NO303390B1

NO303390B1 - FremgangsmÕte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende minst en aza-aminosyre

Info

Publication number: NO303390B1
Application number: NO922319A
Authority: NO
Inventors: Ronald Cotton; Michael Brian Giles
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 1998-07-06
Also published as: CA2069724A1; EP0518655A2; EP0518655B1; NO922319L; EP0518655A3; DE69222091T2; GB9112825D0; US5602231A; JP3249178B2; JPH05170791A; DE69222091D1; ES2106831T3; CA2069724C; AU667035B2; NO922319D0; AU1704092A; ATE157986T1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for frem-stilling av peptider, nærmere bestemt en peptidsyntesemetode i fast-fase for fremstiling, bl.a. av dekapeptidet goserelin.

Fast-fasesyntesen av peptider har vært kjent i nesten 3 0 år etter et banebrytende arbeid av Merrifield, først publisert i 1962. Det generelle prinsipp for denne type syntese er som følger: (a) En N-beskyttet aminosyre (den beskyttende gruppe er vanligvis t-butoksykarbonyl, forkortet Boe) festes til et fast, ikke-oppløselig underlag (vanligvis en polystyrenharpiks) ved sin karboksyliske ende via en forbindende gruppe (vanligvis en benzylester) . (b) Den N-beskyttende gruppe fjernes ved hjelp av midler som ikke løsner aminosyren fra det faste underlaget, og en andre N-beskyttet aminosyre kobles til den allerede tilfestede (vanligvis ved hjelp av et karbodi-imidkoblingsmiddel). (c) Fremgangsmåten gjentas ved å bruke så mange N-beskyttede aminosyrer som er nødvendig inntil man har fått dannet det forønskede peptidet, som stadig er festet i sin karboksylende til det faste underlaget. (d) Den endelige N-beskyttende gruppe fjernes og peptidet skilles fra det faste underlaget ved å avspalte den forbindende gruppen (vanligvis ved å bruke en sterk syre).

Hele syntesen kan maskin-styres, og i visse tilfeller kan peptidet dannes uten noen som helst manuell påvirkning. De Boc-beskyttende grupper fjernes ved hjelp av trifluoreddiksyre, og peptidkjeden fjernes fra det faste underlaget ved hjelp av en sterkere syre, f.eks. fluss-syre.

Etter introduksjonen av denne teknikken er det blitt"innført mange modifikasjoner, men selv i dag er selve grunn- . prosessen den samme som da den ble beskrevet. To større hoved-utviklingstrekk har vært bruken av et polyamid som det faste underlaget, og bruken av en N-fluoren-9-ylmetoksy-karbonyl (Fmoc) beskyttende gruppe for N-a-gruppen i aminosyren. Fmoc-gruppen erkarakterisert vedå være baselabil (vanligvis piperidin). Ytterligere detaljer kan f.eks. finnes i Atherton and Sheppard, "Solid phase peptide syntehesis - a practical approach", IRL Press, Oxford University Press, 1989; Barany et al., "Solid-phase peptide synthesis: a silver anniversary report", Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30./ 705-739 og Fields et al., ibid, 1990, 35, 161-214.

Gjennom hele denne søknad og beskrivelse vil det bli brukt standardforkortelser for aminosyrer, beskyttende grupper, koblingsmidler o.l.. For å unngå tvil, og dette gjelder også Boe og Fmoc som er som definert ovenfor, så vil man bruke de følgende relevante standard forkortelser:

Arg arginin

Azala aza-alanin (H2N-NMe-COOH)

Azgly azaglycin (H2N-NH-C00H)

Azphe azafenylalanin (H2N-NBzl-COOH)

D-Ser D-serin

Gip pyroglutaminsyre'

His histidin

Leu leucin

Pro prolin

Ser serin

Trp tryptofan

Tyr tyrosin

DIPC di-idopropylkarbodi-imid

HOBt 1-hydroksybenzotriazol

DIEA N,N-diisopropyletylamin

DMF N,N-dimetylformamid

Bu<1>" tert-butyl

Bzl benzyl

Su succinimido

Goserelin er en syntetisk analog til det naturlig fore-kommende hormonet, LHRH, og brukes ved behandling av prostata-kreft, brystkreft og visse gynekologiske tilstander. Ved først-nevnte behandling virker forbindelsen ved å indusere en kjemisk kastrering.

