PT87501B - Processo para a producao de angiogeninas por manipulacao genetica - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

A observação de que a vascularização é uma con dição para o crescimento da maioria dos tumores sólidos levou ao isolamento e à caracterização de um factor de angiogónese conhecido por angiogenina a partir do sobrenadante de culturas de células do adenocarcinoma HT29 (Fett et al. , Biochemis try 24 (Ι9θ5) 5480-5486; Strydom et al., Biochemistry 24(1985) 5486-5494), A angiogenina consiste numa cadeia peptídica não glicosilada com uma massa molar de cerca de l4 200 D e com um ponto isoeléctrico >9,5. A partir da sequenciação da proteina foi possível com sondas específicas isolar um ADNc da angioge nina e um clone genómico da angiogenina (Kurachi et al., Biochemistry 24 (1985) 5494-5499)· A angiogenina apresenta uma homologia de 35$> com a ribonuclease A (RNase A), situando-se 3 das 4 pontes de dissulfureto da RNase A exactamente na mesma posição bem como os resíduos de ácidos aminados essenciais

para a actividade catalítica da RNase A His-12, Lys-4l e His-119. Outros trabalhos mostraram também que a angiogenina pos I sui actividade de RNas que ê, no entanto, mais específica do que a da RNase A (Shapiro et al., Biochemistry 25 (1986) 3527 ' ”* i

-3532). j )

I ι

As possibilidades para uma utilização terapêu J tica de angiogenina situam-ee numa supressão de perturbações j da circulação sanguínea local, sendo de considerar um emprego em perturbações da circulação sanguínea coronária e no tratamento de ferimentos, especialmente de lesões dos ossos e dos ligamentos e em transplantações de pele. 0 segundo princípio j terapêutico consiste na inibição da angiogénese, por exemplo | por anticorpos contra a angiogenina. Em virtude da hotnologia entre a angiogenina e a RNase A seria também de pensar em ini bidores sintéticos de baixo peso molecular. Este princípio po j

deria ser utilizado para o diagnostico e para a terapia de tu mores sólidos e das respectivas metásteses (sinergismo com a quimioterapia), em artrite reumática, nas afecções tardias dia béticas (retinopatias) e em outros quadros patológicos. ' ί

í

A fim de esgotar todas estas possibilidades ί terapêuticas é necessário contudo em primeiro lugar isolar de modo vantajoso angiogenina biologicamente activa em quantidades que possibilitem principalmente a continuação das investi gações.

Para a preparação de polipeptídeos por via de manipulação genética em bactérias é importante acoplar o gene estrutural para o polipeptídeo em concordância de quadro de leitura com o gene para o polipeptídeo proprio das bactérias 9-galactosidase. A bactéria produz então uma proteína de fusão na qual o polipeptídeo desejado está ligado pela extremidade amino-terminal na extremidade carboxi-terminal da -gala ctosidase. Também se sabe que nestes processos não se aprovei ta completamente a -galacto sidas e (EP-A 0 001 930 e OQ12494).

• Utiliza-se no entanto apenas uma fracção extremamente curta . ou então essencialmente a sequência integral da >-galactosidasa

Ja foi descrito um processo para a preparação de um polipeptídeo geneticamente codifivável (pedido de Paten te Alemã não publicado P 38 05 150·Β), no qual o gene estrutu ral para este polipeptídeo é acoplado em concordância de quadro de leitura no gene para a A-galactosidase ou um fragmento da /3-galac to sidas e numa região de regulação, se introduz este gene estrutural numa bactéria, se expressa a partir desta bac téria uma proteina de fusão insolúvel, se isola esta após dis rupção das calulas e se obtém o polipeptídeo pretendido por cisão química ou enzimatica, caracterizado por no gene para a /3-galacto sidase ou para o fragmento da ^-galactosidase os cod8es para a metionina e/ou para a arginina e/ou para a cistei na serem integralmente ou parcialmente substituídos por codSes para outros ácidos aminados,

Verificou-se agora que a angiogenina e os seus derivados são acessíveis de modo especialmente vantajoso por um processo análogo a este.

As figuras ilustram a presente invenção como se segue:

A Figura 1 mostra a construção de sequências encurtadas da /J-galactosidase sem adaptador (A 1. - 5.) e com adaptador (B 1. - 5·).

A Figura 2 mostra a construção do plasmídeo pWZ RI (um derivado do plasmídeo pBR 322 com fragmentos do ge ne da /3-galactosidase de pUC 9 e de pUR 27θ)«

A Figura 3 mostra a construção do plasmídeo pLZ/l.

A Figura 4 mostra a construção do plasmídeo pLZP RI dMdC a partir de pWZIP dMdC.

