JPH0338833B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発現ベクターに関する。さらに詳しく
は、本発明はプロモーター活性を有する組み換え
DNAおよび該DNAを用いて形質転換させたバチ
ルス属菌に関する。 遺伝子操作技術は大腸菌を用いて進歩し、すで
に多くの異種遺伝子が大腸菌内で発現されてい
る。 枯草菌は土壌中に生棲し、これまでに動物や植
物の病気に関連したことが知られていないばかり
ではなく、納豆など食品の生産にも利用されて古
くからその安全性が知られている。また枯草菌は
工業上広く使用される発酵微生物であつて、その
工業的規模での管理体制が確立している。さらに
枯草菌はグラム陽性細菌であつて、グラム陰性細
菌である大腸菌に比べて、多くの抗生物質たとえ
ばβ−ラクタム抗生物質やマクロライド抗生物質
に対して感受性であるために生菌を迅速に死にい
たらしめることが可能である。これら枯草菌はす
ぐれた特性に注目して現在、枯草菌を用いた異種
遺伝子の発現系の開発が注目されている。 しかしながら、枯草菌では大腸菌におけるよう
な優れた発現ベクターがないために、枯草菌内で
異種遺伝子が発現された例は大腸菌に比べて極め
て少なくその例としては、Ｂ型肝炎ウイルスＣ抗
原遺伝子および口蹄病ウイルス主抗原（VPI）遺
伝子の発現〔K.Hardy et al：Nature 293、
481（1981）〕、大腸菌のtrp Ｃ遺伝子の発現〔D.
W.Williams et al：Gene、16、199（1981）〕、マ
ウスdihydrofolate reductase遺伝子の発現〔D.
M.Willams et al：Gene、16、199（1981）；R.G.
Schoner et al：Gene、22、47（1983）〕、ヒトイ
ンターフエロン−β遺伝子の発現〔S.Chang et
al：Proceedings of the IVth International
Symposium on Genetics of Industrial
Microorganisms p.227（1982）〕などが挙げられ
るにすぎない。また、一般にその発現量が少ない
ために、枯草菌では強力なプロモーターを有する
優れた発現ベクターの開発が望まれている。現在
までに塩基配列まで明らかにされた枯草菌のプロ
モーターとして、vegプロモーター、tmsプロモ
ーター、penPプロモーター、SPO1プロモータ
ー、φ29AIプロモーター〔C.P.Moran Jr.et al：
Mol.Gen.Genetics、186、339（1982）〕やSPO2プ
ロモーター〔R.G.Schoner et al.Gene 22、47
（1983）〕などが知られてはいるが、これらのうち
で、実際に遺伝子発現に利用されたものはSPO2
プロモーターのみである。また、これまでに発現
された異種遺伝子産物の殆んどは融合蛋白質とし
て産生されている。 これらの状況に鑑がみ、本発明者らは枯草菌を
用いた、より強力な遺伝子発現系の開発を目標に
して研究を進めてきた。その結果、枯草菌の染色
体DNAから強力なプロモーターが得られること
を知り、これに基づき遺伝子の発現ペクターの構
築および遺伝子の発現に成功して本発明を完成し
た。 すわち、本発明は (1) 第１図で示される塩基配列もしくはプロモー
ター活性を有するその一部を有する組み換え
DNAおよびそれで形質転換させたバチルス属
菌、および (2) 第１図で示される塩基配列もしくはプロモー
ター活性を有するその一部の下流にSD配列、
およびSD配列の下流に目的とする蛋白質をコ
ードする遺伝子を含む組み換えDNAおよびそ
れで形質転換させたバチルス属菌を提供するも
のである。 第１図で示される塩基配列のDNAは、たとえ
ば自体公知のDNAの調製法、たとえばLovettら
の方法〔Methods in Enzymology、68、342
（1979）〕などを用いて得られるバチルス
（Bacillus）属菌の染色体DNAを原料としてプロ
モータークローニングベクターを用いてクローニ
ングすることにより得ることができる。 上記の染色体DNAはバチルス菌のものであれ
ばいかなるものであつてもよく、たとえばバチル
ス・サチリス（Bacillus subtilis）JB−１−168
（IFO−14144）、Bacillus sub−tilis 168、
Bacillus subtilis MI114などの株があげられる。
なお、Bacillus subtilis168はザ・バチルス・ジ
エネテイク・ストツク・センター〔The
Bacillus Genetic Stock Center〕にBGSCNo.
