencia de receptores apropiados, la especificidad celular de una quimioquina dada es cuestión en gran medida, aunque no exclusivamente, de si está dirigida a MNPs o a neutrófilos, o a ambos. Además, los eosinófilos son dianas destacadas para las quimioquinas \beta (ver la Tabla 1).
En general, las afinidades de unión, las especificidades y la distribución diferencial de los subtipos de receptores a través de las célula diana determina la contribución que realizará una quimioquina dada al proceso inflamatorio. El perfil biológico de una quimioquina dada determinado en un marco puede no ser cierto en otro, muy especialmente si la proporción y el estado de activación de las células diana cambia durante el trauma o la enfermedad. Por tanto, el perfil biológico de una quimioquina dada debe ser establecido caso por caso. Por ejemplo, los efectos de la proteína quimiotáctica de monocitos-3 (MCP-3) son similares a los de MCP-1, pero la primera se une a un rango más amplio de células. En adición a una situación ya complicada, las quimioquinas se unen también a heparina y a glucosaminoglicanos en la superficie celular de una manera que se cree que facilita el mantenimiento de un gradiente necesario para la activación de leucocitos y su transporte (extravasación) desde la circulación al tejido inflamado.
Las quimioquinas actúan de manera autocrina o paracrina y sus receptores están regulados por incremento en la enfermedad. Estudios in vitro han demostrado que varios estímulos, incluyendo lipopolisacárido (LPS), IL-1, IFN y TNF-\alpha, inducen la expresión y la secreción de quimioquinas a partir de varios tipos celulares del SNC y de células que no son del SNC. Por ejemplo, MCP-1, la proteína inflamatoria de macrófagos-1 beta (MIP-1\beta) y RANTES (Regulada tras la Activación, Expresada y Secretada por Células T Normales) de astrocitos, microglía y leucocitos. Una vez liberadas, las quimioquinas quimioatraen y activan concomitantemente la microglía, los macrófagos, los neutrófilos y los linfocitos T hacia el sitio de la lesión. La activación mediada por quimioquinas significa la síntesis inducida y la secreción de especies reactivas de oxígeno, proteasas y citoquinas por las células diana apropiadas, con un incremento posterior del daño secundario que es atribuible directamente a los agentes secretados.
Volviendo a ejemplos más específicos, las quimioquinas CC MCP-1, MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES son expresadas por astrocitos y macrófagos después de un daño mecánico al cerebro, y su expresión se correlaciona con el inicio de gliosis reactiva y la aparición de MNPs en el lugar de la lesión. En un ejemplo similar, se ha detectado la expresión de MCP-1 y MIP-1\alpha en MNPs y astrocitos después de isquemia cerebral focal en la rata. En un ejemplo más complejo, se ha demostrado una regulación por incremento selectiva y dependiente del tiempo del oncogén regulado por el crecimiento (GRO-\alpha). La proteína inducible por interferón-\gamma (IP-10) y MCP-1 y 5 se observan dentro de las primeras seis a veinticuatro horas después de una lesión por contusión de la médula espinal en la rata. La expresión de Gro-\alpha y la quimioatracción de neutrófilos es un acontecimiento temprano (dentro de las 6 horas), la expresión de IP-10 y la quimioatracción de células T es un acontecimiento intermedio (6-12 horas) y, finalmente, la expresión de MCP-1 y 5 y la quimioatracción de MNPs es un acontecimiento tardío (12-24 horas). En contraste, la expresión de MIP-1\alpha y RANTES parecía estar poco afectada en la contusión de la médula espinal, lo cual no quiere decir que las células infiltrantes y proliferantes no tengan receptores para estas dos quimioquinas \beta.
Varios investigadores han estudiado las quimioquinas en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y han demostrado que las células endoteliales, los MNPs y los astrocitos expresan MCP-1 al inicio de la fase aguda. Los monocitos se infiltran en los lugares de lesión veinticuatro horas más tarde y esto está seguido por la expresión extendida de MCP-1 en la médula espinal. La expresión de MIP-1\alpha, MIP-1\beta, RANTES y MCP-3 fluctúa de acuerdo con la gravedad y el estado de la EAE. Los patrones temporales y espaciales de la expresión de quimioquinas regulan la patogénesis de la enfermedad, y MIP-1\alpha y MCP-1 controlan la infiltración de MNPs durante la EAE aguda y recurrente, respectivamente. Finalmente, ratones transgénicos que sobreexpresan MCP-1 presentan una infiltración de MNPs pronunciada en el SNC.
La contribución de la apoptosis al daño secundario
En la fase inicial de un trauma del SNC, incluyendo SCI, las células gravemente dañadas comienzan a morir casi inmediatamente; el proceso pasivo de necrosis. Después de la activación celular, los mediadores de la inflamación inician un segundo periodo de muerte celular, retardado y prolongado, que equivale a un proceso de suicidio celular activo denominado algunas veces "muerte celular programada" o, más frecuentemente, apoptosis. Los efectos apoptóticos se extienden a las neuronas y a los oligodendrocitos, y su contribución al daño secundario es progresiva. Una vez inducida, la apoptosis puede tener lugar durante un extenso periodo de tiempo y en áreas que están distantes anatómicamente del sitio inicial del daño. El efecto temporal y espacial de la apoptosis puede explicar también por qué se observa todavía muerte celular cuando ya no son detectables células inmunes en o cerca del sitio de la lesión.
Se ha observado apoptosis en una variedad de condiciones inflamatorias y traumáticas incluyendo SCI, AD, MS, daño cerebral traumático y derrame cerebral, enfermedad pulmonar y cáncer. Por ejemplo, la apoptosis de neuronas y oligodendrocitos (asociada con desmielinización) es evidente en varios modelos animales de trauma del SNC y de SCI. Los datos procedentes de modelos animales típicos de trauma del SNC revelan que la apoptosis comienza bastante temprano (en cuestión de horas) y se prolonga durante al menos una semana después del daño. En algunos caos, se ha prolongado el protocolo experimental y la apoptosis es todavía detectable tres semanas después del daño. En al menos un estudio publicado, los datos sugieren que puede haber dos oleadas apoptóticas distintas. El examen inmunohistoquímico de médulas espinales humanas de pacientes que murieron entre tres horas y dos meses después de la SCI, reveló apoptosis de neuronas y oligodendrocitos en el 93% de los casos. En los estudios con animales y post-mortem se detectaron acontecimientos apoptóticos a una distancia del lugar de la lesión.
Los mecanismos apoptóticos implican cambios en la generación de señales intracelulares y en la expresión génica. La activación de endonucleasas y proteasas intracelulares (por ejemplo, caspasas) conduce al corte del ADN (la "escalera de ADN" característica observada mediante electroforesis en gel), a la degradación parcial del citoesqueleto y de los orgánulos intracelulares y, finalmente, a una muerte celular retardada. En el SNC, la apoptosis es iniciada por mediadores inflamatorios derivados de leucocitos y de la astroglía incluyendo citoquinas, quimioquinas, especies reactivas de oxígeno, NO y aminoácidos excitatorios. Una vez más, esto subraya la contribución de estos mediadores al daño tisular secundario.
El énfasis y la intensidad relativa de la apoptosis y de la necrosis parecen ser diferentes para un mediador dado y, por ejemplo, los agonistas del receptor de NMDA y el NO destruyen neuronas utilizando ambos mecanismos. La apoptosis mediada por NMDA o por NO implica la activación de la cascada de caspasas intracelular. Se cree también que especies reactivas de oxígeno, una consecuencia de la activación por NMDA y NO, están implicadas en la apoptosis, pero parece que la formación de radicales de oxígeno y la peroxidación lipídica tienen lugar corriente abajo de la activación de las caspasas. En contraste, las citoquinas derivadas de leucocitos pueden activar o suprimir la apoptosis. Por ejemplo, el TNF-\alpha induce apoptosis en una variedad de tipos celulares a través de al menos dos rutas de señales intracelulares diferentes. La IL-1\beta tiene un papel sinérgico con el NO en la activación de la apoptosis, pero GM-CSF e IL-3 suprimen la apoptosis de leucocitos humanos y de rata. El GM-CSF suprime la apoptosis de neutrófilos humanos que sigue a la activación del FAS, o llamado receptor "de muerte", y las células conservan su capacidad para producir radicales de oxígeno y proteasas. La IL-4, un potente mitógeno para la microglía, suprime la apoptosis en neutrófilos humanos a través de un mecanismo que puede incluir la inducción de síntesis de proteínas de novo. Estos ejemplos sugieren que la supresión o la activación de la apoptosis conduce a un daño tisular secundario que depende de la mezcla exacta de mediadores inflamatorios en el lugar de la lesión.
Inflamación mediada por leucocitos en enfermedades y condiciones del SNC y en enfermedades y condiciones que no son del SNC
La distinción entre una enfermedad y una condición clínica no es siempre fácil de establecer. Por ejemplo, un boxeador profesional puede sufrir varias lesiones cerradas en la cabeza (una condición) en el curso de su carrera y puede pasar luego a desarrollar una forma de demencia (demencia pugilística) en los años posteriores que es muy similar a la enfermedad de Alzheimer. Las similitudes entre una lesión traumática del sistema nervioso, que depende primariamente de procesos inflamatorios agresivos y del daño secundario, y varias enfermedades neurodegenerativas son sorprendentes. En efecto, un informe reciente indica que la respuesta inflamatoria desencadenada por un trauma en la cabeza predispone a un paciente a la AD, y que la inflamación cerebral en pacientes con SIDA favorece la formación de placas amiloides, una característica de la AD. Desde esta perspectiva, las enfermedades a las que van dirigidos los conjugados proporcionados en la presente comparten una etiología y/o patología común.
El daño secundario del SNC es un ejemplo de la progresión de acontecimientos y del papel de las quimioquinas y de las células portadoras de receptores de quimioquinas en el daño progresivo observado procedente de respuestas inflamatorias patofisiológicas. Según se describe más adelante y es conocido por los expertos en la técnica, las células inmunoefectoras desempeñan un papel en la patología de numerosos trastornos y procesos inflamatorios, incluyendo, pero no limitándose a, trastornos inflamatorios pulmonares, cánceres, particularmente en tumores sólidos en los que se observan grandes cantidades de leucocitos infiltrantes, angiogénesis, infecciones víricas y bacterianas, incluyendo la infección por VIH, enfermedades autoinmunes y otros.
C. Componentes de los conjugados 1. Resumen
En la presente se proporcionan compuestos y composiciones y sus usos para tratar condiciones patológicas asociadas con respuestas inflamatorias, particularmente respuestas inflamatorias asociadas con la activación, proliferación y migración de células inmunoefectoras, incluyendo tipos celulares de leucocitos, neutrófilos, macrófagos, eosinófilos y otras células similares, y las condiciones patofisiológicas asociadas a estas respuestas inflamatorias.
Se proporciona lo siguiente:
(1) Composiciones y sus usos para tratar las condiciones patofisiológicas asociadas con respuestas inflamatorias mediadas por células inmunoefectoras mediante la vectorización y administración de agentes citotóxicos a estas células. Estas condiciones patofisiológicas incluyen, pero no se limitan a, el daño tisular secundario asociado con, o consecuencia de, estas respuestas inflamatorias. Dependiendo de la pauta del tratamiento, de la duración del tratamiento y de la condición o enfermedad, los métodos inhiben, alivian o bloquean estas respuestas.
La vectorización y la administración se realizan a través de receptores que se expresan en estas células. Tales receptores incluyen los de citoquinas y, particularmente, los receptores de quimioquinas. Por tanto, los receptores de quimioquinas son convertidos en diana específicamente. Son también convertidos en diana otros receptores, tales como los receptores de citoquinas no quimioquinas, tales como IL-4 y GM-CSF, que son expresados en estas células. Los conjugados proporcionados en la presente (ver (2)) están destinados a ser utilizados en estos métodos. Pueden utilizarse también otros conjugados conocidos por los expertos en la técnica, tales como conjugados conteniendo IL-4 y una toxina, para dirigirse a cualquiera de estos tipos celulares que expresen receptores específicos para los mismos.
Por tanto, se proporcionan composiciones y sus usos que emplean los agentes vectorizantes que están dirigidos a receptores de quimioquinas proporcionados en la presente y composiciones y sus usos que emplean conjugados conocidos, que contienen ligandos que se unen a receptores presentes en las células que están implicadas en estas respuestas inflamatorias patofisiológicas.
(2) Se proporcionan también conjugados que contienen un agente vectorizante que está dirigido a un receptor de quimioquinas y un agente vectorizado. Estos conjugados están destinados a ser utilizados en los métodos anteriores, pero pueden ser utilizados también para administrar cualquier agente a células que expresen receptores con los que interaccionan quimioquinas y efectuar o facilitar la internalización de los restos ligados.
(3) Se proporcionan también composiciones y sus usos en los que se combinan los métodos anteriores con otros métodos reconocidos en la técnica para el tratamiento de los trastornos asociados con las condiciones inflamatorias patofisiológicas.
2. Restos vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas
Cualquier agente que esté dirigido selectivamente a receptores encontrados en la panoplia de células a las que se une selectivamente cualquier quimioquina está destinado a ser utilizado en la presente. El agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es seleccionado preferiblemente de la familia de quimioquinas (de 6 aproximadamente a 14 kDa aproximadamente), que está constituida por cuarenta o más polipéptidos que estimulan la activación, migración, proliferación de varias células inmunoefectoras implicadas en las respuestas inflamatorias. Según se señaló anteriormente, esta familia está subdividida en al menos cuatro subgrupos basados en la posición o existencia de cuatro residuos de cisteína conservados. Los miembros de la subfamilia de quimioquinas CXC (o \alpha) poseen un aminoácido intermedio entre las dos primeras cisteínas conservadas, mientras que los miembros de la subfamilia CC (o \beta) no lo tienen. Las quimioquinas C (o \gamma) carecen del primer y el tercer residuo de cisteína. En general, los miembros de la familia de quimioquinas \alpha son preferencialmente activos sobre neutrófilos y linfocitos T, y las quimioquinas \beta son activas sobre monocitos, macrófagos y linfocitos T. Adicionalmente, varios miembros de las subfamilias de quimioquinas \alpha y \beta son activos sobre células dendríticas, que son células migratorias que exhiben potentes propiedades de presentación del antígeno y se cree que participan en la patofisiología de muchas enfermedades inflamatorias (Xu y col., J. Leukoc. Biol., 60: 365-71, 1996; y Sozzani y col., J. Immunol., 159: 1993-2000, 1997). Se ha descrito recientemente una cuarta quimioquina humana del tipo CX_{3}C referida como fractalquina (Bazan y col., Nature, 385: 640-4, 1997; Imai y col., Cell, 91: 521-30, 1997; Mackay, Curr. Biol., 7: R384-6, 1997). A diferencia de otras quimioquinas, la fractalquina existe en forma unida a la membrana y en forma soluble. La forma soluble es un potente quimioatrayente de monocitos y células T. El receptor en la superficie celular para esta quimioquina se denomina CX_{3}CR1. Debe señalarse que puede haber diferencias sutiles entre la naturaleza química y los efectos fisiológicos de quimioquinas derivadas de especies diferentes (Baggiolini y col., Adv. Immunol., 55: 97-179, 1994; y Haelens y col., Immunobiol., 195: 499-521, 1996).
a. Quimioquinas
Las quimioquinas ejercen sus efectos uniéndose a receptores específicos en las células diana (por ejemplo, CXCR-1 a 5 y CCR-1 a 9, XCR1 y CX_{3}CR1). Estos receptores se unen a los diferentes ligandos quimioquina de una manera solapante y compleja (ver la Tabla 1 siguiente). La especificidad (o especificidades) de unión al receptor y la distribución celular de receptores dados determinan los tipos de células inflamatorias sobre los que tendrá influencia una quimioquina dada. Por ejemplo, MCP-3 tiene efectos similares a los de MCP-1, pero se une a un rango más amplio de subtipos celulares (Combadiere y col., J. Biol. Chem., 270: 29671-5, 1995; Franci y col., J. Immunol., 154: 6511-7, 1995; Weber y col., J. Immunol., 154: 4166-72, 1995; Gong y col., J. Biol. Chem., 271: 10521-27, 1996; y Proost y col., J. Leukoc. Biol., 59: 67-74, 1996). Además, las quimioquinas se unen a heparina y a glucosaminoglicanos en la superficie celular de una manera que se cree que facilita el mantenimiento de un gradiente de quimioquinas necesario para la activación y el tráfico de leucocitos (Schall y col., Current Biol., 6: 865-73, 1994; y Tanaka y col., Immunology Today, 14: 111-15, 1993).
Ejemplos no limitantes de quimioquinas para utilización en los conjugados y métodos aquí proporcionados incluyen, pero no se limitan a, los subgrupos de quimioquinas \alpha, \beta y \gamma. Más particularmente, las quimioquinas actualmente preferidas para ser utilizadas como resto ligando proteináceo en los conjugados ligando-toxina quiméricos incluyen, pero no se limitan a, las quimioquinas \alpha conocidas en la técnica como IL-8; proteína quimiotáctica de granulocitos-2 (GCP-2); oncogén relacionado con el crecimiento-\alpha (GRO-\alpha), GRO-\beta y GRO-\gamma; péptido activador de neutrófilos derivado de células epiteliales-78 (ENA-78); proteína básica de plaquetas (PBP); péptido activador del tejido conectivo III (CTAP III); péptido activador de neutrófilos-2 (NAP-2); factor plaquetario de baja afinidad-4 (LAPF-4); monoquina inducida por interferón-\gamma (MIG); factor plaquetario 4 (PF4); proteína inducible por interferón 10 (IP-10, que posee potentes acciones quimioatrayentes para monocitos, células T y células de músculo liso); los factores derivados de células estromales SDF-1\alpha, SDF-1\beta y SDF-2; las quimioquinas \beta conocidas en la técnica como proteínas quimiotácticas de monocitos MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y MCP-5; las proteínas inhibidoras de macrófagos MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-1\gamma, MIP-2, MIP-2\alpha, MIP-2\beta, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4 y MIP-5; quimioquina derivada de macrófagos (MDC); quimioquina humana 1 (HCC-1); RANTES; eotaxina 1; eotaxina 2; TARC; SCYA17 e I-309; quimioquina de células dendríticas-1 (DC-CK-1); la quimioquina \gamma linfotactina; la forma soluble de la quimioquina CX_{3}C fractalquina; cualquier otra conocida por los expertos en la técnica y cualquier proteína sintética o modificada diseñada para unirse a los receptores de quimioquinas. Las quimioquinas pueden ser aisladas de fuentes naturales utilizando métodos rutinarios, o pueden ser expresadas utilizando un ácido nucleico que codifique la quimioquina. Quimioquinas biológicamente activas han sido expresadas recombinantemente en E. coli (por ejemplo, las disponibles comercialmente en R&D Systems, Minneapolis, MN).
Los receptores de quimioquinas en las células que estimulan el daño tisular secundario pertenecen generalmente a la superfamilia de receptores similares a rodopsina, con siete dominios transmembranales, acoplados a proteína G. Se prefiere que la quimioquina en el conjugado quimérico ligando-toxina se una con especificidad a al menos un receptor de quimioquinas en una célula inmunoefectora implicada en procesos inflamatorios, tales como las que estimulan el daño tisular secundario. Tales receptores incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, uno o más de los receptores conocidos en la técnica como el receptor antígeno de Duffy para quimioquinas (DARC), CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX_{3}CR-1, CD97, XCR1 y otros receptores de quimioquinas.
La Tabla 1 siguiente muestra una lista de quimioquinas representativas asociadas con respuestas inflamatorias patofisiológicas, incluyendo el daño tisular secundario, el(los) receptor(es) al(a los) que se une(n), y los tipos celulares afectados por cada una en humanos.
(Tabla pasa página siguiente)
TABLA 1
1
2
* indica unión con baja afinidad solamente.
** CC-R2 A y B son variantes ayustadas y se unen específicamente a MCP-1 y 3.
M = células del linaje de MNP (monocitos, macrófagos y microglía).
N = neutrófilos.
T = subtipos celulares de linfocitos T.
L = subtipos celulares de leucocitos.
E = eosinófilos.
B = basófilos.
NK = células destructoras naturales.
Dc = células dendríticas.
Adicionalmente, las quimioquinas incluyen ALP y Lungquina (ver, por ejemplo, las SEC ID N^{os} 69 y 70, respectivamente; ver, también, Hromas y col. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm., 258: 737-740) y Lungquina (ver, Rossi y col. (1999) J. Immunol., 162: 5490-5497), Tim-1, una quimioquina CXC humana (ver, por ejemplo, la Solicitud de PCT Internacional Nº WO 99/33990, basada en la Solicitud de EE.UU. Nº de Serie 09/026.546; ver también la base de datos de la EMBL ID HS1301003, Número de Acceso AA505654), las quimioquinas y péptidos similares a quimioquinas descritos en la Solicitud de PCT Internacional Nº WO 99/32631, la Lkn-1 descrita en la Solicitud de PCT Internacional Nº WO 99/28473, la quimioquina \alpha-5, la quimioquina \alpha-6, la quimioquina \beta15 y otras.
Los datos de la Tabla 1 corresponden a humanos. Puede haber diferencias entre especies entre las especificidades de los receptores de quimioquinas, y las quimioquinas pueden tener afinidades diferentes por receptores diferentes. Por tanto, pueden prepararse conjugados específicos para una especie. Pueden existir incluso diferencias alélicas en los receptores entre miembros de una especie y, si es necesario, pueden prepararse conjugados específicos para un alelo. Además, especies diferentes pueden expresar homólogos de quimioquinas humanas. Por ejemplo, TCA-3 es el homólogo murino de la I-309 humana (Goya y col., J. Immunol., 160: 1975-81, 1998).
Se comprende que se conocen otras quimioquinas y que tales quimioquinas y los receptores específicos de las mismas pueden ser identificados, y cuando sea necesario producidos y utilizados para producir conjugados según se describe en la presente. Las enfermedades para las cuales pueden utilizarse los conjugados resultantes pueden ser determinadas por la especificidad y las poblaciones celulares en las que se expresan receptores para los mismos, y también pueden ser determinadas empíricamente utilizando modelos in vitro e in vivo conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo los ejemplificados, descritos y/o referenciados en la presente.
b. Selección de una quimioquina
Las quimioquinas para utilización en los conjugados son seleccionadas de acuerdo con la enfermedad o trastorno a tratar y también de acuerdo con la pauta y duración del tratamiento. Por ejemplo, una quimioquina que presente un grado más elevado de especificidad por el receptor puede ser deseable en una etapa temprana del daño tisular secundario en la que, por ejemplo, la microglía y/o los macrófagos estén iniciando la inflamación. La eliminación de estas células con un agente muy específico puede reducir el potencial para activar las células circundantes y todavía benignas. Cuando son reclutados otros subgrupos de leucocitos, en etapas intermedias o tardías de la enfermedad, puede ser deseable un espectro más amplio de especificidad celular. Además, una quimiotoxina de amplio espectro apropiada proporcionará un golpe muy potente a aquellas poblaciones de leucocitos restringidas que expresan múltiples tipos de receptores de quimioquinas. Ciertas quimioquinas parecen tener más influencia que otras en estados de enfermedad específicos. Por ejemplo, la expresión de MCP-1 parece regular la EAE aguda, mientras que la expresión de MIP-1\alpha se correlaciona con la gravedad de la EAE recurrente, y la tinción inmunohistoquímica de especímenes de cerebro con AD indica un predominio de la expresión de MIP-1\beta sobre otras varias quimioquinas. Así, por ejemplo, MIP-1\alpha y MIP-1\beta serían los ligandos de elección para una quimioquina para tratar MS y la enfermedad de Alzheimer, respectivamente. Ligandos tales como IP-10 y RANTES, que son específicos para receptores CXCR3 y CCR5 que están regulados por incremento en casos de MS humana, serían utilizados para el tratamiento de la MS. Finalmente, las eotaxinas 1 y 2 presentan una elevada especificidad por el receptor de quimioquinas beta CCR3, que es expresado preferencialmente por eosinófilos. Por tanto, las quimiotoxinas eotaxinas pueden ser utilizadas para enfermedades eosinofílicas, incluyendo varias enfermedades pulmonares, el síndrome de mialgia-eosinofilia, alergia nasal y poliposis.
Eotaxina y SDF-1\beta son ejemplos de ligandos quimioquina que presentan un perfil de unión al receptor restringido y muy específico. Un ligando que está dirigido a tipos celulares muy específicos a través de un subgrupo restringido de receptores disponibles. MCP-3 y MCP-1 son ejemplos de ligandos con amplios perfiles de unión a células y receptores. Tales ligandos quimioquina pueden ser relevantes para un único rango o para un amplio rango de condiciones clínicas. Un ligando que esté dirigido a un amplio rango de tipos celulares utilizando subtipos de receptores puede ser expresado en todas las células o solamente en ciertas células. Ésta es principalmente una función de los tipos celulares que son específicos para una condición dada o comunes a un rango de condiciones.
La tabla siguiente resume algunos ligandos ejemplares para el tratamiento de enfermedades y condiciones seleccionadas.
TABLA 2 Ligando(s) ejemplar(es) y enfermedades tratadas
3
4
Los ligandos en cursiva son miembros de la familia de quimioquinas \alpha o CXC, los demás son miembros de la familia de quimioquinas \beta o de otras familias de quimioquinas.
Los ligandos indicados pueden ser utilizados en combinaciones para el tratamiento de las enfermedades indicadas.
El tratamiento combinado puede ser realizado también utilizando moléculas compuestas por dos o más, tal como dos quimioquinas diferentes unidas en cada extremo de un resto toxina. En ese caso, estas fusiones de quimioquinas dobles incluirían preferiblemente un ligando de cada una de las familias de quimioquinas \alpha y \beta.
En la Tabla 3 se presentan las secuencias de aminoácidos de agentes vectorizantes dirigidos a receptores de quimioquinas (ligandos) ejemplares para ser incorporados a los conjugados proporcionados en la presente.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Secuencias de aminoácidos de ligandos ejemplares
5
6
Todas las secuencias mostradas en la Tabla, excepto la de ALP (ver, Hromas y col. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm., 258: 737-740) y la de Lungquina (ver, Rossi y col. (1999) J. Immunol., 162: 5490-5497), son secuencias de la proteína humana. Una secuencia de nucleótidos para MCP-2 está mostrada en la SEC ID Nº 67, y secuencias de nucleótidos para la ALP de ratón y para la Lungquina de ratón están mostradas en las SEC ID N^{os} 69 y 70, respectivamente.
c. Citoquinas que no son quimioquinas
Conjugados que incluyen citoquinas que no son quimioquinas que se unen también a tipos celulares que expresan receptores de quimioquinas o a tipos celulares implicados en el daño tisular secundario, pueden ser también utilizados en los métodos aquí proporcionados. Los conjugados que incluyen tales citoquinas que no son quimioquinas han sido utilizados para otros tratamientos, tal como el tratamiento de cánceres por vectorización hacia las células tumorales. Se desea en la presente que las citoquinas sean seleccionadas por su capacidad para unirse a células portadoras de receptores de quimioquinas, tales como leucocitos que se infiltran en tumores, y a otras células asociadas con respuestas inflamatorias indeseables.
Las citoquinas que no son quimioquinas, los factores estimuladores de colonias (CSF) y las interleuquinas (IL) no quimioquinas útiles como resto ligando proteináceo para la vectorización hacia receptores en las células portadoras de receptores de quimioquinas incluyen, pero no se limitan a, polipéptido activador de monocitos endotelial II (EMAP-II), CSF de granulocito-macrófagos (GM-CSF), CSF de granulocitos (G-CSF), CSF de macrófagos (M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 e IL-13 que se unen, respectivamente, a las familias de receptores de las citoquinas EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 e IL-13 en las células implicadas en una respuesta inflamatoria, tales como las células que estimulan el daño tisular secundario.
Ejemplos de otras proteínas asociadas a receptores que pueden ser utilizadas como agentes vectorizantes para tratar o inhibir condiciones patofisiológicas asociadas con respuestas inflamatorias, son aquéllas que se unen a receptores de no quimioquinas en, y/o activan una o más de, las células que estimulan el daño tisular secundario, tales como, pero sin limitarse a, los receptores secuestradores de LDL acilada 1 y 2 y los receptores para LDL, lipoproteína de muy baja densidad-1 (VLDL-1), VLDL-2, glicoproteína 330/megalina, proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas (LRP), alfa-2-macroglobulina, sorLA-1. Una proteína asociada a receptores particularmente útil, todavía sin nombre, tiene un peso molecular de 39.000 daltons aproximadamente y se une a, y modula, la actividad de proteínas, tales como los miembros de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
d. Restos ligando que son anticuerpos
El resto ligando proteináceo en el conjugado vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas puede ser también un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, que sea específico para un receptor expresado en células implicadas en la respuesta inflamatoria, particularmente un receptor de quimioquinas y receptores expresados en células que expresan receptores de quimioquinas. Se prefiere que el anticuerpo monoclonal sea específico para un receptor de quimioquinas, por ejemplo DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, XCR-1, CX_{3}CR-1, CD97 y otros receptores semejantes.
En algunos casos, el anticuerpo puede ser específico para un receptor de citoquinas no quimioquinas EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 e IL-13. Los conjugados que contienen estos anticuerpos serán utilizados para su vectorización hacia células que expresan receptores de quimioquinas y también hacia los receptores de citoquinas diana o hacia células implicadas en el daño tisular secundario que expresen tales receptores de no quimioquinas.
Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales que pueden ser utilizados en los conjugados incluyen, pero no se limitan a, MAC-1, MAC-3, ED-1, ED-2, ED-3 y anticuerpos monoclonales contra los antígenos siguientes: CD5, 14, 15, 19, 22, 34, 35, 54 y 68; OX4, 6, 7, 19 y 42; Ber-H2, BR96, Fib75, EMB-11, HLA-DR, LN-1 y aglutinina-1 de Ricinus communis.
Pueden prepararse fragmentos de anticuerpo mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante expresión en E. coli de ADN que codifique el fragmento. Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos por métodos convencionales. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos de anticuerpo mediante el corte enzimático de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento de 5S denominado F(ab')_{2}. Este fragmento puede ser cortado posteriormente utilizando un agente reductor tiólico y, opcionalmente, un grupo bloqueante de los grupos sulfhidrilo resultantes del corte de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' de 3,5S. Alternativamente, un corte enzimático utilizando pepsina produce dos fragmentos monovalentes Fab' y un fragmento Fc directamente (ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.036.945 y 4.331.647, y las referencias contenidas en las mismas; ver también Porter, R.R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959). Pueden utilizarse también otros métodos para cortar anticuerpos, tales como la separación de las cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, el corte posterior de los fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Los fragmentos Fv contienen una asociación de cadenas V_{H} y V_{L}. Esta asociación puede ser no covalente, según está descrito en Inbar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2659-62, 1972. Alternativamente, las cadenas variables pueden ser unidas por un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzadas mediante productos químicos tal como glutaraldehido. Preferiblemente, los fragmentos Fv contienen cadenas V_{H} y V_{L} conectadas por un adaptador peptídico. Estas proteínas de una sola cadena que se unen al antígeno (sFv) son preparadas construyendo un gen estructural que contiene secuencias de ADN que codifican los dominios V_{H} y V_{L} conectadas por un oligonucleótido. El gen estructural es insertado en un vector de expresión, el cual es introducido posteriormente en una célula huésped tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un péptido adaptador que enlaza los dos dominios V. Métodos para producir sFvs están descritos, por ejemplo, por Whitlow y Filpula, Methods, 2: 97-105, 1991; Bird y col., Science, 242: 423-426, 1988; Pack y col., Bio/Technology, 11: 1271-77, 1993; y Ladner y col., Patente de EE.UU. Nº 4.946.778.
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Pueden obtenerse péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") mediante la construcción de genes que codifiquen la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes son preparados, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir de ARN de células productoras de anticuerpos (ver, por ejemplo, Larrick y col., Methods, 2: 106-10, 1991; y Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833-3837, 1989).