A Figura 5 mostra a construção dos plasmídeos pLZPWBl dMdC e pLZPWB2 dMdC.

Α Figura 6 mostra esquematicamente a reacção de ligação que conduz a uma angiogenina sintética, em que R significa purificação, L significa ligação e o símbolo circulo significa o grupo 5'-fosfato.

I

As figuras não estão à escala. j ί

Em primeiro lugar d escrevem-se pormenores do ' processo de acordo com o pedido de Patente Alemã P 38 05 150*8 para a preparação de proteínas de fusão:

A fracçao de $-galacto sidase nas proteínas de i

fusão apresenta de preferência mais de 250 ácidos aminados ! mas significativamente menos do que a sequência integral da ί /^-galactosidase. Foram experimentados fragmentos de /3-galacto sidase de cerca de 300 a cerca de 800 ácidos aminados, de pre ferência cerca de 320 a cerca de 650 ácidos aminados, os quais contêm com vantagem uma fracção aminoterminal e/ou carboxiter minai da Agalacto sidase. Este fragmento do gene da /4-galacto sidase está em concordância de quadro de leitura ligado a uma região de regulação e, caso seja necessário através de um ada ptador, ao gene estrutural para a angiogenina.

i , í ) adaptador, que eventualmente também pode não existir, codifica neste caso de preferência para um ou para vários ácidos aminados que se situam antes da extremidade ami no-terminal da angiogenina, possibilitando a separação desta e do fragmento de /3-galac to sidase facilmente — por via quími- j ca ou enzimática. Quando o derivado pretendido da angiogenina · não possui, por exemplo, qualquer metionina ou quando foi mo- , dificado por manipulação genética de tal modo que já não possui qualquer metionina, escolhe-se de modo vantajoso uma metionina para ácido aminado situado antes da extremidade amino -terminal do polipeptídeo pretendido, possibilitando deste mo do a separação entre o polipeptídeo pretendido e a fracção de 0-galactosidase por cisão por cloreto ou por brometo de ciano génio.

processo da presente invenção tem a vanta- ; gem de a proteína de fusão formada ser insolúvel e ser portan : to facilmente isolavel depois da disrupção das células. De acordo com a forma de concretização preferida a proteína de fusão pode, por outro lado, acumular-se em maiores quantidades em bactérias em virtude da relativamente reduzida fracção de galact o sidase. Além disso, a proteína de fusão não é des truida de forma notável por conter uma fracção de uma proteína própria da bactéria e possibilita deste modo um correspondente período de indução mais longo e em consequência um rendimento mais alto.

De acordo com a presente invenção pode portan to obter-se uma angionina por acoplamento do gene estrutural ! para este polipeptídeo em concordância de quadro de leitura, caso seja necessário através de um adaptador, com o gene para a /^-galactosidase ou para um fragmento da /9-galacto sidade de preferência de mais de 250 ácidos aminados, no entanto significativamente menor do que a sequência integral da /^-galactosidade, a uma região de regulação, introdução deste gene es- ! trutural numa bactéria, expressão nesta bactéria de uma proteína de fusão insolúvel, isolamento desta apos disrupção das células e obtenção do polipeptídeo pretendido por cisão quími ca ou enzimática.

A região de regulação pode ser uma região natural, especialmente bacteriana, ou pode ser uma região sinté tica ou ainda uma região híbrida, por exemplo o promotor de fusão tac. As regiões de regulação compreendem ainda adicio- ;

í nalmente um operador, por exemplo o operador lac, e um local de ligação ribossomal 6 a 14 nucleótldos antes do codão para a metionina do fragmento da /3-galactosidase.

fragmento da /^-galactosidase é constituido de modo vantajoso por uma fusão de uma sequência parcial amino-terminal e de uma sequência parcial carboxi-terminal. Deste modo, a fracção da/^-galactosidase na proteína de fusão é

4.

consideravelmente reduzida. Além disso esta construção possibilita a permuta de diferentes sistemas de regulação sem difi i ” i culdades especiais. Também é possível, no entanto, empregar exclusivamente sequências amino-terminais ou de preferência sequências carboxi-terminais da Agalacto sidase. Para esta construção de um gene encurtado da /3-galac to sidas e é possível utilizar locais de corte por enzimas de restrição. No entanto, também podem empregar-se construções com adaptadores ou ligan tes sintéticos que garantam um quadro de leitura correcto — e contendo eventualmente um codão de início ATG·. A Figura 1 A mostra fragmentos de /3-galac to sidas e nos quais se fez uso de locais de corte por enzimas de restrição naturais e a Figura 1 B com utilização de um adaptador de ligação.

Podem revelar-se vantajosas outras modifica- ; ções do fragmento de /3-galactosidase isoladamente ou em combi nação, conforme cada caso.