1A1〔The Bacillus Genetic Stock Center、
Catalog of Strains（Second eddition）〕として
保管され、また、Bacillus subtilis MI114は文献
〔Gene、24、255（1983）〕に記載されている公知
菌であり、また三菱生命研から入手可能である。 染色体DNAを用いてプロモーター活性を有す
るDNA断片をクローニングする場合に用いられ
るベクター（プロモータークローニングベクタ
ー）としては、たとえば制限酵素切断部位にバチ
ルス属菌の染色体DNA断片を挿入させ、その断
片中にプロモーターが存在していることを知るこ
とが出来るプラスミドであればいかなるものであ
つてもよく、たとえばプロモーター部分が欠損し
た遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ、具
体的にはプラスミドpBTM126（第２図参照）な
どがあげられる。なお、このプラスミド
pBTM126はウイリアムスら〔J.Bacteriol.、146、
1162（1981）〕によつて報告されたpPL603と同一
である。すなわち、これらのプラスミド
pBTM126とpPL603はスタフイロコツカス
（Staphylococcus）属由来のカナマイシン耐性プ
ラスミドpUB110〔Plasmid、６、67（1981）〕とバ
チルス・プミルス（Bacillus pumilus）
NCIB8600のクロラムフエニコール・アセチル・
トランスフエラーゼ（以後、CATと略す場合も
ある）遺伝子との組み換えプラスミドから、
CAT遺伝子のプロモーター部分を欠損させて構
築されたものであり、クロラムフエニコールに対
する耐性が失われている。このプラスミド
pBTM126に染色体由来のプロモーター活性を有
するDNA断片をクローニングするためには、本
プラスミドのCAT構造遺伝子の上流の制限酵素
切断部位たとえばEcoR、Pst部位に、染色体
DNAを制限酵素で切断して得られたDNA断片を
たとえばT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、
これを用いてBacillus subtilisの形質転換を行
い、クロラムフエニコール耐性の形質転換株を分
離すればよい。なお、プロモーター活性は、たと
えばウイリアムスらの方法（前出）に従つて測定
することができる。 プロモーター活性を有するDNA断片は該形質
転換株からプラスミドを調製した後、これを、た
とえば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、アガロースゲル電気泳動などの自体
公知の方法を用いて単離することができる。ま
た、単離されたDNA断片の塩基配列は自体公知
の方法、たとえばジヌクレオチド合成鎖停止法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、74、5463（1977）〕
を用いて決定できる。 また、プロモーター活性を有する第１図で示さ
れるDNA断片およびその一部は自体公知の方法、
たとえばトリエステル法〔R.Crea et.al：Proc.
Natl.Acad.Sci.、USA、75、5765（1978）〕を用
いて化学合成することもできる。 本発明のDNA断片は強力なプロモーター活性
を有し、バチルス属菌の優れた発現ベクターのプ
ロモーターとして有用であることのみならず、大
腸菌や放線菌の発現ベクターのプロモーターとし
ても利用可能であると考えられる。 目的とする蛋白質は転写開始に必要なプロモー
ターおよびリボソーム結合部位（SD配列）の下
流に目的とする蛋白質をコードする遺伝子を連結
させたDNAでバチルス属菌を形質転換させ、得
られる形質転換株を培養することにより得ること
ができる。 上記のSD配列としては枯草菌内で機能するも
のであればいかなるものであつてもよく、またそ
の配列のいくつかは、すでに公知である〔J.R.
McLaughlin et al：J.Biol.Chem、256、11283
（1981）、C.P.Moran Jr.et al：Mol.Gen.
Genetics、186、339（1982）〕。したがつて、SD配
列を含むオリゴヌクレオチドを染色体DNAから
単離するか、または自体公知の方法、たとえばト
リエステル法（前出）によつて化学合成し、プロ
モーターを有するベクターにおいてプロモーター
の下流に挿入すれば求める発現ベクターを構築す
ることができる。また、該オリゴヌクレオチドは
SD配列の下流に制限酵素認識部位（例、Claサ
イト、BamHサイト、Salサイト）を有して
いる方が便利である。 発現に使用される遺伝子は介在配列を有さず、
かつ塩基配列の明らかなものがより望ましく、染
色体から単離された遺伝子、mRNAから得られ
た相補DNA、化学合成した遺伝子、半合成遺伝
子などいかなるものであつてもよい。具体的には
免疫インターフエロン遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス
（HBV）表面抗原遺伝子、HAVコア抗原遺伝子、
免疫グロフリンＥ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝
子、インターロイキン−２遺伝子などがあげら
れ、該遺伝子の全部またはその一部を使用しても
よい。また、これらの遺伝子を発現ベクターに挿
入して発現プラスミドを構築する際、必要に応じ
て適当な合成オリゴヌクレオチドを遺伝子に連結
させてもよい。 このようにして得られるプラスミドでバチルス
属菌を形質転換させる場合、宿主は特に限定する
必要はなく、たとえば、Bacillus subtilis
BGSC1A1、BGSC1A339、BGSC1A340などが挙
げられる〔The Bacillus Genetic Stock
Center、Catalog of Strains（Secondedition）
1982年発行〕。形質転換体はそれ自体公知の培地、
たとえばＬ培地などで20〜40℃、３〜48時間培養
される。培養終了後それ自体公知の方法で菌体を
集め、凍結融解法、リゾチーム添加法、超音波処
理法あるいは界面活性剤添加法などの方法を単独
あるいはこれらを組み合せた方法で菌体を溶解さ
せ、産生された蛋白質を抽出することができる。
抽出された蛋白質は通常の蛋白質精製法にしたが
つて精製され、目的とする蛋白質を得ることがで
きる。 また目的とする蛋白質がヒト免疫インターフエ
ロンの場合、以下の方法によつて抽出することが
