JPH0466600A - ヒトβ神経成長因子を含む融合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基からなる蛋
白質とヒトβ神経成長因子（β−ＮＧＦ）の融合蛋白質
を提供するものである。更に本発明は、前記当該融合蛋
白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含むプラスミド
、このプラスミドにより形質転換された微生物、この微
生物を培養することからなる前記融合蛋白質又はβ〜Ｎ
ＧＦの製造方法を提供するものである。

（従来の技術） 神経成長因子（ＮＧＦ）は、胎生期の知覚神経節や交換
神経細胞の生存や成長・分化に必要不可欠な蛋白質とし
て古くから知られている（　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、第　６巻、１）２２０３−２２（１９，１９６７年）
。

ＮＧＦは、雄マウス顎下腺に多量に含まれることか知ら
れており、従来このマウスＮＧＦを対象とした研究がＮ
ＧＦ研究の中心となっている。

マウスＮＧＦは、沈降係数か７３．分子量１３］、、５
００ダルトン、α、β、γの各サブユニットがそれぞれ
二分子ずつ含まれる六量体の蛋白質であり、このうちβ
−ＮＧＦのみか生物活性を有することが知られている。

マウスβＮＧＦは、分子量１３，０００ダルトンの、」
１８アミノ酸残基からなる蛋白質であり、通常、沈降係
数２．５８の二量体である（　ＡｎｇｅＩｅｔｔｉ、に
、Ｈ，ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ、　６８巻、ｐ２４１７−２４２０．１９７９
年）。

近年になり、ヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ配列が報
告された（ｔｌｌｌｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、　３０
３巻ｐ８２１−８２５．１．９ｆ１３年）か、このＤＮ
Ａ配列から推定されるアミ、／酸配列はマウスのそれと
９０％相同であり、ｂｏｖ　ｉ口ｅ、ｃｈｉｃｋｅｎ等
とも高い相同性を示すことか明らかとなった。

更には、ＮＧＦか中枢神経系にも微量ながら存在するこ
とが明らかになり（Ｋｏｒｓｃｈｉｎｇ、Ｓ、ら、ＦＭ
ＢＯＪ、　４＠、ｐ１３８９−１３９３．１９８５年）
、前脳基底前のコリナルシックニューロンに脳内ＮＧＦ
が局在している事実はＮＧＦがコリナルシックニューロ
ンに特異的に作用していることを強く示唆している。

近年社会問題となりつつある老人性痴呆症のうち、アル
ツハイマー型老人性痴呆症は、前記のコリナルシックニ
ューロンを中心とした脳の神経細胞の著しい脱落を伴う
痴呆症であり、ＮＧＦをはじめ神経栄養因子との関連が
注目されている。

ＮＧＦを大量に取得することが老人性痴呆症や他の神経
系疾患の予防、治療という見地から興味が持たれている
が、いまだにヒトＮＧＦを高濃度で含ｑする器官（組織
）は報告されておらす、わずかにヒト胎盤からの精製に
成功したとの報告はあるものの、取得量は極めて微量で
あり、コストや精製に要する時間に見合うものではない
。

ＮＧＦのように、極めて微量しか天然には存在しない蛋
白質を大量に取得する方法に、遺伝子下学的な手法があ
る。現に、遺伝子工学によりβＮＧＦを大量に取得する
方法として、特開昭６１−２０５４８５号、特開平１−
２１１４９０号に記載された方法かある。

（従来技術の課題） 特開昭６１−２０５４８５号によれば、β−ＮＧＦをコ
ードするＤＮＡ、それを含むプラスミド等が記載され、
このプラスミドを含有する微生物及び微生物を培養する
ことによるβ−ＮＧＦの製造方法も記載されている。そ
れに対し、特開平１−２１１４９０号に記載された方法
は、β−ＮＧＦのＮ末端側に、トロンビン等の蛋白質分
解酵素の制限部位を介してヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）
を含む融合蛋白質をコードするＤＮＡ等である。時開″
ｖ−１−２１１４９０号の方法は、微生物中で製造され
難いβ−ＮＧＦを、製造され易いｈＧＨの下流（ＤＮＡ
分子における３−側）に位置させることで生産性を向上
させたものである。

特に特開平１−２１１４９０号に記載された方法によれ
ば、β−ＮＧＦを融合蛋白質として大量に取得すること
が可能であり、しかも取得した後には任意の酵素で処理
することでこれら二つの蛋白質を分離出来るため、β−
ＮＧＦを単独で取得する方法に比較して効率的である。

