JPH05304976A - ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】蛋白質やペプチドを分解を受けることなく製造
する方法を確立する。 【構成】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質またはペプ
チドのＮ末端にシステインを含まないペプチドを連結し
た融合蛋白質またはペプチドを製造し、次いでこれをペ
プチド結合を切断する反応に付すことにより、システイ
ンを含まない目的とするペプチドを製造する。 【効果】システインを含まないペプチドを分解を受ける
ことなく大量に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、融合蛋白質またはポリ
ペプチドを製造し、次いで該融合蛋白質またはポリペプ
チドをペプチド結合の切断反応に付すことにより、シス
テインを含まないペプチドを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いて、ペプチドを
製造するに際しては、ペプチドが細胞内で、分解を受け
やすいために、融合蛋白質の形で発現させることがしば
しば行なわれている。融合蛋白質からの目的ペプチドの
切り出しには、ブロムシアンを用い化学的に切断する方
法（イタクラら、Science, 198, 1056(1977)）、ファフ
ターＸaを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、Metho
ds in Enzymology, 153,46(1987)）が知られている。さ
らに、蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、
２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシス
テイン結合の切断が知られている（「生化学実験講座」
１，タンパク質の化学II，日本生化学会編，東京化学同
人発行，第２４７〜２５０頁１９７６年）。しかしなが
ら、蛋白質からの目的ペプチドの切り出しについては、
開示されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来知られている技術
において、ブロムシアンを用いる場合には、メチオニン
を含有するペプチドの製造には適用することはできない
し、ファクターＸaを使用する場合には、切り出し時の
収率等に問題が多い。このように、融合蛋白質またはポ
リペプチドから目的とするペプチドを効率良く切り出す
方法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
点に鑑み、ブロムシアン，ファクターＸaを用いること
なく、融合蛋白質から、目的ペプチドを効率的に切り出
す方法について、鋭意検討を加えたところ、Ｎ末端にシ
ステインを有する蛋白質またはポリペプチドのＮ末端に
システインを含まないペプチドを連結した融合蛋白質ま
たはポリペプチドを製造し、次いでこれをペプチド結合
を切断する反応に付すことにより、システインを含まな
い目的とするペプチドを効率良く製造できることを見い
出し、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完
成した。

【０００５】本発明は、(１)Ｎ末端にシステインを有す
る蛋白質またはペプチドのＮ末端にシステインを含まな
いペプチドを連結した融合蛋白質またはペプチドをコー
ドする遺伝子を含有するベクターを保持する形質転換体
を培養して融合蛋白質またはペプチドを発現させ、発現
された融合蛋白質またはペプチドをシステイン残基のア
ミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴と
するシステインを含まないペプチドの製造法； (２)Ｎ末端にシステインを有する蛋白質またはペプチド
のＮ末端にシステインを含まないペプチドを連結した融
合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を構築し、
該遺伝子を有するベクターを保持する形質転換体を作製
し、該形質転換体を培養して融合蛋白質またはペプチド
を発現させ、発現された融合蛋白質またはペプチドをシ
ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
付すことを特徴とするシステインを含まないペプチドの
製造法； (３)Ｎ末端にシステインを有するペプチドのＮ末端にシ
ステインを含まないペプチドを連結したポリペプチドを
化学的に合成し、合成されたポリペプチドをシステイン
残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すこと
を特徴とするシステインを含まないペプチドの製造法； (４)システイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断
反応がシアノ化反応、次いでアミノ化合物または置換ア
ミノ化合物を用いて、システインを含まないペプチドの
アミドまたは置換アミドを製造する上記１，２または３
項の製造法；および

【０００６】(５)一般式 R₁-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₂-His-Asn-R₃-R₄-R₅-His
-Leu-Asn-Ser-R₆-R₇-Arg-R₈-Glu-R₉-Leu-R₁₀-R₁₁-R₁₂-L
eu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₁₃ 〔Ｉ〕 〔式中R₁はSerまたはAibを、R₂はMetまたは天然型の脂
溶性アミノ酸を、R₃はLeu，Ser，Lysまたは芳香族アミ
ノ酸を、R₄はGly，またはD-アミノ酸を、R₅はLysまたは
Leuを、R₆はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、R₇は
Glu，または塩基性アミノ酸を、R₈はVal，または塩基性
アミノ酸を、R₉はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イル)
Trpを、R₁₀はArgまたはHisを、R₁₁はLysまたはHisを、
R₁₂はLys，GlnまたはLeuを、R₁₃はフェニルアラニン置
換アミドで表されるペプチドまたはその塩である。

【０００７】上記式(Ｉ)において、Ｒ₂またはＲ₆で示さ
れる脂溶性アミノ酸としては、動物，植物または微生物
を起源とする天然の蛋白質からなるものが挙げられ、具
体的には、Leu，Ile，Val，PheまたはTrpが挙げられ
る。Ｒ₃で示される芳香族アミノ酸としては、Phe，β−
ナフチルAla，Trp，Tyrが挙げられる。Ｒ₄で示されるＤ
−α−アミノ酸としては、特に限定されるものではな
く、具体的にはD-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D
-Ser(But), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, β-ナフチル
-D-Ala, D-Trp, D-Tyr, D-Lys, D-Lys(Fmoc), D-Phe, D
-Asnなどが挙げられるが、に中性アミノ酸が好ましく、
例えばD-Ser，D-Leu，D-ナフチルAla，D-Trp，D-Asn，D
-Asn等が挙げられる。Ｒ₇およびＲ₈で示される塩基性ア
ミノ酸としては、Arg，Lys，AsnおよびHisが挙げられ
る。

【０００８】置換アミノまたは置換アミドとしては、た
とえば、モノ−またはジ−置換体が挙げられる。該置換
基としては、(i)Ｃ_1-20アルキル，Ｃ_3-8シクロアルキ
ル，アリール(aryl)またはアリール−Ｃ_1-3アルキルで
あって、これらは置換基を有していないかあるいは１〜
３個のアミノ基，水酸基を炭素原子に有していてもよい
もの、（ｉｉ）アミノ，または置換アミノ、(iii)水酸基
またはＣ_1-6アルキル基などが挙げられる。上記Ｃ_1-20
アルキルの例としては、たとえば、メチル，エチル，プ
ロピル，イソプロピル，ブチル，sec-ブチル，ペンチ
ル，イソペンチル，ネオペンチル，１−エチルペンチ
ル，ヘキシル，イソヘキシル，ヘプチル，オクチル，ノ
ナニル，デカニル，ウンデカニル，ドデカニル，テトラ
デカニル，ペンタデカニル，ヘキサデカニル，ヘプタデ
カニル，オクタデカニル，ノナデカニルおよびエイコサ
ニルなどが挙げられる。上記Ｃ_3-8シクロアルキルの例
としては、たとえば、シクロプロピル，シクロブチル，
シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチル，シ
クロオクチルなどが挙げられる。上記アリールの例とし
ては、フェニル，ナフチル，アンスリル，フェナンスリ
ル，アセナフチレニルなどが挙げられる。上記アリール
−Ｃ_1-3アルキルの例としては、たとえばベンジル，フ
ェネチル，３−フェニルプロピル，(１−ナフチル)メチ
ル，(２−ナフチル)メチルなどが挙げられる。上記Ｃ
_1-6アルコキシの例としては、たとえばメトキシ，エト
キシ，プロポキシ，ブトキシ，ペンチルオキシ，ヘキシ
ルオキシなどが挙げられる。

【０００９】上記(ii)の置換アミノの置換基の例として
は、たとえばアミノ酸，２〜１０個のアミノ酸からなる
ペプチドが挙げられる。上記アミノ酸としては、Ｌ−体
でもＤ−体でもよく、その例としては、例えば、Ala，A
rg，Asp，Asn，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Met，Leu，P
he，Pro, Ser,Thr, Trp, Tyr, Valが挙げられる。上記
ペプチドの例としては、たとえば、H-D-Leu-Leu-Arg-Pr
o-NH-C₂H₅(配列表：配列番号１)，H-Val-Ala-Leu-D-Ala
-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH(配列表：配列番号２)な
どが挙げられる。上述の塩の例としては、無機塩基
（例、ナトリウム，アンモニウムなど）との塩，有機塩
基（例、トリエチルアミン，エチルアミン，メチルアミ
ンなど）との塩，無機塩（例、塩酸塩，硫酸塩，硝酸塩
など），有機塩（例、ギ酸塩，酢酸塩，プロピオネー
ト，酒石酒塩，クエン酸塩など）が挙げられる。

【００１０】本発明方法において目的とするペプチドと
しては、システインを含まないペプチドであれば、いず
れのペプチドでもよい。該システインを含まないペプチ
ドとしては、分子量が１００〜１２０００のものが好ま
しく、２００〜７０００のものがさらに好ましい。さら
に、該システインを含まないペプチドとしては、たとえ
ば、２〜１００個のアミノ酸からなるものが好ましく、
さらに、３〜７０個のアミノ酸からなるものが好まし
い。その具体例としては例えば、副腎皮質刺激ホルモン
(ＡＣＴＨ)，副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)，エンケファリ
ン類，エンドルフィン類，各種オピオイドペプチド類，
β−メラニン細胞刺激ホルモン，Glucose-dependent In
sulinotropic Polypeptide(ＧＩＰ)，グルカゴン，Gluc
agon-likePeptide(ＧＬＰ−ＩおよびII)，モチリン，サ
イモポエチン，サイモシン類，ユビキチン，血清胸腺因
子，胸腺液性因子，各種キニン類，ニューロテンシン，
タフトシン，および上記のペプチドのフラグメント等が
挙げられる。

【００１１】ペプチドの中には、Ｃ末端にアミドを有す
るもの、分子内に−Ｓ−Ｓ−結合を有するものも数多く
存在する。これらも上記目的とするペプチドに含まれ
る。例えば、ガストリン，カルシトニン，カルシトニン
遺伝子関連ペプチド，コレシストキニン−パンクレオザ
イミン(ＣＣＫ−ＰＺ)，エレドイシン，上皮細胞増殖因
子(ＥＧＦ)，腫瘍増殖因子(ＴＧＦ−α)，パンクレアス
タチン，インスリン，インスリン様成長因子類，黄体形
成ホルモン放出ホルモン(ＬＨ−ＲＨ)，メリチン，オキ
シトシン，バソプレシン類，Pancreatic Polypeptide，
トリプシンインヒビター，リラキシン，セクレチン，ソ
マトスタチン類，ソマトメジン類，サブスタンスＰ，ニ
ューロテンシン，セルレイン，サイロトロピン放出ホル
モン(ＴＲＨ)，Vasoactive Intestinal Polypeptide(Ｖ
ＩＰ)，Pituitary Adenyl CyclaseActivating Polypept
ide(ＰＡＣＡＰ)類，Gastnin Releasing Peptide(ＧＲ
Ｐ），エンドセリン類，Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ
Ｒｅｌｅａｓｉｕｇ Ｆａｃｔｏｒ，(ＣＲＦ)，Growth
Hormone Releasing Factor(ＧＲＦ)，ＰＴＨ−Related
Protein、ガラニン，ペプチドＹＹ，ニューロペプチド
Ｙ，パンクレアスタチン，心房性ナトリウム利尿ペプチ
ド類，および上記ペプチドのフラグメント等が挙げられ
る。

【００１２】本発明の方法に用いられるＮ末端にシステ
インを有する蛋白質としては、特定されるものではな
い。そのＮ末端にシステインを有しない蛋白質の場合
は、Ｎ末端にシステインを有するようにすればよい。該
Ｎ末端にシステインを有するペプチドとしては、分子量
が１００〜１０００００のものが好ましく、さらに、分
子量が３００〜５００００のものが好ましい。また、Ｎ
末端にシステインを有するペプチドとしては、１〜１０
００個のアミノ酸を有するものが好ましく、さらに３〜
５００個のアミノ酸を有するものが好ましい。該蛋白質
としては、たとえばインターフエロン類，インターロイ
キン類，線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)等各種成長因子
類，(プロ)ウロキナーゼ類，リンホトキシン，Tumor Ne
crosis factor(ＴＮＦ)，β−ガラクトシターゼなどの
酵素タンパク類，貯蔵タンパク類，ストレプトアビシ
ン，プロテインＡ，プロテインＧ,Tissue Plasminogen
Activator(ＴＰＡ)，又はこれらの一部などのＮ末端に
システインを有するものが挙げられる。

【００１３】本発明方法で用いられる融合蛋白質をコー
ドする遺伝子は、(１)全塩基配列を化学的に合成しても
よいし、(２)蛋白質をコードする塩基配列のＮ末端側に
システインをコードする塩基配列を配置しさらにそのＮ
末端側にシステインを含まないペプチドをコードする塩
基配列を配置することにより該遺伝子を構築してもよ
い。また、 （３）該ペプチドのフラグメントを得るのが
目的の場合には、所望のフラグメントの直後のアミノ酸
残基を site-directed mutagenesis 等の手法で、システ
インに置換した該遺伝子を構築すればよい。

【００１４】上記の(１)の場合の製造法としてはたとえ
ば、ホスホアミダイド法，リン酸トリエステル法，ジエ
ステル法，ハイドロジェンホスホネート法などを用い
て、短いものなら一度に、長いものでは分割して合成し
た後にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して作成するこ
とが可能である。

【００１５】上記の(２)の場合の製造法としてはたとえ
ば、Ｃ末端の蛋白をコードする遺伝子は、染色体から適
当な制限酵素で切断し、ベクターに連結して得るか、も
しくはcＤＮＡを取得する。しかる後にＮ末端がシステ
インになるように制限酵素で切断するか、もしくは、合
成ＤＮＡを全蛋白もしくはその一部の遺伝子の５′−末
端に結合しＮ末端がシステインになるように改変する。
その５′−末端に目的の蛋白質をコードする遺伝子(化
学合成したものでも、生体よりクローニングしてきたも
のでもよい)をつなげる。などが考えられる。該ＤＮＡ
の具体例としては、たとえば (１) TACGCGGAAGGGACTTTCATCAGTGACTACAGTATTGCCATGGACAAGATTCACCAACAAGACTTTGTGAAC TGGCTGCTGGCCCAAAAGGGGAAGAAGAATGACTGGAAACACAACATCACCCAGＴＧＣ又はＴＧＴＲ (配列表：配列番号３および４) (２) TCTGTGAGTGAAATACAGCTTATGCATAACCTGGGAAAACATCTGAACTCGATGGAGAGAGTAGAATGGCTG CGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCACAATTTTＴＧＣ又はＴＧＴＲ (配列表：配列番号５および６) (３) CATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCT TGGCTGGTGAAAGGCCGAGGAＴＧＣ又はＴＧＴＲ (配列表：配列番号７および８)

【００１６】(１)はGlucose-dependent Insulinotropic
Polypeptide(ＧＩＰ)（図２；配列表：配列番号１１）
をコードするＤＮＡ，(２)はParathyroid Hormoneの１
〜３４位のアミノ酸配列に対応するペプチド，ＰＴＨ
(１−３４)（図４；配列表：配列番号１３），をコード
するＤＮＡ，および、(３)はGlucogon-like Peptide Ｉ
(７−３７)，〔ＧＬＰ−Ｉ(７−３７)(インスリノトロ
ピン)〕（図３；配列表：配列番号１２），をコードす
るＤＮＡである。〔式中、Ｒは CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC (ｈｂＦＧＦの断片) からなる塩基配列を示す。〕で表わされるＤＮＡが挙げ
られる。目的ペプチドがＣ末端にアミドを有する場合に
は、アミドに変換可能なグリシンをコードするＧＧＴ，
ＧＧＣ，ＧＧＡ，ＧＧＧのいずれもの配列をＴＧＴ又は
ＴＧＣの５′側に挿入してもよい。

【００１７】５′末端にＡＴＧを有し、その下流に該融
合蛋白質をコードする領域、ついで翻訳終止コドンを有
するＤＮＡ(プラスミド)は、化学合成で、あるいは遺伝
子工学的に製造された公知の該蛋白質のcＤＮＡ、もし
くは、染色体由来の該蛋白質ＤＮＡを加工することによ
り製造することができる。

【００１８】本発明のＮ末端にシステインを有する蛋白
質またはペプチドのＮ末端にシステインを含まないペプ
チドを連結した融合蛋白質またはペプチドをコードする
遺伝子を、従来のＤＮＡ技術、例えば特定部位指向性変
異誘発技術を用いて目的のムテインをコードする遺伝子
に変換することができる。特定部位指向性変異誘発技術
は周知であり、アール・エフ・レイサー(Lather,R. F.)
及びジェイ・ピー・レコック(lecoq, J. P.)、ジェネ
ティック・エンジニアリング(Genetic Engineering)、
アカデミックプレス社(１９８３年)第３１−５０頁に示
されている。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発
はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．） 及びエス・ギ
ラム(Gillam, S.)、ジェネティック・エンジニアリン
グ：原理と方法、プレナムプムス社(１９８１年)３巻
１−３２頁に示されている。