できる。ヒト免疫インターフエロン遺伝子を有す
るバチルス属菌を培養して、菌体を集め、集めら
れた菌体を凍結融解法、リゾチーム添加法および
超音波処理法のうちの２方法以上の組み合わせで
溶菌させ、ヒト免疫インターフエロンを抽出す
る。 凍結融解法においては−20℃〜−160℃程度で
凍結させた菌体を＋４℃付近で融解時間10秒〜３
分程度で融解させる方法が好適に用いられる。 リゾチーム添加法に用いられるリゾチームはい
かなる種類のリゾチームであつてもよく、菌体濃
度１×10⁴〜１×10¹⁰cells／ml程度に最終濃度50
〜5000μｇ／ml程度、好ましくは500〜1000μｇ／
ml程度となるようにリゾチームを加え、＋15℃〜
＋40℃程度、好ましくは＋28℃〜＋37℃程度で処
理することが好ましい。処理時間はリゾチームの
種類、量、処理温度によつて異なるが、一般には
５分〜30分が好ましい。 超音波処理法においては波長10KHz〜30KHz程
度で５〜60秒程度、好ましくは５〜20秒程度処理
して菌体を破砕する条件が好適である。 これらの３方法のうちの２方法を組み合わせた
方法で菌体を破砕することにより、容易にヒト免
疫インターフエロンを抽出することができるが、
３方法を組み合わせて菌体を破砕することがより
好ましい。 また、必要に応じ、種々の界面活性剤、プロテ
アーゼ阻害剤を添加してもよい。 本願の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明
の欄、図面の簡単な説明の欄および図面を用いる
記号の意義は第１表に示すとおりである。 第１表 DNA：デオキシリボ核酸 cDNA：相補デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン RNA：リボ核酸 mRNA：伝令リボ核酸 dATP：デオキシアデノシン三リン酸 dTTP：デオキシチミジン三リン酸 dGTP：デオキシグアノシン三リン酸 dCTP：デオキシシチジン三リン酸 ATP：アデノシン三リン酸 EDTA：エチレンジアミン四酢酸 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム Leu：ロイシン Thr：スレオニン Cys：システイン Met：メチオニン Glu：グルタミン酸 Lys：リジン His：ヒスチジン Phe：フエニールアラニン Gln：グルタミン 以下に参考例及び実施例を示して本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はこれに限定される
べきものではない。 参考例 １ プロモータークローニングベクターpBTM126
の構築 プラスミドpBTM126は、Williamsらの方法に
従い以下のように作製した。財団法人発酵研究所
より入手したBacillus pumilus NCIB8600（IFO
−12089）よりDNAを調製し、そのDNA（6.5μ
ｇ）を40ユニツトの制限酵素EcoRと37℃、１
時間反応させ切断したのち、68℃で15分間加熱
し、エタノール沈澱を行つた。一方、プラスミド
pUB110（2.0μｇ）を20ユニツトの制限酵素EcoR
と37℃で１時間反応させて切断したのち、68℃
で15分間加熱し、エタノール沈澱を行つた。両沈
澱を水に溶かして混合し、これに60nmoleの
ATP、10ユニツトのT4DNAリガーゼ（宝酒造
製）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液
（100μ）を11℃で30時間保温し、エタノール沈
澱を行つた。沈澱をTE緩衝液（50μ）に溶解
し、その25μを用いてBacillus subtilis MI114
の形質転換を行つた。クロラムフエニコール耐性
の形質転換株よりプラスミドを調製し、該プラス
ミドをpBTM124と命名した。次にプラスミド
pBTM124（2.5μｇ）を14ユニツトの制限酵素Pst
と37℃、１時間反応させて切断し、68℃で15分
間加熱処理したのち、エタノール沈澱を行つた。
沈澱を水に溶解し、66nmoleのATP、10ユニツ
トのT4DNAリガーゼ（宝酒造製）およびリガー
ゼ緩衝液を加えた反応液（100μ）を11℃で24
時間保温し、エタノール沈澱を行つた。沈澱を
TE緩衝液に溶解し、バチルス・サチルスMI114
を形質転換させ、カナマイシン耐性の形質転換株
からプラスミドを調製して、該プラスミドを
pBTM125と命名した。本プラスミドはプラスミ
ドpBTM124のCAT遺伝子のプロモーター部位
（Pst断片）が脱落したものである、次にプラス
ミドpBTM125（2.5μｇ）を18ユニツトの制限酵素
BamHおよび15ユニツトの制限酵素Bglと37
℃で１時間反応させて切断し、68℃で15分間加熱
処理したのちエタノール沈澱を行つた。沈澱を水
に溶解したのち、66nmoleのATP、13ユニツト
のT4DNAリガーゼ（宝酒造製）およびリガーゼ
緩衝液を含む反応液（100μ）中で11℃で28時
間保温し、これを用いてバチルス・サチルス
MI114の形質転換を行つた。カナマイシン耐性の
形質転換株からプラスミドを調製し、該プラスミ
ドをpBTM126と命名した。 参考例 ２ プラスミドpHTItrp2101の構築 免疫インターフエロン（IFN−γ）cDNAを含
むプラスミドpHIT3709および発明ペクター
ptrp601は特開昭58−189197号公報に記載の方法
に従つて構築した。 まず、プラスミドpHIT3709を制限酵素Pst
で切断してIFN−γの構造遺伝子を含むPst断
片を得、この断片を制限酵素BstNIで部分分解
し、IFN−γ構造遺伝子内にあるBstNI部位の切
断されたBstNI−Pst断片を得た。BstNI切断
部位ののりしろ部位をDNAポリメラーゼラー
ジフラグメントでうめたのち、トリエステル法に
よつて化学合成した翻訳開始コドンATGを含む
オリゴヌクレオチドアダプター CGATAATGTGTTACTGCC TATTACACAATGACGG をT4DNAリガーゼで結合させた。 一方、上記アダプターを結合させたIFN−γ遺
伝子をptrp771〔Y.Fujisawa、et al Nucleic
Acids Res.11、3581（1983）〕を制限酵素Pstと
制限酵素Claで切断して得た断片のトリプトフ
アンプロモーターの下流に挿入してT4DNAリガ
ーゼを用いて結合させ、IFN−γ発現プラスミド
pHITtrp1101を構築した。 次に、ptrp601を制限酵素Claおよび制限酵素
Hpaで処理してtrpプロモーターを含むCla−
