JPH0649720B2 - A型血友病およびフォン・ビレブランド病治療用FV▲III▼/vWF複合体ならびにその製造方法 - Google Patents
A型血友病およびフォン・ビレブランド病治療用FV▲III▼/vWF複合体ならびにその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は抗A型血友病活性およびフォン・ビレブランド
活性の両者を有するのみならず高純度の治療用FVIII/v
WF複合体およびその製造方法に関する。
活性の両者を有するのみならず高純度の治療用FVIII/v
WF複合体およびその製造方法に関する。
抗A型血友病因子を治療的に使用する観点でかかる因子
を精製する幾つかの方法が既に発表されている:それら
には種々の方法、例えば低温沈澱(cryoprecipitatio
n)、選択沈澱、吸着および分別溶離およびイオン交換
クロマトグラフイがある。
を精製する幾つかの方法が既に発表されている:それら
には種々の方法、例えば低温沈澱(cryoprecipitatio
n)、選択沈澱、吸着および分別溶離およびイオン交換
クロマトグラフイがある。
抗A型血友病活性は、生理学的状態ではFVIII/vWF複合
体の形で、ビレブランド因子(vWFまたはVIIIR:Ag
と命名された)と会合している因子VIII(FVIIIまたは
VIII:Cと命名された)によつて担持されていることが
知られている。
体の形で、ビレブランド因子(vWFまたはVIIIR:Ag
と命名された)と会合している因子VIII(FVIIIまたは
VIII:Cと命名された)によつて担持されていることが
知られている。
最も一般的に知られ、市販されている治療用抗A型血友
病因子の主たる形は: 4℃で新鮮な血漿の凍結融解(thawing)により得られ
る低温沈澱; または2回のポリエチレングリコール沈澱工程後冷却沈
澱から得られる濃縮物 からなる。
病因子の主たる形は: 4℃で新鮮な血漿の凍結融解(thawing)により得られ
る低温沈澱; または2回のポリエチレングリコール沈澱工程後冷却沈
澱から得られる濃縮物 からなる。
これの形の両者に関しては、低温沈澱の濃度(これはフ
イブリノゲンで非常に汚染されている)は5〜10国際
単位(I.U.)/mであり、一方濃縮物については
25I.U./mの値が得られることが知られてい
る。
イブリノゲンで非常に汚染されている)は5〜10国際
単位(I.U.)/mであり、一方濃縮物については
25I.U./mの値が得られることが知られてい
る。
しかしながら、濃縮物について見ると、その濃縮中フォ
ン・ビレブランド因子の大部分は失われ、フォン・ビレ
ブランド病の患者のフォン・ビレブランド因子の欠乏を
回復するのに有効に使用できない程になる。
ン・ビレブランド因子の大部分は失われ、フォン・ビレ
ブランド病の患者のフォン・ビレブランド因子の欠乏を
回復するのに有効に使用できない程になる。
更にそれは低温沈澱よりも純粋な形で得られるけれど
も、濃縮物はなお強度に汚染されている欠点を有し、複
合体は濃縮物の全蛋白質の10%未満を構成するにすぎ
ない。
も、濃縮物はなお強度に汚染されている欠点を有し、複
合体は濃縮物の全蛋白質の10%未満を構成するにすぎ
ない。
高純度の因子VIIIを得ることのできる元の溶液は既に提
案された。かかる溶液は一般に固体キヤリヤ−上に(血
液由来の)FVIII/vWF複合体を固定すること、汚染分子
を洗うこと、次いで高イオン力のセイライン緩衝液(1
MのNaClまたは0.25〜0.5MのCaCl2)を用い複合体の解
離によつて分離した形で凝血促進剤(procoagulant)因
子VIII(FVIII:C)を溶離することの原理に基づいて
いる。初期の複合体は、アミノヘキシル−セフアロース
の如き好適なイオン交換樹脂により(デイ・イー・ジー
・オーステンのブリテイツシユ・ジヤーナル・オブ・ヘ
マトロジイ、1979年、第43巻第669頁)、また
はセフアロースゲルビーズに結合している多クローン抗
体(イー・ジー・デイ・ツデンハムのジヤーナル・オブ
・ラボラトリー・クリニカル・メデシン、1979年、
第93巻第10頁)または単クローン抗体(テイ・エス
・ツインマーマンおよびシー・エー・フルチヤーの米国
