KR20090037944A - Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트 - Google Patents

Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트 Download PDF

Info

Publication number
KR20090037944A
KR20090037944A KR1020097003147A KR20097003147A KR20090037944A KR 20090037944 A KR20090037944 A KR 20090037944A KR 1020097003147 A KR1020097003147 A KR 1020097003147A KR 20097003147 A KR20097003147 A KR 20097003147A KR 20090037944 A KR20090037944 A KR 20090037944A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
seq
gly
leu
val
Prior art date
Application number
KR1020097003147A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101105610B1 (ko
Inventor
미하엘 브란트
슈테판 피셔
에르하르트 코페츠키
수르야나라야나 산쿠라트리
랄프 슈마허
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20090037944A publication Critical patent/KR20090037944A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101105610B1 publication Critical patent/KR101105610B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체를 포함하는 컨쥬게이트, 및 상기 컨쥬게이트의 약학적 용도에 관한 것으로서, 상기 컨쥬게이트는 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드가 각각 HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 하나의 말단에 공액되어 있는 것을 특징으로 한다.
컨쥬게이트

Description

ＣＣＲ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트 {A CONJUGATE OF AN ANTIBODY AGAINST CCR5 AND AN ANTIFUSOGENIC PEPTIDE}
본 발명은 CCR5 에 대한 항체 및 항푸소제닉 (antifusogenic) 펩타이드의 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 여기서, 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 항-CCR5 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액되어 있다. 항푸소제닉 펩타이드는 아미노산 수준이 상이, 유사 또는 동일할 수 있다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 에 의한 세포 감염은 감염된 세포의 막과 바이러스 막이 융합되는 과정에 의해 수행된다. 이러한 과정에 대한 일반적인 도식이 제안되는데 : 바이러스 외피 당단백질 복합체 (gp120/gp41) 는 감염된 세포의 막 상에 위치한 세포 표면 수용체와 상호작용한다. gp120 이 예를 들어, CCR-5 또는 CXCR-4 와 같은 공동-수용체와 함께 CD4 수용체에 결합하면 gp120/gp41 복합체의 구조 변화가 생긴다. 이러한 구조 변화 결과, gp41 단백질은 표적 세포의 막 내에 삽입될 수 있다. 이러한 삽입은 막 융합 과정의 개시이다. 자연 발생 다형성 때문에 gp41 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HIV 균주에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 그러나, 동일한 도메인 양식, 더욱 정확하게는 융합 신호, 2 개의 헵타드 반복 도메인 (HR1, HR2) 및 막관통 도메인 (N-말단에서 C-말 단 방향으로) 이 인지될 수 있다. 융합 (또는 푸소제닉) 도메인이 세포막으로의 삽입 및 이의 붕괴에 참여하는 것으로 제안된다. HR 영역은 7 개의 아미노산 ("헵타드") 을 포함하는 다중 스트레치로 이루어진다 (예를 들어, [Shu, W., 등, Biochemistry 38 (1999) 5378-5385] 참조). 헵타드 외에도, 하나 이상의 루신 지퍼-형 모티프가 존재한다. 상기 조성물은 gp41 단백질 및 뿐만 아니라 상기 도메인으로부터 유래된 펩타이드의 감긴 코일 구조를 형성한다. 감긴 코일은 일반적으로 2 개 이상의 상호작용하는 나선으로 이루어진 올리고머이다. gp41 의 HR1 또는 HR2 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 펩타이드는 HIV 의, 세포 내로의 획득에 대한 효과적인 시험관 내 및 생체 내 억제제이다 (예를 들어, 펩타이드는 예를 들어, US 5,464,933, US 5,656,480, US 6,258,782, US 6,348,568, 또는 US 6,656,906 참조). 예를 들어, T20 (DP178, Fuzeon®, HR2 펩타이드라고도 알려져 있음), T651 (US 6,479,055), 및 T2635 (WO 2004/029074) 는 HIV 감염의 매우 강력한 억제제이다. 예를 들어, 아미노산 치환 또는 화학적 가교를 이용해 HR2 유도 펩타이드의 효능을 증진시키는 시도가 있었다 (Sia, S.K., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 14664-14669; Otaka, A., 등, Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940).
펩타이드가 특정 분자에 공액하면 그의 약물동력학적 특성이 변할 수 있는데, 예를 들어, 상기 펩타이드 컨쥬게이트의 혈청 반감기가 증가할 수 있다. 공액은 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 인터루킨-6 (EP 0 442 724), PEG 및 에리트로포이에틴 (WO 01/02017), 엔도스타틴 및 면역글로불린 (US 2005/008649) 을 포함하는 키메라성 분자, 분비된 항체 기재 융합 단백질 (US 2002/147311), 알부민을 포함하는 융합 폴리펩타이드 (US 2005/0100991; 인간 혈청 알부민 US 5,876,969), PEG화된 폴리펩타이드 (US 2005/0114037), 및 인터페론 융합에 대해 보고되어 있다. 또한, 당업계에서 겔로닌 및 항체를 포함하는 면역독소 (WO 94/26910), 개질된 트랜스페린-항체 융합 단백질 (US 2003/0226155), 항체-사이토카인 융합 단백질 (US 2003/0049227), 및 면역-자극성, 막 수송, 또는 동종친화성 활성이 있는 펩타이드 및 항체로 이루어진 융합 단백질 (US 2003/0103984) 이 기술되어 있다. WO 2004/085505 에서, 거대분자에 화학적으로 연결된 생물학적 활성 화합물로 이루어진 장기간 작용하는 생물학적 활성 컨쥬게이트가 보고되어 있다.
공동-수용체 CCR5 는 대부분의 HIV-1 1 차 단리물에 의해 사용되고, 감염의 확립 및 유지에 중요하다. 또한, CCR5 기능은 인간 건강에 있어서 없어도 되는 것이다. 돌연변이 CCR5 대립유전자인 "CCR5 Δ 32" 는 절단된, 비-기능성 단백질을 암호화한다 (Samson, M., 등, Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M., 등, Science 273 (1996) 1856-1862). 돌연변이에 대해 동형접합성인 개체는 CCR5 발현이 결여되어 있고, HIV-1 감염으로부터 강하게 보호된다. 이들은 명백한 표현형 결과를 나타내지 않고 M-향성 (M-tropic) HIV 감염에 대해 고도로 내성이며, 반면 이형접합성 개체는 지연된 질환 진행을 나타낸다 (Schwarz, M.K. 및 Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347- 358). CCR5 의 결여는 뚜렷한 부작용이 없는데, 이는 아마도 CCR5 가 α-케모카인 MIP-1a, MIP-1β, 및 RANTES 에 대한 수용체로서 고도로 과다한 케모카인 네트워크의 일부이고, 많은 중복되는 기능을 공유하고, 이의 대부분이 대체 수용체를 가지고 있기 때문이다 (Rossi, D. 및 Zlotnik, A., Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242). HIV-1 공동 수용체로서 CCR5 를 규명한 것은 R5X4 또는 X4 단리물을 제외하고 R5 에 의한 감염을 차단하는 그의 리간드인 MIP-1α, MIP-1β, 및 RANTES 의 능력을 바탕으로 한 것이었다 (Cocchi, F., 등, Science 270 (1995) 1811-1815). CCR5 는 또한 염증 반응 동안에 우선적으로 생성되고 중성구 (CXC 케모카인), 대식세포 및 T 세포의 하위군 (조력자 T 세포인 Th1 및 Th2 세포) 의 보충을 조절하는 "클러스터" 케모카인의 수용체이다. Th1 반응은 전형적으로 바이러스 및 종양에 대해 효과적인 세포-매개 면역성, 세포내 기생충 살해를 맡고 있는 전염증 반응, 영속적인 자가면역 반응을 포함하는 반응이며, 예를 들어, 한편 Th2 반응은 알레르기에 중요한 것으로 생각된다. 따라서, 이들 케모카인 수용체의 억제제는 면역조절제로서 유용한 것으로 생각된다. Th1 반응에 있어서는, 예를 들어, 류마티스 관절염을 포함한 자가면역성에서 과활성 반응이 꺾여지거나 (dampened), 또는 Th2 반응에 있어서는, 천식 공격, 또는 아토피성 피부염을 포함한 알레르기 반응이 감소된다 (예를 들어, Schols, D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller, A., 및 Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38; Kazmierski, W.M., 등, Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, T., Trends Immunol. 23 (2002) 347-351).
인간 CCR5 에 대한 항체는 예를 들어, PRO 140 (Olson, W.C., 등, J. Virol. 73 (1999) 4145-4155), 및/또는 2D7 (Samson, M., 등, J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941) 이다. 추가의 항체는 US 2004/0043033, US 6,610,834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6,528,625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241, EP 1 322 332, EP 1 263 791, EP 1 207 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308, 및 EP 05007138.0 에 요약되어 있다.
CCR5 에 대한 항체의 폴리에틸렌 글리콜 컨쥬게이트는 US 2003/0228306 에서 알려져 있다. US 2003/0215421 은 케모카인-독소 컨쥬게이트에 관한 것이다.
WO 01/43779 는 항-CD4 항체 및 항-CCR5 항체의 컨쥬게이트, 및 항-CD4 항체 및 HIV-1 융합 억제 펩타이드의 컨쥬게이트에 관한 것이다. CCR5 항체 및 독소의 컨쥬게이트는 EP 1 346 731 에 기술된다.
발명의 개요
본 발명은 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드 및 HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것으로서, 각각의 컨쥬게이트의 1 내지 8 개의, 바람직하게는 2 또는 4 개의 항푸소제닉 펩타이드는 HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액하는 것을 특징으로 한다 (항체 당 8 개라는 항푸소제닉 펩타이드의 수는 단지 상기 항체가 8 개의 말단을 포함하는 경우, 즉, 예를 들어, 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 경우에 가능한 것이고 ; 만약 항체가 더 적은 수의 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경우, 예를 들어, scFv 로서 그러한 경우, 컨쥬게이트에서 최대로 가능한 항푸소제닉 펩타이드의 상응하는 수도 감소되는데, 즉, 8 개 미만으로 감소됨).
본 발명은 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CCR5 항체 (mAb CCR5) 를 포함하는 컨쥬게이트를 추가로 포함하는데, 최대 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 상기 항-CCR5 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액되는 것을 특징으로 한다 (mAb CCR5 당 8 개의 항푸소제닉 펩타이드 수는 단지 즉, 예를 들어, mAb CCR5 가 8 개의 말단을 포함하는 경우, 즉, 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 경우에 가능한 것이고 ; 만약 mAb CCR5 가 더 적은 수의 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경우, 예를 들어, scFv 로서 그러한 경우, 컨쥬게이트에서 최대로 가능한 항푸소제닉 펩타이드의 상응하는 수도 감소되는데, 즉, 8 개 미만으로 감소된다).
바람직하게는 항-CCR5 항체 사슬의 카르복시-말단 아미노산은 바람직하게는 중간체 링커 (linker) 가 있으면서 또는 없이 펩타이드 결합에 의해, 항푸소제닉 펩타이드의 아미노-말단 아미노산에 공액되거나, 또는 항푸소제닉 펩타이드의 카르복시-말단 아미노산은 항체 사슬의 아미노-말단 아미노산에 공액된다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 하기 식을 특징으로 한다 :
mAb CCR5 - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]n
[식 중, m 은 각각의 항푸소제닉 펩타이드에 대해 독립적으로 0 (즉, mAb CCR5 및 항푸소제닉 펩타이드 간에 펩타이드 결합) 또는 1 (즉, mAb CCR5 및 항푸소제닉 펩타이드 간의 링커가 1 개) 이고, n 은 1 내지 8 의 정수임].
mAb CCR5 의 중쇄 및/또는 경쇄 및 항푸소제닉 펩타이드의 바람직한 컨쥬게이트 ("사슬 컨쥬게이트") 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다 :
(1) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄]
(2) [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(3) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [항푸소제닉 펩타이드]
(4) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄]
(5) [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(6) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [항푸소제닉 펩타이드]
(7) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(8) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(식 중, 링커는 상기 사슬 컨쥬게이트에서 (내에서 또는 사이에서) 동일 또는 상이할 수 있고, m 은 1 또는 0 의 정수이고, m 은 상기 사슬 컨쥬게이트에서 (내에서 또는 사이에서) 독립적으로 동일 또는 상이할 수 있음).
(펩타이드 또는 mAb CCR5 사슬의 좌측은 N-말단을 의미하고, 우측은 C-말단을 의미한다. 따라서, (1) 에서, 항푸소제닉 펩타이드의 C-말단은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 mAb CCR5 의 중쇄의 N-말단에 연결된다).
바람직하게는 사슬 컨쥬게이트는 mAb CCR5 (예를 들어, 불변 Fc 도메인, scFv 절편, 또는 Fab 절편을 포함하여 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄로 이루어짐) 를 포함하는 본 발명에 따른 컨쥬게이트에 어셈블리된다.
특히 바람직한 사슬 컨쥬게이트는 (2), (3), (4), 및 (7) 이다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 컨쥬게이트는 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x (2), 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x (3), 또는 2 x [mAb CCR5 중쇄] 및 2 x (4), 또는 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x (7) 을 포함한다. 중쇄 및/또는 경쇄는 바람직하게는 불변 영역 (Fc) 을 포함한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄 CDR3 서열 SEQ ID NO: 16, 17 로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 골격 및 CDR3 영역으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 면역글로불린 골격, 및 SEQ ID NO: 16, 17 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 영역, SEQ ID NO: 13, 14, 15 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 CDR1 서열 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 영역으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 및 7 을 포함하는 중쇄 가변 도메인의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 면역글로불린 골격, 및 SEQ ID NO:18, 19, 20 으로부터 선택되는 CDR1 영역, SEQ ID NO:21, 22, 23 으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:24, 25 로부터 선택되는 CDR3 영역으로 이루어진 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 1 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 2 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 3 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 4 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 5 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 6 의 CDR, 또는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 7 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 8 의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 하기 군으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다 :
a) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 에 의해 정의된 중쇄 (VH) 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 에 의해 정의된 경쇄 (VL) 가변 도메인 ;
b) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 4 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
c) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 6 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
d) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 8 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인.
바람직하게는 컨쥬게이트는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 정의된 중쇄 (VH) 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:2 에 의해 정의된 경쇄 (VL) 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:4 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:6 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:7 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:8 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 아미노산 글리신 (G) 및 아스파라긴 (N), 트리펩타이드 GST, 및 SEQ ID NO:36 ~ 62 및 SEQ ID NO:67 ~ 70 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 ; 및 SEQ ID NO:29 내지 35 및 SEQ ID NO: 73 에 의해 정의된 펩타이드의 군으로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 C34, T20, T1249, T651, T2635, N36, DP107, 및 afp-1 을 포함하는 펩타이드의 군으로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄의 각각의 C-말단 또는 경쇄의 각각의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드 (2 개의 항푸소제닉 펩타이드) 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄의 각각의 C-말단 및 경쇄의 각각의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드 (4 개의 항푸소제닉 펩타이드) 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 SEQ ID NO:2 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:1 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:4 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:3 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:6 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:5 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:8 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:7 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 상기 항-CCR5 항체가 IgG1 하위부류인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 항-CCR5 항체가 IgG4 하위부류, 또는 IgG1 또는 IgG2 하위부류인 것이 바람직하며, 아미노산 위치 S228, L234, L235, 및/또는 D265 에서 돌연변이가 있고/거나, 또는 PVA236 돌연변이를 함유한다. 바람직하게는 컨쥬게이트는 상기 IgG4 하위부류의 항-CCR5 항체가 S228P 돌연변이를 가지고, 상기 IgG1 하위부류의 항-CCR5 항체가 L234A 및 L235A 돌연변이를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로, 2 개 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CD4 항체 (mAb CD4) 를 포함하는 컨쥬게이트를 포함하며, 이는 2 내지 8 개, 바람직하게는 2 또는 4 개의 항푸소제닉 펩타이드가 각각 상기 항-CD4 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액되어 있는 것을 특징으로 한다 (mAb CD4 당 8 개의 항푸소제닉 펩타이드라는 수는 단지, mAb CD4 가 8 개의 말단을 포함하는 경우에만, 즉, 예를 들어, 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 경우에만 가능하고 ; mAb CD4 가 더 적은 수의 C- 및 N-말단을 포함한다면, 예를 들어, scFv 로서 있는 경우, 컨쥬게이트 내 상응하는 항푸소제닉 펩타이드의 최대 수는 감소되는데, 즉, 8 개 미만으로 감소됨).
바람직하게는, 중간체 링커와 함께 또는 없이 바람직하게는 펩타이드 결합에 의해, 항체 사슬의 카르복시-말단 아미노산은 항푸소제닉 펩타이드의 아미노-말단 아미노산에 공액되거나, 또는 항푸소제닉 펩타이드의 카르복시-말단 아미노산은 항체 사슬의 아미노-말단 아미노산에 공액된다.
바람직하게는, 컨쥬게이트는 하기 식을 특징으로 한다 :
항체 - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]n
[식 중, m 은 독립적으로 각각의 항푸소제닉 펩타이드에 대해 0 (즉, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드 사이의 펩타이드 결합) 또는 1 (즉, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드 사이의 하나의 링커) 이고, n 은 2 내지 8 의 정수, 바람직하게는 심지어는 2 내지 8, 더욱 바람직하게는 2 또는 4 의 정수임]. 바람직하게는 상기 항체는 mAb CD4 이다.
항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 중쇄 및/또는 경쇄의 바람직한 컨쥬게이트 ("사슬 컨쥬게이트") 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다 (N-말단에서 C-말단 방향으로) :
(1) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄]
(2) [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(3) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [항푸소제닉 펩타이드]
(4) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄]
(5) [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(6) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [항푸소제닉 펩타이드]
(7) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
(8) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
[식 중, 링커는 상기 사슬 컨쥬게이트에서 (내에서 또는 사이에서) 동일 또는 상이할 수 있고, m 은 1 또는 0 의 정수이고, m 은 상기 사슬 컨쥬게이트에서 (내에서 또는 사이에서) 독립적으로 동일 또는 상이할 수 있음].
(펩타이드 또는 항체 사슬의 좌측은 N-말단을 의미하고, 우측은 C-말단을 의미한다. 따라서, (1) 에서, 항푸소제닉 펩타이드의 C-말단은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 항체의 중쇄의 N-말단에 연결된다).
바람직하게는, 사슬 컨쥬게이트는 mAb CD4 를 포함하는 (예를 들어, 불변 Fc 도메인, scFv 절편, 또는 Fab 절편을 포함하여 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄로 이루어진) 본 발명에 따른 컨쥬게이트에 어셈블리된다.