Hpa断片0.33Kbを得た。この断片を、Claで
切断しアルカリホスフアターゼ処理した
pHITtrp1101にT4DNAリガーゼを用いて結合さ
せ、trpプロモーターが二つ直列に入つた
pHITtrp2101を得た。 参考例 ３ () ヒトIL−２をコードするmRNAの分離ヒ
ト末梢血より調製したリンパ球を12−Ｏ−テト
ラデカノイルホルボール−13−アセテート
（TPA）（15nｇ／ml）とコンカナバリンＡ（40μ
ｇ／ml）を含むRPMI1640培地（10％の牛胎児
血清を含む）中、37℃で培養し、IL−２を誘
導させた。24時間後、この誘導した１×10¹⁰個
のヒトリンパ球を5Mグアニジンチオシアネー
ト、５％メルカプトエタノール、50ｍＭ
Tris・HClPH7.6、10ｍＭ EDTA溶液中でテ
フロンホモゲナイザーによつて破壊変性した後
Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを４
％になるように加え、均質化した混合物を
5.7M塩化セシウム溶液（5.7M塩化セシウム、
0.1M EDTA）６ml上に重層し、ベツクマン
SW28のローターを用いて15℃で24000rpm48時
間遠心処理を行い、RNA沈澱を得た。この
RNA沈澱を0.25％Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで
沈澱させ、10mgのRNAを得た。このRNAを高
塩溶液〔0.5M MaCl、10ｍＭ Tris・HClPH
7.6、１ｍＭ EDTA、0.3％SDS〕中でオリゴ
（dT）セルロースカラムに吸着させ、ポリ(A)を
含むmRNAを低塩溶液（10ｍＭ Tris・HCl
PH7.6、１ｍＭ EDTA、0.3％SDS）で溶出さ
せることにより、ポリ(A)を含むmRNA300μｇ
を分取した。 このmRNAを更にエタノールで沈澱させ、
0.2mlの溶液（10ｍＭ Tris・HClPH7.6、２ｍ
Ｍ EDTA、0.3％SDS）に溶かし、65℃で２
分間処理して10〜35％シヨ糖密度勾配遠心処理
（ベツクマンSW28のローターを用いて20℃、
25000rpmで21時間遠心分離）することにより
分画して22画分を得た。この各画分につき
RNAの一部ずつを、アフリカツメガエルの卵
母細胞に注入し、合成される蛋白質中のIL−
２活性を測定し、画分11〜15（沈降定数8S−
15S）にIL−２の活性を検出した。この画分の
IL−2mRNAは約25μｇであつた。 () 単鎖DNAの合成 上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を用い、
100μの反応液（5μｇのmRNA、50μｇオリ
ゴ（dT）、100ユニツトの逆転写酵素、１ｍＭ
ずつのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、
８ｍＭ MgCl₂、50ｍＭ KCl、10ｍＭジチオ
スレイトール、50ｍＭ Tris・HClPH8.3）中
で42℃、１時間インキユベートした後に、フエ
ノールで除蛋白し、0.1NのNaOHで70℃、20
分処理してRNAを分解除去した。 () 二重鎖DNAの合成 ここで合成された単鎖の相補DNAを50μ
の反応液（mRNAとオリゴdTを含まない以外
は上記と同じ反応液）中で42℃２時間反応させ
ることにより二重鎖DNAを合成した。 () dCテイルの付加 この二重鎖DNAにヌクレアーゼS1を50μ
の反応液（二重鎖DNA、0.1M酢酸ナトリウム
PH4.5、0.25M NaCl、1.5ｍＭ ZnSO₄、60ユ
ニツトのS1ヌクレアーゼ）中で室温30分間作
用させ、フエノールで除蛋白し、エタノールで
DNAを沈澱させた後、これにターミナルトラ
ンスフエラーゼを50μの反応液（二重鎖
DNA、0.14Mカコジル酸カリウム、0.3M Tris
（塩基）PH7.6、２ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ CoCl₂、0.15ｍＭ dCTP、30ユニツト
ターミナルトランスフエラーゼ）中で３分間37
℃で作用させ二重鎖DNAの3′末端に約15個の
デオキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一
連の反応で約300nｇのデオキシシチジン鎖を
もつた二重鎖DNAを得た。 () 大腸菌プラスミドの開裂ならびにdGテイル
の付加 一方、10μｇの大腸菌プラスミド
pBR322DNAに制限酵素Pstを50μの反応
液（10μｇ DNA、50ｍＭ NaCl、６ｍＭ
Tris・HClPH7.4、６ｍＭ MgCl₂、６ｍM2−
メルカプトエタノール、100μｇ／ml牛血清ア
ルブミン、20ユニツトのPst）中で３時間37
℃で作用させてpBR322DNA中に１ケ所存在
するPst認識部位を切断し、フエノールで除
蛋白した後、ターミナルトランスフエラーゼを
50μの反応液（DNA10μｇ、0.14Mカコジル
酸カリウム、0.3M Tris・塩基PH7.6、２ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ CoCl₂、0.15ｍ
Ｍ dGTP、30ユニツトターミナルトランスフ
エラーゼ）中で３分間37℃で作用させ上記プラ
スミドpBR322DNAの3′末端に約17個のデオキ
シグアニン鎖を延長させた。 () cDNAの会合ならびに大腸菌の形質変換 このようにして得られた合成二重鎖
DNA0.1μｇと上記プラスミドpBR322、0.5μｇ
を0.1M NaCl、50ｍＭ Tris・HClPH7.6、１
ｍＭ EDTAよりなる溶液中で65℃２分間、
45℃２時間加熱しその後除冷して会合させ
Eneaらの方法〔J.Mo1.Biol.、96、495（1975）〕
に従つて大腸菌MM294を形質転換させた。 () cDNA含有プラスミドの単離 このようにして約20000個のテトラサイクリ
ン耐性株が単離され、これら各々のDNAをニ
トロセルロースフイルターの上に固定した。次
いでTaniguchiらが報告〔Nature、302、305
（1983）〕したIL−２のアミノ酸配列をもとに
してアミノ酸No.74〜78（Lys⁷⁴−His−Leu−Gln
−Cys）およびアミノ酸No.122〜126（Thr¹²²−
Phe−Met−Cys−Glu）に対応する塩基配列
（ ⁵′AAA CAT CTT CAG TGT³′および
⁵′ACA TTC ATG TGT GAA³′）をトリエ
ステル法〔R.Crea et al.Proc.Natl.Acad.Sci.