【００１９】本発明で用いられる融合蛋白質またはペプ
チドをコードする構造遺伝子を製造するためには、たと
えば、(ａ)１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異オリ
ゴヌクレオチドプライマーと雑種形成させる、(ｂ)ＤＮ
Ａポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、突然変異
性ヘテロ二量体（heteroduplex）を形成させる、続いて
(ｃ)この突然変異性ヘテロ二量体を複製する、等の方法
が挙げられる。オリゴヌクレオチドプライマーの大きさ
は、突然変異を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの
安定な雑種形成に必要な条件により、また現在利用可能
なオリゴヌクレオチド合成法の限界によって決まる。オ
リゴヌクレオチドで指示される突然変異誘発に使用する
オリゴヌクレオチドを設計するに当たって、考慮すべき
因子（例えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する
部分の大きさ）は、エム・スミス及びエム・ギラム（前
掲）によって記載されている。概して、オリゴヌクレオ
チドの全長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑
種形成を最適化するような長さであり、突然変異サイト
から５'及び３'末端までの伸長部分（extensions）は、
ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突
然変異の編集をさけるのに十分な大きさとする。本発明
に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチド
は、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ましくは
約１４個ないし約２０個の塩基を含有する。さらに好ま
しくは１４個ないし１８個の塩基を含有する。これらは
通常、変異されるコドンの少なくとも約３個の塩基３'
側を含有する。

【００２０】上記式(Ｉ)で示されるペプチドは、ヒトＰ
ＴＨの誘導体である。元のヒトＰＴＨのアミノ酸配列を
次に示す。 Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met- 1 5 10 15 Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala- 20 25 30 35 Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys- 40 45 50 Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys- 55 60 65 70 Ala-Asp-Val-Asn-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln 75 80 (配列表：配列番号９)

【００２１】例えば、ヒトＰＴＨ(１−８４)をコードす
る遺伝子から、式(Ｉ)で表わされるペプチドをコードす
る遺伝子を特定部位指向性変異誘導技術により製造する
ことができる。たとえば、ヒトＰＴＨのバリンがシステ
インに置換されたムテインを得る場合には、合成ヌクレ
オチドプライマーを用いる方法を該変異誘導技術により
製造することができる。たとえば、ヒトＰＴＨの３５−
位のバリンをシステインに置換する場合の好ましいプラ
イマーとしては、 ＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧＣＧＣＣＴＴＡＧＧ−３′ (オリゴヌクレオチド プライマーＡ) (配列表：配列番
号１０)が挙げられる。

【００２２】プライマーは、ヒトＰＴＨ遺伝子の１本鎖
がクローン化されたＭ１３〔Yanisch-Perror, C., Viei
ra, J. Messing, ジーン(Gene), 33 109-119(1985)； M
essing J. メソッズ・イン・エンザイモロジー（Method
s in Enzymology), 101 20-78(1983)〕，fd〔R. Herrma
n et al. モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティック（Mol. Gen. Genet.), 177 231(1980)〕，又は
φ×174〔M. Snith and S. Gillam, ジェネティック・
エンジニアリング(Genetic Engineering), Plenum Pres
s, Vol. 3, pp 1-32(1981)〕のような１本鎖ファージあ
るいは、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９〔J. Vieira, J.
Messing, メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in
Enzymology), 153, 3-11(1987)〕といったファージとプ
ラスミドのキメラベクターへ雑種形成される。ファージ
が遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも運搬
できることは認められる。ファージがアンチセンス鎖を
運搬する時には、別のアミノ酸を暗号づけたトリプレッ
トを決定するこのコドンとの不一致以外にもプライマー
は突然変異させるコドンを含有するセンス鎖の領域とコ
ドンの縮退のために同一でない場合があってもよい。同
様にファージがセンス鎖を運搬する時には、欠損させる
コドンと対合をつくるトリプレット中の適当な不一致以
外は、突然変異させるコドンを含有するセンス鎖の領域
に対して相補的でない場合があってもよい。雑種形成に
使用される条件はエム・スミス及びエム・ギラム（前
掲）によって記載されている。温度は通常、約０℃ない
し７０℃、もっと一般的には約１０℃ないし５０℃の範
囲にある。雑種形成後、プライマーは大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素又は
他の適当なＤＮＡポリメラーゼとの反応によってファー
ジＤＮＡ上で伸長される。生ずる二重鎖ＤＮＡ（dsＤＮ
Ａ）は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼで
の処理によって閉鎖環dsＤＮＡへ変換される。１本鎖領
域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレアー処理に
よって破壊できる。

【００２３】生ずる突然変異成形ヘテロ二量体は、被感
染能力をもつ宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用
される。宿主によるヘテロ二量体の複製では、双方の鎖
から子孫ができる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子
孫から突然変異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。次に、突然変異化された遺伝子を運搬す
るファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。

【００２４】該融合蛋白質をコードする領域を有するＤ
ＮＡを有するプラスミドを製造するにあたって、ベクタ
ーとして用いられるプラスミドとしては、例えばＣolＥ
Ｉ由来のpＢＲ３２２〔ジーン(Gene)，２，９５(１９７
７)〕，pＢＲ３１３〔ジーン， ２，７５(１９７
７)〕，pＢＲ３２４，pＢＲ３２５〔ジーン４，１２４
(１９７８)〕，pＢＲ３２７，pＢＲ３２８〔ジーン９，
２８７(１９８０)〕，pＢＲ３２９〔ジ ーン１７，７９
(１９８２)〕，pＫＹ２２８９〔ジーン３，１(１９７
８)〕，pＫＹ ２７００〔生化学５２，７７０(１９８
０)〕，pＡＣＹＣ１７７，pＡＣＹＣ１８４〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriolog
y)１３４，１１４１(１９７８)〕，ｐＲＫ２４８，ｐＲ
Ｋ６４６，pＤＦ〔メソッズ・イン・エン ジーモロジー
(Methods in Enzymology)６８，２６８(１９７９)〕，p
ＵＣ１８，pＵＣ１９〔ヤニシューペロンら，ジーン(Ge
ne)，３３，１０３(１９８５)〕などが挙げられる。ま
た、バクテリオファージ、たとえばλファージを使用し
たλgt系のλgt・λＣ〔Proc. Nat. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ. ７１，４５７９(１９７４)〕，λgt・λＢ〔Proc.
Nat. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ. ７２，３４６１(１９７
５)〕，λＤam〔ジーン１，２５５(１９７７)〕やシャ
ロンベクター〔サイエンス(Science)１９６，１６１(１
９７７)；ジャーナル・オブ・ビーロロジー(Journal of
Virology)２９，５５５(１９７９)〕，繊維状ファー
ジを使用したmp系のmp１８，mp１９〔ヤニシューペロン
ら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９８５)〕ベクター
なども挙げられる。

【００２５】上記ＤＮＡは、ＡＴＧの上流にプロモータ
ーを有しているのが好ましく、該プロモーターは、形質
転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。たとえば大腸菌(Esc
herichia coli)ではtrpプロモーター，lacプロモータ
ー，rec Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，lppプ
ロモーター，Ｔ−７プロモーターなど、枯草菌(Bacillu
s subtilis)ではＳＰＯ１プロモーター，ＳＰＯ２プロ
モーター，penＰプロモーターなど、酵母(Saccharomyce
s cerevisiae)ではＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロ
モーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターな
ど、動物細胞ではＳＶ４０由来のプロモーターなどが挙
げられる。必要によりＳＤ(シヤインアンドダルガーノ)
配列をプロモーターの下流に挿入してもよい。Ｔ−７プ
ロモーターの系を用いる場合には、Ｔ−７プロモーター
としては、Ｔ７ＤＮＡ上で見い出されている１７種のプ
ロモーター〔J. L. Oakley ら，Proc. Natl. Acad. Sc
i, Ｕ.Ｓ.Ａ，７４：４２６６−４２７０(１９７７)，
M. D.Rosa, Cell １ ６：８１５−８２５(１９７９)，N.
Panayotatos ら，Nature ２８ ０：３５(１９７９)，
J. J. Dunn ら，J. Mol. Biol. １６６：４７７−５３
５(１９８３)〕のいずれでもよいがφ１０プロモーター
〔A. H. Rosenberg ら，Gene ５６：１２５−１３５(１
９８７)〕が好ましい。

【００２６】転写ターミネーターとしては、大腸菌の系
で作動するターミネーターならいずれでもよいが、好ま
しくはＴφターミネーター〔F. W. Studier ら，J. Mo
l. Biol. １８９：１１３−１３０(１９８６)〕が用い
られる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子としてはＴ７遺
伝子〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol. １８９：１１
３−１３０(１９８６)〕をあげることが出来る。ベクタ
ーは上記ベクターにＴ７プロモーター，Ｔ７ターミネー
ターを組み込んで構築される。このようなベクターとし
ては、pＥＴ−１，pＥＴ−２，pＥＴ−３，pＥＴ−４，
pＥＴ−５〔A. H. Rosenberg, Gene ５６：１２５−１
３５(１９８７)〕をあげることができるが、好ましくは
pＥＴ−３ｃ〔A. H. Rosenberg〕が用いられる。

【００２７】本発明の形質転換体は、上記方法で得られ
る発現用プラスミドを自体公知の方法〔例、コーエンS,
N, ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス(Pro. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.
Ａ.)，６９，２１１０(１９７２)〕で宿主を形質転換す
ることにより製造することができる。形質転換される微
生物の宿主としては、たとえば、エシエリシア(Escheri
chia)属菌，バチリス(Bacillus)属菌，酵母，動物細胞
などが挙げられる。

【００２８】上記エシエリシア属菌の例としては、エシ
エリシア・コリ(E. coli)が挙げられ、具体的にはエシ
エリシア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２ＤＨ１〔プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ.Ｓ.Ａ.)６
０，１６０(１９６８)〕，ＪＭ−１０３〔ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ，(Nucleic Acids Research)９，
３０９(１９８１)〕，Ｊ Ａ２２１〔ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular
Biology)１２０，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレ キュラー・バイオロジー，４
１，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
(Genetics)，３９，４４０(１９５４)〕，Ｎ４８３０
〔セル(Cell)２５，７１３(１９８１)〕，Ｋ−１２ＭＭ
２９４〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ７３，４１７４(１９７
６)〕ＢＬ−２１などが挙 げられる。

【００２９】上記バチルス属菌としては、たとえばバチ
ルス・サチルス(Bacillus subtilis)が挙げられ、具体
的にはバチルス・サチルスＭＩ１１４(ジーン，２４，
２５５(１９８３))，２０７−２１〔ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Journalof Biochemistry)９５，
８７(１９８４)〕などが挙げられる。

【００３０】上記酵母としては、たとえばサッカロマイ
セス・セレビシアエ(Saccharomycescerevisiae)が挙げ
られ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシアエＡ
Ｈ２２〔Proc. Natl. Acid. Sci. ＵＳＡ，７５，１９
２９(１９７８)〕，ＸＳＢ５２ −２３Ｃ〔Proc. Natl.
Acid. Sci. ＵＳＡ，７７ ２１７３(１９８０)〕，Ｂ
Ｈ −６４１Ａ(ＡＴＣＣ ２８３３９)，２０Ｂ−１２
〔Genetics ８５，２３(１９ ７６)〕，ＧＭ３Ｃ−２
〔Proc. Natl. Acid. Sci. ＵＳＡ，７８ ２２５８(１
９ ８１)〕などが挙げられる。

【００３１】動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ
Ｓ−７〔セル(Cell)２３，１７５(１９８１)〕，Vero
〔(日本臨床 ２１，１２０９(１９６３)〕，チャイニ
ーズハムス ター細胞ＣＨＯ〔ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・メデイシン(J.Exp. Med.)１０８，９
４５(１９８５)〕，マウスＬ細胞〔ジャーナル・オブ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート(J. Nat.
Cancer Inst.)４，１６５(１９ ４３)〕，ヒトＦＬ細
胞〔プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・ フ
ォー・ エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・
メディシン(Proc. Sco. Etp. Biol. Med.)９４，５３２
(１９５７)〕，ハムスターＣ細胞などが挙げら れる。

【００３２】Ｔ−７プロモーターの系を用いる場合に
は、その形質転換体の宿主としては、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子(Ｔ７遺伝子１)〔F. W. Studierら，J. Mo
l. Biol. １８９：１１３−１３０(１９８６)〕を組み
込んだ大腸菌株、例えばＭＭ２９４，ＤＨ−１，Ｃ６０
０，ＪＭ１０９，ＢＬ２１，あるいはＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子(Ｔ７遺伝子１)を他のプラスミドと共に組
込んだ大腸菌株など、ならいずれでもよい。好ましくは
Ｔ７遺伝子１を組み込んだλファージが溶原化したＭＭ
２９４株およびＢＬ２１株が用いられる。この場合Ｔ７
遺伝子１のプロモーターとしては、イソプロピル−１−
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧと略する
ことがある。)で発現が誘導されるlacプロモーターが用
いられる。

【００３３】バチルス属菌を宿主として形質転換するに
は、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Molecular and General Genetics), 16
8, 111(1979)など公知の方法に従って行なうことができ
る。酵母菌を宿主として形質転換するには、たとえばPr
oc. Natl. Acad. Sci. USA，75, 1929(1978)などの公知
の方法に従って行なうことができる。動物細胞を宿主と
して形質転換するには、たとえばヴィーロロジー(Virol
ogy,52, 456(1973)などの公知の方法に従って行なうこ
とができる。融合蛋白は、上述の形質転換体を培地に培
養し、産生された融合蛋白を採取することにより製造す
ることができる。培地のpＨは約６〜８が望ましい。

【００３４】エシェリキア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972)〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、たとえば３β−インドリル アクリル酸やイソプロ
ピルβＤ−チオガラクトピラノシドのような薬剤を加え
ることができる。

【００３５】宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通
常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、
通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌
の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bost
ian, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. S
ci.) USA,77, 4505(1980)〕が挙げられる。培地のpＨは
約５〜８に調整するのが好ましい。 培養は通常約２０
℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。

【００３６】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、たとえば約０.２〜２０％好まし
くは約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイ
エンス(Science) 122, 501(1952)〕，ＤＭＥ培地〔ヴィ
ロロジー(Virology), 8, 396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６
４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(The Journal of the American
Medical Association) 199, 519(1967)〕，１９９培地
〔プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the
Society for the Biologcal Medicine) 73, 1 (195
0)〕などが挙げられる。pＨは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００３７】融合蛋白質は、上記形質転換体を培養し、
培養物中に該融合蛋白質を生成，蓄積せしめ、これを採
取することにより製造することができる。培地として
は、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミ
ラー，J.，エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
ェネテイクス(Experiments in Molecular Genetics)，
４３１−４３３(Cold Spring Horbor Laboratort，New
York１９７２)〕，２×ＹＴ培地〔メシング，メソッド
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)，
１０１，２０(１９８３)〕ＬＢ培地などが挙げられる。

【００３８】培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。λc
Ｉtsリプレッサーと、λＰ_L−プロモーターを含有する
発現ベクターとを有する組換え体を使用する場合には、
培養は約１５〜３６℃好ましくは約３０℃〜３６℃の温
度で行い、λc Ｉtsリプレッサーの不活化は約３７℃〜
４２℃で行うのが好ましい。またrecＡプロモーターを
より効率良く働かせるため、すなわちrecＡ遺伝子発現
抑制機能 を低下せしめるため、必要によりマイトマイ
シンＣ，ナルジキシン酸などのような薬剤を添加した
り、紫外線を照射する、あるいは培養液のｐＨをアルカ
リ側に変化させてもよい。Ｔ−７プロモーターの系を用
いている場合には、(１)lacプ ロモーターの下流に連結
されているＴ７遺伝子(ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子)を発
現させる時はＩＰＴＧなどを添加する、もしくは(２)λ
Ｐ_Lプロモーターの下流に連結されているＴ７遺伝子
（ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子）を発現させる時は培養の
温度を上昇させることなどにより、生成するＴ７ファー
ジＲＮＡポリメラーゼ１により特異的にＴ７プロモータ
ーを作動させる。

【００３９】培養後、公知の方法で菌体を集め、たとえ
ば緩衝液に懸濁したのち、たとえば、蛋白変性剤処理，
超音波処理やリゾチームなどの酵素処理，グラスビーズ
処理，フレンチプレス処理，凍結融解処理などを行って
菌体を破砕し、遠心分離など公知の方法によって上清を
得る。上記により得られた上清から、融合蛋白質をより
単離するには、通常知られている蛋白質の精製法に従え
ばよい。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラ
フィー，吸着クロマトグラフィー，高速液体クロマトグ
ラフィー，アフイニティークロマトグラフィー，疎水ク
ロマトグラフィー，電気泳動等を適切に組み合せて行う
ことができる。ここに得られる該融合蛋白質のＮ末端に
は翻訳開始コドンに由来するメチオニンが付加している
場合がある。また、該融合蛋白質は、精製することな
く、あるいは部分精製の状態で、次の反応工程に進んで
もよい。