ところで、遺伝子工学的手法に従って微生物でヒトの蛋
白質等の異種蛋白質を製造し、取得しようとする場合に
は、微生物内で当該蛋白質を製造させた後、微生物に由
来する蛋白質等の夾雑物を除去する操作が必要となる。

特に、医薬品としての用途を考慮するならば、前述のよ
うな夾雑物の混在は重要な問題である。

ゲル濾過クロマトグラフィー（以下、ＧＦＣと略称する
）は、イオン交換クロマトグラフィやその他のクロマト
グラフィーに比較して、使用する溶離液は一種類のみで
よく、濃度勾配を必要としないから簡便な操作で実施で
き、しかも高純度精製も可能である等の利点を供えてい
る。従って、β−ＮＧＦの精製においてＧＦＣを適用す
ることか可能であれば、より簡便な操作でβ−ＮＧＦを
提供することが可能となるのである。

ところか、前述の特開平１−２１１４９０号により融合
蛋白質を取得し、後に蛋白質分解酵素でこれを処理した
場合には、当該処理により分目；ｔ１４．ｏ００ダルト
ンのｈＧＨ断片か出現してしまうことがら、ＧＦＣによ
ってはβ−ＮＧＦと分離し難いという課題か生じる。

本発明者らは、β−・ＮＧＦの精製において、ＧＦＣを
適用することがｉｉＪ能であればより簡便に高純度のβ
−ＮＧＦを取得できるという観点がら、β−ＮＧＦを大
量に製造でき、しかもＧＦＣによる精製を可能とするこ
とを目的として研究を行った。

（課題を解決するための手段） 以上の「１的を達成するためになされた本発明は、任意
の蛋白質分解酵素の制限部位を介してＮ末端側にｈＧＨ
のＮ末端から　１３９残基未病のアミノ酸残基からなる
蛋白質、Ｃ末端側にβ−ＮＧＦを含む融合蛋白質であり
、該融合蛋白質をコードするＤＮＡであり、該ＤＮＡを
含み、微生物中で複製可能なプラスミドであり、該プラ
スミドで形質転換された微生物であり、該微生物を培養
することからなる融合蛋白質の製造方法であり、該微生
物を培養し７て融合蛋白質を製造し、任意の蛋白質分解
酵素で処置した後、ｈＧＨのアミノ酸残基からなる蛋白
質とβ−ＮＧＦを分子量の差を利用］、７て分離するこ
とを特徴とするβ−ＮＧＦの製造方法である。以下、本
発明の詳細な説明する。

ｈＧＨは、１９１アミノ酸残基からなる蛋白質であるが
、本発明はＮ末端側から　１３９残基未病のアミノ酸残
基からなる部分がそのＮ末端側に位置する融合蛋白質が
提供される。このｈＧＨの部分（一部分）の分子量が小
さいほど、ＧＦＣによる精製か容易となるため、アミノ
酸残基数は少ないほうか良い。しかし、あまりアミノ酸
残基数を少なくしたものは、微生物中で製造され難いた
め、最低でも３２残基程度以上とすることか好ましい。

微生物中での製造され易さは、そのような蛋白質をコー
ドするＤＮＡの５−側のコドンの様子に依存するため、
ｈＧＨのＮ末端側のアミノ酸をコドするコドンか少ない
と製造され難くなるのである。

ｈＧＨの一部分とβ−ＮＧＦの蛋白質分解酵素の制限部
位は、後に融Ｃイ蛋白質を分解し７てβＮ　Ｇ　Ｆを取
得する際に使用する酵素の制限部位であれば良い。例え
ば後にトロンビンを使用するのであれば、Ｖａｔ−Ｐｒ
ｏ−＾「ｇとのアミノ酸残基の並び、例えばファクター
Ｘａを使用するのであればｌ１ｅＧ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　
ｙ−Ａ　ｒｇとのアミノ酸残基の並び、例えば血栓溶解
剤であるウロキナーゼを使用するのであればＰ　ｒｏ−
Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｒｇとのアミノ酸残基の並びを介して
両者が結合していれば良い。

Ｃ末端側に位置するβ−ＮＧＦは、例えば特開明６１−
２０５４８５号、特開平１−２１１４９０号に記載され
たアミノ酸配列からなるものの他、その一部が他のアミ
ノ酸配列に置換されたというような変異を有するもので
あっても良い。