USA、75、5765（1978）〕により化学合成した。 このオリゴヌクレオチドに対してT4ポリヌ
クレオチドカイネースを用いて50μの反応液
（オリゴヌクレオチド0.20μｇ、50ｍＭ Tris・
HClPH8.0、10ｍＭ MgCl₂、10ｍＭメルカプ
トエタノール、50μClγ−³²PATP、３ユニツト
T4ポリヌクレオチドカイネース）中で１時間
37℃で反応させ、5′末端を ³²Pで標識した。こ
の標識されたオリゴヌクレオチドをプローブと
してLawnらの方法〔Nucleic Acids Res.、
９、6103（1981）〕に従つて上記のニトロセルロ
ースフイルター上に固定したDNAに会合させ、
オートラジオグラフイーによつて上記二種類の
オリゴヌクレオチドプローブに反応する菌株を
４個単離した。これらの菌株の各々の菌体から
プラスミドDNAをアルカリ法〔H.C.Birnboim
＆J.Doly：Nucleic Acids Res.、７、1513
（1979）〕によつて単離した。次にプラスミド
DNAの挿入部を制限酵素Pstにより切り出
し、分離したプラスミドのうちでその挿入部の
長さの最も長い断片を含むものをえらび、この
プラスミドをpILOT135−８（第３図）と名づ
けた。 次にこのpILOT135−８プラスミドに挿入さ
れたcDNAの配列の一次構造（塩基配列）をジ
デオキシヌクレオチド合成鎖停止法とMaxam
−Gilbert法によつて決定した。その一次構造
を第４図に示す。この塩基配列により規定され
るペプチドはその合成開始信号（No.64〜66の
ATG）から始まつて153個のアミノ酸から成
る。この中Ｎ末端から20個のアミノ酸はシグナ
ルペプチドと考えられる。上記の一次構造か
ら、このプラスミドはヒトIL−２蛋白質をコ
ードする塩基配列を全部持つていることが判明
した。この事実によつてプラスミドに組み込ま
れた遺伝子を他の発現用プラスミドに組み込む
ことによりIL−２蛋白質の任意のポリペプチ
ドを生産することができる。 () プラスミドpILOT135−８を制限酵素
HgiA1で切断し、129bpのIL−２遺伝子を含む
DNA断片を得た。このDNA断片をT4DNAポ
リメラゼーで処理した後、アラニンのコドン
GCAとメチオニンのコドンATGを有するClaI
のリンカー、CGATA ATG GCAを結合させ
ClaI処理した後、ptrp771（Y.Fujisawa et al、
前出）のCla、siteに組み込み、得られたプ
ラスミドをpTF5と命名した。 実施例 １ プロモーターのクローニング 参考例１で得たプロモータークローニングベク
ターpBTM126（2.1μｇ）を制限酵素Pst（８ユ
ニツト）で37℃、１時間切断したのち、さらに制
限酵素EcoR（５ユニツト）で37℃、１時間切
断し、68℃で15分間加熱処理して反応を停止さ
せ、エタノール沈澱を行つた。一方、Bacillus
subtilis JB−１−168（IFO−14144）の染色体
（6.2μｇ）をPst（24ユニツト）およびEcoR
（15ユニツト）でそれぞれ37℃、１時間切断し、
68℃で15分間加熱処理したのちエタノール沈澱を
行つた。両沈澱を水に溶解したのち混合し、アデ
ノシン三リン酸（66nmole）およびT4DNAリガ
ーゼ〔宝酒造製〕（10ユニツト）存在下で11℃、
24時間反応し、エタノール沈澱を行つた。沈澱を
10ｍＭトリス・塩酸緩衝液PH8.0、１ｍＭ
EDTA（TE緩衝液）に溶解し、B.subtilis MI114
の形質転換をプロトプラスト法〔S.Chang and.