【００４０】本発明の原料化合物を化学的に合成するに
は、ペプチド自動合成装置によって行うことができる。
基本的な合成過程等はR. B. Merrifield〔アドバンシズ
・イン・エンザイモロジー(Advances in Enzymology) 3
2, 221-296(1969)〕の方法に順じて行なうことができ
る。この方法は、カルボキシル末端のアミノ酸を樹脂担
体に共有結合させておき、α−アミノ基の保護基の除
去、保護アミノ酸の縮合を順次繰り返して、アミノ末端
に向けてペプチド鎖を延長させ目的のアミノ酸配列を有
する保護ペプチド樹脂を得る事をその原理としている。
各アミノ酸の縮合やα−アミノ基の保護基の除去など
は、ほぼ同一の条件でなされ、中間体の精製も行なわな
い為、合成に際しては一般に高度な熟練は要求されな
い。しかもこの方法は迅速であり、種々のペプチドを合
成するに際し、非常に便利な方法である。こうして得ら
れた保護ペプチド樹脂を、例えば無水フッ化水素、トリ
フルオロメタンスルホン酸もしくはトリフルオロ酢酸と
種々の添加物の共存下に反応させる事により、ペプチド
の樹脂からの脱離と全保護基の除去を一段階で行うこと
ができる。得られたペプチド粗精製物は、ペプチドまた
は蛋白質を精製する公知の手段で精製することができ
る。例えばゲル濾過、陽イオン交換、もしくは陰イオン
交換樹脂を用いるイオン交換クロマトグラフィー、さら
には疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロマトグラフ
ィー等、種々の原理によるカラムクロマトグラフィーや
高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。

【００４１】次に、このようにして得られる融合蛋白質
やペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結
合の切断反応に付す。該切断反応としては、たとえば、
シアノ化反応次いで加水分解反応またはアミノリシスが
挙げられる。該シアノ化反応は、原料化合物に、Ｓ−シ
アノ化試薬を作用させることにより行なう。

【００４２】Ｓ−シアノ化試薬としてはたとえば２−ニ
トロ−５−チオシアノ安息香酸(ＮＴＣＢ)，１−シアノ
−４−ジメチルアミノピリジウム塩(ＤＭＡＰ−ＣＮ)，
ＣＮ^-イオンなどが挙げられる。該Ｓ−シアノ化試薬の
量は、全チオール基の約２倍から５０倍量であればよ
い。より好ましくは約５倍〜１０倍量であればよい。反
応温度は約０゜〜８０℃の間であれば、いずれでもよ
く、約０゜〜５０℃の間がより好ましい。用いる溶媒と
しては、シアノ化試薬と反応しないものであれば、いず
れの緩衝液でもよいが、例えば、トリス−塩酸緩衝液，
トリス−酢酸緩衝液，リン酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，な
どがあげられる。また、有機溶媒は、シアノ化試薬と反
応しないものであれば、存在していてもよい。該反応
は、pＨ１〜１２の間で行なうのが良い。特に、ＮＴＣ
Ｂを用いる場合にはpＨ７〜１０，ＤＭＡＰ−ＣＮを用
いる場合にはＳ−Ｓ交換反応を防止するため、pＨ２〜
７の間が好ましい。また、反応液中には、塩酸グアニジ
ン等の変性剤が存在していてもよい。

【００４３】上記加水分解反応またはアミノリシスとし
ては、たとえばアルカリ処理に付すことが挙げられる。
該アルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液
のpＨを７〜１４に、調整することにより行なわれる。
該pＨの調整は、例えば水酸化ナトリウム，アンモニ
ア，置換アミノ化合物，トリツマベース（トリス〔ヒド
ロキシメチル〕−アミノメタン），リン酸第２ナトリウ
ム，水酸化カリウム，水酸化バリウム等の溶液を原料化
合物を含有する水溶液に適当量加えて行う。該置換アミ
ノ化合物としては、上述したものが挙げられる。上記反
応の際の溶液の濃度としては、たとえば水酸化ナトリウ
ムの場合は約０.０１〜２Ｎ好ましくは約０.１〜１Ｎ、
アンモニアまたは置換アミノ化合物の場合は約０.０１
〜１５Ｎ好ましくは約０.１〜３Ｎ、トリツマベースの
場合は約１mＭ〜１Ｍ好ましくは約２０mＭ〜２００m
Ｍ、リン酸第２ナトリウムの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ま
しくは約１０mＭ〜１００mＭ、水酸化カリウムの場合は
約０.０１〜４Ｎ好ましくは約０.１〜２Ｎ、水酸化カリ
ウムの場合は約０.０１〜０.２Ｍ好ましくは約０.１〜
０.２Ｍが挙げられる。反応温度は約０゜〜８０℃の間
であればいずれでもよく、約０゜〜５０℃の間がより好
ましい。

【００４４】反応時間は、好ましくは、シアノ化反応は
約１〜６０分好ましくは約１５〜３０分が、加水分解反
応は約５分〜１００時間好ましくは１０分〜１５時間
が、アミノリシスは約５分〜２４時間好ましくは約１０
〜１８０分が挙げられる。上記のシアノ化および加水分
解またはアミノリシスにより、図１に示される反応が起
こると考えられる。図１において、ＸはＯＨまたはＲ−
ＮＨ−(Ｒ−ＮＨ−はアミノまたは置換アミノ基を示
す。）を示す。該反応において、アンモニアまたは置換
アミノ化合物を用いた場合には、対応するアミド化合物
または置換アミド化合物が得られる。

【００４５】切り出された目的ペプチドを単離するに
は、通常知られているペプチドの精製法に従がえばよ
い。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフィ
ー，高速液体クロマトグラフィー，アフイニティークロ
マトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロマ
トグラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うことが
できる。ここで得られる目的ペプチドのＮ末端には翻訳
開始コドンに由来するメチオニンが付加している場合が
ある。また、得られる目的ペプチドは、必要によりこれ
を凍結乾燥により粉末とすることもできる。凍結乾燥に
際しては、ソルビトール，マンニトール，デキストロー
ス，マルトース，トレハロース，グリセロールなどの安
定化剤を加えることができる。

【００４６】この方法を用いれば、種々の生理活性を有
するペプチドを任意に製造することができる。例えば本
発明の方法で製造されるＧＩＰ(Glucose-dependent ins
ulinotropic Polypeptide)(アミノ酸配列を〔図２〕に
示す。配列表：配列番号１１)やＧＬＰＩ（７−３７）
（アミノ酸配列を〔図３〕に示す。配列表：配列番号１
２）は、生理的濃度のグルコースの存在下に、インスリ
ンの分泌を促進するので、安全度の高い糖尿病治療薬と
して用いることができる。また、本法を用いて調製され
る副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)，はそのＮ末端より３４個
のペプチドよりなる活性フラグメント，ＰＴＨ(１−３
４)(アミノ酸配列を〔図４〕に示す。配列表： 配列番
号１３)は骨の新陳代謝を高めるので、骨粗鬆症の治療
薬として有用である。

【００４７】本発明の方法で製造されるペプチドは滅菌
水，ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)，生理食塩水その他公
知の生理学的に許容される担体と混合することができ、
非経口的に又は局所に投与することができる。たとえ
ば、その１日投与量は、約２千〜２００万ユニット／k
g、好ましくは、約８万〜８０万ユニット／kgを、静注
または筋注などにより非経口的に投与することができ
る。本発明の方法で製造されるペプチドを含有する製剤
は、塩，希釈剤，アジュバント，他の担体，バッファ
ー，結合剤，界面活性剤，保存剤のような生理的に許容
される他の活性成分も含有していてもよい。非経口的投
与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒と
の懸濁液アンプル、または生理学的に許容される希釈液
で用事希釈して使用しうる滅菌粉末(通常ペプチド溶液
を凍結乾燥して得られる)アンプルとして提供される。

【００４８】本発明の一般式(Ｉ)で表わされるヒトＰＴ
Ｈ(１−３４)誘導体ペプチドは、骨粗鬆症治療剤、副甲
状腺機能低下症の治療剤、高血圧治療剤として用いるこ
とができる。そしてその剤型としては、注射剤、経鼻吸
収剤、直腸吸収剤、膣吸収剤、経皮吸収剤もしくは点眼
剤のようなものが挙げられるが、場合により経口投与さ
れることもある。該ペプチドをこのような治療剤として
用いる場合、哺乳動物に対してその有効量が用いられ
る。一般的には１ng〜１００μg／体重kgの範囲で用い
られる。このペプチドを治療剤として用いる場合には、
注意深く精製を行ない細菌や発熱物質が存在しないよう
に注意しなければならない。このペプチドを骨粗鬆症な
どの治療薬として用いる場合、そのままあるいは薬理学
的に許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合したのち、
上記注射剤、経鼻吸収剤、直腸吸収剤、膣吸収剤、経皮
吸収剤もしくは点眼剤などの剤型で非経口的に投与する
ことができる。投与量は成人の場合、注射剤の場合、１
回あたり５０ng〜５mg、好ましくは１〜５００μgで１
〜３日に１回の投与が適当である。治療剤の濃度は注射
剤では１０〜１００μg／mlが適当である。

【００４９】本明細書および図面において、アミノ酸，
ペプチド，保護基，活性基，その他に関し略号で表示す
る場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ(Commission on B
iochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙
げる。また、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 Ｇly ：グリシン Ａla ：アラニン Ｖal ：バリン Ｌeu ：ロイシン Ｉle ：イソロイシン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｍet ：メチオニン Ｇlu ：グルタミン酸 Ａsp ：アスパラギン酸 Ｌys ：リジン Ａrg ：アルギニン Ｈis ：ヒスチジン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｔyr ：チロシン Ｔrp ：トリプトファン Ｐro ：プロリン Ａsn ：アスパラギン Ｇln ：グルタミン Ａib ：アミノイソブチル酸 Ｎle ：ノルロイシン β−Ａla ：β−アラニン ｈＰＴＨ ：ヒトＰＴＨ Ｆmoc ：９−フルオレニルメトキシカルボニル Ｎva ：ノルバリン Ａbu ：α−アミノブチリル酸

【００５０】後述の実施例５(２)で得られた形質転換体
Escherichia coli ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pＴＢ９６０
−３は、１９９１年１０月１６日から財団法人発酵研究
所(ＩＦＯ)にＩＦＯ １５２４１として寄託されてお
り、また該微生物は１９９１年１０月１９日から通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３６１５としてブダペスト条約に基づく寄託
がなされている。また、後述の実施例６(１)で得られた
形質転換体 Escherichia coli ＭＭ２９４(ＤＥ３)／p
ＴＢ９６０−７は、１９９１年１２月１７日からＩＦＯ
にＩＦＯ１５２５４として寄託されており、また該微生
物は１９９１年１２月２４日からＦＲＩにＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３６９０としてブダペスト条約に基づく寄託がなさ
れている。

【００５１】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
さらに詳しく説明する。 参考例１ テトラサイクリン耐性マーカーを持つrhbＦ
ＧＦムテインＣＳ２３産生組換え体の調製 ｈｂＦＧＦに存在する４つのシステイン残基のうち第６
９位および第８７位のシステイン残基をセリン残基に置
換したrhbＦＧＦムテインＣＳ２３をコードする遺伝子
が組込まれたプラスミドpＴＢ７６２(妹尾等，ビオケミ
カル，アンド，ビオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーション，１５１巻 ７０１−７０８頁，１９８８年，
ヨーロッパ特許出願公開第２８１,８２２号公報)を、Ａ
vaＩおよびＰstＩで完全消化し、rhbＦＧＦムテインＣ
Ｓ２３の大部分を含む約０.４５キロ塩基対の断片を得
た。この断片と合成ＤＮＡ ＧＡＴＣＴＧＣ (ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧ)をＴ４ＤＮＡリガーゼで接続
後、ＡvaＩ，ＰstＩで消化し、ＰstＩ切断部位をＢgl I
I切断部位に改変したフラグメントＡを得た。次にhbＦ
ＧＦのＣ末端の欠失したrhbＦＧＦムテインＣ１２８を
コードする遺伝子が組込まれたプラスミドpＴＢ９５５
(妹尾等，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー１８８巻 ２３９−２４５頁，１９９０年)
をＳalＩ，ＢamＨＩで完全消化し、約４.１キロ塩基対
のフラグメントＢを得た。また、pＴＢ９５５を、Ａva
Ｉ，ＳalＩで完全消化し、約３９０塩基対のフラグメン
トＣを得た。３つのフラグメントＡ，Ｂ，Ｃを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで接続し、アンピシリン耐性をマーカーに
持つ、発現プラスミドpＨＰ９０１を得た。〔図５〕 pＨＰ９０１を、ＥcoＲＩ，Ｂgl IIで完全消化し、rhb
ＦＧＦムテインＣＳ２３をコードする遺伝子とＴ７プロ
モーターとＴ７ターミネーターを含む約１.１キロ塩基
対のフラグメントを得た。ＥcoＲＩ，ＢamＨＩで完全消
化したpＵＣ１８に、このフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで接続し、プラスミドpＭＥ９０１を得た。
〔図６〕 pＭＥ９０１を、ＥcoＲＶ，Ｈind IIIで完全消化し、rh
bＦＧＦムテインＣＳ２３をコードする遺伝子とＴ７プ
ロモーターとＴ７ターミネーターを含む約０.７７キロ
塩基対のフラグメントを得、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
で、末端を平滑化した。このフラグメントを、ＳcaＩで
消化したpＢＲ３２２に、Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼで接続
し、テトラサイクリン耐性をマーカーに持つ、発現プラ
スミドpＣＭ ９０１を得た。〔図７〕

【００５２】実施例１ (ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質
産生組換え体の調製) 参考例１で得られたrhbＦＧＦムテインＣＳ２３発現プ
ラスミドpＣＭ９０１を制限酵素ＥcoＲＩ，ＡbaＩで消
化し、ＣＳ−２３遺伝子部分とＴ７−プロモーターを含
む断片を分取する。この断片と〔図８〕に示すＤＮＡシ
ンセサイザー(ＡＢＩ社，３８１Ａ)により合成された
５′末端に：ＸbaＩ切断部位，３′末端にＡbaＩ切断部
位をもつＧＩＰ遺伝子断片(〔図８〕，配列表：配列番
号１４)とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ＧＩ
Ｐ−ＣＳ２３融合遺伝子断片を調製する。この断片を制
限酵素ＥcoＲＩ，ＸbaＩで消化したpＣＭ９０１にＴ４
ＤＮＡリ ガーゼを用いて組み込み、pＣＭ９０１−１を
作製する。このプラスミドのＸba Ｉ切断部位に制限酵
素ＸbaＩを用いてpＣＭ−９０１から切り出されたＴ７
−プ ロモーターを組み込み、作製される発現プラスミ
ド，pＧＳ２３〔図９および図 １０〕を用いて大腸菌Ｍ
Ｍ２９４(ＤＥ３)株を形質転換させることにより、rhＧ
ＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白(〔図１１〕および〔図１２〕
に示す。配列表：配列番号１６)遺伝子を保持する組換
え体，大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pＧＳ２３を得る。

【００５３】実施例２ (組換え体の培養) ＬＢ培地(バクトトリプトン１０ｇ／ｌ，バクトイース
トエキス５ｇ／ｌ，食塩５ｇ／ｌ)にテトラサイクリン
５mg／ｌを添加した培地３０mlに、組換え大腸菌ＭＭ２
９４(ＤＥ３)／pＧＳ２３を１白金耳接種し、３７℃に
て一夜振盪培養する。この培養液をＭ−９培地(Ｎa₂Ｈ
ＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ １６.８ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄３ｇ／
ｌ，ＮＨ₄Ｃl １ｇ／ｌ，食塩０.５ｇ／ｌ，ＭgＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ０.２４６ｇ／ｌ)にグルコース１５ｇ／ｌ，
カザミノ酸１５ｇ／ｌ，塩酸チアミン１mg／ｌ，テトラ
サイクリン５mg／ｌを添加した培地３０mlへ、１.５ml
宛移植し、３７℃にて振盪培養を行なう。濁度が１００
〜１２０クレット単位まで生育した時点でＩＰＴＧを添
加し、さらに４時間培養を続ける。遠心分離により菌体
を集め、−２０℃にて保存する。