특히 바람직한 사슬 컨쥬게이트는 (2), (3), (4), 및 (7) 이다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 컨쥬게이트는 2 x [mAb CD4 경쇄] 및 2 x (2), 2 x [mAb CD4 경쇄] 및 2 x (3), 또는 2 x [mAb CD4 중쇄] 및 2 x (4), 또는 2 x [mAb CD4 경쇄] 및 2 x (7) 을 포함한다. 중쇄 및/또는 경쇄는 바람직하게는 불변 영역을 포함한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 SEQ ID NO: 103, 104, 또는 105 의 중쇄 CDR3 서열로부터 선택되는 CDR3 영역 및 면역글로불린 골격으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 면역글로불린 골격, 및 SEQ ID NO:103, 104, 또는 105 의 CDR3 서열로부터 선택되는 CDR3 영역, SEQ ID NO:100, 101, 또는 102 의 CDR2 서열로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:97, 98, 또는 99 의 CDR1 서열로부터 선택되는 CDR1 영역으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:82, 또는 83 을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 면역글로불린 골격, 및 SEQ ID NO:87, 88, 89, 또는 90 으로부터 선택되는 CDR1 영역, SEQ ID NO:91, 92, 또는 93 으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:94, 95, 또는 96 으로부터 선택되는 CDR3 영역으로 이루어진 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:81 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:75 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:82 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:76 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:84 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:78 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:85 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:79 의 CDR, 또는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:86 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO:80 의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 하기로부터 독립적으로 선택되는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다 :
a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:81 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:75 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:82 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:76 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:84 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:78 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
d) 아미노산 서열 SEQ ID NO:85 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:79 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
e) 아미노산 서열 SEQ ID NO:86 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:80 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인.
바람직하게는 컨쥬게이트는 아미노산 서열 SEQ ID NO:81 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:75 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:82 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:76 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:84 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:78 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 아미노산 서열 SEQ ID NO:85 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:79 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인, 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:86 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인, 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:80 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 아미노산 글리신 (G) 및 아스파라긴 (N), 트리펩타이드 GST, 및 SEQ ID NO:36 내지 62 및 SEQ ID NO:67 내지 70 으로부터 선택되는 링커 ; 및 SEQ ID NO:29 내지 35 또는 SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 항푸소제닉 펩타이드 C34, T20, T1249, T651, T2635, N36, DP107, 또는 afp-1 로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄의 각각의 C-말단에서 또는 경쇄의 각각의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드 (2 개의 항푸소제닉 펩타이드) 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄의 각각의 C-말단에서 및 경쇄의 각각의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드 (4 개의 항푸소제닉 펩타이드) 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 컨쥬게이트는 중쇄의 2 개의 C-말단에서 및 경쇄의 2 개의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드 (4 개의 항푸소제닉 펩타이드) 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 SEQ ID NO:75 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:81 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:69 의 링커, 및 SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:76 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:82 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:69 의 링커, 및 SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:78 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:84 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:69 의 링커, 및 SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:79 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:85 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:69 의 링커, 및 SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:80 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:86 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:69 의 링커, 및 SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 컨쥬게이트는 상기 항체가 IgG1 하위부류 또는 IgG4 하위부류인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 항체는 아미노산 위치 S228, L234, L235, 및/또는 D265 에 돌연변이가 있는 IgG4 의 것 또는 IgG1 또는 IgG2 하위부류인 것이 바람직하고/거나, 또는 PVA236 돌연변이를 함유한다. 바람직하게는 컨쥬게이트는 상기 IgG4 하위부류의 항체가 S228P 돌연변이를 갖고, 상기 IgG1 하위부류의 항체가 L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 항체는 항-CD4 항체 또는 항-CCR5 항체인 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 제조 방법을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다 :
a) 컨쥬게이트의 발현에 적합한 조건 하에, 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 하나 이상의 플라스미드를 함유하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 상청액으로부터 컨쥬게이트를 회수하는 단계.
한 구현예에서, 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 상에 위치한 연결된 항푸소제닉 펩타이드가 있거나 또는 없는 mAb CCR5 또는 mAb CD4 의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자가 있다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 함유하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 바이러스 감염 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 용도를 포함한다. 바람직하게는 상기 용도는 바이러스 감염이 HIV 감염인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 항바이러스 치료, 바람직하게는 항 HIV 치료가 필요한 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 용도를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 한 측면은 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CCR5 항체 (mAb CCR5) 를 포함하는 컨쥬게이트로서, 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 상기 항-CCR5 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액하는 것을 특징으로 한다. mAb CCR5 당 8 개라는 항푸소제닉 펩타이드의 수는 단지 mAb CCR5 가 8 개의 말단을 포함하는 경우, 즉, 예를 들어, 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 경우에 가능한 것이다. 만약 mAb CCR5 가 더 적은 수의 C-말단 및 N-말단을 포함하는 경우, 예를 들어, scFv 로서 있는 경우, 컨쥬게이트에서 최대로 가능한 항푸소제닉 펩타이드의 상응하는 수도 감소되는데, 즉, 8 개 미만으로 감소된다. 본 발명의 또다른 측면은 2 개 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CD4 항체 (mAb CD4) 를 포함하는 컨쥬게이트로서, 2 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 상기 항-CD4 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액된 것을 특징으로 한다.
일반적인 항체 또는 mAb CCR5 또는 mAb CD4 에 관해 하기 참조가 되어 있는 경우, 적절하다면 다른 mAb 및 상응하는 서열에 대해서 동일한 참조가 포함되기도 한다.
"항푸소제닉 펩타이드" 는 막 융합 관련 사건 또는 막 융합 사건 자체를 억제시키는 펩타이드로서, 다른 것들 중에서도, 막 융합으로 인한 바이러스에 의한 비감염 세포의 감염을 억제시키는 펩타이드이다. 이들 항푸소제닉 펩타이드는 바람직하게는 선형 펩타이드이다. 예를 들어, 이들은 DP107, DP178 과 같은 gp41 엑토도메인으로부터 유도될 수 있다. 상기 펩타이드의 예는 US 5,464,933, US 5,656,480, US 6,013,263, US 6,017,536, US 6,020,459, US 6,093,794, US 6,060,065, US 6,258,782, US 6,348,568, US 6,479,055, US 6,656,906, WO 1996/19495, WO 1996/40191, WO 1999/59615, WO 2000/69902, 및 WO 2005/067960 에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 US 5,464,933 의 SEQ ID NO: 1 내지 10 ; US 5,656,480 의 SEQ ID NO: 1 내지 15 ; US 6,013,263 의 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 16 내지 83 ; US 6,017,536 의 SEQ ID NO: 1 내지 10, 20 내지 83 및 139 내지 149 ; US 6,093,794 의 SEQ ID NO: 1 내지 10, 17 내지 83 및 210 내지 214 ; US 6,060,065 의 SEQ ID NO: 1 내지 10, 16 내지 83 및 210 내지 211 ; US 6,258,782 의 SEQ ID NO: 1286 및 1310 ; US 6,348,568 의 SEQ ID NO: 1129, 1278-1309, 1311 및 1433 ; US 6,479,055 의 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 210 내지 238 ; US 6,656,906 의 SEQ ID NO: 1 내지 171, 173 내지 216, 218 내지 219, 222 내지 228, 231, 233 내지 366, 372 내지 398, 400 내지 456, 458 내지 498, 500 내지 570, 572 내지 620, 622 내지 651, 653 내지 736, 739 내지 785, 787 내지 811, 813 내지 823, 825, 827 내지 863, 865 내지 875, 877 내지 883, 885, 887 내지 890, 892 내지 981, 986 내지 999, 1001 내지 1003, 1006 내지 1018, 1022 내지 1024, 1026 내지 1028, 1030 내지 1032, 1037 내지 1076, 1078 내지 1079, 1082 내지 1117, 1120 내지 1176, 1179 내지 1213, 1218 내지 1223, 1227 내지 1237, 1244 내지 1245, 1256 내지 1268, 1271 내지 1275, 1277, 1345 내지 1348, 1350 내지 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374 내지 1376, 1378 내지 1379, 1381 내지 1385, 1412 내지 1417, 1421 내지 1426, 1428 내지 1430, 1432, 1439 내지 1542, 1670 내지 1682, 1684 내지 1709, 1712 내지 1719, 1721 내지 1753, 1755 내지 1757 ; 또는 WO 2005/067960 의 SEQ ID NO: 5 내지 95 를 포함하거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항푸소제닉 펩타이드는 5 내지 100 개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 75 개의 아미노산 및 더욱 바람직하게는 15 내지 50 개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 특히 바람직한 항푸소제닉 펩타이드는 C-34, T-20, T-1249, T-651, T-2635, N-36, (Root, M.J., 등, Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825) 및 DP-107 (Wild, C, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680) 및 afp-1 (SEQ ID NO:29 내지 35 및 SEQ ID NO:73) 이다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항체를 포함하는데, 여기서, i) 상기 항푸소제닉 펩타이드는 5 내지 100 개의 아미노산의 아미노산 서열을 가진 선형 펩타이드이고, ii) 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 한 말단에 공액되어 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항체, 예를 들어, 항-CCR5 항체 (mAb CCR5) 를 포함하는데, 여기서, i) 상기 항푸소제닉 펩타이드는 gp41 엑토도메인으로부터 유도되고, ii) 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드 각각 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나의 말단에 공액되어 있다. 용어 "gp41 엑토도메인" 은 HIV-1 gp160 의 아미노산 위치 561 로 시작하고 아미노산 위치 620 으로 끝나거나, 또는 HIV-1 gp41 의 아미노산 위치 50 으로 시작하고 아미노산 위치 109 로 끝나는 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 66) 을 말한다 (예를 들어, [Bar, S. 및 Alizon, M. J. Virol. 78 (2004) 811-820] 도 참조).
용어 "항체" 는 전체 항체 및 항체 절편을 포함하여 다양한 형태의 항체 구조물을 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라성 항체, T 세포 항원 제거 항체이다 (WO 98/33523, WO 98/52976, 및 WO 00/34317). 항체 유전 공학은 예를 들어, [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238 및 5,204,244; Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol.23 (2005) 1117-1125] 에 기술되어 있다.
"항체 절편" 은 전장 항체의 일부, 바람직하게는 그의 가변 도메인 또는 적어도 그의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 절편의 예는 이들이 항-CCR5 항체의 특징을 유지하는 한, 예를 들어, 단쇄 항체 분자 (scFv), Fab, F(ab)2 절편 등이다. ScFv 항체는 예를 들어, [Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88] 에 기술되어 있다. Huston 은 또한, 본 발명에 유용한 폴리펩타이드의 연결을 위한 링커 및 방법을 기술한다.
"CCR5" 는 예를 들어, [Oppermann, M., Cell Signal. 16 (2004) 1201-1210] 및 [SwissProt P51681] 에서 기술된 바와 같이 인간 CCR5 를 의미한다. 본 출원 내에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "CCR5 에 결합하는 항체", "항-CCR5 항체", 또는 "mAb CCR5" 는 CCR5 에 특이적으로 결합하고 바람직하게는 표적 세포와의 HIV 융합을 억제시키는 항체를 의미한다. 결합은 세포 기재 시험관 내 ELISA 어세이 (CCR5 발현 CHO 세포) 에서 테스트될 수 있다. 항체가 100 ng/ml 의 항체 농도에서 5 이상, 바람직하게는 10 이상의 S/N (신호/노이즈 (noise)) 비를 야기한다면 결합이 발견된다. 용어 "표적 세포와의 HIV 융합 억제" 는 표적 세포 (예를 들어, PBMC) 와 바이러스 간의 막 융합을 억제시키기에 효과적인 농도의 항체의 존재 하에, 상기 표적 세포와 바이러스를 접촉시키고, 예를 들어, 루시퍼라제 리포터 유전자 활성 또는 HIV p24 항원 농도를 측정하는 것을 포함하는 어세이에서 측정된, 표적 세포와의 HIV 융합 억제를 말한다. 용어 "막 융합" 은 CCR5 및 CD4 폴리펩타이드를 공동발현하는 제 1 세포, 및 HIV env 단백질을 발현하는 제 2 세포 또는 바이러스 간의 융합을 말한다. 막 융합은 리포터 유전자 어세이 (예를 들어, 루시퍼라제 리포터 유전자 어세이) 에 의해, 유전자 조작된 세포 및/또는 바이러스에 의해 측정된다.
바람직한 항-CCR5 항체는 US 2004/0043033, US 6,610,834, US 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6,528,625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241, EP 1 322 332, EP 1 263 791, EP 1 207 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308, 및 WO 2006/103100 에서 언급된다. 특히 바람직한 항-CCR5 항체는 WO 2006/103100 에 기술된다. 특히 바람직한 항-CCR5 항체는 면역글로불린 골격, 및 중쇄 CDR3 서열 SEQ ID NO: 16, 17 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 영역으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다. 추가의 바람직한 항체는 면역글로불린 골격, 및 CDR3 서열 SEQ ID NO: 16, 17 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 영역, CDR2 서열 SEQ ID NO: 13, 14, 15 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 CDR1 서열 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 영역으로 이루어진 가변 중쇄 영역을 포함한다. 바람직한 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 에 나타나 있다. 바람직한 항-CCR5 항체는 또한, 면역글로불린 골격, 및 CDR1 서열 SEQ ID NO: 18, 19, 20 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 영역, CDR2 서열 SEQ ID NO:21, 22, 23 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 CDR3 서열 SEQ ID NO:24, 25 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 영역으로 이루어진 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 항-CCR5 항체는 바람직하게는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 1 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 2 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 3 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 4 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 5 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 6 의 CDR, 또는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 7 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 8 의 CDR 을 포함한다.
CDR 서열은 [Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 측정될 수 있다. SEQ ID NO: 1 ~ 8 의 CDR 은 SEQ ID NO: 9 ~ 25 에 나타나 있다.
항-CCR5 항체는 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함한다 :
a) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 에 의해 정의된 중쇄 (VH) 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 2 에 의해 정의된 경쇄 (VL) 가변 도메인 ;
b) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 4 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
c) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 6 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
d) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 8 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인.
"CD4" 는 예를 들어, [Brady, R.L. and Barclay, A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 205 (1996) 1-18] 및 SwissProt PO 1730 에서 기술된 바와 같은 인간 CD4 를 의미한다. 본 출원 내에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "CD4 에 결합하는 항체", "항-CD4 항체", 또는 "mAb CD4" 는 CD4 에 특이적으로 결합하고 바람직하게는 표적 세포와의 HIV 융합을 억제시키는 항체를 의미한다. 결합은 세포 기재 시험관 내 ELISA 어세이 (CD4 발현 CHO 세포) 에서 테스트될 수 있다. 항체가 100 ng/ml 의 항체 농도에서 5 이상, 바람직하게는 10 이상의 S/N (신호/노이즈 (noise)) 비를 야기한다면 결합이 발견된다. 용어 "표적 세포와의 HIV 융합 억제" 는 상기 표적 세포 (예를 들어, PBMC) 와 바이러스 간의 막 융합을 억제시키기에 효과적인 농도의 항체의 존재 하에, 상기 세포와 바이러스를 접촉시키고, 예를 들어, 루시퍼라제 리포터 유전자 활성 또는 HIV p24 항원 농도를 측정하는 것을 포함하는 어세이에서 측정된, 표적 세포와의 HIV 융합 억제를 말한다. 용어 "막 융합" 은 CD4 폴리펩타이드를 발현하는 제 1 세포, 및 HIV env 단백질을 발현하는 제 2 세포 또는 바이러스 간의 융합을 말한다. 막 융합은 리포터 유전자 어세이 (예를 들어, 루시퍼라제 리포터 유전자 어세이) 에 의해, 유전자 조작된 세포 및/또는 바이러스에 의해 측정된다. 실례의 항-CD4 항체는 예를 들어, [Reimann, K.A., 등, Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943], EP 0 512 112, US 5,871,732, EP 0 840 618, EP 0 854 885, EP 1 266 965, US 2006/0051346, WO 97/46697, WO 01/43779, US 6,136,310, WO 91/009966 에 기술되어 있다.
"CXCR4" 는 예를 들어, [Feng, Y., 등, Science 272 (1996) 809-810], 또는 [Tamamura, H. and Fujii, N., Expert Opinion on Therapeutic Targets 9 (2005) 1267-1282] 에 기술된 바와 같은 인간 CXCR4 를 의미한다. 본 출원 내에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "CXCR4 에 결합하는 항체", "항-CXCR4 항체", 또는 "mAb CXCR4" 는 CXCR4 에 특이적으로 결합하고 바람직하게는 표적 세포와의 HIV 융합을 억제시키는 항체를 의미한다. 결합은 세포 기재 시험관 내 ELISA 어세이 (CXCR4 발현 CHO 세포) 에서 테스트될 수 있다. 항체가 100 ng/ml 의 항체 농도에서 5 이상, 바람직하게는 10 이상의 S/N (신호/노이즈 (noise)) 비를 야기한다면 결합이 발견된다. 용어 "표적 세포와의 HIV 융합 억제" 는 상기 표적 세포 (예를 들어, PBMC) 와 바이러스 간의 막 융합을 억제시키기에 효과적인 농도의 항체의 존재 하에, 상기 세포와 바이러스를 접촉시키고, 예를 들어, 루시퍼라제 리포터 유전자 활성 또는 HIV p24 항원 농도를 측정하는 것을 포함하는 어세이에서 측정된, 표적 세포와의 HIV 융합 억제를 말한다. 용어 "막 융합" 은 CXCR4 폴리펩타이드를 발현하는 제 1 세포, 및 HIV env 단백질을 발현하는 제 2 세포 또는 바이러스 간의 융합을 말한다. 막 융합은 리포터 유전자 어세이 (예를 들어, 루시퍼라제 리포터 유전자 어세이) 에 의해, 유전자 조작된 세포 및/또는 바이러스에 의해 측정된다. 실례의 항-CXCR4 항체는 [Strizki, J.M., 등, J. Virol. 71 (1997) 5678-5683 (Ab 12G5)], US 7,138,496 에 기술되어 있다.
"HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체" 는 본 발명에서, 세포의 세포 표면에 바이러스가 결합하는 것을 매개하는 HIV gp120 하위단위에 의해 사용되는 세포 표면 수용체에 결합하여 상기 수용체에 gp120 이 결합하는 것, 및 또한 세포 표면에 HIV 가 결합하는 것을 방지하는 항체를 말한다. HIV gp120 은 전구체 HIV gp160 의 단백분해성 절단으로부터 유도된다 (예를 들어, [Brenneman, D.E., 등, Int. Rev. Neurobiol. 32 (1990) 305-353] 참조). 상기 절단의 제 2 절편은 HIV gp41 이다. 이들 2 개의 절편은 HIV 및 세포의 결합과 세포 융합을 비-공유적으로 관계하고 매개한다. 실례의 세포 표면 수용체는 CD4 수용체, 또는 CCR5 수용체, CXCR4 수용체, 또는 CXCR5 수용체와 같은 케모카인 수용체이다. 따라서, 한 구현예에서, HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체로는 항-CD4 항체, 또는 항-CCR5 항체, 또는 항-CXCR4 항체, 또는 항-CXCR5 항체가 있다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트에서 사용되는 항체는 바람직하게는 불변 도메인이 인간 기원의 것임을 특징으로 한다. 상기 불변 도메인은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Kabat 에 의해 기술되어 있다 (예를 들어, [Johnson, G., 및 Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참조). 예를 들어, 유용한 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (CH1-힌지-CH2-CH3) 은 SEQ ID NO: 26, 27 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 유용한 인간 카파 (κ) 경쇄 불변 도메인은 SEQ ID NO: 28 의 카파 경쇄 불변 도메인 (κ 경쇄 불변 도메인, CL) 의 아미노산 서열을 포함한다. 항체의 가변 도메인이 마우스 기원이고 Kabat 에 따른 마우스 항체의 항체 가변 도메인 서열 골격을 포함하는 것이 추가로 바람직하다 (예를 들어, [Johnson, G., 및 Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 참조).
바람직한 항-CCR5 항체는 항체 A 내지 E 로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체가 그러하듯이 CCR5 의 동일한 에피토프(들) 에의 결합을 보여주거나 또는 결합의 입체 장애 또는 경쟁적 결합으로 인해 항체 A 내지 E 에 의해 CCR5 에의 결합이 억제된다. 에피토프 결합은 [Olson, W.C., 등 (J. Virol. 73 (1999) 4145-4155)] 에 의해 기술된 에피토프 맵핑에 대한 방법에 따라 알라닌 스캐닝을 사용하여 조사된다. 75% 이상의 신호 감소는 돌연변이된 아미노산(들) 이 상기 항체에 의해 인지되는 에피토프에 기여함을 보여준다. 조사되는 항체 및 항체 A, B, C, D, 또는 E 에 의해, 에피토프에 기여하는 아미노산이 인지된다면, 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 발견된다. HIV 어세이에서 항체 2D7 보다 더 낮은 IC50 값을 나타내는 항체 C 는 항체 2D7 에 의해 인지되는 에피토프와 상이한 CCR5 의 ECL2 도메인 상에 있는 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다 (Lee, B., 등, J. Biol. Chem. 274 (1999) 9617-9626) (2D7 은 ECL2B 아미노산 184 ~ 189 에가 아니라 ECL2A 의 아미노산 K171 및 E172 에 결합함). 항체 C 에 대한 에피토프 결합은 CCR5 돌연변이 K171A 또는 E172A (glu 172 가 ala 으로 돌연변이됨) 에 대해 20% 인 것으로 나타난다. 100% 에피토프 결합은 야생형 CCR5 에 대해 한정된다. 추가의 바람직한 항-CCR5 항체는 항체 C 가 결합하는 동일한 에피토프에 결합한다.
용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정소를 의미한다. 에피토프는 보통 당 측쇄 또는 아미노산과 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 이루어지고, 보통 특이적인 3 차 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가진다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는 비-구조적 에피토프가 아닌 구조적 에피토프에의 결합이 변성화 용매의 존재 하에 상실되는 점에서 구분된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 변성된 CCR5 에가 아니라 본래의 CCR5 에 특이적으로 결합한다. 상기 항체는 바람직하게는 SEQ ID NO: 17 의 중쇄 CDR3, 및 바람직하게는 또한 SEQ ID NO: 10, 11, 12, 14 및/또는 15 의 CDR 의 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 을 포함한다. 바람직하게는 상기 항체는 항체 B, C, D, 또는 E 이거나, 또는 항체 B, C, D, 또는 E 의 가변 도메인을 포함한다. 바람직하게는 변성된 CCR5 에 결합하는 항체는 항체 A 이거나 또는 항체 A 의 가변 도메인을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "가변 도메인" (경쇄의 가변 도메인 (VL), 중쇄의 가변 도메인 (VH)) 은 항원에의 항체 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄 도메인 쌍의 각각의 도메인을 말한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 동일한 일반 구조를 가지는데, 즉, "면역글로불린 골격" 을 가지고, 각각의 도메인은 4 개의 "골격 영역" (FR) 을 포함하고, 이의 서열은 광범위하게 보존되어 있고, 3 개의 "초가변 영역" (또는 "상보성 결정 영역", CDR) 에 의해 연결되어 있다. 골격 영역은 β-판 구조를 채택하고, CDR 은 β-판 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내 CDR 은 골격 영역에 의해 3 차 구조로 고정되어 있고, 다른 사슬의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 하고, 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.
본원에서 사용될 때 용어 "항체의 항원-결합 부분" 또는 "항체의 항원-결합 부위" 는 항원-결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 항체의 항원 -결합 부위는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N- 에서 C-말단으로 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 (면역글로불린 골격) 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 영역은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이고 항체를 한정한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항-CCR5 항체는 중쇄 가변 도메인 내에 SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17 의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상보성 결정 영역 (CDR) 및 골격 (FR) 영역은 [Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.
항-CCR5 항체의 "Fc 부분" 은 CCR5 에의 결합에 직접 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타내는 부분이다. 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 의 부류로 분류되고, 이들 중 다수가 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1 및 IgA2 와 같은 하위부류 (아이소타입) 로 추가 분류될 수 있다. 중쇄 불변 영역에 따라, 상이한 부류의 면역글로불린을 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 라고 부른다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 IgG 유형이다. "항체의 Fc 부분" 은 당업자에게 잘 알려진 용어이고, 항체의 파파인 절단을 바탕으로 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 Fc 부분으로서 인간 Fc 부분 또는 인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분을 함유한다. 본 발명의 추가의 구현예에서, Fc 부분은 하위부류 IgG4 의 인간 항체의 Fc 부분 또는 하위부류 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 의 인간 항체의 Fc 부분으로서, 하기 정의된 바와 같은 Fcγ 수용체 (예를 들어, FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합 중 어느 것도 검출될 수 없도록 개질된 것이다. 바람직하게는 Fc 부분은 인간 Fc 부분이고, 특히 바람직하게는 인간 IgG4 하위부류의 인간 Fc 부분 또는 인간 IgG1 하위부류의 돌연변이된 Fc 부분이다. 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 인간 IgG1 하위부류의 Fc 부분이 더욱 바람직하다. SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 SEQ ID NO: 26, 돌연변이 S228P 가 있는 SEQ ID NO: 27 에 나타낸 Fc 부분이 더욱 바람직하다. IgG4 는 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 보여주는 한편, 다른 IgG 하위부류의 항체는 강한 결합을 보여준다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및 His435 는, 만약 변형되었다면, 마찬가지로 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591- 6604; Lund, J., 등, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 IgG4 하위부류 또는 IgG1 이나 IgG2 하위부류의 Fcγ 수용체 결합에 관해서 L234, L235, 및/또는 D265 에 돌연변이가 있고/거나, 또는 PVA236 돌연변이를 함유한다. IgG1 의 아미노산 위치 233 내지 236 에 돌연변이 S228P, L234A, L235A, L235E, 및/또는 PVA236 (PVA236 은 IgG1 의 아미노산 위치 233 내지 236 의 아미노산 서열 ELLG (하나의 문자가 아미노산 코드로 주어짐) 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 로 대체된 것을 의미함) 가 있는 것이 바람직하다. IgG4 의 돌연변이 S228P, 및 IgG1 의 L234A 와 L235A 의 돌연변이가 특히 바람직하다. 항체의 Fc 부분은 ADCC (항체-의존성 세포-매개 세포독성) 및 CDC (보체-의존성 세포독성) 에 직접 관여한다. 보체 활성화 (CDC) 는 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 부분에 보체 인자 C1q 가 결합함으로써 개시된다. 항체에의 C1q 결합은 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 그러한 Fc 부분 결합 부위는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, [Lukas, T.J., 등, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., 및 Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., 등, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., 등, MoI. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., 등, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324]; 및 EP 0 307 434 에 기술되어 있다. 상기 Fc 부분 결합 부위는 예를 들어, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329 (Kabat 의 EU 지수에 따른 번호매김) 에 의해 특징지어진다. 하위부류 IgG1, IgG2, 및 IgG3 항체는 보통 C1q 및 C3 결합을 포함하여 보체 활성화를 나타내며, 반면, IgG4 는 보체계를 활성화시키지 않고 C1q 및 C3 을 결합하지 않는다. Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 항-CCR5 항체는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 유도하지 않는다. 바람직하게는, 상기 항체는 CCR5 에 결합하고, 인간 기원으로부터 유도된 Fc 부분을 함유하고, Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 또는 인간화된, 또는 T-세포 항원 제거 항체이다. C1q 결합은 [Idusogie, E.E., 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184] 에 따라 측정될 수 있다. "C1q 결합" 은, 상기 어세이에서 492 ~ 405 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 가 8 μg/ml 의 항체 농도에서, 비개질된 야생형 항체 Fc 부분이 인간 C1q 에 결합하는 값보다 테스트 항체에서 15% 더 낮다면 없는 것으로 발견된다. ADCC 는 인간 NK 세포 상의 인간 FcγRIIIa 에의 항체 결합으로서 측정될 수 있다. 결합은 20 μg/ml 의 항체 농도에서 측정된다. "Fcγ 수용체 결합 없음" 또는 "ADCC 없음" 은 20 μg/ml 의 항체 농도에서 인간 NK 세포 상의 인간 FcγRIIIa 에의 결합이 인간 IgG1 (SEQ ID NO:26) 과 동일한 항체의 결합과 비교해 30% 이하임을 의미한다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트에서 사용된 항체는 또한, 상기 언급된 본 발명에 따른 항체의 특징에 영향을 주거나 또는 변형시키지 않는 아미노산 서열 개질인 "보존적 서열 개질" 을 갖는 항체 (변이체 항체) 를 포함한다.
개질은 부위-특이적 돌연변이 및 PCR-매개 돌연변이와 같은 당업자에게 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하성 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신), 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 를 가진 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-CCR5 항체 내 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리의 또다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 따라서, 본원에서 "변이체" 항-CCR5 항체는 모 항체의 중쇄 CDR3 영역 외부의 가변 도메인 영역 중 하나 이상에서 10 개 이하, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 개의 첨가, 소실 및/또는 치환에 의해 아미노산 서열이 "모 (parent)" 항-CCR5 항체의 아미노산 서열과 상이한 분자를 말한다. 각각의 다른 중쇄 CDR 영역은 최대 하나의 아미노산 첨가, 소실 및/또는 치환을 포함한다. 본 발명은 CCR5 에 결합하는 모 항체의 CDR 아미노산 서열을 개질하는 방법을 포함하고, 이는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 82, 83 으로 이루어진 중쇄 가변 도메인의 군으로부터 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 76, 77 로 이루어진 경쇄 가변 도메인의 군으로부터 경쇄 가변 도메인을 선별하고, 상기 처음의 가변 도메인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 제공하고, 하나의 아미노산이 중쇄 CDR1 에서 개질되고, 하나의 아미노산이 중쇄 CDR2 에서 개질되고, 1 ~ 3 개의 아미노산이 경쇄 CDR1 에서 개질되고, 1 ~ 3 개의 아미노산이 경쇄 CDR2 에서 개질되고/거나, 또는 1 ~ 3 개의 아미노산이 경쇄 CDR3 에서 개질되도록 상기 핵산을 개질하고, 상기 개질된 가변 도메인(들) 아미노산 서열을 항체 구조에서 발현 및 혼입시키고, 상기 항체가 CCR5 에 결합하는지 측정하고, 만약 항체가 CCR5 에 결합한다면 상기 개질된 가변 도메인(들)/CDR(들) 을 선별하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 개질은 보존적 서열 개질이다. 아미노산 서열 개질은 [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327], 및 [Queen, C, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033] 에서 기술된 바와 같은 분자 모델링을 바탕으로 한 돌연변이에 의해 수행될 수 있다.
본 출원 내에서 사용된 용어 "링커" 또는 "펩타이드 링커" 는 천연 및/또는 합성 기원의 펩타이드 링커를 말한다. 이들은 20 개의 자연 발생 아미노산이 단량체성 빌딩 블록 (building block) 인 선형 아미노산 사슬로 축적되어 있다. 사슬의 길이는 1 내지 50 개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 28 개의 아미노산, 특히 바람직하게는 3 내지 25 개의 아미노산이다. 링커는 반복 아미노산 서열 또는 힌지-기능이 있는 폴리펩타이드와 같은 자연 발생 폴리펩타이드의 서열을 함유할 수 있다. 링커는 항-CCR5 항체에 공액된 펩타이드가 올바르게 접히고 적절히 제시되게 함으로써 그의 생물학적 활성을 수행할 수 있음을 보장하는 기능을 가진다. 바람직하게는 링커는 글리신, 글루타민, 및/또는 세린 잔기에 풍부한 것으로 지정된 "합성 펩타이드 링커" 이다. 이들 잔기는 예를 들어, GGGGS, QQQQG, 또는 SSSSG 와 같이 5 개 이하의 아미노산의 작은 반복 단위로 배열되어 있다. 상기 작은 반복 단위는 2 내지 5 회 반복되어, 다량체성 단위를 형성할 수 있다. 다량체성 단위의 아미노- 및/또는 카르복시-말단에서 6 개 이하의 추가의 인위적인, 자연 발생 아미노산이 첨가될 수 있다. 다른 합성 펩타이드 링커는 링커 SSSSSSSSSSSSSSS 내 세린과 같이 10 내지 20 회 반복되는 단일 아미노산으로 이루어진다. 아미노- 및/또는 카르복시-말단의 각각에서, 6 개 이하의 추가의 인위적인, 자연 발생 아미노산이 존재할 수 있다. 바람직한 링커는 표 2 에 나타나 있다. 링커 [GQ4]3GNN (SEQ ID NO:40), LSLSPGK (SEQ ID NO:36), LSPNRGEC (SEQ ID NO:37), LSLSGG (SEQ ID NO:61), LSLSPGG (SEQ ID NO:62), G3[SG4]2SG (SEQ ID NO:69) 가 특히 바람직하다. 모든 펩타이드 링커는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있고, 따라서 재조합적으로 발현될 수 있다. 링커가 펩타이드 자체이기 때문에, 항푸소제닉 펩타이드는 2 개의 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합을 통해 링커에 연결된다. 펩타이드 링커는 항푸소제닉 펩타이드와, 항푸소제닉 펩타이드가 공액되는 항-CCR5 항체 사슬 사이에 도입된다. 따라서, 각각 2 또는 3 개의 가능한 서열 (아미노-말단에서 카르복시-말단 방향으로) 이 존재할 수 있다 :
a) 항푸소제닉 펩타이드 - 펩타이드 링커 - 항-CCR5 항체 폴리펩타이드 사슬, 또는
b) 항-CCR5 항체 폴리펩타이드 사슬 - 펩타이드 링커 - 항푸소제닉 펩타이드, 또는
c) 항푸소제닉 펩타이드 - 펩타이드 링커 - 항-CCR5 항체 폴리펩타이드 사슬 - 펩타이드 링커 - 항푸소제닉 펩타이드.
본 발명의 한 구현예에서, mAb CCR5-컨쥬게이트는 하기를 포함하는 것을 특징으로 한다 :
i) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 정의된 중쇄 (VH) 가변 도메인 및 SEQ ID NO:2 에 의해 정의된 경쇄 (VL) 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:4 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:6 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ; 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO:7 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:8 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
ii) 아미노산 글리신 (G) 및 아스파라긴 (N), 트리펩타이드 GST, 및 SEQ ID NO:36 ~ 62, 및 SEQ ID NO:67 ~ 70 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 ; 및
iii) SEQ ID NO:29 내지 35, 또는 73 에 의해 정의된 펩타이드의 군으로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드.
mAb CCR5 의 중쇄 및/또는 경쇄 및 항푸소제닉 펩타이드(들) 의 바람직한 컨쥬게이트 ("사슬 컨쥬게이트") 는 : 컨쥬게이트 (1) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄], (2) [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드], (3) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [항푸소제닉 펩타이드], (4) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄], (5) [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드], (6) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [항푸소제닉 펩타이드], (7) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드], (8) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드] (식 중, 링커는 상기 사슬 컨쥬게이트 내 그리고 사이 둘 다에서 동일 또는 상이할 수 있고, m 은 1 또는 0 의 정수이고, m 은 상기 컨쥬게이트 내 그리고 사이 둘 다에서 동일 또는 상이할 수 있음) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 사슬 컨쥬게이트 (7) 및 mAb CCR5 경쇄를 포함하는 컨쥬게이트에서, 사슬 컨쥬게이트 (7) 내의 2 개의 링커는 동일할 수 있는데, 즉, 동일한 아미노산 서열 및 길이를 가질 수 있거나, 또는 상이할 수 있는데, 즉, 상이한 아미노산 서열 및 길이를 가질 수 있거나, 또는 1 개 또는 2 개 모두가 없을 수도 있다. 예를 들어, 사슬 컨쥬게이트 (2) 및 (4) 를 포함하는 컨쥬게이트에서, 사슬 컨쥬게이트 (2) 내에 함유된 링커 및 사슬 컨쥬게이트 (4) 내에 함유된 링커는 동일할 수 있는데, 즉, 동일한 아미노산 서열 및 길이를 가질 수 있거나, 또는 상이할 수 있는데, 즉, 상이한 아미노산 서열 및/또는 길이를 가질 수 있거나, 또는 1 개 또는 2 개 모두가 없을 수도 있다. 사슬 컨쥬게이트에서, 링커(들) 는 존재 (m = 1) 또는 부재 (m = 0) 할 수 있다. 바람직한 사슬 컨쥬게이트는 사슬 컨쥬게이트 (2), (3), (4), 및 (7) 이다. 본 발명의 한 구현예는 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x 사슬 컨쥬게이트 (2) 를 포함하는 컨쥬게이트이다. 상기 컨쥬게이트는 항푸소제닉 펩타이드의 C-말단에서 N-말단을 통해 공액된 2 개가 아닌 컨쥬게이트 항-CCR5 항체 경쇄 및 2 개의 항-CCR5 항체 중쇄를 임의로 중간체 링커와 함께 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예는 2 개의 mAb CCR5 경쇄 및 2 개의 사슬 컨쥬게이트 (3) 을 포함하는 컨쥬게이트이다. 더욱 또다른 구현예는 2 개의 mAb CCR5 중쇄 및 2 개의 사슬 컨쥬게이트 (4) 를 포함하는 컨쥬게이트이다. 본 발명의 추가의 구현예는 2 개의 mAb CCR5 경쇄 및 2 개의 사슬 컨쥬게이트 (7) 을 포함하는 컨쥬게이트이다. 중쇄 및/또는 경쇄는 바람직하게는 불변 영역 (Fc) 을 포함한다.
