NO319848B1 - Syntetiske peptidanaloger til PTH og PTHrp, fremgangsmate for fastfasesyntese derav, farmasoytiske preparater som omfatter dem, og anvendelse derav til fremstilling av medikamenter til behandling av reduksjoner i benmasse. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

a) Oppfinnelsens område

Denne oppfinnelsen vedrører nye analoger til paratyreoidhormon og paratyreoidhormonbeslektet peptid, deres syntese ved hjelp-.av fastfase- og rekombinant teknikker, og deres anvendelse til å øke benmassen hos pattedyrindivider.

b) Beskrivelse av beslektet teknikk

Osteoporose er den vanligste form av metabolsk ben-sykdom og kan betraktes som det symptomatiske bruddstadium av bentap (osteopeni). Selv om osteoporose kan oppstå sekundært til et antall underliggende sykdommer, synes 90% av alle til-feller å være idiopatiske. Kvinner etter klimakteriet har særlig risiko for idiopatisk osteoporose (postmenopausal eller type I osteoporose). En annen høyrisikogruppe for idiopatisk osteoporose er eldre av begge kjønn (alderdoms- eller type II osteoporose). Osteoporose er også blitt relatert til kortiko-steroidbruk, immobilisering eller langvarig sengehvile, alko-holisme, diabetes, gonadotoksisk kjemoterapi, hyperprolaktin-emi, anorexia nervosa, primær og sekundær amenoré og ooforektomi.

I de forskjellige formene av osteoporose inntrer ofte benbrudd som er resultatet av bentap som har nådd punktet for mekanisk svikt. Postmenopausal osteoporose er kjennetegnet ved brudd i håndledd og ryggsøyle, mens lårhalsbrudd synes å være dSt" dominerende trekk ved alderdomsosteoporose.

Mekanismen hvorved ben går tapt hos osteoporetikere, antas å omfatte en ubalanse i prosessen hvorved skjelettet fornyer seg selv. Denne prosessen er blitt kalt benremodeller-ing. Den inntrer i en serie av atskilte aktivitetslommer.

Disse lommene oppstår spontant i benmassen på en bestemt ben-overflate som et sete for benresorpsjon. Osteoklastere (ben-oppløsende eller resorberende celler) er ansvarlige for res-orpsjonen av en del av ben med generelt konstant dimensjon. Denne resorpsjonsprosessen etterfølges av tilsynekomsten av osteoblastere (bendannende celler) som så gjenfyller med nytt ben hulrommet som etterlates av osteoklastene.

Hos et friskt, voksent individ er hastigheten hvorved osteoklastere og osteoblastere dannes, slik at bendannelse og benresorpsjon er i balanse. Hos osteoporetikere utvikles imidlertid en ubalanse i benremodelleringsprosessen som resulterer i at ben går tapt ved en større hastighet enn det lages. Selv om denne ubalansen inntrer i en viss utstrekning hos de fleste individer etter—hvert som de eldes, er den mye mer alvorlig og opptrer i en yngre alder hos postmenopausale osteoporetikere eller etter ooforektomi.

Det har vært mange forsøk på å behandle osteoporose med det mål enten å nedsette ytterligere bentap eller, mer ønskelig, å produsere en nettogevinst i benmasse. Visse midler, slik som østrogen og bisfosfonatene, synes å nedsette videre bentap hos osteoporetikere. Midler som nedsetter bentap på grunn av de forskjellige varighetene av benresorpsjon og -dannelse, kan synes å øke benmasse (i størrelsesorden 3 til 7%). Denne tilsynelatende økning er imidlertid begrenset i tid, ikke progressiv og skyldes en reduksjon i "remodeller-ingsrom". På grunn av den nære kobling mellom resorpsjon og dannelse vil i tillegg behandlinger som vanskeliggjør ben-resorps jon, også til sist vanskeliggjøre bendannelse.

Det er blitt foreslått at behandling med paratyreoidhormon (PTH) ville føre til både økt benomsetning og en posi-tiv kalsiumbalanse. Kliniske forsøk på mennesker har imidlertid vist at enhver økning i trabekulært ben utlignes av en reduksjon i kortikalt ben slik at det ikke er noen nettoøkning i totalt ben.

Hefti et al. i Clinical Science 62, 389-396 (1982), har rapportert at daglige subkutane doser av enten bPTH(l-84) eller hPTH(l-34) økte det totale kalsiuminnhold i kroppen og askevekten til individuelle ben både hos normale og osteopor-etiske voksne hunnrotter.

Liu et al. i J. Bone Miner. Res. 6:10, 1071-1080

(1991), har lagt merke til at ovariektomi av voksne hunnrotter induserte et 47% tap i den prosentvise andel av trabekulært ben i den proksimale tibialmetafyse, ledsaget av en betydelig økning i antallet osteoblastere og tråbekulære osteoklastere. Daglige subkutane injeksjoner av hPTH(l-34) reverserte full stendig tapet av trabekulært ben og resulterte i mengder av trabekulært ben som overskred den hos imitasjonsopererte kontroller. Antallet osteoblastere økte, og antallet osteoklastere avtok.

Hock et al. i J. Bone Min. Res. 7:1, 65-71 (1992), har rapportert at daglige subkutane injeksjoner av hPTH(l-34) til friske, voksne hannrotter i 12 dager økte trabekulært og kortikalt benkalsium og tørrvekt. Total benmasse, trabekulært benvolum, trabekulær tykkelse og antall, og osteoblastiske overflater ble forøkt.

Pattedyrparatyreoidhormonene, f.eks. humant (hPTH), bovint (bPTH) og porcint (pPTH), er enkeltpolypeptidkjeder med 84 aminosyrerester med molekylvekter på omtrent 9500. Biologisk aktivitet er forbundet med den N-terminale del, med rester (1-34) tilsynelatende som de minimalt påkrevde.

Det N-terminale segment av human-PTH atskiller seg fra det N-terminale segment av bovin- og porcinhormonene med bare henholdsvis tre og to aminosyrerester:

Primærfunksjonen til PTH er å utløse tilpasningsend-ringene som tjener til å opprettholde en konstant konsentrasjon av Ca<2*>i den ekstracellulære væske. PTH virker på nyrene slik at tubularreabsorpsjonen av Ca<2*>fra urinen øker, samt at omdannelsen av kalsifediol til kalsitriol, som er ansvarlig for absorpsjon av Ca<2*>fra tynntarmen, stimuleres. Én fremtred-ende effekt er å øke mobiliseringen av Ca<2*>fra ben. PTH virker på ben slik at resorpsjonshastigheten for Ca<2*>og fosfat økes. PTH stimulerer benresorpsjonshastigheten ved hjelp av osteoklastere, øker differensieringshastigheten for mesenchymal-celler til osteoklastere og forlenger halveringstiden til disse sistnevnte cellene. Med langvarig virkning av PTH øker også antallet bendannende osteoblastere; derved øker hastigheten for benomsetning og -remodellering. Individuelle osteoblastere synes imidlertid å være mindre aktive enn normalt.

Rosenblatt et al. i US patenter nr. 4 423 037,

4 968 669 og 5 001 223 har beskrevet PTH-antagonister erholdt

ved hjelp av delesjonen av de N-terminale (1-6) aminosyrene og den selektive erstatning av Phe<7>, Met<818>og Gly<12>. Tyr<34->NH2ø<k>te påviselig aktiviteten og stabiliteten til disse forbindelsene.

Paratyreoidhormonrelatert peptid (PTHrp), et 140+-aminosyreprotein, og fragmenter derav, reproduserer de vik-tigste biologiske virkningene av PTH. PTHrp bygges opp av en rekke human- og dyretumorer og andre vev og kan spille en rolle i hyperkalsemi ved ondartet kreft. Sekvensen til hPTHrp (1-34) er som følger:

Sekvenshomologien mellom hPTH og hPTHrp er stort sett begrenset til de 13 N-terminale restene, hvorav 8 er identiske; bare 1 av 10 aminosyrer i (25-34)-reseptorbindings-området til hPTH er konservert i hPTHrp. Konformasjonell lik-het kan være årsaken til den felles aktivitet. Cohen et al. i J. Biol. Chera. 266:3, 1997-2004 (1991), har foreslått at mye av sekvensen til PTH(l-34) og PTHrp(l-34), særlig områdene (5-18) og (21-34), inntar en a-helisk konfigurasjon, mens de bemerker at det er en viss usikkerhet med hensyn til hvorvidt denne kon-figurasjonen overvinner karboksylenden under fysiologiske for-hold. En slik sekundærstruktur kan være viktig for lipidinter-aksjon, reseptorinteraksjon og/eller strukturell stabilisering.

Vi har syntetisert analoger av PTH og av PTHrp med

det formål å utvikle forbedrede, terapeutiske midler for gjen-opprettelsen av benmasse hos pattedyrindivider, inkludert de som lider av osteoporose.

Oppsummering av oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen tilveiebringer syntetiske polypeptidanaloger av paratyreoidhormon (PTHrp), paratyreoidhormonrelatert peptid (PTHrp) eller salter derav, kjennetegnet ved at aminosyrerestene (22-31) i PTH eller PTHrp er modifisert slik at de danner en amfipatisk a-heliks, hvor sekvensen til restene (22-31) er valgt fra:

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa<28>og Xaa<31>uavhengig av hverandre er Leu eller Ile; Xaa<29>er Ala, Arg eller Glu; og Xaa<30>er Lys eller Glu (sekvensidentitet nr.: 85) ; idet i en forbindelse hvor Xaa<22>er Phe; Xaa<23>er Phe; Xaa<25>er His; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa28 er Ile; Xaa<29>er Ala; og Xaa<30>er Glu; er Xaa31Leu;

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<29>er Glu, Lys eller Lys(COCH2PEGX) og PEGX er et poly-(etylenglykolmetyleter) - radikal med molekylvekt 100 til 10.000 (sekvensidentitet nr.: 86) ;

Det er også tilveiebrakt farmasøytiske preparater som er kjennetegnet ved at de omfatter en effektiv benmasseøkende mengde av en polypeptidanalog av paratyreoidhormon (PTH), paratyreoidhormonrelatert peptid (PTHrp) eller salter derav, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Denne oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fastfasesyntesen av polypeptidanaloger av PTH, PTHrp og salter derav, hvor aminosyrerestene (22-31) er modifisert slik at de danner en amfipatisk a-heliks, idet restene (22-31) er valgt fra

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa<2B>og Xaa<31>uavhengig av hverandre er Leu eller Ile; Xaa<29>er Ala, Arg eller Glu; og Xaa<30>er Lys eller Glu (sekvensidentitet nr. : 85) ; idet i en forbindelse hvor Xaa22 er Phe; Xaa<23>er Phe; Xaa25 er His; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa<28>er Ile; Xaa<29>er Ala; og Xaa<30>er Glu; er Xaa<31>Leu;

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<29>er Glu, Lys eller Lys(COCH2PEGX) og PEGX er et poly-(etylenglykolmetyleter)-radikal med molekylvekt 100 til 10.000 (sekvensidentitet nr.: 86) ;

hvor fremgangsmåten er kjennetegnet ved sekvensvis sammenkobling av beskyttede aminosyrer på en egnet harpiksbærer, fjerning av sidekjeden og Na<->beskyttelsesgruppene, og avspalting av polypeptidet fra harpiksen.

Også omfattet er anvendelse av en forbindelse ifølge kravene 1-9 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, til fremstilling av et medikament for behandling av pattedyrtilstander som er kjennetegnet ved reduksjoner i benmasse, særlig for behandling av osteoporose.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser DNA-sekvensen og enzymrestriksjonssetene i et syntetisk gen som koder for en PTHrp(1-34)-analog ifølge denne oppfinnelsen (hPTH-PCR-amplifikasjon). Figur 2 skisserer fremstillingen av et plasmid hvor et PTHrp(1-34)-analoggen {Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1-konstruksjon) inkorporeres. Figur 3 skisserer fremstillingen av et plasmid hvor to kopier av et PTHrp(1-34)-analogt gen (Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2-konstruksjon) inkorporeres. Figur 4 skisserer fremstillingen av et plasmid hvor fire kopier av et PTHrp (1-34) -analoggen (Trp LE 18 hPTHrpd-34)4-konstruksjon) inkorporeres.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Forkortelser og definisjoner

Én- og trebokstavsforkortelsene for de forskjellige vanlige nukleotidbasene og aminosyrene er som anbefalt i Pure Appl. Chem. 31, 639-645 (1972) og 40, 277-290 (1974), ogOppfyl-ler 37 CFR §1.822 (55 FR 18245, 1. mai 1990), og PCT-reglene (WIPO Standard ST.23: Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents). Én- og trebokstavsforkortelsene er som følger:

Aminos<y>rerorkortelser

Forkortelsene representerer L-aminosyrer med mindre de er betegnet annerledes som D- eller D,L-. Visse aminosyrer, både naturlige og ikke-naturlige, er akirale, f.eks. glysin. Alle peptidsekvensene er vist med den N-terminale aminosyre til venstre og den C-terminale aminosyre til høyre.

Ytterligere forkortelser for andre aminosyrer og forbindelser som her er brukt, er:

"Hydrofil aminosyre (Haa)" henviser til en aminosyre med minst én hydrofil, funksjonell gruppe i tillegg til de som kreves for peptidbindingsdannelse, slik som arginin, aspara-gin, asparaginsyre, glutaminsyre, glutamin, histidin, lysin, serin, treonin og homologer derav.

"Lipofil aminosyre (Laa)" henviser til en uladet, alifatisk eller aromatisk aminosyre, slik som isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, tryptofan, tyrosin, valin, og homologer derav.

For denne oppfinnelsens formål er alanin klassifisert som "amfifil", dvs. i stand til å virke som enten hydrofil eller lipofil.