【００５４】実施例３ (ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質
の精製) 実施例２で得られる−２０℃に凍結保存した菌体(大腸
菌ＭＭ２９４(ＤＥ２３)／pＧＳ２３)を２５mＭリン酸
緩衝液(pＨ６.０)＋０.１mＭ ＡＰＭＳＦ(ｐ−アミジ
ノフェニルメタンスルホニルフルオロライド塩酸)＋２m
Ｍ ＤＴＴ(ジチオスレイトール)抽出用緩衝液に懸濁す
る。ガラスビーズを用いてダイノミル(ＫＤ−Ｓ型，ウ
ィリーバッフォフェン社，スイス)で氷冷下破砕操作を
行なう。その抽出液を遠心分離(２１型，ベックマン
社，米国)し、得られる上澄液を５０mＭリン酸緩衝液(p
Ｈ６.０)で平衡化したペパリン−５ＰＷ(７.５mmＩＤ×
７５mm，東ソー社)に吸着し、５０mＭリン酸緩衝液(pＨ
６.０)と５０mＭリン酸緩衝液(pＨ６.０)＋２Ｍ塩化ナ
トリウムとの間で、直線濃度勾配をかけて溶出を行な
う。主要溶出画分を０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化
したＯＤＰ−５０(４.６mmＩ Ｄ×１５０mm，旭化成社)
に吸着し、０.１％トリフルオロ酢酸と０.１％トリフ
ルオロ酢酸＋８０％アセトニトリルとの間で、直線濃度
勾配をかけて溶出を行なう。主要溶出画分を遠心減圧式
濃縮器(凍結乾燥機)(サーバント社，米国)を用いてＧＩ
Ｐ−ＣＳ２３融合蛋白質精製乾燥標品を得る。

【００５５】実施例４ (ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質
からＧＩＰの分離) ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質を６Ｍグアニジン塩酸塩を
含む０.２Ｍトリス−酢酸緩衝液(pＨ８.０)＋１０mＭジ
チオトレイトールに溶解し、１〜２時間、３７℃に加温
する。２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸を全チオー
ル基の５〜１０倍量加え、水酸化ナトリウムでpＨを８.
０に再調製する。その後、３７℃で１５分間反応させ
る。酢酸を加えてpＨを４以下として、４℃に冷却後、
透析あるいはゲルろ過(５０％酢酸)で脱塩を行なう。主
要溶出画分を遠心減圧式濃縮器(サーバント社，米国)を
用いて凍結乾燥した後、０.０１Ｎ酢酸に溶解し、５％
アンモニアでpＨ６.４に調整する。それをＣＭ−５ＰＷ
(７.５mmＩＤ×７５mm，東ソー社)に吸着させ、０.０１
Ｍ酢酸アンモニウムと０.２Ｍ酢酸アンモニウムの間
で、直線濃度勾配により溶出する。主要溶出画分を遠心
減圧式濃縮器(サーバン ト社，米国)を用いて凍結乾燥
した後、０.１％ＴＦＡに溶解し、ヌクレオシル５Ｃ１
８(１０mmＩＤ×２.５cm)に吸着させ、０.１％ＴＦＡと
０.１％ＴＦＡ＋８ ０アセトニトリルの間で、直線濃度
勾配により溶出する。主要溶出画分を遠心減圧式濃縮器
(サーバント社，米国)を用いて凍結乾燥し、精製ＧＩＰ
乾燥標品を得る。

【００５６】実施例５ (１)テトラサイクリン耐性マーカーを持つrhbＦＧＦム
テインＣＳ２３産生組換え体の調製：ＰＣＴ国際公開第
ＷＯ９１／０９１２６号公報に記載の方法により得られ
たpＴＢ９６０を、ＥcoＲＶ，Ｂgl IIで切断し、得られ
たrhbＦＧＦムテインＣＳ２３構造遺伝子を含む断片を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した。この断片
をＳcaＩで消化したpＢＲ３２２にＴ４ＤＮＡリガーゼ
で接続し、pＴＢ９６０−１を得た。〔図１３〕 更にpＴＢ９６０−１をＢsmＩ，Ｐvu IIで切断し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで接続し、テトラサイクリン耐性マーカーに持
つ、発現プラスミドpＴＢ９６０−２を得た。〔図１
４〕 (２)ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質産生組換え体の調製：
上記(１)で得られたrhbＦＧＦムテインＣＳ２３発現プ
ラスミドpＴＢ９６０−２をＸbaＩ，ＡvaＩで消化し
た。この断片と、〔図８〕に示されたＤＮＡ配列の
「５′ＴＣＴＡＧ」が「５′ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＧ
ＧＡＧ ＡＴＡ ＴＡＣＡＣＴ」となった、ＤＮＡシン
セサイザー(ＡＢＩ社，３８１Ａ)により合成された５′
末端にＸbaＩ切断部位，３′末端にＡvaＩ切断部位をも
つＧＩＰ遺伝子断片（配列表：配列番号１５）とをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、プラスミドpＴＢ９６
０−３を作成した(〔図１５〕)。発現プラスミドpＴＢ
９６０−３を用いて大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ３)株を形質
転換させることにより、rhＧＩＰ−ｈｂＦＧＦムテイン
ＣＳ２３（以下、ＧＩＰ−ＣＳ２３と略称することもあ
る。）融合蛋白(〔図１１〕および〔図１２〕に示す。
配列表：配列番号１６)遺伝子を保持する組換え体、大
腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＴＢ９６０−３(ＩＦＯ１
５２４１，ＦＥＲＭ ＢＰ−３６１５)を得た。 (３)組換え体の培養：ＬＢ培地(バクトトリプトン１０
ｇ／ｌ，バクトイーストエキス５ｇ／ｌ，食塩５ｇ／
ｌ)にテトラサイクリン５mg／ｌを添加した培地３０ml
に、上記(２)で得られた組換え大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ
３)／pＴＢ９６０−３を１白金耳接種し、３７℃にて一
夜振盪培養した。この培養液をＭ−９培地(Ｎa₂ＨＰＯ₄
・１２Ｈ₂ Ｏ １６.８ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄３ｇ／ｌ，
ＮＨ₄Ｃl １ｇ／ｌ，食塩０.５ｇ／ｌ，ＭgＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０.２４６ｇ／ｌ)にグルコース１５ｇ／ｌ，カ
ザミノ 酸１５ｇ／ｌ，塩酸チアミン１mg／ｌ，テトラ
サイクリン５mg／ｌを添加した培地３０mlへ、１.５ml
宛移植し、３７℃にて振盪培養を行なった。濁度が１０
０ 〜１２０クレット単位まで生育した時点でＩＰＴＧ
を添加し、さらに４時間培養を続けた。遠心分離により
菌体を集め、−２０℃にて保存した。

【００５７】(４)ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質の精製：
上記(３)で得られた−２０℃に凍結保存した形質転換体
大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ２３）／pＴＢ９６０−３を２５
mＭリン酸緩衝液(pＨ６.０)＋０.１mＭ ＡＰＭＳＦ(p
−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオロライド塩
酸)＋２mＭ ＤＴＴ(ジチオスレイトール)＋５０μg／m
l濃度のリゾチームを含む抽出用緩衝液に懸濁し、氷冷
下１時間放置した後、超音波細胞破砕機(インソネータ
ー，モデル２００Ｍ，クボタ社製)を用いて、氷冷下１
０分間処理した。得られた粗抽出液を遠心分離機(ベッ
クマン社製，モデルＪ２−２１，米国)を用いて遠心
し、得られた沈殿物(ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質の封
入体)を２５mＭリン酸緩衝液で洗浄した後、２％ＳＤＳ
または６Ｍグアニジン塩酸塩，１００mＭ ＤＴＴを含
む０.２Ｍ Ｔris−ＨＣl緩衝液(pＨ８.０)に懸濁し、
１００℃で５分間処理して可溶化した。得られた可溶化
蛋白質を０.１％トリフルオロ酢酸で平衡化したフェニ
ル５ＰＷ ＲＰ(４.５mm ＩＤ×７.５cm，東ソー社製)
に吸着し、０.１％トリフルオロ酢酸と０.１％トリフル
オロ酢酸＋８０％アセトニトリルとの間で直線濃度勾配
をかけて溶出を行なった。主要溶出画分を遠心減圧式濃
縮器(凍結乾燥機)(サーバント社，米国)を用いて減圧乾
固し、ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質精製乾燥品を得た。

【００５８】(５)ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質からＧＩ
Ｐの分離：ＧＩＰ−ＣＳ２３融合蛋白質を６Ｍグアニジ
ン塩酸塩を含む０.２Ｍトリス−酢酸緩衝液(pＨ８.０)
＋１０mＭジチオトレイトールに溶解し、１〜２時間、
３７℃に加温した。２−ニトロ−５−チオシアノ安息香
酸を全チオール基の５〜１０倍量加え、水酸化ナトリウ
ムでpＨを８.０に再調製した。その後、３７℃で１５分
間反応させた。酢酸を加えてpＨを４以下として、４℃
に冷却後、透析あるいはゲルろ過(５０％酢酸)で脱塩を
行なった。主要溶出画分を遠心減圧式濃縮器(サーバン
ト社，米国)を用いて凍結乾燥した後、６Ｍグアニジン
塩酸塩を含む、０.２Ｍトリス−塩酸緩衝液(pＨ９.０)
に溶解し、１２時間，３７℃に加温した後、１０ＫＤ膜
（セントリコン，アミコン社製）でろ過し、１０ＫＤ以
下の画分を０.１％ＴＦＡ＋２％アセトニトリルで平衡
化したphenyl ５ＰＷ ＲＰ(４.５mmＩＤ×７.５cm，東
ソー社製)に吸着させ、０.１％ＴＦＡ＋２％アセトニト
リルと０.１％ＴＦＡ＋８０％アセトニトリルの間で直
線濃度勾配により溶出した。主要溶出画分を遠心減圧式
濃縮器(サーバント社，米国)を用いて凍結乾燥した後、
２０mＭリン酸緩衝液（pＨ６.５）に溶解した。得られ
た粗精製ＧＩＰ溶液を、２０mＭリン酸緩衝液で平衡化
したＣＭ−５ＰＷ（７.５mmＩＤ×７.５cm，東ソ ー社
製)に吸着させ、２０mＭリン酸緩衝液（pＨ６.５）と２
０mＭリン酸緩衝液 （pＨ６.５）＋１.０Ｍ ＮaＣlの
間で直線濃度勾配により溶出した。得られた 主要溶出
画分を０.１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＳ−１２０Ｔ
（７.８mmＩＤ×３０cm，東ソー社製）に吸着させ、０.
１％ＴＦＡと０.１％ＴＦＡ＋８０％アセトニトリルの
間で直線濃度勾配により溶出した。主要溶出画分を遠心
減圧式濃縮器(サーバント社，米国)を用いて凍結乾燥
し、精製hＧＩＰ乾燥品を得た。

【００５９】(６)rhＧＩＰのアミノ酸分析：上記(５)で
得られたrhＧＩＰのＮ末端アミノ酸配列分析を４７７Ａ
型プロティンシーケンサー(アプライドバイオシステム
社)で分析した結果、Ｎ末端にＭetが付加されたhＧＩＰ
の配列が検出された(〔表１〕)。又アミノ酸組成分析を
６３３０型アミノ酸分析計(ベックマン社)で分析した結
果、理論値と一致していた（〔表２〕）。

【表１】 Ｎ末端アミノ酸配列分析 ────────────────────────── サイクル アミノ酸配列 塩基配列から予想 数 ＧＩＰ されるアミノ酸 ────────────────────────── １ Ｍet Ｍet ２ Ｔyr Ｔyr ３ Ａla Ａla ４ Ｇlu Ｇlu ５ Ｇly Ｇly ６ Ｔhr Ｔhr ７ Ｐhe Ｐhe ８ Ｉle Ｉle ９ Ｓer Ｓer １０ Ａsp Ａsp １１ Ｔyr Ｔyr １２ Ｓer Ｓer １３ Ｉle Ｉle １４ Ａla Ａla １５ Ｍet Ｍet １６ Ａsp Ａsp １７ Ｌys Ｌys １８ Ｉle Ｉle １９ Ｈis Ｈis ２０ Ｇln Ｇln ────────────────────────── ４７７Ａ型プロティンシーケンサー(アプライドバイオ
システム社)で分析

【表２】 アミノ酸組成分析 ───────────────────── アミノ酸 rhＧＩＰ 理論値 ───────────────────── Ａsp／Ａsn ６.８ ７ Ｔhr １.９ ２ Ｓer １.７ ２ Ｇlu／Ｇln ５.１ ５ Ｇly １.９ ２ Ａla ２.８ ３ Ｖal ０.８ １ Ｍet ２.０ ２ Ｉle ３.８ ４ Ｌeu １.８ ２ Ｔyr １.７ ２ Ｐhe ２.０ ２ Ｈis ２.１ ２ Ｌys ４.９ ５ Ｔrp¹⁾ １.９ ２ ───────────────────── 塩酸加水分解法（６Ｎ塩酸，１１０℃，２４時間） ６３３０型アミノ酸分析計(ベックマン社)で分析¹⁾ Edelhoch 法

【００６０】(７)rhＧＩＰの薄層クロマトグラフィー分
析：上記(５)で得られたrhＧＩＰをシリカゲル(Kieselg
el, メルク社製)とセルロース薄層プレート(アビセルＳ
Ｆ，フナコシ薬品(株)製)で分析した。展開溶媒として
ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝４：１：１：２
を用いて行なった結果Ｒf₁値(シリカゲル)＝０.３０，
Ｒf₂値(セルロース)＝０.４３であった。

【００６１】実施例６ (１)Insulinotropin（ＧＬＰ−Ｉ(７−３７)）−ＣＳ２
３融合蛋白質産生組換え体の調製：実施例５(１)で得ら
れたrhbＦＧＦムテインＣＳ２３発現プラスミドpＴＢ９
６０−２をＸbaＩ，ＡvaＩで消化した。この断片と〔図
１６〕（配列表：配列番号１７）に示すＤＮＡシンセサ
イザー（ＡＢＩ社，３８１Ａ）により合成された５′末
端にＸbaＩ切断部位，３′末端にＡvaＩ切断部位をもつ
ＧＬＰ−Ｉ(７−３７)（Insulinotropinと称することも
ある）遺伝子断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
し、プラスミドpＴＢ９６０−７を作成した（〔図１
７〕）。発現プラスミドpＴＢ９６０−７を用いて大腸
菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）株を形質転換させることにより
ＧＬＰ−Ｉ(７−３７)−hbＦＧＦムテインＣＳ２３（In
sulinotropin−ＣＳ２３と称することもある。）融合蛋
白（〔図１８〕に示す。配列表：配列番号１８）遺伝子
を保持する組換え体、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／p
ＴＢ９６０−７（ＩＦＯ １５２５４，ＦＥＲＭ ＢＰ
−３６９０）を得た。 (２)組換え体の培養：ＬＢ培地（バクトトリプトン１０
ｇ／ｌ，バクトイーストエキス５ｇ／ｌ，食塩５ｇ／
ｌ）にテトラサイクリン５mg／ｌを添加した培地３０ml
に、上記(１)で得られた組換え大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／pＴＢ９６０−７を１白金耳接種し、３７℃にて
一夜振盪培養した。この培養液をＭ−９培地（Ｎa₂ＨＰ
Ｏ₄・１２Ｈ₂Ｏ １６.８ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄３ｇ／ｌ，
ＮＨ₄Ｃl １ｇ／ｌ，食塩０.５ｇ／ｌ，ＭgＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０.２４６ｇ／ｌ）にグルコース１５ｇ／ｌ，カ
ザミノ酸１５ｇ／ｌ，塩酸チアミン１mg／ｌ，テトラサ
イクリン５mg／ｌを添加した培地３０mlへ、１.５ml宛
移植し、３７℃にて振盪培養を行なった。濁度が１００
〜１２０クレット単位まで生育した時点でＩＰＴＧを添
加し、さらに４時間培養を続けた。遠心分離により菌体
を集め、−２０℃にて保存した。

【００６２】(３)Insulinotropin−ＣＳ２３融合蛋白質
の精製：上記(２)で得られた−２０℃に凍結保存した形
質転換体大腸菌ＭＭ２９４(ＤＥ２３）／pＴＢ９６０−
７を２５mＭリン酸緩衝液(pＨ６.０)＋０.１mＭ ＡＰ
ＭＳＦ(p−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオロ
ライド塩酸)＋２mＭ ＤＴＴ(ジチオスレイトール)＋５
０μg／ml濃度のリゾチームを含む抽出用緩衝液に懸濁
し、氷冷下１時間放置した後、超音波細胞破砕機(イン
ソネーター，モデル２００Ｍ，クボタ社製)を用いて、
氷冷下１０分間処理した。得られた粗抽出液を遠心分離
機(ベックマン社製，モデルＪ２−２１，米国)を用いて
遠心し、得られた沈殿物(Insulinotropin−ＣＳ２３融
合蛋白質の封入体)を２５mＭリン酸緩衝液で洗浄した
後、２％ＳＤＳまたは６Ｍグアニジン塩酸塩，１００m
Ｍ ＤＴＴを含む０.２Ｍ Ｔris−ＨＣl緩衝液(pＨ８.
０)に懸濁し、１００℃で５分間処理して可溶化した。
得られた可溶化蛋白質を０.１％トリフルオロ酢酸で平
衡化したフェニル５ＰＷ ＲＰ(４.５mmＩＤ×７.５c
m，東ソー社製)に吸着し、０.１％トリフルオロ酢酸と
０.１％トリフルオロ酢酸＋８０％アセトニトリルとの
間で直線濃度勾配をかけて溶出を行なった。主要溶出画
分を遠心減圧式濃縮器(凍結乾燥機)(サーバント社，米
国)を用いて減圧乾固し、Insulinotropin−ＣＳ２３融
合蛋白質精製乾燥品を得た。