Pueden prepararse anticuerpos que se unan a un receptor de quimioquinas o a un receptor de citoquinas no quimioquinas en una célula estimuladora del daño tisular secundario utilizando como agente inmunizante un polipéptido intacto o un fragmento biológicamente funcional que contenga péptidos pequeños de interés. El polipéptido o el péptido utilizado para inmunizar a un animal (derivado por ejemplo de ADNc traducido o de síntesis química) puede ser conjugado si se desea a una proteína transportadora. Los vehículos comúnmente utilizados que son acoplados químicamente al péptido incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de la lapa ojo de cerradura (KLH), tiroglobulina, seroalbúmina bovina (BSA) y toxoide tetánico. El péptido acoplado es utilizado posteriormente para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo).
La preparación de anticuerpos monoclonales es convencional y bien conocida (ver, por ejemplo, Kohler y col., Nature, 256: 495-7, 1975; y Harlow y col., en: Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Pub., 1988)). Brevemente, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a ratones una composición que contenga un antígeno, verificando la presencia de la producción de anticuerpos mediante la extracción de una muestra de suero, extrayendo el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos hacia el antígeno y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridomas. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados a partir de los cultivos de hibridomas mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sefarosa, cromatografía por exclusión de tamaños y cromatografía de intercambio iónico, y son bien conocidas por los expertos en el oficio (ver, por ejemplo, Pharmacia Monoclonal Antibody Purification Handbook (por ejemplo, # de Catálogo 18-1037-46)).
Los anticuerpos pueden derivar también de anticuerpos de primates subhumanos. Técnicas generales para producir anticuerpos terapéuticamente útiles en babuinos pueden ser encontradas en, por ejemplo, Goldenberg y col., Publicación de Patente Internacional WO 91/11465 (1991) y Losman y col., Int. J. Cancer, 46: 310-314, 1990. Alternativamente, un anticuerpo terapéuticamente útil puede derivar de un anticuerpo monoclonal "humanizado". Los anticuerpos monoclonales humanizados son producidos transfiriendo regiones determinantes de la complementariedad de ratón procedentes de las cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano, y sustituyendo posteriormente los residuos humanos en las regiones de entramado de los equivalentes murinos. La utilización de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas. Técnicas generales para el clonaje de dominios variables de inmunoglobulinas murinas están descritas, por ejemplo, por Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3833-7, 1989. Técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados están descritas, por ejemplo, por Jones y col., Nature, 321: 522-5, 1986; Riechmann y col., Nature, 332: 323-7, 1988; Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-6, 1988; Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-9, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 12: 437-62, 1992; y Singer y col., J. Immunol., 150: 2844-67, 1993.
Es posible también utilizar la tecnología de anti-idiotipos para producir anticuerpos monoclonales que remeden un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico producido hacia un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que es la "imagen" del epítopo que se une al primer anticuerpo monoclonal.
3. Agentes vectorizados
Los agentes vectorizados incluyen cualquier agente que se desee administrar a un tipo celular seleccionado que exprese un receptor de quimioquinas diana. Estos agentes incluyen citotoxinas, tales como la cadena A de Shiga, ricina y saporina, fármacos de sustancialmente todas las clases incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, fármacos antibacterianos, antivirales, antifúngicos, anticancerosos, antimicoplasma, ácidos nucleicos y cualquier otro compuesto del que se desee una administración vectorizada a una célula de interés de la presente. Los fármacos para terapia del cáncer incluyen, en general, agentes alquilantes, agentes antiproliferativos, agentes que se unen a tubulina y otros fármacos similares. Otros agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, análogos de nucleósidos, la familia de fármacos de la antraciclina, los fármacos de la vinca, las mitomicinas. Los conjugados con el fármaco así construidos son eficaces para los fines habituales para los que los fármacos correspondientes son eficaces, y tienen una eficacia superior debido a la capacidad para transportar el fármaco a la célula en la que es particularmente beneficioso, incrementando de este modo la concentración eficaz en el lugar.
a. Restos que son toxinas celulares
Las toxinas celulares adecuadas para ser utilizadas en las composiciones y sus usos incluyen moléculas pequeñas, tales como agentes que cortan ADN, y toxinas celulares proteináceas incluyendo, pero no limitándose a, toxinas bacterianas, fúngicas, vegetales, de insectos, serpientes y arañas.
Las secuencias de aminoácidos de toxinas celulares ejemplares contempladas para ser incorporadas a los conjugados proporcionados en la presente están mostradas en la Tabla 4.
TABLA 4 Secuencias de aminoácidos de toxinas ejemplares
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(1) Agentes que cortan el ADN
Ejemplos de agentes que cortan el ADN adecuados para ser incluidos como la toxina celular en el ligando-toxina quimérico utilizado en la práctica de las composiciones y sus usos incluyen, pero no se limitan a, antraquinona-oligopirrol-carboxamida, bencimidazol, leinamicina; dinemicina A; enediina; así como análogos o derivados de los mismos biológicamente activos (esto es, aquéllos que tienen una actividad biológica sustancialmente equivalente). Análogos y derivados conocidos están descritos en, por ejemplo, Islam y col., J. Med. Chem., 34: 2954-61, 1991; Skibo y col., J. Med. Chem., 37: 78-92, 1994; Behroozi y col., Biochemistry, 35: 1568-74, 1996; Helissey y col., Anticancer Drug Res., 11: 527-51, 1996; Unno y col., Chem. Pharm. Bull., 45: 125-33, 1997; Unno y col., Bioorg. Med. Chem., 5: 903-19, 1997; Unno y col., Bioorg. Med. Chem., 5: 883-901, 1997; y Xu y col., Biochemistry, 37: 1890-7, 1998). Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, iminoquinonas de endiina (Patente de EE.UU. Nº 5.622.958); 2,2r-bis (2-aminoetil)-4-4'-bitiazol (Lee y col., Biochem. Mol. Biol. Int., 40: 151-7, 1996); conjugados de epiliticina-salen.cobre (Routier y col., Bioconjug. Chem., 8: 789-92, 1997).
(2) Antimetabolitos
Ejemplos de antimetabolitos útiles para ser incluidos como la toxina celular en el ligando-toxina quimérico incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, metotrexato, melfalán, daunomicina, doxorrubicina, mostaza nitrogenada y mitomicina C.
(3) Toxinas celulares proteináceas
Ejemplos de toxinas celulares proteináceas útiles para ser incorporadas en los ligando-toxinas quiméricos utilizados en las composiciones y sus usos incluyen, pero no se limitan a, proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo uno y de tipo dos (RIP). RIPs de plantas de tipo uno útiles incluyen, pero no se limitan a, diantina 30, diantina 32, licnina, saporinas 1-9, proteína activada de fitolaca (PAP), PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, Colocina 1 y 2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, proteína inhibidora de la síntesis de proteínas (PSI)-19K, PSI-15K, PSI-9K, alfa-kirilowina, beta-kirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, MAP-30, alfa-momorcharina, beta-momorcharina, tricosantina, TAP-29, tricoquirina; RIP de cebada; RIP de lino, tritina, RIP de maíz, Asparina 1 y 2 (Stirpe y col., Bio/Technology, 10: 405-12, 1992). RIPs de tipo dos útiles incluyen, pero no se limitan a, volkensina, ricina, nigrina-b, CIP-29, abrina, modeccina, ebulitina-\alpha, ebulitina-\beta, ebulitina-\gamma, vircumina, porrectina, así como las subunidades enzimáticas de las mismas biológicamente activas (Stirpe y col., Bio/Technology, 10: 405-12, 1992; Pastan y col., Annu. Rev. Biochem., 61: 331-54; Brinkmann y Pastan, Biochim. et Biophys. Acta, 1198: 27-45, 1994; y Sandvig y Van Deurs, Physiol. Rev., 76: 949-66, 1996).
(4) Toxinas bacterianas
Ejemplos de toxinas bacterianas útiles como toxinas celulares incluyen, pero no se limitan a, la toxina de Shiga y toxinas similares a la de Shiga (esto es, toxinas que tienen la misma actividad o estructura), así como las subunidades catalíticas y fragmentos biológicamente funcionales de las mismas. Estas toxinas bacterianas son también RIPs de tipo dos (Sandvig y Van Deurs, Physiol. Rev., 76: 949-66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis., 171: 1042-5, 1995; Kim y col., Microbiol. Immunol., 41: 805-8, 1997 y Skinner y col., Microb. Pathog., 24: 117-22, 1988). Ejemplos adicionales de toxinas bacterianas útiles incluyen, pero no se limitan a, exotoxina de Pseudomonas y toxina de Diphtheria (Pastan y col., Annu. Rev. Biochem., 61: 331-54; y Brinkmann y Pastan, Biochim. et Biophys. Acta, 1198: 27-45, 1994). Pueden utilizarse también como resto toxina celular formas truncadas y mutantes de las subunidades enzimáticas de las toxinas (Pastan y col., Annu. Rev. Biochem., 61: 331-54; Brinkmann y Pastan, Biochim. et Biophys. Acta, 1198: 27-45, 1994; Mesri y col., J. Biol. Chem., 268: 4852-62, 1993; Skinner y col., Microb. Pathog., 24: 117-22, 1998; y Patente de EE.UU. Nº 5.082.927). Otros agentes vectorizados incluyen, pero no se limitan a, las más de 34 colicinas descritas de la familia de toxinas ARNasa que incluyen las colicinas A, B, D, E1-9, cloacina DF13 y la ARNasa fúngina, \alpha-sarcina (Ogawa y col., Science, 283: 2097-100, 1999; Smarda y col., Folia Microbiol. (Praha), 43: 563-82, 1998; Wool y col., Trends Biochem. Sci., 17: 266-69, 1992).
(5) Porfirinas y otras toxinas activadas por la luz
Las porfirinas son toxinas bien conocidas activables por la luz que pueden ser fácilmente entrecruzadas con proteínas (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.257.970; Patente de EE.UU. Nº 5.252.720; Patente de EE.UU. Nº 5.238.940; Patente de EE.UU. Nº 5.192.788; Patente de EE.UU. Nº 5.171.749; Patente de EE.UU. Nº 5.149.708; Patente de EE.UU. Nº 5.202.317; Patente de EE.UU. Nº 5.217.966; Patente de EE.UU. Nº 5.053.423; Patente de EE.UU. Nº 5.109.016; Patente de EE.UU. Nº 5.087.636; Patente de EE.UU. Nº 5.028.594; Patente de EE.UU. Nº 5.093.349; Patente de EE.UU. Nº 4.968.715; Patente de EE.UU. Nº 4.920.143 y la Solicitud Internacional WO 93/02192).
b. Ácidos nucleicos para administración vectorizada
Los conjugados proporcionados en la presente pueden ser también utilizados para administrar ácidos nucleicos a células diana. Los ácidos nucleicos incluyen ADN destinado a modificar el genoma de una célula y efectuar de este modo una terapia génica, y ADN y ARN para ser utilizados como agentes antisentido. Los ácidos nucleicos incluyen ARN antisentido, ADN, ribozimas y otros oligonucleótidos que se desee utilizar como agentes antisentido. Los ácidos nucleicos pueden incluir también señales para el tráfico de ARN, tales como secuencias de empaquetamiento de virus (ver, por ejemplo, Sullenger y col. (1994) Science, 262: 1566-1569). Los ácidos nucleicos incluyen también moléculas de ADN que codifican genes intactos o que codifican proteínas destinadas a ser utilizadas en terapia génica.
El ADN (o el ARN) que puede ser administrado a una célula para efectuar una terapia génica incluye ADN que codifica moléculas citotóxicas específicas para un tumor, tales como el factor de necrosis tumoral, antígenos víricos y otras proteínas para hacer que la célula sea susceptible a agentes anticancerosos, y ADN que codifica genes, tales como el gen defectuoso (CFTR), asociado con la fibrosis quística (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 93/03709, que está basada en la Solicitud de EE.UU Nº de Serie 07/745.900; y Riordan y col. (1989) Science, 245: 1066-1073), para sustituir genes defectuosos. De particular interés en la presente serían, por ejemplo, genes que expresaran factores de crecimiento del SNC, que podrían ser administrados a células del SNC, tales como las implicadas en la SCI, y para ayudar a la regeneración del tejido dañado.
Los ácidos nucleicos y los oligonucleótidos para ser utilizados según se describe en la presente pueden ser sintetizados mediante cualquier método conocido por los expertos en esta técnica (ver, por ejemplo, WO 93/01286, que está basada en la Solicitud de EE.UU. Nº de Serie 07/723.454; Patente de EE.UU. Nº 5.218.088; Patente de EE.UU. Nº 5.175.269; Patente de EE.UU. Nº 5.109.124). La identificación de oligonucleótidos y ribozimas para ser utilizados como agentes antisentido está dentro de la experiencia en esta técnica. La selección de ADN que codifica genes para la administración vectorizada en terapia génica está también dentro del nivel de experiencia de las personas que están en esta técnica. Por ejemplo, las propiedades, longitudes y otras características deseables de tales oligonucleótidos son bien conocidas. Los oligonucleótidos antisentido son diseñados para que resistan la degradación por los enzimas nucleolíticos endógenos e incluyen, pero no se limitan a: enlaces fosforotioato, metilfosfonato, sulfona, sulfato, cetilo, fosforoditioato, fosforamidato, ésteres de fosfato y otros enlaces similares (ver, por ejemplo, Agrawal y col. (1987) Tetrahedron Lett., 28: 3539-3542; Miller y col. (1971) J. Am. Chem. Soc., 93: 6657-6665; Stec y col. (1985) Tetrahedron Lett., 26: 2191-2194; Moody y col. (1989) Nucl. Acids Res., 17: 4769-4782; Letsinger y col. (1984) Tetrahedron, 40: 137-143; Eckstein (1985) Annu. Rev. Biochem., 54: 367-402; Eckstein (1989) Trends Biol. Sci., 14: 97-100; Stein (1989) En: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed., Macmillan Press, London, pp. 97-117; Jager y col. (1988) Biochemistry, 27: 7237-7246).
(1) Nucleótidos antisentido, incluyendo: oligonucleótidos antisentido; moléculas tricatenarias; oligonucleótidos con forma de pesa; ADN; oligonucleótidos que se unen a proteínas extracelulares y moléculas de nucleótidos pequeñas
Los nucleótidos antisentido son oligonucleótidos que se unen específicamente a ARNm que tiene secuencias complementarias, impidiendo de este modo la traducción del ARNm (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.168.053 para Altman y col.; Patente de EE.UU. Nº 5.190.931 para Inouye; Patente de EE.UU. Nº 5.135.917 para Burch; Patente de EE.UU. Nº 5.087.617 para Smith; y Clusel y col. (1993) Nucl. Acids Res., 21: 3405-3411, que describe oligonucleótidos antisentido con forma de pesa). Las moléculas tricatenarias se refieren a hebras de ADN sencillas que se dirigen a ADN bicatenario e impiden de este modo la transcripción (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.176.996 para Hogan y col. que describe métodos para producir oligonucleótidos sintéticos que se unen a sitios diana en ADN bicatenario).
(2) Ribozimas
Los ribozimas son construcciones de ARN que cortan específicamente ARN mensajero. Existen al menos cinco clases de ribozimas que se sabe que están implicadas en el corte y/o la ligadura de cadenas de ARN. Los ribozimas pueden ser vectorizados hacia cualquier transcrito de ARN y pueden cortar catalíticamente tal transcrito (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.272.262; Patente de EE.UU. Nº 5.144.019; y Patentes de EE.UU. N^{os} 5.168.053, 5.180.818, 5.116.742 y 5.093.246 para Cech y col. que describen ribozimas y métodos para la producción de los mismos). Cualquiera de tales ribozimas puede ser unido al agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas para su administración a células portadoras de receptores de quimioquinas.
Los ribozimas pueden ser administrados a las células diana como ADN que codifica el ribozima unido a un promotor eucariótico, tal como un promotor vírico eucariótico, generalmente un promotor tardío, de tal manera que después de la introducción en el núcleo el ribozima será transcrito directamente. En tales casos, la construcción incluirá también una secuencia de translocación nuclear, generalmente como parte del agente vectorizante o como parte de una orden para la producción de un adaptador con el fin de convertirla en una forma adecuada para la administración de ácidos nucleicos ligados al núcleo.
(3) Ácidos nucleicos que codifican productos terapéuticos para su administración vectorizada
Entre los ADNs que codifican productos terapéuticos contemplados para su utilización, está el ADN que codifica copias correctas de genes defectuosos, tal como el gen defectuoso (CFTR) asociado con la fibrosis quística (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 93/03709, que está basada en la Solicitud de EE.UU Nº de Serie 07/745.900; y Riordan y col. (1989) Science, 245: 1066-1073), y agentes anticancerosos tales como los factores de necrosis tumoral, y agentes citotóxicos, tales como la toxina A1 de Shiga o la saporina, para células portadoras de receptores de quimioquinas. El conjugado debe incluir una NTS. Si el conjugado está diseñado de tal manera que el agente vectorizante y el ADN ligado son cortados en el citoplasma, entonces la NTS debe ser incluida en una porción del adaptador que permanezca unida al ADN a fin de que, después de la internalización, el conjugado sea dirigido hacia el núcleo. La secuencia de translocación nuclear (NTS) puede ser una secuencia heteróloga o puede derivar del agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas seleccionado. Una secuencia NTS consenso típica contiene una prolina o glicina aminoterminal seguida por al menos tres residuos básicos en una serie de siete a nueve aminoácidos (ver, por ejemplo, Dang y col. (1989) J. Biol. Chem., 264: 18019-18023, Dang y col. (1988) Mol. Cell. Biol., 8: 4048-4058 y la Tabla 2, que presenta ejemplos de NTSs y regiones de proteínas que comparten homología con NTSs conocidas).
(4) Acoplamiento de ácidos nucleicos a proteínas
Para realizar la conjugación química de la presente, el agente vectorizante es ligado al ácido nucleico directamente o bien a través de uno o más adaptadores. Los métodos para conjugar ácidos nucleicos, en los extremos 5', en los extremos 3' y en otros lugares, a los extremos amino y carboxilo y a otros sitios de las proteínas, son conocidos por los expertos en la técnica (para una revisión ver, por ejemplo, Goodchild (1993) En: Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Mears, Ed., American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 77-99). Por ejemplo, se han ligado proteínas a ácidos nucleicos utilizando irradiación ultravioleta (Sperling y col. (1978) Nucleic Acids Res., 5: 2755-2773; Fiser y col. (1975) FEBS Lett., 52: 281-283), productos químicos bifuncionales (Bäumert y col. (1978) Eur. J. Biochem., 89: 353-359; y Oste y col. (1979) Mol. Gen. Genet., 168: 81-86), entrecruzamiento fotoquímico (Vanin y col. (1981) FEBS Lett., 124: 89-92; Rinke y col. (1980) J. Mol. Biol., 137: 301-314; Millon y col. (1980) Eur. J. Biochem., 110: 485-454).
En particular, se han utilizado los reactivos N-acetil-N'-(p-glioxililbenzolil)cistamina y 2-iminotiolano para acoplar ADN a proteínas, tal como \alpha_{2}-macroglobulina (\alpha_{2}M), a través de la formación de disulfuros mixtos (ver, Cheng y col. (1983) Nucleic Acids Res., 11: 659-669). La N-acetil-N'-(p-glioxililbenzolil)cistamina reacciona específicamente con residuos de guanina no apareados y, después de la reducción, genera un grupo sulfhidrilo libre. El 2-iminotiolano reacciona con las proteínas para generar grupos sulfhidrilo que son conjugados posteriormente al ADN derivatizado mediante una reacción de intercambio de disulfuros intermolecular. Puede utilizarse cualquier enlace con la condición de que, después de la internalización del conjugado, el ácido nucleico vectorizado sea activo. Por tanto, se espera que pueda ser necesario el corte del enlace, aunque se contempla que para algunos reactivos, tales como ADN que codifica ribozimas unido a promotores o ADN que codifica agentes terapéuticos para su administración al núcleo, tal corte pueda no ser necesario.
Pueden formarse fácilmente enlaces tiol utilizando reactivos heterobifuncionales. Se han unido también aminas al fosfato 5' terminal de oligonucleótidos o ácidos nucleicos no protegidos en soluciones acuosas, haciendo reaccionar el ácido nucleico con una carbodiimida soluble en agua, tal como 1-etil-3'(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o N-etil-N'(3-dimetilaminopropil)carbodiimida-clorhidrato (EDCI), en tampón imidazol a PH 6 para producir el 5'-fosforimidazólido. La puesta en contacto del 5'-fosforimidazólido con moléculas que contengan amina y etiléndiamina, tiene como resultado fosforamidatos estables (ver, por ejemplo, Chu y col. (1983) Nucleic Acids Res., 11: 6513-6529; y WO 88/05077 en la que se nombra la de EE.UU.). En particular, una solución de ADN es saturada con EDC, a pH 6, e incubada con agitación a 4ºC durante una noche. La solución resultante es tamponada posteriormente a pH 8,5 mediante la adición de, por ejemplo, 3 volúmenes aproximadamente de tampón citrato 100 mM, y se añaden 5 \mug aproximadamente-20 \mug aproximadamente de un agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas y se agita la mezcla resultante a 4ºC durante 48 horas aproximadamente. La proteína no reaccionada puede ser eliminada de la mezcla mediante cromatografía en columna utilizando, por ejemplo, SEPHADEX G75 (Pharmacia), empleando como tampón eluyente una solución de carbonato de amonio 0,1 M, pH 7,0. El conjugado aislado puede ser liofilizado y almacenado hasta su utilización.
La Patente de EE.UU. Nº 5.237.016 proporciona métodos para preparar nucleótidos que están bromoacetilados en sus extremos 5' y la reacción de los oligonucleótidos resultantes con grupos tiol. Pueden prepararse oligonucleótidos derivatizados en sus grupos bromoacetilo 5'-terminales mediante la reacción de los oligonucleótidos 5'-aminohexil-fosforamidato con el éster N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.237.016. La Patente de EE.UU. Nº 5.237.016 describe también métodos para preparar nucleótidos derivatizados con tiol, que pueden hacerse reaccionar posteriormente con los grupos tiol del factor de crecimiento seleccionado. Brevemente, los nucleótidos derivatizados con tiol son preparados utilizando un nucleótido 5'-fosforilado en dos etapas: (1) reacción del grupo fosfato con imidazol en presencia de una diimida y desplazamiento del grupo imidazol saliente con cistamina en una etapa de reacción; y (2) reducción del enlace disulfuro del adaptador cistamina con ditiotreitol (ver, también, Chu y col., (1988) Nucl. Acids Res., 16: 5671-5691, que describe un procedimiento similar). Los oligonucleótidos 5'-fosforilados de partida pueden ser preparados por métodos conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Maniatis y col. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p. 122).
El oligómero o el ácido nucleico antisentido, tal como un oligonucleótido metilfosfonato (MP-oligómero), puede ser derivatizado mediante reacción con SPDP o SMPB. El MP-oligómero resultante puede ser purificado por HPLC y acoplado posteriormente al agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas. El MP-oligómero (0,1 \muM aproximadamente) es disuelto en 40-50 \mul aproximadamente de acetonitrilo/agua 1:1 al que se añade tampón fosfato (pH 7,5, concentración final 0,1 M) y 1 mg de MP-oligómero en 1 ml aproximadamente de solución salina tamponada con fosfato. Se deja proceder la reacción durante 5-10 horas aproximadamente a temperatura ambiente y es luego amortiguada con 15 \mul aproximadamente de yodoacetamida 0,1. Los conjugados pueden ser purificados en columnas de heparina Sefarosa Hi Trap (1 ml, Pharmacia), y eluidos con un gradiente lineal o gradual. El conjugado debe eluir en NaCl 0,6 M.
4. Restos adaptadores
En la preparación de los conjugados proporcionados en la presente, la toxina celular es unida directamente o indirectamente al agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas del ligando-toxina quimérico mediante cualquier método conocido actualmente en la técnica para unir dos restos, siempre que la unión del resto adaptador al ligando proteináceo no impida sustancialmente la unión del ligando proteináceo a la célula diana, esto es, a un receptor en la célula diana, ni impida sustancialmente la internalización o el metabolismo del ligando-toxina para disminuir la toxicidad de la toxina celular para la célula diana. El enlace puede ser cualquier tipo de enlace incluyendo, pero no limitándose a, enlaces iónicos y covalentes y cualquier otra asociación suficientemente estable mediante la cual el agente vectorizado será internalizado por una célula a la que está dirigido el conjugado.
El agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas es unido opcionalmente al agente vectorizado a través de uno o más adaptadores. El resto adaptador es seleccionado dependiendo de las propiedades deseadas. Por ejemplo, puede elegirse la longitud del resto adaptador para optimizar la cinética y la especificidad de la unión del ligando, incluyendo cualquier cambio conformacional inducido por la unión del ligando a un receptor diana. El resto adaptador debe ser suficientemente largo y suficientemente flexible para permitir que el resto ligando proteináceo y el receptor de la célula diana interaccionen libremente. Si el adaptador es demasiado corto o demasiado rígido, puede haber impedimento estérico entre el resto ligando proteináceo y la toxina celular. Si el resto adaptador es demasiado largo, la toxina celular puede ser proteolisada en el proceso de producción, o puede no transmitir eficazmente su efecto tóxico a la célula diana. Estos adaptadores químicos pueden ser unidos a ligandos purificados utilizando numerosos protocolos conocidos en la técnica, tales como los descritos en los Ejemplos 1 y 2 (ver, "Solutions, Cross-linking of Proteins: Basic Concepts Strategies", Seminario #12, Pierce Chemicals, Rockford, IL).
Adaptadores ejemplares
Puede utilizarse en la presente cualquier adaptador conocido por los expertos en la técnica. Generalmente, en los conjugados que son proteínas de fusión se utilizará un conjunto de adaptadores diferente de los adaptadores utilizados en los conjugados producidos químicamente. Los adaptadores y los enlaces que son adecuados para los conjugados unidos químicamente incluyen, pero no se limitan a, enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces disulfuro impedidos y enlaces covalentes entre grupos reactivos libres, tales como grupos amina y tiol. Estos enlaces son producidos utilizando reactivos heterobifuncionales para producir grupos tiol reactivos en uno o en los dos polipéptidos y haciendo reaccionar posteriormente los grupos tiol de un polipéptido con grupos tiol o grupos amina reactivos, a los que pueden unirse grupos maleimido o grupos tiol reactivos, del otro polipéptido. Otros adaptadores incluyen adaptadores susceptibles de ser cortados con ácido, tal como bismaleimideotoxi propano, conjugados de transferrina lábiles al ácido y dihidrazida del ácido adípico, que serían cortados en compartimientos intracelulares más ácidos; entrecruzadores que son cortados después de la exposición a luz UV o visible y adaptadores tales como los diferentes dominios, tales como C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3 de la región constante de la IgG_{1} humana (ver, Batra y col. (1993) Molecular Immunol., 30: 379-386). En algunas realizaciones, pueden incluirse varios adaptadores con el fin de aprovechar las propiedades deseadas de cada adaptador.
Pueden insertarse adaptadores químicos y adaptadores peptídicos mediante acoplamiento covalente del adaptador al agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas (TA) y al agente vectorizado. Los agentes heterobifuncionales descritos a continuación pueden ser utilizados para realizar tal acoplamiento covalente. Los adaptadores peptídicos pueden ser también unidos mediante la expresión de ADN que codifique el adaptador y TA, el adaptador y el agente vectorizado o el adaptador, el agente vectorizado y el TA como una proteína de fusión. Se contempla también en la presente la utilización de adaptadores flexibles y de adaptadores que incrementen la solubilidad de los conjugados, ya sea solos o con otros adaptadores.
a. Reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales
Los expertos en esta técnica conocen numerosos reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales que son utilizados para formar enlaces covalentes entre grupos amino y grupos tiol y para introducir grupos tiol en proteínas (ver, por ejemplo, el Catálogo de Pierce, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993, que describe la preparación y la utilización de tales reactivos y proporciona una fuente comercial de tales reactivos; ver, también, por ejemplo, Cumber y col. (1992) Bioconjugate Chem., 3: 397-401; Thorpe y col. (1987) Cancer Res., 47: 5924-5931; Gordon y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 308-312; Walden y col. (1986) J. Mol. Cell Immunol., 2: 191-197; Carlsson y col. (1978) Biochem. J., 173: 723-737; Mahan y col. (1987) Anal. Biochem., 162: 163-170; Wawryznaczak y col. (1992) Br. J. Cancer, 66: 361-366; Fattom y col. (1992) Infection & Immun., 60: 484-589). Estos reactivos pueden ser utilizados para formar enlaces covalentes entre el agente vectorizante, la quimioquina y el agente vectorizado. Estos reactivos incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP; adaptador disulfuro); sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]-hexanoato (sulfo-LC-SPDP); succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil bencil tiosulfato (SMBT, adaptador disulfato impedido); succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]-hexanoato (LC-SPDP); sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC); succinimidil-3-(2-piridilditio)-butirato (SPDB; adaptador con enlace disulfuro impedido); sulfosuccinimidil-2-(7-azido-4-metilcoumarin-3-acetamida)-etil-1,3'-ditiopropionato (SAED); sulfosuccinimidil-7-azido-4-metilcoumarin-3-acetato (SAMCA); sulfosuccinimidil-6-[\alpha-metil-\alpha-(piridilditio)-toluamido]-hexanoato (sulfo-LC-SMPT); 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido]-butano (DPDPB); 4-succinimidiloxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridiltio)-tolueno (SMPT, adaptador disulfato impedido); sulfosuccinimidil-6-[\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)-toluamido)-hexanoato (sulfo-LC-SMPT); éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS); N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB, adaptador tioéter); sulfosuccinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato (sulfo-SIAB); succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB); sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (sulfo-SMPB); azidobenzoil hidrazida (ABH).
Otros entrecruzadores heterobifuncionales que pueden ser cortados incluyen, N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato; sulfosuccinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato; 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio)-tolueno;
sulfosuccinimidil-6-[\alpha-metil-\alpha-(piridilditio)-toluamido]-hexanoato; N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato; succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]-hexanoato; sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]-hexa-
noato; 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazínico, S-(2-tiopiridil)-L-cisteína. Más compuestos adaptadores bifuncionales ejemplares están descritos en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.349.066, 5.618.528, 4.569.789, 4.952.394 y 5.137.877.
b. Adaptadores susceptibles de ser cortados por ácido, fotocortables y sensibles al calor
Pueden utilizarse también adaptadores susceptibles de ser cortados por ácido, fotocortables y sensibles al calor, particularmente cuando pueda ser necesario cortar el agente vectorizado para permitir que el mismo sea accesible más fácilmente a la reacción. Los adaptadores que pueden ser cortados por ácido incluyen, pero no se limitan a, bismaleimideotoxi propano; y adaptadores dihidrazida de ácido adípico (ver, por ejemplo, Fattom y col. (1992) Infection & Immun., 60: 584-589) y conjugados de transferrina lábiles a ácido que contienen una porción suficiente de transferrina para permitir la entrada en la ruta del ciclo de transferrina intracelular (ver, por ejemplo, Welhöner y col. (1991) J. Biol. Chem., 266: 4309-4314).