A purificação do polipeptídeo separado do fra gmento da /3-galactosidase por cisão com cloreto ou brometo de ! , . , i cianogenio e facilitada quando se substitui por mutagenese di rigida in vitro um ou de preferência todos os codões dos resí

- ί duos prejudiciais de metionina por codões para outros ácidos aminados, de preferência para leucina ou isoleucina.

Numa proteína de fusão modificada deste modo a cisão conduz, além do polipeptídeo desejado, a um número me nor de fragmentos de cisão da /2-galac to sidas e que podem ser escolhidos de tal modo que se possam separar facilmente do po lipeptídeo pretendido com base na diferença de dimensão e/ou d e carga,

Em polipeptídeos que devem ser separados do fragmento da /^-galac to sidas e por hidrólise ácida da ligação peptídica entre o ácido aspártico e a prolina, pode ser vanta joso modificar os codões correspondentes no fragmento do gene da /J-galactosidase por mutagenese dirigida in vitro de modo a que nesse local não seja já possível uma hidrólise ácida, de

preferencia por transformação dos codões para o ácido aspárti co em codões para o ácido glutâmico.

Em polipeptídeos para cuja actividade seja ne cessaria a formação de pontes de dissulfureto torna-se geralmente necessário transformar os codões para a cisteína existentes no fragmento do gene da /3_g_alactosidase, por meio de mutagénese dirigida in vitro, em codões para outro ácido aminado, de preferência em serina, a fim de tomar impossível uma eventual formação de pontes de dissulfureto indesejáveis entre o fragmento da A-galactosidase e o polipeptídeo.

adaptador entre o gene do fragmento da /3-ga lactosidase e o gene estrutural para o polipeptídeo pretendido, que em casos convenientes pode não existir, codifica — ím_e diatamente antes da extremidade amino-terminal do polipeptídeo pretendido — para um ácido aminado ou para uma série de ácidos aminados que possibilitam uma fácil separação entre o polipeptídeo pretendido e a fracção de /2-galacto sidase. Conforme já mencionado, este ácido aminado pode ser uma metionina, que possibilita uma fácil cisão por brometo de cianogénio, sempre que o polipeptídeo pretendido não contenha qualquer me tionina ou que os codões correspondentes tenham sido modifica dos por manipulação genética. Um exemplo para um adaptador co mo referido apresenta a seguinte sequência de nucleátidos:

5’ AAT TAT GAA TTC GCA ATG (Eco Rl) TA CTT AAG CGT TAC

Pode conseguir-se uma facilitação adicional das diferentes modalidades de separação — química ou enzimáti ca — através da separação estérica do polipeptídeo pretendido e da fracção de /3-galactosidase. Para este fim, introduzem-se os codões para um poli-ácido aminado através de um adaptador sintético entre a fracção da /^-galactosidase e o polipeptídeo. Em geral podem ser utilizados, sob o aspecto das diferentes estruturas desses braços de poli-ácidos aminados, todos os ácidos aminados geneticamente codificáveis, por exemplo peque

nos ácidos aminados sem carga, como glicina, alanina, serina ou prolina, ou carregados como ácido aspártico e ácido glutâmico por um lado, ou lisina e arginina por outro. A cadeia dos ácidos aminados contém convenientemente 5 a 30 ácidos ami nados, de preferência 10 a 24, especlalmente 15 a 20. Segundo a escolha do ácido aminado pode conseguir-se um afastamento entre o produto génico pretendido na ligação com a fracção de /3-galactosidase.

gene estrutural para a angiogenina pretendi da pode ser preparado por síntese química por meio de métodos conhecidos em si. São vantajosos genes sintéticos de acordo com a utilização particular dos codões da célula hospedeira, como os que se descrevem por exemplo nas publicações de pedidos de Patentes Alemãs 33 27 007 (derivados do factor de libertação da hormona de crescimento), 33 28 793 (derivado da secretina), 34 09 966 (interferão jf humano), 34 19 995 (inter leuqulna-2 e derivados) e 34 29 430 (derivados da hirudina) ou se apresentam no pedido de Patente Alemã P 36 32 037.4 (calcitonina).

Com o objectivo referido preparou-se por via de síntese química um gene para a angionina que apresenta várias vantagens. No gene sintético (Quadro l) são tomadas em conta as preferências de E. coli. No interior do gene estrutu ral está integrada uma série de sequências de reconhecimento singulares para endonucleases de restrição, que permitem o acesso a sequências parciais da angiogenina e que facilitam a modificação do gene por meio de mutações. Além disso, o codão para a única metionina existente na angiogenina natural esta transformado num codão para uma leucina, isoleucina ou valina, o que possibilita, sem perda da actividade biologica, uma separação fácil entre a angionina e o fragmento da />-galactosidase da proteína de fusão por cisão por brometo de cianogénio.