"Fysiologisk aktiv, avkortet homolog eller analog av PTH eller PTHrp" henviser til et polypeptid med en sekvens som omfatter mindre enn den fulltallige besetning av aminosyrer som finnes i PTH eller PTHrp, som imidlertid utløser en lignende fysiologisk respons. Det avkortede PTH eller PTHrp be-høver ikke være fullstendig homolog med PTH eller PTHrp for å utløse en lignende fysiologisk respons. PTH(1-34) og PTHrpfl- 34) er foretrukket, men ikke de eneste representanter for denne gruppen.

"Amfipatisk a-heliks" henviser til sekundærstrukturen som oppvises av visse polypeptider hvor aminosyrene inntar en a-helisk konfigurasjon med motstående polare og ikke-polare overflater orientert langs heliksens lange akse. Muligheten for a-helisk struktur i det aktuelle polypeptid kan i en viss utstrekning undersøkes ved hjelp av konstruksjonen av en "Schiffer-Edmundson-omdreining" (M. Schiffer and A. B. Edmundson, Biophys. J. 7, 121 (1967)), med den passende hellings-vinkel og ved å legge merke til avsetningen av de hydrofile og lipofile restene på motstående overflater til sylinderen som omgir heliksen. Alternativt kan empirisk bevismateriale, slik som sirkulærdikroisme- eller røntgendiffraksjonsdata, være tilgjengelig og indikere tilstedeværelsen av et a-helisk område i et bestemt polypeptid. En ideell a-heliks har 3,6 aminosyrerester pr. omdreining med tilgrensende sidekjeder atskilt ved en buevinkel på 100°. Eisenberg et al. i Nature 299:371-374 (1982) og Proe. Nat. Acad. Sei. USA 81:140-144

(1984) har kombinert en hydrofobisitetsskala med den heliske omdreining for å kvantifisere konseptet med amfipatiske helikser. Det gjennomsnittlige hydrofobe moment defineres som vek-torsummen av hydrofobisitetene til komponentaminosyrene som utgjør heliksen. De følgende hydrofobisiteter for aminosyrene er de som er rapportert av Eisenberg (1984) som "konsensus skalaen: Ile 0,73; Phe 0,61; Val 0,54; Leu 0,53; Trp 0,37;

Met 0,26; Ala 0,25; Gly 0,16; Cys 0,04; Tyr 0,02;

Pro -0,07; Thr -0,18; Ser -0,26; His -0,40;

Glu -0,62; Asn -0,64; Gin -0,69; Asp -0,72;

Lys -1,10; Arg -1,76.

Det hydrofobe moment, u„, for en ideell a-heliks med 3,6 rester pr. omdreining (eller en 100° buevinkel ( = 360°/3,6) mellom sidekjedene), kan beregnes ut fra:

hvor H„ er hydrofobisitetsverdien til den N-te aminosyre og summene er tatt over N-aminosyrene i sekvensen med periodisi-teten 6=100°. Det hydrofobe moment kan uttrykkes som det gjennomsnittlige hydrofobe moment pr. rest ved å dividere u„ med N, hvorved man får <Ph>. En verdi for <uH> ved 100° ± 20° på ca. 0,20 eller mer tyder på amfipatisk heliksdannelse. <uH>-ver-diene ved 100° for hPTHrp (22-31) og hPTH (22-31) er henholdsvis 0,19 og 0,37.

Cornett et al., i J. Mol. Biol., 195:659-685 (1987), har videre utvidet undersøkelsen av amfipatiske a-helikser ved å innføre den "amfipatiske indeks" som en amfipatisitetspre-diktor. De konkluderte med at omtrent halvparten av alle kjente a-helikser er amfipatiske, og at den dominerende hyp-pighet er 97,5" og ikke 100°, idet antallet rester pr. omdreining er nærmere 3,7 enn 3,6. Selv om slike spissfindigheter er vitenskapelig interessante, er den grunnleggende tilnærming til Eisenberg et al. tilstrekkelig til å klassifisere en bestemt sekvens som amfipatisk, særlig når man utformer en sekvens ab initio for å danne en amfipatisk a-heliks.

En amfipatisk a-helisk substituttaminosyresekvens kan mangle homologi med sekvensen til et bestemt segment i et naturlig forekommende polypeptid, men utløser en lignende sekundærstruktur, dvs. en a-heliks med motstående polare og ikke-polare overflater, i det fysiologiske miljø. Erstatning av den naturlig forekommende aminosyresekvens med en alterna-tiv sekvens kan på gunstig måte påvirke den fysiologiske aktivitet, stabilitet eller andre egenskaper hos det endrede opphavspolypeptid. Rettledning med hensyn til utformingen og utvelgelsen av slike sekvenser er gitt i blant annet J. L. Krstenansky et al., FEBS Letters 242:2, 409-413 (1989), og J.

P. Segrest et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117 (1990).

Den amfipatiske ti-aminosyre-a-heliks ifølge denne oppfinnelsen har formelen:

hvor Haa-ene er valgt fra gruppen av hydrofile aminosyrer og

Laa-ene er valgt fra gruppen av llpoflle aminosyrer, som definert ovenfor. Under forutsetning av en idealisert a-heliks er restene 1, 4, 5, 8 og 9 fordelt langs én side (A) av heliksen innenfor en buevinkel på ca. 140" fra hverandre, mens restene 2, 3, 6, 7 og 10 okkuperer en motstående buevinkel på 140° på den andre siden (B) av heliksen. Alle restene på én side har fortrinnsvis den samme polaritet, mens alle de som er på den andre siden, har den motsatte polaritet, dvs. dersom side A er totalt hydrofil, er side B totalt lipofil og vice versa. Fagfolk innen teknikken vil forstå at selv om heliksene ifølge denne oppfinnelsen er beskrevet ved hjelp av vil den motsatte sekvens.

også oppfylle restfordelingskriteriene og er en ekvivalent deskriptor for heliksene ifølge denne oppfinnelsen.

Enten hydrofile eller lipofile aminosyrer kan byttes ut med alanin ettersom Ala lett kan være på begge sidene av en amfipatisk a-heliks selv om Ala10ikke danner amfipatisk a-heliks. Generelt anvendes ikke prolin, cystein og tyrosin; deres tilstedeværelse og andre vilkårlige feil i sekvensen kan imidlertid tolereres, f.eks. en hydrofil rest på den lipofile side så lenge de gjenværende aminosyrene i segmentet i det vesentlige føyer seg etter inndelingen mellom hydrofil side og lipofil side. En passende metode for å bestemme om en sekvens er tilstrekkelig amfipatisk til å være en sekvens ifølge denne oppfinnelsen, er å beregne det gjennomsnittlige, hydrofobe moment, som definert ovenfor. Dersom gjennomsnittsmomentet for toppen pr. rest ved 100" ± 20" overskrider ca. 0,20, så vil sekvensen danne en amfipatisk heliks og er en sekvens ifølge denne oppfinnelsen.

Det gjennomsnittlige, hydrofobe moment pr. rest ved 100° for (sekvensidentitet nr.: 26), Xaa = Glu, beregnes f.eks. på følgende måte:

For denne sekvensen opptrer det gjennomsnittlige, hydrofobe toppmoment ved 92° og har en verdi på 0,48.

Når dette konseptet anvendes på paratyreoidhormon og paratyreoidhormonrelatert peptid, la man til grunn den hypo-tese at ett av eller begge områdene (7-16) og (22-31) kan opp-vise a-helisk sekundærstruktur og vil kunne erstattes med en ikke-homolog sekvens med lignende strukturelle tilbøyeligheter uten tap av biologisk aktivitet eller induksjon av immunolog-isk reaksjon.

Foretrukne utførelsesformer

Ved ett aspekt tilveiebringer denne oppfinnelsen polypeptidene med formelen:

Ved et annet aspekt tilveiebringes polypeptidene med formelen:

Xaa er Glu, Lys eller Lys (COCH2PEGX) og PEGX er et poly-(etylenglykolmetyleter)radikal med molekylvekt 100-10.000 (sekvensidentitet nr.: 27).

Ved et annet aspekt tilveiebringer denne oppfinnelsen polypeptider med formelen:

Xaa<1>er fraværende eller er Ala;

Xaa2 er fraværende eller er Val;

Xaa3 er fraværende eller er Ser;

Xaa4 er fraværende eller er Glu eller Glu(0CH3);

Xaa<5>er fraværende eller er His eller Ala;

Xaa<6>er fraværende eller er Gin;

Xaa' er fraværende eller er Leu;

Xaa<10>og Xaa<17>uavhengig av hverandre er Asp eller Asp(OCH3);

Xaa<11>er Lys, Arg eller Leu;

Xaa<13>er Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, Cys (CH2CONH (CH2) 2NH(biotinyl)) , Lys(7-dimetylamino-2-okso-2H-l-benzopyran-4-acetyl) eller Lys(dihydrocinnamoyl);

Xaa<20>er Arg eller Leu;

Xaa<19>og Xaa<21>uavhengig av hverandre er Lys, Ala eller Arg; Xaa<22*31>er valgt fra (sekvensidentitetene nr. 26, 27, 28, 29 eller 30);

Xaa<32>er His, Pro eller Lys;

Xaa<33>er fraværende eller er Pro, Thr, Glu eller Ala;

Xaa<34>er fraværende eller er Pro, Arg, Met, Ala, hSer, hSerlakton, Tyr, Leu eller 1,4-diaminobutyryllaktam;

Xaa<35>er fraværende eller er Pro, Glu, Ser, Ala eller Gly;

Xaa<3fi>er fraværende eller er Ala, Arg eller Ile;

Xaa<37>er fraværende eller er Arg, Trp eller 3-(2-naftyl)-L-alanin;

Xaa<38>er fraværende eller er Ala eller hSer, eller Xaa<38>"<42>er Thr Arg Ser Ala Trp; og Term er OR eller NR2hvor hver R uavhengig av hverandre er H, (C^-C^alkyl eller fenyl [ C^- Ci) alkyl; og de farmasøytisk akseptable salter derav.

Ved nok et annet aspekt omfatter denne oppfinnelsen polypeptidanaloger av den fysiologisk aktive, avkortede homolog hPTHrp(1-34) som vist i formel (I): Ala Val Ser Glu Xaa5 Gin Leu Leu His Asp Xaa<11>Gly Xaa<13>Ser Ile Gin Asp Leu Xaa<19>Arg Xaa<21>Xaa<22>"<31>Xaa<32>Xaa<33>Xaa34 Term, hvor:Xaa<5>er His eller Ala;

Xaa<11>og Xaa<13>uavhengig av hverandre er Lys, Arg eller Leu; Xaa<19>og Xaa<21>uavhengig av hverandre er Ala eller Arg;

Xaa<22>"<31>er valgt fra:

Xaa er Glu, Lys eller Lys (COCH2PEGX) og PEGX er et poly (etylenglykolmetyleter) radikal med molekylvekt 100-10.000 (sekvensidentitet nr.: 27) ;

Xaa<32>er His eller Lys;

Xaa<33>er Thr, Glu eller Ala;

Xaa<34>er Ala, hSer, Tyr eller Leu;

og Term er Gly Arg Arg, lakton, OH eller NR2, hvor hver R er H eller (Ci-C4)-alkyl; og deres farmasøytisk akseptable salter.

(Formel I) .

Et mer spesifikt aspekt av oppfinnelsen omfatter de polypept idene med formel (I) hvor Xaa<22>"<31>er {sekvensidentitet nr.: 26) for hvilke </iH> ved 100° overskrider 0,45. Et enda mer spesifikt aspekt av oppfinnelsen omfatter de polypeptidene med formel (I) hvor Xaa<22>"<31>er (sekvensidentitet nr. : 26) ; Xaa11 og Xaa<13>begge er Lys; og Xaa<19>og Xaa<21>begge er Arg.

Representative polypeptider omfatter, men er ikke begrenset til:

Et annet aspekt ved denne oppfinnelsen omfatter de polypeptidene med formel (I) hvor Xaa<22>"<31>er (sekvensidentitet nr.: 26); Xaa<11>og Xaa<13>begge er Lys; og én av Xaa<19>og Xaa<21>er Arg og den andre er Ala. Representative polypeptider av denne underslekten omfatter, men er ikke begrenset til:

Ved et annet aspekt omfatter denne oppfinnelsen de polypept idene med formel (I) hvor Xaa<22>-<31>er (sekvensidentitet nr.: 26); én av Xaa<11>og Xaa<13>er Leu og den andre er Lys; og Xaa<19>og Xaa<21>begge er Arg. Representative polypeptider av denne underslekten omfatter, men er ikke begrenset til:

Ved et annet aspekt omfatter denne oppfinnelsen de polypeptidene med formel (I) hvor Xaa<22>-<31>er (sekvensidentitet nr.: 27), for hvilke <uH> ved 100° overskrider 0,50. Et ytterligere aspekt av denne oppfinnelsen omfatter de polypeptidene med formel (I) hvor Xaa<22>"<31>er (sekvensidentitet nr.: 27); Xaa<11>og Xaa<13>begge er Lys eller begge er Arg; og Xaa<19>og Xaa<21>begge er Arg. Representative polypeptider av denne underslekten omfatter, men er ikke begrenset til:

Ved et annet aspekt omfatter denne oppfinnelsen polypeptider med formel (I) hvor Xaa<22>"<31>er {sekvensidentitet nr.: 28), for hvilke <uH> ved 100° er ca. 0,25. Representative polypeptider av denne underslekten omfatter, men er ikke begrenset til":

Ved et annet aspekt omfatter denne oppfinnelsen polypeptider med formel (I) hvor Xaa<22>'<31>er (sekvensidentitet nr.: 29), for hvilke <u„> ved 100° er ca. 0,28. Representative polypeptider av denne underslekten omfatter, men er ikke begrenset til:

Ved et annet aspekt omfatter denne oppfinnelsen polypeptider med formel (I) hvor Xaa<22>'<31>er (sekvensidentitet nr.: 30), for hvilke <uH> ved 100° er ca. 0,29. Representative polypeptider av denne underslekten omfatter, men er ikke begrenset til:

Nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen omfatter polypeptidanaloger av den fysiologisk aktive, avkortede homolog bPTH{l-34), som vist i formel (II):

Xaa<1>er Ser eller Ala;

Xaa<7>erLeu eller Phe;

Xaa<8>er Met eller Nie;

Xaa<16>er Asn eller Ser;

Xaa<18>er Leu, Met eller Nie;

Xaa<19>er Glu eller Arg;

Xaa<21>er Val eller Arg;

Xaa<22>-<31>er valgt fra (sekvensidentitetene nr. 26, 27, 28, 29 og 30);

Xaa<3*>erPhe eller Tyr;

Term er OH eller NR2, hvor hver R er H eller (C^-C^ )-alkyl; og de farmasøytisk akseptable salter derav. (Formel II). Representative polypeptider omfatter, men er ikke begrenset til:

Ved nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen er det overraskende blitt funnet at homologer og analoger av PTH og PTHrP som har mindre enn 34 aminosyrer, også er sterke ben-remodelleringsmidler. Disse forbindelsene har generell formel: Ala Val Ser Glu Xaa<5>Gin Leu Leu His Asp Xaa<11>Gly Xaa<13>Ser Ile Gin Asp Leu Xaa<19>Arg Xaa<21>Xaa<22>"<31>Xaa<32>Xaa<33>Xaa34 Term.