特許第4361509号)により、通常上記固体キヤリ
ヤーに固定されている。
案された。かかる溶液は一般に固体キヤリヤ−上に(血
液由来の)FVIII/vWF複合体を固定すること、汚染分子
を洗うこと、次いで高イオン力のセイライン緩衝液(1
MのNaClまたは0.25〜0.5MのCaCl2)を用い複合体の解
離によつて分離した形で凝血促進剤(procoagulant)因
子VIII(FVIII:C)を溶離することの原理に基づいて
いる。初期の複合体は、アミノヘキシル−セフアロース
の如き好適なイオン交換樹脂により(デイ・イー・ジー
・オーステンのブリテイツシユ・ジヤーナル・オブ・ヘ
マトロジイ、1979年、第43巻第669頁)、また
はセフアロースゲルビーズに結合している多クローン抗
体(イー・ジー・デイ・ツデンハムのジヤーナル・オブ
・ラボラトリー・クリニカル・メデシン、1979年、
第93巻第10頁)または単クローン抗体(テイ・エス
・ツインマーマンおよびシー・エー・フルチヤーの米国
特許第4361509号)により、通常上記固体キヤリ
ヤーに固定されている。
しかしながら、溶離中、フォン・ビレブランド因子と抗
体との結合は解離されないこと、およびこのためこれら
の異なる方法で得られる生成物は凝血促進剤因子VIII
(FVIII:C)単独からなること、従つて上記フォン・
ビレブランド因子(vWFまたはVIIIR:Ag)を含有し
ないこと(かかる因子はフォン・ビレブランド病を持つ
人にとつて必要である)、および更にこの方法で分離さ
れたかかる因子VIIIは生理学的な形の下にないこと(こ
れは通常FVIII/vWF複合体であり、この場合フォン・ビ
レブランド因子は上記因子VIIIの輸送体および保護体と
して作用する)ことを知るべきである。事実として、使
用する溶離セイライン緩衝液は、抗原−抗体結合を一般
には解離できない。出願人は、抗原および抗体を解離さ
せるための通常の緩衝液(酸性もしくはカオトロピツク
緩衝液)は因子VIII凝血促進剤活性を破壊することを知
つた。それにも拘わらずデイ・エヌ・フアス等は抗原・
抗体結合を解離することができ、凝血促進剤因子VIII活
性を保有できるかかる緩衝液を発表した。かかる方法は
FVIII/vWFの固定および溶離には使用できなくて、むし
ろ既に解離したVIII:Cに使用された。更にかかる緩衝
液(50%エチレングリコール)は工業的規模のとき、
エチレングリコールの除去のために困難な工程を必要と
し、これによつて著しい生成物の損失を生ぜしめる。
体との結合は解離されないこと、およびこのためこれら
の異なる方法で得られる生成物は凝血促進剤因子VIII
(FVIII:C)単独からなること、従つて上記フォン・
ビレブランド因子(vWFまたはVIIIR:Ag)を含有し
ないこと(かかる因子はフォン・ビレブランド病を持つ
人にとつて必要である)、および更にこの方法で分離さ
れたかかる因子VIIIは生理学的な形の下にないこと(こ
れは通常FVIII/vWF複合体であり、この場合フォン・ビ
レブランド因子は上記因子VIIIの輸送体および保護体と
して作用する)ことを知るべきである。事実として、使
用する溶離セイライン緩衝液は、抗原−抗体結合を一般
には解離できない。出願人は、抗原および抗体を解離さ
せるための通常の緩衝液(酸性もしくはカオトロピツク
緩衝液)は因子VIII凝血促進剤活性を破壊することを知
つた。それにも拘わらずデイ・エヌ・フアス等は抗原・
抗体結合を解離することができ、凝血促進剤因子VIII活
性を保有できるかかる緩衝液を発表した。かかる方法は
FVIII/vWFの固定および溶離には使用できなくて、むし
ろ既に解離したVIII:Cに使用された。更にかかる緩衝
液(50%エチレングリコール)は工業的規模のとき、
エチレングリコールの除去のために困難な工程を必要と
し、これによつて著しい生成物の損失を生ぜしめる。
従つて本発明によれば、フォン・ビレブランド活性が不
充分である濃縮物とは対照的に、そしてフォン・ビレブ
ランド活性を有しない分離されたFVIII:Cとは対照的
に、抗A型血友病活性のみならずフォン・ビレブランド
活性も有する治療用生成物を供給すること; 従つて上述した活性を有するが、濃縮物および低温沈澱
の純度よりも非常に高い純度を有する治療用のかかるF