본 발명은 추가로, 유효량의 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법 및 상기 방법을 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로, AIDS 환자의 치료를 위한, 약학적 제제의 제조를 위한 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 유효량의 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
본 출원 내에서 사용된 용어 "아미노산" 은 알라닌 (3 개 문자 코드 : ala, 1 개 문자 코드 : A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소루신 (ile, I), 루신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y), 및 발린 (val, V) 을 포함하는 자연 발생 카르복시 α-아미노산의 군을 말한다.
본 발명의 수행에 유용한 당업자에게 알려진 방법 및 기술은 예를 들어, [Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volume I to III (1997), Wiley 및 Sons; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트에서, 항체 사슬의 카르복시-말단 아미노산은 펩타이드 결합을 통해 항푸소제닉 펩타이드의 아미노-말단 아미노산에 결합되거나, 또는 항푸소제닉 펩타이드의 카르복시-말단 아미노산은 펩타이드 결합을 통해 항체 사슬의 아미노-말단 아미노산에 공액된다. 한 구현예에서, 중간체 링커는 항푸소제닉 펩타이드 및 항체 사슬 사이에 존재한다. 따라서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 하기 일반식을 특징으로 한다 :
항체 - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]n
[식 중, m 은 독립적으로 각각의 항푸소제닉 펩타이드에 대해 0 (즉, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드 사이의 1 개의 직접적인 펩타이드 결합) 또는 1 (즉, 링커가 항체 및 항푸소제닉 펩타이드 사이에 존재함) 이고, n 은 1 내지 8 의 정수임]. 한 구현예에서, n 은 2 내지 8 의 정수이다. 또다른 구현예에서, n 은 2 내지 4 의 정수이다. 또다른 구현예에서, n 은 2 또는 4 의 정수이다. 본 발명의 한 구현예는 항체의 중쇄의 각각의 C-말단에서 또는 경쇄의 각각의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트를 포함한다. 상기 구현예에서, 2 개의 항푸소제닉 펩타이드는 1 개의 항체에 공액되어 있다. 또다른 구현예에서, 중쇄의 각각의 C-말단에서 및 경쇄의 각각의 N-말단에서 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트가 포함된다. 상기 구현예에서, 4 개의 항푸소제닉 펩타이드는 1 개의 항체에 공액되어 있다. 한 구현예에서, 상기 항체는 mAb CCR5 또는 mAb CD4 이다.
mAb CCR5 중쇄 및/또는 경쇄(들) 의 말단에 도입되는 항푸소제닉 펩타이드는 mAb CCR5 와 비교해 작은 크기이다. 예를 들어, 최소의 면역글로불린인 부류 G 의 면역글로불린은 대략 150 kDa 의 분자량을 갖고 ; 항푸소제닉 펩타이드는 바람직하게는 12.5 kDa 미만의 크기 (분자량) 를 갖고, 이는 약 100 개의 아미노산에 상당하며, 일반적으로 7.5 kDa 미만이며, 이는 약 60 개의 아미노산에 상당한다. 항푸소제닉 펩타이드는 5 내지 100 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 내지 75 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 15 내지 50 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 컨쥬게이트는 약학, 치료, 또는 진단 적용에 유용하다. mAb CCR5 중쇄 및/또는 경쇄(들) 에 공액될 수 있는 항푸소제닉 펩타이드의 수는 1 개 내지 항-CCR5 항체 폴리펩타이드 사슬의 아미노- 및 카르복시-말단의 조합된 수이다. 본 발명은 상이한 항-CCR5 항체를 포함하기 때문에, 항푸소제닉 펩타이드의 수는 다양할 수 있다. 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄를 포함하는 항-CCR5 항체의 경우, 아미노-말단 (N-말단) 및 카르복시-말단 (C-말단) 의 조합된 수는 8 이고, 이는 동시에 공액된 항푸소제닉 펩타이드의 총 최대 수이며 ; 예를 들어, 단일 사슬 항체 (scFv) 와 같은 항-CCR5 항체 절편의 경우, 말단의 조합된 수 및 따라서 공액가능한 항푸소제닉 펩타이드의 최대 수는 2 이다. 만약 단일 항푸소제닉 펩타이드가 mAb CCR5 에 공액된다면, 펩타이드는 항-CCR5 항체 사슬의 말단 중 어느 하나를 차지할 수 있다. 마찬가지로, 최대 가능한 수의 펩타이드가 mAb CCR5 에 공액된다면, 모든 말단은 단일 펩타이드가 차지한다. mAb CCR5 에 공액되는 펩타이드의 수가 최대 가능한 수보다 더 적으면, 항-CCR5 항체 사슬의 말단에서 펩타이드의 분포가 상이할 수 있다. 예를 들어, 4 개의 펩타이드가 G 또는 E 부류의 면역글로불린에 공액된다면, 5 개의 상이한 조합이 가능하다 (표 1 참조). 2 개의 조합에서, 1 종류의 모든 말단, 즉, 항-CCR5 항체 사슬의 모든 4 개의 아미노-말단 또는 모든 4 개의 카르복시-말단은 각각 하나의 단일 항푸소제닉 펩타이드에 공액된다. 다른 말단은 공액되지 않는다. 상기는 한 구현예에서 항-CCR5 항체의 한 영역 내에 개질/공액이 배치되게 한다. 다른 경우에서는, 폴리펩타이드는 2 개 말단 모두에 공액된다. 이러한 조합 내에서, 공액된 펩타이드는 항-CCR5 항체의 상이한 영역에 배치된다. 어떤 경우에도, 공액된 말단의 합은 4 이다.
4 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 항-CCR5 항체의 말단에 4 개의 펩타이드가 공액되는 경우에 대한 가능한 조합
차지하는 아미노-말단의 수 차지하는 카르복시-말단의 수 차지하는 말단의 총 수
4 0 4
3 1 4
2 2 4
1 3 4
0 4 4
본 발명은 바람직하게는 말단 중 2 개 이상이 항푸소제닉 펩타이드에 공액되는 컨쥬게이트를 포함한다. 항푸소제닉 펩타이드의 아미노산 서열은 상이, 유사 또는 동일할 수 있다. 한 구현예에서, 아미노산 서열 동일성은 90% 내지 100% 미만의 범위에 있고 ; 이들 아미노산 서열 및 상응하는 펩타이드는 유사한 것으로 정의된다. 바람직한 구현예에서, 항푸소제닉 펩타이드는 동일한데, 즉, 100% 의 아미노산 동일성을 갖는다.
본 발명은 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CCR5 항체 (mAb CCR5) 를 포함하는 컨쥬게이트를 포함하며, 여기서, 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 상기 항-CCR5 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나의 말단에 펩타이드 결합을 통해 공액되어 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 2 개 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CCR5 항체를 포함하며, 여기서, 2 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드는 각각 상기 항-CCR5 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나의 말단에 공액되어 있다.
한 구현예에서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 하기를 특징으로 한다 : i) SEQ ID NO:2 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:1 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 사슬 컨쥬게이트를 포함하거나, ii) SEQ ID NO:4 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:3 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 사슬 컨쥬게이트를 포함하거나, iii) SEQ ID NO:6 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:5 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 사슬 컨쥬게이트를 포함하거나, 또는 iv) SEQ ID NO:8 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:7 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 사슬 컨쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
항푸소제닉 펩타이드 및 항-CCR5 항체 사이의 공액은 핵산 수준에서 수행된다. 따라서, 펩타이드 결합은 중간체 링커가 있거나 또는 없이 항푸소제닉 펩타이드 및 항-CCR5 항체 사슬 사이에서 형성된다. 따라서, 항푸소제닉 펩타이드의 카르복시-말단 아미노산은 중간체 링커가 있거나 또는 없이 항-CCR5 항체 사슬의 아미노-말단 아미노산에 공액되거나, 또는 항-CCR5 항체 사슬의 카르복시-말단 아미노산은 중간체 링커가 있거나 또는 없이 항푸소제닉 펩타이드의 아미노-말단 아미노산에 공액되거나, 또는 항-CCR5 항체 사슬의 2 개의 말단 모두 중간체 링커가 있거나 또는 없이 각각 항푸소제닉 펩타이드에 공액된다. 본 발명에 따른 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체-컨쥬게이트의 재조합 제조를 위해, 상이한 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자가 필요하고, 바람직하게는 2 내지 8 개의 핵산 분자가 사용된다. 이들 핵산 분자는 컨쥬게이트의 상이한 항-CCR5 항체 폴리펩타이드 사슬을 암호화하고, 구조 유전자로서 하기에 나타나 있다. 이들은 동일한 발현 플라스미드 (벡터) 상에 위치할 수 있거나, 또는 대안적으로 상이한 발현 플라스미드 (벡터) 상에 위치할 수 있다. 컨쥬게이트의 어셈블리는 바람직하게는 컨쥬게이트의 분비 전에 따라서 발현하는 세포 내에 위치한다. 따라서, 컨쥬게이트의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 분자는 바람직하게는 동일한 숙주 세포 내에 발현된다. 재조합 발현 후에 컨쥬게이트 혼합물이 수득된다면, 상기 컨쥬게이트는 당업자에게 알려진 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 이들 방법은 면역글로불린 정제에 대해 잘 구축되어 있고 광범위하게 사용되며, 단독으로 또는 조합해서 사용된다. 상기 방법은 예를 들어, 미생물-유도 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-형태의 교환 크로마토그래피), 친티오성 흡착 (예를 들어, 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐-세파로스, 친아자-아레노성 (aza-arenophilic) 수지, 또는 m-아미노페닐보론산), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피, 및 제조 전기영동 방법 (예컨대 젤 전기영동, 모세관 전기영동) 이다 (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). 당업자에게 알려진 재조합 조작 방법을 사용해, 컨쥬게이트는 핵산/유전자 수준에서 맞춤-제작될 수 있다. 면역글로불린을 암호화하는 핵산 서열이 알려져 있고 예를 들어, 게놈 데이타베이스로부터 수득될 수 있다. 마찬가지로, 항푸소제닉 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 알려져 있고, 그의 아미노산 서열로부터 쉽게 추론될 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트를 발현시키기 위한 발현 플라스미드의 구축에 필요한 구성원은 예를 들어, 그의 천연 및/또는 개질된 및/또는 공액된 버전의 항-CCR5 항체 경쇄용 발현 카세트, 그의 천연 및/또는 개질된 및/또는 공액된 버전의 항-CCR5 항체 중쇄용 발현 카세트 (대안적으로 항-CCR5 항체 경쇄 및 항-CCR5 항체 중쇄는 예를 들어, 바이시스트로닉 (bicistronic) 발현 구성원으로서 동일한 발현 카세트에서 수득될 수 있음), 선별 마커, 및 이.콜라이 (E.coli) 복제뿐만 아니라 선별 단위이다. 이들 발현 카세트는 프로모터, 분비 신호 서열을 암호화하는 DNA 분절, 구조 유전자, 및 종결자/폴리아데닐화 신호를 포함한다. 구성원은 조작적으로 연결되도록 어셈블리되어서, 컨쥬게이트의 모든 사슬을 암호화하는 하나의 플라스미드 상에서, 또는 각각 컨쥬게이트의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 2 개 이상 플라스미드 상에서 형성된다. 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 위해, 플라스미드(들) 를 적합한 숙주 세포 내에 도입한다. 단백질은 바람직하게는 CHO 세포, NSO 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, K562 세포, BHK 세포, PER.C6® 세포 등과 같은 포유류 세포에서 생성된다. 플라스미드의 조절 구성원은, 이들이 선별된 숙주 세포 내에서 기능적이 되도록 선별되어야 한다. 발현을 위해, 컨쥬게이트의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 플라스미드를 함유하는 숙주 세포를 사슬 발현에 적합한 조건 하에 배양한다. 발현된 컨쥬게이트 사슬은 기능적으로 어셈블리된다. 완전히 처리된 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체-컨쥬게이트는 배지 내로 분비된다.
"발현 플라스미드" 는 숙주 세포 내에서 발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 플라스미드는 예를 들어, 이.콜라이에 대해서는, 복제 원점을 포함하는 원핵 플라스미드 증식 단위, 내성 유전자, 진핵 선별 마커, 및 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결자를 포함하는 구조 유전자(들) 의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 조절 하에 일어나고, 상기 구조 유전자는 프로모터에 "조작적으로 연결되어 있다" 고 한다. 유사하게는, 조절 구성원 및 코어 프로모터는, 조절 구성원이 코어 프로모터의 활성을 조절한다면 조작적으로 연결된다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 제조 방법이다 :
a) 컨쥬게이트의 발현에 적합한 조건 하에, 각각이 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 플라스미드를 함유하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 상청액으로부터 컨쥬게이트를 회수하는 단계.
용어 "컨쥬게이트의 발현에 적합한 조건 하에" 는 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 배양에 사용되고, 당업자에게 알려진 또는 쉽게 측정될 수 있는 조건을 말한다. 이들 조건은 발현되는 폴리펩타이드의 유형 및 배양되는 세포의 유형에 따라 다양할 수 있는 것으로 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로, 세포는 예를 들어, 2O℃ 내지 40℃ 의 온도에서, 그리고, 폴리펩타이드 컨쥬게이트가 효과적으로 생성되게 하기에 충분한 시간 동안, 예를 들어, 4 내지 28 일 동안 배양된다.
본원에서 사용된, "약학적으로 허용가능한 담체" 는 생리학적으로 융화가능한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡착/재흡수 지연제 등이다. 바람직하게는, 담체는 주사 또는 주입에 적합하다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 성분용 상기 배지 및 제제의 용도는 당업계에 알려져 있다. 물 외에도, 담체는 예를 들어, 등장성 완충 식염수일 수 있다.
선택되는 투여 경로와는 상관 없이, 적합한 수화물 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 통상의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여량 형태로 제형된다.
본 발명의 약학적 조성물 내 활성 성분의 실제 투여량 수준은 다양해서, 환자에 독성이지 않으면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득할 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 분비 속도, 사용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반 건강상태 및 이전의 의학적 이력 및 의료 분야에서 잘 알려진 요소를 포함하여 다양한 약물동력학적 요소에 따라 다를 것이다.
본 발명은 바람직하게는 AIDS 와 같은 면역결핍 증후군을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 용도를 포함한다.
하기 실시예, 서열 목록, 도면 및 기탁증은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되며, 이의 실제적인 범주는 첨부되는 청구항에 나타나 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 과정에 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다.
도 1: mAb CCR5 κ-경쇄 발현 벡터 4900 의 플라스미드 지도.
도 2: mAb CCR5 γ1 -중쇄 발현 벡터 4901 의 플라스미드 지도.
도 3: mAb CCR5 γ1-중쇄 컨쥬게이트 발현 벡터 4995 의 플라스미드 지도.
도 4: mAb CD4 κ-경쇄 발현 벡터 6310 의 플라스미드 지도.
도 5: mAb CD4 γ1-중쇄 발현 벡터 6309 의 플라스미드 지도.
도 6: mAb CD4 γ1-중쇄 컨쥬게이트 발현 벡터 6303 의 플라스미드 지도.
항- CCR5 항체 기탁
본 발명에 따른 컨쥬게이트에서 유용한 mAb CCR5 를 발현하는 바람직한 하이브리도마 세포주를 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany 에 기탁하였다.
세포주 기탁 번호 기탁일
m<CCR5>Pz01.F3 DSM ACC 2681 18.08.2004
m<CCR5>Pz02.1C11 DSM ACC 2682 18.08.2004
m<CCR5>Pz03.1C5 DSM ACC 2683 18.08.2004
m<CCR5>Pz04.1F6 DSM ACC 2684 18.08.2004
항체 명칭
<CCR5>>Pz01.F3: 항체 A SEQ ID NO: 1, 2
<CCR5>PzO2.1C11: 항체 B SEQ ID NO: 3, 4
<CCR5>PzO3.1C5 : 항체 C SEQ ID NO: 5, 6
<CCR5>F3.1H12.2E5: 항체 D SEQ ID NO: 7, 8
<CCR5>PzO4.1F6: 항체 E
mAb CD4 의 가변 도메인 1 은 US 5,871,732 의 SEQ ID NO: 10, 15, 45, 및 56 에 기록되어 있다.
mAb CD4 의 가변 도메인 2 및 4 는 [Reimann, K.A., 등, Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943] 에 기록되어 있다.
mAb CD4 의 가변 도메인 3 은 WO 91/009966 의 도 3, 4, 12, 및 13 에 기록되어 있다.