Los adaptadores fotocortables son adaptadores que son cortados después de una exposición a luz (ver, por ejemplo, Goldmacher y col. (1992) Bioconj. Chem., 3: 104-107), liberando de este modo el agente vectorizado después de la exposición a luz. Se conocen adaptadores fotocortables que son cortados después de la exposición a luz (ver, por ejemplo, Hazum y col. (1981) en Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16ª, Brunfeldt, K. (Ed), pp. 105-110, que describe la utilización de un grupo nitrobencilo como grupo protector fotocortable para cisteína; Yen y col. (1989) Makromol. Chem., 190: 69-82, que describe copolímeros fotocortables solubles en agua, incluyendo copolímeros de hidroxipropilmetacrilamida, copolímeros de glicina, copolímeros de fluoresceína y copolímeros de metilrodamina; Goldmacher y col. (1992) Bioconj. Chem., 3: 104-107, que describe un entrecruzador y un reactivo que experimenta degradación fotolítica después de la exposición a luz UV cercana (350 nm); y Senter y col. (1985) Photochem. Photobiol., 42: 231-237, que describe reactivos de entrecruzamiento de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo que producen enlaces fotocortables), liberando de este modo el agente vectorizado después de la exposición a luz. Tales adaptadores tendrían una utilización particular en el tratamiento de condiciones dermatológicas u oftálmicas que pueden ser expuestas a la luz utilizando fibra óptica. Después de la administración del conjugado, el ojo o la piel, u otra parte del cuerpo, pueden ser expuestos a la luz, teniendo como resultado la liberación del resto vectorizado del conjugado. Tales adaptadores fotocortables son útiles en conexión con protocolos de diagnóstico en los que es deseable eliminar el agente vectorizante para permitir una desaparición rápida del organismo del animal.
c. Otros adaptadores para conjugación química
Otros adaptadores incluyen adaptadores de tritilo, particularmente, grupos tritilo derivatizados para producir un género de conjugados que proporcionan la liberación de agentes terapéuticos a varios grados de acidez o alcalinidad. La flexibilidad así conseguida por la capacidad para preseleccionar el rango de pH al que será liberado el agente terapéutico, permite la selección de un adaptador basada en las diferencias fisiológicas conocidas entre tejidos que necesitan la administración de un agente terapéutico (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 5.612.474). Por ejemplo, la acidez de los tejidos tumorales parece ser más baja que la de los tejidos normales.
d. Adaptadores peptídicos
Los restos adaptadores pueden ser péptidos. Pueden emplearse adaptadores peptídicos en proteínas de fusión y también en conjugados unidos químicamente. El péptido tiene típicamente de 2 aproximadamente a 60 residuos de aminoácidos aproximadamente, por ejemplo de 5 aproximadamente a 40 aproximadamente, o de 10 aproximadamente a 30 residuos de aminoácidos aproximadamente. La longitud seleccionada dependerá de factores tales como la utilización para la cual se ha incluido el adaptador.
El ligando proteináceo se une con especificidad a un receptor(es) en una o más de la(s) célula(s) diana y es captado por la(s) célula(s) diana. Con el fin de facilitar el pase del ligando-toxina quimérico a la célula diana, actualmente se prefiere que el tamaño del ligando-toxina quimérico no sea mayor que el que puede ser captado por la célula diana de interés. Generalmente, el tamaño del ligando-toxina quimérico dependerá de su composición. En el caso en el que el ligando-toxina quimérico contenga un adaptador químico y una toxina química (esto es, en lugar de una proteinácea), el tamaño del ligando-toxina es generalmente menor que cuando el ligando-toxina quimérico es una proteína de fusión. Los adaptadores peptídicos pueden estar codificados convenientemente por un ácido nucleico y ser incorporados a proteínas de fusión después de la expresión en una célula huésped tal como E. coli.
Los adaptadores peptídicos son ventajosos cuando el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es proteináceo. Por ejemplo, el resto adaptador puede ser una secuencia de aminoácidos separadora flexible, tales como las conocidas en la investigación de anticuerpos de cadena sencilla. Ejemplos de tales restos adaptadores conocidos incluyen, pero no se limitan a, GGGGS (SEC ID Nº:1), (GGGGS)_{n} (SEC ID Nº:2), GKSSGSGSESKS (SEC ID Nº:3), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID Nº:4), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEC ID Nº:5), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID Nº:6), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEC ID Nº:7), EGKSSGSGSESKEF (SEC ID Nº:8), SRSSG (SEC ID Nº:9), SGSSC (SEC ID Nº:10). Es también útil un adaptador sensible a tripsina de la toxina de Diphtheria que tiene la secuencia AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM (SEC ID Nº:11).
Alternativamente, el resto adaptador peptídico puede ser VM o AM, o puede tener la estructura descrita por la fórmula: AM(G_{2 \ a \ 4}S)_{x}AM, en la que X es un número entero de 1 a 11 (SEC ID Nº:12). Restos adaptadores adicionales están descritos en, por ejemplo, Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988; Whitlow, M. y col., Protein Engineering, 6: 989-995, 1993; Newton y col., Biochemistry, 35: 545-553, 1996; A.J. Cumber y col., Bioconj. Chem., 3: 397-401, 1992; Ladurner y col., J. Mol. Biol., 273: 330-337, 1997; y Patente de EE.UU. Nº 4.894.443.
Otros adaptadores incluyen, pero no se limitan a: sustratos enzimáticos tales como un sustrato de catepsina B, un sustrato de catepsina D, un sustrato de tripsina, un sustrato de trombina, un sustrato de subtilisina, un sustrato del Factor Xa y un sustrato de enteroquinasa; los adaptadores que incrementan la solubilidad, flexibilidad y/o la capacidad de corte intracelular incluyen adaptadores tales como (Gly_{m}Ser)_{n} y (Ser_{m}Gly)_{n}, en los cuales m es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 2 a 4, y n es de 1 a 30, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 4 (ver, por ejemplo, Solicitud de PCT Internacional Nº WO 96/06641, que proporciona adaptadores ejemplares para ser utilizados en conjugados). En algunas realizaciones, pueden incluirse varios adaptadores con el fin de aprovechar las propiedades deseadas de cada adaptador.
D. Preparación de conjugados
Los conjugados con agentes vectorizados ligados pueden ser preparados mediante conjugación química, tecnología de ADN recombinante o combinaciones de expresión recombinante y conjugación química. Los métodos de la presente están ejemplificados con referencia particular a quimioquinas y Shiga-A1 o saporina. Se comprende, sin embargo, que pueden emplearse los mismos métodos para preparar y utilizar conjugados de cualquier agente vectorizante con cualquier agente vectorizado, tal como una RIP, un ácido nucleico o cualquier otro agente vectorizado, ya sea directamente o a través de adaptadores según se describe en la presente. El agente vectorizante y el agente vectorizado pueden ser ligados en cualquier orientación, y en un conjugado puede estar presente más de un agente vectorizante y/o más de un agente vectorizado.
1. Producción de proteínas de fusión
El ligando quimioquina y/o las proteínas de fusión quiméricas pueden ser producidos mediante técnicas bien conocidas de síntesis de proteínas si se conoce la secuencia de aminoácidos de la quimioquina y/o de la toxina celular, o, si es necesario, la secuencia puede ser determinada primeramente mediante métodos bien conocidos descritos más adelante. Algunos de los genes de los ligandos están actualmente disponibles comercialmente. Una ventaja de obtener genes comercialmente disponibles es que generalmente han sido optimizados para la expresión en E. coli. Un polinucleótido que codifique una proteína, un péptido o un polipéptido de interés puede ser producido utilizando la tecnología de síntesis de ADN. Más adelante se describen métodos para obtener el ADN que codifica un gen no disponible y expresar a partir del mismo un producto génico, y se ilustran en el Ejemplo 1 de la presente.
El ligando-toxina quimérico, que incluye un ligando quimioquina, un resto adaptador proteináceo y una toxina celular proteinácea, puede ser también producido como una proteína de fusión que tenga la estructura general ilustrada en la Figura 1. La proteína de fusión es producida utilizando técnicas bien conocidas en las que una célula huésped es transfectada con un vector de expresión que contiene secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la expresión de la proteína de fusión (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook y col., eds., 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989).
La Tabla 5 siguiente ilustra el tamaño y el pI teóricos de conjugados de un ligando vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas representativos y también de conjugados que contienen citoquinas no quimioquinas que se unen a poblaciones celulares que expresan receptores de quimioquinas. Los conjugados con citoquinas no quimioquinas, tales como conjugados que contienen IL-4, han sido utilizados previamente para proporcionar la administración vectorizada a células tumorales, pero no han sido utilizados para tratar condiciones inflamatorias patológicas tales como el daño tisular secundario.
TABLA 5 Pesos moleculares y puntos isoeléctricos teóricos de ligandos humanos libres y de proteínas de fusión ligando-Saporina 6 (unidos por un adaptador ALA-MET)
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CLAVE: (A) Quimioquinas CC; (B) Quimioquinas CXC; (C) Proteína Asociada al Receptor para el Receptor de LDL; (D) Toxina más adaptador; (E) Citoquinas no quimioquinas que están dirigidas a células asociadas con las respuestas inflamatorias descritas en la presente.
a. Plásmidos y células huésped para la expresión de construcciones que codifican agentes peptídicos vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas, conjugados, adaptadores, proteínas de fusión y agentes vectorizados peptídicos
La construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en células transfectadas implica la utilización de técnicas de clonaje molecular que son también bien conocidas en el oficio (ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook y col., eds., 2ª Ed., Cold Spring Harbor, NY (1989) y Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 y 2, Ausubel y col., Eds., Current Protocols, 1987-1994; John Wiley and Sons, Inc., 1994-1999; Cloning Vectors - A Laboratory Manual, Vols. I-IV, Pouwels y col., Eds., y Suplementos de los mismos, Elsebier, NY, 1995-1998). Tales métodos incluyen la construcción de vectores de expresión que contienen una secuencia que codifica una proteína de fusión y señales apropiadas para el control transcripcional/traduccional según se ilustra en las Figuras 2-5. Estos métodos incluyen también técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación/recombinación genética in vivo (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook y col., eds., 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 y 2, Ausubel y col., Eds., Current Protocols, 1987-1994; John Wiley and Sons, Inc., 1994-1999; Cloning Vectors - A Laboratory Manual, Vols. I-IV, Pouwels y col., Eds., y Suplementos de los mismos, Elsebier, NY, 1995-1998).
Los ácidos nucleicos utilizados para transfectar células con secuencias que codifican la expresión del polipéptido de interés, estarán generalmente en forma de un vector de expresión que incluye secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica la expresión del polipéptido. Los métodos para obtener una transferencia estable, de manera que el ácido nucleico foráneo sea mantenido continuamente en el huésped, son conocidos en la técnica. La transformación de una célula huésped con ADN recombinante puede ser llevada a cabo mediante técnicas convencionales como es bien conocido por los expertos en el oficio. Cuando el huésped es procariótico, tal como E. coli, pueden prepararse células competentes que sean capaces de captar ADN a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y tratadas posteriormente por el método del CaCl_{2} mediante procedimientos bien conocidos en el oficio. Alternativamente, puede utilizarse MgCl_{2} o RbCl. La transformación puede ser realizada también después de formar un protoplasto de la célula huésped o mediante electroporación. Preferiblemente, se utiliza como célula huésped un huésped procariótico.
Cuando el huésped es eucariótico, los métodos de transfección de ADN incluyen la formación de coprecipitados con fosfato de calcio, y procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación e inserción de un plásmido incluido en liposomas. Otro método es utilizar un vector vírico eucariótico, tal como el virus de simio 40 (SV40), el virus del papiloma bovino o el vector parvovirus autónomo recombinante (según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.585.254) para infectar transitoriamente o transformar células eucarióticas y expresar la proteína (Eukaryotic Viral Vectors. Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Las células eucarióticas pueden ser también cotransfectadas con secuencias de ADN que codifiquen el polipéptido de fusión y una segunda molécula de ADN foráneo que codifique un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina quinasa del Herpes simplex.
Los sistemas de expresión eucarióticos pueden permitir que tengan lugar modificaciones post-traduccionales adicionales de las proteínas de mamífero expresadas. Tales células poseen la maquinaria celular para el procesamiento post-traduccional del transcrito primario, si así se desea. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, fosforilación, farnesilación. Tales líneas celulares huésped pueden incluir, pero no se limitan a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293 y WI38.
Las técnicas para el aislamiento y purificación de lo expresado por procariotas o eucariotas pueden ser efectuadas mediante cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican la utilización de anticuerpos monoclonales o policlonales o de antígenos.
Puede utilizarse una variedad de sistemas huésped-vector de expresión para expresar la secuencia que codifica la proteína de fusión. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias, transformados con vectores de expresión de ADN recombinante de bacteriófagos, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen una secuencia que codifica la proteína de fusión; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificadora de la proteína de fusión; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen una secuencia que codifica la proteína de fusión; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen una secuencia que codifica la proteína de fusión; o sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus, virus vaccinia) que contienen una secuencia que codifica la proteína de fusión, o sistemas de células animales transformadas manipuladas para que tengan una expresión estable.
Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, puede utilizarse en el vector de expresión cualquiera de varios elementos adecuados para la transcripción y la traducción, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (ver, por ejemplo, Bitter y col., Methods in Enzymology, 153: 516-544, 1987). Por ejemplo, cuando se realiza el clonaje en sistemas bacterianos, pueden utilizarse promotores inducibles tales como, pero sin limitarse a, pL del bacteriófago S, plac, ptrp, ptac, tac, T7 (promotor híbrido ptrp-lac). Cuando el clonaje se realiza en sistemas celulares de mamífero, pueden utilizarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, la repetición terminal larga de retrovirus; el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5 K del virus vaccinia). Pueden utilizarse también promotores producidos por técnicas de ADN recombinante o por técnicas sintéticas para proporcionar la transcripción de la secuencia insertada que codifica la proteína de fusión.
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse de manera ventajosa varios vectores de expresión dependiendo de los atributos deseados del sistema. Por ejemplo, cuando han de producirse grandes cantidades de la proteína de fusión, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de los productos proteínas de fusión que sean fácilmente purificados. Se prefieren aquéllos que son manipulados para que contengan un sitio de corte que facilite la recuperación de la proteína de fusión. Pueden obtenerse excelentes resultados, y han sido obtenidos, utilizando varios vectores disponibles comercialmente, incluyendo pET11a, b, c o d (Novagen, Madison, WI).
Los plásmidos particularmente preferidos para la transformación de células de E. coli incluyen los vectores de expresión pET (ver, la Patente de EE.UU. Nº 4.952.496; disponible en Novagen, Madison, WI; ver, también la literatura publicada por Novagen describiendo el sistema). Tales plásmidos incluyen pET11c y/o pET11a, que contienen el promotor lac de T7, el terminador de T7, el operador lac de E. coli inducible y el gen represor de lac; pET12a-c, que contiene el promotor de T7, el terminador de T7 y la señal de secreción de ompT de E. coli; y pET15b (Novagen, Madison, WI), que contiene una secuencia líder His-Tag™ (SEC ID Nº:40) para ser utilizada en la purificación con una columna de His, y un sitio de corte de trombina que permite el corte después de la purificación sobre la columna; la región del promotor lac de T7 y el terminador de T7.
El ácido nucleico que codifica un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas ligado a un agente vectorizado con y sin adaptadores, y otras construcciones similares, puede estar en los vectores de expresión pET, pET11c, pET11a y pET15b (Novagen, Madison, WI) para la expresión intracelular y periplásmica, respectivamente, de las proteínas de fusión.
Otros plásmidos incluyen los plásmidos pKK, particularmente pKK 223-3, que contiene el promotor TAC (disponible en Pharmacia; ver también, Brosius y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6929; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology; Patentes de EE.UU. N^{os} 5.122.463, 5.173.403, 5.187.153, 5.204.254, 5.212.058, 5.212.286, 5.215.907, 5.220.013, 5.223.483 y 5.229.279), que contiene el promotor TAC. El plásmido pKK ha sido modificado mediante la inserción de un casete de resistencia a kanamicina con extremos cohesivos de EcoRI (adquirido a Pharmacia; obtenido a partir de pUC4K, ver, por ejemplo, Vieira y col. (1982) Gene, 19: 259-268; y Patente de EE.UU. Nº 4.719.179) en el gen marcador de resistencia a ampicilina.
Otros vectores preferidos incluyen el vector de expresión inducible pP_{L}-lambda y el vector pDR450 con el promotor tac (ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.281.525, 5.262.309, 5.240.831, 5.231.008, 5.227.469, 5.227.293; disponible en Pharmacia P.L. Biochemicals; ver, también, Mott y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 88; y De Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21); y vectores baculovirus tales como el vector pBlueBac (denominado también pJVETL y derivados del mismo; ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.278.050, 5.244.805, 5.243.041, 5.242.687, 5.266.317, 4.745.051 y 5.169.784), incluyendo pBlueBac III.
Otros plásmidos incluyen los plásmidos pIN-IIIompA (ver, la Patente de EE.UU. Nº 4.575.013 para Inouye; ver, también, Duffaud y col. (1987) Meth. Enz., 153: 492-507), tal como pIN-IIIompA2. Los plásmidos pIN-IIIompA incluyen un sitio de inserción para ADN heterólogo unido en el marco de lectura transcripcional con fragmentos funcionales derivados del gen de lipoproteínas de E. coli. Los plásmidos incluyen también un fragmento de ADN que codifica el péptido señal de la proteína ompA de E. coli, situado de tal manera que el polipéptido deseado se expresa con el péptido señal de ompA en su extremo amino, permitiendo de este modo una secreción eficaz a través de la membrana citoplásmica. Los plásmidos incluyen además ADN que codifica un segmento específico del promotor-operador lac de E. coli, que está situado en la orientación correcta para la expresión transcripcional del polipéptido deseado, así como un gen lacI de E. coli funcional separado que codifica la molécula represora asociada que, en ausencia de un inductor del operón lac, interacciona con el promotor-operador lac para impedir la transcripción a partir del mismo. La expresión del polipéptido deseado está bajo el control del promotor de la lipoproteína (lpp) y del promotor-operador lac, aunque la transcripción a partir de cada promotor está normalmente bloqueada por la molécula represora. El represor es inactivado selectivamente por medio de una molécula inductora, induciendo de este modo la expresión transcripcional del polipéptido deseado a partir de ambos promotores.
La proteína represora puede estar codificada por el plásmido que contiene la construcción o por un segundo plásmido que contiene un gen que codifica una proteína represora. La proteína represora es capaz de reprimir la transcripción de un promotor que contenga secuencias de nucleótidos a las que se une la proteína represora. El promotor puede ser desreprimido alterando las condiciones fisiológicas de la célula. La alteración puede ser realizada mediante la adición al medio de crecimiento de una molécula que inhiba, por ejemplo, la capacidad para interaccionar con el operador o con proteínas reguladoras, o con otras regiones del ADN, o alterando la temperatura del medio de crecimiento. Las proteínas represoras preferidas incluyen, pero no se limitan a, el represor lacl de E. coli sensible a la inducción por IPTG, el represor cI857 sensible a temperatura. Se prefiere el represor lacl de E. coli.
En ciertas realizaciones, las construcciones incluyen también una secuencia terminadora de la transcripción. Las regiones promotoras y los terminadores de la transcripción son seleccionados cada uno independientemente del mismo gen o de genes diferentes. En algunas realizaciones, el fragmento de ADN es replicado en células bacterianas, preferiblemente en E. coli. El fragmento de ADN incluye también típicamente un origen de replicación bacteriano, para asegurar el mantenimiento del fragmento de ADN de generación en generación de las bacterias. De esta forma, pueden producirse grandes cantidades del fragmento de ADN por la replicación en bacterias. Los orígenes de replicación bacterianos preferidos incluyen, pero no se limitan a, los orígenes de replicación f1-ori y col E1.
Para huéspedes insecto, pueden utilizarse también para la expresión de los polipéptidos vectores baculovirus, tal como un vector pBlueBac (también denominado pJVETL y derivados del mismo), particularmente pBlueBac III (ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.278.050, 5.244.805, 5.243.041, 5.242.687, 5.266.317, 4.745.051 y 5.169.784; disponible en Invitrogen, San Diego). El vector pBlueBac III es un vector promotor doble y proporciona la selección de recombinantes mediante el cribado de azules/blancos, ya que este plásmido contiene el gen de la \beta-galactosidasa (lacZ) bajo el control del promotor ETL reconocible por insectos y es inducible con IPTG. Una construcción de ADN es introducida en un vector baculovirus pBlueBac III (Invitrogen, San Diego, CA) y cotransfectada posteriormente con el virus de tipo salvaje en células del insecto Spodoptera frugiperda (células sf9; ver, por ejemplo, Luckow y col. (1988) Bio/technology, 6: 47-55 y Patente de EE.UU. Nº 4.745.051).
Los huéspedes bacterianos preferidos contienen copias cromosómicas de ADN que codifican ARN polimerasa de T7 unidas operativamente a un promotor inducible, tal como el promotor lacUV (ver, la Patente de EE.UU. Nº 4.952.496). Tales huéspedes incluyen, pero no se limitan a, las cepas lisogénicas de E. coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(D3) y BL21(DE3). Se prefiere la cepa BL21(D3). Las cepas pLys proporcionan niveles bajos de lisozima de T7, un inhibidor natural de la ARN polimerasa de T7. Los huéspedes bacterianos preferidos son las células del insecto Spodoptera frugiperda (células sf9; ver, por ejemplo, Luckow y col. (1988) Bio/technology, 6: 47-55 y la Patente de EE.UU. Nº 4.745.051).
Un sistema de expresión alternativo que puede ser utilizado para expresar la proteína de fusión es un sistema de insecto. En uno de tales sistemas, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica la proteína de fusión puede ser clonada en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocada bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina). La inserción con éxito de la secuencia que codifica la proteína de fusión tendrá como resultado la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (esto es, virus que carece de la cubierta proteinácea codificada por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes son utilizados posteriormente para infectar células de Spodoptera frugiperda en las cuales se expresa el gen insertado, ver la Patente de EE.UU. Nº 4.215.051.
Las construcciones proporcionadas en la presente son también insertadas en el vector baculovirus vendido comercialmente bajo el nombre de pBlueBac III (Invitrogen, San Diego, CA; ver el Catálogo de Invitrogen; ver, Vialard y col. (1990) J. Virol., 64: 37; ver también, la Patente de EE.UU. Nº 5.270.458; la Patente de EE.UU. Nº 5.243.041; y la Solicitud de PCT Internacional Publicada WO 93/10139, que está basada en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/792.600). El vector pBlueBac III es un vector con un promotor doble y proporciona la selección de los recombinantes mediante el cribado de azules/blancos, ya que este plásmido contiene el gen de la \beta-galactosidasa (lacZ) bajo el control del promotor ETL reconocible por los insectos y es inducible con IPTG. La construcción, un otra construcción, es insertada en este vector bajo el control del promotor de la polihedrina. Se seleccionan las placas víricas azules sin oclusión y se purifican en placa y se someten a selección por la presencia del ADN que codifica el conjugado quimioquina-toxina mediante cualquier metodología estándar, tal como transferencias Western utilizando los antisueros apropiados o transferencias Southern utilizando una sonda apropiada. El virus recombinante purificado seleccionado es cotransfectado posteriormente, tal como mediante transfección con CaPO_{4} o liposomas, en células de Spodoptera frugiperda (células sf9) con baculovirus de tipo salvaje y cultivado en frascos de cultivo de tejidos o en cultivos en suspensión.
En levaduras, pueden utilizarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Tales vectores son bien conocidos (para una revisión ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubel y col., eds., Capítulo 13, Current Protocols, 1987-1994; John Wiley and Sons, Inc., 1994-1999; Bitter y col., Methods in Enzymol., 153: 516-544, 1987; Rothstein, En: DNA Cloning, Vol. II, Glover, D.M., ed., IRL Press, Wash., D.C., Capítulo 3, 1986; y Bitter y col., Methods in Enzymol., 152: 673-684, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern y col., eds., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II, 1982). Puede utilizarse un promotor de levaduras constitutivo tal como ADH o LEU2, o un promotor inducible tal como GAL (DNA Cloning, Vol. II, Glover, D.M., Ed., IRL Press, Wash., D.C., Capítulo 3, 1986). Alternativamente, pueden utilizarse vectores que estimulen la integración de secuencias de ADN foráneo en el cromosoma de la levadura.
En los casos en los que se utilizan vectores de expresión vegetales, la expresión de una secuencia que codifica una proteína de fusión puede ser dirigida por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores víricos tales como los promotores 35S de ARN y 19S de ARN del CaMV (Brisson y col., Nature, 310: 511-514, 1984), o el promotor de la proteína de la cubierta del TMV (Takamatsu y col., EMBO J., 6: 307-311, 1987); alternativamente, pueden utilizarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi y col., EMBO J., 3: 1671-1680, 1984; Broglie y col., Science, 224: 838-843, 1984); o promotores del choque de calor, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurley y col., Mol. Cell. Biol., 6: 559-565, 1986). Estas construcciones pueden ser introducidas en células vegetales utilizando los plásmidos Ti, los plásmidos Ri, vectores víricos de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de tales técnicas ver, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp. 421-463, 1988; y Plant Molecular Biology, 2ª Ed., Covey, S.N., ed., Capítulos 7-9, Blackie, London, 1988.
Pueden construirse sistemas de células de mamífero que utilicen virus recombinantes o elementos víricos para dirigir la expresión. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores de expresión adenovíricos, la secuencia que codifica la proteína de fusión puede ser ligada a un complejo para el control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede ser insertado posteriormente en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) tendrá como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la proteína de fusión en los huéspedes infectados (por ejemplo, ver, Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3655-3659, 1984). Alternativamente, puede utilizarse el promotor 7,5 K del virus vaccinia (por ejemplo, ver, Mackett y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7415-7419, 1982; Mackett y col., J. Virol., 49: 857-864, 1984; Panicali y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927-4931, 1982). Son de particular interés los vectores basados en el virus del papiloma bovino que tienen la capacidad de replicarse como elementos extracromosómicos (Sarver y col., Mol. Cell. Biol., 1: 486-96, 1981). Muy poco después de la entrada de este ADN en células de ratón, el plásmido se replica hasta 100 a 200 copias por célula aproximadamente. La transcripción del ADNc insertado no requiere la integración del plásmido en el cromosoma del huésped, produciendo de este modo un elevado nivel de expresión. Estos vectores pueden ser utilizados para una expresión estable mediante la inclusión en el plásmido de un marcador seleccionable, tal como el gen neo. Alternativamente, el genoma del retrovirus puede ser modificado para ser utilizado como un vector capaz de introducir y dirigir la expresión del gen de la proteína de fusión en las células huésped (Cone y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6349-6353, 1984). Puede conseguirse también un elevado nivel de expresión utilizando promotores inducibles, incluyendo, pero no limitándose a, el promotor IIA de la metalotioneína y promotores del choque de calor.
Para una producción de proteínas recombinantes con alto rendimiento, de larga duración, se prefiere la expresión estable. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células huésped pueden ser transformadas con ADNc que codifique la proteína de fusión controlada por elementos apropiados para el control de la expresión (por ejemplo, secuencias promotoras, intensificadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia para la selección y permite a las células integrar de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar foci que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Por ejemplo, después de la introducción de ADN foráneo, las células manipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y posteriormente son cambiadas a un medio selectivo. Pueden utilizarse varios sistemas de selección, incluyendo, pero no limitándose a, los genes de la timidina quinasa del virus Herpes simplex (Wigler y col., Cell, 11: 223-32, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-30, 1962) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell, 22: 817-31, 1980), que pueden ser empleados en células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente. Puede utilizarse también la resistencia a antimetabolitos como base de la selección por los genes dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3567-70, 1980; O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 1527-31, 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-6, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol., 150: 1-14, 1981); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., Gene, 30: 147-56, 1984). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, a saber trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8047-51, 1988); y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue y col., J. Biol. Chem., 258: 8384-8388).
En una realización, la proteína de fusión es producida mediante tecnología de ADN recombinante en la que un único polipéptido incluye un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, un resto adaptador peptídico y un agente vectorizado proteináceo tal como un resto toxina celular. El resto vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas puede estar colocado en el extremo amino con relación al resto toxina celular en el polipéptido. Tal proteína de fusión tiene la estructura generalizada: (extremo amino) resto ligando quimioquina -- resto adaptador peptídico -- resto toxina celular proteinácea (extremo carboxi). Tal proteína de fusión tiene la estructura generalizada: (extremo amino) resto ligando quimioquina -- resto adaptador peptídico -- resto toxina celular proteinácea (extremo carboxi) y se ilustra en la Figura 1. Alternativamente, el resto quimioquina puede estar colocado en el extremo carboxi con relación al resto toxina celular dentro de la proteína de fusión. Se contemplan también en la presente proteínas de fusión que contienen secuencias de aminoácidos extra en los extremos amino y/o carboxi, por ejemplo, marcas de polihistidina.
Después de la transformación, pueden aislarse y purificarse grandes cantidades de la proteína de acuerdo con métodos convencionales. Por ejemplo, puede prepararse un lisado del huésped de expresión y la proteína deseada (o proteína de fusión) puede ser purificada utilizando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otras técnicas de purificación. La proteína purificada será generalmente de un 80% aproximadamente a un 90% aproximadamente pura, y puede ser hasta, e incluyendo, un 100% pura. Pura tiene la intención de significar libre de otras proteínas, así como de desechos celulares.
b. Clonaje y expresión de una proteína de fusión ligando-toxina quimérica Construcción de una biblioteca de ADNc
El ARN total es aislado de una línea celular que se sabe que produce el ligando proteináceo deseado y purificado mediante fraccionamiento sobre oligo(dT)-celulosa para unir al ARN una cola de poli A. Se lleva a cabo la síntesis de una primera hebra de ADNc utilizando una transcriptasa inversa y un cebador con un sitio de restricción adecuado, tal como NotI. Están disponibles varias transcriptasas inversas, siendo las de ave y las murinas las utilizadas más frecuentemente. Esta molécula híbrida de ADN-ARN es utilizada posteriormente para generar una doble hebra de ADNc mediante uno de varios métodos diferentes que están disponibles. Se unen adaptadores al ADN y el ADN es luego fraccionado por tamaños mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADN así obtenido es clonado directamente en un vector adecuado, o es sometido a selección primeramente mediante sondaje. Para el sondaje, se construyen dos oligonucleótidos a partir de la secuencia génica conocida, uno para cada extremo del gen, y los oligonucleótidos son utilizados para sondar el gel. Cualquier región del gel que muestre hibridación con ambas sondas es cortada y el ADN es purificado. Este ADN purificado es clonado y utilizado para transformar E. coli. Las colonias obtenidas son sondadas de nuevo y se seleccionan los clones positivos.
Expresión del producto génico
En segundo lugar, el producto génico es expresado. Una vez que se ha obtenido un clon positivo, se lleva a cabo una reacción de secuenciación para asegurar que el clon seleccionado tiene la secuencia deseada. Se construyen oligonucleótidos para PCR de tal manera que el codon de inicio ATG del gen esté precedido directamente por un sitio de restricción en el vector de expresión pKK223-3 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Después del extremo 3' del gen hay dos sitios de restricción. El primer sitio de restricción es reconocido por un enzima que corta 10 a 12 bases antes de la secuencia de reconocimiento con el fin de permitir la digestión posterior para eliminar el codon de parada y para permitir la fusión a un segundo gen. El segundo sitio de reconocimiento es utilizado para clonar el gen en el vector de expresión. La PCR es llevada a cabo utilizando condiciones estándar para extender la secuencia, el ADN resultante es separado en un gel de agarosa y un clon que tenga una banda del tamaño correcto es escindido y clonado en el vector de expresión. Como la PCR puede introducir errores, el gen completo es ahora secuenciado para confirmar que tiene la secuencia correcta deseada. Una vez que se ha aislado de esta manera un clon que tenga la secuencia correcta, el vector es transfectado en E. coli y el clon es cultivado hasta la fase logarítmica media inducido con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido durante 4 a 6 horas.
Las proteínas expresadas son separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y son teñidas con el colorante Azul de Coomassie para su aislamiento. En esta etapa la proteína es expresada con alto rendimiento en una fase soluble. Si la proteína es insoluble o el rendimiento es demasiado bajo, se realizan varias modificaciones en el sitio de unión de ribosomas o en las condiciones de crecimiento para corregir el problema.