A integração do gene estrutural, constituído por uma região de regulação, um gene para um fragmento de /38

-galactosidase, eventualmente um adaptador e o gene estrutuI i ral, num vector apropriado, a introdução do vector híbrido as sim obtido numa célula hospedeira apropriada, a cultura das células hospedeiras, a disrupção das células, o isolamento e a cisão da proteína de fusão bem como o isolamento do polipeptídeo pretendido são conhecidos em geral. Para estas opera- i

ÇÔes podem ser referidos os livros de texto e manuais gerais.

Os vectores preferidos são plasmídeos, espeI cialmente os plasmídeos compatíveis com E. coli, como pBR 322, i i

pBR 325» pUC 8 e pUC 9» hem como outros plasmídeos comerciais ou acessíveis em geral. 0 hospedeiro bacteriano preferido ê E. coli.

Nos seguintes exemplos a presente invenção ê elucidada mais em pormenor.

Exemplo 1

Submetem-se 20 ^ig do plasmídeo comercial pUC 9 (ver Vieira et al., Gene 19 (1982) 259 - 268; The Molecular ! Biology Catalogue, Pharmacia P-L Biochemicals, 1984, Apendice, i ρ. 4o) a uma dupla digestão com as endonucleases de restrição Eco RI e Pvu I e separa-se por electroforese em gel um fragmento de ADN de 123 pares de bases (pb) de comprimento. Este fragmento contém uma fracção da sequência amino-terminal de !

codificação da /^-galactosidase. !

i

Para isolamento da fracção carboxi-terminal do gene da /3-galacto sidas e até ao local de corte natural Eco RI digerem-se 20 yug do plasmídeo puR 270 (Ríither e Míiller-Hill, EMBO J. 2 (1983) 1791-1794) em primeiro lugar com Eco RI e em seguida parcialmente com a enzima Pvu I. Por electroforese num gel de poliacrilamida a 5$ separa-se e isola-se um fragmen to de ADN de 2895 ph. '

Os fragmentos de ADN amino-terminal e carbo xi-terminal do gene da /^-galactosidase são ligados entre si du9

rante um período de 6 horas a 16°C e o produto da ligação é precipitado com etanol. 0 ADN precipitado ressuspendido ê cor tado com Eco RI e novamente fraccionado num gel de poliacrila mida a 5%· θ fragmento de ADN com o comprimento de 3018 pb é isolado a partir do gel por electro eluição e ligado no local de corte Eco RI do plasmídeo pBR 322. 0 plasmídeo híbrido assim obtido é denominado pVZ RI.

As fases de reacção anteriormente descritas são apresentadas na Figura 2. As operações unitárias foram le vadas a efeito de modo conhecido (Maniatis et al,, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982).

plasmídeo pWZ RI é utilizado para transformar E. coli, amplificado e novamente isolado. Por digestão com Eco RI podem-se separar fragmentos amino-terminais ou carboxi -terminais do gene da A-galactosidase encurtado, que podem ser depois isolados em escala preparativa. Podem construir-se outras versões encurtadas por meio dos locais de corte por en ί zimas de restrição conhecidos e estas versões podem ser intro duzidas em plasmídeos de expressão apropriados. A Figura 1 A mostra versões encurtadas como as referidas.

A Figura 1 B mostra construções com um adapta dor sintético.

Tanto as construções da Figura 1 A como as da í Figura 1 B foram escolhidas de modo que o quadro de leitura ί da /9-galac to sidas e encurtada continua sem transição no quadro de leitura do polipeptídeo pretendido carboxi-terminal. Os adaptadores sintéticos da Figura 1 B podem ser quaisquer mas devem, evidentemente, garantir o quadro de leitura livre de codoes de paragem e eventualmente um codão de início ATG e apre sentar os locais de corte por enzima de restrição desejados.

Exemplo 2

I

Pode ser preparada uma versão útil encurtada e ¹

modificada do fragmento obtenível por cisão com Eco RI a partir do pWZ RI do gene da /^-galactosidase como indicado a seguir.

Cortam-se 10 /ig do plasmídeo pWZ RI (Eig. 2) com as enzimas de restrição Eco RI e Pvu I e separa-se num gel de poliacrilamida a 7»5%. Isolam-se os fragmentos de ADN de 123 e de 1222 pb de comprimento. Em seguida ligam-se entre si quantidades equimolares dos dois fragmentos de AON durante 6 horas a 10°C e digere-se novamente com Eco RI. A mistura de ligação assim obtida é separada num gel de poliacrilamida a 7,5% e as bandas de ADN com um comprimento de 1345 pb são iso ladas em escala preparativa. Este fragmento de ADN é integrado no vector pBR 322 aberto com Eco RI e em seguida desfosforilado. 0 plasmídeo assim obtido é denomidado pWZP RI.