Representative polypeptider omfatter, men er ikke begrenset til: Forbindelse 41: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2

(sekvensidentitet nr.: 55)

Fysikalske data

Forbindelse 42: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH,

(sekvensidentitet nr.: 56)

Fysikalske data

Fagfolk innen teknikken vil forstå at det kan syntet-iseres et stort antall permutasjoner av polypeptidanalogene som vil ha de ønskelige fordelene ved de som er beskrevet her, forutsatt at en aminosyresekvens med et gjennomsnittlig hydro-fobt moment pr. rest ved 100° ±20° som er større enn ca. 0,20, er innføyet i stillingene (22-31).

Klassisk syntese av polypeptidene

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan s<y>ntetiseres ved hjelp av fremgangsmåter, slik som de som er angitt i J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Syn-thesis, 2. utg., Pierce Chemical Co-, Rockford, Illinois

(1984) og J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol.

2, Academic Press, New York, (1973) for fastfasesyntese og E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, vol. 1, Academic Press, New York, (1965) for oppløsningssyntese.

Generelt omfatter disse fremgangsmåtene den sekvens-vise addisjon av beskyttede aminosyrer til en voksende peptid-kjede. Normalt beskyttes enten amino- eller karboksylgruppen i den første aminosyren og enhver reaktiv sidekjedegruppe. Denne beskyttede aminosyre festes så enten til en inert, fast bærer eller benyttes i oppløsning, og den neste aminosyren i sekvensen som også er passende beskyttet, adderes under betingelser som er dannelsesvennlige for amidbindingen. Etter at alle de ønskede aminosyrer er blitt bundet i den korrekte sekvens, fjernes beskyttelsesgrupper og en eventuell fast bærer, hvorved man får råpolypeptidet. Polypeptidet avsaltes og renses, fortrinnsvis kromatografisk, hvorved man får sluttproduktet.

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av ana-logene til de fysiologisk aktive, avkortede polypeptider, som har færre enn ca. 40 aminosyrer, omfatter fastfase-peptidsyn-tese. Ved denne fremgangsmåten beskyttes o-amino-funksjonene (N°) og eventuelle reaktive sidekjeder ved hjelp av syre- eller basesensitive grupper. Beskyttelsesgruppen bør være stabil overfor betingelsene ved peptidbindingsdannelse, samtidig som den er lett fjernbar uten å påvirke polypeptidkjeden som ennå er i behold. Egnede a-aminobeskyttelsesgrupper omfatter, men er ikke begrenset til, t-butoksykarbonyl (Boe), benzyloksykar-bonyl (Cbz), o-klorbenzyloksykarbonyl, bifenylisopropyloksy-karbonyl, t-amyloksykarbonyl (Amoc), isobomyloksykarbonyl, a,a-dimetyl-3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl, o-nitrofenylsul-fenyl, 2-cyano-t-butoksykarbonyl, 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Pmoc) og lignende, fortrinnsvis t-butoksykarbonyl (Boe). Egnede sidekjedebeskyttelsesgrupper omfatter, men er ikke begrenset til: acetyl, benzyl (Bzl), benzyloksymetyl (Bom), o-brom-benzyloksykarbonyl, t-butyl, t-butyldimetylsilyl, 2-klorbenzyl

(Cl-z), 2,6-diklorbenzyl, sykloheksyl, syklopentyl, isopropyl, pivalyl, tetrahydropyran-2-yl, tosyl (Tos), trimetylsilyl og trityl.

Ved fastfasesyntese festes først den C-terrainale aminosyre til en egnet harpiksbærer. Egnede harpiksbærere er de materialene som er inerte overfor reagensene og reaksjons-betingelsene for de trinnvise kondensasjons- og avbeskyttel-sesreaksjoner, samt er uoppløselige i de anvendte medier. Eksempler på kommersielt tilgjengelige harpikser omfatter styren/divinylbenzenharpikser modifisert med en reaktiv gruppe, f.eks. klormetylert kopoly(styren-divinylbenzen), hydroksymetylert kopoly(styren-divinylbenzen) og lignende. Benzylert, hydroksymetylert fenylacetamidometylharpiks (PAM) er foretrukket. Når C-enden til forbindelsen er et amid, er en foretrukket harpiks p-metylbenzhydrylamino-kopoly(styren-divinylbenzen )-harpiks.

Festing til PAM-harpiksen kan utføres ved omsetning av den JT-beskyttede aminosyre, fortrinnsvis Boc-aminosyren, som dens ammonium-, cesium-, trietylammonium-, 1,5-diazabisyk-lo-[5.4.0]undec-5-en-, tetrametylammonium- eller lignende salt i etanol, acetonitril, N,N-dimetylformamid (DMF) og lignende, fortrinnsvis cesiumsaltet i DMF, med harpiksen ved en forhøyet temperatur, f.eks. mellom ca. 40 og 60"C, fortrinnsvis ca. 50°C, i fra ca. 12 til 72 timer, fortrinnsvis ca. 48 timer.

N°-Boc-aminosyren kan festes til benzhydrylaminharpiksen ved hjelp av f.eks. en kobling formidlet med N,N'-di-isopropylkarbodiimid (DIC)/l-hydroksybenzotriazol (HOBt) i fra ca. 2 til ca. 24 timer, fortrinnsvis ca. 2 timer ved en temperatur mellom ca. 10 og 50°C, fortrinnsvis 25"C, i et slikt oppløsningsmiddel som diklormetan eller dimetylformamid, fortrinnsvis diklormetan.

Den suksessive kobling av beskyttede aminosyrer kan utføres ved hjelp av fremgangsmåter som er godt kjent innen teknikken, typisk i et automatisert peptidsynteseapparat. Etter nøytralisering med trietylamin eller lignende base inn-føres hver beskyttet aminosyre fortrinnsvis i et omtrent 1,5 til 2,5 gangers molart overskudd, og koblingen utføres i et slikt inert, ikke-vandig, polart oppløsningsmiddel som diklormetan, DMF eller blandinger derav, fortrinnsvis i diklormetan, ved omgivelsestemperatur. Representative koblingsmidler er N,N'-disykloheksylkarbodiimid (DCC), N,N'-diisopropylkarbo-diimid (DIC) eller annet karbodiimid, enten alene eller i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol (HOBt), O-acyl-ureaforbindelser, benzotriazol-l-yl-oksytris(pyrrolidino)fosfonium-heksafluor-fosfat (PyBop), N-hydroksysuccinimid, andre N-hydroksyimider eller oksimer. Alternativt kan det anvendes beskyttede amino-syreaktive estere (f.eks. p-nitrofenyl, pentafluorfenyl og lignende) eller symmetriske anhydrider.

Ved slutten av fastfasesyntesen fjernes det fullstendig beskyttede peptid fra harpiksen. Når bindingen til harpiksbæreren er av benzylestertypen, kan spalting utføres ved hjelp av aminolyse med et alkylamin eller fluoralkylamin for peptider med en alkylamid-C-ende, eller ved hjelp av aminolyse med f.eks. ammoniakk/metanol eller ammoniakk/etanol for peptider med en usubstituert amid-C-ende, ved en temperatur mellom ca. -10 og 50°C, fortrinnsvis ca. 25"C, i mellom ca. 12 og 24 timer, fortrinnsvis ca. 18 timer. Peptider med en hydroksy-C-ende kan spaltes ved hjelp av HF eller annen sterkt sur av-beskyttelsesbehandling eller ved forsåpning. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved transforestring, f.eks. med metanol, etterfulgt av aminolyse eller forsåpning. Det beskyttede peptid kan renses ved hjelp av silikagelkromatografi.

Sidekjedebeskyttelsesgruppene kan fjernes fra peptidet ved behandling av aminolyseproduktet med f.eks. vannfritt, flytende hydrogenfluorid i nærvær av anisol eller annen karboniumionfjerner, behandling med kompleks av hydrogenfluorid og pyridin, behandling med tris(trifluoracetyl)bor og trifluoreddiksyre, ved reduksjon med hydrogen og palladium-på-karbon eller polyvinylpyrrolidon, eller ved reduksjon med nat-rium i flytende ammoniakk, fortrinnsvis med flytende hydrogenfluorid og anisol ved en temperatur mellom ca. -10 og +10"C, fortrinnsvis ved ca. 0<8>C, i mellom ca. 15 minutter og 2 timer, fortrinnsvis ca. 1,5 time.

For peptider på benzhydrylaminharpiksen kan harpiks-avspaltings- og avbeskyttelsestrinnene kombineres i et enkelt trinn under benyttelse av flytende hydrogenfluorid og anisol som beskrevet ovenfor.

Oppløsningen kan avsaltes (f.eks. med "BioRad AG-3"

anionbytterharpiks) og peptidet renses ved hjelp av en rekke-følge av kromatografiske trinn under anvendelse av hvilken som helst av de følgende typer: ionebytting på en svakt basisk harpiks i acetatform; hydrofob adsorpsjonskromatografi på uderivatisert kopoly(styren-divinylbenzen), f.eks. "Amberlite" XAD; silikageladsorpsjonskromatografi; ionebytterkromatografi på karboksymetylcellulose; fordelingskromatografi, f.eks. på "Sephadex" G-25; motstrømsfordeling; eller væskekromatografi med høy yteevne (HPLC), spesielt reversfase-HPLC på oktyl-eller oktadecylsilylsilika(ODS)-bundet fasekolonnepakking.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører således fremgangsmåter for fremstilling av polypeptider og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor fremgangsmåtene omfatter sekvensvis kondensering av beskyttede aminosyrer på en egnet harpiksbærer, fjerning av beskyttelsesgruppene og harpiksbæreren, og rensing av produktet, hvorved man får analoger av de fysiologisk aktive, avkortede homologer og analoger av PTH og PTHrp, fortrinnsvis av PTH(l-34) og PTHrp(l-34), hvor aminosyrene i stillingene (22-31) danner en amfipatisk a-helisk peptidsekvens, som definert ovenfor.

Rekombinant syntese av polypeptidene

Alternativt kan pol<y>peptidene ifølge denne oppfinnelsen fremstilles ved kloning og ekspresjon av et gen som koder for det ønskede polypeptid. Med denne fremgangsmåten fremstilles et plasmid som inneholder den ønskede DNA-sekvens, og inn-føyes i en passende vertsmikroorganisme, vanligvis en bak-terie, slik som E. coli, eller en gjær, slik som Saccharomyces cerevislae, hvorved vertsmikroorganismen induseres til å produsere multippelkopier av plasmidet, og også av den cDNA som koder for polypeptidanalogene ifølge denne oppfinnelsen.

Først utformes et syntetisk gen som koder for den utvalgte PTH- eller PTHrp-analog, med passende restriksjonsen-zymspaltingsseter for å lette senere endringer. Polymerasekjedereaksjon (PCR) som beskrevet av Mullis i US patent-skrifter nr. 4 683 195 og 4 683 202, kan anvendes for å ampli-fisere sekvensen.

Det amplifiserte, syntetiske gen kan isoleres og ligeres til et egnet plasmid, slik som et Trp-LE-plasmid, hvori fire kopier av genet kan innføyes anbrakt etter hverandre. Fremstilling av Trp-LE-plasmider er beskrevet i US patentskrift nr. 4 738 921 og europeisk patentpublikasjon nr. 0212532. Trp-LE-plasmider produserer generelt 8-10 ganger mer protein enn Trp-E-plasmider. Multikopigenet kan så uttrykkes i en passende vert, slik som E. coli eller S. cerevisiae.

Den bestemte ekspresjonsvektor som her anvendes, var Trp-LE-18-Prot-(Ile<3>, Pro<5>) inneholdende de følgende elementer: et pBR322-fragment (EcoRI-BamHI) inneholdende ampicillinresis-tensgenet og plasmidopprinnelsesstedet for replikasjon; et EcoRI-SacII-fragment inneholdende trp-promoteren og trpE-genet; et HIV-protease (Ile<3>,Pro<5>)-genfragment (Sacll-Hindlll);

et bGRF-genfragment (Hindlll-BamHI); og en transkripsjonster-minator fra E. coli rpoc-gen. HIV-proteasen og bGRF-genfrag-mentene er ikke av avgjørende betydning og kan om ønsket erstattes av andre kodende sekvenser.