El segundo fragmento de ácido nucleico que va a ser fusionado al gen del ligando (por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifica un adaptador proteináceo) es obtenido mediante síntesis a partir de una secuencia de aminoácidos conocida, tal como las SEC ID N^{os} 1-12 (Solicitud de PCT Internacional Nº WO 96/06641, que proporciona adaptadores ejemplares para ser utilizados en conjugados), excepto en que se añade un cebador de PCR en el extremo 5' con sitios de restricción dobles, un sitio para facilitar el clonaje directo para la expresión y un sitio que permitirá el clonaje del oligonucleótido en un vector de expresión para construir una proteína de fusión. La segunda proteína sería expresada por sí misma, o bien en una proteína de fusión conteniendo los productos de ambos genes. Se obtiene un tercer gen, (por ejemplo, uno que codifique una toxina celular proteinácea) a partir de una línea celular apropiada de la manera descrita anteriormente y se añade al vector de expresión antes de su transfección a la célula huésped.
c. Construcción y expresión de genes de fusión de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas-toxina ejemplares
Se han construido doce genes de fusión ligando-toxina (Tabla 6). Los productos génicos contienen cuatro ligandos fusionados genéticamente a cada una de tres toxinas. Los genes marcados con HIS fueron construidos de tal manera que una pequeña cantidad de cada fusión pudiera ser expresada, purificada y analizada convenientemente in vitro. La marca HIS permite también una vía alternativa para la purificación de la proteína, si es que se requiere alguna. La fusión quimioquina-toxina conteniendo Saporina sirve como prototipo frente al cual pueden compararse y caracterizarse las demás toxinas.
Se ha analizado OPL98110 parcialmente purificada en células diana y no diana, in vitro. En un estado relativamente quiescente, las células diana (monocitos primarios de sangre periférica humana y la línea celular humana THP-1) son eliminadas lentamente, consistente con un mecanismo apoptótico, mientras que las células diana activadas (la línea celular humana THP-1 y linfocitos T primarios humanos) fueron eliminadas en un marco de tiempo más corto. Este último efecto es debido presumiblemente, al menos en parte, a la velocidad metabólica regulada por incremento de las células, a la expresión de receptores de quimioquinas adecuados y al efecto inhibidor de OPL98110 sobre una tasa incrementada de síntesis de proteínas. Las células no diana metabólicamente activas (neuronas fetales humanas preactivadas y células de glioma humanas) no son afectadas por la quimioquina-toxina a concentraciones a las que las células diana aparecen claramente anormales o muertas. La proteína de fusión quimioquina-toxina analizada en cultivo de tejidos destruye las células diana del linaje de leucocitos, pero no afecta a las células no diana. Estos resultados indican que OPL98110 sería útil para tratar lesiones de la médula espinal.
Esta proteína quimioquina-toxina es utilizada para erradicar las células que causan el daño tisular secundario, mientras que no afecta a las poblaciones neuronales y de astrocitos vitales que son necesarias para la supervivencia y la función normal del SNC.
Según se indicó anteriormente, se construyeron doce construcciones ejemplares que codifican una serie de proteínas de fusión quimioquina-toxina que contienen una quimioquina ligada a una toxina celular a través de un adaptador peptídico. Las composiciones, el código de denominación y las características teóricas seleccionadas de estas proteínas de fusión se presentan en la Tabla 6.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 6 Composición, denominación, peso molecular y punto isoeléctrico teóricos de las quimioquina-toxinas y de las toxinas libres
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CLAVE: (A) Conjugados quimioquina-toxina compuestos por una quimioquina, un adaptador y un resto toxina; (B) Restos de toxina libre. "HIS6" indica seis residuos de histidina carboxi terminales.
La expresión de cada quimioquina-toxina fue claramente detectable, pero se calculó que era sustancialmente menor del 0,1% de la proteína total en las pastas celulares brutas. Estos bajos niveles son totalmente consistentes con las observaciones previamente publicadas de que las proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs), incluyendo las toxinas Shiga y Saporina, son tóxicas para las células huésped bacterianas que las expresan. O lo que es más importante, la subunidad A1 de Shiga es la toxina RIP más potente analizada contra los ribosomas de E. coli. Con el fin de mejorar los niveles de las proteínas expresadas, se une operativamente un péptido señal a la proteína expresada para transportarla al espacio periplásmico. Alternativamente, y preferiblemente, la proteína de fusión es introducida en vectores de expresión estrictamente regulados, y cultivada utilizando medios y procedimientos de fermentación optimizados.
Las proteínas de fusión proporcionadas en la presente fueron expresadas utilizando el vector pET11c estrictamente regulado (promotor de T7), pero las condiciones de fermentación no estaban todavía optimizadas para una producción de proteínas rutinaria. Consistente con todo esto, E. coli transformada con la quimioquina-toxina comienza a morir a las cuatro horas aproximadamente después de la inducción, y a una densidad celular relativamente baja. Experimentos más recientes con OPL98110 y OPL98106 indican que estas quimioquina-toxinas están asociadas de manera creciente con la fracción insoluble a medida que transcurre la fermentación, lo cual sugiere que están asociadas con cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión insolubles son una ventaja práctica para el aislamiento y purificación de proteínas. La optimización de la fermentación de las cepas que contienen las proteínas que codifican el conjugado quimioquina-toxina, incluyendo la adopción de fermentadores automatizados, y medios y condiciones de crecimiento más apropiados, aprovechará totalmente el sistema del pET11c.
2. Producción de conjugados químicos
Para llevar a cabo la conjugación química de la presente, el agente vectorizante es ligado a través de uno o más adaptadores seleccionados, o directamente, al agente vectorizado. Debe utilizarse la conjugación química si el agente vectorizado es distinto de un péptido o una proteína, tal como un ácido nucleico o un fármaco no peptídico. Puede utilizarse cualquier medio conocido por los expertos en la técnica para conjugar químicamente restos seleccionados. En los Ejemplos se describen varios métodos
E. Modelos animales para analizar los conjugados
Los conjugados proporcionados en la presente y conjugados disponibles tales como conjugados que contienen IL-2, IL-4, GM-CSF, anti-CD4 y anti-CD5, utilizados para otras indicaciones, pueden ser utilizados y analizados en varios modelos animales de las enfermedades y condiciones inflamatorias contempladas en la presente para confirmar la actividad y/o para identificar los que son adecuados para el tratamiento de una enfermedad o condición particular contemplada en la presente.
Además, los conjugados que están dirigidos a receptores de quimioquinas proporcionados en la presente, pueden ser también analizados en modelos de enfermedades para los que se han utilizado otros conjugados. Por ejemplo, el modelo de xenoinjerto en ratón para identificar actividad antitumoral (ver, por ejemplo, Beitz y col. (1992) Cancer Research, 52: 227-230; Houghton y col. (1982) Cancer Res., 42: 535-539; Bogden y col. (1981) Cancer (Philadelphia), 48: 10-20; Hoogenhout y col. (1983) Int. J. Radiat. Oncol., Biol. Phys., 9: 871-879; Stastny y col. (1993) Cancer Res., 53: 5740-5744).
Los modelos animales para seleccionar candidatos para el tratamiento de mamíferos son bien conocidos y existen numerosos modelos reconocidos. Además, se ha demostrado el papel de las células inmunes activadas en estos estados de enfermedad. Modelos ejemplares de tales enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, los incluidos en la discusión siguiente.
Lesión de la médula espinal (SCI)
Algunas referencias ejemplares que proporcionan y utilizan modelos animales de SCI que pueden ser empleados para analizar los conjugados vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes:
Bennett y col. (1999) "Spasticity in rats with sacral spinal cord injury" [Cita En Curso], J. Neurotrauma, 16: 69-84, proporciona un modelo en rata de espasticidad muscular que es mínimamente perjudicial, no interfiriendo con la función de la vejiga, del intestino ni con la función locomotora del tren posterior. Se realizaron secciones transversales espinales a nivel sacro S2 y, por tanto, sólo afectaban a la musculatura de la cola. Después del corte transversal espinal, los músculos de la cola fueron inactivos durante 2 semanas. Después de este periodo inicial, se desarrollaron en la cola hipertonía, hiperreflexia y clonus, y se pronunciaron más con el tiempo. Estos cambios fueron determinados en la rata consciente, ya que la cola es fácilmente accesible y fácil de manipular. El estiramiento muscular o la estimulación cutánea de la cola producían espasmos musculares e incrementos notables del tono muscular, medidos con registros de fuerza y electromiográficos. Cuando se liberaba la cola, espasmos flexores y extensores espontáneos o inducidos por reflejos enrollaban la cola. El movimiento durante los espasmos desencadenaba a menudo el clonus en el extremo de la cola. El pelo y la piel de la cola eran extremadamente hiperreflexivos a un toque ligero, retirándose rápidamente al contacto, y a veces el clonus podía ser sostenido por contacto repetido de la cola sobre una superficie. Los reflejos segmentales de los músculos de la cola, por ejemplo los reflejos de Hoffman (reflejos H), fueron medidos antes y después de la espinalización e incrementaban significativamente 2 semanas después del corte transversal. Estos resultados indican que las ratas con una lesión espinal sacra desarrollan síntomas de espasticidad en los músculos de la cola con características similares a las observadas en los músculos de los miembros de humanos con una lesión de la médula espinal, y proporcionan por tanto una preparación útil para estudiar esta condición.
Taoka y col. (1998) "Spinal cord injury in the rat", Prog. Neurobiol., 56: 341-58, proporciona una revisión de los mecanismos patológicos de lesiones de la médula espinal inducidas por trauma en ratas para el desarrollo posterior de nuevas estrategias terapéuticas. La lesión de la médula espinal inducida por trauma es una consecuencia de un daño físico inicial y de un proceso lesivo progresivo posterior que implica varios acontecimientos patoquímicos que conducen a la destrucción del tejido. Este último proceso debería ser por tanto una diana para tratamiento farmacológico. Recientemente, se ha demostrado que neutrófilos activados están implicados en este último proceso de la lesión de la médula espinal en rata. Los neutrófilos activados dañan las células endoteliales por la liberación de mediadores inflamatorios tales como la elastasa de los neutrófilos y los radicales libres de oxígeno. La adhesión de neutrófilos activados a las células endoteliales podría desempeñar también un papel en el daño a las células endoteliales. Este daño de las células endoteliales podría a su vez inducir trastornos microcirculatorios que conducirían a isquemia en la médula espinal. Algunos agentes terapéuticos que inhiben la activación de neutrófilos alivian los trastornos motores observados en el modelo de lesión de la médula espinal en rata. La metilprednisolona (MPS) y el gangliósido GM1, que son los dos únicos agentes farmacológicos actualmente disponibles en la clínica para el tratamiento de lesiones agudas de la médula espinal, no inhiben la activación de neutrófilos en este modelo de rata. Tomadas en conjunto, estas observaciones plantean la posibilidad de que otros agentes farmacológicos que inhiban la activación de neutrófilos utilizados junto con MPS o con el gangliósido GM1, puedan tener un efecto sinérgico en el tratamiento de lesiones traumáticas de la médula espinal en humanos.
Carlson y col. (1998) "Acute inflammatory response in spinal cord following impact injury", Exp. Neurol., 151: 77-88, proporciona un estudio que examina la distribución rostral-caudal de neutrófilos y macrófagos/microglía a las 4, 6, 24 y 48 horas después de una lesión por contusión en la médula espinal T10 de rata (peso de 10 g, caída desde 50 mm). Los neutrófilos estaban localizados predominantemente en las regiones necróticas, con una variación a lo largo del tiempo que alcanzaba un máximo a las 24 horas, según se midió con ensayos de la actividad mieloperoxidasa (MPO). El pico más pronunciado de actividad MPO estaba localizado entre 4 mm rostral y caudal respecto a la lesión. Los macrófagos/microglía fueron visualizados con anticuerpos contra ED1 y OX-42. Hacia las 24 horas estaban presentes numerosas células con morfología fagocítica, con mayor número hacia las 48 horas. Estas células fueron localizadas predominantemente en la sustancia gris y en la sustancia blanca del funículo dorsal. El número de células disminuía gradualmente hasta 6 mm rostral y caudal respecto a lesión. La tinción con OX-42 reveló también una microglía reactiva con procesos contundentes, particularmente a niveles distantes de la lesión. El número de macrófagos/microglía se correlacionaba significativamente con la cantidad de daño tisular en cada nivel.
Bartholdi y col. (1997) "Expression of pro-inflammatory cytoquine and chemokine mRNA upon experimental spinal cord injury in mouse: an in situ hybridization study", Eur. J. Neurosci., 9: 1422-38, describe un estudio del patrón de expresión de citoquinas proinflamatorias y quimioatrayentes en un modelo experimental de lesión de la médula espinal en ratón. La hibridación in situ muestra que los transcritos para las citoquinas proinflamatorias TNF-\alpha e IL-1, así como para las quimioquinas MIP-1\alpha y MIP-1\beta están regulados por incremento en la primera hora después de la lesión. En esta fase temprana, la expresión de las citoquinas proinflamatorias está limitada a células en los alrededores del área de la lesión, probablemente células residentes del SNC. Mientras que el TNF-\alpha es expresado en una ventana de tiempo muy estrecha, la IL-1 puede ser detectada en una segunda fase en un subgrupo de granulocitos polimorfonucleares que migran hacia la médula espinal a alrededor de las 6 horas. El mensaje para las quimioquinas MIP-1\alpha y \beta es expresado de manera generalizada en la sustancia gris de toda la médula espinal a alrededor de las 24 horas, y está limitado de nuevo al infiltrado celular en el lugar de la lesión a los 4 días después del daño. Los datos indican que células residentes del SNC, muy probablemente células microgliales, y no las células inflamatorias periféricas, son la fuente principal de ARNms de citoquinas y quimioquinas. El patrón de citoquinas definido observado indica que los acontecimientos inflamatorios después de lesionar el SNC están estrictamente controlados. La expresión muy temprana de mensajes de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias puede representar un elemento importante del reclutamiento de células inflamatorias.
Blight y col. (1991) "Morphometric analysis of blood vessels in chronic experimental spinal cord injury: hypervascularity and recovery of function", J. Neurol. Sci., 106: 158-74, proporciona un modelo de trauma de la médula espinal en cobayos basado en la compresión hasta un grosor fijado, que fue descrito previamente. Las lesiones por compresión de la médula torácica inferior fueron producidas en 11 cobayos adultos anestesiados, y el resultado fue monitorizado utilizando ensayos de comportamiento sucesivos y morfometría de la lesión a los 2-3 meses. Este informe describe cambios en la vascularidad de la médula espinal basados en el análisis mediante microscopía óptica de secciones transversales en plástico de 1 micra a través del centro de la lesión. La densidad media de los vasos sanguíneos en estas lesiones era aproximadamente el doble de la encontrada en regiones equivalentes de médulas espinales normales, no lesionadas, y la hipervascularidad de la sustancia blanca se extendía al menos hasta cuatro segmentos de la médula espinal cranealmente y caudalmente desde el centro de la lesión. La distribución del diámetro capilar estaba desplazada significativamente a valores mayores y espacios perivasculares grandes rodeaban a la mayoría de los capilares y de los vasos pre y post-capilares. El grado de hipervascularidad no estaba correlacionado con la gravedad global de la lesión, pero existía una correlación positiva significativa entre la densidad de vasos sanguíneos en las 400 micras exteriores de la sustancia blanca y la pérdida secundaria de la función neurológica debajo de la lesión, observada entre un día y ocho semanas después del daño. Estos datos indican que la hipervascularización de la lesión está relacionada con mecanismos patológicos secundarios en la lesión de la médula espinal, posiblemente respuestas inflamatorias, que son relativamente independientes de la lesión mecánica primaria pero que están conectados más estrechamente con la pérdida y recuperación de la función.
Blight y col. (1993) "Increased levels of the excitotoxin quinolinic acid in spinal cord following contusion injury", Brain Res., 632: 314-6, muestra que los productos de los fagocitos inflamatorios son contribuyentes potenciales a la patología secundaria subsiguiente a un trauma de la médula espinal, y presenta un estudio que cuantifica los niveles de la neurotoxina y del producto de los macrófagos activados, ácido quinolínico (QUIN), en la médula espinal torácica inferior de cobayos adultos 5 días después de una lesión por compresión breve. En el sitio lesionado (T13), elevaciones de los niveles tisulares de QUIN (>10 veces) acompañaban a incrementos proporcionales de la actividad de indolamina-2,3-dioxigenasa (>2 veces) y de las concentraciones de L-quinurenina (>2,5 veces). En contraste, no había cambios significativos en dos regiones no lesionadas examinadas en comparación con los controles, a saber la médula espinal cervical (C2) y la corteza somatosensorial.
Forbes y col. (1994) "Inhibition of neutrophil adhesion does not prevent ischemic spinal cord injury", Ann. Thorac. Surg., 58: 1064-8, se basa en modelos animales para mostrar que puede ocurrir paraplejia después de una oclusión aórtica transitoria como consecuencia de la isquemia primaria en la médula espinal o del daño producido durante el periodo de reperfusión. En modelos animales de isquemia/reperfusión hay evidencia de que el daño por reperfusión puede ser modulado parcialmente por neutrófilos. Se determinó la eficacia del anticuerpo monoclonal murino que bloquea la adherencia de los neutrófilos (mAb 60.3) en isquemia/reperfusión de la médula espinal en conejos. La isquemia de la médula espinal se llevó a cabo mediante oclusión de la aorta infrarrenal con un catéter de globo. La determinación neurológica fue clasificada como normal, déficit neurológico parcial o parálisis completa. Se utilizó la monitorización electrofisiológica con potenciales provocados somatosensorialmente para determinar la duración de tiempo óptima de la oclusión. Los animales fueron tratados aleatoriamente con 2 mg/kg de mAb 60.3 intravenoso (n = 8) o con solución salina (n = 9), desconociendo el investigador el tratamiento. Los tiempos de oclusión medios no fueron diferentes entre los grupos (control, 32,7 +/- 3,6 minutos frente al mAb, 32,4 +/- 6,0 minutos). Cinco (55%) de los animales tratados con solución salina y 4 (50%) de los animales tratados con el mAb 60.3 resultaron parapléjicos. Los animales con paraparesis inicial evolucionaron todos hasta paraplejia fláccida en 24 horas. El estudio concluye que la lesión de la médula espinal después de una oclusión aórtica transitoria es independiente del complejo de glicoproteínas CD11/CD18 del neutrófilo. El daño en este marco puede tener lugar durante la isquemia y puede por tanto no ser dependiente de los neutrófilos ni de la reperfusión.
Liu y col. (1997) "Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury", J. Neurosci., 17: 5395-406, examina las médulas espinales de ratas sometidas a daños traumáticos de gravedad leve a moderada. Pocos minutos después de un impacto por la caída de un peso leve (un peso de 10 g cayendo desde 6,25 mm), las neuronas del área de impacto inmediata mostraban una pérdida de sustancias de Nissl citoplásmicas. A lo largo de los 7 días siguientes, este área de lesión se expandía y cavitaba. Se observó que neuronas positivas para el marcaje de extremos mellados con desoxiuridina trifosfato-biotina mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) estaban restringidas primariamente al área de lesión primitiva a las 4-24 horas después del daño, con una presencia máxima a las 8 horas después del daño. Glía TUNEL-positivas estaban presentes en todas las etapas estudiadas entre 4 horas y 14 días, con una presencia máxima en el área de la lesión 24 horas después del daño. Siete días después del daño, se observó una segunda oleada de células gliales TUNEL-positivas en la sustancia blanca periférica a la lesión y se extendían hasta al menos varios milímetros de distancia del centro de la lesión. La sugerencia de apoptosis fue apoyada por la microscopía electrónica, así como por la tinción nuclear con el colorante Hoechst 33342, y por examen de ADN preparado del sitio de la lesión. Además, inyecciones intraperitoneales repetidas de cicloheximida, comenzando inmediatamente después de una lesión por caída de un peso desde 12,5 mm, produjeron una reducción sustancial de la evidencia histológica de daño medular y de la disfunción motora determinadas 4 semanas después. Los datos apoyan la hipótesis de que la apoptosis dependiente de la síntesis de proteínas activa contribuye a la muerte celular neuronal y glial, así como a la disfunción neurológica, inducidas por daños traumáticos de gravedad leve a moderada en la médula espinal de la rata.
Lesión cerebral traumática y derrame cerebral
Ghirnikar y col. (1996) "Chemokine expression in rat stab wound brain injury", J. Neurosci. Res., 46: 727-33, describe que una lesión traumática en el sistema nervioso central (SNC) de mamíferos adultos tiene como resultado astrogliosis activa y la migración de células hematógenas al tejido neural dañado. Las quimioquinas, una clase de citoquinas quimioatrayentes, son reconocidas como mediadores de los cambios inflamatorios que tienen lugar después del daño. Se ha demostrado la expresión de MCP-1 (péptido quimiotáctico de macrófagos-1), un miembro de la familia de quimioquinas \beta, en traumas del cerebro de rata (Berman y col. (1996) J. Immunol., 156: 3017-3023). Utilizando un modelo de daño mecánico por heridas punzantes, se estudia la expresión de otras dos quimioquinas \beta: RANTES (Regulada tras la Activación, Expresada y Secretada en Células T Normales) y MIP-1\beta (proteína inflamatoria de macrófagos-1\beta) en el cerebro de rata. El daño por herida punzante se caracterizaba por gliosis generalizada e infiltración de células hematógenas. La tinción imnunohistoquímica reveló la presencia de RANTES y MIP-1\beta en el cerebro lesionado. RANTES y MIP-1\beta se expresaban ambas difusivamente en el tejido necrótico y fueron detectadas tan pronto como 1 día después del daño (dpi). Estudios de doble marcaje mostraron que MIP-1\beta, pero no RANTES, era expresado por astrocitos reactivos cerca del lugar de la lesión. Además, se detectó también tinción de MIP-1\beta en macrófagos en el lugar de la lesión. La expresión inicial de las quimioquinas se correlacionaba estrechamente con la aparición de células inflamatorias en el SNC lesionado, sugiriendo que RANTES y MIP-1\beta pueden tener un papel en los acontecimientos inflamatorios del daño cerebral traumático. Este estudio demuestra también la expresión de MIP-1\beta en astrocitos reactivos después de un trauma en el SNC de la rata.
Wang y col. (1998) "Prolonged expression of interferon-inducible protein-10 in ischemic cortex after permanent occlusion of the middle cerebral artery in rat", J. Neurochem., 71: 1194-204, investiga el papel de IP-10 en la apoplejía focal y estudia la expresión temporal del ARNm de IP-10 después de la oclusión de la arteria cerebral media en rata por medio de análisis Northern. La expresión del ARNm de IP-10 después de aplopejía focal demostraba un único perfil bifásico, con un notable incremento temprano a las 3 horas (4,9 veces sobre el control; p 0,01), un nivel máximo a las 6 horas (14,5 veces; p 0,001) después de la oclusión de la arteria cerebral media, y una segunda onda de inducción 10-15 días después del daño isquémico (incremento de 7,2 y 9,3 veces a los 10 y 15 días, respectivamente; p 0,001). La hibridación in situ confirmó la expresión inducida de ARNm de IP-10 y reveló su distribución espacial después de la aplopejía focal. Estudios inmunohistoquímicos demostraron la expresión del péptido IP-10 en neuronas (3-12 horas) y células astrogliales (de 6 horas a 15 días) de la zona isquémica. Se demostró una acción quimiotáctica de IP-10 dependiente de la dosis sobre células gliales C6 y la fijación incrementada de neuronas en los gránulos cerebelares de rata. Los datos indican que la isquemia induce IP-10, que desempeña un papel pleyotrópico en el reclutamiento de leucocitos prolongado, en la migración/activación de astrocitos y en la fijación/brote de neuronas después de aplopejía focal.
Galasso y col. (1998) "Excitotoxic brain injury stimulates expression of the chemokine receptor CCR5 in neonatal rats", Am. J. Pathol., 153: 1631-40, evalúa el impacto de inyecciones intrahipocampales de NMDA sobre la expresión de CCR5 en ratas el día 7 postnatal. La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa reveló un incremento de la expresión de ARNm de CCR5 en el hipocampo 24 horas después de producir la lesión, y el análisis de hibridación in situ demostró que se expresaba ARNm de CCR5 en el hipocampo lesionado y en las regiones adyacentes. El análisis de transferencia Western demostró proteína CCR5 incrementada en extractos tisulares de hipocampo 32 horas después de la producción de la lesión. Estudios de inmunocitoquímica complementarios identificaron microglía/monocitos infiltrantres y neuronas dañadas como las células inmunorreactivas con CCR5 principales. Estos resultados evidencian que una lesión excitotóxica aguda regula la expresión de CCR5.
Vannucci y col. (1999) "Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage", J. Neurosci. Res., 55: 158-63, utiliza un modelo de rata inmadura para comprender mejor la patogénesis y el tratamiento del daño cerebral isquémico hipóxico perinatal. El modelo supone la ligadura de una arteria carótica común seguido por hipoxia sistémica posteriormente. La injuria produce un daño cerebral isquémico hipóxico permanente limitado al hemisferio cerebral ipsilateral a la oclusión de la arteria carótida. Este modelo es utilizado en investigaciones con el fin de identificar estrategias terapéuticas para prevenir o minimizar el daño cerebral isquémico hipóxico.
Enfermedad de Alzheimer
Hauss-Wegrzyniak y col. (1998) "Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease", Brain Res., 780: 294-303, describe que los procesos inflamatorios tienen un papel en la patogénesis de los cambios degenerativos y de las discapacidades cognitivas asociadas con la enfermedad de Alzheimer (AD) y describe la utilización de lipopolisacárido (LPS) procedente de la pared celular de bacterias gram negativas para producir inflamación global crónica en el cerebro de ratas jóvenes. La infusión crónica de LPS (0,25 microgramos/horas) en el 4º ventrículo durante cuatro semanas producía (1) un incremento del número de astrocitos activados positivos para la proteína ácida fibrilar glial y microglía reactiva OX-6-positiva distribuidos por todo el cerebro, teniendo lugar el incremento mayor en el lóbulo temporal, particularmente en el hipocampo, (2) una inducción de los niveles de ARNm para interleuquina-1\beta, factor de necrosis tumoral \alpha y proteína precursora de \beta amiloide en la región del cerebro anterior basal y en el hipocampo, (3) la degeneración de neuronas piramidales de la CA3 del hipocampo y (4) un deterioro significativo de la memoria espacial según se determinó por un comportamiento de alternancia espontánea en un laberinto T disminuido.
Se conocen otros numerosos modelos de enfermedad de Alzheimer, incluyendo roedores manipulados genéticamente para que expresen la forma mutada de un gen humano implicado en la producción de A\beta en familias con aparición temprana de AD, y están disponibles para los expertos en esta técnica.
Esclerosis múltiple
La esclerosis múltiples (MS) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por áreas localizadas de desmielinización. Aunque la etiología y la patogénesis de la MS permanecen en su mayoría desconocidas, se asume generalmente que respuestas inmunes a antígenos de mielina contribuyen al proceso de la enfermedad. La secuencia exacta de acontecimientos, así como los mediadores moleculares que conducen a la destrucción de la mielina, deben ser todavía definidos.
Liu y col. (1998) "TNF is a potent anti-inflammatory cytokine in autoimmune-mediated demyelination", Nat. Med., 4: 78-83, describe la utilización de un modelo en roedores, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), para estudiar MS.
Artritis y enfermedad autoinmune
Barnes y col. (1998) "Polyclonal antobody directed against human RANTES ameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model", J. Clin. Invest., 101: 2910-9, describe que la artritis inducida por adyuvante (AIA) es uno de los muchos modelos animales de artritis reumatoide, una enfermedad caracterizada por un infiltrado celular de linfocitos T y macrófagos. Barnes y col. caracterizan el desarrollo de este modelo de enfermedad con respecto a la expresión de quimioquinas y muestran que se encontraron niveles incrementados de dos quimioquinas, RANTES, un quimioatrayente de linfocitos T y monocitos, y KC, un quimioatrayente de neutrófilos, en sangre completa y en la articulación. Los niveles de MIP-1\alpha, otro quimioatrayente de linfocitos T y monocitos, no variaron a lo largo del curso de la enfermedad en sangre completa y estaban sólo ligeramente elevados en la articulación. La expresión de RANTES desempeña un importante papel en la enfermedad, ya que un anticuerpo policlonal hacia RANTES mejoraba enormemente los síntomas en animales en los que se indujo AIA, y se encontró que era tan eficaz como el tratamiento con indometacina, un antiinflamatorio no esteroide. Anticuerpos policlonales hacia MIP-1\alpha o hacia KC fueron ineficaces.
Weinberg, A.D. (1998) "Antibodies to OX-40 (CD134) can identify and eliminate autoreactive T cells: implications for human autoimmune disease", Mol. Med. Today, 4: 76-83, describe que células T CD4+ específicas para un autoantígeno, han sido implicadas como el tipo celular causante en: esclerosis múltiple, artritis reumatoide, uveitis autoinmune, diabetes mellitus, enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad de injerto contra huésped; describe la utilización de enfermedades autoinmunes inducidas experimentalmente para desarrollar una terapia eficaz que elimine las células T autorreactivas en el lugar de la destrucción autoinmune del tejido.
Schrier y col. (1998) "Role of chemokines and cytokines in a reactivation model of arthritis in rats induced by injection with streptococcal cell walls", J. Leukoc. Biol., 63: 359-63, proporciona un estudio del papel de las quimioquinas en un modelo animal de artritis. La inyección intraarticular del antígeno de la pared celular de estreptococos (SCW) seguida por un desafío intravenoso, tiene como resultado una artritis monoarticular mediada por células T en ratas Lewis hembra. Estudios iniciales mostraron que esta respuesta de reactivación al antígeno SCW intravenoso depende de la presencia de interleuquina-1 (IL-1) y factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) y que la fase temprana de tumefacción es dependiente de neutrófilos. La eliminación de neutrófilos o la inmunización pasiva con anticuerpos hacia selectina P o hacia la proteína inflamatoria de macrófagos-2, redujo la intensidad del edema del tobillo y la llegada de neutrófilos. Después de los primeros días, sin embargo, la respuesta artrítica está mediada primariamente por células mononucleares. Los tejidos de la articulación mostraban una regulación por incremento del ARNm de la proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1), que podía ser inhibida en parte por anti-IL-4; el tratamiento de las ratas con anticuerpos hacia IL-4 o hacia MCP-1 suprimía significativamente el desarrollo del edema del tobillo y la evidencia histopatológica de inflamación. Anticuerpos hacia interferón-\gamma o hacia IL-10 no tenían efecto. El tratamiento con anti-MCP-1 suprimía también la llegada de células T marcadas con ^{(111)}In a la articulación del tobillo. Estos datos sugieren que la fase tardía de la artritis inducida por SCW en ratas Lewis hembra, dependiente de mononucleares, requiere citoquinas que regulen por incremento MCP-1, que a su vez puede facilitar el reclutamiento y la extravasación de células mononucleares hacia la articulación.
Oppenheimer-Marks y col. (1998) "Interleukin 15 is produced by endothelial cells and increases the transendothelial migration of T cells in vitro and in the SCID mouse-human rheumatoid arthritis model in vivo", J. Clin. Invest., 101: 1261-72, examina la capacidad de células endoteliales (CE) para producir IL-15 y la capacidad de la IL-15 para influir sobre la migración transendotelial de células T. Las células endoteliales de la vena umbilical humana expresan ARNm de IL-15 y la proteína. La IL-15 derivada del endotelio incrementaba la migración transendotelial de células T según se demostró por la inhibición de este proceso mediante anticuerpos monoclonales bloqueantes hacia IL-15. La IL-15 aumentaba la migración transendotelial de células T mediante la activación de la capacidad de unión de la molécula de adhesión integrina LFA-1 (CD11a/CD18) e incrementaba también la motilidad de células T. Además, la IL-15 inducía la expresión de la molécula de activación temprana CD69. La importancia de la IL-15 en la regulación de la migración de células T in vivo fue documentada por su capacidad para incrementar la acumulación de células T humanas transferidas adoptivamente en tejido sinovial de artritis reumatoide injertado en ratones SCID inmunodeficientes. Estos resultados demuestran que las CE producen IL-15, que desempeña un papel crítico en la estimulación de células T para extravasarse al tejido inflamatorio.