VIII/vWF複合体を供給すること; 更に濃縮物および低温沈澱の濃度よりも高い因子VIIIの
濃度を有する高純度の治療用のかかるFVIII/vWF複合体
を供給すること; 分離されたFVIII:Cとは対照的に、因子VIIIが輸送体
および保護体として作用するフォン・ビレブランド因子
と結合しているような生理学的分子を供給すること; また濃縮物製造における収率よりも大なる収率で、上述
した特徴を有するFVIII/vWF複合体を得るための方法を
提供すること、そして更にヒト血漿に応用できるかかる
方法を提供することが可能である。
充分である濃縮物とは対照的に、そしてフォン・ビレブ
ランド活性を有しない分離されたFVIII:Cとは対照的
に、抗A型血友病活性のみならずフォン・ビレブランド
活性も有する治療用生成物を供給すること; 従つて上述した活性を有するが、濃縮物および低温沈澱
の純度よりも非常に高い純度を有する治療用のかかるF
VIII/vWF複合体を供給すること; 更に濃縮物および低温沈澱の濃度よりも高い因子VIIIの
濃度を有する高純度の治療用のかかるFVIII/vWF複合体
を供給すること; 分離されたFVIII:Cとは対照的に、因子VIIIが輸送体
および保護体として作用するフォン・ビレブランド因子
と結合しているような生理学的分子を供給すること; また濃縮物製造における収率よりも大なる収率で、上述
した特徴を有するFVIII/vWF複合体を得るための方法を
提供すること、そして更にヒト血漿に応用できるかかる
方法を提供することが可能である。
本発明によれば、この方法は免疫精製の良く知られてい
る原理に基づいている〔蛋白質精製における免疫吸着剤
(イー・ルオスラチ編、Sc.J.Immunol.1976年、補
遣No.3、第1項〜第84項);ヒトインターフエロン
に対する単クローン抗体の特性化およびそのアフィニテ
ィクロマトグラフイでの使用(ステンマン等、J.and Im
munol.Meth.1981年、第46巻、第337頁〜第3
45頁)〕。
る原理に基づいている〔蛋白質精製における免疫吸着剤
(イー・ルオスラチ編、Sc.J.Immunol.1976年、補
遣No.3、第1項〜第84項);ヒトインターフエロン
に対する単クローン抗体の特性化およびそのアフィニテ
ィクロマトグラフイでの使用(ステンマン等、J.and Im
munol.Meth.1981年、第46巻、第337頁〜第3
45頁)〕。
その原理を因子VIIIの個々のケースに応用するとき、因
子VIIIが非常に特殊な方法で挙動すること、即ち例えば
グリシン塩酸塩、酸性pHのアセテート緩衝溶液、KSCNお
よび同様条件の如き免疫精製に通常使用される溶離溶液
中で、凝血促進剤活性を不可逆的に失うことを知らなけ
ればならない。
子VIIIが非常に特殊な方法で挙動すること、即ち例えば
グリシン塩酸塩、酸性pHのアセテート緩衝溶液、KSCNお
よび同様条件の如き免疫精製に通常使用される溶離溶液
中で、凝血促進剤活性を不可逆的に失うことを知らなけ
ればならない。
しかしながら本発明は因子VIIIの凝血促進剤機能および
FVIII/vWF複合体の両方について提案し、従つて、特定
単クローン抗体上へ生理学的媒体中のFVIII/vWF複合体
を固定することを含み、そしてかかるFVIII/vWF複合体
の性質および機能に効果を有せず、FVIII/vWF複合体と
選択した単クローン抗体との間の結合を解離することが
でき、従つてFVIII/vWF複合体を高度に精製した形で収
集できる好適な溶離媒体によつて上記複合体を放出させ
ることを特徴とする方法を提供する。
FVIII/vWF複合体の両方について提案し、従つて、特定
単クローン抗体上へ生理学的媒体中のFVIII/vWF複合体
を固定することを含み、そしてかかるFVIII/vWF複合体
の性質および機能に効果を有せず、FVIII/vWF複合体と
選択した単クローン抗体との間の結合を解離することが
でき、従つてFVIII/vWF複合体を高度に精製した形で収
集できる好適な溶離媒体によつて上記複合体を放出させ
ることを特徴とする方法を提供する。
本発明の別の特徴は: 抗体が固体キヤリヤーに結合している; 単クローン抗体、を生理学的媒体中でFVIII/vWF複合体