【００６３】(４)Insulinotropin−ＣＳ２３融合蛋白質
からInsulinotropinの分離：Insulinotropin−ＣＳ２３
融合蛋白質を６Ｍグアニジン塩酸塩を含む０.２Ｍトリ
ス−酢酸緩衝液(pＨ８.０)＋１０mＭジチオトレイトー
ルに溶解し、１〜２時間、３７℃に加温した。２−ニト
ロ−５−チオシアノ安息香酸を全チオール基の５〜１０
倍量加え、水酸化ナトリウムでpＨを８.０に再調製し
た。その後、３７℃で１５分間反応させた。酢酸を加え
てpＨを４以下として、４℃に冷却後、透析あるいはゲ
ルろ過(５０％酢酸)で脱塩を行なった。主要溶出画分を
遠心減圧式濃縮器(サーバント社，米国)を用いて凍結乾
燥した後、６Ｍグアニジン塩酸塩を含む、０.２Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液(pＨ９.０)に溶解し、１２時間，３７℃
に加温した後、１０ＫＤ膜（セントリコン，アミコン社
製）でろ過し、１０ＫＤ以下の画分を０.１％ＴＦＡ＋
２０％アセトニトリルで平衡化したphenyl ５ＰＷＲＰ
(４.５mmＩＤ×７.５cm，東ソー社製)に吸着させ、０.
１％ＴＦＡ＋２０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡ＋
８０％アセトニトリルの間で直線濃度勾配により溶出
した。主要溶出画分を遠心減圧式濃縮器(サーバント
社，米国)を用いて凍結乾燥した後、２０mＭリン酸緩衝
液（pＨ６.５）に溶解した。得られた粗精製Insulinotr
opin溶液を、２０mＭリン酸緩衝液で平衡化したＣＭ−
５ＰＷ（７.５mmＩＤ×７.５cm，東ソー社製)に吸着さ
せ、２０mＭリン酸緩衝液（pＨ６.５）＋１.０Ｍ Ｎa
Ｃlの間で直線濃度勾配により溶出した。得られた主要
溶出画 分を０.１％ＴＦＡで平衡化したＯＤＳ−１２０
Ｔ（７.８mmＩＤ×３０cm，東ソー社製）に吸着させ、
０.１％ＴＦＡと０.１％ＴＦＡ＋８０％アセトニトリル
の間で直線濃度勾配により溶出した。主要溶出画分を遠
心減圧式濃縮器(サーバン ト社，米国)を用いて凍結乾
燥し、精製Insulinotropin乾燥品を得た。

【００６４】(５)Insulinotropinのアミノ酸分析：上記
(４)で得られたrhInsulinotropinのＮ末端アミノ酸配列
分析を４７７Ａ型プロティンシーケンサー(アプライド
バイオシステム社)で分析した結果、Ｎ末端にＭetが付
加されたInsulinotropinの配列が検出された(〔表
３〕)。又アミノ酸組成分析を６３ ３０型アミノ酸分析
計(ベックマン社)で分析した結果、理論値と一致してい
た(〔表４〕)。

【表３】 InsulinotropinのＮ末端アミノ酸配列 ────────────────────────── サイクル アミノ酸配列 塩基配列から予想 数 Insulinotropin されたアミノ酸 ────────────────────────── １ Ｍet Ｍet ２ Ｈis Ｈis ３ Ａla Ａla ４ Ｇlu Ｇlu ５ Ｇly Ｇly ６ Ｔhr Ｔhr ７ Ｐhe Ｐhe ８ Ｔhr Ｔhr ９ Ｓer Ｓer １０ Ａsp Ａsp １１ Ｖal Ｖal １２ Ｓer Ｓer １３ Ｓer Ｓer １４ Ｔyr Ｔyr １５ Ｌeu Ｌeu １６ Ｇlu Ｇlu １７ Ｇly Ｇly １８ Ｇln Ｇln １９ Ａla Ａla ２０ Ａla Ａla ────────────────────────── ４７７Ａ型プロティンシーケンサー(アプライドバイオ
システム社)で分析

【００６５】

【表４】 Ｎ.Ｄ. ：Not Determined 塩酸加水分解法 ６３３０型アミノ酸分析計(ベックマン社)で分析

【００６６】実施例７ (Ｉ)ヒトＰＴＨをコードする遺伝子の製造 (a)ＤＮＡ断片の合成 図１９に示す１４種のＤＮＡ断片（＃１〜＃１４）（配
列表：配列番号１９〜３２）は適当に保護されたＤＮＡ
β−シアノエチルホスホアミダイドを原料とし、アプ
ライドバイオシステムズ社、モデル３８０Ａ・ＤＮＡ自
動合成装置を用いて合成した。合成のプロトコールはア
プライドバイオシステムズ社指定のものを用いた。合成
した保護ＤＮＡオリゴマー・樹脂を０.２μmoleの樹脂
に対し濃アンモニア水２ml中で６０℃、６時間加熱し
た。得られた生成物を逆相高速液体クロマトグラフィー
（以下ＨＰＬＣと略記）で精製し、５’末端水酸基のみ
がジメトキシトリチル基で保護されたＤＮＡオリゴマー
を得た。これを８０％酢酸２ml、２０分間処理し５’末
端ジメトキシトリチル基を除去し、生成物を逆相ＨＰＬ
Ｃ、イオン交換ＨＰＬＣで精製した。この様にして合成
した１４種のＤＮＡオリゴマーは図１９（配列番号：１
６〜２９）に示した通りである。

【００６７】(b)ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 ５’末端になるべき＃１（配列表：配列番号１９），＃
１４（配列表：配列番号３２）を除いた１２種のＤＮＡ
オリゴマー（＃２〜＃１３）（配列表：配列番号２０〜
３１）各々を２５μlのリン酸化反応液〔ＤＮＡオリゴ
マー１０μg，５０mＭ Tris−ＨＣl,pＨ７.６, １０mＭ
ＭgＣl₂, １mＭスペルミジン，１０mＭジチオスレイト
ール（以後ＤＴＴと略記），０.１mg／mlウシ血清アル
ブミン（以後ＢＳＡと略記），１mＭ ＡＴＰ，１０ユニ
ットＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で３
７℃ １時間反応させ、５’末端リン酸化した。この反
応液を６５℃で１０分間処理し、次いで凍結、融解後、
次の反応に用いた。 (c)ＤＮＡフラグメントの連結（図２０，図２１参照） (c−１)hＰＴＨ遺伝子の２重鎖構成の１連の段階は図２
０に示した通りである（図中左端に突起のある（・−）
印は５’末端水酸基がリン酸化されていることを示
す）。たとえばブロックＩの連結は次の様にした。５種
（ＤＮＡフラグメント＃２〜＃６（配列表：配列番号２
０〜２４）に各々対応する）の上記(ｂ)の操作で得たＤ
ＮＡフラグメントのリン酸化反応液を７.５μlずつと
５’末端に相当するＤＮＡフラグメント＃１（配列表：
配列番号１９）の２.５μgとを合わせ、５０μlとし
た。これに５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイ
ングランド・バイオラボ社）を加え、１４℃で５時間イ
ンキュベートした後、６５℃で１０分間処理し、反応を
止めてブロックＩを得た。同様にしてブロックII、III
を得た。これらブロックＩ〜IIIを各々２０μlずつ混合
し、ここに５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１４
℃で２０時間インキュベートし、６５℃で１０分間処理
し、反応を止めた。これを７.５％アクリルアミドゲル
を用いて、緩衝液(pＨ８.３)〔１００mＭ Tris−ＨＣ
l，１００mＭホウ酸、２mＭ ＥＤＴＡ〕中、１６０Ｖで
１.５時間電気泳動にかけた。泳動後、０.６mg／ｌのエ
チジウムブロマイド（ＥtＢr）でゲルを染色し、２６３
bpのＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入
し、泳動用緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電気
的に溶出した〔ジャーナル オブモレキュラー バイオ
ロジー（J. Mol. Biol）, 110, 119(1977)〕。この透析
チューブ内液を回収し、これを０.２Ｍ ＮaＣl，２０m
Ｍ Tris−ＨＣl(pＨ７.４)，１０mＭ ＥＤＴＡ溶液であ
らかじめ緩衝化したElutip-d・カラム（Schleicher ＆
Schnell社）に注いでＤＮＡを吸着させ、次いで、１.０
Ｍ ＮaＣl、２０mＭ Tris−ＨＣl(pＨ７.４)、１.０mＭ
ＥＤＴＡ緩衝液で溶出させた。溶出液に２倍量のエタ
ノールを加え、−２０℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを
沈殿させた。

【００６８】(c−２)hＰＴＨ遺伝子の２重鎖構成の１連
の段階は図２１に示した方法でも達成できる（図中左端
に突起のある棒（・−）印は５’末端水酸基がリン酸化
されていることを示す）。１２種（ＤＮＡフラグメント
＃２から＃１３（配列表：配列番号２０〜３１）に各々
対応する）のＤＮＡフラグメントのリン酸化反応液（上
記(ｂ)で得られた）５μlずつと５’末端に相当するＤ
ＮＡフラグメント＃１（配列表：配列番号１９），＃１
４（配列表：配列番号３２）各々２μgを混ぜ、７０μl
とした。これに５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）を加え、１ ５℃で２０時間インキュベートした。
これを８％アクリルアミドゲルを用いて、緩衝液(pＨ
８.３)〔１００mＭ Tris−ＨＣl，１００mＭホウ酸、２
mＭ ＥＤＴＡ〕中、１２５Ｖで２時間電気泳動にかけ
た。泳動後、０.６mg／ｌのＥtＢrでゲ ルを染色し、２
６３bpのＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チューブ内に封
入し、泳動用緩衝液内に沈め、ＤＮＡ断片をゲルから電
気的に溶出した。この透析チューブ内液についてフェノ
ール処理を２回行ったのち、水層（上層）を回収し、２
倍量のエタノールを加え、−７０℃に冷却した後、遠心
でＤＮＡを沈殿させた。このようにして約１μgのＤＮ
Ａフラグメントが得られ、Ｔ４ポリヌクレオチドキ ナ
ーゼ（宝酒造）によるリン酸化を行った後、以下の（d
−２）に供した。 (d)hＰＴＨ遺伝子のクローニング（図２２） (d−１)クローニングベクターには大腸菌のプラスミドp
ＢＲ３２２由来のpＵＣ１９〔Messing. J., ジーン(Gen
e), 33 103-109(1985)〕を使用した。pＵＣ１９ＤＮＡ
を２０μlの反応液〔２０mＭ Tris−ＨＣl，pＨ７.６，
７mＭ ＭgＣl₂,１５０mＭ ＮaＣl, １０mＭ ２−メルカ
プトエタノール，２０ユニットのＮdeＩ（ニューイング
ランド・バイオラボ社），１５ユニットのＢamＨＩ（宝
酒造）〕中、３７℃、２４時間反応させた後、水で５倍
希釈し、６５℃で２０分間処理し、酵素を失活させた。
この反応液５μlと約５当量のＤＮＡフラグメント（上
記ｃ−１）を混合し、５０mＭ Tris−ＨＣl(pＨ７.
５)，１０mＭ ＭgＣl₂，１０mＭ ＤＴＴ，１mＭスペル
ミジン，０.１mg／ml ＢＳＡおよび１mＭ ＡＴＰを含む
２０μlの反応液として、１４℃、１５時間Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ社製）を作
用させて、hＰＴＨ遺伝子をプラスミドに結合させた。

【００６９】この反応液を用い、既知の方法に従い、大
腸菌ＪＭ１０９株〔Messing. J. ジーン(Gene), 33 103
-119(1985)〕を形質転換させた。すなわち、−７０℃で
保存していた５０μlのコンピテントセル〔Hanahan,
D., ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
（J. Mol. Biol.），166, 557(1983)〕を０℃、１５分
間インキュベートした後、１０μlの上記反応液を添加
した。さらに０℃、３０分間インキュベートした後、４
２℃で１.５分間、さらに０℃で２分間インキュベート
した。この反応液に２００μlのＬＢ培地（１リットル
当りバクトトリプトン１０ｇ、バクトイースト抽出物５
ｇ、ＮaＣl ５ｇを含む）を加え、３７℃、１時間イン
キュベートした。この大腸菌を５０μg／mlのアンピシ
リン，１００μg／ml Ｘ−Ｇal, ０.１mＭ ＩＰＴＧを
含むＬＢ寒天培地上にまき、３７℃で１晩培養した。生
じたアンピシリン耐性コロニー中、β−ガラクトシダー
ゼ欠損の１４株を選び、この転換体のプラスミドＤＮＡ
をアルカリ法〔Maniatis, T.ら、モレキュラー クロー
ニング(Molecular Cloning (Cold Spring Harbour)、36
8-369(1982)〕により粗精製し、ＮcoＩおよびＢamＨＩ
消化、さらにＮdeＩおよびＢamＨＩ消化した。これら消
化物の１.７％アガロースゲルでの泳動パターンから、
１株が正しくhＰＴＨ遺伝子の挿入されている転換株で
あることがわかった。

【００７０】(d−２)hＰＴＨ遺伝子のクローニングは以
下の方法でも行った。クローニングベクターにはpＵＣ
１９（宝酒造）を使用した。pＵＣ１９ＤＮＡ ０.５μg
を１０μｌの反応液〔５０mＭ Tris−ＨＣl，pＨ７.
５，１０mＭ ＭgＣl₂，１００mＭＮaＣl₂, １mＭジチオ
スレイトール、２０ＵのＮdeＩ（ニューイングランド・
バイオラボ社），１０ＵのＢamＨＩ(宝酒造)〕中、３７
℃、５時間反応させた後、６５℃で１５分間処理し、酵
素を失活させた。この反応液１μlと約１０当量のＤＮ
Ａフラグメント（上記ｃ−２）とを混合し、ＤＮＡライ
ゲーションキット(宝酒造)を用い、hＰＴＨ遺伝子をプ
ラスミドに結合させた。大腸菌ＪＭ１０９株への形質転
換は上記d−１と同じ方法で行った。生じたアンピシリ
ン耐性コロニー中、β−ガラクトシダーゼ欠損の１７株
を選び、この転換株のプラスミドＤＮＡをアルカリ法に
より粗精製し、ＮcoＩおよびＢamＨＩ消化、さらにＮde
ＩおよびＢamＨＩ消化した。これら消化物の１.５％ア
ガロースゲルでの泳動パターンから、３株が正しくhＰ
ＴＨ遺伝子の挿入されている転換株であることがわかっ
た。

【００７１】上記d−１およびd−２で得たクローニング
ベクターをpＵ・ＰＴＨ・Ｃ１９と名付けた。このプラ
スミドpＵ・ＰＴＨ・Ｃ１９を持つ大腸菌ＪＭ１０９組
換え体の１白金耳を、５０μg／mlのアンピシリンを含
むＬＢ培地２０mlに接種し、３７℃で一夜、振盪培養し
た。この培養液からプラスミドＤＮＡを粗精製し、２０
μg／mlのＲＮaseを含むＴＥ緩衝液（１０mＭ Tris−Ｈ
Ｃl pＨ８.０，１mＭＥＤＴＡ）８０μlに溶かした。 (e)hＰＴＨの発現用プラスミドの構築ならびに形質転換
体の製造（図２２） １) 上記ｄ項で得られた約１０μgのpＵ・ＰＴＨ・Ｃ１
９を反応液〔１５０mＭＮaＣl，２０mＭ Tris−ＨＣl
（pＨ７.８），７mＭ ＭgＣl₂，１０mＭ ２−メルカプ
トエタノール，４０ユニットＮdeＩ，２０ユニットＢam
ＨＩ(宝酒造)〕中、３７℃、５時間反応させた後、１.
７％アガロースゲル電気泳動により２６３bpＤＮＡ断片
を常法に従って精製した。一方、発現用ベクターにはp
ＥＴ３c〔Stadier, F. W. ら、メソッズ インエンザイ
モロジー（Methods in Enzymology），195 60-89(199
0)〕を使用した。pＥＴ３c ＤＮＡを上記と同様にし
て、ＮdeＩ及びＢamＨＩ消化し、この反応液に４倍量の
水を加え、６５℃で２０分間加熱し、酵素を失活させ
た。この様にして得た２６３bp ＤＮＡおよびプラスミ
ドＤＮＡは各々、両端にＮdeＩ消化およびＢamＨＩ消化
により生じた単鎖の付着端を有する。これら両者を混合
し、５０mＭ Tris−ＨＣl，pＨ７.６，１０mＭ ＭgＣ
l₂，１０mＭ ＤＴＴ，１mＭスペルミジン０.１mg／ml
ＢＳＡおよび１mＭ ＡＴＰ存在下、１４℃，１６時間Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ
社）を作用させてＤＮＡを結合し、前出と同様な方法で
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。次にこの大腸菌
を５０μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に
まき、３７℃で１日培養した。生じたアンピシリン耐性
コロニーを選んだ。さらに転換株のプラスミドＤＮＡを
ＮdeＩ−ＢamＨＩ，Ｂgl II−ＢamＨＩ，ＥcoＲＩ−Ｎd
eＩ，Ａvr II−Ｂgl IIなどの制限酵素の組み合わせで
消化し、ポリアクリルアミド電気泳動のパターンから、
正しくhＰＴＨ遺伝子を含む形質転換体を選択した。こ
の様にして得た発現用プラスミドをＰＥ−ＰＴＨと、ま
た形質転換体をエシエリヒアコリＪＭ１０９／pＥ−Ｐ
ＴＨと名づけた。