Kasama y col. (1995) "Interleukin-10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type II collagen-induced arthritis", J. Clin. Invest., 95: 2868-76, estudia la expresión y la contribución de quimioquinas específicas, la proteína inflamatoria de macrófagos-1\alpha (MIP-1\alpha) y la proteína inflamatoria de macrófagos-2 (MIP-2), y la interleuquina 10 (IL-10) durante la evolución de la artritis inducida por colágeno de tipo II (CIA). Se observaron primeramente niveles detectables de las proteínas citoquinas quimiotácticas MIP-1\alpha y MIP-2 entre los días 32 y 36 después del desafío inicial con colágeno de tipo II, mientras que se observaron incrementos de IL-10 entre los días 36 y 44. Ratones con CIA inmunizados pasivamente con anticuerpos dirigidos hacia MIP-1\alpha o MIP-2 demostraron un retraso de la aparición de la artritis y una reducción de la gravedad de la artritis. Los ratones con CIA que recibieron anticuerpos anti-IL-10 neutralizantes demostraron una aceleración de la aparición y un incremento de la gravedad de la artritis. De manera interesante, el tratamiento con anti-IL-10 incrementó la expresión de MIP-1\alpha y MIP-2, además de incrementar la actividad mieloperoxidasa (MPO) y la infiltración de leucocitos en las articulaciones inflamadas. Estos datos indican que MIP-1\alpha y MIP-2 desempeñan un papel en el inicio y en el mantenimiento, mientras que IL-10 parece tener un papel regulador durante el desarrollo de la artritis experimental.
Keffer y col. (1991) "Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis", EMBO J., 10: 4025-31, proporcionan líneas de ratones transgénicos que portan y expresan transgenes del factor de necrosis tumoral humano (hTNF-\alpha, caquectina) de tipo salvaje y modificados en 3'; muestran que puede establecerse la expresión correcta del gen del hTNF sensible a endotoxina y específico de macrófagos en ratones transgénicos y presentan evidencias de que la región 3' del gen del hTNF puede estar implicada en la transcripción específica de macrófagos. Ratones transgénicos portadores de transgenes del hTNF modificados en 3' muestran patrones de expresión desregulados y desarrollan poliartritis inflamatoria crónica. Keffer y col. muestran que los ratones transgénicos que predictiblemente desarrollan artritis, representan un modelo genético mediante el cual puede investigarse adicionalmente la patogénesis y el tratamiento de esta enfermedad en humanos.
Sakai y col. (1998) "Potencial withdrawal of rheumatoid synovium by the induction of apoptosis using a novel in vivo model of rheumatoid arthritis", Arthritis Rheum., 41: 1251-7, investiga si la apoptosis mediada por Fas tiene potencial como estrategia terapéutica en artritis reumatoide (AR) mediante la utilización de un modelo de AR en el que tejido de AR humana es injertado en ratones SCID. Tejido sinovial reumatoide fresco, incluyendo el cartílago de la articulación, fue injertado subcutáneamente en los lomos de ratones SCID. Seis semanas después del injerto, se inyectó intraperitonealmente anticuerpo monoclonal anti-Fas. Se evaluaron los cambios apoptóticos relacionados con el tiempo causados por el anticuerpo monoclonal anti-Fas en la sinovia injertada mediante histoquímica con marcaje de los extremos mellados. Treinta y seis horas después de la inyección, se observaron cambios apoptóticos difusos en la sinovia injertada. Cuatro semanas después de la inyección, disminuyó el tejido sinovial reumatoide.
Smith y col. (1999) "Diacerhein treatment reduces the severity of osteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis", Arthritis Rheum., 42: 545-54, describen un modelo canino de osteoartritis (OA). La OA fue inducida en 20 perros mestizos adultos mediante sección transversal del ligamento cruzado anterior de la rodilla izquierda y utilizaron el modelo con el fin de analizar tratamientos para la OA.
Enfermedades inflamatorias pulmonares
Kumagai y col. (1999) "Inhibition of Matrix Metalloproteinases Prevents Allergen-Induced Airway Inflammation in a Murine Model of Asthma", J. Immunol., 162: 4212-4219, investigan el papel de MMPs en la patogénesis del asma bronquial utilizando un modelo murino de asma alérgica. Utilizando este modelo, se describe un incremento de la liberación de MMP-2 y MMP-9 en fluidos de lavado bronquioalveolar después de inhalación de Ag en los ratones sensibilizados con OVA, que estaba acompañado por la infiltración de linfocitos y eosinófilos. La administración de un inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 a las vías respiratorias inhibía la infiltración inducida por Ag de linfocitos y eosinófilos en la pared y en la luz de las vías respiratorias, reducía la hipersensibilidad de las vías respiratorias inducida por Ag e incrementaba el número de eosinófilos y linfocitos en sangre periférica. La inhibición de la infiltración celular en la luz de las vías respiratorias se observó también con un inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1 y con un inhibidor sintético de la metaloproteinasa de la matriz. Los datos indican que MMPs, especialmente MMP-2 y MMP-9, son cruciales para la infiltración de células inflamatorias y para la inducción de hipersensibilidad de las vías respiratorias, que son características patofisiológicas del asma bronquial.
Griffiths-Johnson y col. (1997) "Animal models of asthma: role of chemokines", Methods Enzymol., 288: 241-66, describe que se han descubierto numerosas quimioquinas mediante la utilización de (1) un bioensayo de sobrenadantes de cultivo celular in vitro y de exudados in vivo procedentes de modelos animales de inflamación y (2) de técnicas de biología molecular. Cualquier quimioquina puede ser producida a menudo por varios tipos celulares diferentes y ejerce sus efectos sobre diferentes células diana, y existen evidencias convincentes procedentes de estudios en animales y clínicos de que los eosinófilos son células efectoras importantes en el asma. Griffiths-Johnson y col. identifican dos dianas para prevenir el reclutamiento de eosinófilos hacia el pulmón: IL-5 y su receptor, que son importantes en varios aspectos de la biología de los eosinófilos, y eotaxina y su receptor, CCR3. El receptor de eotaxina se expresa a un nivel elevado en los eosinófilos, pero no en otros leucocitos, y parece ser el detector principal de eotaxina y otras quimioquinas tal como MCP-4 del eosinófilo. Indican que están siendo desarrollados ratones con ablación del gen ("knockout") para eotaxina y para CCR3, y que los modelos animales continuarán siendo inestimables.
Campbell y col. (1998) "Temporal role of chemokines in a murine model of cockroach allergen-induced airway hyperreactivity and eosinophilia", J. Immunol., 161: 7047-53, proporciona un modelo murino de enfermedad de las vías respiratorias inducida por un alergeno de cucaracha y determina los mecanismos específicos de la respuesta, que se asemeja al asma atópico humano. Las respuestas alérgicas en este modelo incluyen eosinofilia en las vías respiratorias específica del alergeno y una fisiología de las vías respiratorias significativamente alterada, que se correlaciona directamente con inflamación. Se identifican papeles específicos de las quimioquinas CC durante estas etapas, siendo MIP-1\alpha un atrayente de eosinófilos importante durante la etapa primaria y la eotoxina durante la etapa de redesafío secundaria. Estos modelos permiten la evaluación de los mediadores implicados en ambas etapas del desafío con el alergeno de cucaracha, además del análisis de modalidades terapéuticas específicas.
Piguet y col. (1989) "Tumor necrosis factor/cachectin plays a key role in bleomycin-induced pneumopathy and fibrosis", J. Exp. Med., 170: 655-63 y Schrier y col. (1983) "The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation", Am. Rev. Respir. Dis., 127: 614-617, describen un modelo de fibrosis pulmonar en ratón.
Steinhauser y col. (1999) "IL-10 is a major mediator of sepsis-induced impairment in lung antibacterial host defense", J. Immunol., 162: 392-399, describen un modelo murino de neumonía por Pseudomonas aeruginosa inducida por sepsis para explorar el mecanismo de inmunosupresión asociado con la sepsis. Ratones CD-1 fueron sometidos a ligadura del ciego y a una punción con una aguja de 26 gauge (CLP) o a cirugía simulada, seguido por la administración intratraqueal (i.t.) de P. aeruginosa o solución salina. La supervivencia de los ratones sometidos a CLP seguida 24 horas después por la administración i.t. de solución salina o de P. aeruginosa fue del 58% y del 10%, respectivamente, mientras que el 95% de los animales que fueron sometidos a cirugía simulada seguido por la administración de P. aeruginosa sobrevivieron. La mortalidad incrementada en el grupo de CLP/P. aeruginosa era atribuible a un aclaramiento bacteriano notablemente deteriorado en el pulmón y al desarrollo temprano de bacteremia por P. aeruginosa. La administración i.t. de bacterias a ratones sometidos a CLP, pero no a ratones operados de manera simulada, tuvo como resultado una impresionante acumulación de neutrófilos intrapulmonar. Además, el desafío con P. aeruginosa en ratones sépticos tuvo como resultado un desplazamiento relativo hacia una producción de IL-10 incrementada en el pulmón concomitante con una tendencia hacia IL-12 disminuida. La administración i.p., pero no i.t., de Abs hacia IL-10 realizada justo antes del desafío con P. aeruginosa en ratones sépticos, mejoraba significativamente la supervivencia y el aclaramiento de bacterias de los pulmones de los animales sépticos a los que se administró P. aeruginosa. Finalmente, macrófagos alveolares aislados de animales sometidos a CLP mostraron un deterioro notable de la capacidad para ingerir y destruir P. aeruginosa ex vivo, y este defecto fue revertido parcialmente por la neutralización in vivo de IL-10. Colectivamente, estas observaciones indican que la respuesta séptica reduce sustancialmente la inmunidad pulmonar innata a P. aeruginosa, y que este efecto está mediado por IL-10 producida endógenamente.
Inflamación después de terapia génica
Muruve y col. (1999) "Adenoviral gene therapy leads to rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injury in vivo" [Cita En Curso], Hum. Gene Ther., 10: 965-76, estudia los mecanismos moleculares mediante los cuales adenovirus con replicación deficiente inducen daño e inflamación agudos de los tejidos infectados, que limita su uso en terapia génica humana. Para caracterizar esta respuesta, se evaluó la expresión de quimioquinas en ratones DBA/2 después de la administración intravenosa de varios vectores adenovíricos. La administración de adCMVbeta gal, adCMV-GFP o FG140 intravenosamente indujo rápidamente un patrón consistente de expresión de quimioquinas C-X-C y C-C en el hígado del ratón de una manera dependiente de la dosis. Una hora después de la infección con 10(10) UFP de adCMV\beta gal, los niveles hepáticos de ARNm de MIP-2 se incrementaron >60 veces sobre la línea basal. Los niveles de ARNm de MCP-1 e IP-10 se incrementaron también inmediatamente después de la infección con varios vectores adenovíricos, alcanzando un máximo a las 6 horas con una expresión >25 y >100 veces, respectivamente. También tenía lugar la inducción temprana de ARNm de RANTES y MIP-1\beta por los vectores adenovíricos, pero en menor grado. La inducción de quimioquinas tenía lugar independientemente de la expresión de genes víricos, ya que partículas adenovíricas inactivadas con Psoralén producían un patrón idéntico de transcripción de los genes de quimioquinas dentro de las primeras 16 horas después de la administración. La expresión de quimioquinas se correlacionaba, según se esperaba, con la llegada de neutrófilos y células CD11b+ a los hígados de los animales infectados. A títulos elevados, todos los vectores adenovíricos causaban necrosis y apoptosis hepáticas significativas después de la administración sistémica a ratones DBA/2. Para investigar el papel de los neutrófilos en este daño hepático inducido por adenovirus, los animales fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-MIP-2 o se redujo el número de sus neutrófilos. El antagonismo de MIP-2 y la disminución de neutrófilos tuvieron ambos como resultado niveles séricos de ALT/AST reducidos y una atenuación del daño hepático inducido por el adenovirus histológicamente, confirmando que este daño temprano es debido principalmente a la producción de quimioquinas y al reclutamiento de neutrófilos. Los resultados clarifican la respuesta inmune temprana contra vectores adenovíricos con replicación deficiente, y sugieren una estrategia para prevenir la inflamación y el daño tisular mediados por adenovirus interfiriendo con la función de las quimioquinas o de los neutrófilos.
Angiogénesis, incluyendo su papel en la artritis, otras enfermedades inflamatorias y crecimiento de tumores
El reclutamiento de células implicadas en angiogénesis y en inflamación está asociado con el crecimiento y desarrollo de tumores. Las referencias siguientes describen estas relaciones y que los expertos en la técnica conocen modelos animales para identificar terapias para tumores, inhibidores de angiogénesis y de la respuesta inflamatoria. Los conjugados utilizados y las células diana de algunos de estos estudios son distintos de los conjugados y las célula diana de la presente. Estas referencias evidencian la disponibilidad de modelos animales para el estudio de agentes terapéuticos para inhibir el crecimiento de tumores y las células asociadas con los mismos.
Crecimiento tumoral
Phillips y col. (1994) "Transforming growth factor-alpha-Pseudomonas exotoxin fusion protein (TGF-\alpha-PE38) treatment of subcutaneous and intracranial human glioma and medulloblastoma xenografts in athymic mice", Cancer Res., 54: 1008-15, aprovecha la expresión diferencial del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que está amplificada o sobreexpresada en muchos gliomas malignos y en otros tumores cerebrales primarios, pero que es baja o indetectable en el cerebro normal, para una terapia vectorizada de tumores cerebrales utilizando una toxina recombinante TGF-\alpha-exotoxina de Pseudomonas, TGF-\alpha-PE38, empleando ratones desnudos portadores de xenoinjertos s.c. de glioblastoma o meduloblastoma. El modelo de xenoinjertos debería ser útil para estudiar conjugados vectorizantes dirigidos a receptores de quimioquinas para el tratamiento de respuestas inflamatorias y para la vectorización hacia células implicadas en el desarrollo tumoral.
Debinski y col. (1994) "Interleukin-4 receptors expressed on tumor cells may serve as a target for anticancer therapy using chimeric Pseudomonas exotoxin", Int. J. Cancer, 58: 744-748, describen la utilización de proteínas quiméricas compuestas por IL-4 humana (hIL-4) y 2 formas mutantes diferentes de una potente toxina bacteriana, la exotoxina A de Pseudomonas (PE) en un modelo de xenoinjertos de tumores sólidos humanos. Las 2 toxinas quiméricas, denominadas hIL4-PE4E y hIL4-PE38QQR, mostraban actividades antitumorales específicas, dependientes de hIL4R y dependientes de la dosis.
Husain, S.R.; Behari, N.; Kreitman, R.J.; Pastan, I.; Puri, R.K. (1998) "Complete regression of established human glioblastoma tumor xenograft by interleukin-4 toxin therapy", Cancer Res., 58: 3649-53, muestra la utilización de un conjugado de IL-4 y una toxina para el tratamiento vectorizado de tumores glioblastomas en el flanco de ratones desnudos. Kreitman y col. (1998) "Accumulation of a recombinant immunotoxin in a tumor in vivo: fewer than 1000 molecules per cell are sufficient for complete responses", Cancer Res., 58: 968-975, demuestran también la utilización de este modelo.
Angiogénesis
Folkman y col. (1987) "Angiogenic factors", Science, 235: 442-7, establece el papel de la angiogénesis y de factores tales como el factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico, la angiogenina y los factores de crecimiento transformantes \alpha y \beta, y su significado para comprender de la regulación del crecimiento del sistema vascular. Cuando fueron evaluados de acuerdo con sus supuestas dianas, los factores se distribuían en grupos: los que actuaban directamente sobre las células endoteliales vasculares para estimular la locomoción o la mitosis, y los que actuaban directamente mediante la movilización de células huésped (por ejemplo, macrófagos) para liberar factores de crecimiento endoteliales. Además de su presencia en tumores que experimentaban neovascularización, los mismos péptidos angiogénicos se encontraban en muchos tejidos normales en los que no estaba teniendo lugar una neovascularización. Esto sugiere que la expresión fisiológica de factores angiogénicos está estrictamente regulada. Además de la persistente angiogénesis inducida por los tumores, parece ahora que una variedad de enfermedades no neoplásicas, que previamente se creía que no estaban relacionadas, pueden ser consideradas como "enfermedades angiogénicas" debido a que están dominadas por el crecimiento patológico de vasos sanguíneos capilares.
Leibovich y col. (1987) "Macrophage-induced angiogenesis is mediated by tumour necrosis factor-\alpha", Nature, 329: 630-632, describe que los macrófagos son importantes en la inducción del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos durante la reparación de heridas, la inflamación y el crecimiento tumoral, e investigan esto estudiando la formación de vasos sanguíneos capilares en la córnea de rata y en la membrana corioalantoidea de pollo en desarrollo.
Koch y col. (1992) "Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis", Science, 258: 1798-1801, describe que factores angiogénicos producidos por monocitos-macrófagos están implicados en la patogénesis de trastornos inflamatorios crónicos caracterizados por una angiogénesis persistente. Se demostró que el papel de la interleuquina-8 (IL-8), que es quimiotáctica para linfocitos y neutrófilos, era potentemente angiogénico cuando se implantaba en la córnea de rata e inducía proliferación y quimiotaxis de las células endoteliales de la vena umbilical humana. Los datos indican un papel de la IL-8 derivada de macrófagos en las enfermedades dependientes de angiogénesis tales como la artritis reumatoide, el crecimiento tumoral y la reparación de heridas.
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Westmoreland y col. (1998) "Chemokine receptor expression on resident and inflammatory cells in the brain of macaques with simian immunodeficiency virus encephalitis", Am. J. Pathol., 152: 659-665, describe la existencia de una correlación entre infiltrados de monocitos/macrófagos en el cerebro y la enfermedad neurológica, y que las quimioquinas y los receptores de quimioquinas pueden desempeñar funciones en la neuropatogénesis por VIH y describe su patrón de expresión en el modelo de encefalitis por VIH en macaco rhesus infectado con VIS. Se ha demostrado la expresión elevada de las quimioquinas proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1\alpha, MIP-1\beta, RANTES y de proteína inducible por interferón (IP)-10 en el cerebro de monos macacos con encefalitis por VIS, y en este estudio se demuestra que los receptores de quimioquinas correspondientes CCR3, CCR5, CXCR3 y CXCR4 están expresados en infiltrados perivasculares en estos mismos tejidos. Además, se detectaron CCR3, CCR5 y CXCR4 en subpoblaciones de neuronas grandes piramidales neocorticales y del hipocampo y en células gliales en cerebro normal y en cerebro encefalítico. Los datos y resultados indican que múltiples quimioquinas y sus receptores contribuyen al reclutamiento de monocitos y linfocitos hacia el cerebro en encefalitis por VIS. Además, la expresión de correceptores conocidos de VIH/VIS en neuronas sugiere un posible mecanismo mediante el cual el VIH o el VIS pueden interaccionar directamente con estas células, alterando su función fisiológica normal y contribuyendo a la patogénesis del complejo de demencia del SIDA.
Tyor y col. (1993) "A model of human immunodeficiency virus encephalitis in scid mice", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8658-62, proporciona un modelo animal del complejo de demencia asociado al VIH para ayudar al desarrollo de tratamientos para el mismo. Ratones con inmunodeficiencia combinada grave (ratones SCID), que aceptan xenoinjertos sin rechazo, fueron inoculados intracerebralmente con células mononucleares de sangre periférica humana y con VIH. De 1 a 4 semanas después de la inoculación, los cerebros de estos ratones contenían macrófagos humanos (algunos de los cuales eran positivos para el antígeno p24 del VIH), células multinucleadas ocasionales y una gliosis sorprendente por tinción inmunocitoquímica. Los macrófagos humanos eran también frecuentemente positivos para el factor de necrosis tumoral de tipo alfa y ocasionalmente para interleuquina 1 y VLA-4. Los cultivos de estos cerebros para detectar VIH fueron positivos. Generalmente, los macrófagos humanos no estaban presentes en los cerebros de los ratones control, ni había gliosis significativa, y no se recuperó VIH de los ratones que recibieron VIH sólo intracerebralmente. Patológicamente, este modelo de encefalitis por VIH en ratones SCID se asemeja a la encefalitis por VIH en humanos, y los datos sugieren que la activación de macrófagos por la infección con VIH tiene como resultado su acumulación y persistencia en el cerebro y el desarrollo de gliosis. Este modelo de encefalitis por VIH proporciona nuevas percepciones sobre la patogénesis y el tratamiento de esta enfermedad.
Toggas y col. (1994) "Central nervous system damage produced by expression of the HIV-1 coat protein gp120 in transgenic mice", Nature, 367: 188-193, proporciona ratones transgénicos que expresan gp120 en sus cerebros y la utilización de estos ratones para estudiar el papel de la gp120 en el daño neuronal y glial observado en humanos. Los cambios observados en los cerebros de los ratones transgénicos se asemejan a las anormalidades de los cerebros de humanos infectados con VIH-1. La gravedad del daño se correlacionaba positivamente con el nivel de expresión de gp120 en el cerebro. Estos resultados proporcionan la evidencia in vivo de que la gp120 desempeña una parte clave en el deterioro del sistema nervioso asociado al VIH-1. Esto facilita la evaluación y el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a las interacciones VIH-cerebro.
Wykrzykowska y col. (1998) "Early regeneration of thymic progenitors in rhesus macaques infected with simian immunodeficiency virus", J. Exp. Med., 187: 1767-1778, utilizando el modelo de SIDA en macaco/VIS, examina los efectos tempranos del VIS sobre el timo.
Krucker y col. (1998) "Transgenic mice with cerebral expression of human immunodeficiency virus type-1 coat protein gp120 show divergent changes in short- and long-term potentiation in CA1 hippocampus", Neuroscience, 83: 691-700, estudian ratones transgénicos que expresan constitutivamente gp120 dirigida por la proteína ácida fibrilar glial a partir de astrocitos de cerebro y presentan cambios neuronales y gliales que se asemejan a las anormalidades de los cerebros humanos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1.
Power y col. (1998) "Neurovirulence in feline immunodeficiency virus-infected neonatal cats is viral strain specific and dependent on systemic immune suppression", J. Virol., 72: 9109-15, proporcionan un modelo animal de VIH y su papel en la inmunosupresión. El virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) es un lentivirus que produce inmunosupresión y enfermedad neurológica en los gatos. Con el fin de determinar el grado al que diferentes cepas de VIF causaban la enfermedad neurológica, se compararon las cepas de VIF V1CSF y Petaluma en ensayos ex vivo e in vivo. Ambos virus infectaban y se replicaban en macrófagos y en cultivos mixtos de células gliales a niveles similares, pero V1CSF inducía una muerte neuronal significativamente mayor que Petaluma en un ensayo de neurotoxicidad. Los animales infectados con V1CSF mostraron un retraso significativo del desarrollo neural en comparación con los animales infectados con Petaluma y los animales no infectados. Estudios de espectroscopía por resonancia magnética de la corteza frontal revelaron proporciones significativamente reducidas de N-acetil aspartato/creatina en el grupo de V1CSF en comparación con los demás grupos. El tratamiento con Ciclosporina A de los animales infectados con Petaluma produjo un retraso del desarrollo neural y proporciones reducidas de N-acetil aspartato/creatina en el cerebro. Se observaron recuentos reducidos de células CD4(+) y CD8(+) en el grupo infectado con V1CSF en comparación con el grupo no infectado y con el grupo infectado con Petaluma. Estos hallazgos indican que el retraso del desarrollo neural y el daño neuronal son específicos de la cepa de VIF, pero que la inmunosupresión sistémica es también un determinante importante de la neurovirulencia inducida por VIF.
F. Formulación y administración de composiciones que contienen los conjugados
En la presente se proporcionan composiciones para ser utilizadas en tratamiento de enfermedades asociadas con respuestas inflamatorias patofisiológicas, incluyendo el daño tisular secundario y los estados de enfermedad asociados. Tales composiciones contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un ligando-toxina quimérico que comprende una quimioquina, o un fragmento de la misma biológicamente funcional, y una toxina celular, según se describió anteriormente.
Concentraciones eficaces de uno o más de los agentes vectorizantes dirigidos a un receptor de quimioquinas, o de derivados de los mismos farmacéuticamente aceptables, son mezcladas con un transportador o vehículo farmacéutico adecuado para administración sistémica, tópica o local. Los compuestos son incluidos en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad seleccionada. La concentración del compuesto activo en la composición dependerá de la absorción, la inactivación, las tasas de excreción del compuesto activo, de la pauta de dosificación y de la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos por los expertos en la técnica.
Los transportadores o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los conjugados y para los métodos aquí proporcionados, incluyen cualquiera de tales vehículos que los expertos en la técnica saben que son adecuados para el modo de administración particular. Además, los compuestos pueden ser formulados como el único ingrediente farmacéuticamente activo de la composición o pueden ser combinados con otros ingredientes activos.
La cantidad del agente terapéutico administrado está en el rango de 0,1 pg aproximadamente a 1 ng por kg de peso corporal aproximadamente. Puede ser administrado en un vehículo de liberación retardada lenta tal como, pero sin limitarse a, microesferas, liposomas, micropartículas, nanopartículas y carbón coloidal. Típicamente, una dosificación terapéuticamente eficaz debería producir una concentración sérica de ingrediente activo de 0,1 ng/ml aproximadamente hasta 50-100 \mug/ml aproximadamente. Las composiciones farmacéuticas deben proporcionar típicamente una dosis de 0,01 mg aproximadamente a 100-2000 mg de conjugado aproximadamente, dependiendo del conjugado seleccionado, por kilogramo de peso corporal por día. Típicamente, para el tratamiento intravenoso o sistémico sería suficiente una dosis diaria de entre 0,05 y 0,5 mg/kg aproximadamente. La aplicación local debería proporcionar de 1 ng aproximadamente hasta 100 \mug aproximadamente, preferiblemente de 1 \mug aproximadamente a 10 \mug aproximadamente, por administración de dosis individual. Se comprende que la cantidad a administrar será función del conjugado seleccionado, de la indicación tratada y posiblemente de los efectos colaterales que serán tolerados. Las dosificaciones pueden ser determinadas empíricamente utilizando modelos reconocidos para cada enfermedad.
El ingrediente activo puede ser administrado de una vez, o puede ser dividido en varias dosis más pequeñas para ser administradas a intervalos de tiempo. Se comprende que la dosificación precisa y la duración precisa del tratamiento son una función del tejido que está siendo tratado y pueden ser determinadas empíricamente utilizando protocolos de ensayo conocidos o mediante extrapolación a partir de datos de ensayos in vivo o in vitro. Debe señalarse que las concentraciones y los valores de dosificación pueden variar también con la edad del individuo tratado. Debe comprenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y con el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de concentración expuestos en la presente son solamente un ejemplo y no están destinados a limitar el ámbito o la práctica de las composiciones reivindicadas.
El compuesto puede ser suspendido en forma micronizada o en otra forma adecuada, o bien puede ser derivatizado para producir un producto activo más soluble o para producir un profármaco. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluyendo el modo deseado de administración y la solubilidad del compuesto en el transportador o vehículo seleccionado. La concentración eficaz es suficiente para mejorar la condición diana y puede ser determinada empíricamente. Para formular una composición, la fracción de peso del compuesto es disuelta, suspendida, dispersada o mezclada de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz tal, que la condición diana sea aliviada o mejorada.
Para una administración interna local, tal como una administración intramuscular, parenteral o intraarticular, los compuestos son formulados preferiblemente como una solución o suspensión en un medio acuoso, tal como solución salina tamponada isotónicamente, o son combinados con un soporte o bioadhesivo biocompatible destinado a la administración interna.
Las mezclas resultantes pueden ser soluciones, suspensiones, emulsiones o similares y pueden ser formuladas como mezclas acuosas, cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendajes o cualquier otra formulación adecuada para administración sistémica, tópica o local.
Los transportadores o vehículos farmacéuticos y cosméticos adecuados para la administración de los compuestos aquí proporcionados, incluyen cualquiera de tales vehículos que se conoce por los expertos en la técnica que son adecuados para el modo particular de administración. Además, los compuestos pueden ser formulados como el único ingrediente farmacéuticamente activo de la composición o pueden ser combinados con otros ingredientes activos. El compuesto activo está incluido en el vehículo en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil sobre el individuo tratado con ausencia de efectos tóxicos serios. La concentración eficaz puede ser determinada empíricamente mediante el análisis de los compuestos utilizando sistemas in vitro e in vivo, incluyendo los modelos animales descritos en la presente.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación local pueden incluir cualquiera de los componentes siguientes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceite fijado, polietilén glicol, glicerina, propilén glicol u otro solvente sintético; agentes antimicrobianos tales como alcohol bencílico y metil parabén; antioxidantes tales como ácido ascórbico y bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etiléndiaminotetraacético [EDTA]; tampones tales como acetatos, citratos y fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Las preparaciones líquidas pueden estar incluidas en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis de vidrio, plástico u otro material adecuado. Los vehículos adecuados pueden incluir solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato [PBS], y las suspensiones y soluciones pueden contener agentes espesantes y solubilizantes tales como glucosa, polietilén glicol y polipropilén glicol y mezclas de los mismos. Las suspensiones liposomales pueden ser también adecuadas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden ser preparadas de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Los agentes terapéuticos y las composiciones pueden ser administrados por cualquier vía conocida por los expertos en la técnica, tal como, pero sin limitarse a, tópicamente, intraarticularmente, intracisternalmente, intraocularmente, intraventicularmente, intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intradérmicamente, intratraquealmente, así como mediante cualquier combinación de dos o más de cualquiera de las mismas.
La vía de administración más adecuada variará dependiendo del estado de enfermedad que va a ser tratado, por ejemplo de la localización de la condición inflamatoria. Los modos de administración incluyen, pero no se limitan a, tópicamente, localmente, intraarticularmente, intracisternalmente, intraocularmente, intraventricularmente, intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, intratraquealmente, intraperitonealmente, intradérmicamente y mediante una combinación de dos o más de cualquiera de los mismos. Por ejemplo, para el tratamiento de SCI y de otras condiciones inflamatorias del SNC, la administración local, incluyendo la administración al fluido del SNC o al cerebro (por ejemplo, intratecalmente, intraventricularmente o intracisternalmente) proporciona la ventaja de que el agente terapéutico puede ser administrado a una concentración elevada sin el riesgo de las complicaciones que pueden acompañar a la administración sistémica de un agente terapéutico. De manera similar, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias de las articulaciones, puede preferirse la administración local por inyección del agente terapéutico en la articulación inflamada (esto es, intraarticularmente). Como otro ejemplo, un estado de enfermedad asociado con una condición inflamatoria de la piel puede ser tratado de manera ventajosa mediante la administración tópica del agente terapéutico formulado, por ejemplo, como una crema, un gel o un ungüento. Para el tratamiento de un estado de enfermedad asociado con una condición inflamatoria pulmonar, la vía de administración preferida del agente terapéutico puede ser por inhalación en un aerosol o intratraquealmente.
El agente terapéutico es administrado en una cantidad eficaz. Las cantidades eficaces para uso terapéutico dependerán, por supuesto, de la gravedad de la enfermedad y del peso y el estado general del sujeto, así como de la vía de administración. La administración local del agente terapéutico requerirá típicamente una dosis menor que cualquier modo de administración sistémica, aunque la concentración local del agente terapéutico, en algunos casos, puede ser mayor después de administración local que la que puede conseguirse con seguridad después de administración sistémica.
Como los sujetos individuales pueden presentar una amplia variación en la gravedad de los síntomas y cada agente terapéutico tiene sus características terapéuticas exclusivas, depende del médico el determinar la respuesta de un sujeto al tratamiento y variar en consecuencia las dosificaciones. Las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil de las cantidades útiles para la administración in situ de la composición farmacéutica, y pueden utilizarse en algunos casos modelos animales para determinar las dosificaciones eficaces para el tratamiento de trastornos particulares. En general, sin embargo, para administración local, se contempla que una cantidad eficaz del agente terapéutico será una cantidad en el rango de 0,1 picogramos (pg) aproximadamente hasta 1 ng por kg de peso corporal aproximadamente. Varias consideraciones para llegar a una cantidad eficaz están descritas en, por ejemplo, Hardman J.G. y col., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press, 1990; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, y los estudios de Mantyh y col. (Science, 278: 275-79, 1997) que implican la inyección intratecal de un ligado-toxina específico para neuronas.