Para eliminação dos 8 codões para a metionina existentes no plasmídeo pWZP RI (Ml a M8) e dos 6 codões para a cisteína presentes neste plasmídeo (Cl a C6), corta-se 1 jug do ADN de pWZP RI com Eco RI. 0 fragmento de 13^5 pb de dimen são é integrado no vector fagico M13mpl9ara aberto com Eco RI e em seguida desfosforilado (Patschinsky et al., J. Virol. 59 (1986) 341-353). θ fago obtido apos transfecção de E. coli JM1O1 é denominado MWZPam. Como primeira fase da eliminação dos codões para a metionina, leva-se a efeito uma mutagénese dirigida in vitro de acordo com o método de gapped duplex (Kramer et al., Nucl. Acida Res. 12 (1984) 9441-9456), usando -se para iniciadores mutagénicos os 4 oligonucleótidos dM5 a dM8 (Quadro 2) em virtude da boa eficiência deste método (em média 7θ %)· θ ADNcs de 12 dos fagos resultantes é sequenciado, usando-se, além dos iniciadores normais de 17 bases, também dM7 e dC5 (Quadro 2) como iniciadores para a sequenciação 2 dos 12 ADNs apresentam todas as 4 mutações pretendidas, isto é, os codões para M5 a M8 foram transformados em codões pa ra isoleucina. Estes fagos são denominados MWZP dM5» 8. Para a eliminação dos restantes codões para a metionina conde-se o ADN-RP de MWZP dM5> 8 com Eco RI e clona-se o fragmento de ADN de 1345 pb em M13mpl9am desfosforilado. 0 fago obtido deste

modo 4 denominado MWZP dM5» 8am. 0 ADNcs deste fago é submeti do a uma nova mutagénese in vitro usando como iniciadores de mutagénese dMl a dM4. 0 ADNcs dos 12 fagos resultantes e sequenciado e 3 dos 12 fagos apresentam todas as mutações pretendidas, isto é, os codões para Ml a M3 foram transformados em codões para leucina e o codão para M4 foi transformado num codão para isoleucina. Estes fagos são denominados MWZPdM.

Por clonagem do fragmento Eco RE de 1345 pb da forma RP deste fago no vector pBR 322 desf osforilado obtém-se o plasmídeo pWZP dM. Para transformação adicional dos codões para cisteína em codões para serina isola-se o fragmento Eco RI de 1345 pb do plasmídeo pWZP dM e clona-se no vector fágico M13mpl9am desfosforilado. 0 ADNcs do fago MWZP assim obtido é submetido a uma mutagénese in vitro com dCl a dC6 com iniciadores mutagénicos. 0 ADNcs de 24 dos fagos obtidos é sequenciado, tendo -se verificado que 4 dos clones fágicos, que foram denominados MWZP dMdC, apresentam correctamente todos os codões para a cisteína transformados em codões para a serina. 0 ADN-RP destes fagos é cortado com Eco RI e o fragmento Eco RI de 1345 pb é clonado no vector pBR 322 desfosforilado, obtendo-se assim o plasmídeo pWZP dMdC.

Exemplo 3 plasmídeo pLZ^, em que se podem clonar com j vantagem as versões encurtadas e/ou modificadas do gene da fi>- i -galactosidase, é obtenível como se segue (Pig. 3):

Cortam-se 10 )ig do plasmídeo pBR 322 com as endonucleases de restrição Eco RI e Pvu II e separa-se num gel de agarose a 1 %. 0 fragmento de ADN de 2293 pb de dimensão é purificado, cortado parcialmente com Hae II e de novo submeti do a electroforese num gel de agarose a 1 %. 0 fragmento de · ADN de 2017 pb de dimensão é isolado e é ligado dum dia para o outro a 12°C com o fragmento de ADN de pUR 2 (Ríither, Mol. Gen. Genet. 178 (l98O) 475-477) de 225 pb de dimensão após cor te com Eco RI e com Hae II, que contém o promotor/operador do

operão lac, um local de ligação ribossomal e os primeiros 5 codães do gene lac Z (incluindo o codão de início). Após trans formação de células competentes de E. coli obtém-se o plasmídeo pLZ/ó.

Exemplo 4

Obtêm-se, como descrito, plasmídeos apropriados para a expressão de polipeptídeos sob a forma de proteínas de fusão em virtude de conterem locais de clonagem múltipla (Fig. 4):

jig do plasmídeo pLZ/3 (Fig· 3) é aberto com Eco RI, é desfosforilado e é ligado a 12°C dum dia para o outro com o fragmento Eco RI de 1345 pb modificado obtido a par tir de pWZP dMdC (-^xemplo 2). Após transformação de células competentes de E. coli e selecção no que respeita à expressão daβ-galactosidase e à distribuição correcta dos locais de cor te para as diferentes endonucleases de restrição obtém-se o plasmídeo pLZP RI dMdC (Fig. 4).