항체 서열, 항푸소제닉 펩타이드의 서열 및 펩타이드 링커의 서열
SEQ ID NO: 1 <CCR5>Pz01.F3 중쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 2 <CCR5>Pz01.F3 경쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 3 <CCR5>PzO2.1C11 중쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 4 <CCR5>Pz02.1C11 경쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 5 <CCR5>PzO3.1C5 중쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 6 <CCR5>PzO3.1C5 경쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 7 <CCR5>F3.1H12.2E5 중쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 8 <CCR5>F3.1H12.2E5 경쇄, 가변 도메인
SEQ ID NO: 9 중쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO: 10 중쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO: 11 중쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO: 12 중쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO: 13 중쇄 CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO: 14 중쇄 CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO: 15 중쇄 CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO: 16 중쇄 CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO: 17 중쇄 CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO: 18 경쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:19 경쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:20 경쇄 CDR1 mAb CCR5
SEQ ID NO:21 경쇄 CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:22 경쇄 CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:23 경쇄 CDR2 mAb CCR5
SEQ ID NO:24 경쇄 CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO:25 경쇄 CDR3 mAb CCR5
SEQ ID NO:26 γ1 중쇄 불변 영역
SEQ ID NO:27 γ4 중쇄 불변 영역
SEQ ID NO:28 κ 경쇄 불변 도메인
SEQ ID NO:29 C34
SEQ ID NO:30 T20
SEQ ID NO:31 T1249
SEQ ID NO:32 T651
SEQ ID NO:33 T2635
SEQ ID NO:34 N36
SEQ ID NO:35 DP107
SEQ ID NO:36-62, 67-70 링커 펩타이드
SEQ ID NO:63 성숙한 mAb CCR5 κ-경쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO:64 성숙한 mAb CCR5 γ1 -중쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO:65 성숙한 mAb CCR5 컨쥬게이트 중쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO:66 HIV-1 gp41
SEQ ID NO:71 성숙한 mAb CD4 κ-경쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO:72 성숙한 mAb CD4 γ1 -중쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO:73 afp-1
SEQ ID NO:74 성숙한 mAb CD4 컨쥬게이트 중쇄의 아미노산 서열
SEQ ID NO:75 쥣과 경쇄 가변 도메인 1 mAb CD4
SEQ ID NO:76 키메라성 경쇄 가변 도메인 1 mAb CD4
SEQ ID NO:77 키메라성 경쇄 1 mAb CD4
SEQ ID NO:78 키메라성 경쇄 가변 도메인 2 mAb CD4
SEQ ID NO:79 키메라성 경쇄 가변 도메인 3 mAb CD4
SEQ ID NO:80 키메라성 경쇄 가변 도메인 4 mAb CD4
SEQ ID NO:81 쥣과 중쇄 가변 도메인 1 mAb CD4
SEQ ID NO:82 키메라성 중쇄 가변 도메인 1 mAb CD4
SEQ ID NO:83 키메라성 중쇄 1 mAb CD4
SEQ ID NO:84 키메라성 중쇄 가변 도메인 2 mAb CD4
SEQ ID NO:85 키메라성 중쇄 가변 도메인 3 mAb CD4
SEQ ID NO:86 키메라성 중쇄 가변 도메인 4 mAb CD4
SEQ ID NO:87 경쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:88 경쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:89 경쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:90 경쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:91 경쇄 CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:92 경쇄 CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:93 경쇄 CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO:94 경쇄 CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:95 경쇄 CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:96 경쇄 CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO:97 중쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:98 중쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:99 중쇄 CDR1 mAb CD4
SEQ ID NO:100 중쇄 CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO: 101 중쇄 CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO: 102 중쇄 CDR2 mAb CD4
SEQ ID NO: 103 중쇄 CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO: 104 중쇄 CDR3 mAb CD4
SEQ ID NO: 105 중쇄 CDR3 mAb CD4
Figure 112009009433529-PCT00001
재료 & 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보는 : [Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 에 나타나 있다. 항체 사슬의 아미노산은 EU 번호매김에 따라 번호매겨진다 (Edelman, G.M., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).
재조합 DNA 기술 :
[Sambrook, J. 등, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기술된 바와 같이 DNA 를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 분자생물학적 시약을 제조업자의 지시에 따라 사용하였다.
유전자 합성 :
목적하는 유전자 분절을 화학적 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오타이드로부터 제조하였다. PCR 증폭을 포함하여 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 연결에 의해, 하나의 내부 제한효소 (restriction endonuclease) 절단 부위 옆에 위치하는 100 ~ 600 bp 의 긴 유전자 분절을 어셈블리하고, 이어서 A-오버행 (overhang) 을 통해 pCR2.1-TOPO-TA 클로닝 벡터 (Invitrogen Corp., USA) 내로 클 로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 절편의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱 (sequencing) 에 의해 확인하였다.
단백질 측정 :
아미노산 서열을 바탕으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 컨쥬게이트의 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 1
항- CCR5 항체 발현 플라스미드의 제조
항-CCR5 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 인간 카파-경쇄 불변 도메인 (CL) 을 암호화하는 유전자 분절을, 항-CCR5 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 인간 γ1-중쇄 불변 도메인 (CH1-힌지-CH2-CH3) 에 대한 유전자 분절과 마찬가지로 조인하였다.
SEQ ID NO:63/64 의 mAb CCR5 의 경우, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 마우스 항체로부터 유도되고, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 인간 항체 (C-카파 및 IgG1) 로부터 유도된다.
이어서, 완전한 항-CCR5 항체 경쇄를 암호화하는 유전자 분절을 연결자 링커 서열을 포함하여 항푸소제닉 펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 N- 및/또는 C-말단에 삽입하고/거나, 또는 완전한 항-CCR5 항체 중쇄를 암호화하는 유전자 분절을 연결자 링커 서열을 포함하여 항푸소제닉 펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 N- 및/또는 C-말단에 삽입하였다.
a) 벡터 4900
벡터 4900 은 HEK293 세포 내 mAb CCR5 경쇄 (게놈적으로 조직된 발현 카세트; 엑손-인트론 조직화) 의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드이다.
mAb CCR5 κ-경쇄 발현 카세트 외에도, 상기 벡터는 하기를 함유한다 :
- 선별 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 의 복제 원점, oriP,
- 이.콜라이 내에서 상기 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 벡터 pUC18 의 복제 원점, 및
- 이.콜라이 내에 앰피실린 내성을 부여하는 β-락탐계 항생제 분해효소 (lactamase) 유전자.
mAb CCR5 κ-경쇄 유전자의 전사 단위는 하기 구성원으로 이루어진다 :
- 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 (immediate early) 인핸서 및 프로모터,
- 합성 5'-비번역 영역,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (신호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2 [L1-인트론-L2]),
- 5'-말단에 있는 독특한 BsmI 제한 부위 (L2 신호 서열) 및 3'-말단에 있는 스플라이스 공여자 부위 및 독특한 NotI 제한 부위와 함께 배열된 쥣과 항-CCR5 항체 성숙한 가변 κ-경쇄 암호화 분절,
- 인간/마우스 κ-경쇄 하이브리드 인트론 2,
- 인간 κ-경쇄 유전자 불변 도메인,
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열, 및
- 각각 5'- 및 3'-말단에 있는 독특한 제한 부위 AscI 및 FseI.
mAb CCR5 κ-경쇄 발현 벡터 4900 의 플라스미드 지도는 도 1 에 나타나 있다. 성숙한 (신호 서열 없는) mAb CCR5 κ-경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:63 에 나타나 있다.
b) 벡터 4991
벡터 4991 은 HEK293 세포 내에서 mAb CCR5 γ1-중쇄 (게놈적으로 조직된 발현 카세트 ; 엑손-인트론 조직화) 의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드이다.
mAb CCR5 γ1-중쇄 발현 카세트 외에도, 상기 벡터는 하기를 함유한다 :
- 선별 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 의 복제 원점, oriP,
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 벡터 pUC18 의 복제 원점, oriP, 및
- 이. 콜라이에 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락탐계 항생제 분해효소 유전자.
mAb CCR5 γ1-중쇄의 전사 단위는 하기 구성원으로 이루어진다 :
- 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 합성 5'-비번역 영역,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (신호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2 [L1-인트론-L2]),
- 5'-말단에 있는 독특한 BsmI 제한 부위 (L2 신호 서열) 및 3'-말단에 있는 스플라이스 공여자 부위 및 독특한 NotI 제한 부위와 함께 배열된 쥣과 항-CCR5 항체 성숙한 가변 중쇄 암호화 분절,
- 마우스 중쇄 인핸서 구성원 (부분 JH3, JH4) (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378) 을 포함하는 인간/마우스 중쇄 하이브리드 인트론 2,
- 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 도메인,
- 인간 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열, 및
- 각각 5'- 및 3'-말단에 있는 독특한 제한 부위 AscI 및 SgrAI.
mAb CCR5 γ1-중쇄 발현 벡터 4901 의 플라스미드 지도는 도 2 에 나타나 있다. 성숙한 (신호 서열 없는) mAb CCR5 γ1-중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:64 에 나타나 있다.
c) 벡터 4995
벡터 4995 는 HEK293 세포에서 키메라성 펩타이드-항-CCR5 항체 γ1-중쇄 컨쥬게이트 (게놈적으로 조직된 발현 카세트; 엑손-인트론 조직화) 의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드이다.
벡터 4995 는, mAb CCR5 γ1-중쇄가 항푸소제닉 펩타이드 T-2635 를 암호화하는 핵산 (SEQ ID NO:33) 및 펩타이드 링커 서열 [GQ4]3GNN (SEQ ID NO:40) 과 함께 C-말단에서 조인되도록 플라스미드 4991 로부터 유도된다.
키메라성 펩타이드 항-CCR5 항체 γ1 -중쇄 컨쥬게이트 발현 카세트 외에도, 상기 벡터는 하기를 함유한다 :
- 선별 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 의 복제 원점, oriP,
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 벡터 pUC18 의 복제 원점, oriP, 및
- 이. 콜라이에 앰피실린 내성을 부여하는 베타 (β)-락탐계 항생제 분해효소 유전자.
키메라성 펩타이드-항-CCR5 항체 γ1-중쇄 컨쥬게이트의 전사 단위는 하기 구성원으로 이루어진다 :
- 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 합성 5'-비번역 영역,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (신호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2 [L1-인트론-L2]),
- 5'-말단에 있는 독특한 BsmI 제한 부위 (L2 신호 서열) 및 3'-말단에 있는 스플라이스 공여자 부위 및 독특한 NotI 제한 부위와 함께 배열된 쥣과 항-CCR5 항체 성숙한 가변 중쇄 암호화 분절,
- 마우스 중쇄 인핸서 구성원 (부분 JH3, JH4) 을 포함하는 인간/마우스 중쇄 하이브리드 인트론 2 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378),
- 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 도메인,
- 항푸소제닉 펩타이드 T-2635,
- 펩타이드 링커 서열 [GQ4]3GNN,
- 인간 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열, 및
- 각각 5'- 및 3'-말단에 있는 독특한 제한 부위 AscI 및 SgrAI.
mAb CCR5 γ1-중쇄 컨쥬게이트 발현 벡터 4995 의 플라스미드 지도는 도 3 에 나타나 있다. 성숙한 (신호 서열 없는) 컨쥬게이트 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:65 에 나타나 있다.
실시예 2
최종 항- CCR5 항체 발현 플라스미드의 제조
mAb CCR5 유전자 분절을 포함하는 융합 유전자 (중쇄 및/또는 경쇄 항체 융합 유전자), 임의의 링커 유전자 분절 및 항푸소제닉 펩타이드 유전자 분절을 알려진 재조합 방법 및 기술을 사용해 해당 핵산 분절의 연결에 의해 어셈블리하였다. 펩타이드 링커 및 항푸소제닉 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 각각 화학 합성에 의해 합성한 다음, 증폭용 이. 콜라이 플라스미드에 연결하였다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
실시예 3
HEK293 EBNA 세포에서 면역글로불린 및 면역글로불린 변이체의 일시적인 발현
재조합 항-CCR5 항체 및 항-CCR5 항체-변이체는 10% 초-저 (ultra-low) IgG FCS (태아 소 혈청, Gibco), 2 mM 글루타민 (Gibco), 1% 부피 대 부피 (volume by volume) (v/v) 비필수 아미노산 (Gibco) 및 250 μg/ml G418 (Roche Molecular Biochemicals) 이 든 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) 에서 배양된 부착 성장형 HEK293-EBNA 세포 (엡스타인-바-바이러스 핵 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포주 293 ; American type culture collection 기탁 번호 ATCC # CRL-10852) 의 일시적인 트랜스펙션에 의해 생성하였다. 트랜스펙션을 위해, FuGENE™ 6 트랜스펙션 시약 (Roche Molecular Biochemicals) 을 시약 (㎕) 대 DNA (μg) 의 비율을 3:1 내지 6:1 의 범위로 사용하였다. 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트 경쇄 및 중쇄를 포함하는 경쇄 및 중쇄는 각각 플라스미드를 암호화하는 경쇄 대 중쇄의 몰 비를 1:2 내지 2:1 의 범위로 사용하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 세포 배양 상청액을 함유하는 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 트랜스펙션 후 4 내지 11 일째에 수합하였다. 예를 들어, HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 [Meissner, P. 등, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 나타나 있다.
실시예 4
면역글로불린 특이적 항체 컨쥬게이트를 사용한 SDS PAGE , 웨스턴 블로팅 트 랜스퍼 및 검출을 이용한 발현 분석
발현 및 분비된 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해 처리하 고, 분리된 항-CCR5-항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5-항체-컨쥬게이트 사슬을 젤로부터 막으로 옮기고, 이어서 면역학적 방법에 의해 검출하였다.
SDS - PAGE :
LDS 샘플 완충액, 4 배 농축물 (4x) : 4 g 글리세롤, 0.682 g TRIS-Base, 0.666 g TRIS-염산염, 0.8 g LDS (리튬 도데실 술페이트), 0.006 g EDTA (에틸렌 디아민 4산 (tetra acid)), 0.75 ml 의, 수 (water) 중 Serva Blue G250 1 중량% (w/w) 용액, 0.75 ml 의, 페놀 레드 1 중량% (w/w) 용액을 물에 첨가하여, 총 부피 10 ml 로 만들었다.
분비된 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트가 든 배양액을 원심분리하여, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 정화된 상청액의 분취물을 1/4 부피 (v/v) 의 4 x LDS 샘플 완충액 및 1/10 부피 (v/v) 의 0.5 M 1,4-디티오트레이톨 (DTT) 과 혼합하였다. 다음, 샘플을 70℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션시키고, SDS-PAGE 에 의해 단백질을 분리하였다. NuPAGE® Pre-Cast 젤 시스템 (Invitrogen) 을 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 특히, 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 젤 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MOPS 작동 완충액 (running 완충액) 을 사용하였다.
웨스턴 블롯 :
트랜스퍼 완충액 : 39 mM 글리신, 48 mM TRIS-염산염, 0.04 중량% (w/w) SDS, 및 20 부피% 메탄올 (v/v).
SDS-PAGE 후에, 분리된 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트 사슬 을 Burnette 의 "Semidry-Blotting-Method" (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203) 에 따라 니트로셀룰로스 여과막 (기공 크기 : 0.45 μm) 에 전기영동으로 옮겼다.
면역학적 검출 :
TBS-완충액 : 50 mM TRIS-염산염, 150 mM NaCl, pH 7.5 로 조정됨,
블라킹 용액 : TBS-완충액 중 1% (w/v) Western 블라킹 시약 (Roche Molecular Biochemicals),
TBST-완충액 : 0.05 부피% (v/v) Tween-20 이 든 1 x TBS-완충액
면역학적 검출을 위해, 웨스턴 블로팅 막을 TBS-완충액 내에서 실온에서 흔들면서 5 분 동안 2 회, 그리고 블라킹 용액 내에서 90 분 동안 1 회 인큐베이션시켰다.
펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트 사슬의 검출 :
중쇄 : 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트의 중쇄의 검출을 위해, 퍼옥시다제에 공액된 정제된 토끼 항-인간 IgG 항체를 사용하였다 (DAKO, Code No. P 0214).
경쇄 : 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트의 경쇄를 정제된 퍼옥시다제 공액된 토끼 항-인간 카파 경쇄 항체 (DAKO, Code No. P 0129) 를 사용하여 검출하였다.
항체 경쇄 및 중쇄의 시각화를 위해, 세정 및 블라킹된 웨스턴 블롯 막을 우선 10 ml 블라킹 용액 내에서 1:10,000 으로 희석시킨, 중쇄의 경우에는 퍼옥시다 제에 공액된 정제된 토끼 항-인간 IgG 항체와 함께, 또는 경쇄의 경우에는 정제된 퍼옥시다제 공액된 토끼 항-인간 카파 경쇄 항체와 함께 4℃ 에서 밤새 흔들면서 인큐베이션시켰다. 막을 실온에서 10 분 동안 TBTS-완충액으로 3 회, 그리고 TBS 완충액으로 1 회 세정한 후, 웨스턴-블롯 막을 화학발광을 생성하는 루미놀/퍼옥시드-용액으로 발색시켰다 (Lumi-LightPLUS Western blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals). 따라서, 막을 10 초 내지 5 분 동안 10 ml 루미놀/퍼옥시드-용액에서 인큐베이션시키고, 후에 방출된 빛을 LUMI-Imager F1 Analysator (Roche Molecular Biochemicals) 를 사용해 검출하고/거나, 또는 x-선 필름을 사용해 기록하였다. 스팟의 세기를 LumiAnalyst Software (Version 3.1) 를 사용해 정량화하였다.
면역블롯의 다중-염색 :
검출에 사용된 2 차 퍼옥시다제-표지된 항체 컨쥬게이트는 100 mM 베타-머캅토에탄올 및 20% (w/v) SDS 가 든 1 M TRIS-염산염-완충액 (pH 6.7) 내, 70℃ 에서 1 시간 동안 막을 인큐베이션시킴으로써 염색된 블롯으로부터 제거할 수 있다. 상기 처리 후, 블롯을 상이한 2 차 항체를 이용해 2 회째 염색시킬 수 있다. 두번째 검출 전에, 블롯을 TBS-완충액에서 각각 10 분 동안 흔들면서, 실온에서 3 회 세정한다.
실시예 5
펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트의 친화성 정제, 투석 및 농도
발현 및 분비된 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 공지된 방 법에 따라 단백질 A-세파로스™ CL-4B (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden) 를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게는, 원심분리 (10,000 g 에서 10 분 동안) 및 0.45 μm 필터를 통한 여과 후에, 펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트 함유 정화된 배양 상청액을 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화시킨 단백질 A-세파로스™ CL-4B 칼럼에 놓았다. 비결합된 단백질을 PBS 평형화 완충액 및 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 5.5 으로 세정하였다. 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 3.0 으로 용출하고, 컨쥬게이트 함유 분획을 1 M TRIS-Base 로 중화시켰다. 다음, 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 4℃ 에서 PBS 완충액에 대해 광범위하게 투석시키고, Biomax-SK 막을 갖춘 Ultrafree®-CL Centrifugal Filter Unit (Millipore Corp., USA) 을 사용해 농축시키고, 0℃, 얼음-수조에서 보관하였다. 컨쥬게이트의 본래상태 (integrity) 를 환원제의 존재 및 부재 하에 SDS-PAGE 에 의해 분석하고, 실시예 4 에서 기술된 바와 같이 코마시 블루 (Coomassie brilliant blue) 를 사용해 염색하였다. 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트의 응집을 분석 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
실시예 6
펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트의 탈글리코실화
항-CCR5 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트의 N-연결 탄 수화물을 펩타이드-N-글리코시다제 F (PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany 또는 Prozyme, San Leandro, CA) 를 사용한 효소 처리에 의해 절단하였다. 따라서, 항-CCR5 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 약 2 mg/ml 의 단백질 농도에서, PBS 완충액 중 N-글리코실화된 단백질 mg 당 50 mU PNGaseF 를 사용하여 37℃ 에서 12 ~ 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 펩타이드-N-글리코시다제 F 를 공지된 방법에 따라 제조 젤 여과에 의해 분리하였다. 간략하게는, PNGaseF 처리된 항-CCR5-항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트를 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화시킨 Superose™ 12 10/300 GL 칼럼 (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden) 상에 놓은 다음, 및 Amersham Bioscience (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden) 사의 Akta 익스플로러 크로마토그래피 시스템을 사용하여 0.5 ~ 1.0 ml/분의 유속에서 평형화 완충액을 사용해 용출하였다.