Los conjugados pueden ser administrados mediante cualquier vía apropiada, por ejemplo, oralmente, parenteralmente, intravenosamente, intradérmicamente, subcutáneamente o tópicamente, en forma líquida, semilíquida o sólida y son formulados de manera adecuada para cada vía de administración. Los modos de administración preferidos dependen de la indicación tratada. Las indicaciones dermatológicas y oftalmológicas serán típicamente tratadas localmente; mientras que los tumores, SCI y otras enfermedades similares serán tratados típicamente mediante modos de administración sistémica, intradérmica o intramuscularmente.
En una realización de las composiciones y sus usos aquí proporcionados, el agente terapéutico es administrado localmente en un vehículo de administración de liberación lenta, por ejemplo, encapsulado en un sistema de dispersión coloidal o en cristales estabilizados poliméricos. Los sistemas de dispersión coloidal útiles incluyen nanocápsulas, microesferas, esferas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones aceite-en-agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal actualmente preferido es un liposoma o una microesfera. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de administración de liberación lenta cuando son inyectados o implantados. Algunos ejemplos de conjugados lípido-polímero y liposomas están descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.631.018. Otros ejemplos de vehículos de administración de liberación lenta son matrices de hidrogel biodegradables (Patente de EE.UU. Nº 5.041.292), conjugados de polímeros dendríticos (Patente de EE.UU. Nº 5.714.166) y liposomas multivesiculares (Depofoam®, Depotech, San Diego, CA) (Patentes de EE.UU. N^{os} 5.723.147 y 5.766.627). Un tipo de microesferas adecuado para encapsular agentes terapéuticos para inyección local (por ejemplo, en el tejido subdérmico) son las microesferas de poli(D,L)lactida, según está descrito en D. Fletcher, Anesth. Analg., 84: 90-94, 1997.
Además de proporcionar una dosis terapéutica eficaz al lugar del trauma y disminuir la posibilidad de toxicidad sistémica, la administración local disminuye también la exposición del agente terapéutico a procesos de degradación, tal como la degradación proteolítica y la intervención inmunológica a través de respuestas antigénicas e inmunogénicas. La derivatización de fármacos con, por ejemplo, monometoxipoli(etilén glicol) puede disminuir también la probabilidad de los inconvenientes anteriormente mencionados. Se ha descrito que la pegilación de agentes terapéuticos incrementa la resistencia a proteolisis; incrementa la semivida en plasma y disminuye la antigenicidad y la inmunogenicidad. Un método para unir polímeros de PEG (variando en tamaño desde 2.000 hasta 8.000 Da aproximadamente) está ilustrado en el Ejemplo 5 de la presente. Otros ejemplos de metodologías de pegilación están presentados por Lu y Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu y Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix y col., Int. J. Peptide Res., 46: 253-64, 1995; Benhar y col., J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu y col., J. Immunol., 154: 3088-95, 1995).
La composición proporcionada en la presente contiene además uno o más adyuvantes que facilitan la administración tales como, pero sin limitarse a, vehículos inertes o sistemas de dispersión coloidal. Ejemplos representativos y no limitantes de tales vehículos inertes pueden ser seleccionados de agua, alcohol isopropílico, fluorocarburos gaseosos, alcohol etílico, polivinil pirrolidona, propilén glicol, un material productor de gel, alcohol estearílico, ácido esteárico, espermaceti, monooleato de sorbitán, metilcelulosa, así como combinaciones adecuadas de dos o más de los mismos.
Una composición proporcionada en la presente puede ser también formulada como una suspensión inyectable estéril de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1-4,butanodiol. Los aceites fijados, estériles, son empleados convencionalmente como solvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijado suave incluyendo, pero no limitándose a, mono o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos (incluyendo ácido oleico), aceites vegetales que existen de forma natural como el aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de algodón, etc., o vehículos grasos sintéticos como oleato de etilo. Tampones, conservantes, antioxidantes y los ingredientes adecuados, pueden ser incorporados según se requiera o, alternativamente, pueden componer la formulación.
Las composiciones orales incluirán generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible y pueden ser comprimidas para formar tabletas o incluidas en cápsulas de gelatina. Para administración terapéutica oral, el compuesto o los compuestos activos pueden ser incorporados con excipientes y utilizados en forma de tabletas, cápsulas o troches. Agentes aglutinantes y materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles pueden ser incluidos como parte de la composición.
Las tabletas, píldoras, cápsulas, troches y similares pueden contener cualquiera de los ingredientes siguientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto y gelatina; un excipiente tal como almidón y lactosa; un agente desintegrante tal como, pero sin limitarse a, ácido algínico y almidón de maíz; un lubricante tal como, pero sin limitarse a, estearato de magnesio; un deslizante tal como, pero sin limitarse a, dióxido de silicona coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; y un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo y aromas de frutas.
Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además de un material del tipo anterior, un vehículo líquido tal como un ácido graso. Además, las formas de unidad de dosificación pueden contener otros materiales diferentes que modifiquen la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, revestimientos de azúcar y otros agentes entéricos. Los conjugados pueden ser administrados también como componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, goma de mascar o similares. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservantes, tintes y colorantes y aromatizantes.
Los materiales activos pueden ser mezclados también con otros materiales activos que no reduzcan la acción deseada, o con materiales que suplementen la acción deseada, tal como cisplatino para el tratamiento de tumores.
Finalmente, los compuestos pueden ser empaquetados como artículos de fabricación conteniendo material de envase, uno o más conjugados o composiciones como los proporcionados en la presente dentro del material de envase y una etiqueta que señale la indicación para la que se proporciona el conjugado.
G. Estados de enfermedad asociados con la respuesta inflamatoria y el daño tisular secundario
El SCI y otros varios estados de enfermedad están asociados con la proliferación, activación y migración de varios tipos de leucocitos. Estos acontecimientos se combinan para producir un entorno muy agresivo e inhóspito en el lugar de la lesión o enfermedad. Las aproximaciones al tratamiento actuales, independientemente de su éxito, tienden a centrarse alrededor de componentes individuales del proceso proinflamatorio. Por ejemplo, muchos investigadores se han concentrado en el trasplante de neuronas o de tejido del SNC en el sistema nervioso dañado con la esperanza de estimular la supervivencia y regeneración de las células trasplantadas o de las células existentes que producen factores de crecimiento y neurotróficos. Otras aproximaciones han intentado dirigirse al daño secundario a través del antagonismo de canales ionotrópicos, inhibiendo las acciones citotóxicas de los aminoácidos excitatorios utilizando antagonistas de NMDA e inhibiendo la peroxidación lipídica utilizando antioxidantes, por ejemplo, con el esteroide metilprednisolona. Todas estas aproximaciones han demostrado poco o ningún beneficio de larga duración. En resumen, el enfoque sobre mecanismos bioquímicos individuales no es capaz de apreciar la capacidad de la respuesta al trauma (o al proceso de enfermedad) como un todo para producir cambios compensatorios que anulan el efecto de la intervención terapéutica o que, en algunos casos, pueden realmente empeorar las cosas.
Se ha encontrado en la presente que el tratamiento es más eficaz si no se inicia la respuesta inflamatoria normal, y que la probabilidad de mejora y recuperación está significativamente comprometida cuanto más tiempo se permita continuar a este proceso. Las composiciones y sus usos proporcionados en la presente están diseñados para inhibir o suprimir transitoriamente la actividad de subtipos de leucocitos clave (y/o astrocitos) y para eliminar las fuentes clave que estimulan los mecanismos inflamatorios y el daño secundario.
Las composiciones y sus usos aquí proporcionados permiten la administración selectiva, deliberada y subrepticia del agente terapéutico a las células que organizan la respuesta a una lesión o enfermedad. Con el fin de iniciar y mantener un proceso de enfermedad (por ejemplo, cáncer) o una respuesta inflamatoria, las células implicadas son activadas y regulan por incremento su expresión de receptores en la superficie celular para una variedad de ligandos. Como los receptores implicados en el trauma y en la enfermedad están a menudo regulados por incremento, se aumenta la probabilidad de que el agente terapéutico sea internalizado por las células correctas.
Se ha encontrado en la presente que la biología celular de más de setenta enfermedades y condiciones, que implican a la mayoría de los sistemas orgánicos, implicaba respuestas inflamatorias patofisiológicas de manera similar a la biología celular de las SCI agudas. La lista no exhaustiva siguiente, y el tratamiento más detallado de cuatro áreas clínicas, están diseñados para ilustrar algunas de las similitudes más importantes. Enfermedades y condiciones ejemplares, además de las lesiones de la médula espinal, incluyen derrame cerebral, lesiones pulmonares agudas y el síndrome del distrés respiratorio agudo (ARDS), enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad inflamatoria de las articulaciones, encefalitis por VIH, crecimiento, neovascularización (angiogénesis) y metástasis de varias formas de cáncer incluyendo, cáncer de cerebro, mama y pulmón, esclerosis múltiple, encefalopatías espongiformes, sepsis, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, vitreorretinopatía proliferativa y uveitis.
Infección por VIH y SIDA e infecciones con otros patógenos
La activación y la infección de la microglía del SNC y de los macrófagos infiltrantes es una característica fundamental de la patogénesis de las enfermedades inducidas por el VIH. Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) pueden entrar a una célula solamente si el receptor CD4 está asociado con un correceptor de quimioquinas específico. Los CXCR4, CCR2b, CCR3, CCR5, CCR6, CCR8 y CX_{3}CR1 pueden actuar todos en capacidad de correceptor. Por ejemplo, las cepas de VIH-1 macrofagotrópicas utilizan generalmente correceptores CCR5, mientras que las cepas células T-trópicas utilizan generalmente CXCR4. Además, virus doblemente trópicos pueden utilizar los correceptores CXCR4 y CCR5 para entrar, mientras que otros subgrupos de cepas de virus VIH utilizan una variedad de otros correceptores de quimioquinas.
En pacientes con encefalitis por VIH (EVIH), el CXCR4 está expresado en MNPs, astrocitos y en una subpoblación de neuronas colinérgicas, mientras que CCR5 está expresado principalmente en MNPs. Debe señalarse que la mayoría de las células infectadas en los pacientes con EVIH (niños y adultos) parecen ser MNPs, y la expresión incrementada de CCR5 parece estar correlacionada con la gravedad de la enfermedad. Esto sugiere que los acontecimientos mediados por MNPs pueden ser más importantes, al menos en las etapas tardías y graves de la EVIH. El receptor CCR5 es también regulado por incremento después de una infección bacteriana del SNC y en un modelo de daño cerebral isquémico en rata.
La producción incrementada de citoquinas (por ejemplo, TNF-\alpha) y quimioquinas (por ejemplo, RANTES, MCP-1, MIP-1\alpha y MIP-1\beta) está asociada con la infección por VIH. Quimioquinas del SNC incrementadas en VIH serían responsables del reclutamiento de leucocitos periféricos y de la liberación de citoquinas con efectos citotóxicos directos (al menos en el caso de TNF-\alpha) sobre neuronas y oligodendrocitos, y refleja de manera precisa la experiencia en el trauma del SNC. Varias citoquinas incluyendo, GM-CSF, CSF de macrófagos, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-6, TNF-\alpha y TNF-\beta pueden contribuir también a la patogénesis de la enfermedad por VIH activando y/o aumentando la replicación del VIH.
El daño secundario tiene lugar en pacientes pre-SIDA, VIH-1 positivos, asintomáticos (An y col. (1997) Arch. Anat. Cytol. Pathol., 45: 94-105). Estos investigadores fueron capaces de detectar ADN del VIH-1 en el 50% de los cerebros de pacientes asintomáticos y casi el 90% mostraban astrogliosis. Estos pacientes tenían también niveles elevados de inmunomoléculas y citoquinas, incluyendo TNF-\alpha, IL-1, IL-4 e IL-6. El daño neuronal se confirmó por la detección de neuronas apoptóticas.
La neurotoxicidad directa y la regulación por incremento del correceptor CCR5 por aminoácidos excitatorios derivados de MNPs han sido también implicadas en la patología de la infección por VIH. Se ha detectado un incremento de la actividad sintasa de óxido nítrico inducible en microglía infectada por VIH procedente de pacientes con SIDA. Esto sugiere que la producción de óxido nítrico podría contribuir a la formación de lesiones en áreas del sistema nervioso infectadas por VIH. Una vez más, la patología de las encefalopatías por VIH, y el SIDA que afecta al SNC antes de su manifestación y en su manifestación completa, parecen remedar el daño tisular secundario observado en SCI y en otras enfermedades inflamatorias.
Se ha encontrado también que algunas quimioquinas y receptores de quimioquinas son también factores promicrobianos y facilitan la enfermedad infecciosa (ver, por ejemplo, Pease y col. (1998) Seminar in Immunol., 10: 169-178). Los patógenos aprovechan el sistema de quimioquinas. Por ejemplo, los receptores celulares de quimioquinas son utilizados para entrar en la célula por patógenos intracelulares, incluyendo VIH. Además, los virus utilizan receptores de quimioquinas codificados viralmente para estimular la proliferación en la célula huésped. Los patógenos alteran también el sistema de quimioquinas. Se conocen antagonistas de quimioquinas codificados por virus y secuestradores de quimioquinas codificados por virus. Por tanto, los conjugados proporcionados en la presente pueden ser utilizados para interferir con las infecciones víricas y bacterianas mediante una variedad de mecanismos.
Enfermedad inflamatoria de las articulaciones y enfermedad autoinmune
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune caracterizada por un daño crónico del tejido conectivo y erosión ósea. La patogénesis de la enfermedad incluye la infiltración de leucocitos en el espacio sinovial, su activación y la liberación de mediadores inflamatorios que finalmente deforman y destruyen la articulación afectada. La respuesta artrítica real parece iniciarse cuando los MNPs liberan citoquinas y quimioquinas proinflamatorias. TNF-\alpha, IL-1, IL-6, GM-CSF y la quimioquina IL-8 se encuentran en abundancia en el tejido de las articulaciones de pacientes con AR y su origen más probable incluye a los fibroblastos sinoviales, además de los MNPs. La combinación de MNPs, neutrófilos y células T, con la participación de los fibroblastos sinoviales y los sinoviocitos, establece una cascada de inflamación.
Se cree que IL-1 y TNF-\alpha son responsables de la producción de quimioquinas en la articulación artrítica. En un estudio, concentraciones incrementadas de estas dos citoquinas inducían la expresión de IL-8 (un potente quimioatrayente de células T) y RANTES (un potente quimioatrayente de neutrófilos), en fibroblastos sinoviales humanos aislados de pacientes con AR (Rathanaswami y col. (1993) J. Biol. Chem., 268: 5834-9). Otros investigadores han demostrado que tejido sinovial inflamado procedente de pacientes con AR y osteoartríticos contiene concentraciones elevadas de MCP-1, y TNF-\alpha e IL-1 incrementaban notablemente la expresión de ARNm de esta quimioquina en sinoviocitos cultivados derivados de estos especímenes. Parece que las quimioquinas procedentes de MNPs y los fibroblastos sinoviales y los sinoviocitos estimulados por citoquinas desempeñan un papel en la patología de la AR facilitando el reclutamiento y la extravasación de monocitos, neutrófilos y células T periféricos. En común con otras enfermedades y condiciones, los leucocitos activados liberan un rango de otros mediadores que dañan los tejidos. Más específicamente, las especies reactivas de oxígeno y los enzimas proteolíticos derivados de leucocitos (por ejemplo metaloproteinasas de la matriz, catepsina y elastasa derivada de neutrófilos) han sido implicados en el inicio y el mantenimiento del daño tisular en enfermedades inflamatorias de las articulaciones.
Enfermedad pulmonar
El daño pulmonar cubre una amplia serie de condiciones clínicas. Para los fines de la presente, son referidas colectivamente como Enfermedades Inflamatorias del Pulmón (ILDs). Una ILD es típicamente el resultado de un daño específico, por ejemplo, de infecciones bacterianas sistémicas (por ejemplo, sepsis), trauma (por ejemplo, lesión por isquemia-reperfusión) e inhalación de antígenos (por ejemplo, toxinas como el humo de cigarrillos). Las ILDs incluyen también alveolitis alérgica, ARDS (síndrome del distrés respiratorio agudo o del adulto), varias formas de asma, bronquitis, enfermedad vascular de colágeno, sarcoidosis pulmonar, enfermedades pulmonares eosinofílicas, neumonía y fibrosis pulmonar. Brevemente, la patología de estas enfermedades y condiciones implica la activación de macrófagos, particularmente de los localizados en los alvéolos. Neutrófilos, eosinófilos y células T son activados y reclutados hacia el lugar de la lesión después de la liberación de macrófagos y de citoquinas y quimioquinas derivadas de las células endoteliales y epiteliales vecinas. Las citoquinas y quimioquinas específicas implicadas incluyen: GM-CSF, TNF-\alpha, IL-1, IL-3, IL-5, IL-8, MCP-1, MCP-3, MIP-1\alpha, RANTES y eotaxina.
Los leucocitos responden a las citoquinas y quimioquinas proinflamatorias liberando los muchos mediadores del daño tisular secundario, incluyendo proteasas, especies reactivas de oxígeno y lípidos biológicamente activos, y expresando antígenos de la superficie celular y moléculas de adhesión celular. Además, parece que poblaciones específicas de leucocitos desempeñan un papel más destacado en algunas ILDs que en otras. Los neutrófilos y los MNPs son los contribuyentes más importantes al daño secundario en lesiones pulmonares agudas como ARDS y varias fibrosis pulmonares, mientras que las células T y los eosinófilos son los culpables principales de las enfermedades pulmonares eosinofílicas que incluyen asma alérgico, alveolitis fibrosante y sarcoidosis.
Cáncer
Se ha demostrado que los factores de crecimiento, las citoquinas y las quimioquinas generados por células tumorales y por MNPs, regulan la angiogénesis tumoral y el reclutamiento de leucocitos hacia el microentorno del tumor. Aunque los leucocitos tienen una función tumoricida, la infiltración de leucocitos y una sobreproducción de factores angiogénicos tienen como resultado la neovascularización que nutre a las células tumorales y facilita el desarrollo del tumor. El examen cuantitativo de infiltrados de leucocitos ha revelado que, por ejemplo, los MNPs constituyen hasta el 50% de la masa celular en carcinomas de mama. Un estudio reciente concluyó que la sobreexpresión de MCP-1 era responsable de la infiltración de leucocitos y del elevado número de macrófagos y células T que están asociados con tumores ováricos. En efecto, se ha observado la sobreexpresión de otras quimioquinas y citoquinas en otros cánceres, incluyendo linfomas y gliomas. Un recuento elevado de neutrófilos ha sido asociado con el carcinoma bronquioloalveolar y se correlaciona con la concentración incrementada de IL-8, un potente quimioatrayente de neutrófilos, en biopsias pulmonares y muestras de lavado bronquioalveolar.
La regulación por incremento de las moléculas de adhesión celular y de proteinasas en respuesta a la activación por citoquinas y quimioquinas es una parte integral de la metástasis tumoral. Las proteasas de leucocitos y de células epiteliales destruyen las matrices extracelulares y están implicadas en la dispersión de células desde los tumores primarios. Por ejemplo, la elastasa de neutrófilos está ligada a la invasión directa de la aorta por células procedentes de cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC). Además, las células tumorales contribuyen al proceso metastásico produciendo sus propias proteasas. La expresión de moléculas de adhesión celular (MAC) en todos los tipos de células (por ejemplo, en células tumorales, endoteliales y leucocitos) es esencial para la metástasis. Las MACs integrinas no solamente desempeñan un papel en la metástasis, sino que están implicadas en el crecimiento y en la supervivencia de las células tumorales, y cooperan con varias proteinasas para estimular la metástasis y la angiogénesis.
Daño tisular secundario
Los estados de enfermedad asociados con el daño tisular secundario pueden ser tratados de acuerdo con las composiciones y sus usos aquí proporcionados y utilizando los conjugados proporcionados en la presente así como ciertas citoquinas no quimioquinas conocidas por los expertos en la técnica para el tratamiento de otras condiciones. Estos estados de enfermedad incluyen, pero no se limitan a, lesiones del SNC, enfermedades inflamatorias del SNC, trastornos neurodegenerativos, enfermedades cardíacas, enfermedades inflamatorias de los ojos, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedades inflamatorias de las articulaciones, enfermedades inflamatorias del riñón o renales, enfermedades inflamatorias pulmonares, enfermedades inflamatorias nasales, enfermedades inflamatorias del tiroides, cánceres regulados por citoquinas y otros estados de enfermedad que implican o están asociados con el daño tisular secundario.
Ejemplos de enfermedades inflamatorias y/o trastornos neurodegenerativos del SNC que pueden ser tratados utilizando los métodos de la presente y los conjugados aquí proporcionados incluyen, pero no se limitan a, derrame cerebral, lesión cerrada de la cabeza, leucoencefalopatía, coriomeningitis, meningitis, adrenoleucodistrofia, complejo de demencia del SIDA, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, síndrome de fatiga crónica, encefalitis, encefalomielitis, encefalopatías espongiformes, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, lesión/trauma de la médula espinal (SCT) y lesiones cerebrales traumáticas; las enfermedades cardíacas que pueden ser tratadas utilizando los métodos proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, ateroesclerosis, hiperplasia y restenosis neoíntima; las enfermedades inflamatorias de los ojos que pueden ser tratadas utilizando las composiciones y sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, retinopatía proliferativa de la diabetes, vitreorretinopatía proliferativa, retinitis, escleritis, escleroiritis, coroiditis y uveitis. Ejemplos de enfermedades inflamatorias intestinales que pueden ser tratadas utilizando las composiciones, sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, colitis crónica, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Ejemplos de enfermedades inflamatorias de las articulaciones que pueden ser tratadas utilizando las composiciones, sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis reumatoide, espondilartropatías, tales como espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis reactiva, artritis psoriática, espondilitis, espondilartropatías no diferenciadas y el síndrome de Behcet; ejemplos de enfermedades inflamatorias del riñón o renales que pueden ser tratadas utilizando las composiciones y sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, glomerulonefritis, nefritis de lupus y nefropatía por IgA. Ejemplos de enfermedades inflamatorias pulmonares que pueden ser tratadas utilizando las composiciones y sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, enfermedad pulmonar eosinofílica, neumonía eosinofílica crónica, enfermedades pulmonares fibróticas, neumonía eosinofílica aguda, broncoconstricción, incluyendo asma, displasia broncopulmonar, eosinofilia broncoalveolar, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía, síndrome del distrés respiratorio agudo y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); ejemplos de enfermedades inflamatorias nasales que pueden ser tratadas utilizando las composiciones y sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, poliposis, rinitis, sinusitis; ejemplos de enfermedades inflamatorias tiroideas que pueden ser tratadas utilizando las composiciones y sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, tiroiditis; y ejemplos de cánceres regulados por citoquinas que pueden ser tratados utilizando las composiciones y sus usos proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, gliomas, ateromas, carcinomas, adenocarcinomas, granulomas, glioblastomas, granulomatosis, linfomas, leucemias, melanomas, cánceres de pulmón, mielomas, sarcomas, sarcoidosis, micogliomas, meningiomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, enfermedad de Hodgkins y cánceres de mama y próstata. Otras enfermedades inflamatorias susceptibles a tratamiento utilizando las composiciones y sus usos y los conjugados proporcionados en la presente incluyen, pero no se limitan a, vasculitis, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), psoriasis, lupus eritematoso sistémico, sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) e inflamación lesiva debida a quemaduras.
Según se señaló anteriormente, estas enfermedades, aunque diversas, comparten las características comunes relacionadas con la respuesta inflamatoria. La lesión o trauma de la médula espinal, que puede ser tratada mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de un agente terapéutico como el descrito en la presente, es un ejemplo principal de los trastornos contemplados. Los tratamientos de la presente están diseñados para atacar los resultados adversos de estas respuestas que implican la proliferación y migración de leucocitos. Los tratamientos eliminarán o reducirán la proliferación y migración de leucocitos y, en virtud de esto, conducirán a una mejora de los síntomas, a una reducción de los acontecimientos adversos o a otros resultados beneficiosos que pueden incrementar la eficacia de otros tratamientos.
Los ejemplos siguientes están incluidos con fines ilustrativos solamente y no están destinados a limitar el ámbito de la invención.
Ejemplo 1 Construcción de genes
Para activar el proceso de desarrollo, se diseñó una construcción genética, la construcción de un casete, que facilita el intercambio del ligando, la toxina y las secuencias adaptadoras de la proteína de fusión. Esta "construcción casete" fue sintetizada químicamente con la secuencia codificadora completa de OPL98101 (ver la Tabla 6; y ver la SEC ID Nº 55) en su lugar. El gen fue diseñado de tal manera que la proteína de fusión comienza con un residuo de metionina (Met) seguido por la secuencia publicada de la MCP-3 madura y un residuo de alanina (Ala). Esta secuencia estaba seguida por un residuo de Met (formando de este modo el adaptador Ala-Met) y los residuos 23-268 de la subunidad A1 de la toxina de Shiga.
Para facilitar la eliminación y la sustitución por genes de ligandos y toxinas diferentes, se incorporaron sitios de endonucleasas de restricción en cada secuencia génica próximos a sus extremos 3' y 5' (ver, las SEC ID N^{os} 52-67). Además, se sintetizó un gen de una segunda toxina, con sitios de restricción internos apropiados, que codifica la forma madura de la proteína Saporina-6 (OPL982). La toxina de Shiga fue subclonada de manera similar. Los genes de las fusiones quimioquina-toxina y los genes de la toxina libre contienen sitios de restricción flanqueantes de XbaI (5') y BamHI (3'). Fueron clonados individualmente en un vector pGemex-1 (Promega Inc.). El plásmido resultante que contenía la toxina Saporina libre fue pOPL2 (toxina Saporina libre). El mapa del plásmido de la toxina Saporina libre (pOPL2) está mostrado en la Figura 2. Un mapa del plásmido de una fusión ligando-toxina (MCP3-AM-SHIGA, denominada OPL98101 en la Tabla 6) está mostrado en la Figura 3, en la que el plásmido es denominado pOPL1.
El codon de inicio ATG de ambos genes incluía un sitio de NdeI para el subclonaje en el sistema de expresión pET11c (pormotor de T7, Novagen Inc.). La selección de codones en ambas construcciones de ADN fue optimizada para la expresión en E. coli durante la fase de diseño. Los genes de los vectores pGemex-1 fueron subclonados en el sistema de expresión pET11c utilizando enzimas de restricción apropiados. Mapas plasmídicos de plásmidos ejemplares conteniendo quimioquina-toxina en plásmidos pET11c están mostrados en las Figuras 4 (MCP1-AM-SAP) y 5 (MCP3-AM-SHIGA). La expresión de construcciones tales como éstas dieron lugar a proteínas tales como OPL98101 y OPL983 (ver la Tabla 6).
Clonaje de los genes de ligandos y toxinas
Todos los genes restantes, y variantes de las secuencias originales, fueron clonados utilizando cebadores oligonucleotídicos apropiados (ver la Tabla 7) y técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se diseñaron cebadores de la hebra directa con un sitio de restricción para el subclonaje del gen en pET11c. Los cebadores de la hebra inversa solapaban con el adaptador y con parte de la secuencia de la toxina requerida y codificaban sitios de restricción apropiados para la eliminación y la sustitución posterior del ligando y de la toxina, y para el subclonaje en el vector de expresión. MCP-1 fue clonado a partir del ADN del plásmido ATCC 65933 (Rockville, MD), mientras que la Eotaxina humana y el SDF-1\beta procedían de una biblioteca de ADNc de pulmón humano Quick-Clone (Clonetech, Palo Alto, CA). Los genes de Shiga-A1 truncada (con y sin una secuencia marca de seis residuos de histidina C-terminal en la proteína de fusión madura) fueron clonados a partir de pOPL98101. Los productos de la PCR fueron aislados de los geles de agarosa utilizando un kit para la extracción del gel Qiagen y clonados en el vector pCR2.1 utilizando un kit de clonaje TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para confirmar su identidad, los genes terminados fueron secuenciados utilizando los cebadores directo e inverso de M13 y un Analizador Genético Prism 310 de ABI.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 7
11
12
Selección por la expresión de conjugados quimioquina-toxina
Las construcciones de pET11c portadoras de quimioquina-toxina (Tabla 6) fueron transformadas en E. coli BL21-
DE3 pLysS (Stratagene) y plaqueadas en caldo de Luria que contenía un 1% de glucosa y 100 \mug/ml de carbenicilina (LB-car). Después de una incubación durante una noche se utilizó una única colonia para inocular 10 ml de LB-car, se cultivó hasta una DO_{600} de 1,0 y se indujo con IPTG 1 mM. Se tomaron muestras una y dos horas después de la inducción, y las células fueron concentradas por centrifugación y resuspendidas en SDS-tampón de muestra a una DO de 1,3. Las proteínas expresadas fueron sometidas a SDS-PAGE y visualizadas mediante tinción con Coomassie, mientras que un grupo paralelo de geles fue sometido a transferencia Western y a inmunotransferencia utilizando los anticuerpos apropiados (R&D systems, Minneapolis, MN). Todos estos conjugados quimioquina-toxina (ver la Tabla 6) se habían expresado positivamente. Alícuotas de las células transformadas (1 ml de LB conteniendo un 15% de glicerol con una DO_{600} \sim 0,85) fueron congeladas a -70ºC para un uso posterior.
Purificación de las proteínas de fusión seleccionadas Purificación de OPL98110 mediante cromatografía de afinidad con níquel
Se construyeron genes para las proteínas quimioquina-toxina marcadas con HIS de tal manera que pequeñas cantidades del material de investigación pudieran ser expresadas y purificadas rápidamente para acelerar el bioensayo in vitro, y para introducir una vía adicional para la purificación a gran escala, si se requiriera. Se obtuvo una pequeña cantidad de OPL98110 parcialmente purificada (\sim65% de pureza en geles de SDS) utilizando cromatografía de afinidad con níquel. Un proceso de dos etapas de cromatografía de intercambio catiónico y de afinidad con níquel produce una proteína quimioquina-toxina esencialmente pura.
Células transformadas con pOPL98110 fueron cultivadas hasta una DO_{600} de 1,28 (periodo de incubación de 7 horas a 37ºC) en un matraz con agitación que contenía 500 ml de LB, inducidas con IPTG 1 mM durante 1,5 horas (DO_{600} = 2,53) y recogidas por centrifugación. La mitad de la pella (esto es, el equivalente a 250 ml de cultivo original) fue sonicada sobre hielo en 6 ml de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 300 mM y urea 8 M. El lisado fue centrifugado a 13.000 rpm en tubos de microcentrífuga y el sobrenadante resultante fue centrifugado a 100.000 g a 4ºC durante 1 hora. El sobrenadante final fue mezclado con 1 ml de una suspensión (50% v/v) de Níquel-resina NTA (Qiagen) previamente equilibrada en tampón de lisis que contenía imidazol 5 mM pero no urea. La mezcla fue rotada suavemente durante 5 horas a 4ºC, vertida en una pequeña columna y lavada con 4 ml de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 60 mM. La columna fue eluida con 4 x 1 ml de tampón que contenía fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) e imidazol 0,5 M. Las fracciones positivas para OPL98110 fueron identificadas mediante SDS-PAGE con transferencia Western e inmunotransferencia. Una vez agrupadas, se estimó que el rendimiento y la pureza de la proteína de fusión eran de 200 \mug y un 65%, respectivamente.
Purificación de proteínas de fusión sin marca de His (OPL98101)
La OPL98101 fue purificada utilizando una versión ligeramente modificada de un método publicado (McDonald y col. (1996) Protein Expr. Purif., 8: 97-108) según sigue. Células bacterianas que contenían el plásmido de OPL98101 (cepa BL21(DE3)pLysS) procedentes de un cultivo de una noche (dilución 1:100) fueron cultivadas a 30ºC en un incubador con agitación hasta una DO_{600} de 0,7. Se añadió IPTG (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a una concentración final de 0,2 mM y se continuó el cultivo durante 1,5 horas, momento en el que las células fueron centrifugadas. El cultivo de las células BL21(DE3)pLysS a 30ºC en lugar de a 37ºC mejora los rendimientos. Cuando las células son cultivadas a 30ºC, se dejan crecer hasta una DO_{600} de 1,5 antes de la inducción. Después de la inducción, se continua el crecimiento durante 2 a 2,5 horas aproximadamente, momento en el que las células son recogidas por centrifugación.