De uttrykte multimerfusjonsproteiner akkumulerer intracellulært i stabile inklusjonslegemer og kan skilles ved sentrifugering fra resten av det cellulære protein. Det isol-erte fusjonsprotein omdannes til den monomere PTH- eller PTHrp-analog og kan renses ved hjelp av kationbytter- og/eller reversfase-HPLC.

Alternative fremgangsmåter for kloning, amplifikasjon, ekspresjon og rensing vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken. Representative metoder er beskrevet i Maniatis et al-, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. utg-, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

Anvendelighet og administrering

Polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes til forhindring og behandling av mange forskjellige pattedyrtilstander manifestert ved tap av benmasse. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er særlig indikert for profylakse og terapeutisk behandling av osteoporose og osteopeni hos mennesker.

Generelt administreres polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen, eller saltene derav, i mengder mellom ca. 0,002 og 1 ug/kg kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis fra ca. 0,04 til ca. 0,2 ug/kg kroppsvekt pr. dag. For et 50 kg menneskeindivid av hunnkjønn er den daglige dose av aktiv bestanddel fra ca. 0,1 til ca. 50 ug, fortrinnsvis fra ca. 2,0 til ca. 10 ug. Hos andre pattedyr, slik som hester, hunder og kveg, kan det være påkrevet med høyere doser. Denne doseringen kan avleveres i et vanlig farmasøytisk preparat ved hjelp av en enkelt administrering, ved hjelp av multiple applikasjoner eller via kontrollert frigjørelse, alt etter hva som trengs for å oppnå de mest effektive resultater, fortrinnsvis én eller flere ganger daglig ved injeksjon.

Utvelgelsen av den nøyaktige dose og sammensetning, og den mest passende avleveringsfremgangsmåte vil blant annet være påvirket av de farmakologiske egenskapene til det utvalgte polypeptid, typen og alvorligheten av tilstanden som behandles, og mottakerens fysiske tilstand og mentale klarhet.

Representative avleveringsregimer omfatter oral, parenteral (inkludert subkutan, intramuskulær og intravenøs), rektal, bukkal (inkludert sublingual), pulmonar, transdermal og intranasal.

Farmasøytisk akseptable salter bibeholder den ønskede biologiske aktivitet til opphavspolypeptidet uten toksiske bivirkninger. Eksempler på slike salter er (a) syreaddisjons-salter dannet med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, hydro-bromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre og lignende; og salter dannet med organiske syrer, slik som f.eks. eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, glukon-syre, sitronsyre, eplesyre, askorbinsyre, benzosyre, garve-syre, embonsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftalensulfon-syrer, naftalendisulfonsyrer, polygalakturonsyre og lignende; (b) baseaddisjonssalter dannet med flerverdige metallkationer, slik som sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium og lignende; eller med et or-ganisk kation dannet av N,N'-dibenzyletylendiamin eller etyl-endiamin; eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt og lignende.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører farmasøytiske preparater som omfatter som en aktiv bestanddel et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i blanding med en far-masøytisk akseptabel, ikke-toksisk bærer. Som nevnt ovenfor, kan slike preparater fremstilles for parenteral (subkutan, intramuskulær eller intravenøs) administrering, fortrinnsvis i form av flytende oppløsninger eller suspensjoner; for oral eller bukkal administrering, særlig i form av tabletter eller kapsler; for pulmonar eller intranasal administrering, særlig i form av pulvere, nesedråper eller aerosoler; og for rektal eller transdermal administrering.

Preparatene kan passende administreres i endoseform og kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av de fremgangsmåter som er godt kjent innen den farmasøytiske teknikk, f.eks. som beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. utg., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Formuleringer for parenteral administrering kan som eksipienser inneholde sterilt vann eller fysiologisk saltvann, alkylengly-koler, slik som propylenglykol, polyalkylenglykoler, slik som polyetylenglykol, oljer av vegetabilsk opprinnelse, hydrogen-erte naftalener og lignende. For oral administrering kan for-muleringen forsterkes ved tilsetning av gallesalter eller acylkarnitiner. Formuleringer for nasal administrering kan være faste og kan inneholde eksipienser, f.eks. laktose eller dekstran, eller kan være vann- eller oljeoppløsninger for anvendelse i form av nesedråper eller utmålt spray. For bukkal administrering omfatter typiske eksipienser sukkere, kalsium-stearat, magnesiumstearat, forgelatinert stivelse og lignende.

Ved formulering for nasal administrering kan absorp-sjonen over neseslimhinnen forsterkes ved hjelp av overflate-aktive syrer, slik som f.eks. glykocholsyre, cholsyre, tauro-cholsyre, etocholsyre, deoksycholsyre, chenodeoksycholsyre, dehydrocholsyre, glykodeoksycholsyre, syklodekstriner og lignende, i en mengde i området mellom ca. 0,2 og 15 vekt%, fortrinnsvis mellom ca. 0,5 og 4 vekt%, helst ca. 2 vekt%.

Avlevering av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse til individet over langvarige tidsrom, f.eks. i tidsrom på én uke til ett år, kan utføres ved hjelp av en enkelt administrering av et system med regulert frigjørelse som inneholder tilstrekkelig aktiv bestanddel for den ønskede fri-gjørelsesperiode. Forskjellige systemer for kontrollert fri- gjørelse, slik som monolitt- eller reservoartype-mikrokapsler, depotlmplantater, osmotiske pumper, vesikler, miceller, lipo-somer, transdermale plastere, iontoforetiske anordninger og

alternative, injiserbare doseringsformer, kan benyttes for dette formål. Lokalisering på stedet hvor avlevering av den aktive bestanddel er ønsket, er et ytterligere trekk ved noen anordninger med kontrollert frigjørelse som kan vise seg gunstig ved behandlingen av visse sykdommer.

Én form av preparat med regulert frigjørelse inneholder polypeptidet eller dets salt dispergert eller inn-kapslet i en sakte nedbrytende, ikke-toksisk, ikke-antigen polymer, slik som kopoly(melke-/glykol-)syre, som beskrevet i pionérarbeidet til Kent, Lewis, Sanders og Tice, US patentskrift nr. 4 675 189. Forbindelsene eller fortrinnsvis deres relativt uoppløselige salter kan også formuleres i kolesterol eller andre 1ipidmatrikspelleter, eller silastomermatriks-implantater. Ytterligere formuleringer med sakte frigjørelse, depotimplantatformuleringer eller injiserbare formuleringer

vil være åpenbare for fagfolk. Se f.eks. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson red.,

Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, og R.W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987.

De følgende spesifikke eksempler er ment å illustrere 5 syntesen og testingen av representative forbindelser ifølge oppfinnelsen og bør ikke betraktes som begrensende for omfan-get av kravene. I eksemplene er "smp." smeltepunkt,<n>[a]D<25>" er den optiske aktivitet ved 25"C og den bestemte konsentrasjon i

det angitte oppløsningsmiddel, "FAB" er hurtig atombombarde-Q ment-massespektrometri, og "AAA" er aminosyreanalyse med de forventede verdier i parenteser etter de observerte verdier. Aminosyreanalysene ble utført på et Hewlett-Packard AminoQuant analyseapparat ved å følge produsentens anbefalte fremgangsmåter. Primære aminosyrer ble derivatisert med o-ftalaldehyd; 5 sekundære aminosyrer med Fmoc. Fluorescenspåvisning av de derivatiserte aminosyrer ble brukt for kvantifisering. De beskyttede aminosyrer ble erholdt fra Applied Biosystems Inc.

(Foster City, CA).

Eksempel I

Forbindelse 1 (sekvensidentitet nr.: 7) ble fremstilt på 0,5 mmol skala ved hjelp av fastfasemetoden på 4-metylbenz-hydrylaminharpiks under anvendelse av et automatisert Applied Biosystems modell 430A peptidsynteseapparat. a-aminogruppene ble beskyttet med t-butoksykarbonyl (Boe). Sidekjedebeskyttelsesgruppene var: benzyl (Bzl) for Asp, Glu og Ser; tosyl (Tos) for Arg; benzyloksymetyl (Bom) for His, og 2-klorbenzyl (Cl-z) for Lys. Aminosyrene ble koblet sekvensvis under anvendelse av N, N-disykloheksylkarbodiimid/l-hydroksybenzotriazol (DCC/HOBt) ved å følge Stewart og Young (supra). Etter hver aminosyrekob-ling ble peptidet acetylert under anvendelse av en blanding av eddiksyreanhydrid og diisopropyletylamin i N-metylpyrrolidon. Det fullstendige peptid ble spaltet fra harpiksen med samtidig avbeskyttelse av sidekjedebeskyttelsesgruppene under anvendelse av vannfritt HF (25 ml) i nærvær av anisol (2,5 ml) ved -10°C i 30 minutter, og ved 0°C i 60 minutter. Etter avdamping av HF under vakuum ble resten vasket med vannfri eter og rå-peptidet ekstrahert med 10% eddiksyre. Lyofilisering av 10% eddiksyreekstrakten ga 900 mg råprodukt. Peptidet ble renset ved ODS reversfasekolonnekromatografi ved middels trykk under anvendelse av en gradient på 22-45% CH3CN i 0,1% TFA. Produktet eluerte i tre fraksjoner som ble konsentrert og lyofilisert, hvorved man fikk 130 mg hvitt, fast stoff med >98% renhet.

Forbindelse 1:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA- NHT

( sekvensidentitet nr. : 7)

F<y>sikalske data: smp. 150-159°C [a]D<35>-34,88° (c 0,16, H20) F AB <Cl7SH300NS6051): [M+H]<+>4005,5

AAA: Asp, 1,9(2); Glu, 5,6(6); Ser, 1,6(2); His, 2,7(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,8(3);

Val, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,3(8); Lys, 4,0(4).

Likeledes ble forbindelsene 2, 5-18, 21-27, 29-36, 38-48, 50-54, 58-64 og 66-70 fremstilt ogkarakterisert, idet PAM-harpiks ble byttet ut etter behov for syntesen av hydrok-syterminale polypeptider.

Forbindelse 2:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA- OH

( sekvensidentitet nr. : 6)

Fysikalske data: smp. 154-170'C [o]D<25>-49,35° (c 0,46, H20) FAB (<C>175<H>301N57<0>50): [M+H]<*>4005,0

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 5,9(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3);

Gly, 1,1{1); Thr, 1,0(1); Ala, 1,9(2); Arg, 3,0(3);

Val, 1,2(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,8(8); Lys, 4,2(4).

Forbindelse 5:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA- OH

( sekvensidentitet nr. : 15)

F<y>sikalske data: smp. 147-165°C [a]0<2S>-49,17° (c 0,66, H20) FAB (C175H299<N>59<0>52): [M<+>H]<+>4061

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 5,0(5);

Val, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,7(8); Lys, 1,9(2).

Forbindelse 6:

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA- OH

fsekvensidentitet nr. : 16)

Fysikalske data: smp. 150-170'C [a]D<25>-48,65" (c 0,54, H20) FAB (C175H299N63052 ): [M+H]<+>4118,0

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,2(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 6,9(7);

Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,8(8).

Forbindelse 7:

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA- OH

( sekvensidentitet nr. : 17)

Fysikalske data: smp. 177-182<C>C [ct]D25 -46,17° (c 0,14, H20) FAB (C176<H>304N64050): [M+H]<+>4117

AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 4,8(5); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 6,7(7);

Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,7(8); Lys, 0,9(1).

Forbindelse 8:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA- OH

( sekvensidentitet nr. : 5)

F<y>sikalske data: smp. 147-165"C [a]D<25>-49,17° (c 0,66, H20) FAB (C176H305N5g049): [M+H]<+>4033,0

AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 4,8(5); Ser, 1,8(2); His, 2,7(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,9(4);

Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,9(8); Lys, 4,0(4).

Forbindelse 9:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR- OH

( sekvensidentitet nr. : 10)

F<y>sikalske data: smp. 158-160°C [a]D<25>-44,76" (c 0,1, H20) FAB (C189H326<N>M<0>5S): [M]<*>4375,0

AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 5,9(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3);

Gly, 2,3(2); Thr, 1,0(1); Ala, 1,9(2); Arg, 5,0(5);

Val, 1,2(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,8(8); Lys, 4,3(4).

Forbindelse 10:

AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL- OH

( sekvensidentitet nr. : 14)

F<y>sikalske data: smp. 170-175"C [a]D<25>-31,59° (c 0,54, H20) FAB (<C>174<H>300N52<0>51): [M+H]<+>3936,0

AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 6,0(6); Ser, 1,8(2); His, 2,0(2);

Gly, 1,2(1); Ala, 3,0(3); Arg, 2,8(3); Val, 1,1(1);

Ile, 1,0(1); Leu, 9,9(10); Lys, 3,0(3).

Forbindelse 11:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL- NH,

( sekvensidentitet nr. : 11)

F<y>sikalske data: smp. 172-174°C [a]D<25>-43,29° (c 0,2, H20) FAB (<C>179<H>311N55<0>52): [M+H]<+>4065,8

AAA: Asp, 2,2(2); Glu, 7,7(7); Ser, 1,7(2); His, 2,0(2);

Gly, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Val, 1,1(1);

Ile, 1,0(1); Leu, 9,3(9); Lys, 5,1(5).

Forbindelse 12:

AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY- NHT

( X=Nle. sekvensidentitet nr. : 23)

Fysikalske data: smp. 178°C [o]D<25>-36,88°C (c 0,4, H20) FAB (C1B2<H>2<g>sNso05l): [M+H]<+>4001,6

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,5(6); Ser, 2,7(3); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 1,0(1); Arg, 1,0(1); Tyr, 0,8(1);

Val, 2,0(2); Phe, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu+Nle, 8,5(7+2); Lys, 3,1(3).