실시예 7
단일-주기 항바이러스 활성 어세이
슈도유형 (pseudotyped) NL-Bal 바이러스의 제조를 위해, 플라스미드 pNL4-3Δenv (env 유전자 내 소실이 있는 HIV pNL4-3 게놈 구축물) 및 pCDNA3.1/NL-BAL env [NL-BaI env 유전자를 함유하는 pcDNA3.1 플라스미드 (AIDS 시약에 대한 NIBSC Centralized Facility 에서 수득함)] 를 HEK 293FT 세포주 (Invitrogen) 에 공동- 트랜스펙션시키고, 10% 태아 소 혈청 (FCS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.5 mg/mL 제니티신 (모든 배지는 Invitrogen/Gibco 사의 것임) 이 든 Dulbecco's modified minimum medium (DMEM) 에서 배양하였다. 슈도유형 바이러스를 함유하는 상청액을 트랜스펙션 후 2 일째에 수합하고, 세포 찌꺼기를 0.45 μm 의 기공 크기 PES (폴리에테르술폰) 필터 (Nalgene) 를 통한 여과에 의해 제거하고, -80℃ 에서 분취물 형태로 보관하였다. 어세이 수행에서의 정상화를 위해, 바이러스 보관 분취물을 사용하여, JC53-BL (US NIH Aids 시약 프로그램) 세포를 감염시켜, 웰 당 대략 1.5 x 105 RLU (상대 광 단위 (relative light unit)) 를 수득하였다. 테스트 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트, 대조군 항체 및 대조군 항푸소제닉 펩타이드 (T-20, T-1249, T-651 및 T-2635) 를 96-웰 플레이트에서 단계 희석시켰다. 어세이는 4 벌 중복 수행하였다. 각각의 플레이트에는 세포 대조군 및 바이러스 대조군 웰이 함유되었다. 바이러스 원료 1.5 x 105 RLU 당량을 각각의 웰에 첨가한 다음, 2.5 x 104 JC53-BL 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 최종 어세이 부피가 웰 당 200 ㎕ 가 되게 하였다. 37℃, 90% 상대 습도, 및 5% CO2 에서 3 일 동안 인큐베이션시킨 후에, 배지를 흡입하고, 50 ㎕ 의 Steady-Glo® 루시퍼라제 어세이 시스템 (Promega) 을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션시킨 후, 어세이 플레이트를 휘도계 (Luminometer) (Luminoskan, Thermo Electron Corporation) 상에서 판독하였다. 루시퍼라제 활성 억제 % 를 배경을 감한 후 각각의 투여점에 대해 계산하고, IC5O 및 IC90-값을 Excel 용 XLfit 커브 피팅 소프트웨어 (version 3.0.5 Buildl2; Microsoft) 를 사용해 측정하였다. 결과를 표 3 에 나타내었다.
항푸소제닉 폴리펩타이드, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CCR5 항체 컨쥬게이트의 항바이러스 활성
화합물 항바이러스 활성
IC50 (ng/mL) IC90 (ng/mL)
대조군 항체 1 (불활성) 불활성 불활성
대조군 항체 2 (불활성) 불활성 불활성
T-20 206 3955
T-1249 11 90
T-651 11 139
T-2635 14 161
mAb CCR5 (4901/4900) 114 2387
키메라성 펩타이드 mAb CCR5 컨쥬게이트 (4995/4900) 7 45
실시예 8
세포-세포 융합 어세이
제 1 일에, gp160-발현 HeLa 세포 (2 x 104 세포/50 ㎕/웰) 를 10% FCS 및 2μg/ml 독시사이클린이 든 DMEM 배지에서 백색 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 심었다. 제 2 일에, 웰 당 상청액 샘플 또는 항체 대조군 100 ㎕ 를 투명한 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 다음, 배지에 8 x 104 CEM-NKr-Luc 현탁액 세포를 함유하는 100 ㎕ 를 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. HeLa 세포 배양 배지를 96 웰 플레이트로부터 흡입하고, 200 ㎕ 항체/CEM-NKr-Luc 혼합물 중 100 ㎕ 를 첨가하고, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 제 3 일에, 100 ㎕/웰 Bright-Glo™ 루시퍼라제 어세이 기질 (1,4-디티오트레이톨 및 나트륨 디티오나이트 ; Promega Corp., USA) 을 첨가하고, 발광을 실온에서 최소 15 분 인큐베이션시킨 후 측정하였다.
재료 :
HeLa-R5-16 세포 (독시사이클린 유도 시 HIV gp160 을 발현하기 위한 세포주) 를 400 μg/ml G418 및 200 μg/ml 하이그로마이신 B 가 있는 10% FCS 및 영양분이 든 DMEM 배지에서 배양하였다. CEM.NKR-CCR5-LUC (카탈로그 번호 : 5198, NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA 에서 구입가능한 T-세포주). 세포 유형 : CEM.NKR-CCR5 (Cat. #4376) 를 트랜스펙션시켜 (전기천공법), HIV-2 LTR 의 전사 조건 하에 루시퍼라제 유전자를 발현시키고, 10% 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 (100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신), 및 0.8 mg/ml 제니티신 술페이트 (G418) 가 든 RPMI 1640 에서 증식시켰다. 성장 특징 : 둥근 림프구 세포, 모양이 매우 다양하지는 않다. 세포는 단일 세포로서 현탁액 내에서 성장하고, 작은 덩어리를 형성할 수 있다. 매주 2 회 1 : 10 으로 분할한다. 특별한 특징 : HIV-2 LTR 의 상호활성화 후에 루시퍼라제 활성을 발현한다. 중성화 및 약물-민감도 어세이를 위해 1 차 HIV 단리물로 감염시키기에 적합하다 (Spenlehauer, C, 등, Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., 등, J. Virol. 73 (1999) 8966- 8974). 세포주를 [NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH from Drs. John Moore 및 Catherine Spenlehauer] 를 통해 수득하였다. Bright-Glo™ 루시퍼라제 어세이 완충액 (Promega Corp. USA, Part No E2264B), Bright-Glo™, 루시퍼라제 어세이 기질 (Promega Corp. USA, part No EE26B).
실시예 9
말초 혈액 단핵구 세포 ( PBMC ) 에서의 항바이러스 활성 어세이 .
제조업자의 프로토콜에 따라, 피콜-플라크 (Ficoll-Paque) (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA) 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 PBMC 를 연막 (스탠포드 혈액 센터에서 수득하였음) 으로부터 단리하였다. 간략하게는, 혈액을 50 ml 코니칼 튜브 내 연막에서 옮기고 멸균 Dulbecco's 인산염 완충 식염수 (Invitrogen/Gibco) 에서 희석시켜, 최종 부피가 50 ml 이 되게 하였다. 희석된 혈액 중 25 ml 을 2 개의 50 ml 코니칼 튜브에 옮기고, 12.5 ml 의 피콜-플라크 플러스 (Amersham Biosciences) 와 함께 조심스럽게 하층에 있게 하고, 450 x g 에서 멈추지 않고 실온에서 20 분 동안 원심분리하였다. 백색 세포층을 조심스럽게 새 50 ml 코니칼 튜브에 옮기고, PBS 로 2 회 세정하였다. 남은 적혈구 세포를 제거하기 위해, 세포를 실온에서 5 분 동안 ACK 파쇄 완충액 (Biosource) 과 함께 인큐베이션시키고, PBS 로 1 회 이상 세정하였다. PBMC 의 수를 계수하고, 10% FCS (Invitrogen/Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨-피루베이트, 및 2 μg/ml 피토헤마글루티닌 (Invitrogen) 이 든 RPMI1640 에서 2 ~ 4 x 1O6 세포/ml 의 농도로 37℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 어세이 전에, 세포를 5 유닛/ml 인간 IL-2 (Roche Molecular Biochemicals) 와 함께 최소 48 시간 동안 인큐베이션시켰다. 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서, 1 x 105 PBMC 를 단계 희석된 테스트 펩타이드-면역글로불린-컨쥬게이트, 대조군 면역글로불린 및 대조군 펩타이드 (T-20, T-1249, T-651 및 T-2635) 의 존재 하에, HIV-1 JR-CSF 바이러스로 감염시켰다 (Koyanagi, Y., 등, Science 236 (1987) 819-822). 사용된 바이러스의 양은 1.2 ng HIV-1 p24 항원/웰에 당량이었다. 감염은 4 벌 중복으로 하였다. 플레이트를 37℃ 에서 6 일 동안 인큐베이션시켰다. 바이러스 생성은 p24 ELISA (HIV-1 p24 ELISA #NEK050B, Perkin Elmer/NEN) 를 사용하여 감염 종료 시에, 마이크로소프트 엑셀 피트 (Microsoft Excel Fit (버전 3.0.5 Build 12; equation 205; Microsoft)) 에서 하나의 결합 부위와 S 자형 투여량-반응 모델을 사용하여 측정하였다.
실시예 10
항- CD4 항체 발현 플라스미드의 제조
항-CD4 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 인간 카파-경쇄 불변 도메인 (CL) 을 암호화하는 유전자 분절을 항-CD4 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 인간 γ1-중쇄 불변 도메인 (CH1-힌지-CH2-CH3) 에 대한 유전자 분절과 마찬가지로 조인하였다.
SEQ ID NO:71/72 의 mAb CD4 의 경우, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 예를 들어, [Reimann, K.A., 등, Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943] 또는 US 5,871,732 에서 기술된 바와 같이 인간화된 마우스 항체로부터 유도하였고, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 인간 항체 (C-카파 및 IgG1) 로부터 유도하였다.
이어서, 완전한 항-CD4 항체 경쇄를 암호화하는 유전자 분절을 연결부 링커 서열을 포함하여 항푸소제닉 펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 N- 및/또는 C-말단에 조인하였고/거나, 또는 완전한 항-CD4 항체 중쇄를 암호화하는 유전자 분절을 연결부 링커 서열을 포함하여 항푸소제닉 펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 N- 및/또는 C-말단에 조인하였다.
a) 벡터 6310
벡터 6310 은 발현 플라스미드, 예를 들어, HEK293 세포에서 mAb CD4 경쇄 (게놈적으로 조직된 발현 카세트; 엑손-인트론 조직화) 를 일시적으로 발현시키기 위한 발현 플라스미드이다.
mAb CD4 κ-경쇄 발현 카세트 외에도, 상기 벡터는 하기를 함유한다 :
- 선별 마커로서 네오마이신 내성 유전자,
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 벡터 pUC18 의 복제 원점, 및
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 β-락탐계 항생제 분해효소 유전자.
mAb CD4 κ-경쇄 유전자의 전사 단위는 하기 구성원으로 이루어진다 :
- 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 항체 생식선 유전자의 5'-비번역 영역,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (신호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2 [Ll-인트론-L2]),
- 스플라이스 공여자 부위 및 3'-말단에 있는 독특한 BamHI 제한 부위와 배열된 인간화된 항-CD4 항체 성숙한 가변 κ-경쇄 암호화 분절,
- 절단된 인간 κ-경쇄 인트론 2,
- 인간 κ-경쇄 유전자 불변 도메인,
- 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열, 및
- 3'-말단에 있는 독특한 제한 부위 AscI 및 SgrAI.
mAb CD4 κ-경쇄 발현 벡터 6310 의 플라스미드 지도는 도 4 에 나타내었다. 성숙한 (신호 서열 없는) mAb CD4 κ-경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 71 에 나타나 있다.
b) 벡터 6309
벡터 6309 는 예를 들어, HEK293 세포에서 mAb CD4 γ1-중쇄 (게놈적으로 조직된 발현 카세트; 엑손-인트론 조직화) 를 일시적으로 발현시키기 위한 발현 플라스미드이다.
mAb CD4 γ1-중쇄 발현 카세트 외에도, 상기 벡터는 하기를 함유한다 :
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드가 복제될 수 있게 하는 벡터 pUC18 의 복제 원점, 및
- 이. 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락탐계 항생제 분해효소 유전자.
mAb CD4 γ1-중쇄의 전사 단위는 하기 구성원으로 이루어진다 :
- 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 항체 생식선 유전자의 5'-비번역 영역,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (신호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2 [Ll-인트론-L2]),
- 3'-말단에 있는 스플라이스 공여자 부위 및 독특한 XhoI 제한 부위와 배열된 인간화된 항-CD4 항체 성숙한 가변 중쇄 암호화 분절,
- 마우스/인간 중쇄 하이브리드 인트론 2,
- L234A 및 L235A 돌연변이를 함유하는 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 도메인,
- 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열, 및
- 3'-말단에 있는 독특한 제한 부위 SgrAI.
mAb CD4 γ1-중쇄 발현 벡터 6309 의 플라스미드 지도는 도 3 에 나타나 있다. 성숙한 (신호 서열 없는) mAb CD4 γ1-중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 72 에 나타나 있다.
c) 벡터 6303
벡터 6303 은 예를 들어, HEK293 세포에서 키메라성 펩타이드-항-CD4 항체 γ1-중쇄 컨쥬게이트 (게놈적으로 조직된 발현 카세트; 엑손-인트론 조직화) 를 일시적으로 발현시키기 위한 발현 플라스미드이다.
벡터 6303 은 mAb CD4 γ1-중쇄를 하나의 C-말단 아미노산을 제외하고, 즉, 중쇄의 C-말단 리신 잔기를 제거하는 식으로 마지막 아미노산에 조인하여 벡터 6309 으로부터 유도하였으며, 상기 벡터에는 항푸소제닉 펩타이드 afp-1 을 암호화하는 핵산 (SEQ ID NO:73) 및 SEQ ID NO:69 의 펩타이드 글리신-세린 링커가 있었다.
키메라성 펩타이드 항-CD4 항체 γ1-중쇄 컨쥬게이트 발현 카세트 외에도, 상기 벡터는 하기를 함유한다 :
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드를 복제할 수 있게 하는 벡터 pUC18 의 복제 원점, oriP, 및
- 이. 콜라이에 앰피실린 내성을 부여하는 베타(β)-락탐계 항생제 분해효소 유전자.
키메라성 펩타이드-항-CD4 항체 γ1-중쇄 컨쥬게이트의 전사 단위는 하기 구성원으로 이루어진다 :
- 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 인간 항체 생식선 유전자의 5'-비번역 영역,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (신호 서열 1, 인트론, 신호 서열 2 [L1-인트론-L2]),
- 스플라이스 공여자 부위 및 3'-말단에 있는 독특한 XhoI 제한 부위와 배열된 인간화된 항-CD4 항체 성숙한 가변 중쇄 암호화 분절,
- L234A 및 L235A 돌연변이를 함유하는 마우스/인간 중쇄 하이브리드 인트론,
- SEQ ID NO:69 의 펩타이드 세린-글리신 링커 서열,
- SEQ ID NO:73 의 항푸소제닉 펩타이드 afp-1,
- 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열, 및
- 3'-말단에 있는 독특한 제한 부위 SgrAI.
mAb CD4 γ1-중쇄 컨쥬게이트 발현 벡터 6303 의 플라스미드 지도는 도 6 에 나타나 있다. 성숙한 (신호 서열 없는) 컨쥬게이트 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:74 에 나타나 있다.
실시예 11
최종 항- CD4 항체 발현 플라스미드의 제조
mAb CD4 유전자 분절, 임의의 링커 유전자 분절 및 항푸소제닉 펩타이드 유전자 분절을 포함하는 융합 유전자 (중쇄 및/또는 경쇄 항체 융합 유전자) 를 해당 핵산 분절의 연결에 의해, 알려진 재조합 방법 및 기술을 사용해 어셈블리하였다. 펩타이드 링커 및 항푸소제닉 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 각각 화학 합성에 의해 합성한 다음, 증폭용 이.콜라이 플라스미드에 연결하였다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
실시예 12
HEK293 EBNA 세포에서의 면역글로불린 및 면역글로불린 변이체의 일시적인 발현
재조합 항-CD4 항체 및 항-CD4 항체-변이체는 10% 초-저 (ultra-low) IgG FCS (태아 소 혈청, Gibco), 2 mM 글루타민 (Gibco), 1% 부피 대 부피 (volume by volume) (v/v) 비필수 아미노산 (Gibco) 및 250 μg/ml G418 (Roche Molecular Biochemicals) 이 든 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) 에서 배양된 부착 성장형 HEK293-EBNA 세포 (엡스타인-바-바이러스 핵 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포주 293 ; American type culture collection 기탁 번호 ATCC # CRL-10852) 의 일시적인 트랜스펙션에 의해 생성하였다. 트랜스펙션을 위해, FuGENE™ 6 트랜스펙션 시약 (Roche Molecular Biochemicals) 을 시약 (㎕) 대 DNA (μg) 의 비율을 3:1 내지 6:1 의 범위로 사용하였다. 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트 경쇄 및 중쇄를 포함하는 경쇄 및 중쇄는 각각 플라스미드를 암호화하는 경쇄 대 중쇄의 몰 비를 1:2 내지 2:1 의 범위로 사용하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 세포 배양 상청액을 함유하는 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 트랜스펙션 후 4 내지 11 일째에 수합하였다. 예를 들어, HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 [Meissner, P. 등, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 나타나 있다.
실시예 13
면역글로불린 특이적 항체 컨쥬게이트를 사용한 SDS PAGE , 웨스턴 블로팅 트 랜스퍼 및 검출을 이용한 발현 분석
발현 및 분비된 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해 처리하고, 분리된 항-CD4-항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4-항체-컨쥬게이트 사슬을 젤로부터 막으로 옮기고, 이어서 면역학적 방법에 의해 검출하였다.
SDS - PAGE :
LDS 샘플 완충액, 4 배 농축물 (4x) : 4 g 글리세롤, 0.682 g TRIS-Base, 0.666 g TRIS-염산염, 0.8 g LDS (리튬 도데실 술페이트), 0.006 g EDTA (에틸렌 디아민 4산 (tetra acid), 0.75 ml 의, 수 (water) 중 Serva Blue G250 1 중량% (w/w) 용액, 0.75 ml 의, 페놀 레드 1 중량% (w/w) 용액을 물에 첨가하여, 총 부피 10 ml 로 만들었다.