を結合し、次いでかかる複合体を溶離媒体中に放出する
ものの中から選択し、抗体自体は変性されず、その生理
学的媒体中へもどした後FVIII/vWF複合体を固定するそ
の能力を回復し、これによつて繰返し精製サイクルを可
能にする; 好ましくは上述した定義に該当する抗体は、FVIII/vWF
複合体で免疫したBALB/cマウス脾細胞およびマウ
ス骨髄腫X63細胞の一連のハイブリツド化後選択した
ハイブリドーマから産生された単クローン抗体である; 溶離媒体はpH8.5〜10.5のアルカリ性溶液の中から選択
する; アルカリ性溶液は次の塩基:NaOH、NH4OH、エタノール
アミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等
の中から選択する。
を結合し、次いでかかる複合体を溶離媒体中に放出する
ものの中から選択し、抗体自体は変性されず、その生理
学的媒体中へもどした後FVIII/vWF複合体を固定するそ
の能力を回復し、これによつて繰返し精製サイクルを可
能にする; 好ましくは上述した定義に該当する抗体は、FVIII/vWF
複合体で免疫したBALB/cマウス脾細胞およびマウ
ス骨髄腫X63細胞の一連のハイブリツド化後選択した
ハイブリドーマから産生された単クローン抗体である; 溶離媒体はpH8.5〜10.5のアルカリ性溶液の中から選択
する; アルカリ性溶液は次の塩基:NaOH、NH4OH、エタノール
アミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等
の中から選択する。
特別の実施態様によれば、抗体の選択は次の三工程で行
なう: 1.抗体抗VIIIR:Ag抗体を滴定板上に固定したフォン
・ビレブランド因子(VIIIR:Ag)および抗マウス免疫
グロブリン山羊抗体(沃素125でラベル付けした)に
より同定する。
なう: 1.抗体抗VIIIR:Ag抗体を滴定板上に固定したフォン
・ビレブランド因子(VIIIR:Ag)および抗マウス免疫
グロブリン山羊抗体(沃素125でラベル付けした)に
より同定する。
2.上述した如く同定した抗VIIIR:Ag抗体をゲル型の
固体粒子にカツプリングし、その後それらを血漿からの
FVIII/vWF複合体に結合し、インビトロで試験したフォ
ン・ビレブランド活性および抗A型血友病因子の減少に
よって、それらの活性について試験する。
固体粒子にカツプリングし、その後それらを血漿からの
FVIII/vWF複合体に結合し、インビトロで試験したフォ
ン・ビレブランド活性および抗A型血友病因子の減少に
よって、それらの活性について試験する。
3.固体粒子とカツプリングし、FVIII/vWF複合体を効
率的に固定できる抗VIIIR:Ag抗体を、アルカリ性媒体
(pH8.5〜10.5)中でFVIII/vWF複合体を放出するそれ
らの能力について試験する。即ち、溶離された抗A型血
友病およびフォン・ビレブランド活性をインビトロで既
知の方法で試験する。
率的に固定できる抗VIIIR:Ag抗体を、アルカリ性媒体
(pH8.5〜10.5)中でFVIII/vWF複合体を放出するそれ
らの能力について試験する。即ち、溶離された抗A型血
友病およびフォン・ビレブランド活性をインビトロで既
知の方法で試験する。
他の特徴によれば、収集したFVIII/vWF複合体は超過
またはアミノヘキシルセフアロースクロマトグラフイの
既知の方法で濃縮できる;この方法はゲル過工程およ
び/または凍結乾燥工程で完了させることができる。
またはアミノヘキシルセフアロースクロマトグラフイの
既知の方法で濃縮できる;この方法はゲル過工程およ
び/または凍結乾燥工程で完了させることができる。
下記実施例は例示として示し、本発明を限定するもので
はない。
はない。
FVIII/vWF複合体で高度免疫したBALB/Cマウスの脾細胞
をポリエチレングリコールによつてマウス骨ずい腫(X
63細胞系)と融合した。抗VIIIR:Ag抗体を生成する
ハイブリドーマを選択し、生成した抗体をセフアロース
4B型の固体粒子とカツプリングして、FVIII/vWF複合
体を固定するそれらの能力、中でもかかる複合体を固定
する能力について正の結果を与える能力、アルカリ性媒
体(pH8.5〜10.5)でFVIII/vWF複合体を放出するそれ