Dets struktur er følgende:

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (Bu1") -Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2

Det fremgår at det er to trekk ved denne strukturen som er uforenlig med de tradisjonelle fastfasepeptidsynteser. Det første trekket er den Azgly-karboksyterminale aminosyren; fremgangsmåter for å forbinde en slik gruppe til et fast underlag er generelt ikke kjente, skjønt Knolle et al., Peptider 1990, 414-415 beskriver hvordan man kan feste dipeptidet Pro-Azgly til en aminometylharpiks gjennom en substituert fenylpropionsyreforbindende gruppe. Denne fremgangsmåten er selvsagt bare anvendbar for fast-fasesyntese av peptider med en C-terminal Azgly. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gjør det imidlertid mulig å syntetisere peptider som inneholder en aza-aminosyre i en hvilken som helst stilling i peptidkjeden. Fri azaglycin har selvsagt en terminal -NH-COOH-gruppe, og er således en ustabil karbaminsyre.

Det annet trekk ved goserelin som er uforenlig med tradisjonell fast-fasesyntese, er den tert-butylgruppen som er festet til D-seringruppen; og hvis denne gruppen skal beholdes kan man ikke bruke de tradisjonelle sterke syrer for å fjerne det fullstendige peptidet fra det faste underlaget.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstillingen av goserelin og andre peptider inneholdende aza-aminosyrer i enhver stilling i peptidkjeden ved fast-fasesyntese.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende minst én aza-aminosyre,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av en N-beskyttet aza-aminosyre, enten med et passende reaktivtfast underlag hvis man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en C-terminal aza-aminosyre, eller med et peptid som er festet til et fast underlag i det tilfellet man ønsket å syntetisere et peptid inneholdende en ikke-C-terminal aza-aminosyre ; (ii) utfører videre vanlig kjent fast fasepeptidsyntese for å feste ytterligere aminosyrer slik at man får danne et peptid med den forønskede aminosyresekvens bundet til nevnte faste underlag; og

(iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget.

En egnet aktiv ester for reaksjon med det faste underlaget er f.eks. en succinimido, benzotriazol-l-yl, pentafluorfenyl,2,4,5-triklorfenyl eller 3,4-dihydro-4-okso-1,2,3-benzotriazin-3-ylester.

Det reaktive faste underlaget kan være et vanlig kjent underlag basert f.eks. på en tverrbundet polystyrenharpiks hvor det er innført klormetylgrupper, som så igjen er reagert med en fenoksygruppe, f.eks. en Ring-harpiks (H. Rink, Tet. Lett.,

(1987), 28, 3787-3790), SASRIN (super syre følsom harpiks; N.Mergler, R. Tanner, J. Gostelli og P. Grogg, Tet. Lett., (1988), 29, 4005-4008) eller Wang (S. S. Wang, J. am Chem. Soc., (1973), 95, 1328-1333). Et spesielt foretrukket underlag for bruk ved fremstillingen av peptider med et C-terminalt amid, er harpiksen kjent som Fmoc-NH-Rink-harpiks, som består av 4- (of-Fmoc-amino-2',4'-dimetoksybenzyl)fenoksygrupper festet til metylengruppene på polystyrenharpiksen. Peptider bundet gjennom denne gruppen kan avspaltes fra' harpiksunderlaget ved en kort behandling med lave konsentrasjoner av en syre såsom trifluoreddiksyre. Egnede aza-aminosyrer som kan brukes i ovennevnte fremgangsmåte er f.eks. azaglycin, aza-alanin og azafenylalanin. De (N-beskyttede-aza-aminoacyl) aktive estere som brukes som utgangsforbindelser, er nye forbindelser og danner som sådan et ytterligere trekk ved foreliggende oppfinnelse. Mer spesielt er Fmoc-Azgly-OSu, Fmoc-Azala-OSu, Fmoc-Azphe-OSu, Fmoc-Azala-OBt og Fmoc-Azphe-OBt ytterligere spesifikke trekk ved foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende en aminosyre som har en tert-butyloksygruppe i sin sidekjede, og hvor fremgangsmåten innbefatter at man bruker en forbindende gruppe som knytter den C-terminale aminosyren til det faste underlaget, og hvor den bindende gruppen er labil under slike tilstander som ikke avspalter en O-tert-butylgruppe. En egnet bindende gruppe er den som er tilveiebrakt i nevnte Fmoc-NH-Ring-harpiks. Fjerning av det syntetiserte peptidet fra harpiksen ved hjelp av en kort behandling med lave konsentrasjoner av en syre, f.eks. trifluoreddiksyre, vil ikke spalte den tert-butyleteren i sidekjeden i det syntetiserte peptidet. Aminosyrene som kan inngå i et slikt peptid er tert-butyl-etere av f.eks. serin, D-serin, treonin, tyrosin og hydroksyprolin. Foreliggende oppfinnelse er viderekarakterisert vedat det er tilveiebrakt en fremgangsmåte for fast fasesyntese av et peptid som inneholder minst én aza-aminosyre,karakterisert vedat man (i) reagerer en aktiv ester av en N-beskyttet aza-aminosyre, enten med et passende reaktivt fast underlag i det tilfellet man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en C-terminal aza-aminosyre, eller med et peptid som er festet til et fast underlag i det tilfellet at man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en ikke-C-terminal aza-aminosyre ; (ii) utfører en vanlig fast-fasepeptidsyntese uten bruk av beskyttende grupper på sidekjedene av aminosyrene serin, arginin, tyrosin, treonin og hydroksyprolin;

(iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget; og

(iv) reagerer det fremstilte produktet med hydrazin for å fjerne eventuelle acylgrupper som er blitt dannet på serin, arginin, tyrosin, treonin eller hydroksyprolin under - syntesen.

Egnede aktiverte grupper og faste underlag er de som er definert ovenfor.

Under det siste trinn av denne fremgangsmåten vil eventuelle acylerte sidekjedegrupper som er blitt dannet, bli deacylert ved hjelp av hydrazinet.

Oppfinnelsen er illustrert av de følgende eksempler:

Eksempel 1

(a) Syntese av N~1 - fluoren- 9- ylmetoksykarbonyl- N—2- succinimido-oksy- karbonylhydrazin ( Fmoc- Azqly- OSu)

1,28 ml av en 95% vandig hydrazinoppløsning i 100 ml acetonitril ble i løpet av 2 timer dråpevis tilsatt ved 20°C til en rørt oppløsning av 13,48 g fluoren-9-ylmetylsuccinimidokarbonat (Fmoc-OSu) i 200 ml acetonitril, og blandingen ble rørt i 16 timer og deretter filtrert. Den faste resten ble vasket med en 1:1 v/v blanding av acetonitril og dietyleter og så med dietyleter, og deretter tørket. Man fikk således fremstilt 7,81 g fluoren-9-ylmetoksykarbonylhydrazin (Fmoc-hydrazin). Ytterligre 0,96 g av dette produktet ble oppnådd ved å konsentrere filtratet og vaskeoppløsningen, utføre en filtrering og utkrystallisere den faste resten fra etanol.

8,77 g av ovennevnte Fmoc-hydrazin og 9,72 g disuccinimido-karbonat ble ved 20°C tilsatt 150 ml acetonitril, og blandingen ble rørt i 10 min. inntil man fikk en fullstendig oppløsning, og så i ytterligre 20 timer og så fordampet til tørrhet. En opp-løsning av resten i etylacetat ble vasket suksessivt med en mettet vandig natriumbikarbonatoppløsning, vann og en mettet vandig natriumkloridoppløsning, så tørket over magnesiumsulfat og fordampet til tørrhet. Resten ble så utrørt i petroleter (k.p. 60-80°C), hvoretter blandingen ble filtrert, og den faste resten ble tørket. Man fikk således fremstilt 11,81 g (87% utbytte) av Fmoc-Azgly-OSu, og strukturen av denne forbindelsen ble bekreftet ved FAB-massespektroskopi, H<1->NMR ved 250MHz og. ved elementæranalyse.

(b) Festing av Fmoc- Azcfly- OSu til harpiks

Alle fast-fasereaksjoner ble utført ved vanlig labora-torietemperatur ved å bruke en Biosearch 9500 Peptid Synthe-sizer. I alle koblingsreaksjoner brukte man 4 molar ekvivalenter av acyleringskomponenten.