Para a integração por clonagem de um local de clonagem múltipla no local Eco RI na extremidade 3’ do gene da /^-galacto sidase verifica-se ser vantajoso eliminar o local Eco RI na extremidade 5’ por mutagénese dirigida in vitro. Pa ra este fim integra-se por clonagem o fragmento Pst I-Sac I de 1767 pb de dimensão em M13mpl9am e submete-se a mutagénese in vitro de acordo com o método gapped duplex” com o iniciador mutagénico

5'-GCCAGTGAATCCGTAATCATGG-3'.

ADN de 2 dos 4 clones fágicos em investigação apresenta após sequenciação e análise de restrição a ausên cia desejada do local de corte para Eco RI. A partir do ADN-RF deste clone fágico é isolado o fragmento Pst I-Sac I de 17^7 pb de dimensão e é ligado a ló°C durante 4 horas com o fragmen to Pst I-Sac I do plasmídeo pLZP RI dMdC. Após transformação

de células competentes de E, coli obtém-se o plasmxdeo pLZP dMdC (Fig. 5).

Para a integração do local de clonagem múltipla, abrem-se 2 ug de pLZP dMdC com Eco RI, desfosforila-se e liga-se com a seguinte sequência de ADN sintética que contém uma variedade de locais de corte por enzimas de restrição·.

	(Eco Rl)	Sac I	Sma I	Bam HI	Xba I Sal I
5'	AA TTC	GAG CTC GCC CGG GGA TCC	TCT AGA GTC GAC
3’	G	CTC GAG CGG GCC CCT AGG	AGA TCT CAG CTG
	Pst I	Hind	III	Nru I Ava	III Bgl II
	CTG CAG	CCC AAG	CTT	CGC GAT GCA	TCA GAT CTA
	GAC GTC	GGG TTC	GAA	GCG CTA CGT	AGT CTA GAT
	Nco I	Sph I	(Eco	Rl')

CCA TGG CAT GCC 3'

GGT ACC GTA CGG TTA A 5’

Deste modo obtêm-se após transformação de células competentes de E. coli os plasrnídeos pLZPWBl dMdC e pLZPWB2 dMdC (Fig. 3), que se distinguem pela diferente orien taçâo da sua sequência MCS.

Exemplo 5

A integração por clonagem de um gene sintético para a angiogenina (Quadro l) que se distingue do gene da angiogenina normal humana principalmente pela substituição do codão para a metionina 3θ por um codao para a leucina, isoleu cina ou valina, no vector pLZPWB2 dMdC é levada a efeito como se segues gene sintético para a angiogenina é formado pela junção de 12 oligonucleótidos que o constituem (ver Qua• dro 3).

- l4 -

Tomando como exemplo o oligonucleótido componente Ia, que abrange os nucleotidos 1 a 49 da cadela de codi ficação, elucida-se a síntese dos componenres. Para a síntese em fase sólida utiliza-se o nucleósido situado na extremidade 3* , no presente caso portanto uma adenosina (nucleotido nS 4p), ligado a um suporte por uma ligação covai ente através de uma função 3’-hidroxilo. 0 material de suporte é vidro de poro controlado (Controlled Pore Glass w CPG) funcionalizado com resíduos de alquilo de cadeia longa.

Nas seguintes fases de síntese utiliza-se como componente base 5'-0~dimetoxitritilnucleósido-3’-fosfato de goiano etilo-dialquilamida, estando a adenina sob a forma do composto N^-benzoilo, a citosina sob a forma do composto

2

N -benzoilo, a guanina sob a forma do composto N e a timina sem grupo protector.

mg do suporte polimérico, que contém 0,2 ^imol de N^-benzoil-adenosina, são tratados sucessivamente com os seguintes agentess

A) acetonitrilo

B) ácido tricloroacético a 3% em diclorometano

c) acetonitrilo

D) 5 /^mol do correspondente nucleósido-3*-0-fosfito e 25 Jimol de tetrazolo em 0,15 ml de acetonitrilo

E) acetonitrilo

F) anidrido acético a 20% em tetra-hidrofurano com 4o% de lutidina e 10% de dimetilaminopiridina

G) acetonitrilo

H) iodo a 3% em lutidina/água/tetra-hidrofurano nas proporçoes de 10il:40

Por fosfito deve entender-se aqui o 2.’-desoxirribose-3’-monofosfito de monocianoetilo, sendo neste caso a terceira valência saturada por meio de um resíduo de isopropilamina. 0 rendimento de cada fase de síntese pode ser sempre determinado a seguir à reacção de destritilação B) por

medida da absorção do catião de dimetoxitritilo no comprimento de onda de 496 nm.