Después de la fermentación, las bacterias fueron sonicadas en 5 volúmenes de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) conteniendo EGTA 10 mM, EDTA 10 mM y NaCl 50 mM y centrifugadas a 100.000 g. El sobrenadante fue aplicado a una columna Q-Sefarosa-FF (equilibrada en el mismo tampón) conectada a la entrada de una columna de S-Sefarosa-FF. Bajo estas condiciones, OPL98101 fluye a través de la resina de intercambio aniónico y se pega a la resina de intercambio catiónico. La columna Q fue desconectada y la columna de S-Sefarosa fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (0,05-1,0 M, 10 volúmenes de columna) en fosfato de sodio 10 mM (EGTA 1 mM y EDTA 1 mM, pH 7,4). La quimioquina-toxina fue detectada por inmunotransferencia y las fracciones agrupadas apropiadamente fueron aplicadas a una columna de Sefacril S100.
Las fracciones que contenían la proteína fueron analizadas mediante electroforesis en gel y tinción de los geles con Azul de Coomassie. La quimioquina-toxina altamente enriquecida copurificaba con una proteína ácida (pI 6,3) de \sim28 kDa en una proporción de \sim1:1 (proteína de fusión:contaminante). No se detectaron otras bandas de proteína en los geles teñidos con Azul de Coomassie. La secuenciación N-terminal confirmó la presencia de OPL98101 y que el contaminante era una "proteína constitutiva" de E. coli. Intentos posteriores para separarlas, incluyendo cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), no tuvieron éxito. Parece probable que el contaminante ácido estuviera estrechamente unido a la proteína de fusión básica a lo largo de la purificación. El lisado de las células a pH bajo (\sim5,0-5,8) en presencia de un desnaturalizante, tal como urea 8 M, elimina tales estrechas asociaciones de las dos proteínas. La experiencia posterior con OPL98110 (estable en presencia de urea) apoya esta conclusión.
Ejemplo 2 Bioactividad in vitro de las proteínas de fusión quimioquina-toxina seleccionadas Ensayos de inhibición de síntesis de proteínas in vitro (RIP)
La inhibición de la síntesis de proteínas mediada por la toxina inactivadora de ribosomas en la proteína de fusión y libre, puede ser medida utilizando un sistema comercialmente disponible de lisado de reticulocitos de conejo que analiza la traducción de ARN de luciferasa (Promega, Madison, WI). Brevemente, las muestras fueron diluidas de manera seriada en Tricina 20 mM, pH 7,8, y 5 \mul de proteína diluida fueron combinados con 5 \mul de la mezcla de reacción (50 \mug/ml de ARN de luciferasa, mezcla de aminoácidos sin metionina 0,1 mM) y 15 \mul de lisado de reticulocitos de conejo. Además de varios controles negativos (tampón y un blanco de reactivos), se utilizó Saporina libre (0,03-1 nM) como control positivo. Las muestras fueron incubadas a 30ºC durante 1 hora antes de transferir 2,5 \mul de la mezcla de reacción a una placa de 96 pocillos Dynex (Dynex Technologies Inc., Chentilly, VA) y analizarla utilizando un luminómetro LUMIstar* precalentado (30ºC) (BMG Lab Technologies, Durham, NC).
Inhibición de la síntesis de proteínas - El ensayo RIP
La actividad tóxica de OPL98101 fue medida utilizando un ensayo de inhibición de síntesis de proteínas in vitro disponible comercialmente. A una concentración de 30 pM, la Saporina inhibía un 90%, mientras que una muestra que contenía la misma concentración estimada de la quimioquina-toxina tuvo que ser diluida 500 veces para dar un resultado similar. Asumiendo que el cálculo de concentraciones fue correcto, este resultado es consistente con los datos publicados de que la subunidad A de Shiga es más potente que la Saporina en este ensayo [ver, Zollman y col. (1994) Protein Expr. Purif., 5: 291-5; McDonald y col. (1996) Protein Expr. Purif., 8: 97-108; y Chandler y col. (1998) Int. J. Cancer, 78: 106-11].
Protocolos para el cultivo de tejidos Cultivos primarios
Los protocolos para el cultivo de células de cerebro humano adulto son conocidos (ver, por ejemplo, Yong y col. (1997) "Culture of glial cells from human brain biopsies", En Protocols for Neural Cell Culture (A. Richardson y S. Fedoroff, eds.), Humana Press, St. Louis, 157-172). Brevemente, tejido cerebral resecado quirúrgicamente es cortado en cubos de 1 mm e incubado en tripsina al 0,25% durante una hora a 37ºC. La suspensión se pasa a través de un filtro de nailon de 130 \mum que disocia el tejido en células individuales. Después de centrifugación (15.000 rpm, 25 minutos) en Percoll al 30%, el sobrenadante contiene neuronas viables mientras que la pella está compuesta por desechos tisulares, mielina y glóbulos rojos sanguíneos. Las células neurales son recogidas y plaqueadas sobre plástico para cultivo de tejidos no revestido. Los cultivos son incubados durante 24 horas a 37ºC, tiempo mediante el cual la microglía se adhiere al plástico mientras que los oligodendrocitos permanecen en solución. Los oligodendrocitos son decantados, centrifugados y plaqueados sobre poli-L-lisina a la que se adhieren. Las neuronas y los astrocitos no sobreviven a este proceso de aislamiento, sin embargo, las poblaciones resultantes de oligodendroglía y microglía son más de un 95% puras.
Las neuronas y los astrocitos derivan de especímenes de cerebro fetal. El tejido cerebral es cortado en pequeños cubos e incubado con tripsina al 0,25% y 100 \mug/mg de ADNasa a 37ºC (ver, Oh y col. (1996) Glia, 17: 237-53). La suspensión es pasada a través de un filtro de nailon de 130 \mum y el filtrado es recogido, lavado y sembrado sobre plástico para cultivo de tejidos revestido con poli-L-lisina para permitir que las células se adhieran. No se requiere una etapa de centrifugación en Percoll, ya que la mayoría de los tractos axonales fetales no están mielinizados. Para purificar la población neuronal, el cultivo mixto es tratado con arabinósido de citosina 25 \muM (Sigma, St. Louis), que destruye los astrocitos mitóticamente activos. Para purificar la población astrocítica, el cultivo mixto es pasado en presencia de tripsina al 0,25%, que destruye las neuronas. Los astrocitos adultos son aislados de manera similar. Se prepararon cultivos primarios de astrocitos adultos y fetales y de neuronas fetales.
En general, los cultivos de células neurales son alimentados dos veces por semana con medio esencial mínimo (MEM) suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 20 \mug/ml de gentamicina y un 0,1% de dextrosa (Gibco, Grand Island, NY).
Los leucocitos de sangre periférica humana son recogidos de acuerdo con métodos publicados (ver, por ejemplo, Chabot y col. (1997) J. Clin. Invest., 100: 604-12). Brevemente, sangre venosa es dispuesta sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y centrifugada durante 30 minutos a 2500 rpm. Se recoge la fracción de células mononucleares, se lava dos veces y se siembra sobre sustratos para cultivo de tejidos no revestidos. Dos horas más tarde, las células flotantes (en su mayoría linfocitos T) son retiradas para dejar tras de sí una población adherente que consta primariamente de monocitos. Estas células son utilizadas inmediatamente en experimentos de citotoxicidad, o son activadas antes de la experimentación (tres días, 1 mg/ml de anti-unión al receptor CD3 para las células T o 1 mg/ml de lipopolisacárido para monocitos).
En general, todas las células hematopoyéticas (células primarias o las líneas celulares descritas a continuación) son mantenidas en medio RPMI suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 20 mg/ml de Gentamicina y un 0,1% de dextrosa (Gibco).
Líneas celulares
Las líneas celulares derivadas de fagocitos mononucleares humanos son cultivadas de manera rutinaria. Por ejemplo, se han utilizado para ensayar los compuestos células U937 y THP-1 derivadas de monocitos, y la línea CHME similar a microglía de cerebro fetal (obtenida del Dr. Tardieu, Francia; ver, también, Janabi y col. (1995) Neurosci. Lett., 195: 105-8). Numerosas líneas celulares, incluyendo las del linaje astrocítico y neuronal, pueden ser fácilmente obtenidas de la ATCC (Rockville, MD) y cultivadas con éxito utilizando las instrucciones que acompañan al envío.
Inmunohistoquímica
Se realiza rutinariamente inmunohistoquímica indirecta para confirmar la pureza de los cultivos enriquecidos y, por extensión, para distinguir entre tipos celulares diferentes en un cultivo mixto. Existen una variedad de anticuerpos específicos de tipos celulares disponibles académicamente y comercialmente que pueden ser utilizados para facilitar este proceso. Ejemplos incluyen un anticuerpo anti-galactocerebrósido (GalC) para identificar oligodendrocitos, un anticuerpo anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para astrocitos, un anticuerpo anti-Mac-1 para la microglía y un anticuerpo anti-neurofilamento para neuronas (anti-NFL).
Brevemente, células vivas sobre portaobjetos son tratadas con un fijador apropiado (por ejemplo, paraformaldehido al 4% para galactocerebrósido y etanol 95%/ácido acético glacial 5%, v/v). Se aplica una concentración predeterminada del anticuerpo primario seguido por un anticuerpo secundario apropiado (típicamente, anti-IgG de conejo o anti-IgG de ratón producido en cabra conjugado a rodamina o a fluoresceína). Las células teñidas son examinadas utilizando un microscopio equipado para detectar inmunofluorescencia. El análisis de los cultivos de células adherentes se basa primariamente en la tinción y el marcaje inmunohistoquímicos indirectos, y en métodos de doble marcaje. Cada tipo celular es contado en un número suficientemente grande de campos microscópicos elegidos aleatoriamente y los datos son sometidos a un análisis estadístico apropiado. Dependiendo del modo y/o nivel de toxicidad, esto es, apoptosis frente a necrosis y/o toxicidad sutil frente a toxicidad flagrante, el grado de muerte celular es registrado cualitativamente (grado de toxicidad de 0 a 4, ver; por ejemplo, Noble y col. (1994) Brain Res., 633: 83-90) o cuantitativamente (el número de células muertas como porcentaje de la población total; ver, por ejemplo, Oh y col. (1997) Brain Res., 757: 236-44). En la mayoría de los casos, los datos son analizados utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía con comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. Las células suspendidas son analizadas utilizando un citómetro de flujo, que típicamente automatiza la recogida de datos y el análisis estadístico apropiado (por ejemplo, el equipo de Becton Dickinson).
Ensayos de citotoxicidad
Brevemente, se suministra a las células de ensayo medio fresco conteniendo sustancias control y de ensayo (a diferentes concentraciones) y se incuban durante un periodo especificado (24-36 horas). Posteriormente se mide la citotoxicidad como la capacidad de las células adherentes para reducir el colorante vital MTT, según está descrito con detalle en otro lugar (Mosmann, T. (1983) J. Immunol. Methods, 65: 55-63; Gieni y col. (1995) J. Immunol. Methods, 187: 85-93). La citotoxicidad en cultivos de células suspendidas es medida utilizando un contador Coulter, en el que se toma el número absoluto de células como un índice del número de células supervivientes por condición de ensayo. Finalmente, la supervivencia celular general y la morfología celular son monitorizadas a lo largo de todos los experimentos utilizando microscopía de fase invertida y la exclusión del colorante Azul Trypan (Yong y col. (1997) "Culture of glial cells from human brain biopsies", En Protocols for Neural Cell Culture (A. Richardson y S. Fedoroff, eds.), Humana Press, St. Louis, 157-172).
Ensayos quimiotácticos
El efecto quimiotáctico de cada quimioquina-toxina recombinante es de interés, principalmente como un análisis de la actividad biológica del componente ligando. Numerosos ensayos quimiotácticos con conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Stuve y col. (1996) Ann. Neurol., 40: 853-63; y Stuve y col. (1997) J. Neuroimmunol., 80: 38-46). Brevemente, los compartimientos superior e inferior de una cámara de Boyden modificada son separados por una membrana de 3 \mum revestida con fibronectina. Células respondedoras hematopoyéticas, apropiadas para la quimioquina que esté siendo analizada, son colocadas en el compartimiento superior de la cámara mientras que los materiales de ensayo son colocados en el inferior. Después de un periodo de tiempo apropiado, se registra el número de células que han migrado en respuesta a un estímulo quimiotáctico. Los linfocitos T migratorios se desprenden de la membrana hacia la cámara inferior y pueden ser contados posteriormente utilizando un contador Coulter. En contraste, los MNPs migratorios son retenidos sobre el lado inferior de la membrana y, por consiguiente, la superficie superior debe ser lavada y la superficie inferior fijada antes de la tinción con Azul de Coomassie y el análisis mediante microscopía óptica.
Actividad de OPL98110 sobre células diana estacionarias
Nota: El Control A es medio de cultivo de tejidos. El Control B es una fracción de lavado obtenida antes de la elución de la quimioquina-toxina de la resina de afinidad con níquel. Esta fracción estaba muy enriquecida en proteínas de E. coli. A no ser que se indique de otro modo, todos los procedimientos se llevaron a cabo por triplicado.
Monocitos de sangre periférica humana (de donantes sanos) y células THP-1 (una línea de células monocíticas humanas) fueron tratados con diluciones 1:10 y 1:50 de Control B y OPL98110. Veinticuatro horas más tarde las células fueron examinadas mediante microscopía de contraste de fases y se fotografiaron y contaron los campos representativos. OPL98110 produjo una alteración notable de la membrana y vacuolización en ambos tipos celulares. La mayoría de las células tratadas parecían anormales y una cantidad incrementada de desechos celulares indicaba que algunas estaban ya muertas. A la concentración más baja de la quimioquina-toxina (1:50), estaban afectados el 20-25% de ambos tipos celulares.
En otro experimento, se cultivaron células THP durante 48 horas en presencia y ausencia de OPL98110 (dilución 1:10) y se examinó la viabilidad celular mediante microscopía o por la capacidad para excluir Azul Trypan. Las células que excluyen el colorante están vivas, mientras que las células teñidas están muertas. Debido a que las células THP-1 son naturalmente no adherentes, y con el fin de producir un recuento más preciso, las células control y tratadas fueron disociadas de los desechos celulares mediante pipeteo suave antes del recuento. Después de 48 horas, el 7,4 \pm 3% de las células control estaban muertas (esto es, teñidas), en comparación con el 58,8 \pm 13% del grupo tratado con OPL98110. Ésta es una diferencia del 51,4%. Pocillos hermanos examinados después de 96 horas, revelaron que las células control habían proliferado y continuaban pareciendo bastante normales y sanas, mientras que los cultivos tratados con la quimioquina-toxina contenían muchos desechos celulares, pero pocas, si es que había alguna, células vivas.
Estos cultivos fueron divididos y se dejaron incubar durante siete días más. Las células THP-1 control continuaban desarrollándose y proliferando. No había células supervivientes en los pocillos derivados de los cultivos tratados con OPL98110. Estos estudios demuestran que las células tratadas enferman y, eventualmente, mueren a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, sugiriendo un mecanismo apoptótico.
Actividad de OPL98110 sobre células no diana
OPL98110 fue ensayada sobre neuronas fetales humanas primarias y sobre la línea celular de glioma humano U251 (tumor astrocítico) no dianas. Las neuronas fueron activadas con TNF-\alpha para simular inflamación. Las células de glioma estaban proliferando agresivamente y, por tanto, estaban activadas. Después de una exposición de 24 horas a OPL98110 (dilución 1:50) no había ningún efecto detectable sobre ninguno de los tipos celulares. La tinción inmunohistoquímica de las neuronas para determinar \beta-tubulina y la detección de apoptosis (TUNEL) revelaron células sanas, intactas.
Actividad de OPL98110 sobre células diana migratorias
En la primera serie de experimentos, se analizaron células diana del linaje de leucocitos (monocitos periféricos humanos y células THP-1) en su estado quiescente, estacionario. Según se discutió anteriormente, después de una lesión o inflamación focal in vivo, las células inmunes son activadas por una variedad de estímulos (por ejemplo, citoquinas y quimioquinas) y responden mediante, entre otras cosas, la regulación por incremento de la expresión de receptores de quimioquinas y la migración hacia el lugar de la inflamación. Está bien establecido que estas respuestas características in vivo pueden ser remedadas in vitro mediante la exposición de las células diana a varios agentes exógenos tales como citoquinas, quimioquinas, ésteres de forbol y lipopolisacárido bacteriano. Más específicamente, la migración de leucocitos in vitro puede ser inducida por quimioquinas, y medida mediante el recuento de las células que migran a través de un filtro de 3 \mum que separa la cámara superior y la cámara inferior de una placa de cultivo de tejidos de Boyden modificada. Se emplean típicamente incubaciones de corta duración (por ejemplo, 2-3 horas) de la quimioquina de ensayo y las células, con el fin de observar el efecto quimioatrayente temporal. No todas las quimioquinas son quimioatrayentes eficaces sobre todos los tipos celulares, aunque una célula dada pueda tener el receptor apropiado.
En el caso de células THP-1, MCP-3 es quimioatrayente pero MCP-1 (y por tanto OPL98110) no lo es. MCP-3 atraía a las células THP-1 hacia la cámara inferior en un 185 \pm 8% del Control A. Además, la propia naturaleza de OPL98110 hace difícil cuantificar cualquier actividad quimioatrayente, dado que cualquier célula sensible a MCP-1 será destruida. Las células THP-1 normales, sin embargo, migran naturalmente sin ningún estímulo exógeno específico (el acceso a una región de baja densidad celular es todo lo que parece requerirse), aunque a una velocidad mucho más lenta que la inducida por quimioquinas.
Armados con este conocimiento, se diseñaron experimentos con incubaciones de mayor duración para analizar los efectos citotóxicos de OPL98110 sobre células THP-1 que migraban de forma natural y migradas (esto es, células que alcanzan la cámara inferior de las placas de cultivo de tejidos de Boyden modificadas). Células THP-1 fueron plaqueadas en las cámaras superiores de cámaras de Boyden modificadas. Las cámaras inferiores contenían medio de cultivo con y sin diluciones seriadas de OPL98110. Después de 24 horas, se contaron las células de la cámara superior y de la cámara inferior utilizando un contador Coulter. No había diferencia del número de células en las cámaras superiores entre el control y los problemas, sugiriendo que había migrado un número igual de células bajo todas las condiciones. En comparación con el control, el número de células en las cámaras inferiores de células tratadas disminuía a medida que aumentaba la concentración de OPL98110. Las células THP-1 migradas fueron destruidas por OPL98110 de manera dependiente de la dosis.
Las células "activas" en los experimentos con la cámara de Boyden modificada parecen ser más susceptibles a OPL98110 que las células analizadas en el modelo de cultivo de tejidos "estacionario" (quiescente). Por ejemplo, después de 24 horas, el 75-80% aproximadamente de células THP-1 estacionarias tratadas con OPL98110 (dilución 1:50) parecían sanas cuando eran observadas bajo el microscopio. La tasa de supervivencia celular media en los ensayos de migración utilizando la misma dilución de la quimioquina-toxina fue de 50 \pm 15% (media de 3 experimentos por triplicado).
Se realizó un experimento similar utilizando linfocitos T humanos activados (con anti-CD3+) aislados de voluntarios sanos. OPL98110 (dilución 1:50) destruyó el 32 \pm 7% (p<0,05) de estas células, en comparación con el 49 \pm 2% (p<0,001) de células THP-1 analizadas al mismo tiempo.
Ejemplo 3 Preparación de conjugados quimioquina-toxina unidas químicamente Unión de un entrecruzador bifuncional a través de grupos de amina primaria
Se utiliza un entrecruzador bifuncional para unir un anticuerpo monoclonal (IgG) a un compuesto que tenga una amina primaria según sigue: el entrecruzador utilizado es N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), sulfosuccinimidil-6-hexanoato (Sulfo-LC-SPDP) o sulfosuccinimidil-6-[3'-(2-piridilditio)-propionamido]-hexanoato (Pierce Chemicals, Rockford, IL). La toxina y la IgG son derivatizadas inicialmente con el entrecruzador.
A 10 mg de toxina en 1,0 ml de BBS se añade una solución madre 20 nM del entrecruzador preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la mezcla es agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar el entrecruzador no conjugado, se aplica la muestra a una columna de desalinización de 5 ó 10 ml equilibrada con PBS, y se recogen fracciones de 1 ml, se monitoriza la absorbancia a 280 nm, y se determinan y agrupan las fracciones de los picos. Las fracciones de los picos recogidas son concentradas hasta un volumen final de 1,0 ml utilizando, por ejemplo, microdiálisis.
A continuación, 25 mg del anticuerpo son añadidos a 30 \mul de la solución madre del entrecruzador y la mezcla es agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se recogen las fracciones de los picos y se concentran a partir de una columna de desalinización equilibrada con tampón acetato igual que anteriormente. Al concentrado se añaden 12 mg de ditiotreitol en 500 \mul del tampón acetato, y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos.
La mezcla es aplicada a una columna de desalinización de 10 ml equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el exceso de agente reductor. Se recogen fracciones de 1 ml y se monitoriza la absorbancia de cada una a 280 nm. La primera fracción que tiene un pico de absorbancia a 280 nm es añadida a la toxina derivatizada y la mezcla de reacción se incuba a temperatura ambiente durante 18 horas, se aplica posteriormente a una columna de Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) (Pharmacia) y se equilibra con PBS mientras se recogen fracciones de 1 ml y se monitorizan por la absorbancia a 280 nm. Se agrupan las fracciones que contienen el conjugado.
Ejemplo 4 Preparación de conjugados quimioquina-toxina unidas químicamente Unión de un entrecruzador bifuncional a través de grupos sulfhidrilo
La conjugación de un ligando anticuerpo monoclonal a una toxina con un grupo sulfhidrilo se lleva a cabo según sigue utilizando los entrecruzadores anteriormente descritos. A 5 mg del ligando en 1,0 ml de PBS se añaden 25 \mul de una solución madre 20 mM del entrecruzador, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para eliminar el exceso de entrecruzador, la muestra es aplicada a una columna de desalinización de 5 ml equilibrada con PBS/ácido etilén diamino tetraacético (EDTA), y se recogen fracciones de 1 ml y se monitorizan por su absorbancia a 280 nm. Las fracciones de los picos que contienen la proteína son agrupadas y concentradas hasta un volumen final de 1,0 ml. Al concentrado de proteína se añaden 3 mg de \beta-galactosidasa y la mezcla de reacción se incuba durante una noche a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla de reacción es aplicada a una columna de Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) (Pharmacia) equilibrada con PBS, y se recogen fracciones de 1 ml. La absorbancia de la fracción es monitorizada a 280 nm, y el primer pico absorbente que emerge de la columna contiene el conjugado de proteínas.
Ejemplo 5 Preparación de conjugados quimioquina-toxina unidas químicamente Pegilación de un conjugado quimioquina-toxina
La pegilación de un conjugado quimioquina-toxina purificado se lleva a cabo mezclando la toxina con metoxi-PEG-maleimida (MPEG-MAL) (PM 5000) (Sigma, St. Louis, MO) a una relación molar de 1:10 en tampón A (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM, pH 7,0). Después de 30 minutos de incubación, la reacción es amortiguada mediante la adición de un exceso molar de 30 veces de Cys sobre MPEG-MAL. Con el fin de concentrar la proteína, la mezcla de reacción es aplicada a una resina de cromatografía adecuada y eluida en una forma más concentrada con tampón conteniendo sal (pH neutro). Por ejemplo, la mezcla de reacción es aplicada a una columna de S-Sefarosa (Pharmacia) equilibrada con NaCl 50 mM en tampón B (fosfato de sodio 10 mM, EDTA 1 mM, pH 6,0). Las proteínas son eluidas en forma discontínua con NaCl 1 M en tampón. La proteína concentrada es cargada en una columna de filtración en gel y eluida con tampón C (citrato de sodio 50 mM, NaCl 80 mM, EDTA 0,1 mM, pH 6,0). El conjugado quimioquina-toxina con polímeros de PEG unidos es separado del conjugado quimioquina-toxina no derivatizado en virtud de su diferencia de peso molecular.
Debido a que serán obvias modificaciones para los expertos en esta técnica, se tiene la intención de que esta invención esté limitada solamente por el ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
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<110> McDonald, John R.
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Coggins, Philip 
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<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DEL DAÑO TISULAR SECUNDARIO Y OTRAS CONDICIONES Y ENFERMEDADES INFLAMATORIAS
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<130> 25020-601B
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<140> No asignado
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<141> 21-07-1999
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<160> 70
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<170> FastSEQ para Windows, Versión 3.0
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<210> 1
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Homo sapiens 
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<400> 1
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\sa{Gly Gly Gly Gly Ser}
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<210> 2
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> REPETICIÓN
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<222> (1)...(5)
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<223> Homo sapiens 
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<400> 2
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\sa{Gly Gly Gly Gly Ser}
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<210> 3
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Homo sapiens 
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<400> 3
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\sa{Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser}
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<210> 4
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Homo sapiens 
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\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly}
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<210> 5
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.333000\baselineskip
<223> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr}
\sac{Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Ser Thr}
\sac{Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Ser Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ser Ser Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> adaptador sensible a tripsina de la toxina diftérica
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Met Gly Arg Ser Gly Gly Gly Cys Ala Gly Asn Arg Val Gly Ser}
\sac{Ser Leu Ser Cys Gly Gly Leu Asn Leu Gln Ala Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.333000\baselineskip
<223> unidad de repetición 2-4 veces
\vskip0.333000\baselineskip
<221> REPETICIÓN
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (3)...(4)
\vskip0.333000\baselineskip
<223> familia de repetición 1-11 veces
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Met Gly Ser Ala Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 127
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Bryonia dioica 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 275
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Saponaria officinalis 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
45
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Momordica charantia 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Shigella dysenteriae 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
49
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
51
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Trichosanthews kirilowii 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
53
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Secuencia líder marcada con His de Homo sapiens 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador directo de Homo sapiens (Eotaxina)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
gggtaatagc atatggggcc agcttctgtc ccaacca 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador inverso de Homo sapiens (Eotaxina)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
cccgaattct ttcatcgctg gctttggagt tggagatttt tggt 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador directo de Homo sapiens (MCP-1)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
gggtaatagc atatgcagcc agatgcaatc aatgcccca 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador inverso de Homo sapiens (MCP-1)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
cccgaattct ttcatcgcag tcttcggcgt ttgggtttct t 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador directo de Homo sapiens (MCP-3)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
catatgcaac cggtaggcat caacacg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador inverso de Homo sapiens (MCP-3)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
cactagtaac catcgcaagc ttcggggtct gag 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador directo de Homo sapiens (SDF-1\sqbullet)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
gggtaatagc atatgaagcc cgtcagcctg agctacag 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador inverso de Homo sapiens (SDF-1\sqbullet)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
cccgaattct ttcatcgcca tcttgaacct cttgtttaaa gctttc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador directo de Shigella dysenteriae (Shiga)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
gggtaatagc atatgaaaga attcaccctg gacttttcc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador inverso de Shigella dysenteriae (Shiga)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
cccggatcca ctagtattaa gcgtggtg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador inverso de Shigella dysenteriae (Shiga-His6)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
cccggatcca ctagtttaat gatgatggtg gtggtggcaa ttgag 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 978
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(978)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina MCP1-AM-subunidad A1 de Shiga truncada
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
56
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 984
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(984)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina MCP1-AM-subunidad A1 de Shiga truncada HIS6
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
59
60
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 999
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(999)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina MCP1-AM-SAPORINA
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
62
63
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 978
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(978)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina MCP3-AM-subunidad A1 de Shiga truncada
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
65
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 984
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(984)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina MCP3-AM-subunidad A1 de Shiga truncada HIS6
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
67
68
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 999
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(999)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina MCP3-AM-SAPORINA
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
70
71
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 963
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina SDF1\sqbullet-AM-subunidad A1 de Shiga truncada
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(963)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
73
74
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 969
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina SDF1\sqbullet-AM-subunidad A1 de Shiga truncada HIS6
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(969)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
76
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 984
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina SDF1\sqbullet-AM-SAPORINA
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(984)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
78
79
80 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 972
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(972)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina EOTAXINA-AM-subunidad A1 de Shiga truncada
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
81
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 978
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(978)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina EOTAXINA-AM-subunidad A1 de Shiga truncada HIS6
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
84
85
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 993
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(993)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica la proteína de fusión quimioquina-toxina EOTAXINA-AM-SAPORINA
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
87
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 744
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica una proteína de fusión Metionina-subunidad A1 de Shiga truncada
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(744)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
89
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 750
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica una proteína de fusión Metionina-subunidad A1 de Shiga truncada HIS6
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(750)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
91
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 765
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica una proteína de fusión Metionina-Saporina
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(765)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
93
94
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(231)
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Construcción que codifica una proteína Metionina-MCP2
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
96
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa 
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Señal de retención en el retículo endoplásmico carboxi-terminal de la toxina de Pseudomonas 
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> ADNc de la quimioquina de ratón ALP
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (11)..(373)
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
98
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 912
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> ADNc de la Lungquina de ratón
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.333000\baselineskip
<222> (1)..(504)
\vskip0.333000\baselineskip
<300>
\vskip0.333000\baselineskip
<308> AFO82859/GenBank
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
100
101

Claims (110)

1. Utilización de un conjugado para la formulación de un medicamento para el tratamiento de condiciones patológicas asociadas con respuestas inflamatorias y/o con daño tisular secundario asociado con la activación, proliferación y migración de células inmunoefectoras mediante la inhibición de la activación, proliferación o migración de las células inmunoefectoras, que comprende la administración de un conjugado a un animal mediante lo cual se inhibe la activación, proliferación o migración de las células inmunoefectoras, inhibiendo de este modo la respuestas inflamatoria y/o el daño tisular secundario, donde:
el conjugado comprende los componentes siguientes: (agente vectorizante dirigido a un receptor de 
\hbox{quimioquinas) _{n} ,}
(L)_{q} y (agente citotóxico)_{m}, en el que:
L es un adaptador para ligar el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas a un agente citotóxico vectorizado;
el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es cualquier resto que se una selectivamente a un receptor de quimioquinas;
el agente citotóxico vectorizado o una porción del mismo, cuando es internalizado en una célula, altera el metabolismo o la expresión génica en la célula, regula o altera la síntesis de proteínas en la célula, inhibe la proliferación de la célula o destruye la célula;
m y n, que son seleccionados independientemente, son al menos 1;
q es 0 o más, siempre que el conjugado resultante se una al receptor diana, se internalice y suministre el agente citotóxico vectorizado; y
el conjugado resultante se une a un receptor que interacciona con, e internaliza, una quimioquina, mediante lo cual el(los) agente(s) citotóxico(s) vectorizado(s) es(son) internalizado(s) en una célula portadora del receptor.
2. La utilización de la reivindicación 1, en la que el animal es un mamífero.
3. La utilización de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la condición comprende el daño tisular secundario.
4. La utilización de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la condición es seleccionada de entre lesiones del sistema nervioso central (SNC), enfermedades inflamatorias del SNC, trastornos neurodegenerativos, enfermedad cardíaca, enfermedades inflamatorias oculares, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedades inflamatorias de las articulaciones, enfermedades inflamatorias del riñón o renales, enfermedades inflamatorias pulmonares, enfermedades inflamatorias nasales, enfermedades inflamatorias del tiroideas y cánceres regulados por citoquinas.
5. La utilización de la reivindicación 4, en la que las enfermedades inflamatorias del SNC y/o los trastornos neurodegenerativos son seleccionados de entre derrame cerebral, lesión cerrada de la cabeza, leucoencefalopatía, coriomeningitis, meningitis, adrenoleucodistrofia, complejo de demencia del SIDA, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, síndrome de fatiga crónica, encefalitis, encefalomielitis, encefalopatías espongiformes, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson y lesiones/traumas de la médula espinal (SCI).
6. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad cardíaca es ateroesclerosis.
7. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria ocular es seleccionada de entre retinopatía diabética proliferativa, vitreorretinopatía proliferativa, retinitis, escleritis, escleroiditis, coroiditis y uveitis.
8. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria intestinal es seleccionada de entre colitis crónica, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
9. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria de las articulaciones es seleccionada de entre artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis reumatoide y espondilartropatías.
10. La utilización de la reivindicación 9, en la que la espondilartropatía es seleccionada de entre espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis reactiva, artritis psoriática, espondilitis, espondilartropatías no diferenciadas y síndrome de Behcet.
11. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria del riñón o renal es seleccionada de entre glomerulonefritis, nefropatía por IgA y nefritis de lupus.
12. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria pulmonar es seleccionada de entre síndrome del distrés respiratorio agudo, enfermedad pulmonar eosinofílica, neumonía eosinofílica crónica, neumonía eosinofílica aguda, broncoconstricción, displasia broncopulmonar, eosinofilia broncoalveolar, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía y enfermedad pulmonar fibrótica.
13. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria nasal es seleccionada de entre poliposis, sinusitis y rinitis.
14. La utilización de la reivindicación 4, en la que la enfermedad inflamatoria del tiroides es tiroiditis.
15. La utilización de la reivindicación 4, en la que los cánceres regulados por citoquinas son seleccionados de entre gliomas, ateromas, carcinomas, adenocarcinomas, granulomas, glioblastomas, granulomatosis, linfomas, leucemias, cánceres de pulmón, melanomas, mielomas, sarcomas, sarcoidosis, microgliomas, meningiomas, astrocitomas y oligodendrogliomas.
16. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en la que: el agente vectorizante dirigido al receptor de quimioquinas es una quimioquina, un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de quimioquinas o un fragmento de la quimioquina o del anticuerpo, donde la quimioquina, el anticuerpo o el fragmento de los mismos se une al receptor e internaliza el agente citotóxico vectorizado en una célula.
17. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que m y n, que son seleccionados independientemente, son 1-6.
18. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que q es 1, n es 1 y m es 1.
19. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es una quimioquina.
20. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se une específicamente a receptores de quimioquinas en leucocitos.
21. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se une específicamente a receptores de quimioquinas en células seleccionadas de fagocitos mononucleares (MNP), leucocitos, células destructoras naturales, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B.
22. La utilización de la reivindicación 20, en la que los leucocitos son seleccionados de basófilos, neutrófilos, eosinófilos y combinaciones de dos o más de cualquiera de los mismos.
23. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en la que el agente vectorizante quimioquina es seleccionado de entre IL-8, GCP-2, GRO-\alpha, GRO-\beta, GRP-\gamma, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG, IP-10, SDF-1\alpha, SDF-1\beta, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-1\gamma, MIP-2, MIP-2\alpha, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, ALP, lungquina, eotaxina-1, eotaxina-2, I-309, SCYA17, Tim-1, TARC, RANTES, DC-CK-1, linfotactina y fractalquina.
24. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en la que el agente vectorizado es una toxina.
25. La utilización de la reivindicación 24, en la que la toxina es un agente que corta ADN.
26. La utilización de la reivindicación 25, en la que el agente que corta ADN es seleccionado de entre antraquinona-oligopirrolcarboxamida, bencimidazol, leinamicina, dinemicina A, enediina, iminoquinonas de endiina, 2,2r-bis (2-aminoetil)-4-4'-bitiazol, conjugados de epiliticina-salen.cobre y análogos o derivados funcionales de los mismos.
27. La utilización de la reivindicación 24, en la que la toxina es un antimetabolito.
28. La utilización de la reivindicación 27, en la que el antimetabolito es seleccionado de entre 5-fluorouracilo, metotrexato, melfalán, daunomicina, doxorrubicina, mostazas nitrogenadas, mitomicina C y análogos o derivados funcionales de los mismos.
29. La utilización de la reivindicación 24, en la que la toxina es seleccionada de entre toxinas bacterianas, vegetales, de insecto, de serpiente y de araña.
30. La utilización de la reivindicación 24, en la que la toxina es una proteína inactivadora de ribosomas (RIP).
31. La utilización de la reivindicación 30, en la que la RIP es una RIP de tipo uno o un fragmento de la misma biológicamente funcional.
32. La utilización de la reivindicación 31, en la que la RIP de tipo uno es seleccionada de entre diantina 30, diantina 32, licnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-6, saporina-7, saporina-8 y saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, \alpha-kirilowina, \beta-kirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, MAP-30, \alpha-momorcharina, \beta-momorcharina, tricosantina, TAP-29, tricoquirina, RIP de cebada, tritina, RIP de lino, RIP de maíz, asparina-1 y asparina-2.
33. La utilización de la reivindicación 30, en la que la RIP es una RIP de tipo dos, la subunidad catalítica de la misma o una subunidad o fragmento de la misma biológicamente funcional.
34. La utilización de la reivindicación 33, en la que la RIP de tipo dos es seleccionada de entre volkensina, ricina, nigrina-b, CIP-29, abrina, vircumina, modeccina, ebulitina-\alpha, ebulitina-\beta, ebulitina-\gamma y porrectina.
35. La utilización de la reivindicación 25, en la que la toxina es una toxina bacteriana seleccionada de entre exotoxina de Pseudomonas, toxina de Diphteria, toxina de Shiga, toxinas similares a Shiga, subunidades catalíticas de las mismas y fragmentos de las mismas biológicamente funcionales.
36. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-35, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas y el agente citotóxico vectorizado están unidos directamente a través de un enlace covalente o iónico.
37. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-35, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas y el agente citotóxico vectorizado está unidos a través de un adaptador.
38. La utilización de la reivindicación 37, en la que el adaptador es un polipéptido o un adaptador químico.
39. La utilización de la reivindicación 37, en la que el adaptador químico es un entrecruzador heterobifuncional susceptible de ser cortado.
40. La utilización de la reivindicación 39, en la que el adaptador químico es seleccionado de entre N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, sulfosuccinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio)-tolueno, sulfosuccinimidil-6-[a-metil-a-(piridilditio)-toluamido]-hexanoato, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato, succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]-hexanoato, sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-
propionamido]-hexanoato, 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazínico y S-(2-tiopiridil)-L-cisteína.
41. La utilización de la reivindicación 37, en la que el adaptador es un péptido o un aminoácido.
42. La utilización de la reivindicación 41, en la que el péptido contiene entre 1 y 60 aminoácidos.
43. La utilización de la reivindicación 42, en la que el adaptador es seleccionado entre péptidos que reducen el impedimento estérico entre el agente citotóxico vectorizado y el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, sustratos enzimáticos intracelulares, adaptadores que incrementan la flexibilidad del conjugado, adaptadores que incrementan la solubilidad del conjugado, adaptadores que incrementan la estabilidad en suero del conjugado, adaptadores fotocortables y adaptadores susceptibles de ser cortados con ácido.
44. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-43, en la que el receptor de quimioquinas es un miembro de la superfamilia de receptores similares a rodopsina, con siete dominios transmembranales, acoplados a proteína G.
45. La utilización de la reivindicación 44, en la que el receptor de quimioquinas es seleccionado de entre DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX_{3}CR-1, XCR-1 y CD97.
46. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-45, que comprende además una citoquina no quimioquina o una proteína asociada al receptor que se une a receptores en, y/o activa, una o más de las células que estimulan el daño tisular secundario, distintos de receptores de quimioquinas.
47. La utilización de la reivindicación 46, en la que la proteína asociada al receptor tiene un peso molecular de 38 a 40 kDa aproximadamente y se une a, y modula la actividad de, un miembro de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
48. La utilización de la reivindicación 47, en la que el receptor de LDL es seleccionado de entre los receptores secuestradores de LDL aciladas 1 y 2, los receptores de LDL, VLDL-1, VLDL-2, glicoproteína 330/megalina, LRP, alfa-2-macroglobulina y sorLA-1.
49. La utilización de la reivindicación 46, en la que la citoquina se une a un receptor específico de citoquinas.
50. La utilización de la reivindicación 46, en la que la citoquina es seleccionada de entre interleuquinas, linfoquinas, monoquinas, factores estimuladores de colonias y proteínas asociadas a receptores.
51. La utilización de la reivindicación 46, en la que la citoquina es seleccionada de entre EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 e IL-13.
52. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo específico de un antígeno.
53. La utilización de la reivindicación 52, en la que el anticuerpo es específico para un antígeno seleccionado de entre DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX_{3}CR-1, XCR-1 y CD97.
54. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1-45, que comprende además un anticuerpo que se une a un receptor de citoquinas no quimioquinas y/o a una citoquina no quimioquina.
55. Utilización de un conjugado que comprende un agente vectorizado y un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas o una porción del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de condiciones patológicas asociadas con respuestas inflamatorias y con el daño tisular secundario asociado con la activación, proliferación y migración de células inmunoefectoras mediante la inhibición de la activación, proliferación o migración de las células inmunoefectoras en un animal, mediante lo cual se inhibe la activación, proliferación, migración de las células inmunoefectoras, inhibiendo de este modo la respuesta inflamatoria, donde:
el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es una quimioquina, un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de quimioquinas o un fragmento de la quimioquina o del anticuerpo, donde la quimioquina, el anticuerpo o el fragmento de los mismos se une al receptor e internaliza el agente vectorizado en una célula;
el agente vectorizado o una porción del mismo, cuando es internalizado en una célula, altera el metabolismo o la expresión génica en la célula, regula o altera la síntesis de proteínas en la célula, inhibe la proliferación de la célula o destruye la célula; y
el conjugado se une a un receptor de quimioquinas, teniendo como resultado la internalización del agente vectorizado en las células portadoras del receptor.
56. La utilización de la reivindicación 55, en la que la respuesta inflamatoria tiene como resultado un daño tisular secundario.
57. La utilización de la reivindicación 55 ó 56, en la que las células son leucocitos.
58. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, en la que las células son seleccionadas de fagocitos mononucleares (MNP), leucocitos, células destructoras naturales, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B.
59. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 55-58, en la que la citoquina no quimioquina es seleccionada de entre EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 e IL-13.
60. La utilización de la reivindicación 55, en la que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es una quimioquina.
61. Utilización de un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas en asociación con un agente vectorizado, en la preparación de una composición para la administración vectorizada de dicho agente vectorizado a células que expresan receptores de quimioquinas, en la cual:
las células son leucocitos;
el agente vectorizado es cualquier agente para ser internalizado en las células mediante unión a un agente vectorizante, y que después de la internalización altera o influye sobre el metabolismo celular, el crecimiento, la actividad, la viabilidad u otra propiedad o característica de las células;
el agente vectorizante es una molécula o ligando que se une específicamente a un receptor de quimioquinas en las células y lleva a cabo la internalización del agente vectorizado; y
el agente vectorizante dirige al agente vectorizado hacia los receptores de quimioquinas en leucocitos, mediante lo cual el compuesto es internalizado por las células.
62. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 55-61, en la que el agente terapéutico es administrado por un método seleccionado de entre tópicamente, localmente, intraarticularmente, intracisternalmente, intraocularmente, intraventricularmente, intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, intratraquealmente, intraperitonealmente, intradérmicamente y una combinación de dos o más de cualquiera de los mismos.
63. La utilización de la reivindicación 56, en la que el daño tisular secundario es el resultado de una lesión o trauma de la médula espinal.
64. La utilización de la reivindicación 55 o de la reivindicación 56, en la que la respuesta inflamatoria está asociada con un estado de enfermedad seleccionado de entre lesiones del SNC, enfermedades inflamatorias del SNC, trastornos neurodegenerativos, enfermedad cardíaca, enfermedades inflamatorias oculares, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedades inflamatorias de las articulaciones, enfermedades inflamatorias del riñón o renales, enfermedades inflamatorias pulmonares, enfermedades inflamatorias nasales, enfermedades inflamatorias del tiroides y cánceres regulados por citoquinas.
65. Un conjugado que contiene un agente vectorizado que comprende un agente citotóxico o un ácido nucleico que codifica un agente citotóxico y un agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas seleccionado de una quimioquina o una porción de la misma y un anticuerpo que se une a un receptor de quimioquinas o una porción del mismo, donde:
el conjugado se une a un receptor de quimioquinas, teniendo como resultado la internalización del agente vectorizado unido en células portadoras del receptor;
en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se une específicamente a receptores de quimioquinas en fagocitos mononucleares (MNP), leucocitos, células destructoras naturales, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B; y
la quimioquina es seleccionada de entre IL-8, GCP-2, GRP-\gamma, ENA-78, PBP, CTAP III, NAP-2, LAPF-4, MIG, IP-10, SDF-1\alpha, SDF-1\beta, SDF-2, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, MIP- 1\alpha, MIP-1\beta, MIP-1\gamma, MIP-2, MIP-2\alpha, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, MIP-5, MDC, HCC-1, eotaxina-1, eotaxina-2, I-309, SCYA17, Tim-1, TARC, RANTES, DC-CK-1, linfotactina, ALP, lungquina y fractalquina.
66. El conjugado de la reivindicación 65, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es una quimioquina seleccionada de entre eotaxina-1, eotaxina-2, MCP-1, MCP-3, SDF-1\alpha, SDF-1\beta, I-309, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-1\gamma, MIP-2, MIP-2\alpha, MIP-3\alpha, MIP-3\beta, MIP-4, MIP-5, RANTES e IL-8.
67. El conjugado de la reivindicación 65, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es ALP o lungquina.
68. El conjugado de la reivindicación 65, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es un anticuerpo o una porción del mismo que se une a un receptor de quimioquinas seleccionado de DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX_{3}CR-1, XCR-1 y CD97.
69. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-68, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se une específicamente a receptores de quimioquinas en leucocitos.
70. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-68, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas se une específicamente a receptores de quimioquinas en células seleccionadas de fagocitos mononucleares (MNP), leucocitos, células destructoras naturales, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B.
71. El conjugado de la reivindicación 69, donde los leucocitos son seleccionados de basófilos, neutrófilos, eosinófilos y combinaciones de dos o más de cualquiera de los mismos.
72. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-71, en el que el agente vectorizado es una toxina o un ácido nucleico.
73. El conjugado de la reivindicación 72, en el que la toxina celular es un agente que corta ADN.
74. El conjugado de la reivindicación 73, en el que el agente que corta ADN es seleccionado de entre antraquinona-oligopirrolcarboxamida, bencimidazol, leinamicina, dinemicina A, enediina, iminoquinonas de endiina, 2,2r-bis (2-aminoetil)-4-4'-bitiazol, conjugados de epiliticina-salen.cobre y análogos o derivados funcionales de los mismos.
75. El conjugado de la reivindicación 72, en el que la toxina es un antimetabolito.
76. El conjugado de la reivindicación 75, en el que el antimetabolito es seleccionado de entre 5-fluorouracilo, metotrexato, melfalán, daunomicina, doxorrubicina, mostazas nitrogenadas, mitomicina C y análogos o derivados funcionales de los mismos.
77. El conjugado de la reivindicación 72, en el que la toxina es seleccionada de entre toxinas bacterianas, vegetales, de insecto, de serpiente y de araña.
78. El conjugado de la reivindicación 77, en el que la toxina es una proteína inactivadora de ribosomas (RIP).
79. El conjugado de la reivindicación 78, en el que la RIP es una RIP de tipo uno o un fragmento de la misma biológicamente funcional.
\newpage
80. El conjugado de la reivindicación 79, en el que la RIP de tipo uno es seleccionada de entre diantina 30, diantina 32, licnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-6, saporina-7, saporina-8 y saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, \alpha-kirilowina, \beta-kirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, MAP-30, \alpha-momorcharina, \beta-momorcharina, tricosantina, TAP-29, tricoquirina, RIP de cebada, tritina, RIP de lino, RIP de maíz, asparina-1 y asparina-2.
81. El conjugado de la reivindicación 78, en el que la RIP es una RIP de tipo dos, la subunidad catalítica de la misma o una subunidad o fragmento de la misma biológicamente funcional.
82. El conjugado de la reivindicación 81, en el que la RIP de tipo dos es seleccionada de entre volkensina, ricina, nigrina-b, CIP-29, abrina, vircumina, modeccina, ebulitina-\alpha, ebulitina-\beta, ebulitina-\gamma y porrectina.
83. El conjugado de la reivindicación 77, en el que la toxina es una toxina bacteriana seleccionada de entre exotoxina de Pseudomonas, toxina de Diphteria, toxina de Shiga, toxinas similares a Shiga, subunidades catalíticas de las mismas y fragmentos de las mismas biológicamente funcionales.
84. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-83, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas y el agente vectorizado están unidos directamente a través de un enlace covalente o iónico.
85. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-83, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas y el agente vectorizado está unidos a través de un adaptador.
86. El conjugado de la reivindicación 85, en el que el adaptador es un polipéptido o un adaptador químico.
87. El conjugado de la reivindicación 85, en el que el adaptador químico es un entrecruzador heterobifuncional susceptible de ser cortado.
88. El conjugado de la reivindicación 87, en el que el adaptador químico es seleccionado de entre N-succinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, sulfosuccinimidil-(4-yodoacetil)-aminobenzoato, 4-succinimidil-oxicarbonil-\alpha-(2-piridilditio)-tolueno, sulfosuccinimidil-6-[\alpha-metil-\alpha-(piridilditio)-toluamido]-hexanoato, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato, succinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-propionamido]-hexanoato, sulfosuccinimidil-6-[3-(2-piridilditio)-
propionamido]-hexanoato, 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazínico, S-(2-tiopiridil)-L-cisteína.
89. El conjugado de la reivindicación 85, en el que el adaptador es un péptido o un aminoácido.
90. El conjugado de la reivindicación 89, en el que péptido contiene entre 1 y 60 aminoácidos.
91. El conjugado de la reivindicación 90, en el que el adaptador es seleccionado de entre péptidos que reducen el impedimento estérico entre el agente vectorizado y el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas, sustratos enzimáticos intracelulares, adaptadores que incrementan la flexibilidad del conjugado, adaptadores que incrementan la solubilidad del conjugado, adaptadores que incrementan la estabilidad en suero del conjugado, adaptadores fotocortables y adaptadores susceptibles de ser cortados por ácido.
92. El conjugado de la reivindicación 55, en el que el receptor de quimioquinas es un miembro de la superfamilia de receptores similares a rodopsina, con siete dominios transmembranales, acoplados a proteína G.
93. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-92, que comprende además una citoquina no quimioquina o una proteína asociada al receptor que se une a receptores en, y/o activa, una o más de las células que estimulan el daño tisular secundario, distintos de receptores de quimioquinas.
94. El conjugado de la reivindicación 93, en el que la proteína asociada al receptor tiene un peso molecular de 38 a 40 kDa aproximadamente y se une a, y modula la actividad de, un miembro de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
95. El conjugado de la reivindicación 94, en el que el receptor de LDL es seleccionado de entre los receptores secuestradores de LDL aciladas 1 y 2, los receptores de LDL, VLDL-1, VLDL-2, glicoproteína 330/megalina, LRP, \alpha-2-macroglobulina y sorLA-1.
96. El conjugado de la reivindicación 93, en el que la citoquina se une a un receptor específico de citoquinas.
97. El conjugado de la reivindicación 93, en el que la citoquina es seleccionada de entre interleuquinas, linfoquinas, monoquinas, factores estimuladores de colonias y proteínas asociadas a receptores.
98. El conjugado de la reivindicación 93, en el que la citoquina es seleccionada de entre EMAP-II, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 e IL-13.
99. El conjugado de la reivindicación 65, en el que el agente vectorizante dirigido a un receptor de quimioquinas es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo específico de un antígeno.
100. El conjugado de la reivindicación 99, en el que el anticuerpo monoclonal es específico para un antígeno seleccionado de entre DARC, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CX_{3}CR-1, XCR-1 y CD97.
101. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-92, que comprende además un anticuerpo que se une a un receptor de citoquinas no quimioquinas y/o a una citoquina no quimioquina.
102. El conjugado de la reivindicación 65, en el que el agente vectorizado es un ácido nucleico.
103. El conjugado de la reivindicación 65, que es seleccionado de entre OPL98104, OPL98112, OPL98108, OPL98102, OPL98110, OPL98106, OPL98101, OPL98109, OPL98105, OPL98103, OPL98111 y OPL98107.
104. Una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 68-73, 75, 77-85, 89-101 y 103, donde el conjugado contiene un agente citotóxico que es un polipéptido.
105. Un plásmido que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 104.
106. Una célula huésped que contiene el plásmido de la reivindicación 105.
107. Un método para producir un conjugado, que comprende:
el cultivo de la célula de la reivindicación 106 bajo condiciones mediante las cuales se exprese una proteína de fusión que contenga el conjugado; y
el aislamiento de la proteína de fusión.
108. El ácido nucleico de la reivindicación 104, que es ADN.
109. Una composición farmacéutica que contiene una concentración o cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 65-103 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
110. Utilización de una composición farmacéutica de la reivindicación 109 en la preparación de un medicamento para tratar el daño tisular secundario y estados de enfermedad asociados, en la que la composición inhibe la proliferación, migración o actividad fisiológica de las células inflamatorias que estimulan el daño tisular secundario.
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Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
EP1098664B1 (en) * 1998-07-22 2003-08-06 Osprey Pharmaceuticals Limited Conjugates for treating inflammatory disorders and associated tissue damage
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US20040071736A1 (en) 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
IL145335A0 (en) * 1999-03-11 2002-06-30 Micromet Ag Antibody and chemokine constructs and their use in the treatment of autoimmune diseases
US6723538B2 (en) 1999-03-11 2004-04-20 Micromet Ag Bispecific antibody and chemokine receptor constructs
US6358697B2 (en) * 1999-04-21 2002-03-19 Children's Hospital Medical Center Intracellular pharmaceutical targeting
AU783994B2 (en) * 1999-08-19 2006-01-12 Curagen Corporation Novel hematopoietic regulatory factors and methods of use thereof
US20080038274A1 (en) 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
DE10033219A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-24 Univ Heidelberg Neuroprotektive Wirkung von Granulocyten-Colony Stimmulierendem Faktor (G-CSF)
MXPA03000310A (es) * 2000-07-12 2004-12-13 Gryphon Therapeutics Inc Quimiocinas sinteticas bioactivas, modificadas con polimeros y metodos para su elaboracion y uso.
PL366062A1 (en) * 2000-09-08 2005-01-24 Micromet Ag Antibody and/or chemokine constructs and their use in immunological disorders
WO2002036806A2 (en) * 2000-11-01 2002-05-10 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression vectors able to elicit improved immune response and methods of using same
DE60234057D1 (de) 2001-07-25 2009-11-26 Raptor Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur modulation des transports durch die blut-hirn-schranke
WO2003047632A1 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Chimeric molecule for the treatment of th2-like cytokine mediated disorders
JP2005525089A (ja) * 2001-12-17 2005-08-25 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ ケモカイン・アンタゴニストとして作用するケモカイン突然変異体
US6846484B2 (en) * 2001-12-28 2005-01-25 Regents Of The University Of Minnesota DTAT fusion toxin
AU2003219730A1 (en) * 2002-02-07 2003-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Anti-pathogen treatements
US7785601B2 (en) 2002-12-31 2010-08-31 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US7695723B2 (en) 2002-12-31 2010-04-13 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
JP5624256B2 (ja) * 2003-06-20 2014-11-12 ラプター・ファーマシューティカル・インコーポレイテッド 脳および他の組織への治療化合物の送達
US7351423B2 (en) 2004-09-01 2008-04-01 Depuy Spine, Inc. Musculo-skeletal implant having a bioactive gradient
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
TW200714610A (en) 2005-02-16 2007-04-16 Univ Maryland CXCR3 is a gliadin receptor
CN101189339A (zh) * 2005-03-22 2008-05-28 美得思达健康有限公司 诊断和治疗心血管疾病的递送系统和方法
EP1926747A1 (en) 2005-08-12 2008-06-04 Schering Corporation Mcp1 fusions
EP1937311A2 (en) 2005-09-30 2008-07-02 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Methods and compositions for modulating immune tolerance
CA2656992A1 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Inagen Aps Immunotoxins for the treatment of diseases related to cmv infection
MX2009001204A (es) 2006-08-17 2009-02-11 Hoffmann La Roche Conjugado de un anticuerpo cointra ccr5 y un peptido antifusogenico.
TW200817438A (en) 2006-08-17 2008-04-16 Hoffmann La Roche A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide
EP2097529A4 (en) * 2006-12-29 2010-03-24 Osprey Pharmaceuticals Usa Inc METHOD FOR SELECTION AND PRODUCTION OF MODIFIED TOXINS, MODIFIED TOXINE CONJUGATES AND USES THEREOF
EP2062592A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-27 BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND letztvertreten durch das Robert Koch-Institut vertreten durch seinen Präsidenten System for delivery into a XCR1 positive cell and uses thereof
BRPI0915142A8 (pt) 2008-06-12 2018-01-02 Syntaxin Ltd Polipeptídeos, ácido nucleico e usos dos mesmos
JP5728380B2 (ja) 2008-06-12 2015-06-03 シンタクシン リミテッドＳｙｎｔａｘｉｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 神経内分泌疾患の抑制
US8524656B2 (en) 2008-07-08 2013-09-03 Jacques Galipeau GM-CSF and truncated CCL2 conjugates and methods and uses thereof
GB0820970D0 (en) 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
EP2280063A1 (en) * 2009-07-28 2011-02-02 Consiglio Nazionale delle Ricerche Pichia pastoris as a host for the production of the ribosome-inactivating protein (RIP) saporin and saporin fusion chimaeras
US8524217B2 (en) 2010-05-11 2013-09-03 Merck Sharp & Dohme Corp. MCP1-Ig fusion variants
TWI487713B (zh) * 2011-12-06 2015-06-11 Nat Univ Chung Hsing 趨化素－細胞素融合蛋白和其應用
WO2013126587A1 (en) 2012-02-21 2013-08-29 Cytonics Corporation Systems, compositions, and methods for transplantation
JP6472784B2 (ja) 2013-03-12 2019-02-20 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. 細胞内在化を誘導するためのｃｄ２０結合免疫毒素及びそれを用いる方法
GB201312317D0 (en) 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US20160340394A1 (en) 2014-01-27 2016-11-24 Molecular Templates, Inc. De-immunized shiga toxin a subunit effector polypeptides for applications in mammals
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
CN113831416A (zh) 2014-06-11 2021-12-24 分子模板公司 耐受蛋白酶切割的志贺毒素a亚基效应子多肽和包含其的细胞靶向分子
JP6601922B2 (ja) 2015-01-09 2019-11-06 イプセン バイオイノベーション リミテッド 陽イオン性神経毒
CN108064247B (zh) 2015-02-05 2022-06-03 分子模板公司 包含志贺毒素a亚基效应物区域的多价cd20结合分子及其富集组合物
LT3303373T (lt) 2015-05-30 2020-07-10 Molecular Templates, Inc. Deimunizuoto shiga toksino a subvieneto karkasai ir juos apimančios ląstelės taikinio molekulės
CN105018500A (zh) * 2015-07-01 2015-11-04 中国人民解放军第二军医大学 密码子优化的天花粉蛋白基因在基因治疗中的应用
GB201517450D0 (en) 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
EP3263710A1 (en) 2016-07-01 2018-01-03 Ipsen Biopharm Limited Production of activated clostridial neurotoxins
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
WO2018106895A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
JP7082424B2 (ja) 2017-01-25 2022-06-08 モレキュラー テンプレーツ，インク． 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニットエフェクター及びｃｄ８＋ｔ細胞エピトープを含む細胞標的化分子
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
KR102095284B1 (ko) * 2017-05-11 2020-04-01 (주)케어젠 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체
EP3573652A1 (en) 2018-04-17 2019-12-04 Molecular Templates, Inc. Her2-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds
AU2019301697A1 (en) * 2018-07-13 2021-01-07 Il-2Rx, Inc. Compounds, compositions, methods, and uses for treating cancer and immunological disorders
GB201815817D0 (en) 2018-09-28 2018-11-14 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising and exogenous activation loop
GB201900621D0 (en) 2019-01-16 2019-03-06 Ipsen Biopharm Ltd Labelled polypeptides
JP7382032B2 (ja) 2019-07-02 2023-11-16 アジュ ユニバーシティー インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション ヘビ毒を含む関節リウマチの予防または治療用組成物
GB201914034D0 (en) 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
JP2023504659A (ja) 2019-12-03 2023-02-06 ニューボーゲン，インコーポレイティド 腫瘍細胞ワクチン
GB202100566D0 (en) 2021-01-15 2021-03-03 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of brain damage
GB202104294D0 (en) 2021-03-26 2021-05-12 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop
AU2021438810A1 (en) 2021-03-30 2023-09-21 Ipsen Biopharm Limited Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders
BR112023020057A2 (pt) 2021-03-30 2024-03-12 Ipsen Biopharm Ltd Tratamento de dor e distúrbios inflamatórios
GB202116795D0 (en) 2021-11-22 2022-01-05 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of visceral pain
GB202214232D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site
GB202214229D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site
CN116076438B (zh) * 2023-03-21 2024-01-30 湖南中医药大学 类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型及其构建方法和应用
CN117045683B (zh) * 2023-10-12 2023-12-26 北京国卫生物科技有限公司 应用神经干细胞修复脊髓损伤的细胞治疗方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5084556A (en) * 1987-10-23 1992-01-28 Genetics Institute, Inc. Composition of M-CSF conjugated to cytotoxic agents and a method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US5541297A (en) * 1988-04-01 1996-07-30 Immunomedics, Inc. Therapeutic conjugates of toxins and drugs
US5152980A (en) * 1988-05-19 1992-10-06 The Beth Israel Hospital Association Induction of tolerance to a foreign antigen IL-2 receptor-binding substances
US5191067A (en) * 1989-04-27 1993-03-02 The Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor conjugates
US5169934A (en) * 1990-05-14 1992-12-08 Anergen, Inc. Intracellularly cleavable compounds
US5326559A (en) * 1991-05-16 1994-07-05 Miller D Douglas Treatment of accelerated atheosclerosis with interleukin-2 receptor targeted molecules
WO1993025228A1 (en) * 1992-06-15 1993-12-23 Whittier Institute For Diabetes And Endocrinology Cytotoxins specific for gm-csf receptor-bearing cells
US5346686A (en) * 1992-10-05 1994-09-13 Mallinckrodt Medical, Inc. Labelled interleukin-8 and medical uses thereof
US5413778A (en) * 1992-10-05 1995-05-09 The Regents Of The University Of Michigan Labelled monocyte chemoattractant protein material and medical uses thereof
WO1995012414A1 (en) * 1993-11-05 1995-05-11 Repligen Corporation Novel modified pf4 compositions and methods of use
US6100387A (en) * 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
EP1098664B1 (en) * 1998-07-22 2003-08-06 Osprey Pharmaceuticals Limited Conjugates for treating inflammatory disorders and associated tissue damage

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002521019A (ja) 2002-07-16
JP2010075194A (ja) 2010-04-08
EP1098664B1 (en) 2003-08-06
ES2275999T3 (es) 2007-06-16
IL140893A (en) 2010-06-16
CA2335105A1 (en) 2000-02-03
EP1346731A1 (en) 2003-09-24
DK1098664T3 (da) 2003-11-17
IL140893A0 (en) 2002-02-10
DK1346731T3 (da) 2007-04-10
DE69934337D1 (de) 2007-01-18
WO2000004926A3 (en) 2000-11-02
EP1098664A2 (en) 2001-05-16
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WO2000004926A2 (en) 2000-02-03
IL187388A (en) 2010-06-30
DE69910216T2 (de) 2004-02-19
DE69934337T2 (de) 2007-05-24
ATE347378T1 (de) 2006-12-15
ATE246517T1 (de) 2003-08-15
IL187388A0 (en) 2008-02-09
CA2335105C (en) 2010-05-11
IL187389A (en) 2010-06-30
IL187389A0 (en) 2008-02-09
EP1346731B1 (en) 2006-12-06
HK1037133A1 (en) 2002-02-01
DE69910216D1 (de) 2003-09-11
JP4454152B2 (ja) 2010-04-21

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