4- (of-Fmoc-amino-2 ', 4 ' -dimetoksybenzyl) f enoksy-polystyrenharpiks tverr-bundet med 1% divinylbenzen (Fmoc-NH-Rink-harpiks, lg, 0,64 meq/g) ble behandlet med en 20% v/v oppløsning av piperidin i DMF for å fjerne Fmoc-gruppen, deretter vasket med DMF og i 1 time omsatt med 4 molare ekvivalenter av Fmoc-Azgly-OSu som en 0,2 molar oppløsning i DMF.

(c) Dannelse av dekapeptidet<g>oserelin

De gjenværende 9 aminosyrer ble deretter festet til ovennevnte harpiks ved å bruke ovennevnte synteseapparat satt på automatisk drift. I alle tilfeller brukte man koblingsmidlet di-isopropylkarbodi-imid (DIPC), og aminosyrene (bortsett fra Gip som ble brukt i siste trinn og som derfor ikke trenger beskyttelse) ble beskyttet i aminoenden ved hjelp av Fmoc. Histidin (som ble brukt i trinn 8) ble bis-beskyttet ved hjelp av Fmoc; mens man ikke brukte beskyttende grupper for eventuelle andre aminosyrer som har en funksjonell gruppe i sin sidekjede. Reaksjonsbetingelsene varierte noe for hvert enkelt trinn, dvs. på følgende måte:

( i) Tilsetning av Pro

Den følgende operasjonssekvens ble utført:

DMF vasking

20% piperidin i DMF (2 min.)

20% piperidin i DMF (8 min.)

DMF vasking

Fmoc-Pro-OH/DIPC/DMF

DMF vasking

( ii) Tilsetning av Arg

Skjønt syntesen var automatisk så ble fremdriften av acyleringen kontrollert ved hjelp av en Kaiser-analyse (E. Kaiser, R.L. Colescott, CD. Bossinger & P.I. Cook, Anal. Biochem., (1970), 34. 595-598), og forlenget når dette var nødvendig. Man utførte følgende sett av operasjoner:

DMF vask

20% piperidin i DMF (2 min.)

20% piperidin i DMF (8 min.)

DMF vask

Fmoc-Arg(HC1)-OH/DIPC/DMF (2,5 timer)

DMF vask

10% DIEA/DMF vask (5 min.)

DMF vask

0,5 molar HOBt/DMF vask (5 min.)

Fmoc-Arg(HC1)-OH/DIPC/DMF (1,5 timer)

DMF vask

( iii) til ( vii) inkl. -

tilsetning av Leu, D- Ser( Bu—), Tyr, Ser, Trp

Man utførte følgende sett av operasjoner:

DMF vask

20% piperidin i DMF (2 min.)

20% piperidin i DMF (8 min.)

DMF vask

0,5 molar HOBt/DMF vask (5 min.)

Fmoc-(aminosyre)-0H (aminosyrene i sekvens)/DIPC/DMF

(1 time).

( viii) Tilsetning av His

Den sekvens av arbeidsoperasjoner som er angitt for (iii) til (vii) ble gjentatt, bortsett fra at det relativt uoppløse-lige Fmoc-His(Fmoc)-0H ble tilsatt manuelt istedenfor automatisk.

( ix) Tilsetning av Gip

Den sekvens av arbeidsoperasjoner som er angitt for (iii)

til (vii) ble gjentatt. Harpiksen ble så vasket med DMF og deretter med diklormetan og så tørket.

(d) Avspaltin<g>av peptidet fra harpiksen

0,3 g av peptidharpiksen fremstilt som beskrevet ovenfor, ble to ganger i 3 min. hver gang behandlet med en oppløsning av 20 0/il trifluoreddiksyre i 10 ml diklormetan, hvoretter blandingen ble filtrert over i et kar som inneholdt 800 fil trietylamin. Harpiksen ble vasket med diklormetan og så med metanol, og det samlede filtratet og vaskeoppløsninger ble fordampet til tørrhet. Fordampningsresten ble oppløst i metanol, og oppløsningen fordampet til tørrhet. Resten ble oppløst i 20 ml vann, så tilsatt 100 fil 95% vandig hydrazin, og blandingen ble holdt på 20°C i 2 timer. Blandingen ble så filtrert, hvoretter filtratet ble tilsatt tilstrekeklig acetonitril til at det ble en 5% volum-oppløsning av dette tilsetningsmidlet, hvoretter hele oppløsningen ble tilsatt en reversert fasekromatografikolonne (Dynamax, C^g, 300, 12/xm, 25 x 2,25 cm) . Kolonnen ble eluert med en gradient (fra 5% til 18% pr. volum) av acetonitril i vann inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre. Passende fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert, og man fikk fremstilt 73 mg goserelin, og strukturen av dette produktet ble bekreftet ved aminosyrenalayse og massespektroskopi.