Forbindelse 13:

AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY- NH7

( X=Nle. sekvensidentitet nr. : 24)

Fysikalske data: smp. 260°C [a]D<25>-37,02° (c 0,2, H20) FAB (C1M<H>304N56049): [M+H]<*>4084

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 5,5(5); Ser, 2,6(3); His, 3,1(3);

Ala, 1,0(1); Gly, 1,1(1); Arg, 3,2(3); Tyr, 1,0(1);

Val, 1,0(1); Phe, 1,0(1), Ile, 1,0(1); Leu, 9,0(9);

Lys, 3,0(3).

Forbindelse 14:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA- NH3

( sekvensidentitet nr. : 20)

F<y>sikalske data: smp. 190-225'C [a]D<25>-56,58° (c 0,36, H20) FAB (C161H272N540„): [M+H]<+>3747,0

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 4,9(5); Ser, 1,7(2); His, 2,6(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 7,6(7); Arg, 2,8(3);

Val, 1,2(1); Ile, 1,0(1); Leu, 6,6(6); Lys, 1,9(2).

Forbindelse 15:

AVSEHOLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA- NH7

( sekvensidentitet nr. : 12)

F<y>sikalske data: smp. 170-180°C [o]D<25>-48,19° (c 0,2, H20) FAB (<C>172<H>293N53<0>51): [M+H]<+>3919,0

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,7(2); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 3,0(3); Arg, 2,1(2);

Val, 1,1(1); He, 1,0(1); Leu, 8,0(8); Lys, 4,4(4).

Forbindelse 16:

AVSEHOLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 13)

F<y>sikalske data: smp. 190-195°C [a]D<25>-50,50° (c 0,4, H20) FAB (C172H293N„051): [M+H]<+>3919,0

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,0(6); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 3,0(3); Arg, 2,1(2);

Val, 1,1(1); Ile, 1,0(1), Leu, 7,5(8); Lys, 4,2(4).

Forbindelse 17: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA- NH- ;

( sekvensidentitet nr. : 21)

Fysikalske data: smp. 195-204°C [a]D<25>-67,11" (c 0,3, H20) FAB (<C>l63<H>280<N>54050): [M+H]<+>3796,0

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 2,9(3); Ser, 6,8(7); His, 3,1(3);

Gly, 1,2(1); Thr, 1,0(1);Ala, 2,0(2); Arg, 3,0(3);

Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Lys, 2,0(2).

Forbindelse 18:

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA- NH2

( sekvensidentitet nr. : 22)

Fysikalske data: smp. 200-207°C [a]D<25>-60,26° (c 0,6, H20) FAB (<C>174H284NS6050): [M+H]<+>3960,0

AAA: Asp, 2,9(3); Glu, 3,5(4); Ser, 1,4(2); His, 2,6(3);

Gly, 0,9(1); Thr, 1,0(1); Ala, 4,0(4); Arg, 3,0(3);

Tyr, 0,9(1); Val, 1,9(2); Phe, 1,1(1); Ile, 0,9(1);

Leu, 3,6(4); Lys, 4,1(4).

Forbindelse 21:

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH,

( sekvensidentitet nr. : 351

F<y>sikalske data: smp. 148-155'C [a]D<25>-45,97 (c 0,26, H20) FAB (C184H304N56049): [M+H]<+>4084

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,0(5); Ser, 2,7(3); His, 3,0(3);

Gly, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,1(3); Tyr, 0,9(1);

Val, 1,0(1); Phe, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu, 9,3(9);

Lys, 3,2(3).

Forbindelse 24:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL RELLEKLLEK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 38)

F<y>sikalske data: smp. 175-182°C [cc]D25 -49,99 (c 0,47, H20) FAB (C175H299N49<0>51)<:>[M+H]* 3906,5

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 6,5(6); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Val, 1,1(1);

Ile, 1,0(1); Leu, 9,1(9); Lys, 6,5(6).

Forbindelse 25:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 39)

Fysikalske data: smp. 136,5-153,5°C [a]D<25>-32,57 (c 0,13, H20) FAB (C175H300N60<0>51): [M+H]<+>4060,8

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,2(6); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 5,2(5);

Val, 1,1(1); Ile, 1,1(1); Leu, 8,4(8); Lys, 2,2(2).

Forbindelse 26:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP- OH

f sekvensidentitet nr. : 40)

F<y>sikalske data: smp. 125,8-127,2°C [a]D<25>-54,62 (c 0,23, H20) FAB (C180H306<N>60053): [M+H]<+>4158,0

AAA: Asx, 2,1(2); Glu, 6,2(6); Ser, 1,8(2); His, 2,9(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 5,1(5);

Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,0(8); Lys, 2,1(2);

Pro, 1,1(1).

Forbindelse 27:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR- OH

( sekvensidentitet nr. : 41)

F<y>sikalske data: smp. 106-137,3<8>C [a]D<25>-39,55 (c 0,67, H20) FAB (<C>189H326<N>68055): [M+H]* 4430,5

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,6(2); His, 2,7(3);

Gly, 2,2(2); Thr, 1,0(1); Ala, 1,8(2); Arg, 7,3(7);

Val, 0,8(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8); Lys, 2,1(2).

Forbindelse 29:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY- NH,

( sekvensidentitet nr. : 43)

Fysikalske data: smp. 160-172"C [a]B<2S>-49,85 (c 0,34, H20) FAB (<C>181<H>3M<N>56052): [M+H] + 4096,9

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 1,7(2); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,0(3);

Tyr, 0,9(1); Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,7(8);

Lys, 4,4(4).

Forbindelse 30:

AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH^

( sekvensidentitet nr. : 44)

Fysikalske data: smp. 130-171°C [ct]D25 -40,65 (c 0,34, H20) FAB (C178H297N„0„): [M+H] + 4039,4

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 1,8(2); His, 3,4(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 2,9(3);

Tyr, 0,8(1); Val, 1,0(1); Ile; 0,9(1), Leu, 7,9(8);

Lys, 3,4(3).

Forbindelse 31:

AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 45)

Leu His Thr Ala nh, C(sekvensidentitet nr.: 45)

Fysikalske data: smp. 140-160'C [a]D<25>-44,48 (c 0,25, H20) FAB (C^jH^<N>ssOsiSi): [M+H]* 3979

AAA: Asx+Cys, 3,0(2+1); Glx, 5,6(6); Ser, 1,7(2); His,

3,0(3); Gly, 1,0(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,5(3); Val, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lys, 3,3(3).

Forbindelse 32:

AVSEHQLLHD KGXSIODLRR RELLEKLLEK LHTA- NH7

( sekvensidentitet nr. : 46)

f X - Cvsf CH?CONH( CH?) 7NH( biotinvl)))

Fysikalske data: smp. (ikke bestemt) [<x]D<zs>(ikke bestemt) FAB (<C>186<H>3l6N„0MSz): [M+H]<*>4306,6

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,8(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3);

Val, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,3(3); Lys, 3,3(3).

Forbindelse 33:

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH7

( sekvensidentitet nr. : 47)

( X = Lys( 7- dimetylamino- 2- okso- 2H- l- benzopyran- 4- acetyl))

Fysikalske data: smp. 135-205°C [a]D<25>-26,92 (c 0,104, 50%

vandig HOAc)

FAB (C188<H>311N57054): [M+H]<+>4233

AAA: Asx, 1,9(2); Glx, 6,3(6); Ser, 1,7(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,2(3);

Val, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,2(8); Lys, 4,5(4).

Forbindelse 34:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG- OH

( sekvensidentitet nr. : 48)

F<y>sikalske data: smp. 92,1-146,6°C [a]D<25>-40,76 (c 0,34, H20) FAB (<C>177<H>302N56O53): [M+H]<+>4062,0

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,7(6); Ser, 1,8(2); His, 3,0(3);

Gly, 2,2(2); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,8(3);

Val, 1,2(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lys, 4,2(4).

Forbindelse 35:

AVSXjHQLLHX-, KGKSI0X7LRR RX1LLX, KLLX1 K LHA- OH

( sekvensidentitet nr. : 49)

( X1 o GlufOCH^ : X7= Asp( 0CH,))

F<y>sikalske data: smp. (ikke bestemt) [a]D<25>-21,96 (c 0,132,

H20)

FAB (<C>1B1<H>311<N>55052): [M+H]<+>4089,0

AAA:Asx, 2,1(2); Glx, 6,3(6); Ser, 1,8(2); His, 3,3(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3);

Val, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0(8); Lys, 4,2(4).

Forbindelse 36:

AVSX^ OLLHXt KGKSIQX, LRR RX, LLX1 KLLX1K LHA- OCH,

( sekvensidentitet nr. : 50)

( Xt = GlufOCH,) ; X7= Asp( 0CH,n

F<y>sikalske data: smp. (ikke bestemt) [a]D<25>-46,80 (c 0,07,

H20)

FAB (C182H313N55<0>52): [M+H]<+>4103

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 6,2(6); Ser, 1,4(2); His, 3,0(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,1(1); Ala, 1,7(2); Arg, 3,2(3);

Val, 0,6(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0(8); Lys, 4,1(4).

Forbindelse 38:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP- OH

( sekvensidentitet nr. : 52)

Fysikalske data: smp. 152,1-186,5°C [a]D<25>-55,91 (c 0,33, H20) FAB (<C>180<H>306N56OS3): [M+H]<+>4102,6

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,9(3);

Val, 1,2(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,7(8); Lys, 4,3(4).

Forbindelse 39:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP- OH

( sekvensidentitet nr. : 53)

F<y>sikalske data: smp. 120-148,2°C [a]D<25>-52,78 (c 0,14, H20) FAB (C177H301<N>550S2): [M+H]<+>4031,0

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 1,8(2); His, 2,9(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 2,9(3);

Val, 1,2(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lys, 3,6(3);

Pro, 0,9(1).

Forbindelse 40:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP- NH,

( sekvensidentitet nr. : 54)

F<y>sikalske data: smp. 133,9-155,1°C [a]D<25>-54,22 (c 0,37, H20) FAB (<C>177<H>302N56051): [M+H]<+>4030,7

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 1,9(2); His, 2,9(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 0,9(1); Arg, 2,8(3);

Val, 1,2(1); Ile, 1,1(1); Leu, 7,8(8); Lys, 4,2(4);

Pro, 0,9(1).

Forbindelse 41:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP- NH-,

( sekvensidentitet nr. : 55)

F<y>sikalske data: smp. 142,8-166,1°C [a]D<25>-53,80 (c 0,38, H20) FAB (<C>173<H>295N55049): [M+H]<*>3929

AAA:Asx, 2,0(2); Glx, 5,7(6); Ser, 1,8(2); His, 3,0(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 0,9(1); Arg, 2,8(3); Val, 1,2(1);

Ile, 0,9(1); Leu, 7,4(8); Lys, 4,4(4); Pro, 0,9(1).

Forbindelse 42:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP- NH?

( sekvensidentitet nr. : 56)

F<y>sikalske data: smp. 161,0-177,0°C [a]D<25>-61,97 (c 0,19, H20) FAB (<C>167H288N52048): [M+H]<+>3792,0

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,9(2); His, 2,1(2);

Gly, 1,1(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Val, 1,1(1);

Ile, 1,0(1); Leu, 7,9(8); Lys, 4,3(4); Pro, 0,9(1).

Forbindelse 43:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW- OH

( sekvensidentitet nr. : 57)

F<y>sikalske data: smp. 181-202'C [a]D<2S>-45,14 (c 0,19, H20) FAB (C195H326N62056): [M+H]* 4435,2

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,8(6); Ser, 2,8(3); His, 2,8(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 3,7(4);

Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lys, 4,3(4); Trp, 0,9(1).

Forbindelse 44:

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW- OH

( sekvensidentitet nr. : 58)

F<y>sikalske data: smp. 130-132,2°C [a]D<a5>-46,66 (c 0,195, H20) FAB (<C>216<H>365N81062): [M+H]<+>5088,8

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,0(6); Ser, 2,7(3); His, 3,0(3);

Gly, 2,2(2);Thr, 2,1(2); Ala, 3,0(3); Arg, 10,5(10);

Val, 0,9(1).; Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Trp 1,0(1).

Forbindelse 45:

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTÅGRRTRSAW- NH7

( sekvensidentitet nr. : 59)

F<y>sikalske data: smp. 158-174°C [a]D<zs>-43,57 (c 0,53, H20) FAB (C216<H>366<N>8206l): [M+H]<+>5087,4

AAA: Asx, 1,9(2); Glx, 5,6(6); Ser, 2,6(3); His, 3,3(3);

Gly, 2,1(2); Thr, 2,0(2); Ala, 2,9(3); Arg, 10,1(10);

Val, 0,9(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,3(8); Trp, 1,1(1).

Forbindelse 46:

AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW- OH

( sekvensidentitet nr. : 60)

Fysikalske data: smp. 165,4-175,2'C [a]D<25>-40,43 (c 0,20, H20) FAB (C225<H>374<N>80062): [M+H]<*>5191

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 6,3(6); Ser, 2,8(3); His, 3,2(3);

Gly, 2,1(2); Thr, 2,0(2); Ala, 3,2(3); Arg, 9,9(9);

Val, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,6(8); Lys, 1,1(1);

Trp, 1,1(1).

Forbindelse 47:

AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY- NH;

( sekvensidentitet nr. : 61)

(X » norleucin)

Fysikalske data: smp. 140-160°C [o]D<25>-56,88 (c 0,16, H20) FAB (C180H287NS5058): [M+H]<+>3989,8

AAA: Asx, 3,0(3); Glx, 2,9(3); Ser, 3,7(4); His, 2,8(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,0(2);

Tyr, 1,0(1); Val, 1,7(2); Phe, 0,9(1); Ile; 0,9(1), Leu+Nle, 5,8(2+4); Lys, 3,4(3); Trp, 1,1(1).

Forbindelse 48:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA- NH-,

( sekvensidentitet nr. : 62)

Fysikalske data: smp. 140-210°C [a]D<25>-47,75 (c 0,178, HaO) FAB (C^^O^): [M+Hr 4135,0

AAA: Asx, 2,3{2); Glx, 6,6(6); Ser, 1,4(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3);

Val, 0,9(1); Met, 1,1(1), Ile, 1,0(1); Leu, 8,8(8);

Lys, 4,4(4).