S.N.Cohen；Mol.Gen.Genet.、168、111（1979）〕
で行い、12.5μｇ／mlのクロラムフエニコールを
含むDM3寒天プレート〔Mol.Gen.Genet.、168、
111（1979）〕で選択すると956株の形質転換株が得
られた。さらに200μｇ／mlのクロラムフエニコ
ールを含むブレイン・ハートインヒユージヨン
（Difco社、米国）の寒天プレートでレプリカす
ると20株が生育した。これらの形質転換株は強力
なプロモーター活性を有するDNA断片を組み込
んだプラスミドを保有している。 実施例 ２ 染色体DNAより得られたDNA断片のプロモー
ター活性はウイリアムスらの方法〔前出〕に基づ
き、CAT活性を測定することによつて求めた。 この活性測定には実施例１で得られた形質転換
体20株のうちの１株Bacillus subtilis48〔プラス
ミドpBTM128（第２図参照）を含有するBacillus
subtilis MI114〕を用い、対照として参考例１で
得られたプラスミドpBTM124（プロモーターを
含むCAT遺伝子を含有）およびpBTM126（プロ
モーターが欠損したCAT遺伝子を含有）を含む
Bacillus subtilis MI114を用いた。 まず、各株をクロラムフエニコール含有（5μ
ｇ／ml）又は非含有のＬ培地40mlを含む200ml容
三角フラスコで30℃、16時間振とう培養した。次
に、得られた培養液の10mlを遠心分離して集めた
菌体を20ｍＭトリス−HCl緩衝液（PH7.8）で洗
浄した。洗浄菌板を0.5mg／mlのリゾチームを含
む同じ緩衝液１mlに懸濁し、37℃で25分間保温し
たのち超音波破砕機で2A、10秒間処理し、遠心
分離して得られた上清を酵素液として、活性測定
に用いた。CAT活性は5′，５−ジチオビス（２
−ニトロ安息香酸）を用いる比色法（Methods
in Enzymology、43巻、737頁、1975年）で測定
した。蛋白質はLowryらの方法〔J.Biol.Chem、
193、265（1951）〕によつて定量した。表１にその
結果を示す。 【表】 表中、＋Cmはクロラムフエニコール5μｇ／ml
を含むＬ培地を、−Cmはクロラムフエニコール
非含有のＬ培地を示す。この結果からpBTM128
にクローニングされたDNA断片は強力なプロモ
ーター活性を有していることが明らかになつた。 実施例 ３ プラスミドの調製 Bacillus subtilis T48を１％トリプトン（デイ
フコ社、米国）、0.5％酵母エキス（デイフコ社）、
0.5％塩化ナトリウム、PH7.2からなるＬ培地
（500ml）で28℃、16時間振とう培養した。得られ
た500mlの培養液を遠心分離して集めた菌体に、
60mlの25％シヨ糖を含むTES緩衝液（30ｍＭ
Tris・HCl PH8.0−50ｍＭ NaCl−５ｍＭ
EDTA）、12mlの0.25M EDTAPH8.0、16mlの５
mg／mlリゾチーム溶液および0.8mlの５mg／mlリ
ボヌクレアーゼＡ溶液を加え、37℃で30分間保温
した。さらに８mlの10％ラウロイル硫酸ナトリウ
ムを加え、37℃で15分間保温した。つぎに20mlの
5M塩化ナトリウムを加え、０℃で３時間放置し
たのち遠心分離した。その上清に２倍容の冷エタ
ノールを加え、−20℃で１夜放置した。遠心分離
して得られた沈澱を8.6mlの0.4％ザルコシールを
含むTES緩衝液に溶かし、９ｇの塩化セシウム
および0.25mlの30mg／mlエチジウムブロマイド溶
液を加えたのち、ベツクマン超遠心機（ローター
50Ti）を用いて20℃で38000rpmで48時間遠心し
た。紫外線照射によつて検出されるプラスミドの
バンドを取り、これに〔（比重）＝1.6〕の塩化セ
シウム−エチジウムブロマイド溶液を加え、再び
ベツクマン超遠心機（ローターVti65）を用いて
20℃で55000rpmで６時間遠心した。プラスミド
のバンドを取り、ｎ−ブタノール抽出によつてエ
チジウムブロマイドを除去したのちTE緩衝液で
透析し、プラスミドpBTM128（第２図参照）を
調製した。260nｍの吸光度から約330μｇのプラ
スミドが得られたことがわかつた。 実施例 ４ プロモーターのDNA断片の単離および性質 実施例３で得られたプラスミドpBTM128
（221μｇ）をPst（208ユニツト）およびEcoRI
（220ユニツト）でそれぞれ37℃で１時間切断した
のち10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。ゲルをエチジウムブロマイド溶液に侵して染
色し、紫外線ランプで検出したプロモーターの
DNA断片を回収した。電気的にDNA断片をゲル
から溶出させたのちフエノール抽出、エーテル抽
出を行い、エタノール沈澱した。沈澱をTE緩衝
液に溶かし、3.55μｇのプロモーターDNA断片を
単離した。 得られたプロモーターDNA断片の大きさを４
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した。
プラスミドpBR322のHae分解物を標準とする
と約120bpと算出された。本断片の塩基配列はジ
ヌクレオチド合成鎖停止法（前出）によつて第１
図の様に決定された。本断片は117bpからなり、
5′末端にEcoR切断部位を、3′末端にPst切断
部位を有する。また断片中には−10領域および−
35領域と思われる塩基配列が認められる。 実施例 ５ 発現ベクターpBTM134の作製 実施例３で得られたプラスミドpBTM128（7.7μ
ｇ）を制限酵素Pst（51ユニツト）と37℃、１
時間反応させて切断したのち、0.75ユニツトの大
腸菌アルカリフオスフアターゼで65℃、30分間処
理した。反応生成物は、反応液をフエノール抽
出、エーテル抽出したのち、エタノール沈澱を行
つて集めた。沈澱を少量の水に溶解し、これに
5′末端をリン酸化した８塩基の合成ヌクレオチド
GGAGGTAT（200nｇ）、5′末端をリン酸化した
14塩基の合成ヌクレオチド
CGATACCTCCTGCA（350nｇ）、100nmoleの
ATP、28ユニツトのT4DNAリガーゼ（宝酒造
製）およびリガーゼ緩衝液を加え、反応液