Eksempel 2

Syntese av N~1 - fluoren- 9- vlmetoksykarbonvl- N—2 - metyl- N—2-( succih-imido- oksvkarbonyl) hydrazin ( Fmoc- Azala- Osu)

16,86 g Fmoc-OSu ble ved 20°C tilsatt en rørt oppløsning av 7,31 g N^-Boc-N^-metylhydrazin i 75 ml acetonitril, og blandingen ble kokt under tilbakeløp i 4,5 timer og så holdt på 20°C i ytterligere 72 timer. Reaksjonsblandingen ble fordampet til tørrhet,

og resten ble delt mellom vann og diklormetan. Diklormetanlaget ble skilt ut, vasket med en mettet vandig natriumkloridoppløsning, tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet. Den gjenværende gummien ble oppløst i 70 ml kloroform, og oppløsningen ble påsatt en kolonne av silisiumdioksydgel (Merck Kiselgel 60/9385, 5 x 30 cm) og eluert med kloroform fulgt av kloroform/metanol (99,5/0,5 v/v) . Passende fraksjoner ble slått sammen og fordampet til tørrhet, og man fikk således fremstilt 8,75 g N1- tert-butoksykarbonyl-N 1 -metyl-N 2-(fluoren-9-ylmetoksykarbonyl)hydrazid som en gul gummi, og strukturen av dette produktet ble bekreftet ved en FAB-massespektroskopi (MH<+>= 369).

En 5,2 molar oppløsning av hydrogenklorid i 10 ml etylacetat ble ved 20°C tilsatt en rørt oppløsning av 4,6 g av det ovennevnte produkt i 15 ml etylacetat. Etter 25 min. hadde det dannet seg et hvitt bunnfall. Dette ble frafiltrert, vasket med dietyleter og tørket. Man fikk således fremstilt 2,5 g N^-fluoren-9-yl-metoksy-2 1-2

karbonyl-N -metylhydrazin (N Fmoc-N -metylhydrazin)hydroklorid, og strukturen av dette produktet ble bekreftet ved en FAB-massespektroskopi (MH<+>= 269).

1,5 ml trietylamin og 2,56 g bis-succinimidokarbonat (BSC) ble suksessivt tilsatt en rørt suspensjon av 3,05 g av ovennevnte hydrazidhydroklorid i 30 ml acetontril ved 20°C. Ytterligere to 0,5 g porsjoner av BSC ble tilsatt den rørte reaksjonsblandingen etter 15 og 3 0 min. hhv.. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen fordampet til tørrhet, og resten ble opp-varmet med 50 ml etylacetat og en mettet vandig natrium-bikarbonatoppløsning. Etyl-acetatlaget ble skilt ut, vasket med en mettet vandig natrium-bikarbonatoppløsning og så med en mettet vandig natriumklorid-oppløsning, tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet. Resten ble oppløst i kloroform, og oppløsningen ble satt på en silisiumdioksydgelkolonne (Merck Kiselgel 60/9385, 40 x 2 cm), og eluert suksessivt med kloro-form, kloroform/metanol (99,5 : 0,5 v/v) og kloroform/metanol (99 : 1 v/v). Passende fraksjoner ble slått sammen og fordampet til tørrhet, noe som ga 2,8 g Fmoc-Azala-OSu som et hvitt skum, og strukturen av dette ble bekreftet ved en FAB massespektroskopi (MH<+>= 410).