Forbindelse 50:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA- NH-,

( sekvensidentitet nr. : 64)

Fysikalske data: smp. 136,5-156,8°C [a]D<25>-49,89 (c 0,24, H20) FAB (C182H300N56<0>49): [M+H]<+>4056,0

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 5,0(5); Ser, 1,9(2); His, 3,3(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 3,1(3);

Val, 1,0(1); Phe, 2,0(2); Ile, 0,9(1); Leu, 7,2(7);

Lys, 3,5(4).

Forbindelse 51:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA- NH-,

( sekvensidentitet nr. : 65)

F<y>sikalske data: smp. 80,7-141,0'C [a]0<Z5>-55,38 (c 0,23, H20) FAB (C176H300N58O„): [M+H]<+>4012,8

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 4,9(5); Ser, 1,8(2); His, 4,3(4);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3);

Val, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8); Lys, 3,9(4).

Forbindelse 52:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 66)

F<y>sikalske data: smp. 134,3-157,9°C [a]D<25>-50,72 (c 0,45, H20) FAB (C175H295<N>57051): [M+H]<+>4012,8

AAA: Asx 2,1(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,8(2); His, 4,2(4);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,0(3);

Val, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,1(8); Lys, 3,1(3).

Forbindelse 53:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 67)

F<y>sikalske data: smp. 142,7-159,8<e>C [<x]D25 -54,01 (c 0,21, H20) FAB (C173H29BN560„): [M+H]<+>3946,0

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 4,9(5); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 3,1(3); Arg, 3,1(3);

Val, 1,0(1); Ile, 1,9(2); Leu, 7,0(7); Lys, 4,3(4).

Forbindelse 54:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 66)

Fysikalske data: smp. 138-185°C [a]D<25>-50,17 (c 0,14, H20) FAB (C174H295N550„): [M+H]<+>4005

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 7,1(7); Ser, 1,7(2); His, 2,8(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 3,1(3);

Val, 1,1(1); Ile, 1,7(2); Leu, 7,1(7); Lys, 2,7(3).

Forbindelse 58:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH,

( sekvensidentitet nr. : 72)

Fysikalske data: smp. 158-163°C [a]D<Z5>-46,06 (c 0,17, H20) FAB (C195H327N63<0>55): [M+H]<+>4434,8

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 2,7(3); His, 3,1(3);

Gly, 1,0(1); Ala, 1,8(2); Arg, 4,0(4); Thr, 0,9(1);

Val, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lys, 3,9(4);

Trp, 1,0(1).

Forbindelse 59:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX- OH

( sekvensidentitet nr. : 73)

( X = Nal( 2) = 3-( 2- naftvl)- L- alanln)

F<y>sikalske data: smp. 156-162'C [a]D<25>-44,44 (c 0,189, Hz0) FAB (C197H328<N>62<0>5S): [M+H]<+>4445,6

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,5(6); Ser, 2,8(3); His, 2,9(3);

Gly, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 4,0(4); Thr, 0,9(1);

Val, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lys, 4,2(4);

Nal, 1,1(1).

Forbindelse 60:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW- OH

( sekvensidentitet nr. : 74)

Fysikalske data: smp. 159-164'C [cc]D25 -50,94.(c 0,29, H20) FAB (C192H320N60<O>55): [M+H]<+>4349,0

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 2,7(3); His, 3,2(3);

Gly, 1,0(1); Ala, 3,1(3); Arg, 2,8(3); Thr, 1,0(1);

Val, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,6(8); Lys, 4,0(4);

Trp, 1,0(1).

Forbindelse 61:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA- OH

( sekvensidentitet nr. : 75)

F<y>sikalske data: smp. 155-210°C [a]D<25>-46,15 (c 0,12, H20) FAB (C195H334<N>620sa): [M+H]<+>4475,8

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,9(7); Ser, 1,7(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 3,1(3); Arg, 4,0(4); Thr, 0,9(1);

Val, 1,1(1); Ile, 1,9(2);Leu, 8,1(8); Lys, 4,1(4).

Forbindelse 62

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR- OH

( sekvensidentitet nr. : 76)

Fysikalske data: smp. 186-218'C [a]D<25>-52,73 (c 0,265, H20) FAB (C192H329N61057): [M+H]<+>4404,4

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 6,6(7); Ser, 1,9(2); His, 3,4(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,8(4); Thr, 1,0(1);

Val, 1,1(1); Ile, 1,7(2); Leu, 7,9(8); Lys, 4,0(4).

Forbindelse 63:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI- OH

( sekvensidentitet nr. : 77)

F<y>sikalske data: smp. 169-205<e>C [a]„" -50,78 (c 0,51, H20) FAB (C186<H>317<N>57056): [M+H]<+>4248,0

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,8(7); Ser, 1,8(2); His, 3,3(3);

Gly, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,0(3); Thr, 1,0(1);

Val, 1,0(1); Ile, 1,8(2); Leu, 7,8(8); Lys, 3,6(4).

Forbindelse 64:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE- OH

( sekvensidentitet nr. : 78)

F<y>sikalske data: smp. 199-205'C [a]D<25>-52,47 (c 0,41, H20) FAB (<C>180<H>306<N>56<0>55): [M+H]<+>4135,0

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 6,6(7); Ser, 1,9(2); His, 3,3(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 2,9(3); Thr, 1,0(1);

Val, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Lys, 3,8(4).

Forbindelse 66:

SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 80)

Fysikalske data: smp. 134,2°C [a]„<25>-48,12 (c 0,36, H20) FAB (C167H286N5t0„): [M+H]<+>3834,4

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,7(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3);

Gly, 1,0(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,0(1); Arg, 2,8(3);

Ile, 0,9(1); Leu, 7,4(8); Lys, 4,3(4).

Forbindelse 67:

LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH?

( sekvensidentitet nr. : 81)

F<y>sikalske data: smp. 128,5-184,5°C [o]D<25>-6,53 (c 0,69,

MeOH)

FAB (C148<H>259N47<Q>41): [M+H]<+>3353

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 4,1(4); Ser, 0,9(1); His, 2,1(2);

Gly, 1,0(1); Thr, 0,9(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3);

Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8); Lys, 4,2(4).

Forbindelse 68:

LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 82)

Fysikalske data: smp. 165-210°C [a]D<25>-36,05 (c 0,12, Ha0) FAB (<C>142<H>248N46<0>40): [M+H]<+>3239,0

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 3,9(4); Ser, 0,9(1); His, 1,9(2);

Gly, 1,0(1); Thr, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 2,9(3);

Ile, 0,9(1); Leu, 6,8(7); Lys, 4,2(4).

Forbindelse 69:

SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW- OH

( sekvensidentitet nr. : 83)

F<y>sikalske data: smp. 150-210<8>C [a]D<25>-18,0 (c 0,64, H20) FAB (C206H351N79<0>60): [M+H]* 4918,6

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,2(6); Ser, 2,8(3); His, 3,1(3);

Gly, 2,2(2); Thr, 2,2(2); Ala, 2,2(2); Arg, 10,4(10);

Ile, 1,0(1); Leu, 8,0(8); Trp, 1,1(1).

Forbindelse 70:

LLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW- OH

fsekvensidentitet nr. : 84)

Fysikalske data: smp. 150-210°C [a]D<25>-41,70 (c 0,36, H20) FAB (<C>189<H>324N72<0>52): [M+H]<+>4437,14

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 4,1(4); Ser, 1,9(2); His, 2,0(2);

Gly, 2,1(2); Thr, 2,0(2); Ala, 2,1(2); Arg, 9,7(10);

Ile, 0,9(1); Leu, 7,4(8).

Den sidekjedesykliserte analog (forbindelse 57) ble syntetisert som ovenfor, bortsett fra at N°-Boc-NE<->Fmoc-Lys og tf-Boc-N^-Fmoc-Asp ble plassert i henholdsvis stilling 13 og 17. Etter fullførelse av Boc-aminosyresyntesen ble harpiksen behandlet med 20% piperidin i DMF ved romtemperatur i 30 minutter. Harpiksen ble filtrert og vasket med DMF, MeOH og CH2C12. Harpiksen (1,1 g) ble oppslemmet i 10 ml DMF inneholdende 250 mg PyBOP. pH-verdien ble regulert til 8-9 med DIEA og harpiksen omrørt i 1 time. Harpiksen ble filtrert, vasket med DMF og CH2C12, og så på nytt oppslemmet i DMF. Koblingen ble gjentatt under anvendelse av 125 mg PyBOP. Harpiksen ble filtrert, vasket med DMF, MeOH og CH2C12og tørket. Harpiksen ble så behandlet med HF og peptidet renset som nevnt ovenfor.

Forbindelse 57:

I 1

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA- NH,

( sekvensidentitet nr. : 71)

F<y>sikalske data: smp. 142,5-163,5°C [a]D<25>-34,31 (c 0,17, H20) FAB (<C>17s<H>2g8<N>56050): [M+H]<+>3986,4

AAA: Asx, 1,9(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,0(3); Thr, 1,0(1);

Val, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0(8); Lys, 4,0(4).

Eksempel II

[Met<3*>, Ala35] forbindelse 1, AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRREL-LEK-LLEKLHTMA-NH2, ble fremstilt og renset ved å følge fremgangsmåtene ifølge eksempel I. Dette polypeptidet ble omdannet

til homoserinlaktonet på følgende måte. Det rensede peptid (160 mg) ble oppløst i 44% maursyre (4 ml). Denne oppløsningen ble slått sammen med en forblandet oppløsning av cyanbromid (700 mg) og fenol (1,6 mg) i 44% maursyre (4 ml) ved 0<8>C. Opp-løsningen ble omrørt ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur i 2 timer. Dannelsen av produktet ble overvåket ved hjelp av HPLC ("Vydac" C-18, 300 A, 4,6 x 250 mm), strømning på

1,2 ml/min, gradient 25-45% acetonitril i 0,1% TFA i løpet av 10 minutter. Omsetningen var fullstendig i løpet av 4 timer. Halvparten av prøven ble konsentrert og renset ved preparativ RP-HPLC ("Vydac" C-18, gradient 25-45% acetonitril i 0,1% TFA). Homoserinlaktonpeptidf r aksjonene ble slått sammen og lyofilisert, hvorved man fikk 28 mg hvitt, fast stoff med >95% renhet, forbindelse 4.

Forbindelse 4

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX

( X = hSerlac. sekvensidentitet nr. : 9)

F<y>sikalske data: smp. 138-142'C [a]D<25>-50,66° (c 0,1, H20) FAB (C176H299N55052): [M+H]<*>4017,61

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,0(3);

Thr, 1,1(1); Ala, 1,1(1); Arg, 2,7(3); Val, 1,0(1);

Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Lys, 3,8(4); Gly, 1,09(1);

hSer, 1,09(1).

Likeledes ble forbindelse 65 fremstilt i overensstemmelse med denne fremgangsmåten.

Forbindelse 65:

AVSEIQFX^ N KGKHLSSXjER VEWLRKKLQD VHNX,

fsekvensidentitet nr. : 79)

fX t = L- norleucin: X2■ = homoserinlakton)

F<y>sikalske data: smp. 166-176"C [a]D<25>-52,22 (c 0,25, H20) FAB (C180HZB8NS4<0>50): [M+H]<+>4008,6

AAA: Asx, 3,1(3); Glx, 4,8(5); Ser, 2,9(3); His, 2,9(3);

Gly, 1,1(1); Ala, 1,1(1); Arg, 2,0(2); Val, 2,7(3);

Phe, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu+Nle 5,9(4+2); Lys, 2,8(3).

Eksempel III

For å fremstille homoserinamidet ble den urensede hSerlakton-analog, forbindelse 4, konsentrert og behandlet med 25 ml mettet NH3i metanol. Oppløsningen ble omrørt ved 0°C i 2 timer og ved romtemperatur i 16 timer. Reaksjonen ble overvåket ved hjelp av HPLC ("Vydac" C-18, 300 A, 4,6 x 250 mm, gjennomstrømning på 1,2 ml/min, gradient 20-45% acetonitril i 0,1% TFA) og var fullstendig i løpet av 18 timer. Oppløsningen ble konsentrert og renset ved preparativ RP-HPLC ("Vydac" C-18, gradient på 25-45% acetonitril i 0,1% TFA). Homoserinamid-peptidfraksjonene ble slått sammen og lyofilisert, hvorved man fikk 30 mg hvitt, fast stoff med >98% renhet, forbindelse 3.

Forbindelse 3

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX- NH-,

( X = hSer. sekvensidentitet nr. : 8)

F<y>sikalske data: smp. 138-142'C [a]D<25>-45,97<*>(c 0,25, H20) FAB <C176H30JNS6052): [M+H]<+>4033,9

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,6(2); His, 2,8(3);

Gly, 0,97(1); hSer, 0,97(1); Thr, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 2,9(3); Val, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,6(8); Lys, 3,9(4).

Likeledes ble forbindelsene 22, 23 og 28 fremstilt ved å følge denne fremgangsmåten.

Forbindelse 22:

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH,

( sekvensidentitet nr. : 36) ( X°homoserin)

Fysikalske data: smp. 69,4-128"C [a]D<2S>-43,93. (c 0,15, H20) FAB (C179H302N560„): [M+H]<*>4022,9

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 4,9(5); Ser, 2,6(3); His, 2,8(3);

Gly, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Val, 1,0(1);

Phe, 1,0(1); Ile, 0,9(1);Leu, 8,8(9); Lys, 3,4(3).