（100μ）を11℃で20時間保温したのち、エタノ
ール沈澱を行つた。沈澱を少量の水に溶解し、25
ユニツトのClaで37℃、１時間処理したのちセ
フアロース4Bカラムで小型オリゴヌクレオチド
を除去し、目的物をエタノール沈澱して集めた。
沈澱を水に溶解し、これに100nmoleのATP、28
ユニツトのT4DNAリガーゼ（宝酒造製）および
リガーゼ緩衝液を加えた反応液（100μ）を11
℃で20時間保温してClaサイトを連結したのち
その50μを用いてプロトプラスト法（前出）に
よつてBacillus slbtilis MI114を形質転換させ
た。カナマイシンおよびクロラムフエニコール耐
性の形質転換株からプラスミドを単離し、このプ
ラスミドをpBTM134（第５図参照）と命名した。 実施例 ６ ヒト免疫インターフエロン遺伝子の発現 参考例２で得られたプラスミドpHITtrp2101
より単離して得られたヒト免疫インターフエロン
遺伝子を含む1.03KbのClaI−Pst断片5μｇに
5′末端をリン酸化した８塩基の合成オリゴヌクレ
オチドGATCGATC（300nｇ）、5′末端をリン酸化
した12塩基の合成オリゴヌクレオチド
GATCGATCTGCA（450nｇ）、100nmoleの
ATP、2000ユニツトのT4DNAリガーゼ（ニユ
ーイングランドバイオラブ製、米国）およびリガ
ーゼ緩衝液を加えた反応液（100μ）を11℃で
24時間保温したのち、エタノール沈澱を行つた。
沈澱を水に溶解し、25ユニツトの制限酵素ClaIで
37℃、１時間反応させたのち、セフアロース4B
カラム（1.5ml）で小型オリゴヌクレオチドを除
去し、エタノール沈澱を行つてヒト免疫インター
フエロン遺伝子の両末端がClaIサイトとなつた
DNA断片を得た。 一方、実施例５で得られた発現ベクター
pBTM134の1.1μｇを10ユニツトのClaIで37℃、
１時間切断し、0.1ユニツトの大腸菌アルカリ性
フオスフアターゼで65℃、30分間処理したのちフ
エノール抽出およびエーテル抽出し、エタノール
沈澱を行つた。この沈澱および上記の沈澱を少量
の水に溶解したのち混合し、さらに100nmoleの
ATP、1200ユニツトのT4DNAリガーゼ（ニユ
ーイングランドバイオラブ製）およびリガーゼ緩
衝液を加えて得られた反応液（100μ）を11℃
で24時間保温し、この50μを用いてプロトプラ
スト法によつてBa−cillus subtilis MI114を形質
転換させた。カナマイシン耐性の形質転換株から
プラスミドを単離し、pBTM134のClaIサイトに
ヒト免疫インターフエロン遺伝子を有するDNA
断片が正方向および逆方向に挿入されたプラスミ
ドをそれぞれpHIT−B101（第６図参照）および
pHIT−B102と命名した。 プラスミドpBTM134、pHIT−B101および
pHIT−B102を保持するバチルス・サチルス
MI114を40mlのＬ倍地（5μｇ／mlのカナマイシン
含有）を含む200ml容三角フラスコに寒天倍地よ
り接種し、37℃で５時間振とう培養したところ
OD₆₀₀が1.2に達した。得られた培養液を遠心分離
し、その菌体を30ｍＭトリス・HCl緩衝液PH8.0
−50ｍＭ NaCl−５ｍＭ EDTAで２回洗浄し
たのちドライアイス−エタノール（−70℃）で凍
結した。この凍結菌体を２mlの50ｍＭトリス・
HCl緩衝液PH8.0−10％シヨ糖−100ｍＭ NaCl
−10ｍＭ EDTA−20ｍＭスペルミジン−１
mg／mlアルブミンに懸濁し、40μの20mg／mlリ
ゾチーム溶液を加え、37℃で20分間保温したの
ち、超音波破砕機で19.5KHz、10秒間処理した。
処理液を15000rpmで15分間遠心し、その上清を
ヒト免疫インターフエロンの定量の標品に供し
た。 ヒト羊膜由来wish細胞に対する水泡性口内炎
ウイルス（VSV）の細胞変性効果阻止試験によ
り、上記で得られたヒト免疫インターフエロンの
抗ウイルス活性を定量した結果、プラスミド
pBTM134、pHIT−B102を有するBacillus
subtilis MI114株ではヒト免疫インターフエロン
活性は認められなかつたが、プラスミドpHIT−
B101を有するBacillus subtilis MI114株では
1238ユニツト／ml（抽出液）のヒト免疫インター
フエロン活性が認められた。 実施例 ７ IL−２遺伝子の発現 プラスミドpBTM134（1μｇ）を制限酵素ClaI
（10ユニツト）で37℃、１時間切断し、さらに0.1
ユニツトの大腸菌アルカリ性フオスフアターゼで
65℃、30分間処理したのち、反応液をフエノール
抽出およびエーテル抽出し、エタノール沈澱を行
つてDNAを沈澱させた。一方、参考例３で得ら
れたIL−２遺伝子を有するプラスミドpTF5よ
り、IL−２遺伝子を含む1.3KbのClaIDNA断片
を単離した。上記のようにして得られたプラスミ
ドpBTM134のClaI分解物（0.5μｇ）および
0.3KbのClaIDNA断片（0.6μｇ）を混合し、これ
に100nmoleのATP、2000ユニツトのT4DNAリ
ガーゼ（ニユーイングランド・バイオラブス製）
およびリガーゼ緩衝液を加えた100μの反応液
を11℃で24時間保温してpBTM134に1.3Kbの
ClaIDNA断片を結合させた。これを用いて
Bacillus subtilis MI114を形質転換させ、得られ
たカナマイシン耐性株からプラスミドを調製し、
プラスミドpBTM134のClaIサイトにIL−２遺伝
子を有する1.3KbのDNA断片が正方向および逆
方向に挿入されたプラスミドを得、それぞれ
pILT−B101およびpILT−B102と命名した。な
お本DNA断片の方向性は制限酵素EcoRI−XbaI
を用いて決定した。このプラスミドpILT−B101
を有するBacillus subtilis MI114は財団法人発酵
研究所にIFO−14305として、また通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP−
610として寄託されている。 プラスミドpBTM134、pILT−B101および
pILT−B102を保持するBacillus subtilis MI114