Eksempel 3

Syntese av N~1 - fluoren- 9- ylmetoksykarbonyl- N~2 - metvl- N—2- benzyl-N—2- succinimido- oksvkarbonylhydrazin ( Fmoc- Azphe- OSu)

En oppløsning av 8,84 g N 1 -tert-butoksykarbonyl-N 1-benzyl-hydrazin i 20 ml acetonitril ble tilsatt en oppløsning av 13,43 g Fmoc-OSu i 150 ml acetonitril, og reaksjonsblandingen ble opp-varmet under tilbakeløp i 10 timer og så fordampet til tørrhet. Resten ble delt mellom kloroform og vann, og kloroformlaget ble så skilt ut, vasket to ganger med vann og så med mettet vandig natriumkloridoppløsning, tørket over natriumsulfat og fordampet til tørrhet. Resten ble oppløst i en blanding av kloroform og etylacetat (98:2 v/v), og oppløsningen ble så påsatt en kolonne av silisiumdioksydgel (Merck Kiselgel 60/9385, 35 x 4 cm) og eluert med kloroform/etylacetat (98:2 v/v). Passende fraksjoner ble slått sammen og fordampet til tørrhet, og man fikk således frem-12 2

stilt 16,5 g N -Fmoc-N -benzyl-N -Boc-hydrazm som et hvitt krystallinsk fast stoff, og strukturen av dette ble bekreftet ved en FAB-massespektroskopi (MH<+>= 445).

En 5,2 molar oppløsning av hydrogenklorid i 50 ml etylacetat ble tilsatt en oppløsning av 16,4 g av ovennevnte hydrazid i 50 ml etylacetat, og blandingen ble holdt på 20°C i 1 time og så fordampet til tørrhet. Resten ble oppløst i 60 ml etylacetat, og man fikk langsomt utfelt et gelatinøst fast stoff. Dette ble frafiltrert, vasket med etylacetat og deretter med dietyleter og så tørket, og man fikk således fremstilt 9,57 g N 1 -Fmoc-N 2-benzylhydrazinhydroklorid, og strukturen av dette ble bekreftet ved FAB massespektroskopi (MH<+>= 345).

1,4 ml trietylamin og 2,56 g bis-succinimidokarbonat (BSC) ble tilsatt en rørt suspensjon av 3,81 g av ovennenvte hydrazidhydroklorid i 100 ml acetonitril, og røring ble fortsatt ved 20°C. Ytterligere 1,2 g og 1,0 g BSC ble tilsatt med 1 times mellomrom. Oppløsningen ble deretter fordampet til tørrhet, og resten ble oppløst i et mindre volum av en blanding av etylacetat og petroleter (k.p. 60-80°C) (45:55 v/v). Oppløsningen ble påsatt en silisiumdioksydgelkolonne (Merck Kiselgel 60/9385, 30 x 3 cm), og

eluert med samme blanding av etylacetat/petroleter. Passende fraksjoner ble slått sammen og fordampet til tørrhet, og man fikk således fremstilt 3,8 g Fmoc-Azphe-OSu som en stiv gummi, og strukturen av dette ble bekreftet ved FAB massespektroskopi (MH<+>= 486).

Eksempel 4

Syntese av N~1 - fluoren- 9- ylmetoksykarbonyl- N—2 - metyl- N~2- benzotriazol- 1- yloksvkarbonylhvdrazin ( Fmoc- Azala- OBt)

4,23 g bis-benzotriazol-l-ylkarbonat ble tilsatt en rørt suspensjon av 3,05 g N<1->Fmoc-N<1->metylhydrazinhydroklorid og 1,4 ml trietylamin i 50 ml acetonitril, og man fikk raskt en klar suspensjon. Blandingen ble rørt i 2,5 timer ved 20°C og så filtrert. Den faste resten ble vasket med acetonitril og så med dietyleter og deretter tørket. Man fikk således fremstilt 1,56 g Fmoc-Azala-OBt som et amorft fast stoff, og strukturen av dette ble bekreftet ved FAB massespektroskopi (MH<+>= 430).

Eksempel 5

Syntese av N~1 - fluoren- 9- ylmetoksykarbonyl- N—2 - benzyl- N—2- benzotriazol- 1- yloksvkarbonvlhvdrazin ( Fmoc- Azphe- OBt)

4,23 g bis-benzotriazol-l-yl ble tilsatt en rørt suspensjon av 1,40 ml trietylamin og 3,81 g N 1 -Fmoc-N 2-benzylhydrazinhydro-klorid i 50 ml acetonitril, og blandingen ble rørt i 3 timer ved 20°C og så fordampet til tørrhet. Resten ble oppløst i en 1:2 v/v blanding av etylacetat og petroleter (k.p. 60-80°C), og så påsatt en silisiumdioksydgelkolonne (Merck kiselgel 60/9385, 35 x 3 cm) og eluert med samme etylacetat/petroleterblanding. Passende fraksjoner ble slått sammen og fordampet til tørrhet, og man fikk således fremstilt 2,6 g Fmoc-Azphe-OBt som et hvitt skum, og strukturen av dette ble bekreftet ved FAB massespektroskopi

(MH<+>= 506).