Forbindelse 23:

AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX- NH,

( sekvensidentitet nr. : 37) ( X => homoserin)

Fysikalske data: smp. 87,1-142,l'C [a]D<25>-52,14 (c 0,41, H20) FAB (Cl79H303<N>57049): [M+H]<*>4038

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 4,9(5); Ser, 2,7(3); His, 2,8(3);

Gly, 1,0(1); hSer, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3);

Val, 1,1(1); Phe, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,9(8);

Lys, 3,7(4).

Forbindelse 28:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH,

f sekvensidentitet nr. : 42) ( X = homoserin)

F<y>sikalske data: smp. 80°C [a]D<25>-48,64 (c 0,09, H20)

FAB (C193H334<N>70056): [M+H]<*>4530,0

AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,1(6); Ser, 1,7(2); His, 3,0(3);

Gly, 1,9(2); hSer, 1,0(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,1(2);

Arg, 7,2(7); Val, 0,8(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,4(8);

Lys, 2,1(2).

Homoserinalkylamidene ble likeledes fremstilt fra homoserinlaktonet ved å oppløse det i DMF inneholdende et overskudd av det tilsvarende alkylamin. Etter omrøring ved romtemperatur i flere dager (reaksjonen ble overvåket ved analytisk HPLC) ble blandingen inndampet til tørrhet og peptidet renset ved preparativ HPLC. Representative homoserinalkyl-amider er forbindelsene 55 og 56.

Forbindelse 55:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX- NHCHXH,

fsekvensidentitet nr. : 69) ( X = homoserin)

Fysikalske data: smp. (ikke bestemt) [a]„<25>(ikke bestemt) FAB (C1V8H306<N>56<O>52): [M<+>H]<+>4063,0

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,8(6); Ser, 1,7(2); His, 3,1(3);

Gly, 0,9(1); Thr, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,0(3);

Val, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,4(8); Lys, 3,7(4);

hSer, 0,9(1).

Forbindelse 56:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX- NHCH7CHTCffH«

( sekvensidentitet nr. : 70) ( X = homoserin)

F<y>sikalske data: smp. (ikke bestemt) [a]D<25>(ikke bestemt) FAB (C1M<H>310N56052): [M+H]<+>4138,8

AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3);

Gly, 0,9(1); Thr, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,0(3);

Val, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0(8); Lys, 4,1(4);

hSer, 0,9(1).

Eksempel IV

Cesiumsaltet av Na-Boc-NT-Fmoc-L-2, 4-dlaminosmørsyre ble festet til Merrifield-harpiks (DMF, 50°C, 48 t) og brukt i en fastfasesyntese i stedet for Boc-Ala-harpiksen som i eksempel I. Etter fullførelse av syntesen ble peptidet behandlet med 20% piperidin i DMFved romtemperatur i 30 minutter for å fjerne sidekjedebeskyttelsesgruppen FMOC. Det beskyttede peptid sykliserte spontant til laktamet, hvorved det avspaltet seg selv fra harpiksen. Oppløsningen ble filtrert fra harpiksen og inndampet under vakuum, hvorved man fikk en olje. Resten ble behandlet med flytende HF som i eksempel I, hvorved man fikk det urensede, ubeskyttede peptid. Peptidet ble behandlet og renset som i eksempel I.

Forbindelse 49:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX

( sekvensidentitet nr. : 63) ( X = L- 2. 4- diaminobutyryllaktam)

F<y>sikalske data: smp. 161-181'C [o]D" -48,38 (c 0,25, H20) FAB (C176H300N56<O>51): [M+H]<+>4016,8

AAA: Asx, 2,1{2); Glx, 6,3(6); Ser, 1,7(2); His, 3,3(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 2,9(3);

Val, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0(8); Lys, 3,8(4).

Eksempel V

En vandig oppløsning av homoserinlaktonanalogen fra eksempel II ble behandlet med porcin leveresterase (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Hydrolysen av laktonet til det C-terminale homoserin ble overvåket ved analytisk HPLC. Etter at hydrolysen var bedømt til å være fullstendig, ble materialet renset ved hjelp av preparativ HPLC som i eksempel

I.

Forbindelse 37:

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX- OH

( sekvensidentitet nr. : 51) ( X = homoserin)

F<y>sikalske data: smp. (ikke bestemt) [oc]D<25>(ikke bestemt) FAB (<C>176<H>301<N>55053): [M+H]<+>4035,1

AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,9(6); Ser, 2,0(2); His, 3,1(3);

Gly, 0,8(1); hSer,'0,8(1); Thr, 1,0(1); Ala, 1,0(1);

Arg, 3,0(3); Val, 1,3(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8);

Lys, 3,8(4).

Eksempel VI

Ved å følge eksempel I ble den beskyttede peptidhar-piks BocAVS(Bzl)E(OBz)H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD-(OBz)LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLe(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T-(Bzl)A- 0-PAM syntetisert i en 0,35 mmol skala. Alle Na-grupper ble beskyttet med t-butoksykarbonyl (Boe); sidekjedebeskyttelsesgrupper var som angitt. Etter fullførelse av syntesen ble peptidharpiksen behandlet med 50 ml 20% piperidin i dimetylformamid (DMF) ved romtemperatur i 30 minutter for å fjerne beskyttelsesgruppen fluorenylmetoksykarbonyl) (Fmoc) på lysin. Harpiksen ble vasket suksessivt med DMF, MeOH, CH2C13og tørket, hvorved man fikk 1,6 g delvis beskyttet peptid. 0,8 g (0,175 mmol) av det delvis beskyttede peptid ble acylert på lysin med 0,44 g (0,3 mmol) metoksydi(etylenoksy)eddiksyre [PE6(2)CHZC00H] i nærvær av 0,16 g (0,3 mmol) benzotriazolylok-sy-tris(pyrrolidino)fosfoniumheksafluorfosfat (PyBop) og 0,067 g (0,525 mmol) diisopropyletylamin (DIEA) i 20 ml DMF ved romtemperatur i 5 timer. Etter 5 timer ble harpiksen filtrert og vasket suksessivt med DMF, MeOH og CH2C12. Acylerings-trinnet ble gjentatt to ganger inntil det ble oppnådd negativt ninhydrinresultat på harpiksen. Sluttpeptidet ble avspaltet fra harpiksen med fjerning av sidekjedebeskyttelsesgruppene og rensing som i eksempel I; det ble erholdt 100 mg av forbindelse 19.

Forbindelse 19

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA- OH

( sekvensidentitet nr. : 18)

CHjO (CHiCHjO)jCH,C=0

Fysikalske data: smp. 145-195'C [a]D<25>-44,60° (c 0,2, H20) FAB (C183<H>316N64<0>54): [M+H]<+>4276,2

AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 5,0(5); Ser, 1,6(2); His, 2,9(3);

Gly, 0,9(1); Thr, 1,9(2); Arg, 7,1(7); Val, 1,1(1);

Ile, 1,0(1); Leu, 8,0(8); Lys, 0,9(1).

Eksempel VII

Peptid ble syntetisert, spaltet og renset på samme måte som i eksempel IV, bortsett fra at 2-metoksypoly(etylen-oksy )eddiksyre [PEG(5000)CH2C02H] ble brukt som acyleringsmid-del. 0,8 g (0,175 mmol) av det delvis beskyttede peptid ga 300 mg ren forbindelse 20.

Forbindelse 20

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA- OH

fsekvensidentitet nr. : 19)

CH,0 (CH,CH:0) „0CH3C=0

F<y>sikalske data: smp. 105°C [a]D<25>-22,95° (c 0,11,

50% vandig HOAc)

AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 4,8(5); Ser, 1,6(2); His, 2,6(3);

Gly, 1,1(1); Thr, 1,1(1); Arg, 7,3(7); Val, 0,8(1);

Ile, 0,9(1); Leu, 8,3(8); Lys, 1,1(1); Ala, 1,8(2).

Eksempel VIII

Syntese av hPTHrp( l- 34)- analoaaen

Et syntetisk gen som koder for hPTHrp(l-34)-analogen, forbindelse 4 (sekvensidentitet nr.: 9), ble utformet med nuk-leotidsekvensen og enzymrestriksjonssetene som er vist i figur 1. De påkrevde oligodeoksynukleotider ble fremstilt med et DNA-synteseapparat (Milligen/Biosearch) under anvendelse av fosforamidittfremgangsmåten til Sinha et al., Nucleic Acid Research 12, 4539-4557 (1984). Etter avbeskyttelse ble råoligonukleotidene renset ved gelelektroforese på preparative 15% polyakrylamidgeler. Oligonukleotidene ble lokalisert med UV, fjernet fra gelen, avsaltet over Waters C18 "Sep-pak"-patroner og lyofilisert.

Ampi1fikasjon via polymerasekjedereaksjon (PCR) ble utført på et Perkin-Elmer Cetus varmesykliseringsapparat med 25 sykluser å: 94°C i 1 minutt, 50°C i 2 minutter og 72°C i 3 minutter, under anvendelse av reagenser, inkludert Taq-poly-merase, fra "GeneAmp" DNA-amplifikasjonssettet (Perkin-Elmer Cetus).

To overlappende oligonukleotider, en 88-mer (2 ug), PTH3, (sekvensidentitet nr.: 31):

ble fremstilt som templat-DNA-sekvensen for hPTHrp(1-34)-analoggenet. Ved å benytte de to flankerende primere, PTHPCR1: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG (sekvensidentitet nr.: 33) og PTHPCR2: CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC (sekvensidentitet nr.: 34), ble hele genet amplifisert ved hjelp av PCR. De amplifiserte DNA-produkter ble renset ved gelelektroforese på 4% "NuSieve" agarosegel. Båndet som inneholder det syntetiske hPTHrp(l-34)-analoggen, omtrent 150 baser langt, ble fjernet fra gelen og omtrent 200 ng DNA isolert ved hjelp av "Elu-Quik" glassgel-DNA-ekstraksjon (Schleicher & Schuell, Keene,

NH).

Eksempel IX

Molekylær kloning av et hPTHrp( 1- 34U- analoggen

For å subklone hPTHrp(l-34)-analoggenet ifølge eksempel VI ble 200 ng av den amplifiserte DNA isolert og kuttet ved hjelp av restriksjonsenzymene Hind III og Sac II. Som vist i figur 2, ble DNA ligert til 2 ug TrpLE 18 Prot (Ile3, Pro5)-plasmid som på forhånd var spaltet med Hind III og Sac II.

Det resulterende plasmid, TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1, som inneholder én kopi av hPTHrp(l-34)-analoggenet, ble så trans-formert inn i kompetente E. coli HB 101-celler (CLONTECH, Palo Alto, CA). Transformanter ble underkastet PCR-analyse for å verifisere innføyelse. Transformerte cellekolonier ble utvalgt og kokt i 200 ul vann i 5 minutter; 2 ul ble underkastetPCRmed to primere som flankerte innføyelsen. PCR-produktet ble så analysert på 1% agarosegel for å bekrefte tilstedeværelsen av én kopl av hPTHrp(1-34)-gen±nn£øyelsen. TrpLE 18 hPTHrp(l-34)1-konstruksjonen ble så verifisert ved hjelp av DNA-sekvensering på et automatisert DNA-sekvenseringsapparat (Applied Biosystems modell 373A, Foster City, CA) under anvendelse av leverandørens "Dye Deoxy Terminator" sekvenserings-sett.

Eksempel X

Konstruksjon av en Trp LE 18- vekt or som inneholder multiple kopier av hPTHrp( 1- 34)- analogqenet

Unike Nhe I- og Xba I-restriksjonsseter befinner seg nær begynnelsen av og slutten på hPTHrp(1-34)-analoggensekven-sen. Disse to setene som gjenkjenner forskjellige sekvenser, men som gir identiske enkelttrådkohesive ender, muliggjør konstruksjonen av multippelkopi-hPTHrp(1-34)-genene innenfor Trp LE 18-vektoren.

Strategien for konstruksjon av gjentatte hPTHrp(1-34)-sekvenser etter hverandre er skissert i figur 5. I separ-ate reaksjoner ble 5 ug plasmid-Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1 som inneholder en enkeltkopi av genet, spaltet med Bam HI + Nhe I og Xba I + Bam HI. Fra hver fordøyelse ble ca. 300 ng av frag-mentet som inneholder hPTHrp(l-34)-analoggenet, isolert. Disse to fragmentene ble blandet og ligert, hvorved Trp LE 18 hPTHrp(l-34)2-plasmidet ble dannet. Dette plasmid ble brukt til å transformere kompetente E. coli HB 101-celler. størrel-sessortering av de transformerte PCR-produkter på 1% agarosegel ble brukt for å bestemme tilstedeværelsen av to kopier av hPTH(l-34)-geninnføyelsen. TrpLE 18 hPTHrp(l-34)2 inneholdende to kopier av genet, ble så bekreftet ved hjelp av DNA-sekvens-ering. Den korrekte fusjon av de to hPTHrp(1-34)-genene resulterer i elimineringen av Nhe I- og Xba I-seter i sammenknyt-ningspunktet. Dette gjør de gjenværende Xba I- og Nhe I-setene som flankerer tandemgenene, unike.

Ved å gjenta denne fremgangsmåten ble sluttplasmidet Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 som inneholder fire kopier av hPTHrp(1-34)-genet, konstruert, som vist i figur 4. Sekvensen til Trp LE 18 hPTHrpt1-34)4 ble funnet å være korrekt ved hjelp av DNA-sekvensanalyse.

Eksempel XI

Ekspresjon og rensing av Trp LE 18 hPTHrpf1- 34) 4

Induksjon av Trp LE 18 hPTHrp( 1- 34) 4

En starterkultur av 50 ml LB-dyrkningsmedlum, J.H. 3 Miller, "Experiments in Molecular Genetics", s. 431 (1972), inneholdende 50 ug/ml ampicillin og 100 rø/ml tryptofan, ble inokulert med E. coli-celler inneholdende Trp LE 18 hPTHrp(l-34)4-plasmid, og dyrket over natten ved 37"C med kraftig risting inntil en Asso-verdi på ca. 6. To liter av LB-dyrknings-J mediet for produksjon ble forvarmet til 37°C og inokulert med 20 ml av starterkulturen, hvorved man fikk en A550-verdi på ca.