【００７２】(II)〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨ(１−８４)の製
造 (i)特定部位指向性変異誘発を行うためのヒトＰＴＨ遺
伝子を含むプラスミドpＵ−ＰＴＨの構築 ヒトＰＴＨのＤＮＡが組み込まれたプラスミドpＥ−Ｐ
ＴＨ（上記(Ｉ)で得られたもの）からＢamＨＩとＸbaＩ
とで消化することによりヒトＰＴＨのＤＮＡおよびpＥ
Ｔ３ｃの発現プロモーターを含む０.３キロベースのＤ
ＮＡ断片を得た。次に、一本鎖調製用プラスミドベクタ
ーpＵＣ１１８をＢamＨＩとＸbaＩにより消化し、上述
のヒトＰＴＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片と混ぜ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより連結した。連結したＤＮＡを用いて大
腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、ＸgaＩを指示種とする
プレート上に播き、正しくヒトＰＴＨ遺伝子がpＵＣ１
１８に挿入された組換えプラスミドpＵ−ＰＴＨをファ
ージ粒子の形で培地に放出する。この一本鎖ＤＮＡを精
製して、部位指向性変異誘発の鋳型として用いた。な
お、ここで用いた大腸菌ＭＶ１１８４、ヘルパーファー
ジＫ０７は、J. Vieira,J. Messing, メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology），153, 3-
11(1987)に記載されている。

【００７３】(ii)〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨ(１−８４)をコ
ードする遺伝子の製造とその発現 (a)〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨ(１−８４)をコードする遺伝
子の製造（図２３参照） まず、３５位のＶalのコドンをＣysのコドンに変換する
ためオリゴヌクレオチドプライマーＡ：ＣＡＣＡＡＴＴ
ＴＴＴＧＣＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＣ（配列表：配列番号
３３）を合成した。Ｔ４キナーゼ処理により５’ＯＨ末
端をリン酸化した上記合成オリゴヌクレオチド（４ピコ
モル）と、先に記した一本鎖状のpＵ−ＰＴＨ（５μg）
を用いて、特定部位指向性変異誘発キット（アマシャム
社：オリゴヌクレオチド・ディレクテッド・インビトロ
・ミュータジェネシス・システム・バージョン２）によ
り、変異を導入したプラスミドを得た。このプラスミド
で常法により大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５０
μg／mlのアンピシリンを含む２倍ＹＴ培地寒天プレー
トに播いて３７℃、１５時間培養し、多数のコロニーを
得た。そのうち１０個のコロニーから少量の菌体を取っ
て０.３mlの２倍ＹＴ培地で約５時間培養した。この培
養液３０μlとヘルパーファージＫ０７を含む溶液３０
μlを混合して３７℃に１時間静置し、３mlの２倍ＹＴ
培地を加えて一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と
菌体に分け、菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精
製し、上清からは、常法によりファージ粒子として存在
する一本鎖ＤＮＡを回収した。

【００７４】前述のオリゴヌクレオチドプライマーＡに
は、鋳型となるヒトＰＴＨをコードする遺伝子中に存在
しなかった制限酵素ＨhaＩ認識部位が含まれている。し
たがって、正しく変異が導入されたプラスミドにＨhaＩ
を作用させると、変異により新たに生じたＨhaＩ部位と
pＵＣ１１８に始めから存在するＨhaＩ部位の２５ケ所
で切断され、２６０塩基対の断片が生じるはずである。
前述の１０個のコロニーから得たプラスミドをＨhaＩで
消化し、アガロースゲル電気泳動で分析したところ、４
つのクローンで正しい大きさの断片が見られた。さら
に、この２つのクローンの一本鎖状プラスミドを鋳型と
して、アプライドバイオシステムズ社、モデル３７３Ａ
ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を分析した結
果、目的とする変異が導入されていることを確認した
（図２５）（配列表：配列番号３３）。

【００７５】こうして得られた〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨを
コードする遺伝子（図２５）を含むプラスミドをpＵ−
Ｃ３５ＰＴＨと称する。 (b)大腸菌での発現用プラスミドpＥ−３５ＰＴＨの構築
（図２４参照） (a)で得られたpＵ−Ｃ３５ＰＴＨを制限酵素ＸbaＩおよ
びＢamＨＩで消化して、ムテイン〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨ
をコードする約０.３kbpの断片を得た。これをアガロー
スゲル電気泳動で精製した後、前もって制限酵素ＸbaＩ
とＢamＨＩで消化しておいた発現用プラスミドベクター
pＥＴ３ｃ〔F. W. Stadier ら、メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology），195, 60-89
(1990)〕に、Ｔ４リガーゼにより結合させた。こうして
得られた発現用プラスミドをpＥ−Ｃ３５ＰＴＨと称す
る。大腸菌ＭＭ２９４株に、Ｔ７ファージのＲＡＮポリ
メラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３〔F. W.
Stadier ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（J. Mol. Biol.）189, 113-130(1986)〕を溶原
化させ、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）株を作成した。該
プラスミドpＥ−Ｃ３５ＰＴＨを用いて大腸菌ＭＭ２９
４（ＤＥ３）を形質転換することにより、図２５に示す
ムテインをコードする遺伝子を含有するプラスミドを持
つ菌体ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＥ−Ｃ３５ＰＴＨを得
た。

【００７６】(c)〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨの製造 ｉ) エシエリヒア コリＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＥ−
Ｃ３５ＰＴＨを５０μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ
培地３ml中、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液１
００μlを２００mlのフラスコに分注した１０mlの同じ
培地に加え、３７℃でクレット値が約１７０になるまで
培養した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、０.１mＭとなるようにし
た。さらに２時間培養を続けた後、この培養液１mlを１
５０００rpm、４℃、５分間遠心分離し、得られた菌体
を、０.５Ｍ Tris・ＨＣl(pＨ６.８)、１０％グリセロ
ール、１０％(Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、β−メルカプトエタノール0.１％（Ｗ／Ｖ）、ブ
ロモフェノールブルーの入った水溶液１００μl〔Laemm
li, U. K, ネイチャー（Nature), 227 680(1970)〕に溶
かし３分間煮沸後、１６％ＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動（ＰＡＧＥ）に付した。泳動の後ゲルをクマシー
ブリリアントブルーで染色したところ、標準品ヒトＰＴ
Ｈと同じ移動度を示す濃いバンドが観察された（図２６
参照）。図２６における各レーンは各々、レーン１：ヒ
トＰＴＨ（１μg）、レーン２：ＩＰＴＧを添加後のプ
ラスミドpＥ−Ｃ３５ＰＴＨを保持しない大腸菌株の培
養液（１０μl）、レーン３：ＩＰＴＧを添加後のプラ
スミドpＥ−Ｃ３５ＰＴＨを保持する大腸菌株培養液
（１０μl）のものを示す。また別のゲルをヒトＰＴＨ
抗体を用いたウエスタンブロッティングに付した結果、
ここでも標準ヒトＰＴＨと同じ染色パターンが得られた
（図２７参照）。図２７における各レーンの対象は図２
６のものと同様である。ゲルの染色における標準品との
量的比較より、〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨは１リットル培養
液に換算して約２００mg発現していた。

【００７７】ii) E. coli内に蓄積された〔Ｃys³⁵〕ヒ
トＰＴＨを以下のようにして精製した。上記と同様にし
て得られた培養液２００mlからの菌体を８Ｍ尿素、５０
mＭ Tris・ＨＣl（pＨ７.５）、５０mＭ ＥＤＴＡ、２
０mＭ ２−メルカプトエタノール （以下２−ＭＥと略
す）１mＭ α−トルエンスルホニルフルオライドを含有
する緩衝液（５ml）に懸濁し、氷冷下で激しく撹拌し
（約１時間）、菌体を破壊した。１５０００rpm、４
℃、２０分間遠心分離し、上清を集め、沈殿について同
じ 組織の緩衝液（３mlずつ）で同様の抽出操作を２度
行なった。上清液を合わせ、２倍に希釈し、この液を、
４Ｍ尿素と１０mＭ ２−ＭＥを含む５０mＭ酢酸アン モ
ニウム緩衝液（pＨ５）で平衡化した、ＴＳＫ−ゲル、
ＣＭ−トーヨーパール のカラム（東ソー）（１０ml）
に通し、目的物を吸着させた、４Ｍ尿素と１０m Ｍ ２
−ＭＥを含む、５０mＭ酢酸アンモニウム緩衝液（pＨ
５）でカラムを洗浄 し（約１０mlを要した）、２８０n
mにおける吸収がなくなったら、１０mＭ ２−ＭＥを含
む５０mＭ酢酸アンモニウム（pＨ５）緩衝液５０ml−
０.５Ｍ酢酸アン モニウム（pＨ６）緩衝液５０mlを用
いた直線濃度勾配法でカラムを展開した（流速：１０ml
／時間、１フラクション２ml）。フラクション３５−４
３を集め、これを凍結乾燥した。これを以下の条件の逆
相高速液体クロマトグラフィーに付した。カラム、ＹＭ
Ｃ−パック Ａ−３２５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ（１×
３０cm）（ワイ・エム・シー製）；溶媒，０.１％トリ
フルオロ酢酸を含む、２５％か ら５０％までのアセト
ニトリルによる直線濃度勾配法（３０分間）；流速、３
ml／分。目的物のピーク（保持時間１７.０分）を分取
した。得られた溶出液をＢio−Ｒad ＡＧl×８（酢酸
型）（Bio−Rad Laboratory）のカラムに通し洗液も合
わせアセトニトリルを留去した後、凍結乾燥した。目的
のhＰＴＨが白色粉末と して３.６mg得られた。

【００７８】本標品は以下の諸分析結果より、高純度の
〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨであることが示された。 a) 逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを示した（図２８
参照）。カラム：ＹＭＣ−パックＡ−３０３ Ｓ−５ Ｏ
ＤＳ １２０Ａ φ４.６×２５０mm；溶出液：Ａ（０.１
％トリフルオロ酢酸）、Ｂ（０.１％トリフルオロ酢酸
を含むアセトニトリル）；濃度勾配：０−３０分（３０
−３８％，Ｂ）、流速１ml／分。 b) ＳＤＳ−ＰＡＧＥでもヒトＰＴＨと同じ移動度の単
一バンドを示した（図２９参照）。各レーンは、レーン
１：分子量マーカー、レーン２：ヒトＰＴＨ、レーン
３：〔Ｃys³⁵〕ヒトＰＴＨのものを示す。 c) アミノ酸分析（チオグリコール酸存在下、減圧封管
中、１１０℃、２４時間、５.７Ｎ塩酸加水分解、カッ
コ内は理論値を示す）：Ａsp(10), １０.３３；Ｔhr
(1), ０.９１；Ｓer(7), ６.１０；Ｇlu(11), １１.８
２；Ｐro(3), ３.００； Ｇly(4), ４.４４；Ａla(7),
６.９１；Ｃys(1), １.１１；Ｖal(7), ６.６０；Ｍet
(2), ２.１１；Ｉle(1), １.０１；Ｌeu(10), １０.８
３；Ｐhe(1), １.１ ０；Ｌys(9), ９.３２；Ｈis(4),
３.７５；Ａrg(5), ５.２１；Ｔrp(1),０.９３（回収率
８４.２％、Ｃysは過蟻酸酸化後の加水分解物の分析
値） d) アプライドバイオシステムズ社 気相シークエンサー
モデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、１
位Ｓerから１５位Ｌeuまでの配列が正しいものである事
が示された。このようにして３５位バリンがシステイン
に置換された図２５に示すアミノ酸配列（配列表：配列
番号３４）を有するムテインが得られた。

【００７９】(III)〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)からh
ＰＴＨ(１−３４)ＯＨの製造 〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)のＣys³⁵のＳ−シアノ化
は実施例５(５)に示した方法に順じて以下のように行っ
た。〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)４.７６mgを２.４ml
の６Ｍ・Ｇu−ＨＣl−０.２Ｍ−トリス−酢酸（pＨ８.
０）に溶解し、上記緩衝液０.１mlに溶かした０.１５４
mgのジチオスレイトールを加えて、室温で３０分放置し
た。これに０.１mlの同緩衝液に溶かした１.６４６mgの
ＮＴＣＢを加え、直ちにpＨを８.０に調整し、室温で１
５分間反応させた。反応終了後、２.５mlの酢酸を加
え、セファデックスＧ−２５（Sephadex Ｇ−２５）を
用いるゲルろ過により脱塩した。ゲルろ過条件は、カラ
ムサイズ，２.６×３７cm, 検出波長２８０nm；溶媒，
１０％酢酸；流速２０ml／ｈであった〔ＳＣＮ−Ｃy
s³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)を含む画分を集め、凍結乾燥後
切断反応に使用した。hＰＴＨ(１−３４)ＯＨを得るた
めの切断反応は以下のように行った。２００μgの〔Ｓ
ＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)を２００μlの６Ｍ−
Ｇu−ＨＣl−０.１Ｍホウ酸緩衝液中、３７℃，１７時
間反応させ、等量の氷酢酸を加えて反応を停止させた。
得られた反応液について逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにより分析した（図３０）。分析条件は、カラム，Ｙ
ＭＣ Ａ−３０３ ＯＤＳ ４.６×２５０mm；カラム温
度，２５℃；溶出溶媒Ａ，０.１％トリフルオロ酢酸−
９９.９％蒸留水；溶出溶媒Ｂ，０.１％トリフルオロ酢
酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラム０分
（７５％Ａ＋２５％Ｂ），４０分（６０％Ａ＋４０％
Ｂ），４５分（２０％Ａ＋８０％Ｂ）；溶出速度０.７m
l／min；検出波長２３０nmであった。図中、矢印で示し
た保持時間約３５分のピークがペプチド研究所（日本）
から購入した標準hＰＴＨ(１−３４)ＯＨの溶出時間と
一致した。このピーク画分を分取し、種々の蛋白化学的
分析を実施した。なお、本逆相高速液体クロマトグラフ
ィーの溶出条件では切断産物のうちＣ末端側フラグメン
トは素通り画分に溶出された。

【００８０】上述の方法に従って分析したhＰＴＨ(１−
３４)ＯＨのアミノ酸組成値は表５のとおりであり、こ
れらの値はｈＰＴＨ(１−３４)ＯＨの理論値とよく一致
していた。さらに、得られたhＰＴＨ(１−３４)ＯＨの
カルボキシル末端アミノ酸、Ｐhe³⁴がラセミ化していな
い事を以下の方法で確めた。アミノ酸分析に用いた加水
分析物を試料として用い、オルトフタルアルデヒドによ
り、加水分析物中の全てのアミノ酸をプレラベルした。
カラムにはＹＭＣＡ−３０３ ＯＤＳ（４.６×２５０m
m）を用い、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分
析した。溶出溶媒は５０mＭ酢酸ナトリウム−４０％メ
タノールであった。その結果、加水分解物中のＰheは全
てＬ−Ｐheとして検出され、Ｄ−Ｐheのピークは全く検
出されなかった。また、得られたhＰＴＨ(１−３４)Ｏ
Ｈの分子量をＦＡＢ−ＭＳ（fast atom bombardment ma
ss spectrometry）により測定した結果、mass (m／z)：
(Ｍ＋Ｈ)⁺＝４１１６.８が観測され、理論値４１１８.
１との差は誤差範囲であった。