Claims

1. Fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende minst én aza-aminosyre,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av en N-beskyttet aza-aminosyre, enten med et passende reaktivt fast underlag i det tilfellet man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en C-terminal aza-aminosyre, eller med et peptid som er festet til et fast underlag i det tilfellet man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en ikke-C-terminal aza-aminosyre; (ii) utfører videre en vanlig fast-fasepeptidsyntese for i sekvens å tilføye ytterligere aminosyrer, slik at man får dannet et peptid med den forønskede aminosyresekvens bundet til det faste underlag; og (iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende minst et C-terminalt azaglycin, aza-alanin eller azafenylalaninamid,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av N-beskyttet aza-glycin, aza-alanin eller azafenylalanin med et egnet reaktivt fast underlag; (ii) gjennomfører en vanlig fast-fasepeptidsyntese for i sekvens' å tilføye ytterligere aminosyrer, slik at man får dannet et peptid med den' forønskede aminosyresekvens bundet til det faste underlaget; og (iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2 for fast-fasesyntese av goserelin,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av N-beskyttet aza-glycin med et passende reaktivt fast underlag; (ii) utfører videre en vanlig f ast-f asepeptidsyntese -for i sekvens å tilføye prolin, arginin, leucin, O- tert-butyl-D-serin, tyrosin, serin, tryptofan, histidin og pyroglutaminsyre slik at man får dannet goserelin bundet til nevnte faste underlag; og (iii) avspalter goserelinet fra det faste underlaget ved hjelp av syrebehandling.

4. Fremgangsmåte for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende minst én aza-aminosyre,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av en N-beskyttet aza-aminosyre, enten med et passende reaktivt fast underlag i det tilfellet man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en C-terminal aza-aminosyre, eller med et peptid som er festet til et fast underlag i det tilfellet man ønsker å syntetisere et peptid inneholdende en ikke-C-terminal aza-aminosyre; (ii) utfører videre en vanlig fast-fasepeptidsyntese uten å bruke beskyttende grupper på sidekjedene i aminosyrene serin, arginin, tyrosin, treonin og hydroksyprolin; (iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget; og (iv) reagerer det fremstilte produktet med hydrazin for å fjerne eventuelle acylgrupper som er blitt dannet på nevnte serin, arginin, tyrosin, treonin eller hydroksyprolin under syntesen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fast-fasesyntese av et peptid inneholdende et C-terminalt azaglycin, aza-alanin eller azafenylalaninamid,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av N-beskyttet azaglycin, aza-alanin eller azafenylalanin med et passende reaktivt fast underlag; (ii) utfører en vanlig fast fasepeptidsyntese uten å bruke beskyttende grupper på sidekjedene i aminosyrene serin, arginin, tyrosin, treonin og hydroksyprolin; (iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget; og - (iv) reagerer det fremstilte produktet med hydrazin for å fjerne eventuelle acylgrupper som måtte være dannet, på nevnte serin, arginin, tyrosin, treonin eller hydroksyprolin under syntesen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fast-fasesyntese av goserelin,karakterisert vedat man: (i) reagerer en aktiv ester eller imidazolid av N-beskyttet azaglycin med et egnet reaktivt fast underlag; (ii) utfører videre en vanlig fast-fasepeptidsyntese slik at man i sekvens tilføyer prolin, arginin, leucin, O-tert-butyl-D-serin, tyrosin, serin, tryptofan, histidin og pyroglutamin-syre, slik at man får fremstilt goserelin bundet til nevnte faste underlag; og (iii) avspalter peptidet fra det faste underlaget ved hjelp av syrebehandling; (iv) reagerer det fremstilte produktet med hydrazin for å fjerne eventuelle acylgrupper som måtte være dannet på nevnte serin, arginin, tyrosin, treonin eller hydroksyprolin under syntesen.