以上に説明した本発明の融合蛋白質は、そのＮ末端側に
位置したｈＧＨの部分のＮ末端に、メヂオニン（Ｎｅｔ
）が位置していても良い。即ち、遺伝子工学的手法によ
り蛋白質を製造する場合、例えば大腸菌等を宿主とする
と、Ｍｅｔをコードするコドンが翻訳開始を意味するた
めである。従って、Ｎ末端にＮｅｔが位置した場合には
、本発明の融合蛋白質のｈＧＨ部分は最長で１４０残基
、最短で３３残基からなるものとなる。

本発明の融合蛋白質中、トロンビンの制限部位を介して
Ｎ末端側に３２残基のｈＧＨ部分を有し、Ｃ末端側に天
然のアミノ酸配列からなるβ−ＮＧＦを含む融合蛋白質
として、以下の式で示されるものが例示できる。なお、
式で示された融合蛋白質では、ｈＧＩ（のＮ末端にＮｅ
ｔか位置しているため、Ｉ・ロンビンの制限部位（式中
　　で示す）のＮ末端側には、合計Ｓ８のアミノ酸残基
が位置している。

（Ｎ末端） Ｎｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ｍｃｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ　ｌ　ａ−
Ｈｉｓ−ＡｒｇＬｅｕ−Ｈｆｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＣｌｎＧｌｕ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−３ｅｔ−８
ｅｔ−８ｅｒ−１１ｉｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｈｅ−ｔ
（ｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｖ
ａｌＣｙｓ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｖａｌ
−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｓｎ
−Ａｓｎ−８ｅｒ−■ａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｙ
ｓ−Ｃｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ａｓ　ｐ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓ　ｎ
−Ｐ　ｒｏ−Ｖａ　ｌ　−Ａｓ　ｐ−８ｅｒ−Ｇ　ｌ　
ｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−１１ｅ−Ａｓｐ−８
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｈｆｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ
−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−ＧｌｙＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−１ｌｅ−Ａｒｇ−１１ｅ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａ　ｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ａｒｇ （Ｃ末端） 本発明は、以上説明した融合蛋白質をコードするＤＮＡ
を提供する。該ＤＮＡは、ｈＧＨ部分、β−ＮＧＦ部分
及び蛋白質分解酵素の制限部位のアミ２ノ酸配列をコー
ドするもの一〇あればよく、塩基配列に制限はない。こ
のようなりＮＡは、特開平１−２１１４９０号に記載さ
れたプラスミドｐＮＦ−ＴＩを利用（２て取得しても良
いし７、ホスホルアミダイト法を利用するＤＮＡ合成機
を使用して４０−５０塩基ず一つの断片を合成し、後に
これを結合して取得（２でも良い（大塚栄子ら、現代化
学ｌＯ月号、ｐ２４−３０．１９８８年）。

以上のようなりＮＡを３み、微生物中で複製可能なプラ
スミドは、通常の遺伝子Ｔ学的手法により調製すること
が１１能である。このようなプラスミドは、形質転換さ
れた微生物の選別を容易にするため、例λばアンビンリ
ン耐性等を宿主に付与する性質を有することが好ま１７
い。また、通常の遺伝子工学的手法に従えば、容易にこ
のプラスミドで微生物を形質転換することが可能であり
、当該プラスミドを内部に保持する微生物を調製するこ
とが出来る。

融合蛋白質をコードするＤＮＡを、ＤＮＡ配列を発現さ
せるために必要なプロモーター等のＤＮＡ配列と結合さ
せたプラスミドで微生物を形質転換すれば、当該微生物
を培養することで目的の融合蛋白質を取得することが出
来る。取得された融合蛋白質については、例えば特開昭
５９−１６１３２１号等に記載された活性化法を施し、
任意の蛋白質分解酵素で処理し７た後、分子量の差を利
用する精製する方法により精製か可能である。精製方法
としては、限外濾過膜を使用する方法も例示出来るが、
より精度の高いＧＦＣによることが好ましい。

（発明の効果） 本発明の融合蛋白質では、Ｎ末端側に位置するｈＧＨ部
分をβ−ＮＧＦに比較して低分子となるようにしたこと
から、蛋白質分解酵素で処理１７た後にＧＦＣ等の分子
量の差を利用する精製方法により精製操作を実施するこ
とが出来る。この操作によれば微生物に由来する夾雑物
を除去するのと同時に、制限部位を介してＮ末端側に位
置していたｈＧＨ部分をも除去することが可能である。