Depois de terminada a síntese segue-se a eliminação do grupo dimetoxitritilo conforme descrito desde Ay a

C). 0 oligonucleótido é separado do suporte por tratamento com amoníaco e o grupo ^-ciano etilo é eliminado do mesmo modo. 0 grupo protector de amina é eliminado das bases quantitativamente por tratamento durante 16 horas dos oligomeros com amónia concentrada a 50°C · 0 produto bruto obtido deste modo é pu rificado por meio de electroforese em gel de poliacrilamida.

Para fosforilação dos oligonucleótidos na extremidade 5’ tratam-se 1 nmol de cada um dos oligonucleótidos lb a 6a com 5 nmol de fosfato de adenosina e com quatro unida des de quinase de polinucleótido T4 em 20 jil de tampão de tris-HCl 50 mM (pH 7,6), cloreto de magnésio 10 mM e ditiotreitol (DDT) 10 mM durante 30 minutos a 37^0. A enzima é des activada por aquecimento a 950 durante cinco minutos. Os oli gonucleótidos la e 6b» que formam na sequência de ADN as sequências em cadeia simples salientes”, não são fosfoliladas. Deste modo evita-se» na ligação subsequente» a formação de fragmentos de genes maiores do que o correspondente à sequência d e ADN I.

Os oligonucleótidos la a 6b (ver Quadro 3) fo ram ligados ao gene conjunto como se segue (Fig. 6)s 1 nmol de cada um dos oligonucleótidos la e lb até 6a e 6b foram hibridados aos pares» dissolvendo cada um destes em 20 ^jlL de tampão de tris-HCl 50 mM (pH 7*6), cloreto de magnésio 10 mM, e DTT 10 mM, aquecendo esta solução durante 5 minutos a 95° C e arrefecendo até à temperatura ambiente no decurso de 2 horas. Nesta operação os oligonucleótidos lb a 6a foram usados sob a forma dos respectivos 5’ -fosfatos. Para a ligação subse quente dos fragmentos de ADN bi-helicoidais formados, juntam-se as soluçoes dos mesmos conforme se mostra na Figura 6 levando a efeito a ligação para formação do gene integral.

A purificação do gene è levada a efeito por meio de electroforese em gel nuih gel de poliacrilamida a 6 a (sem adição de ureia, 4o x 20 x 0,1 cm), servindo como substância de marcação 0xl74-ADN (áoc, BRL) cortado com Hinf I ou pBR 322 cortado com Hae III.

fragmento Sph I-Eco RI assim obtido ê ligado a 16°C dum dia para o outro com o vector pLZWB2 dMdC corta do com Eco RI e Sph I. Após transformação de células de E. co li competentes obtêm-se colónias resistentes à ampicilina que são investigadas no que respeita à expressão de uma proteína de fusão da ordem de grandeza esperada. Em 4 clones positivos foi levada a efeito uma análise de sequenciação da fracção de angiogenina na qual a sequência de 2 dos 4 clones se revelou correcta. Estes plasmídeos são denominados pLZFWB2 dMdC Ang.

Do mesmo modo são obtidos os genes para a angiogenina-Ile-30 e para a angiogenina-Val-30 por ligação com os oligonucleótidos 2c e 2d ou 2e e 2f respectivamente (Quadro 4).

Exemplo 6

As estirpes bacterianas cultivadas até à densidade óptica óptima foram induzidas usando como indutor IPTG durante o tempo suficiente, por exemplo 2 horas. Em seguida mataram-se as células com cresol a 0,1% e fluoreto de fenil-mctil-sulfonilo (fluoreto de benzilsulfonilo) 0,1 mM. Após centrifugação ou filtração procede-se à disrupção da massa ce lular numa solução aquosa ácida a pH 3»0 num aparelho apropria do (prensa francesa ou moinho ^RDyno), separando-se os resíodos celulares insolúveis por centrifugação. As proteínas são isoladas a partir do sobrenadante por meio de métodos normais (Grau et al., Angew. Chem. 98 (1986) 530). A concentração e a pureza dos produtos são verificadas por meio de HPLC analítica .