【表５】

【００８１】実施例８ 〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)からhＰＴＨ(１−３４)−
ＮＨ₂の製造 〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)のＣys³⁵のＳ−シアノ化
はジャーナル オブ ケミカル ササイエテイ ケミカ
ル コミュニケイション（J. C. S. Chem. Comm.）196
7, ２１〜２２に順じて、以下のように行った。８.４０
mgの〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)を３.７８mlの７Ｍ
Ｕrea−０.１Ｍ 酢酸アンモニウム（pＨ３.５）に溶解
し、２５℃，１５分間放置したのち、５９２μgの１−
シアノ−４−ジメチルアミノ ピリジニウム フルオロ
ボレイトを０.４２mlの上記緩衝液に溶かして加えた。
室温で１５分間反応させ、反応終了後、直ちにセファデ
ックスＧ−２５（Sephadex Ｇ−２５）カラムを用いて
脱塩した。カラム条件は、カラムサイズ，２.６×３７c
m；溶出溶媒，１０％酢酸；流速２０ml／hr；検出波
長，２８０nmであった。〔ＳＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１
−８４)を含む画分を集め、 凍結乾燥した。収量は７.
５mgであった。これを用いて以下の切断反応を行った。
２００μgの〔ＳＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)を２
００μlの３Ｍ−アンモニア水に溶解し、３７℃で１０
分反応させた。得られた反応液について、実施例７で示
した分析条件で逆相高速液体クロマトグラフィーを行っ
た。図３１に示したように、〔ＳＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴ
Ｈ(１−８４)は完全に消失し、保持時間３２分にショル
ダーを持つ１つのピークが観察された。このピークのう
ち主ピーク部分が固相合成した標準hＰＴＨ(１−３４)
ＮＨ₂の溶出位置と一致した。なお、切断産物のうちＣ
末端側フラグメントはこの分析条件では素通り画分に溶
出された。

【００８２】実施例９ 〔Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)からhＰＴＨ(１−３４)−
ＮＨＣ₂Ｈ₅の製造 実施例８で得られた〔ＳＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８
４)２００μgを５００μlの３.１Ｍエチルアミンに溶解
し、３７℃で２０分間反応させ、反応終了後等量の氷酢
酸を加えて反応を停止させた。得られた反応液について
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した。分析
条件は実施例７に示した。図３２に示したように〔ＳＣ
Ｎ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)はほぼ消失し、主に２
つのピークが検出された。保持時間３１分および３６分
に溶出されたピークをそれぞれピーク７およびピーク８
と名ずけ、分取し、蛋白化学的分析を実施した。実施例
７に述べた方法に従って分析したピーク８画分のアミノ
酸組成値は表６のとおりであり、これらの値はhＰＴＨ
(１−３４)ＮＨＣ₂Ｈ₅の理論値とよく一致していた。さ
らに、ピーク８のカルボキシ末端アミノ酸Ｐhe³⁴につい
て、アミノ酸分析に用いた加水分解物を試料として用
い、Ｄ，Ｌ体のいずれであるかを分析した。分析はオル
トフタルアルデヒドにより全てのアミノ酸をプレラベル
したのち、ＹＭＣ Ａ−３０３ ＯＤＳ（４.６×２５０m
m）カラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに
より行った。溶出溶媒は５０mＭ酢酸ナトリウム−４０
％メタノールであった。その結果、加水分解物中のＰhe
は全てＬ−Ｐheとして検出され、Ｄ−Ｐheのピークは全
く検出されなかった。また、得られたhＰＴＨ(１−３
４)ＮＨＣ₂Ｈ₅の分子量をＦＡＢ−ＭＳにより測定した
結果、mass(m／z)：(Ｍ＋Ｈ)⁺＝４１４４.９が観測さ
れ、理論値４１４３.２との差は誤差範囲であった。ピ
ーク７画分についても同様にアミノ酸分析を行った。得
られた値は〔ＳＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)の組
成比とほぼ一致していた。原料である〔ＳＣＮ−Ｃy
s³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)は保持時間約３５分に溶出され
ることから、ピーク７は〔ＳＣＮ−Ｃys³⁵〕hＰＴＨ(１
−８４)のＳ−シアノ基がβ脱離して生じた〔デヒドロ
アラニン³⁵〕hＰＴＨ(１−８４)であることが示唆され
た。β脱離反応は切断反応と競争して起こることがY. D
egani, A. Patchornik らによって報告されている。バ
イオケミストリー（Biochemistry）13, 1〜11(1974)。

【００８３】なお、切断産物のうちのＣ末端側フラグメ
ントは、本分析条件では素通り画分に溶出された。

【表６】 得られたhＰＴＨ(１−３４)ＮＨＣ₂Ｈ₅のアミノ酸組成

【００８４】実施例１０ (1) H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-
NH₂(ペプチドＡ)の製造 H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH
₂(ペプチドＡ)（配列表：配列番号３５）の合成は自動
ペプチド合成機４３０Ａ（アプライドバイオシステムズ
社）を用いてメリーフィールド アール ビー（Merrif
ield, R. B.）(1969)アドバンズ オブ エイザイモロ
ジー（Adv. Enzymol.）32, 221-296の方法に順じて、固
相法で行なった。担体にはｐ−Methyl−ＢＨＡ−レジン
を用い、カルボキシル末端から順次合成した。Ｂoc−ア
ミノ酸として、Ｂoc−Ｐro，Ｂoc−Ｔyr（Ｂr−Ｚ），
Ｂoc−Ｇly，Ｂoc−Ｃys（４−ＣＨ₃Ｂzl），Ｂoc−Ｇl
u（ＯＢzl），Ｂoc−Ａsn，Ｂoc−Ｌeu，Ｂoc−Ｖalを
用いた。アミノ末端Ｐroまで合成したのちペプチドレジ
ンを合成機から取り出した。ペプチドレジン４５０mgに
ｐ−クレゾール０.４５ml エタンジチオール０.４５ml
２−メルカプトピリジン５０mg，さらに約３.６mlの
液体フッ化水素を加えて、０℃で１.５hr反応させた。
反応終了後、フッ化水素を減圧除去し、０.１％の２−
メルカプトエタノールを含むジエチルエーテルで洗い、
大部分の混在試薬を除去した。ペプチドを１０mlの３％
酢酸で抽出し、遠心分離してレジンを除き、上清液につ
いてセファデックスＧ−２５（Sephadex−Ｇ−２５）を
用いるゲルろ過により精製した。ゲルろ過条件は、カラ
ムサイズ，２.８×６０cm；検出波長，２８０nm；溶
媒，３％酢酸；流速３０ml／hrであった。ペプチドを含
む画分を集め、逆相高速液体クロマトグラフィーにより
さらに精製した。カラム、ＹＭＣ Ａ−３０３ ＯＤＳ
４.６×２５０mm；カラム温度，２５℃；溶出溶媒Ａ，
６.１％トリフルオロ酢酸−９９％蒸留水；溶出溶媒
Ｂ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニトリ
ル；溶出プログラム０分（９５％Ａ＋５％Ｂ），３０分
（５５％Ａ＋４５％Ｂ），３５分（２０％Ａ＋８０％
Ｂ）；流速０.７ml／min；検出波長，２８０nm。本条件
下で保持時間約２７分に溶出した主ピーク画分を集めて
凍結乾燥した。 アミノ酸分析値：Ａsp(1), １.０３；Ｇlu(2), ２.１
５；Ｇly(2), １.８９；Ｖal(1), ０.８９；Ｌeu(1),
１.００；Ｔyr(2), １.９６；Ｐro(1), １.００

【００８５】(2) H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-
Leu-Val-Tyr-NH₂からH-Pro-Tyr-Gly-OH（配列表；配列
番号３６)の製造 H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH
₂(ペプチドＡ)のＣys⁴のＳ−シアノ化はメソッド イン
エイザイモロジー（Methods in Enzymol.）47,129-13
2(1977)に順じて以下のように行った。６７７μg（０.
５４６μモル）のペプチドＡに２.４mlの６Ｍグアニジ
ン塩酸（Ｇu・ＨＣl）−０.２Ｍ トリス酢酸緩衝液（p
Ｈ８.０）を加えて溶解し、０.１mlの同緩衝液に溶解し
た１５４μg（１μモル）のジチオスレイトールを加
え、室温で３０分間放置した。これに０.１mlの同緩衝
液に溶解した２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（Ｎ
ＴＣＢ）１.６５mg（７.５μモル）を加え、pＨを８.０
に再調整後室温で１５分間反応させたのち、１mlの氷酢
酸を加えて反応を停止させた。このようにして得られた
反応液について逆相高速液体クロマトグラフィーにより
脱塩精製し、〔Ｓ−シアノ−Ｃys⁴〕−ペプチドＡ〔Ｓ
ＣＮ−Ｃys⁴〕ペプチドＡ）を得た。逆相高速液体クロ
マトグラフィーの条件はカラム、ＹＭＣ Ａ−３０３ Ｏ
ＤＳ ４.６×２５０nm；カラム温度，２５℃；溶出溶媒
Ａ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％蒸留水；溶出
溶媒Ｂ，０.１％トリフルオロ酢酸−９９.９％アセトニ
トリル；溶出プログラム０分（９５％Ａ＋５％Ｂ），３
７分（５５％Ａ＋４５％Ｂ），３５分（２０％Ａ＋８０
％Ｂ）；溶出速度，０.７ml／min；検出波長，２８０n
m。本条件下で〔ＳＣＮ−Ｃys⁴〕ペプチドＡは主ピーク
として保持時間２８分に溶出された。本画分を分取し以
下の切断反応に使用した。

【００８６】H-Pro−Tyr−Gly−OH を得るための切断反
応は、メソッド イン エイザイモロジー（Methods in
Enzymol.）47, 129-132(1977)に順じ、６Ｍ Ｇu・ＨＣ
l・０.１Ｍ−ホウ酸緩衝液（pＨ９.２）中で行った。す
なわち、６２μgの〔ＳＣＮ−Ｃys⁴〕ペプチドＡを２ml
の６Ｍ−Ｇu・ＨＣl−０.１Ｍ−ホウ酸緩衝液（pＨ９.
２）に溶解し、３７℃で２０時間反応させ、０.２mlの
氷酢酸を加えて反応を停止させた。得られた反応液を逆
相高速液体クロマトグラフィーにより分析した(図３３
−Ｂ)。逆相高速液体クロマトグラフィーの分析条件は
[ＳＣＮ−Ｃys⁴]ペプチドＡの取得のための条件と同じ
であった。保持時間２８分に溶出された〔ＳＣＮ−Ｃys
⁴〕ペプチドＡ（図３３−Ａ）は切断反応後完全に消失
し、代わりに主に２つのピークが認められた。保持時間
１７分のピークをピーク１，２５分のピークをピーク２
となずけ、それぞれ分取し、蛋白化学的分析を行った。
アミノ酸組成分析は定沸点塩酸を加えて減圧下に封管
後、１１０℃で２４時間加水分解し、日立製８３５型ア
ミノ酸分析計により実施した。その結果、ピーク１のア
ミノ酸組成比は、Ｐro ０.８８(1), Ｇly １.００(1),
Ｔyr ０.８８(1)であり、目的物であるＰro−Ｔyr−Ｇl
y−ＯＨの理論アミノ酸組成比とよく一致した。ピーク
２のアミノ酸組成比はＡsp １.００(1), Ｇlu １.８６
(2), Ｇly０.８４(1), Ｖal １.００(1), Ｌeu １.０３
(1), Ｔyr ０.９７(1)であり、切断産物のＣ末端側フラ
グメントの理論アミノ酸組成比とよく一致した。ピーク
１の分子量とＳＩＭＳ（Secondary ion mass spectrome
try）により測定した結果、mass(m／z)：(Ｍ＋Ｈ)⁺＝３
３６が検出され、Ｈ−Ｐro−Ｔyr−Ｇly−ＯＨ の理論
分子量３３５.１４と一致した。

【００８７】実施例１１ H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH₂
からH-Pro-Tyr-Gly-NH₂の製造 H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH
₂(ペプチドＡ)のＣys⁴のＳ−シアノ化および〔ＳＣＮ−
Ｃys⁴〕ペプチドＡの分取は実施例１０に示した。 H-P
ro−Tyr−Gly−NH₂ を得るため、希アンモニア水中で切
断反応を行った。 すなわち〔ＳＣＮ−Ｃys⁴〕ペプチド
Ａ６２μgを０.５mlの３Ｍ−アンモニア水 中３７℃で
１０分間反応させ、等量の氷酢酸を加えて反応を停止さ
せた。得られた反応液について、実施例１０に示した条
件で逆相高速液体クロマトグラフィーを行い、反応液を
分析した（図３３−Ｃ）。切断反応後、原料の〔ＳＣＮ
−Ｃys⁴〕ペプチドＡのピークは完全に消失し、代わり
に主として２つのピークが観察 された。保持時間１
４．８分に溶出されたピークをピーク３、保持時間２５
分に溶出されたピークをピーク４と名ずけ、それぞれ分
取した。両ピークのアミノ酸組成値を実施例１０に示し
た方法に従って分析した結果、ピーク３のアミノ酸組成
比はＧly １.００(1), Ｔyr ０.９８(1), Ｐro ０.９６
(1)であり、これらの 値は目的物であるＨ−Ｐro−Ｔyr
−Ｇly−ＮＨ₂の理論アミノ酸組成比とよく一 致した。
ピーク４のアミノ酸組成値はＡsp １.００(1), Ｇlu
１.９２(2), Ｇly ０.９９(1), Ｖal ０.８４(1), Ｌeu
０.９５(1), Ｔyr ０.９９(1)であり、切断産物のうち
のＣ末端側フラグメントの理論アミノ酸組成値と一致し
た。ピーク３の分子量をＳＩＭＳにより測定した結果、
mass(m／z)：(Ｍ＋Ｈ)⁺＝３３５が 検出され、Ｈ−Ｐro
−Ｔyr−Ｇly−ＮＨ₂の理論分子量３３４.１６と一致し
た。

【００８８】実施例１２ H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH₂
からH-Pro-Tyr-Gly-NHC₂H₅の製造 H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH
₂(ペプチドＡ)のＳ−シアノ化および〔ＳＣＮ−Ｃys⁴〕
ペプチドＡの分取は実施例１０に示した方法に従った。
Ｈ−Ｐro−Ｔyr−Ｇly−ＮＨＣ₂Ｈ₅ 取得のための切断
反応は以下のように行った。６２μgの〔ＳＣＮ−Ｃy
s⁴〕ペプチドＡを５００μlの３.１Ｍエチルアミン溶液
中３７℃，１０分間反応させた。等量の氷酢酸を加えて
反応を停止させ、得られた反応液を逆相高速液体クロマ
トグラフィーにより分析した。（図３３−Ｄ）。カラム
条件は実施例１０に示した分析条件と同じであった。切
断反応後、原料の〔ＳＣＮ−Ｃys⁴〕ペプチドＡのピー
クは完全に消失し、代わりに２つのピークが認められ
た。保持時間１８.６分に検出されたピークをピーク
５，２５分に検出されたピークをピーク６とし、それぞ
れ分取した。両ピークのアミノ酸組成値を実施例１０に
示した方法に従って分析した結果、ピーク５はＧly１.
００(1), Ｔyr ０.９５(1), Ｐro １.０２(1), エチル
アミン ０.９５(1),（ニンヒドリン発色率をＧlyと同じ
として算出）であり目的物Ｈ−Ｐro−Ｔyr−Ｇly−ＮＨ
Ｃ₂Ｈ₅の理論アミノ酸組成値と一致した。ピーク６はＡ
sp １.００(1), Ｇlu １.８９(2), Ｇly ０.９９(1),
Ｖal ０.８４(1), Ｌeu ０.９４(1),Ｔyr １.００(1)で
あり、切断産物のうち、Ｃ末端側フラグメントの理論ア
ミノ 酸組成値と一致した。ピーク５の分子量をＳＩＭ
Ｓにより測定した結果、mass(m／z)：(Ｍ＋Ｈ)⁺＝３６
３が検出され、Ｈ−Ｐro−Ｔyr−Ｇly・ＮＨＣ₂Ｈ₅の理
論分子量３６２.２０と一致した。

【００８９】

【発明の効果】本発明方法によると、目的とする蛋白質
やペプチドを分解を受けないで製造することができるの
で、医薬用等のペプチドを工業的大量に製造する際に有
利である。

【００９０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００９１】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００９２】配列番号：３ 配列の長さ：５６１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TACGCGGAAG GGACTTTCAT CAGTGACTAC AGTATTGCCA TGGACAAGAT TCACCAACAA 60 GACTTTGTGA ACTGGCTGCT GGCCCAAAAG GGGAAGAAGA ATGACTGGAA ACACAACATC 120 ACCCAGTGCC CCGAGGATGG CGGCAGCGGC GCCTTCCCGC CCGGCCACTT CAAGGACCCC 180 AAGCGGCTGT ACTGCAAAAA CGGGGGCTTC TTCCTGCGCA TCCACCCCGA CGGCCGAGTT 240 GACGGGGTCC GGGAGAAGAG CGACCCTCAC ATCAAGCTAC AACTTCAAGC AGAAGAGAGA 300 GGAGTTGTGT CTATCAAAGG AGTGAGCGCT AATCGTTACC TGGCTATGAA GGAAGATGGA 360 AGATTACTAG CTTCTAAGTC TGTTACGGAT GAGTGTTTCT TTTTTGAACG ATTGGAATCT 420 AATAACTACA ATACTTACCG GTCAAGGAAA TACACCAGTT GGTATGTGGC ACTGAAACGA 480 ACTGGGCAGT ATAAACTTGG ATCCAAAACA GGACCTGGGC AGAAAGCTAT ACTTTTTCTT 540 CCAATGTCTG CTAAGAGCTG C 561