このことは、β−ＮＧＦの精製において操作が簡便であ
りしかも精度の高いＧＦＣを適用出来ることを意味して
いる。しかも本発明の融合蛋白質は、微生物を用いてβ
−ＮＧＦを単独で製造する場合に比較して大量に取得す
ることか出来る。

以上のように、本発明は将来老人性痴呆症の予防薬、治
療薬として関心を集めているβ−ＮＧＦを、研究用とし
て、又は実用として、安定な純度、低価格にて安定して
供給することを可能とするものである。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

実施例１、 （トロンビン制限部位を含むＤＮＡ断片の合成と精製） 以下に示すオリゴヌクレオチド（ｔｌｉ、ＩＪ２）をホ
スホルアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｊｏｓｙｓｔｅｍｓ　　社製、３ｇ０Ａ型Ｄ
ＮＡ　５ｙｎｔｔ＋ｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。

［Ｊｌ　　５’　ＣＧＡＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＣＣＴ
ＣＣＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧ
ＣＧ　３ ＬＩ２　５°ＴＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧ
ＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＧＣＴＴ
ＡＡ　３各オリゴヌクレオチドは、５°−０１（を保護
したジメトキシトリチル基をつけたままカラムがらアン
モニア水で脱離させ、５５℃で約６時間、塩基の脱保護
を行った。その後、溶媒をエバポレートし、純水に溶解
した。続いて逆相モードでの液体クロマトグーｙ　７　
イー（ＯＤＳ−８０℃Ｍ、４．６＋ｎＬＨ１，Ｄ、ｘ２
５０ｍｍ、東ソー（株）製を使用）によりジメトキシト
リチルオリゴマーを精製した。なお溶出は、０．１Ｍ　
ｌ−リエチルアミンー酢酸緩衝液（ｐＨ７，０）　ノ、
Ｏ−５０９０のアセトニトリルの直線濃度勾配条件で行
った。

アセトニトリル濃度４０％付近に溶出する、目的のジメ
トキシトリチル−オリゴマーを取得し７、エバポレート
した後、残渣に８０％酢酸をｌ　ｍｌ加えて２０分間放
置し、脱ジメトキシトリチルを行った。

更にエバポレートを行い、残渣に純粋５　ｍｌを加えて
溶解した後、等量の酢酸エチルにより二回、抽出操作を
行った。水相をエバポレート後、残渣を純粋Ｉ　ｌｌ１
ｌに溶解し、更に液体クロマトグラフィにより精製を行
った。溶出は、０．１Ｍ）リエチルアミンー酢酸緩衝液
（ｐＨ７，０）の、ｌ　Ｏ−１５％のアセトニトリルの
直線濃度勾配条件で行った。

アセトニトリル濃度１３−１５％付近に溶出する、Ｌ１
的のオリゴマーを取得し２、エバポレートした後、残渣
を純粋１．０１に溶解して精製標品と１２だ。

（発現ベクターｐＮＦ・−ＴＳＩ及び形質転換体Ｅ、ｃ
ｏｌｉＨＢＩＯＩ／Ｉ）ＮＦ−ＴＳＩの調製）特開平１
−２１１４９０号の記載に従って調製Ｉ７た（第１図参
照）プラスミドｐＮＦ−ＴＳＩ　　５μｇを、５ユニツ
トのＮ５ｐ（７５２４）Ｖ　（宝酒造（株）製）で３０
℃条件下２時間処理し、更に５ユニツトのＥｃｏＲｌ（
宝酒造（株）製）で３７℃条件Ｆ２時間処理し、た。

処理後、アガロースゲル電気泳動で分離して約４１００
塩基のバンドを取得し、５１１Ｉ　（７）０．１ＸＴＥ
　　（１ｍＭ　　トリス−塩酸（ｐＨγ５）　、０．１
ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。

先に調製されたＵｌ及びｌｌを３０．２００ユニツトず
つトライアップした後、１０１ｚｌの反応溶ｄ（５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−）旧（ｐＨ８，０）、１０ＩＩＩＭ　Ｍ
ｇＣｌ２．５ｍＭ　ＤＴＴ、ＩｍＭ　ＡＴＰ）中で５ユ
ニツトのＴ４リボヌクレアーゼ（宝酒造（株）製）で３
７℃７℃条件下９間処理り、た後、約３分間９０℃で処
理し、て反応を停市した。