らの適応度について試験し、上記第一試験で固定し、第
二試験につづいて溶離した抗A型血友病およびフォン・
ビレブランド活性を既知の方法でインビトロで試験す
る。
をポリエチレングリコールによつてマウス骨ずい腫(X
63細胞系)と融合した。抗VIIIR:Ag抗体を生成する
ハイブリドーマを選択し、生成した抗体をセフアロース
4B型の固体粒子とカツプリングして、FVIII/vWF複合
体を固定するそれらの能力、中でもかかる複合体を固定
する能力について正の結果を与える能力、アルカリ性媒
体(pH8.5〜10.5)でFVIII/vWF複合体を放出するそれ
らの適応度について試験し、上記第一試験で固定し、第
二試験につづいて溶離した抗A型血友病およびフォン・
ビレブランド活性を既知の方法でインビトロで試験す
る。
上述した如く選択したハイブリドーマによつて作られた
単クローン抗体を、次いで適切な蛋白質媒体中に置き、
セフアロース4B(テキストラン重合体)とカツプリン
グさせる。次いで1のカラムを抗体とカツプリングし
たゲルで充填する。
単クローン抗体を、次いで適切な蛋白質媒体中に置き、
セフアロース4B(テキストラン重合体)とカツプリン
グさせる。次いで1のカラムを抗体とカツプリングし
たゲルで充填する。
塩化ナトリウム0.1Mで平衡化したカラムに、流速0.5
/hrで血漿10を投入する。次いでカラムを2の塩
化ナトリウム0.1Mで洗い、次いで2のトリエタノー
ルアミン100mM(pH9.9)で溶離する。活性成分全体
を1の溶離剤中に集める。そしてそれは約5000I.
U.のフォン・ビレブランド因子および因子VIIIを含有す
る、即ち50%の収率および5I.U./mの濃度を有す
る。この生成物は冷却沈澱よりも100倍も少ない汚染
物を含有し、濃縮物より10倍少ない汚染物を含有する。
/hrで血漿10を投入する。次いでカラムを2の塩
化ナトリウム0.1Mで洗い、次いで2のトリエタノー
ルアミン100mM(pH9.9)で溶離する。活性成分全体
を1の溶離剤中に集める。そしてそれは約5000I.
U.のフォン・ビレブランド因子および因子VIIIを含有す
る、即ち50%の収率および5I.U./mの濃度を有す
る。この生成物は冷却沈澱よりも100倍も少ない汚染
物を含有し、濃縮物より10倍少ない汚染物を含有する。
その比活性は、VIII凝血促進剤活性およびフォン・ビレ
ブランド活性の両方で20I.U./mgに達する。
ブランド活性の両方で20I.U./mgに達する。
蛋白質含有量は非常に少ない(低温沈澱におけるよりも
100倍も少ない)ので、生成物は超過またはアミノ
ヘキシルセフアロースクロマトグラフイによつて25倍
まで(125I.U./m)濃縮できる。溶離緩衝剤として
のトリエタノールアミンの使用は溶離生成物の直接凍結
乾燥を可能にする。この容易性はまた他の揮発性塩基
(NH4OH、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ま
たは同様化合物)を使用するときにも存在する。
100倍も少ない)ので、生成物は超過またはアミノ
ヘキシルセフアロースクロマトグラフイによつて25倍
まで(125I.U./m)濃縮できる。溶離緩衝剤として
のトリエタノールアミンの使用は溶離生成物の直接凍結
乾燥を可能にする。この容易性はまた他の揮発性塩基
(NH4OH、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ま
たは同様化合物)を使用するときにも存在する。
塩化ナトリウム0.1Mで再平衡させたカラムは上述した
如く再び使用でき、同じ結果が得られた。
如く再び使用でき、同じ結果が得られた。
セフアロースの代わりに上述した操作においてセフアク
リル(デキストランおよびアクリルアミド重合体)を使
用したとき、16I.U./mの濃度が得られた。同様にト
リスアクリル(トリスおよびアクリルアミド重合体)の
如き他の同様ゲルを使用できる。
リル(デキストランおよびアクリルアミド重合体)を使
用したとき、16I.U./mの濃度が得られた。同様にト
リスアクリル(トリスおよびアクリルアミド重合体)の
如き他の同様ゲルを使用できる。
この方法で得られた生成物は、少量(4m中500I.