【００９３】配列番号：４ 配列の長さ：５６１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TACGCGGAAG GGACTTTCAT CAGTGACTAC AGTATTGCCA TGGACAAGAT TCACCAACAA 60 GACTTTGTGA ACTGGCTGCT GGCCCAAAAG GGGAAGAAGA ATGACTGGAA ACACAACATC 120 ACCCAGTGTC CCGAGGATGG CGGCAGCGGC GCCTTCCCGC CCGGCCACTT CAAGGACCCC 180 AAGCGGCTGT ACTGCAAAAA CGGGGGCTTC TTCCTGCGCA TCCACCCCGA CGGCCGAGTT 240 GACGGGGTCC GGGAGAAGAG CGACCCTCAC ATCAAGCTAC AACTTCAAGC AGAAGAGAGA 300 GGAGTTGTGT CTATCAAAGG AGTGAGCGCT AATCGTTACC TGGCTATGAA GGAAGATGGA 360 AGATTACTAG CTTCTAAGTC TGTTACGGAT GAGTGTTTCT TTTTTGAACG ATTGGAATCT 420 AATAACTACA ATACTTACCG GTCAAGGAAA TACACCAGTT GGTATGTGGC ACTGAAACGA 480 ACTGGGCAGT ATAAACTTGG ATCCAAAACA GGACCTGGGC AGAAAGCTAT ACTTTTTCTT 540 CCAATGTCTG CTAAGAGCTG C 561

【００９４】配列番号：５ 配列の長さ：５３７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TCTGTGAGTG AAATACAGCT TATGCATAAC CTGGGAAAAC ATCTGAACTC GATGGAGAGA 60 GTAGAATGGC TGCGTAAGAA GCTGCAGGAT GTGCACAATT TTTGCCCCGA GGATGGCGGC 120 AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG GACCCCAAGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG 180 GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC 240 CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGAA GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG 300 AGCGCTAATC GTTACCTGGC TATGAAGGAA GATGGAAGAT TACTAGCTTC TAAGTCTGTT 360 ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG GAATCTAATA ACTACAATAC TTACCGGTCA 420 AGGAAATACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG AAACGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC 480 AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGC 537

【００９５】配列番号：６ 配列の長さ：５３７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TCTGTGAGTG AAATACAGCT TATGCATAAC CTGGGAAAAC ATCTGAACTC GATGGAGAGA 60 GTAGAATGGC TGCGTAAGAA GCTGCAGGAT GTGCACAATT TTTGTCCCGA GGATGGCGGC 120 AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG GACCCCAAGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG 180 GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC 240 CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGAA GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG 300 AGCGCTAATC GTTACCTGGC TATGAAGGAA GATGGAAGAT TACTAGCTTC TAAGTCTGTT 360 ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG GAATCTAATA ACTACAATAC TTACCGGTCA 420 AGGAAATACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG AAACGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC 480 AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGC 537

【００９６】配列番号：７ 配列の長さ：５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CATGCTGAAG GGACCTTTAC CAGTGATGTA AGTTCTTATT TGGAAGGCCA AGCTGCCAAG 60 GAATTCATTG CTTGGCTGGT GAAAGGCCGA GGATGCCCCG AGGATGGCGG CAGCGGCGCC 120 TTCCCGCCCG GCCACTTCAA GGACCCCAAG CGGCTGTACT GCAAAAACGG GGGCTTCTTC 180 CTGCGCATCC ACCCCGACGG CCGAGTTGAC GGGGTCCGGG AGAAGAGCGA CCCTCACATC 240 AAGCTACAAC TTCAAGCAGA AGAGAGAGGA GTTGTGTCTA TCAAAGGAGT GAGCGCTAAT 300 CGTTACCTGG CTATGAAGGA AGATGGAAGA TTACTAGCTT CTAAGTCTGT TACGGATGAG 360 TGTTTCTTTT TTGAACGATT GGAATCTAAT AACTACAATA CTTACCGGTC AAGGAAATAC 420 ACCAGTTGGT ATGTGGCACT GAAACGAACT GGGCAGTATA AACTTGGATC CAAAACAGGA 480 CCTGGGCAGA AAGCTATACT TTTTCTTCCA ATGTCTGCTA AGAGCTGC 528

【００９７】配列番号：８ 配列の長さ：５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CATGCTGAAG GGACCTTTAC CAGTGATGTA AGTTCTTATT TGGAAGGCCA AGCTGCCAAG 60 GAATTCATTG CTTGGCTGGT GAAAGGCCGA GGATGTCCCG AGGATGGCGG CAGCGGCGCC 120 TTCCCGCCCG GCCACTTCAA GGACCCCAAG CGGCTGTACT GCAAAAACGG GGGCTTCTTC 180 CTGCGCATCC ACCCCGACGG CCGAGTTGAC GGGGTCCGGG AGAAGAGCGA CCCTCACATC 240 AAGCTACAAC TTCAAGCAGA AGAGAGAGGA GTTGTGTCTA TCAAAGGAGT GAGCGCTAAT 300 CGTTACCTGG CTATGAAGGA AGATGGAAGA TTACTAGCTT CTAAGTCTGT TACGGATGAG 360 TGTTTCTTTT TTGAACGATT GGAATCTAAT AACTACAATA CTTACCGGTC AAGGAAATAC 420 ACCAGTTGGT ATGTGGCACT GAAACGAACT GGGCAGTATA AACTTGGATC CAAAACAGGA 480 CCTGGGCAGA AAGCTATACT TTTTCTTCCA ATGTCTGCTA AGAGCTGC 528

【００９８】配列番号：９ 配列の長さ：８４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn- 1 5 10 15 Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His- 20 25 30 Asn-Phe-Val-Ala-Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser- 35 40 45 Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu- 50 55 60 Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asn-Val-Leu-Thr-Lys- 65 70 75 80 Ala-Lys-Ser-Gln 84

【００９９】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CACAATTTTT GCGCCTTAGG 20

【０１００】配列番号：１１ 配列の長さ：４２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Alg Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln 35 40 42

【０１０１】配列番号：１２ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30

【０１０２】配列番号：１３ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe 34

【０１０３】配列番号：１４ 配列の長さ：１４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TCTAG ATG TAC GCG GAA GGG ACT TTC ATC AGT GAC TAC AGT ATT GCC 47 Met Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala 1 5 10 ATG GAC AAG ATT CAC CAA CAA GAC TTT GTG AAC TGG CTG CTG GCC CAA 95 Met Asp Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln 15 20 25 30 AAG GGG AAG AAG AAT GAC TGG AAA CAC AAC ATC ACC CAG TGC CCC GAG 143 Lys Gly Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln Cys 35 40

【０１０４】配列番号：１５ 配列の長さ：１７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TCT AGA AAG GAG ATA TAC ACT ATG TAC GCG GAA GGG ACT TTC ATC AGT 48 Met Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser 1 5 GAC TAC AGT ATT GCC ATG GAC AAG ATT CAC CAA CAA GAC TTT GTG AAC 96 Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn 10 15 20 25 TGG CTG CTG GCC CAA AAG GGG AAG AAG AAT GAC TGG AAA CAC AAC ATC 144 Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile 30 35 40 ACC CAG TGC CCC GAG 159 Thr Gln Cys

【０１０５】配列番号：１６ 配列の長さ：１８７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp 1 5 10 15 Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly 20 25 30 Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln Cys Pro Glu Asp Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 50 55 60 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 65 70 75 80 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 85 90 95 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn 100 105 110 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser 115 120 125 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 130 135 140 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 145 150 155 160 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 165 170 175 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 180 185 187

【０１０６】配列番号：１７ 配列の長さ：９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TCT AGA AAG GAG ATA TAC ACT ATG CAC GAT GAA TTT GAA AGA CAT GCT 48 Met His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala 1 5 GAA GGC ACC TTT ACC AGC GAT GTA AGC TCT TAT CTG GAA GGC CAG GCT 96 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 10 15 20 25 GCC AAA GAA TTC ATT GCT TGG CTG GTG AAA GGC CGT GGC TGC CCC GAG 144 Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys Pro Glu 30 35 40

【０１０７】配列番号：１８ 配列の長さ：１７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys Pro Glu Asp 20 25 30 35 Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr 40 45 50 Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly 55 60 65 70 Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg 75 80 85 Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu 90 95 100 105 Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Tyr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 110 115 120 125 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp 130 135 140 Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser-OH 165 170 175

【０１０８】配列番号：１９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：２・・・３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TATGTCTGTG TCCGAGATTC AGTTAATGCA 30

【０１０９】配列番号：２０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・３４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＡＧＧＴＴＡＴＧＣＡ ＴＴＡＡＣＴＧＡＡＴ ＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡ ＧＡＣ
Ａ ３４

【０１１０】配列番号：２１ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TAACCTTGGC AAACATTTGA ACTCCATGGA GCGTGTAGAA TGGCT 45

【０１１１】配列番号：２２ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TTACGCAGCC ATTCTACACG CTCCATGGAG TTCAAATGTT TGCCA 45

【０１１２】配列番号：２３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GCGTAAGAAG TTGCAGGATG TGCACAATTT 30

【０１１３】配列番号：２４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GCAACAAAAT TGTGCACATC CTGCAACTTC 30

【０１１４】配列番号：２５ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TGTTGCCTTA GGTGCCCCAT TGGCTCCTCG TGATGCTGGT TCCCAA 46

【０１１５】配列番号：２６ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧ ＧＡＡＣＣＡＧＣＡＴ ＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣ ＣＡＡ
ＴＧＧＧＧＣＡ ＣＣＴＡＡＧ ４６

【０１１６】配列番号：２７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ＡＧＡＣＣＡＣＧＴＡ ＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡ ＣＡＡＴＧＴＣＴＴＡ ＧＴＴ
ＧＡＧＡＧＣＣ Ａ ４１

【０１１７】配列番号：２８ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TTTTCATGGC TCTCAACTAA GACATTGTCT TCCTTTTTAC G 41

【０１１８】配列番号：２９ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TGAAAAATCC CTAGGCGAGG CAGACAAGGC CGATGTGAAT GT 42

【０１１９】配列番号：３０ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・４２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GTTAATACAT TCACATCGGC CTTGTCTGCC TCGCCTAGGG AT 42

【０１２０】配列番号：３１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・２８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ATTAACTAAA GCTAAATCCC AGTAATGAG 29

【０１２１】配列番号：３２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：６・・・２７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTA 27

【０１２２】配列番号：３３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CACAATTTTT GCGCCTTAGG TGC 23

【０１２３】配列番号：３４ 配列の長さ：２５２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１０３・・・１０５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TCT GTG TCC GAG ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC 48 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 TCC ATG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC 96 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 AAT TTT TGC GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC 144 Asn Phe Cys Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA 192 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA 240 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 GCT AAA TCC CAG 252 Ala Lys Ser Gln 84

【０１２４】配列番号：３５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３６ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の反応工程における反応メカニズムを示
す。

【図２】ＧＩＰのアミノ酸配列を示す。

【図３】ＧＬＰＩ（７−３７）のアミノ酸配列を示す。

【図４】ＰＴＨ(１−３４)のアミノ酸配列を示す。

【図５】参考例１で得られた、プラスミドpＨＰ９０１
の構築図を示す。

【図６】参考例１で得られた、プラスミドpＭＥ９０１
の構築図を示す。

【図７】参考例１で得られた、プラスミドpＣＭ９０１
の構築図を示す。

【図８】実施例１および実施例５(２)で用いられる遺伝
子断片を示す。

【図９】実施例１で得られる、プラスミドpＧＳ２３の
構築図を示す。

【図１０】実施例１で得られる、プラスミドpＧＳ２３
の構築図を示す。

【図１１】実施例１で得られるおよび実施例５(２)で得
られた融合蛋白質の全アミノ酸配列を示す。

【図１２】実施例１で得られるおよび実施例５(２)で得
られた融合蛋白質の全アミノ酸配列を示す。

【図１３】実施例５(１)で得られた、プラスミドpＴＢ
９６０−１の構築図を示 す。

【図１４】実施例５(１)で得られた、プラスミドpＴＢ
９６０−２の構築図を示 す。

【図１５】実施例５(２)で得られた、プラスミドpＴＢ
９６０−３の構築図を示 す。

【図１６】実施例６で得られた、Insulinotropin をコ
ードするＤＮＡ配列を示す。

【図１７】実施例６で得られた、プラスミドｐＴＢ９６
０−７の構築図を示す。

【図１８】実施例６で得られた、ＧＬＰ−Ｉ（７−３
７）−ｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３のアミノ酸配列を示
す。

【図１９】実施例７で得られた、ＤＮＡフラグメントを
示す。

【図２０】実施例７で得られた、２重鎖構成のｈＰＴＨ
遺伝子を製造する模式図を示す。

【図２１】実施例７で得られた、２重鎖構成のｈＰＴＨ
ＤＮＡを製造する模式図を示す。

【図２２】実施例７で得られた、プラスミドｐＥ−ＰＴ
Ｈの構築図を示す。

【図２３】実施例７で得られた、プラスミドｐＵ・Ｃ３
５ＰＴＨの構築図を示す。

【図２４】実施例７で得られた、プラスミドｐＥ・Ｃ３
５ＰＴＨの構築図を示す。

【図２５】実施例７で得られた、〔Ｃｙｓ³⁵〕ヒトＰＴ
Ｈ対応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。

【図２６】実施例７で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果を示す。

【図２７】実施例７で得られた、ウエスタンブロッティ
ングの結果を示す。

【図２８】実施例７で得られた、逆相ＨＰＬＣの結果を
示す。

【図２９】実施例７で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果を示す。

【図３０】実施例７で得られた、逆相高速液体カラムク
ロマトグラフィーの結果を示す。

【図３１】実施例８で得られた、逆相高速液体カラムク
ロマトグラフィーの結果を示す。

【図３２】実施例９で得られた、逆相高速液体カラムク
ロマトグラフィーの結果を示す。

【図３３】実施例１０，１１および１２で得られた、逆
相高速液体カラムクロマトグラフィーの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 福田 常彦 京都府京都市西京区大原野西境谷町２丁目 ９番10−202号

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドのＮ末端にシステインを含まないペプチドを連
   結した融合蛋白質まペプチドをコードする遺伝子を含有
   するベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白
   質またはペプチドを発現させ、発現された融合蛋白質ま
   たはペプチドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド
   結合の切断反応に付すことを特徴とするシステインを含
   まないペプチドの製造法。
2. 【請求項２】Ｎ末端にシステインを有する蛋白質または
   ペプチドのＮ末端にシステインを含まないペプチドを連
   結した融合蛋白質またはペプチドをコードする遺伝子を
   構築し、該遺伝子を有するベクターを保持する形質転換
   体を作製し、該形質転換体を培養して融合蛋白質または
   ペプチドを発現させ、発現された融合蛋白質またはペプ
   チドをシステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切
   断反応に付すことを特徴とするシステインを含まないペ
   プチドの製造法。
3. 【請求項３】Ｎ末端にシステインを有するペプチドのＮ
   末端にシステインを含まないペプチドを連結したポリペ
   プチドを化学的に合成し、合成されたポリペプチドをシ
   ステイン残基のアミノ基側のペプチド結合の切断反応に
   付すことを特徴とするシステインを含まないペプチドの
   製造法。
4. 【請求項４】システイン残基のアミノ基側のペプチド結
   合の切断反応がシアノ化反応、次いでアミノ化合物また
   は置換アミノ化合物を用いて、システインを含まないペ
   プチドのアミドまたは置換アミドを製造する請求項１，
   ２または３記載の製造法。
5. 【請求項５】一般式 R₁-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₂-His-Asn-R₃-R₄-R₅-His
   -Leu-Asn-Ser-R₆-R₇-Arg-R₈-Glu-R₉-Leu-R₁₀-R₁₁-R₁₂-L
   eu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₁₃ 〔Ｉ〕 〔式中R₁はSerまたはAibを、R₂はMetまたは天然型の脂
   溶性アミノ酸を、R₃はLeu，Ser，Lysまたは芳香族アミ
   ノ酸を、R₄はGly，またはD-アミノ酸を、R₅はLysまたは
   Leuを、R₆はMetまたは天然型の脂溶性アミノ酸を、R₇は
   Glu，または塩基性アミノ酸を、Ｒ_８はVal，または塩基
   性アミノ酸を、R₉はTrpまたは2-(1,3-ジチオラン-2-イ
   ル) Trpを、R₁₀はArgまたはHisを、R₁₁はLysまたはHis
   を、R₁₂はLys，GlnまたはLeuを、R₁₃はフェニルアラニ
   ン置換アミドを示す。〕で表されるペプチドまたはその
   塩。