ＵｌとＬｌをｋｉｎａｔｉｏｎしたオリゴヌクレオチド
各約０１０Ｄユニットを混合Ｌ　（１０μｌ　）　、１
０μｍ　（７）ライゲーション・バッファー（３３０ｍ
Ｍ　ＴｒＬｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、　３３ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２，２．５ｍＭ　ＡＴＰ）　、３２．５１１Ｉの
純粋を添加して室温に放置した。更に２５μｌの０．２
Ｍ　２−メルカプトエタノールを添加し、先の約４１０
０塩基のＤＮＡ断片０．５μｇと混合【７、Ｔ４　’Ｄ
ＮＡＬｉｇａｓｅ　３００　Ｕｎｉｔで１６℃にて一夜
処理した。

１００１のＥ、ｃｏｌｌ　８８１０１株　ｃｏｍｐｅｔ
ｅｎｔ　ｃｅｌｌ（−ｉｂ：酒造（株）製）に前記溶液
の１０μｍを添加し、３０分間０℃に保った後、４２℃
で１分間熱処理し、再び０℃で１分間放置して１　ｉｔ
のＬ−ｂｒｏｔｈ液を加え、３７℃で　１時間インキュ
ベートした。　５分間遠心５）離して沈殿を取得１２．
０．３１１１１のＬ−ｂｒｏｔｈ液に懸濁（７た。これ
を０．１１ずツＡｇｅｒ　ｐｌａｔｅ　（ｔｒｉｐｔ。

ｎ　　ＩＯｇ／１．ｙｅａｓｔ　　ｅｘｔｒａｃｔ　　
５ｇ／１．Ｎａｃｌ　　　Ｌｏｇ／ｌ、Ａｇａｒｏｓｅ
　Ｉ５ｇ／ｌ、Ａｍｐｉｃｊｌｌｉｎ　５０ｍｇ／Ｉ　
）に接種した。３７℃条件Ｆで一夜インギュベートした
後、アンピシリンに耐性を示したコロニーのうちプラス
ミドの制限酵素による開裂パターンが合成ｌ、たトロン
ビンの制■部位を含む、予想されたパターンと同一のも
のを選択し、た。この形質転換体を、以下ＨＢ　１０１
　／ｐＮＦ−ＴＳＩと呼ぶ。

（形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／ｐＮＦ−ＴＳ
ｌの培養）前記のようにして取得されたｔ（ＢｉＯ１／
ｐＮＦ−Ｔｓｌを、アンピシリンを５０μｇ／ｌの割合
て含む１００１のり、−ｂｒｏｔｈ液に接種し、３７℃
条件下で培養した。

接種６時間後に、５　ｍｇの３−インドール酢酸（ナカ
ライテスク社製）を添加して、プラスミド中のトリプト
ファンプロモーターを誘導し、更に１２時間培養してβ
−ＮＧＦを製造させた。

培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、その一部に
１１０９６（／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（５ＤＳ
）を加えて９０℃条件下で１０分間処理し７た後、２−
メルカプトエタノールで処理１７．５ＤＳ−ポリアクノ
ルアミド電気泳動により蛋白質を分離１．＝、　、　Ｃ
ＢＢＲ２５０て染色して分子量１８ｋＤａの融合蛋白質
を確認した。染色したゲルをデンントメーター　（島津
製作所製、Ｃ８−９３０型）でバンド定量した結果、培
養菌体の総蛋白量に占める前記の蛋白質は５％であった
。

（β−ＮＧＦを含む融合蛋白質の部分精製）以上の操作
で残った菌体（湿重量１．０ｇ）を、５０１１のＴＥＧ
緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、
２ｍＭ　ＥＤＴ＾、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　）に懸濁し
、４℃にて３０分間超音波破砕処理ｊ−だ。続いて破砕
後溶液を遠心分離して不溶性画分を取得し、特開平１−
２５７４９１号に従−）てｉｉＪ溶化処理を行−フた。