を40mlのＬ培地（5μｇ／mlのカナマイシン含有）
を含む200ml容三角フラスコで37℃、４時間振と
う培養するとOD₆₀₀が1.1〜1.5に達した。得られ
た培養液を遠心分離して集めた菌体を1M KClで
３回洗浄したのち、まずドライアイスーエタノー
ル（−70℃）で凍結した。つぎに凍結菌体を２ml
の30ｍＭ Tris・HCl（PH8.0）−50ｍＭ NaCl−
５ｍＭ EDTA−１mg／mlアルブミンに懸濁し、
これに50μの20mg／mlリゾチーム溶液を加え、
37℃で15分間保温したのち、超音波破砕機で
19.5KHz、10秒間処理した。この処理液を
10000rpmで10分間遠心し、その上清をIL−２の
定量に供した。 IL−２の定量はIL−２依存性マウスNKC3細胞
の生育促進を ³H−チミジンの取込みを測定する
ことによつて行つた。表２に各プラスミドを保持
する菌株のIL−２活性を示す。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図はDNA断片の塩基配列を示し、記号
５′および３′はそれぞれ、5′末端および3′末端を
示す。 第２図はプラスミドpBTM126および
pBTM128の制限酵素地図を示し、記号Ori，
Km^r，CmおよびＰはそれぞれ、複製開始点、カ
ナマイシン耐性遺伝子、プロモーター欠損クロラ
ムフエニコール耐性遺伝子（クロラムフエニコー
ル・アセチル トランスフエラーゼ遺伝子）およ
びプロモーターを示す。 第３図はプラスミドpILOT135−８を示し、
Tc^rはテトラサイクリン耐性遺伝子を示す。 第４図はプラスミドpILOT135−８に挿入され
たIL−２をコードするcDNAの塩基配列を示し、
記号５′および３′はそれぞれ5′末端および3′末端
を示す。 第５図はプラスミドpBTM134の構築図を示
し、記号Ori，Km^r，Cm，Ｐ→およびSD→はそれぞ
れ、複製開始点、カナマイシン耐性遺伝子、プロ
モーター欠損クロラムフエニコール耐性遺伝子
（クロラムフエニコール・アセチル トランスフ
エラーゼ遺伝子）、プロモーターおよびリボゾー
ム結合部位を示す。 第６図はプラスミドpHIT−B101の構築図を示
し、記号Ori，Km^r，Cm，Ｐ→，SD→，Tc^r，trp−
ＰおよびIFN−γはそれぞれ複製開始点、カナマ
イシン耐性遺伝子、プロモーター欠損クロラムフ
エニコール耐性遺伝子、プロモーター、リボゾー
ム結合部位、テトラサイクリン耐性遺伝子、trp
プロモーターおよびヒト免疫インターフエロン遺
伝子を示す。第７図はプラスミドpILT−B101の
構築図を示し、記号Ori，Km^r，Cm，Ｐ→，SD→，
Tc^r，Amp^r，trp−ＰおよびIL−２はそれぞれ複
製開始点、カナマイシン耐性遺伝子、プロモータ
ー欠損クロラムフエニコール耐性遺伝子、プロモ
ーター、リボゾーム結合部位、テトラサイクリン
耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、trpプロ
モーターおよびインターロイキン−２遺伝子を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 5′
   AATTCCAAGTGTTAATATTCCTTAAAA
   ＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴ
   ＧＡ
   ＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣ
   ＴＧ
   ＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧ
   ＣＴ
   ＴＴＴＴＣＴＧＣＡ 3′ で示される塩基配列もしくはプロモーター活性を
   有するその一部を有する組み換えDNA。 ２ 式 5′
   AATTCCAAGTGTTAATATTCCTTAAAA
   ＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴ
   ＧＡ
   ＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣ
   ＴＧ
   ＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧ
   ＣＴ
   ＴＴＴＴＣＴＧＣＡ 3′ で示される塩基配列もしくはプロモーター活性を
   有するその一部の下流にSD配列、およびSD配列
   の下流に目的とする蛋白質をコードする遺伝子を
   含む特許請求の範囲第１項記載の組み換えDNA。 ３ 式 5′
   AATTCCAAGTGTTAATATTCCTTAAAA
   ＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴ
   ＧＡ
   ＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣ
   ＴＧ
   ＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧ
   ＣＴ
   ＴＴＴＴＣＴＧＣＡ 3′ で示される塩基配列もしくはプロモーター活性を
   有するその一部を有する組み換えDNAで形質転
   換させたバチルス属菌。 ４ 式 5′
   AATTCCAAGTGTTAATATTCCTTAAAA
   ＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴ
   ＧＡ
   ＴＡＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣ
   ＴＧ
   ＧＴＡＡＴＴＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧ
   ＣＴ
   ＴＴＴＴＣＴＧＣＡ 3′ で示される塩基配列もしくはプロモーター活性を
   有するその一部の下流にSD配列、およびSD配列
   の下流に目的とする蛋白質をコードする遺伝子を
   含む組み換えDNAで形質転換させた特許請求の
   範囲第３項記載のバチルス属菌。