U.)の静脈内注射によりA型血友病およびフォン・ビレ
ブランド病患者において欠乏している活性を回復するの
に特に好適である。
U.)の静脈内注射によりA型血友病およびフォン・ビレ
ブランド病患者において欠乏している活性を回復するの
に特に好適である。
本発明は純粋に説明のためにのみ示したので全く限定す
るためのものでなく、本発明の範囲を逸脱することなく
均等置換によつて有用な改変をなしうることは判るであ
ろう。従つて本発明による方法は低温沈澱からのまたは
FVIII/vWF複合体を含有する他の媒体からのFVIII/vWF
複合体の精製に特に適用できる。
るためのものでなく、本発明の範囲を逸脱することなく
均等置換によつて有用な改変をなしうることは判るであ
ろう。従つて本発明による方法は低温沈澱からのまたは
FVIII/vWF複合体を含有する他の媒体からのFVIII/vWF
複合体の精製に特に適用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4361509(US,A) ケミカルアブストラクト第96巻第19号第 571頁抄録番号第160565Y 「BLOOD」第63巻第6号P.1408〜 1415(1984)(Biological A bstracts vol.78,抄録番号 57028号(1984) 「Dev.Biol.Stand」 (1984),57(Monoclonal A ntibodies)67−76(ケミカルア ブストラクツ第103巻第5号第376頁抄録番 号35829Z号(1985)) 「生化学辞典」東京化学同人発行 (1984.4.10)P.404,1057「血液凝 固▲VIII▼因子」、「フォン・ビルブ ラント因子」の項
Claims (9)
- 【請求項1】高純度のFVIII/vWF複合体を含むA型血友
病およびフォン・ビレブランド病治療剤の製造方法であ
って、 −生理学的媒体中のFVIII/vWF複合体を、該複合体に対
するアフィニティが生理学的媒体中では強く、pH8.5
〜10.5のアルカリ性媒体中では弱い特異的単クロー
ン抗体に固定し、 −選択した単クローン抗体とFVIII/vWF複合体との結合
を、pH8.5〜10.5のアルカリ性溶離媒体を用いて
解離させて、該複合体を放出させ、次いで −該複合体を、因子VIII凝血促進活性およびフォン・ビ
レブランド活性の両方が約20I.U./mgタンパク質以上
の高純度の形態で回収することを特徴とする方法。 - 【請求項2】抗体が固体キャリヤに結合している請求項
1記載の方法。 - 【請求項3】同じ単クローン抗体を、数サイクルで使用
する請求項1または2記載の方法。 - 【請求項4】単クローン抗体が、マウスX63骨髄腫細
胞と、FVIII/vWF複合体で免疫したBALB/cマウス
との脾細胞との融合後、選択したハイブリドーマから得
られたものである、請求項1〜3のいずれか1項記載の
方法。 - 【請求項5】溶離媒体組成物中に含まれる塩基が、NH
4OH、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリ
エタノールアミンおよび同等の化合物よりなる群から選
択される揮発性塩基である請求項1記載の方法。 - 【請求項6】免疫学的に精製したFVIII/vWF複合体を、
次いで凍結乾燥する請求項1〜5のいずれか1項記載の
方法。 - 【請求項7】更に、超濾過またはアミノヘキシルセファ
ロースクロマトグラフィによる濃縮工程を含む請求項1
〜6のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項8】更に、ゲル濾過工程を含む請求項1〜7の
いずれか1項記載の方法。 - 【請求項9】因子VIII凝血促進活性およびフォン・ビレ
ブランド活性の両方が約20I.U./mgタンパク質以上の
高純度のFVIII/vWF複合体を含むことを特徴とするA型
血友病およびフォン・ビレブランド病治療剤。
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