まず、沈殿を５０ｍ１の７Ｍ尿素、０、ＩＭ　　酢酸溶
液に溶解Ｌ５、次に等量の１０％（Ｖ　／　Ｖ　）モノ
エタノールアミンを添加し、遠心により不溶物を除去し
５て」−清を５１の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　（
ｐｔ１８０）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液に透析した。透析
後、不溶物を遠心分離により除去し、１００１の融合蛋
白質を含む蛋白質溶液（蛋白質濃度０．２８ｎ＋ｇ／ｍ
ｌ）を取得した。なお、蛋白質の定量は、ウシ血清アル
ブミン（シグマ社製）を標準蛋白質とし、蛋白質分析用
試薬（バイオラッド社製）を使用して行−った。

（融合蛋白質の蛋白質分躬酵素処理とｖ４製）以上のよ
・うに１７で取得された融合蛋白質を含む蛋白質溶液に
、９８０単位相当のαトロンビン（持ｌ］製薬（株）製
）を加えて３７℃条（１下で１時間処理し、融合蛋白質
中の前記酵素の制限部位を切断した。

反応終了後、溶液に３１．３ｇの硫酸アンモニウムを添
加１２、生じた沈殿を遠心により回収した。

沈殿を２０ｍ１の７Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐ１１６．８）に溶解（−１同溶液で平衝化（〜た陽
イオン交換カラム（ＣＭ−１−ヨバール６５０Ｍ、２５
ｍｍ　１．Ｄ、ｘ　３０ｃｙｍ。

東ソー（株）製）に供１−１：　ｏカラムを同緩衝液で
洗浄し７た後、吸着物を０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む同緩
衝液で溶出させ、フラクションコ１／クターを用いて分
取Ｌ７た。

各フラクションの２０μｍを、２−メルカプトエタノー
ルで処理し、ＳＤＳポリアクリルアミド亀気泳動に供し
たところ、β−ＮＧＦのバンドである　１３ｋＤａのバ
ンドを示す両分は、ｈＧＨ部分に由来する約１ｆｌｉｋ
Ｄａのバンドをも示した。

（分子量の差を利用した精製） 前述の両分のうち、１３ｋＤａのバンドを示した両分を
、７Ｈ尿素を含む５０ａ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８
）で平衝化したゲル濾過クロマトグラフィー用カラム（
Ｇ　２０００　ＳＷ、２１．５℃ｍ　ＩＤ　Ｘ　　３０
ｃｍ、東ソー（株）製）に供した。溶出液の２８ＯｎＩ
１１の吸光度をモニタし、ピークを示した両分について
前記したのと同様にして電気泳動を行った。その結果、
１３ｋＤａのバンドを示す両分中には、他のバンドは出
現しなかった。　　この結果は、陽イオン交換によって
は除去されなかったｈＧＨ部分の蛋白質が、ＧＦＣによ
り除去されていることが分かる。

この分画を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３，５）に対
して一夜透析し、８１の精製β−ＮＧＦ溶液（０，８ｍ
ｇ／■１蛋白質濃度）を取得した。この溶液中の蛋白質
について、Ｎ末端のアミノ酸残基を調査したところ、天
然のβ−ＮＧＦのものと同一であった。

ンである ＡＴＧが位置している。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）任意の蛋白質分解酵素の制限部位を介してＮ末端
   側にヒト成長ホルモンのＮ末端から１３９残基未満のア
   ミノ酸残基からなる蛋白質、Ｃ末端側にヒトβ神経成長
   因子（β−ＮＧＦ）を含む融合蛋白質。
2. （２）ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基がＮ末端から３
   ２残基以上であることを特徴とする請求項１に記載の融
   合蛋白質。
3. （３）ヒト成長ホルモンのアミノ酸残基のＮ末端にメチ
   オニンが位置する請求項１又は２に記載の融合蛋白質。
4. （４）次式のアミノ酸配列からなる請求項３に記載の融
   合蛋白質。 （Ｎ末端） 【遺伝子配列があります。】 （Ｃ末端）
5. （５）請求項１に記載の融合蛋白質をコードする
6. （６）請求項５に記載のＤＮＡを含み、微生物中で複製
   可能なプラスミド。
7. （７）請求項６に記載のプラスミドで形質転換された微
   生物。
8. （８）請求項７に記載の微生物を培養することからなる
   融合蛋白質の製造方法。
9. （９）請求項７に記載の微生物を培養して融合蛋白質を
   製造し、任意の蛋白質分解酵素で処置した後、ヒト成長
   ホルモンのアミノ酸残基からなる蛋白質とβ−ＮＧＦを
   分子量の差を利用して分離することを特徴とするβ−Ｎ
   ＧＦの製造方法。