0,06. Kulturen ble så dyrket med kraftig risting inntil en AS50-verdi på mellom 0,6 og 0,8, hvoretter 2 ml av en 10 mg/ml

oppløsning av indolakrylsyre (IAA) ble tilsatt. Dyrking ble s fortsatt med god lufting i ca. 16 timer inntil en slutt-A550-verdi på ca. 6 (vanligvis mellom 4 og 10). Cellene ble konsentrert ved sentrifugering og på nytt oppslemmet i 500 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA-bufferoppløsning (Tris-buffer).

Suspensjonen ble sonikert under anvendelse av en Heat<0>Systems-Ultrasonics, Inc. modell 220F sonikator (utstyrt med en 1,9 cm trakt) drevet ved 50% av full kapasitet for å unngå overoppvarming.

For å bestemme induksjonsomfanget ble de hele cellene analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Genproduktene avledet fra Trp<5>LE 18 hPTHrp(1-34)4-konstruksjonen, ble sett som et hovedbånd av den forutsagte molekylvekt på omtrent 17.000. Dette utgjør så mye som 10% av det totale cellulære protein.

Isolering av fusjonsproteinet

<0>Cellelysatet ble sentrifugert i 15 minutter ved ca.

3600 x g for å pelletere Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4-fusjonsproteinet; supernatanten ble kastet. Pelleten ble på nytt oppslemmet i 200 ml Tris-buffer (vanligvis 40-80 A^/ml).

5 Eksempel XII

Bearbeiding av fusjonsproteinet og rensing av homo- Serlakton-hPTHrp( 1- 34)- peptid

Avspalting av metioninrestene som flankerer det mul- timere fusjonsprotein hPTHrp(1-34) med CNBr, frigjør det ønskede homo-Serlakton-hPTHrp(1-34)-polypeptid som ble renset som beskrevet ovenfor.

CNBr- behandlina av fusjonsprotein

Den vaskede pellet av TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4-fusjonsprotein ble på nytt oppslemmet ved forsiktig omrøring i 60 ml 70% maursyre (ca. 20 mg/ml totalprotein; vanligvis opp-løses materiale fra 1000 A550-enheter av celler i 3 ml). Noen få dråper oktanol ble tilsatt og N2boblet gjennom oppløsningen i 20 minutter før tilsetning av 5,5 g CNBr. Denne reaksjonen fikk forløpe i 6 timer ved 25°C før et likt volum av 50:50 Me0H:H20 ble blandet med prøven og deretter fjernet ved rota-sjonsinndamping. Etter 2 til 4 repetisjoner av denne fremgangsmåten ble hovedmassen av maursyren og CNBr i det vesentlige fjernet. Prøven ble så inndampet til tørrhet, på nytt oppløst i 200 ml vann og lyofilisert for lagring.

Rensing av homo- Serlakton- hPTHrp( 1- 34)

Den CNBr-spaltede supernatant ble dialysert mot 50 mM ^2^4, pH 6,5, i 24 timer med flere skiftninger. Under dialyse ble pH holdt ved 6,5. Etter dialyse ble utfellingene fjernet ved høyhastighetssentrifugering. Supernatanten ble klaret gjennom en Gelman 0,45 um filteranordning ("Acrodisc 4184").

Kat i onbvtterkromatogra f i

Innledende rensing ble utført ved hjelp av kationbyt-terkromatografi på en "Bio-Gel TSK-SP-5PW" HPLC-kolonne (21,5 x 150 mm). Kromatografiske betingelser for en strømningshas-tighet på 8 ml/min og et utbytte på omtrent 12 mg høyrenset homo-Serlakton-hPTHrp( 1-34)-peptid var:

1. Kolonneekvilibrering i 50 mM KH2P04, pH 6,5.

2. Påfyll 10 ml klaret supernatant (omtrent 1,5 1 dyrkningsvæske eller 2,4 g inklusjon). 3. Vask kolonnen med 50 mM KH2P04, pH 6,5, inneholdende 50 mM NaCl inntil grunnlinjen er stabilis-ert. 4. Eluer kolonnen med 50 mM KH2P04, pH 6,5, inneholdende 90 mM NaCl. Samle opp fraksjoner i ca.

45 minutter.

5. Analyser 90 mM NaCl-fraksjonene med hensyn på homo-Serlakton-hPTHrp(1-34)-innhold ved hjelp av C18-HPLC før sammenslåing og lagring.

Reversfase- HPLC- kromatoqrafi

En reversfase "Poros" R/M 4,6 x 100 mm kolonne (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) ble brukt for sluttren-singstrinnet. De kromatografiske betingelsene var som følger:

Mobil fase A: 0,1% trifluoreddiksyre (TFA)/vann

B: 0,1% trifluoreddiksyre (TFA)/CH3CN

Retensjonstid for homo-Serlaktonet hPTHrp(1-34), forbindelse 4, var omtrent 2,943 minutter. Det rensede peptid var omtrent 98% rent slik det ble bestemt ved hjelp av massespek-troskopi.

Eksempel XIII

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen ble evaluert med hensyn på deres effekt på benmasse hos ovarieektomiserte rotter, generelt i overensstemmelse med fremgangsmåtene ifølge Gunness-Hey and Hock, Metab. Bone Dis. 5:177 181 (1984).

Voksne Sprague-Dawley hunnrotter ble akklimatisert, vektgruppert (n = 9, 10 eller 12) og underkastet tosidig ovarieektomi (OVX) eller imitasjonskirurgi. Dosering ble star-tet opp 17 dager etter kirurgi og fortsatt i 20 dager. Test- forbindelse ble administrert subkutant én gang pr. dag i 2% rotteserum/fysiologisk saltvann som bærer.

Etter 20 dagers dosering ble rottene avlivet og de høyre lårben tatt ut. Lårbena ble kuttet i to, og den nedre halvdel av lårbena (DHF) ble videre delt opp i trabekulært ben (TB) og kortikalt ben (CB) ved å bore ut trabeklene. Kalsium ble ekstrahert og målt ved hjelp av "Calcette" kalsiumanalyse-apparat og uttrykt som gjennomsnittlig ben-Ca i mg/DHF/100 g kroppsvekt.

Den to-prøvers t-test ble brukt for å sammenligne OVX og blindgrupper. Énveis ANOVA ble brukt til å sammenligne OVX-grupper, etterfulgt av Fishers LSD multippelsammenligning for å sammenligne hver behandlingsgruppe med bærer.

Ovarieektomi induserte i det vesentlige totalt bentap, primært fra trabekulært ben. Totalt benkalsium var 47-54% lavere enn for blindopererte kontroller.

bPTH(l-34) og hPTHrp(l-34) ved 80 ug/kg/dag ga stat-istisk signifikante økninger i totalt benkalsium for behand-lede OVX-rotter, varierende fra henholdsvis 53-95% og 18-40%; det var imidlertid ingen signifikant økning i kortikalt benkalsium.

Forbindelser ifølge denne oppfinnelsen, dosert ved 80 ug/kg/dag, økte totalt benkalsium med fra 66 til 138% og trabekulært kalsium med fra 87 til 128%. Kortikalt benkalsium, trabekulær tykkelse og benvolum ble også signifikant forøkt sammenlignet med ubehandlede OVX-kontroller.

Ved denne analysen ble de følgende forbindelser tes-tet:

Ved lignende undersøkelser ble ovarieektomiserte rotter dosert i 5, 10 og 20 dager ved 40 ug/kg/dag med de følg-ende resultater:

Eksempel XIV

Toksisitet

I eksempel XI ovenfor ble det ikke observert noen toksiske effekter med forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

Claims (12)

1. Syntetisk polypeptidanalog av paratyreoidhormon (PTH), paratyreoidhormonrelatert peptid (PTHrp) eller et salt derav,karakterisert vedat aminosyrerestene (22-31) i PTH eller PTHrp er modifisert slik at de danner en amfipatisk ct-heliks, hvor sekvensen til restene (22-31) er valgt fra:

Xaa<22>og Xaa<2S>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa<28>og Xaa<31>uavhengig av hverandre er Leu eller Ile; Xaa<29>er Ala, Arg eller Glu; og Xaa<30>er Lys eller Glu (sekvensidentitet nr. :

85) ; idet i en forbindelse hvor Xaa<22>er Phe; Xaa<23>er Phe; Xaa<25>er His; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa<28>er Ile; Xaa<29>er Ala; og Xaa30 er Glu; er Xaa31Leu;

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<29>er Glu, Lys eller Lys (COCH2PEGX) og PEGX er et poly- (etylenglykolmetyleter) - radikal med molekylvekt 100 til 10.000 (sekvensidentitet nr.:

86) ;

2. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat det har formelen:

Xaa er Glu eller Arg (sekvensidentitet nr.: 26).

3. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat det har formelen:

Xaa er Glu, Lys eller Lys (COCH2PEGX) og PEGX er et poly-(etylenglykolmetyleter)radikal med molekylvekt 100 til 10.000 (sekvensidentitet nr.: 27) .

4. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert vedat det har formelen: Xaa<1>Xaa2 Xaa3 Xaa<4>Xaa<5>Xaa6 Xaa7 Leu His Xaa10Xaa11 Gly Xaa<13>Ser Ile Gin Xaa<17>Leu Xaa" Xaa<20>Xaa<21>Xaa<22-31>Xaa<32>Xaa<33>Xaa<34>Xaa<35>Xaa<36>Xaa<37>Xaa<38>Term, hvor: Xaa<1>er fraværende eller er Ala; Xaa2 er fraværende eller er Val; Xaa3 er fraværende eller er Ser; Xaa<4>er fraværende eller er Glu eller Glu(0CH3); Xaa<5>er fraværende eller er His eller Ala; Xaa6 er fraværende eller er Gin; Xaa<7>er fraværende eller er Leu,- Xaa<10>og Xaa<17>uavhengig av hverandre er Asp eller Asp(0CH3); Xaa<11>er Lys, Arg eller Leu; Xaa<13>er Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, Cys (CH2C0NH (CH2) 2NH (biotinyl)) , Lys(7-dimetylamino-2-okso-2H-l-benzopyran-4-acetyl) eller Ly s (d i hydro c i nnamoy 1) Xaa<20>er Arg eller Leu; Xaa<19>og Xaa<2X>uavhengig av hverandre er Lys, Ala eller Arg; Xaa<22>"<31>er valgt fra sekvensene ifølge krav 1; Xaa<32>er His, Pro eller Lys; Xaa<33>er fraværende eller er Pro, Thr, Glu eller Ala; Xaa<34>er fraværende eller er Pro, Arg, Met, Ala, hSer, hSerlakton, Tyr, Leu eller 1,4-diaminobutyryllaktam; Xaa<35>er fraværende eller er Pro, Glu, Ser, Ala eller Gly; Xaa<36>er fraværende eller er Ala, Arg eller Ile; Xaa<37>er fraværende eller er Arg, Trp eller 3-(2-naftyl)-L-alanin; Xaa<38>er fraværende eller er Ala eller hSer, eller Xaa<38>"<42>er Thr Arg Ser Ala Trp; og Term er OR eller NR2hvor hver R uavhengig av hverandre er H, (Ci-C4) alkyl eller fenyl (C1-C4) alkyl ; og farmasøytisk akseptable salter derav.

5. Polypeptid ifølge krav 4, karakterisert vedat Xaa<22>"<31>er sekvensen ifølge krav la), og hvor Xaa<11>og Xaa<13>begge er Lys, og Xaa19 ogXaa<21>begge er Arg.

6. Polypeptid ifølge krav 5, karakterisert vedat det er:

7. Polypeptid ifølge krav 5,karakterisert vedat det er:

8. Polypeptid ifølge krav 5,karakterisert vedat det er:

9. Polypeptid ifølge krav 5,karakterisert vedat det er:

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter en effektiv benmasseøkende mengde av et polypeptid ifølge kravene 1-9 eller et salt derav, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer.

11. Fremgangsmåte for fastfasesyntese av en syntetisk polypeptidanalog av paratyreoidhormon (PTH) , paratyreoidhormonrelatert peptid (PTHrp) eller et salt derav, hvor aminosyrerestene (22-31) i PTH eller PTHrp er modifisert slik at de danner en amfipatisk a-heliks, idet sekvensen til restene (22-31) er valgt fra

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(0CH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa28 og Xaa<31>uavhengig av hverandre er Leu eller Ile; Xaa<29>er Ala, Arg eller Glu; og Xaa<30>er Lys eller Glu (sekvensidentitet nr. :

85) ; idet i en forbindelse hvor Xaa<22>er Phe; Xaa23 er Phe; Xaa<25>er His; Xaa<26>er Lys eller His; Xaa<28>er Ile; Xaa29 er Ala; og Xaa<30>er Glu; er Xaa<31>Leu;

Xaa<22>og Xaa<25>uavhengig av hverandre er Glu, Glu(OCH3), His eller Phe; Xaa<23>er Leu eller Phe; Xaa<29>er Glu, Lys eller Lys (COCH2PEGX) og PEGX er et poly- (etylenglykolmetyleter) - radikal med molekylvekt 100 til 10.000 (sekvensidentitet nr.:

86) ;

karakterisert vedat beskyttede aminosyrer kobles sekvensvis på en egnet harpiksbærer, sidekjeden og N<*1->beskyttelsesgruppene fjernes og polypeptidet avspaltes fra harpiksbæreren.

12. Anvendelse av en forbindelse ifølge kravene 1-9 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, til fremstilling av et medikament for behandling av pattedyrtilstander som er kjennetegnet ved reduksjoner i benmasse, særlig for behandling av osteoporose.