A fim de libertar a angiogenina a partir da

proteína de fusão dissolve-se o resíduo seco em ácido fármico a 70% e incuba-se com 2O;á em peso de brometo de cianogénio (calculado em relação à massa seca utilizada) durante 4 horas à temperatura ambiente. Por precipitação com 5 volumes de éter metil-t-butílico obtém-se um produto de cisão por brometo de cianogénio a partir do qual podem ser isoladas as angiogeninas de alta concentração de carga reduzidas por meio de croma tografia através de um permutador de catiões apropriado (p. ex. S-Sepharose^R a pH 8 com ureia 6 a 8 M) sob condições redu toras (p. ex. com adição de mercaptoetanol, etc). Para a precipitação da angiogenina na sua estrutura terciária nativa com fecho das três pontes de dissulfureto podem ser usados os métodos clássicos de regeneração de proteínas reduzidas por meio de misturas adequadas de glutatião oxidado e reduzido (p. ex. Karim Ahmed et al., J. Biol. Chem. 250 (1975) 8477-8482). A partir do produto de precipitação isola-se angiogenina de alto grau de pureza por meio de filtração em gel seguida de cromatografia de permuta de iánica.

A verificação do grau de pureza do produto fi nal é levada a efeito por meio de HPLC de fase reversa e de electroforese em gel de SDS. A actividade de angiogênese é ve rificada por meio de análise de CAM e da análise da cárnea de coelho (Fett et al., Biochemistry 24 (1985) 5480-5486),

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Quad ro 2

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dM3	5'-	GCA	AAA	ATC	CAG	TTC	GCT	GGT	G
dM4	5'-	C	GCC	AAT	CCA	TAT	CTG	TGA	AA
dM5	5'-	C	GGT	AAT	CGC	AAT	TTG	ACC	AC
dMó	5'-	A	CGG	GGT	ATA	GAT	GTC	TGA	CA
dM7	5'-	G	GCT	GGT	TTC	AAT	CAG	TTG	CT
dM8	5'-	C	ACC	AAT	CCC	TAT	ATG	GAA	ACC
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dC2	5‘-		CAG	CTC	GAT	GGA	AAA	ATC	CAG TTC
dC3	5'-		ATC	TGC	CGT	GGA	CTG	CAA	CAA
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Tabela

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - 15 Processo para a preparação de uma angiotensina caracterizado por se acoplar o gene estrutural para este polipeptídeo no quadro de leitura correcto numa região de regulação sobre um gene para a /5-galactosidase ou de um fragmen to da /â-galactosidase convenientemente de mais de 250 ácidos aminados, no entanto significativamente menor do que a sequên cia integral da /3-galactosidase, estando no gene para a /2-galactosidase ou para o fragmento da /3-galacto sidase os codões para a metionina e/ou para a arginina e/ou para a cisteína in tegralmente ou em parte substituídos por codões para outros ácidos aminados, integrar este gene estrutural numa bactéria, expressar na referida bactéria uma proteína de fusão insolúvel, isolar esta proteína de fusão apos desintegração das células e separar o polipeptídeo pretendido por meio de hidrólise química ou enzimática.

   - 2« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fragmento da A-galacto sidase ser constituído por uma fusão entre uma sequência parcial aminoterminal e carboxit ermlnal.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o fragmento da /2-galactosida se apresentar aproximadamente 300 a 800 ácidos aminados.

   Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o fragmento da $-galacto sidase apresentar aproximadamente 320 a 650 ácidos aminados.

   Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o gene para o fragmento da /9-galactosidase corresponder a uma sequência de ADN de acor do com a figura 1.

   Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o gene estrutural para a angiogenina estar acoplado ao gene para o fragmento da /2-gala ctosidase através de um adaptador.

   - 7& Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado por imediatamente antes da extremidade aminoterminal do gene estrutural se situar um ou vários codões para um ou vários ácidos aminados que possibili tam uma separação química ou enzimática do polipeptídeo.

   Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 7» caracterizado por a angiotensina ser codificada por uma sequência de ADN de acordo com o quadro 1 ou com o Quadro 4.

   8^a

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã, em 19 de Maio de 1987» sob o n? P 37 ló 722.7.

   Lisboa, 18 de Maio de 1988

   RESUMO

   PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ANGIOGENINAS POR MANIPULAÇÃO GENÉTICA

   A invenção refere-se a um processo para a pre paração de uma angiotensina que compreende acoplar-se o gene estrutural para este polipeptídeo no quadro de leitura correc to numa região de regulação sobre um gene para a A-galactosidase ou de um fragmento da fi-galactosidase convenientemente de mais de 250 ácidos aminados, no entanto significativamente menor do que a sequência integral da /3-galacto sidase, estando no gene para a /^-galactosidase ou para o fragmento da /2-galac tosidase os codães para a metionina e/ou para a arginina e/ou para a cisteína integralmente ou em parte substituídos por co does para outros ácidos aminados, integrar este gene estrutural numa bactéria, expressar na referida bactéria uma proteína de fusão insolúvel, isolar esta proteína de fusão apás des integração das células e separar o polipeptídeo pretendido por meio de hidrólise química ou enzimática.