분비된 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트가 든 배양액을 원심분리하여, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 정화된 상청액의 분획물을 1/4 부피 (v/v) 의 4 x LDS 샘플 완충액 및 1/10 부피 (v/v) 의 0.5 M 1,4-디티오트레이톨 (DTT) 과 혼합하였다. 다음, 샘플을 70℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션시키고, SDS-PAGE 에 의해 단백질을 분리하였다. NuPAGE® Pre-Cast 젤 시스템 (Invitrogen) 을 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 특히, 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 젤 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MOPS 작동 완충액 (running 완충액) 을 사용하였다.
웨스턴 블롯 :
트랜스퍼 완충액 : 39 mM 글리신, 48 mM TRIS-염산염, 0.04 중량% (w/w) SDS, 및 20 부피% 메탄올 (v/v).
SDS-PAGE 후에, 분리된 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트 사슬을 Burnette 의 "Semidry-Blotting-Method" (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203) 에 따라 니트로셀룰로스 여과막 (기공 크기 : 0.45 μm) 에 전기영동으로 옮겼다.
면역학적 검출 :
TBS-완충액 : 50 mM TRIS-염산염, 150 mM NaCl, pH 7.5 로 조정됨,
블라킹 용액 : TBS-완충액 중 1% (w/v) Western 블라킹 시약 (Roche Molecular Biochemicals),
TBST-완충액 : 0.05 부피% (v/v) Tween-20 이 든 1 x TBS-완충액
면역학적 검출을 위해, 웨스턴 블로팅 막을 TBS-완충액 내에서 실온에서 흔들면서 5 분 동안 2 회, 그리고 블라킹 용액 내에서 90 분 동안 1 회 인큐베이션시켰다.
펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트 사슬의 검출 :
중쇄 : 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 중쇄의 검출을 위해, 퍼옥시다제에 공액된 정제된 토끼 항-인간 IgG 항체를 사용하였다 (DAKO, Code No. P 0214).
경쇄 : 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 경쇄를 정제된 퍼옥시다제 공액된 토끼 항-인간 카파 경쇄 항체 (DAKO, Code No. P 0129) 를 사용하여 검출하였다.
항체 경쇄 및 중쇄의 시각화를 위해, 세정 및 블라킹된 웨스턴 블롯 막을 우선 10 ml 블라킹 용액 내에서 1:10,000 으로 희석시킨, 중쇄의 경우에는 퍼옥시다제에 공액된 정제된 토끼 항-인간 IgG 항체와 함께, 또는 경쇄의 경우에는 정제된 퍼옥시다제 공액된 토끼 항-인간 카파 경쇄 항체와 함께 4℃ 에서 밤새 흔들면서 인큐베이션시켰다. 막을 실온에서 10 분 동안 TBTS-완충액으로 3 회, 그리고 TBS 완충액으로 1 회 세정한 후, 웨스턴-블롯 막을 화학발광을 생성하는 루미놀/퍼옥시드-용액으로 발색시켰다 (Lumi-LightPLUS Western blotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals). 따라서, 막을 10 초 내지 5 분 동안 10 ml 루미놀/퍼옥시드-용액에서 인큐베이션시키고, 후에 방출된 빛을 LUMI-Imager F1 Analysator (Roche Molecular Biochemicals) 를 사용해 검출하고/거나, 또는 x-선 필름을 사용해 기록하였다. 스팟의 세기를 LumiAnalyst Software (Version 3.1) 를 사용해 정량화하였다.
면역블롯의 다중-염색 :
검출에 사용된 2 차 퍼옥시다제-표지된 항체 컨쥬게이트는 100 mM 베타-머캅토에탄올 및 20% (w/v) SDS 가 든 1 M TRIS-염산염-완충액 (pH 6.7) 내, 70℃ 에서 1 시간 동안 막을 인큐베이션시킴으로써 염색된 블롯으로부터 제거할 수 있다. 상기 처리 후, 블롯을 상이한 2 차 항체를 이용해 2 회째 염색시킬 수 있다. 두번째 검출 전에, 블롯을 TBS-완충액에서 각각 10 분 동안 흔들면서, 실온에서 3 회 세정한다.
실시예 14
펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트의 친화성 정제, 투석 및 농도
발현 및 분비된 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 공지된 방법에 따라 단백질 A-세파로스™ CL-4B (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden) 를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게는, 원심분리 (10,000 g 에서 10 분 동안) 및 0.45 μm 필터를 통한 여과 후에, 펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트 함유 정화된 배양 상청액을 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화시킨 단백질 A-세파로스™ CL-4B 칼럼에 놓았다. 비결합된 단백질을 PBS 평형화 완충액 및 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 5.5 으로 세정하였다. 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 3.0 으로 용출하고, 컨쥬게이트 함유 분획을 1 M TRIS-Base 로 중화시켰다. 다음, 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 4℃ 에서 PBS 완충액에 대해 광범위하게 투석시키고, Biomax-SK 막을 갖춘 Ultrafree®-CL Centrifugal Filter Unit (Millipore Corp., USA) 을 사용해 농축시키고, 0℃, 얼음-수조에서 보관하였다. 컨쥬게이트의 본래 상태 (integrity) 를 환원제의 존재 및 부재 하에 SDS-PAGE 에 의해 분석하고, 실시예 13 에서 기술된 바와 같이 코마시 블루 (Coomassie brilliant blue) 를 사용해 염색하였다. 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 응집을 분석 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
실시예 15
펩타이드 면역글로불린 컨쥬게이트의 탈글리코실화
항-CD4 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 N-연결 탄수화물을 펩타이드-N-글리코시다제 F (PNGaseF, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany 또는 Prozyme, San Leandro, CA) 를 사용한 효소 처리에 의해 절단하였다. 따라서, 항-CD4 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 약 2 mg/ml 의 단백질 농도에서, PBS 완충액 중 N-글리코실화된 단백질 mg 당 50 mU PNGaseF 를 사용하여 37℃ 에서 12 ~ 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 펩타이드-N-글리코시다제 F 를 공지된 방법에 따라 제조 젤 여과에 의해 분리하였다. 간략하게는, PNGaseF 처리된 항-CD4-항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트를 PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화시킨 Superose™ 12 10/300 GL 칼럼 (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden) 상에 놓은 다음, 및 Amersham Bioscience (GE Healthcare former Amersham Bioscience, Sweden) 사의 Akta 익스플로러 크로마토그래피 시스템을 사용하여 0.5 ~ 1.0 ml/분의 유속에서 평형화 완충액을 사용해 용출하였다.
실시예 16
단일-주기 항바이러스 활성 어세이
슈도유형 (pseudotyped) NL-Bal 바이러스의 제조를 위해, 플라스미드 pNL4-3Δenv (env 유전자 내 소실이 있는 HIV pNL4-3 게놈 구축물) 및 pCDNA3.1/NL-BAL env [NL-Bal env 유전자를 함유하는 pcDNA3.1 플라스미드 (AIDS 시약에 대한 NIBSC Centralized Facility 에서 수득함)] 를 HEK 293FT 세포주 (Invitrogen) 에 공동-트랜스펙션시키고, 10% 태아 소 혈청 (FCS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.5 mg/mL 제니티신 (모든 배지는 Invitrogen/Gibco 사의 것임) 이 든 Dulbecco's modified minimum medium (DMEM) 에서 배양하였다. 슈도유형 바이러스를 함유하는 상청액을 트랜스펙션 후 2 일째에 수합하고, 세포 찌꺼기를 0.45 μm 의 기공 크기 PES (폴리에테르술폰) 필터 (Nalgene) 를 통한 여과에 의해 제거하고, -80℃ 에서 분취물 형태로 보관하였다. 어세이 수행에서의 정상화를 위해, 바이러스 보관 분취물을 사용하여, JC53-BL (US NIH Aids 시약 프로그램) 세포를 감염시켜, 웰 당 대략 1.5 x 105 RLU (상대 광 단위 (relative light unit)) 를 수득하였다. 테스트 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트, 모 항-CD4 항체, 대조군 항체 및 대조군 항푸소제닉 펩타이드 (T-651) 를 96-웰 플레이트에서 단계 희석시켰다. 어세이는 4 벌 중복 수행하였다. 각각의 플레이트에는 세포 대조군 및 바이러스 대조군 웰이 함유되었다. 바이러스 원료 1.5 x 105 RLU 당량을 각각의 웰에 첨가한 다음, 2.5 x 104 JC53-BL 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 최종 어세이 부피가 웰 당 200 ㎕ 가 되게 하였다. 37℃, 90% 상대 습도, 및 5% CO2 에서 3 일 동안 인큐베이션시킨 후에, 배지를 흡입하고, 50 ㎕ 의 Steady-Glo® 루시퍼라제 어세이 시스템 (Promega) 을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션시킨 후, 어세이 플레이트를 휘도계 (Luminometer) (Luminoskan, Thermo Electron Corporation) 상에서 판독하였다. 루시퍼라제 활성 억제 % 를 배경을 감한 후 각각의 투여점에 대해 계산하고, IC5O 및 IC90-값을 Excel 용 XLfit 커브 피팅 소프트웨어 (version 3.0.5 Buildl2; Microsoft) 를 사용해 측정하였다. 결과를 각각 표 4 및 5 에 나타내었다.
항푸소제닉 폴리펩타이드, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 항바이러스 활성 (중량으로)
화합물 항바이러스 활성
NL-BAL (R5) NL-4-3 (X4)
IC50 (ng/mL)/ IC90 (ng/mL) IC50 (ng/mL)/ IC90 (ng/mL)
대조군 항체 1 (불활성) 불활성/불활성 불활성/불활성
대조군 항체 2 (불활성) 불활성/불활성 불활성/불활성
T-651 21.5/181.9 169.2/1099.7
mAb CD4 (6310/6309) 최대 억제 = 50% 최대 억제 = 20%
항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트 (6310/6303) 6.1/32.2 43.9/123.9
항푸소제닉 폴리펩타이드, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 항바이러스 활성 (몰농도로)
화합물 항바이러스 활성
NL-BAL (R5) NL-4-3 (X4)
IC50 (nM)/ IC90 (nM) IC50 (nM)/ IC90 (nM)
대조군 항체 1 (불활성) 불활성/불활성 불활성/불활성
대조군 항체 2 (불활성) 불활성/불활성 불활성/불활성
T-651 5.4/45 42/275
mAb CD4 (6310/6309) 최대 억제 = 50% 최대 억제 = 20%
항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트 (6310/6303) 0.038/0.201 0.275/0.774
실시예 17
세포-세포 융합 어세이
제 1 일에, gp160-발현 HeLa 세포 (2 x 104 세포/50 ㎕/웰) 를 10% FCS 및 2μg/ml 독시사이클린이 든 DMEM 배지에서 백색 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 심었다. 제 2 일에, 웰 당 상청액 샘플 또는 항체 대조군 100 ㎕ 를 투명한 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. 다음, 배지에 8 x 104 CEM-NKr-Luc 현탁액 세포를 함유하는 100 ㎕ 를 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. HeLa 세포 배양 배지를 96 웰 플레이트로부터 흡입하고, 200 ㎕ 항체/CEM-NKr-Luc 혼합물 중 100 ㎕ 를 첨가하고, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 제 3 일에, 100 ㎕/웰 Bright-Glo™ 루시퍼라제 어세이 기질 (1,4-디티오트레이톨 및 나트륨 디티오나이트 ; Promega Corp., USA) 을 첨가하고, 발광을 실온에서 최소 15 분 인큐베이션시킨 후 측정하였다.
재료 :
HeLa-R5-16 세포 (독시사이클린 유도 시 HIV gp160 을 발현하기 위한 세포주) 를 400 μg/ml G418 및 200 μg/ml 하이그로마이신 B 가 있는 10% FCS 및 영양분이 든 DMEM 배지에서 배양하였다. CEM.NKR-CD4-LUC (카탈로그 번호 : 5198, NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA 에서 구입가능한 T-세포주). 세포 유형 : CEM.NKR-CD4 (Cat. #4376) 를 트랜스펙션시켜 (전기천공법), HIV-2 LTR 의 전사 조건 하에 루시퍼라제 유전자를 발현시키고, 10% 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 (100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신), 및 0.8 mg/ml 제니티신 술페이트 (G418) 가 든 RPMI 1640 에서 증식시켰다. 성장 특징 : 둥근 림프구 세포, 모양이 매우 다양하지는 않다. 세포는 단일 세포로서 현탁액 내에서 성장하고, 작은 덩어리를 형성할 수 있다. 매주 2 회 1 : 10 으로 분할한다. 특별한 특징 : HIV-2 LTR 의 상호활성화 후에 루시퍼라제 활성을 발현한다. 중성화 및 약물-민감도 어세이를 위해 1 차 HIV 단리물로 감염시키기에 적합하다 (Spenlehauer, C, 등, Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., 등, J. Virol. 73 (1999) 8966- 8974). 세포주를 [NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH from Drs. John Moore 및 Catherine Spenlehauer] 를 통해 수득하였다. Bright-Glo™ 루시퍼라제 어세이 완충액 (Promega Corp. USA, Part No E2264B), Bright-Glo™, 루시퍼라제 어세이 기질 (Promega Corp. USA, part No EE26B).
실시예 18
말초 혈액 단핵구 세포 ( PBMC ) 에서의 항바이러스 활성 어세이 .
제조업자의 프로토콜에 따라, 피콜-플라크 (Ficoll-Paque) (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA) 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 PBMC 를 연막 (스탠포드 혈액 센터에서 수득하였음) 으로부터 단리하였다. 간략하게는, 혈액을 50 ml 코니칼 튜브 내 연막에서 옮기고 멸균 Dulbecco's 인산염 완충 식염수 (Invitrogen/Gibco) 에서 희석시켜, 최종 부피가 50 ml 이 되게 하였다. 희석된 혈액 중 25 ml 을 2 개의 50 ml 코니칼 튜브에 옮기고, 12.5 ml 의 피콜-플라크 플러스 (Amersham Biosciences) 를 사용해 조심스럽게 하층에 있게 하고, 450 x g 에서 멈추지 않고 실온에서 20 분 동안 원심분리하였다. 백색 세포층을 조심스럽게 새 50 ml 코니칼 튜브에 옮기고, PBS 로 2 회 세정하였다. 남은 적혈구 세포를 제거하기 위해, 세포를 실온에서 5 분 동안 ACK 파쇄 완충액 (Biosource) 과 함께 인큐베이션시키고, PBS 로 1 회 이상 세정하였다. PBMC 의 수를 계수하고, 10% FCS (Invitrogen/Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨-피루베이트, 및 2 μg/ml 피토헤마글루티닌 (Invitrogen) 이 든 RPMI1640 에서 2 ~ 4 x 1O6 세포/ml 의 농도로 37℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 어세이 전에, 세포를 5 유닛/ml 인간 IL-2 (Roche Molecular Biochemicals) 와 함께 최소 48 시간 동안 인큐베이션시켰다. 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서, 1 x 105 PBMC 를 단계 희석된 테스트 항푸소제닉 펩타이드-항 CD-4 항체-컨쥬게이트, 대조군 면역글로불린, 모 항-CD4 항체 및 대조군 펩타이드 (T-651) 의 존재 하에, HIV-1 JR-CSF 바이러스로 감염시켰다 (Koyanagi, Y., 등, Science 236 (1987) 819-822). 사용된 바이러스의 양은 1.2 ng HIV-1 p24 항원/웰에 당량이었다. 감염은 4 벌 중복으로 하였다. 플레이트를 37℃ 에서 6 일 동안 인큐베이션시켰다. 바이러스 생성은 p24 ELISA (HIV-1 p24 ELISA #NEK050B, Perkin Elmer/NEN) 를 사용하여 감염 종료 시에, 마이크로소프트 엑셀 피트 (Microsoft Excel Fit (버전 3.0.5 Build 12; equation 205; Microsoft)) 에서 하나의 결합 부위와 S 자형 투여량-반응 모델을 사용하여 측정하였다.
항푸소제닉 폴리펩타이드, 항체 및 항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트의 항바이러스 활성 (중량으로)
화합물 항바이러스 활성
NL-BAL NL-4-3
IC50 (ng/mL)/ IC90 (ng/mL) IC50 (ng/mL)/ IC90 (ng/mL)
대조군 항체 1 (불활성) 불활성/불활성 불활성/불활성
대조군 항체 2 (불활성) 불활성/불활성 불활성/불활성
T-651 14.1/57.8 41.4/79.6
mAb CD4 (6310/6309) 917.6/최대 54% 억제 35.6/1117.0
항푸소제닉 펩타이드-항-CD4 항체 컨쥬게이트 (6310/6303) 5.3/18.2 3.2/25.1
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide <130> 23883 WO <150> EP 06017156.8 <151> 2006-08-17 <150> EP 07014335.9 <151> 2007-07-20 <150> EP 06020647.1 <151> 2006-09-29 <160> 105 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> mouse <400> 1 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Arg 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Thr 85 90 95 Arg Gly Arg Gly Asp Arg Gly Asp Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> mouse <400> 2 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Gly Asn Gln Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Thr Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 3 <211> 117 <212> PRT <213> mouse <400> 3 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Val Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Ile Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> mouse <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Ala Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> mouse <400> 5 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ile Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Ile Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> mouse <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> mouse <400> 7 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Thr Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Ile Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> mouse <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 9 Thr Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 10 Val Phe Gly Val His 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 11 Ile Phe Gly Val His 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> mouse <400> 12 Thr Phe Gly Val His 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <400> 13 Ser Ile Ser Thr Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Arg Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <400> 14 Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <400> 15 Val Ile Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> mouse <400> 16 Gly Arg Gly Asp Arg Gly Asp Leu Phe Gly Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <400> 17 Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <400> 18 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Gly Asn Gln Met Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> mouse <400> 19 Arg Ser Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> mouse <400> 20 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> mouse <400> 21 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> mouse <400> 22 Asn Thr Lys Ala Leu Ala Glu 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> mouse <400> 23 Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <400> 24 Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> mouse <400> 25 Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 27 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 29 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C34 <400> 29 Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His 1 5 10 15 Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 20 25 30 Leu Leu <210> 30 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T20 <400> 30 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35 <210> 31 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T1249 <400> 31 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15 Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30 Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210> 32 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T651 <400> 32 Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 1 5 10 15 Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu 20 25 30 Gln Glu Leu Leu 35 <210> 33 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2635 <400> 33 Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 1 5 10 15 Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu 20 25 30 Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 34 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N36 <400> 34 Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala 1 5 10 15 Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln 20 25 30 Ala Arg Ile Leu 35 <210> 35 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DP107 <400> 35 Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu 20 25 30 Arg Tyr Leu Lys Asp Gln 35 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 1 <400> 36 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 2 <400> 37 Leu Ser Pro Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 3 <400> 38 Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 4 <400> 39 Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 5 <400> 40 Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly 1 5 10 15 Asn Asn <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 6 <400> 41 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 7 <400> 42 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 8 <400> 43 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 9 <400> 44 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 10 <400> 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 11 <400> 46 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 12 <400> 47 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 13 <400> 48 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 14 <400> 49 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ser <210> 50 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 15 <400> 50 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 51 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 16 <400> 51 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 52 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 17 <400> 52 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 18 <400> 53 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser 20 25 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 19 <400> 54 Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 20 <400> 55 Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 24 <400> 56 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ala Ser <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 25 <400> 57 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 58 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 26 <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 27 <400> 59 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly <210> 60 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 28 <400> 60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 29 <400> 61 Leu Ser Leu Ser Gly Gly 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 30 <400> 62 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly 1 5 <210> 63 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Gly Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 64 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ile Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 65 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Pro Leu Gly Ile Phe 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Arg Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Val Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 435 440 445 Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gln Gly Asn 450 455 460 Asn Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala 465 470 475 480 Arg Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn 485 490 495 Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 500 <210> 66 <211> 345 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 66 Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln 20 25 30 Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile 35 40 45 Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln 65 70 75 80 Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala 85 90 95 Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 100 105 110 Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 115 120 125 Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys 130 135 140 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 145 150 155 160 Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met 165 170 175 Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser 180 185 190 Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr 195 200 205 His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu 210 215 220 Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly 225 230 235 240 Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser 245 250 255 Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu 275 280 285 Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu 290 295 300 Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu 305 310 315 320 Val Val Gln Gly Ala Cys Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu 340 345 <210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 31 <400> 67 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 68 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 32 <400> 68 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 33 <400> 69 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 34 <400> 70 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 <210> 71 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD4 antibody light chain <400> 71 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 72 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD4 antibody heavy chain <400> 72 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 73 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> afp-1 <400> 73 Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Gln Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn 20 25 30 Glu Gln Glu Leu Leu 35 <210> 74 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD4 antibody heavy chain - afp-1 antifusogenic peptide conjugate <400> 74 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Gln Tyr 465 470 475 480 Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu 485 490 495 Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu 500 <210> 75 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 76 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric light chain variable domain <400> 76 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 77 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric light chain <400> 77 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser 20 25 30 Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser 35 40 45 Gly Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr 50 55 60 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser 65 70 75 80 Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85 90 95 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Arg Gly 115 120 125 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 165 170 175 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 180 185 190 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 215 220 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240 Cys <210> 78 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric light chain variable domain <400> 78 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 79 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric light chain variable domain <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln His Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Cys Leu Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 100 105 <210> 80 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric light chain variable domain <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 81 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized heavy chain variable domain <400> 82 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Leu Asp Pro Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric heavy chain <400> 83 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Leu Asp Pro Ser Thr Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe 115 120 125 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 210 215 220 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Gly Lys 465 <210> 84 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric heavy chain variable domain <400> 84 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric heavy chain variable domain <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Asp His Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric heavy chain variable domain <400> 86 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 88 Lys Ser Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 89 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR <400> 90 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 91 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 95 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Arg Thr 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 96 Tyr Asp Asn Leu Leu Phe 1 5 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Ser Tyr Val Ile His 1 5 <210> 98 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 98 Ser Tyr Val Ile His 1 5 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asp Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102 Ala Ile Ser Asp His Ser Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro 1 5 10 <210> 103 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Glu Lys Asp Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Ala Arg Lys Tyr Gly Gly Asp Tyr Asp Pro Phe 1 5 10

Claims (26)

  1. 하나 이상의 항푸소제닉 펩타이드 및 HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체를 포함하는 컨쥬게이트로서, 1 내지 8 개의 항푸소제닉 펩타이드가 각각 HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나의 말단에 공액되어 있는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  2. 제 1 항에 있어서, HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체가 2 내지 4 개의 항푸소제닉 펩타이드에 공액되어 있는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  3. 제 1 항에 있어서, HIV gp120 결합 세포 표면 수용체에 대한 항체가 항-CCR5 항체 (mAb CCR5) 인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체의 말단 중 2 개 이상이 각각 항푸소제닉 펩타이드에 공액되어 있는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 항푸소제닉 펩타이드가 선형 펩타이드이고, 5 내지 100 개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식 mAb CCR5 - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]n [식 중, m 은 각각의 항푸소제닉 펩타이드에 대해 독립적으로 0 또는 1 이고, n 은 최대 1 내지 8 의 정수임] 인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  7. 제 6 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, mAb CCR5 의 중쇄 및/또는 경쇄 및 항푸소제닉 펩타이드(들) 의 컨쥬게이트 ("사슬 컨쥬게이트") 를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트 :
    (1) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄]
    (2) [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
    (3) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [항푸소제닉 펩타이드]
    (4) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄]
    (5) [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
    (6) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [항푸소제닉 펩타이드]
    (7) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [중쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩타이드]
    (8) [항푸소제닉 펩타이드] - [링커]m - [경쇄] - [링커]m - [항푸소제닉 펩 타이드]
    (식 중, 링커는 동일 또는 상이할 수 있고, m 은 1 또는 0 의 정수이고, m 은 독립적으로 동일 또는 상이할 수 있음).
  8. 제 7 항에 있어서, 사슬 컨쥬게이트 (2), (3), (4), 또는 (7) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  9. 제 7 항에 있어서, 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x (2), 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x (3), 2 x [mAb CCR5 중쇄] 및 2 x (4), 또는 2 x [mAb CCR5 경쇄] 및 2 x (7) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항푸소제닉 펩타이드는 SEQ ID NO:29 내지 35 및 SEQ ID NO:73 에 의해 정의된 펩타이드의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 면역글로불린 골격 및 중쇄 CDR3 서열 SEQ ID NO: 16, 17 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 영역으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  12. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 면역글로불린 골격, 및 중쇄 CDR3 서열 SEQ ID NO: 16 및 17 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 영역, 중쇄 CDR2 서열 SEQ ID NO:13, 14, 및 15 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 중쇄 CDR1 서열 SEQ ID NO:9, 10, 11, 및 12 로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 영역으로 이루어진 가변 중쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  13. 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 및 7 의 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  14. 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 면역글로불린 골격, 및 SEQ ID NO:18, 19 및 20 으로부터 선택되는 CDR1 영역, SEQ ID NO:21, 22 및 23 으로부터 선택되는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO:24 및 25 로부터 선택되는 CDR3 영역으로 이루어진 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  15. 제 3 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 1 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 2 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 3 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 4 의 CDR, 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 5 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 6 의 CDR, 또는 중쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 7 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 SEQ ID NO: 8 의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  16. 제 3 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트 :
    a) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 에 의해 정의된 중쇄 (VH) 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 2 에 의해 정의된 경쇄 (VL) 가변 도메인 ;
    b) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 4 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
    c) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 6 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
    d) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 8 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인.
  17. 제 3 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 정의된 중쇄 (VH) 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:2 에 의해 정의된 경쇄 (VL) 가변 도메인, 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:4 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인, 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:6 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인, 아미노산 서열 SEQ ID NO:7 에 의해 정의된 중쇄 가변 도메인 및 아미노산 서열 SEQ ID NO:8 에 의해 정의된 경쇄 가변 도메인 ;
    아미노산 글리신 (G) 및 아스파라긴 (N), 트리펩타이드 GST, 및 SEQ ID NO:36 ~ 62 및 SEQ ID NO:67 ~ 70 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 ; 및
    SEQ ID NO:29 내지 35 및 SEQ ID NO: 73 에 의해 정의된 펩타이드의 군으로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  18. 제 3 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:29 내지 35 및 SEQ ID NO:73 의 군으로부터 선택되는 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  19. 제 3 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:2 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:1 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:4 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:3 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, SEQ ID NO:6 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:5 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:8 의 2 개의 경쇄 가변 도메인, 각각이 SEQ ID NO:7 의 중쇄 가변 도메인, SEQ ID NO:40 의 링커 및 SEQ ID NO:33 의 항푸소제닉 펩타이드를 포함하는 유형 (2) 의 2 개의 컨쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  20. 제 3 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CCR5 항체는 아미노산 S228, L234, L235, 및/또는 D265 에 돌연변이가 있는, IgG4 하위부류, 또는 IgG1 또는 IgG2 하위부류의 항체이고/거나, 또는 PVA236 돌연변이를 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 IgG4 하위부류의 항-CCR5 항체는 돌연변이 S228P 를 갖고, 상기 IgG1 하위부류의 항-CCR5 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  22. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트의 제조 방법 :
    a) 컨쥬게이트의 발현에 적합한 조건 하에, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 하나 이 상의 플라스미드를 함유하는 세포를 배양하는 단계,
    b) 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 컨쥬게이트를 회수하는 단계.
  23. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 함유하는 약학적 조성물.
  24. 바이러스 감염 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트의 용도.
  25. 제 24 항에 있어서, 바이러스 감염이 HIV 감염인 것을 특징으로 하는 용도.
  26. 항바이러스 치료가 필요한 환자의 치료를 위한, 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트의 용도.
KR1020097003147A 2006-08-17 2007-08-14 Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트 KR101105610B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06017156.8 2006-08-17
EP06017156 2006-08-17
EP06020647 2006-09-29
EP06020647.1 2006-09-29
EP07014335.9 2007-07-20
EP07014335 2007-07-20
PCT/EP2007/007164 WO2008019817A1 (en) 2006-08-17 2007-08-14 A conjugate of an antibody against ccr5 and an antifusogenic peptide

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090037944A true KR20090037944A (ko) 2009-04-16
KR101105610B1 KR101105610B1 (ko) 2012-01-18

Family

ID=38877282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097003147A KR101105610B1 (ko) 2006-08-17 2007-08-14 Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP2054086A1 (ko)
JP (1) JP2010500984A (ko)
KR (1) KR101105610B1 (ko)
AU (1) AU2007286451A1 (ko)
BR (1) BRPI0715794A2 (ko)
CA (1) CA2658474A1 (ko)
IL (1) IL195667A0 (ko)
MX (1) MX2009001204A (ko)
WO (1) WO2008019817A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2599791A1 (en) * 2007-04-27 2013-06-05 Genentech, Inc. Potent, stable and non-immunosuppressive anti-CD4 antibodies
US20090022720A1 (en) * 2007-07-20 2009-01-22 Stephan Fischer Conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
US8828931B2 (en) 2008-05-28 2014-09-09 New York Blood Center, Inc. Bifunctional molecules for inhibiting HIV entry
WO2010028796A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
US8936789B2 (en) 2008-10-16 2015-01-20 New York Bood Center, Inc. Immunoenhancer-linked oligomeric HIV envelope peptides
CN102307588A (zh) 2009-02-09 2012-01-04 纽约血库公司 用于治疗或预防hiv感染的三聚体hiv融合抑制剂
CA2794632A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 New York Blood Center, Inc. Bifunctional molecules for inactivating hiv and blocking hiv entry
KR101641206B1 (ko) 2013-06-24 2016-07-22 에이비엘바이오 주식회사 안정성이 개선된 항체-약물 결합체 및 이의 용도
RS63490B1 (sr) 2015-10-02 2022-09-30 Symphogen As Anti-pd-1 antitela i kompozicije
WO2018091661A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Symphogen A/S Anti-pd-1 antibodies and compositions
CN110621698B (zh) 2017-04-05 2024-04-12 法国施维雅药厂 靶向pd-1、tim-3及lag-3的组合疗法
US20200157192A1 (en) * 2017-05-10 2020-05-21 Albajuna Therapeutics, S.L. Fc-fusion protein derivatives with high dual hiv antiviral and immunomodulatory activity

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
FR2654429B1 (fr) 1989-11-13 1992-03-06 Panmedica Sa Nouveaux derives du methyl-2-propionate de 3,3,5-trimethylcyclohexanol, leur procede de preparation ainsi que compositions therapeutiques les contenant.
AU662891B2 (en) * 1990-11-27 1995-09-21 Biogen Idec Ma Inc. Anti CD-4 antibodies blocking HIV-induced syncytia
NZ254640A (en) 1992-07-20 1997-04-24 Univ Duke Hiv protein fragments of transmembrane glycoprotein gp41 (dp-107) with antiviral activity and their use
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
US5464933A (en) 1993-06-07 1995-11-07 Duke University Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission
US6017536A (en) 1993-06-07 2000-01-25 Trimeris, Inc. Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities
US6743594B1 (en) 1995-06-06 2004-06-01 Human Genome Sciences, Inc. Methods of screening using human G-protein chemokine receptor HDGNR10 (CCR5)
AU723537B2 (en) 1995-06-07 2000-08-31 Trimeris Inc. The treatment of HIV and other viral infections using combinatorial therapy
WO1997045543A2 (en) 1996-05-28 1997-12-04 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Cc chemokine receptor 5, antibodies thereto, transgenic animals
US6528625B1 (en) 1996-10-28 2003-03-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibodies and kits comprising same
AU5874798A (en) 1997-01-31 1998-08-25 Biovation Limited Vaccination methods and molecules
GB2339430A (en) 1997-05-21 2000-01-26 Biovation Ltd Method for the production of non-immunogenic proteins
US6258782B1 (en) 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6656906B1 (en) 1998-05-20 2003-12-02 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
DK1098664T3 (da) 1998-07-22 2003-11-17 Osprey Pharmaceuticals Ltd Sammensætninger og deres anvendelser til at behandle sekundær vævsskade og andre inflammatoriske tilstande og forstyrrelser
US20030215421A1 (en) 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US20030099645A1 (en) 2000-10-10 2003-05-29 Lobo Peter Isaac Naturally occuring IgM antibodies that bind to membrane receptors on lymphocytes
US6610834B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 Peter I. Lobo Human IgM antibodies to chemokine receptors
CN1202128C (zh) 1998-12-08 2005-05-18 拜奥威神有限公司 修饰蛋白的免疫原性
AU773175B2 (en) 1998-12-16 2004-05-20 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Synergistic inhibition of HIV-1 fusion and attachment, compositions and antibodies thereto
TR200102779T2 (tr) 1999-03-11 2002-03-21 Micromet Ag Antikor ve kemokin yapìlarìnìn oto baĞìçìklìk hastalìklarìnìn tedavisinde kullanìmì
CN1351611A (zh) 1999-05-17 2002-05-29 康久化学公司 病毒感染的长效融合肽抑制剂
US20030049251A1 (en) 1999-12-08 2003-03-13 Barbas Carlos F. Methods and compositions useful for inhibiting ccr5-dependent infection of cells by hiv-1
AU2265701A (en) * 1999-12-16 2001-06-25 Tanox, Inc. Anti-hiv-1 conjugates for treatment of hiv disease
WO2001058916A2 (en) 2000-02-09 2001-08-16 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to ccr5
US20040043033A1 (en) 2000-05-01 2004-03-04 Green Lorrence H. Method and vaccine for the prevention of AIDS
US7138119B2 (en) 2000-09-15 2006-11-21 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection
US20030165988A1 (en) 2002-02-08 2003-09-04 Shaobing Hua High throughput generation of human monoclonal antibody against peptide fragments derived from membrane proteins
US7005503B2 (en) 2002-02-08 2006-02-28 Genetastix Corporation Human monoclonal antibody against coreceptors for human immunodeficiency virus
EP1207202A1 (en) 2000-11-16 2002-05-22 Mölling, Karin, Inst. für med. Virologie der Uni. Zürich Nucleic acid molecules encoding a protein interacting with the chemokine receptor CCR5 or other chemokine receptor family members
US20020147147A1 (en) 2000-11-16 2002-10-10 Karin Molling Nucleic acid molecules encoding a protein interacting with the chemokine receptor CCR5 or other chemokine receptor family members
US7175988B2 (en) 2001-02-09 2007-02-13 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10
US20030003440A1 (en) 2001-03-14 2003-01-02 Lucia Lopalco Novel CCR5 epitope and antibodies against it
US7060273B2 (en) 2001-04-06 2006-06-13 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibiting HIV-1 infection
US20020146415A1 (en) 2001-04-06 2002-10-10 Olson William C. Methods for inhibiting HIV-1 infection
US7223844B2 (en) 2001-10-16 2007-05-29 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly cross-reactive neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus selected by Env-CD4-co-receptor complexes
WO2003066830A2 (en) 2002-02-08 2003-08-14 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against membrane proteins
US7122185B2 (en) 2002-02-22 2006-10-17 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibody
JP2006508631A (ja) 2002-02-22 2006-03-16 プロジェニクス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｃｃｒ５抗体
BR0314711A (pt) * 2002-09-27 2005-07-26 Tanox Inc Composições sinérgicas para a prevenção e tratamento da sìndrome da imunodeficiência adquirida
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004108885A2 (en) * 2003-05-06 2004-12-16 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Fc chimeric proteins with anti-hiv drugs
WO2004103312A2 (en) * 2003-05-19 2004-12-02 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Peptides useful as hiv fusion inhibitors
AU2004313242A1 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Trimeris, Inc. HIV gp41 HR2-derived synthetic peptides, and their use in therapy to inhibit transmission of human immunodeficiency virus
US7551647B2 (en) * 2004-07-19 2009-06-23 Qvidium Technologies, Inc. System and method for clock synchronization over packet-switched networks

Also Published As

Publication number Publication date
KR101105610B1 (ko) 2012-01-18
BRPI0715794A2 (pt) 2013-07-23
CA2658474A1 (en) 2008-02-21
IL195667A0 (en) 2009-09-01
AU2007286451A1 (en) 2008-02-21
JP2010500984A (ja) 2010-01-14
WO2008019817A1 (en) 2008-02-21
EP2054086A1 (en) 2009-05-06
MX2009001204A (es) 2009-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101105610B1 (ko) Ｃｃｒ５ 에 대한 항체 및 항푸소제닉 펩타이드의 컨쥬게이트
AU2008280443B2 (en) A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
JP4733736B2 (ja) Ｃｃｒ５に対する抗体およびそれらの使用
JP2010500984A5 (ko)
JP4960459B2 (ja) Ｃｃｒ５に対する抗体およびその使用
US20070148180A1 (en) Peptide-immunoglobulin-conjugate
US20110165182A1 (en) Conjugate of an antibody against ccr5 and an antifusogenic peptide
AU2013251184A1 (en) A conjugate of an antibody against CD4 and antifusogenic peptides
CN101500615A (zh) 针对ccr5的抗体和抗融合肽的缀合物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee