JPH06107700A - Ｆ ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体吸着のための免疫吸着材 - Google Patents
Ｆ ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体吸着のための免疫吸着材Info
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- JPH06107700A JPH06107700A JP5072978A JP7297893A JPH06107700A JP H06107700 A JPH06107700 A JP H06107700A JP 5072978 A JP5072978 A JP 5072978A JP 7297893 A JP7297893 A JP 7297893A JP H06107700 A JPH06107700 A JP H06107700A
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
- F16L—PIPES; JOINTS OR FITTINGS FOR PIPES; SUPPORTS FOR PIPES, CABLES OR PROTECTIVE TUBING; MEANS FOR THERMAL INSULATION IN GENERAL
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- F16L55/26—Pigs or moles, i.e. devices movable in a pipe or conduit with or without self-contained propulsion means
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- H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
- H04N5/00—Details of television systems
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- H04N5/92—Transformation of the television signal for recording, e.g. modulation, frequency changing; Inverse transformation for playback
- H04N5/9201—Transformation of the television signal for recording, e.g. modulation, frequency changing; Inverse transformation for playback involving the multiplexing of an additional signal and the video signal
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
(57)【要約】
【構成】 抗VIIIＲ：Ａｇ単クローン抗体を担持する固
体キャリアからなる免疫吸着材であって、該単クローン
抗体が、マウスｘ６３骨髄腫細胞と、F VIII／vWF 複合
体で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞との融合後、
選択されたハイブリドーマから産生され、VIIIＲ：Ａｇ
に対するアフィニティが生理学的媒体中で強く、pH８．
５〜１０．５の間で弱いことを特徴とするF VIII／vWF
複合体吸着用免疫吸着材。 【効果】 該免疫吸着材は、生理学的媒体中のF VIII／
vWF 複合体を該複合体の機能に影響を及ぼさずに回収す
ることができ、因子VIII凝血促進活性およびフォン・ビ
レブランド活性の両方を有する高純度の治療用F VIII／
vWF 複合体の製造を可能にする。
体キャリアからなる免疫吸着材であって、該単クローン
抗体が、マウスｘ６３骨髄腫細胞と、F VIII／vWF 複合
体で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞との融合後、
選択されたハイブリドーマから産生され、VIIIＲ：Ａｇ
に対するアフィニティが生理学的媒体中で強く、pH８．
５〜１０．５の間で弱いことを特徴とするF VIII／vWF
複合体吸着用免疫吸着材。 【効果】 該免疫吸着材は、生理学的媒体中のF VIII／
vWF 複合体を該複合体の機能に影響を及ぼさずに回収す
ることができ、因子VIII凝血促進活性およびフォン・ビ
レブランド活性の両方を有する高純度の治療用F VIII／
vWF 複合体の製造を可能にする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗Ａ型血友病活性およ
びフォン・ビレブランド活性の両方を有する、高純度の
治療用F VIII／vWF 複合体の製造に用いられる免疫吸着
材に関する。
びフォン・ビレブランド活性の両方を有する、高純度の
治療用F VIII／vWF 複合体の製造に用いられる免疫吸着
材に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗Ａ型血友病因子を治療用に使用する観
点で、かかる因子を製造するいくつかの方法が既に発表
されている。それらには種々の方法、例えば、低温沈殿
（cryoprecipitation)、選択沈殿、吸着および分別溶離
とイオン交換クロマトグラフィがある。
点で、かかる因子を製造するいくつかの方法が既に発表
されている。それらには種々の方法、例えば、低温沈殿
（cryoprecipitation)、選択沈殿、吸着および分別溶離
とイオン交換クロマトグラフィがある。
【０００３】抗Ａ型血友病活性は、生理学的状態ではF
VIII／vWF 複合体の形で、フォン・ビレブランド因子
（ｖＷＦまたはVIIIＲ：Ａｇと命名された）と会合して
いる因子VIII（F VIIIまたはVIIIＲ：Ｃと命名された）
によって保持されていることが知られている。
VIII／vWF 複合体の形で、フォン・ビレブランド因子
（ｖＷＦまたはVIIIＲ：Ａｇと命名された）と会合して
いる因子VIII（F VIIIまたはVIIIＲ：Ｃと命名された）
によって保持されていることが知られている。
【０００４】最も一般的に知られ、市販されている治療
用抗Ａ型血友病因子の主たる形は： −４℃で新鮮な血漿の凍結融解により得られる低温沈
殿；または −２回のポリエチレングリコール沈殿工程後、冷却沈殿
から得られる濃縮物 からなる。この形の両者に関しては、低温沈殿の濃度
（これはフィブリノーゲンで非常に汚染されている）は
５〜１０国際単位（I.U.）/ml であり、一方、濃縮物に
ついては２５I.U./ml の値が得られることが知られてい
る。
用抗Ａ型血友病因子の主たる形は： −４℃で新鮮な血漿の凍結融解により得られる低温沈
殿；または −２回のポリエチレングリコール沈殿工程後、冷却沈殿
から得られる濃縮物 からなる。この形の両者に関しては、低温沈殿の濃度
（これはフィブリノーゲンで非常に汚染されている）は
５〜１０国際単位（I.U.）/ml であり、一方、濃縮物に
ついては２５I.U./ml の値が得られることが知られてい
る。
【０００５】しかしながら、濃縮物についてみると、そ
の濃縮中フォン・ビレブランド因子の大部分は失われ、
フォン・ビレブランド病の患者のフォン・ビレブランド
因子の欠乏を回復するのに有効に使用できないほどにな
る。さらにそれは低温沈殿よりも純粋な形で得られるけ
れども、濃縮物はなお強度に汚染されている欠点を有
し、複合体は濃縮物の全タンパク質の１０％未満を構成
するにすぎない。
の濃縮中フォン・ビレブランド因子の大部分は失われ、
フォン・ビレブランド病の患者のフォン・ビレブランド
因子の欠乏を回復するのに有効に使用できないほどにな
る。さらにそれは低温沈殿よりも純粋な形で得られるけ
れども、濃縮物はなお強度に汚染されている欠点を有
し、複合体は濃縮物の全タンパク質の１０％未満を構成
するにすぎない。
【０００６】高純度の因子VIIIを得ることのできる元の
溶液は既に提案された。かかる溶液は一般に固体キャリ
ア上に（血液由来の）F VIII／vWF 複合体を固定するこ
と、汚染分子を洗うこと、次いで高イオン力のセイライ
ン緩衝液（１M のNaClまたは０．２５〜０．５M の CaC
l2）を用い、該複合体の解離によって分離した形で凝血
促進（procoagulant) 因子VIII（VIII：Ｃ）を溶離する
ことの原理に基づいている。初期の複合体は、アミノヘ
キシル−セファロースの如き好適なイオン交換樹脂によ
り（D.G.E. Austin, British J. of Haematol., 1979,
vol.43, p.669）、またはセファロースゲルビーズに結
合しているポリクローナル抗体（E.G.D.Tuddenham et a
l., J. of Laboratory Clin. Med., 1979, vol.93, p.1
0）又は単クローン抗体（T.S. Zimmermann and C.A. Fu
lcher、 1982、 米国特許第４，３６１，５０９号明細
書）により、通常上記固体キャリアに固定されている。
溶液は既に提案された。かかる溶液は一般に固体キャリ
ア上に（血液由来の）F VIII／vWF 複合体を固定するこ
と、汚染分子を洗うこと、次いで高イオン力のセイライ
ン緩衝液（１M のNaClまたは０．２５〜０．５M の CaC
l2）を用い、該複合体の解離によって分離した形で凝血
促進（procoagulant) 因子VIII（VIII：Ｃ）を溶離する
ことの原理に基づいている。初期の複合体は、アミノヘ
キシル−セファロースの如き好適なイオン交換樹脂によ
り（D.G.E. Austin, British J. of Haematol., 1979,
vol.43, p.669）、またはセファロースゲルビーズに結
合しているポリクローナル抗体（E.G.D.Tuddenham et a
l., J. of Laboratory Clin. Med., 1979, vol.93, p.1
0）又は単クローン抗体（T.S. Zimmermann and C.A. Fu
lcher、 1982、 米国特許第４，３６１，５０９号明細
書）により、通常上記固体キャリアに固定されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、溶離
中、フォン・ビレブランド因子と抗体との結合は解離さ
れないこと、およびこのためこれらの異なる方法で得ら
れる生成物は凝血促進因子VIII（VIII：Ｃ）単独からな
ること、したがって上記フォン・ビレブランド因子（ｖ
ＷＦまたはVIIIＲ：Ａｇ）を含有しないこと（かかる因
子はフォン・ビレブランド病を持つ人にとって必要であ
る）、およびさらにこの方法で分離されたかかる因子VI
IIは生理学的な形の下にないこと（これは通常F VIII／
vWF 複合体であり、この場合、フォン・ビレブランド因
子は上記因子VIIIの輸送体および保護体として作用す
る）ことを知るべきである。
中、フォン・ビレブランド因子と抗体との結合は解離さ
れないこと、およびこのためこれらの異なる方法で得ら
れる生成物は凝血促進因子VIII（VIII：Ｃ）単独からな
ること、したがって上記フォン・ビレブランド因子（ｖ
ＷＦまたはVIIIＲ：Ａｇ）を含有しないこと（かかる因
子はフォン・ビレブランド病を持つ人にとって必要であ
る）、およびさらにこの方法で分離されたかかる因子VI
IIは生理学的な形の下にないこと（これは通常F VIII／
vWF 複合体であり、この場合、フォン・ビレブランド因
子は上記因子VIIIの輸送体および保護体として作用す
る）ことを知るべきである。
【０００８】事実として、使用する溶離用セイライン緩
衝液は、抗原−抗体結合を一般には解離できない。本発
明者は、抗原および抗体を解離させるための通常の緩衝
液（酸性もしくはカオトロピック緩衝液）は凝血促進因
子VIII活性を破壊することを知った。それにもかかわら
ずD.N. Fass らは抗原−抗体結合を解離することがで
き、凝血促進因子VIII活性を保有できるかかる緩衝液を
発表した。かかる方法はF VIII／vWF の固定および溶離
には使用できなくて、むしろ既に解離したVIII：Ｃに使
用された。さらにかかる緩衝液（５０％エチレングリコ
ール）は工業的規模の時、エチレングリコールの除去の
ために困難な工程を必要とし、これによって著しい生成
物の損失を生ぜしめる。
衝液は、抗原−抗体結合を一般には解離できない。本発
明者は、抗原および抗体を解離させるための通常の緩衝
液（酸性もしくはカオトロピック緩衝液）は凝血促進因
子VIII活性を破壊することを知った。それにもかかわら
ずD.N. Fass らは抗原−抗体結合を解離することがで
き、凝血促進因子VIII活性を保有できるかかる緩衝液を
発表した。かかる方法はF VIII／vWF の固定および溶離
には使用できなくて、むしろ既に解離したVIII：Ｃに使
用された。さらにかかる緩衝液（５０％エチレングリコ
ール）は工業的規模の時、エチレングリコールの除去の
ために困難な工程を必要とし、これによって著しい生成
物の損失を生ぜしめる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の免疫吸着材は、
VIIIＲ：Ａｇに対するアフニティが生理学的媒体中で強
く、pH８．５〜１０．５の間で弱い、抗VIIIＲ：Ａｇ単
クローン抗体によりFVIII／vWF 複合体を固定するの
で、pH８．５〜１０．５の溶離媒体による溶離によっ
て、F VIII／vWF 複合体を抗体から放出させることがで
きる。
VIIIＲ：Ａｇに対するアフニティが生理学的媒体中で強
く、pH８．５〜１０．５の間で弱い、抗VIIIＲ：Ａｇ単
クローン抗体によりFVIII／vWF 複合体を固定するの
で、pH８．５〜１０．５の溶離媒体による溶離によっ
て、F VIII／vWF 複合体を抗体から放出させることがで
きる。
【００１０】したがって、本発明の免疫吸着材によれ
ば、 −フォン・ビレブランド活性が不充分である濃縮物とは
対照的に、そしてフォン・ビレブランド活性を有しない
分離されたVIII：Ｃとは対照的に、抗Ａ型血友病活性の
みならずフォン・ビレブランド活性も有する治療用生成
物を供給すること； −したがって上述した活性を有するが、濃縮物および低
温沈殿の純度よりも非常に高い純度を有する治療用のか
かるF VIII／vWF 複合体を供給すること； −分離されたVIII：Ｃとは対照的に、因子VIIIが輸送体
および保護体として作用するフォン・ビレブランド因子
と結合しているような生理学的分子を供給すること； −また濃縮物製造における収率よりも大なる収率で、上
述した特徴を有するF VIII／vWF 複合体を得るための方
法を提供すること、そしてさらにヒト血漿に応用できる
かかる方法を提供することが可能である。
ば、 −フォン・ビレブランド活性が不充分である濃縮物とは
対照的に、そしてフォン・ビレブランド活性を有しない
分離されたVIII：Ｃとは対照的に、抗Ａ型血友病活性の
みならずフォン・ビレブランド活性も有する治療用生成
物を供給すること； −したがって上述した活性を有するが、濃縮物および低
温沈殿の純度よりも非常に高い純度を有する治療用のか
かるF VIII／vWF 複合体を供給すること； −分離されたVIII：Ｃとは対照的に、因子VIIIが輸送体
および保護体として作用するフォン・ビレブランド因子
と結合しているような生理学的分子を供給すること； −また濃縮物製造における収率よりも大なる収率で、上
述した特徴を有するF VIII／vWF 複合体を得るための方
法を提供すること、そしてさらにヒト血漿に応用できる
かかる方法を提供することが可能である。
【００１１】本発明の免疫吸着材を使用する方法は、免
疫精製のよく知られている原理に基づいている（タンパ
ク質精製における免疫吸着材（E. Ruoslahti編、Sc. J.
Immunol., 1976, 補遺No.3, pp.1-84 ）; ヒトインタ
ーフェロンに対する単クローン抗体の特性化およびその
アフィニティクロマトグラフィでの使用（Stenman 等、
J. Immunol. Meth. 1981, vol.46, pp.337-345) ）。そ
の原理を因子VIIIの個々のケースに応用するとき、因子
VIIIが非常に特殊な方法で挙動すること、すなわち、例
えば、グリシン塩酸塩、酸性pHのアセテート緩衝溶液、
ＫＳＣＮおよび同様条件の如き免疫精製に通常使用され
る溶離溶液中で、凝血促進剤活性を不可逆的に失うこと
を知らなければならない。
疫精製のよく知られている原理に基づいている（タンパ
ク質精製における免疫吸着材（E. Ruoslahti編、Sc. J.
Immunol., 1976, 補遺No.3, pp.1-84 ）; ヒトインタ
ーフェロンに対する単クローン抗体の特性化およびその
アフィニティクロマトグラフィでの使用（Stenman 等、
J. Immunol. Meth. 1981, vol.46, pp.337-345) ）。そ
の原理を因子VIIIの個々のケースに応用するとき、因子
VIIIが非常に特殊な方法で挙動すること、すなわち、例
えば、グリシン塩酸塩、酸性pHのアセテート緩衝溶液、
ＫＳＣＮおよび同様条件の如き免疫精製に通常使用され
る溶離溶液中で、凝血促進剤活性を不可逆的に失うこと
を知らなければならない。
【００１２】しかしながら、本発明は、VIIIＲ：Ａｇに
対するアフィニティが、生理学的媒体中で強く、pH８．
５〜１０．５の間で弱い単クローン抗体を担持する固体
キャリアからなる免疫吸着材であって、該抗体上に生理
学的媒体中のF VIII／vWF 複合体を固定し、次いで該抗
体とF VIII／vWF 複合体との結合を、該複合体の機能に
影響を及ぼさずに解離させ得る好適な溶離溶媒を用い
て、該複合体を放出させることができ、それにより因子
VIII凝血促進活性およびフォン・ビレブランド活性が約
２０I.U./mg に達し得る高純度の形態で治療用F VIII／
vWF 複合体を製造することを可能にするものである。
対するアフィニティが、生理学的媒体中で強く、pH８．
５〜１０．５の間で弱い単クローン抗体を担持する固体
キャリアからなる免疫吸着材であって、該抗体上に生理
学的媒体中のF VIII／vWF 複合体を固定し、次いで該抗
体とF VIII／vWF 複合体との結合を、該複合体の機能に
影響を及ぼさずに解離させ得る好適な溶離溶媒を用い
て、該複合体を放出させることができ、それにより因子
VIII凝血促進活性およびフォン・ビレブランド活性が約
２０I.U./mg に達し得る高純度の形態で治療用F VIII／
vWF 複合体を製造することを可能にするものである。
【００１３】本発明の別の特徴は： −抗体が固体キャリアに結合している； −単クローン抗体を、生理学的媒体中でF VIII／vWF 複
合体を結合し、ついでかかる複合体を溶離媒体中に放出
するものの中から選択し、抗体自体は変性されず、その
生理学的媒体中へ戻した後F VIII／vWF 複合体を固定す
るその能力を回復し、それにより繰り返し精製サイクル
を可能にする； −好ましくは上述した定義に該当する抗体は、F VIII／
vWF 複合体で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞および
マウス骨髄腫ｘ６３細胞の融合後、選択したハイブリド
ーマから産生される単クローン抗体である； −溶離媒体はpH８．５〜１０．５のアルカリ性溶液の中
から選択する； −アルカリ性溶液は、次の塩基：NaOH、 NH4OH、エタノ
ールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミ
ン等の中から選択する。
合体を結合し、ついでかかる複合体を溶離媒体中に放出
するものの中から選択し、抗体自体は変性されず、その
生理学的媒体中へ戻した後F VIII／vWF 複合体を固定す
るその能力を回復し、それにより繰り返し精製サイクル
を可能にする； −好ましくは上述した定義に該当する抗体は、F VIII／
vWF 複合体で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞および
マウス骨髄腫ｘ６３細胞の融合後、選択したハイブリド
ーマから産生される単クローン抗体である； −溶離媒体はpH８．５〜１０．５のアルカリ性溶液の中
から選択する； −アルカリ性溶液は、次の塩基：NaOH、 NH4OH、エタノ
ールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミ
ン等の中から選択する。
【００１４】特別の実施態様によれば、抗体の選択は次
の三工程で行う： １．抗VIIIＲ：Ａｇ抗体を、滴定板上に固定したフォン
・ビレブランド因子（VIIIＲ：Ａｇ）および抗マウス免
疫グロブリンヤギ抗体（Ｉ125 でラベル付けした）によ
り同定する。 ２．上述した如く同定した抗VIIIＲ：Ａｇ抗体をゲル型
の固体粒子にカップリングし、その後それらを血漿から
のF VIII／vWF 複合体に結合し、インビトロで試験した
フォン・ビレブランド活性および抗Ａ型血友病因子の減
少によって、それらの活性について試験する。 ３．固体粒子とカップリングし、F VIII／vWF 複合体を
効率的に固定できる抗VIIIＲ：Ａｇ抗体を、アルカリ性
媒体（pH８．５〜１０．５）中でF VIII／vWF 複合体を
放出するそれらの能力について試験する。すなわち、溶
離された抗Ａ型血友病活性およびフォン・ビレブランド
活性を既知の方法で試験する。
の三工程で行う： １．抗VIIIＲ：Ａｇ抗体を、滴定板上に固定したフォン
・ビレブランド因子（VIIIＲ：Ａｇ）および抗マウス免
疫グロブリンヤギ抗体（Ｉ125 でラベル付けした）によ
り同定する。 ２．上述した如く同定した抗VIIIＲ：Ａｇ抗体をゲル型
の固体粒子にカップリングし、その後それらを血漿から
のF VIII／vWF 複合体に結合し、インビトロで試験した
フォン・ビレブランド活性および抗Ａ型血友病因子の減
少によって、それらの活性について試験する。 ３．固体粒子とカップリングし、F VIII／vWF 複合体を
効率的に固定できる抗VIIIＲ：Ａｇ抗体を、アルカリ性
媒体（pH８．５〜１０．５）中でF VIII／vWF 複合体を
放出するそれらの能力について試験する。すなわち、溶
離された抗Ａ型血友病活性およびフォン・ビレブランド
活性を既知の方法で試験する。
【００１５】本発明の免疫吸着材を用いて回収したF VI
II／vWF 複合体は、さらに超濾過またはアミノヘキシル
セファロースクロマトグラフィの既知の方法で濃縮でき
る；この方法はゲル濾過工程および／または凍結乾燥工
程で完了させることができる。
II／vWF 複合体は、さらに超濾過またはアミノヘキシル
セファロースクロマトグラフィの既知の方法で濃縮でき
る；この方法はゲル濾過工程および／または凍結乾燥工
程で完了させることができる。
【００１６】
【実施例】下記実施例は例示として示し、本発明を限定
するものではない。F VIII／vWF 複合体で高度免疫した
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞をポリエチレングリコール
によってマウス骨髄種（ｘ６３細胞系）と融合させた。
抗VIIIＲ：Ａｇ抗体を生成するハイブリドーマを選択
し、生成した抗体をセファロース４Ｂ型の固体粒子とカ
ップリングして、F VIII／vWF 複合体を固定するそれら
の能力、中でもかかる複合体を固定する能力について正
の結果を与える能力、アルカリ性媒体（pH８．５〜１
０．５）でF VIII／vWF 複合体を放出するそれらの適応
度について試験し、上記第一試験で固定し、第二試験に
続いて溶離した抗Ａ型血友病活性およびフォン・ビレブ
ランド活性を既知の方法でインビトロで試験する。
するものではない。F VIII／vWF 複合体で高度免疫した
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞をポリエチレングリコール
によってマウス骨髄種（ｘ６３細胞系）と融合させた。
抗VIIIＲ：Ａｇ抗体を生成するハイブリドーマを選択
し、生成した抗体をセファロース４Ｂ型の固体粒子とカ
ップリングして、F VIII／vWF 複合体を固定するそれら
の能力、中でもかかる複合体を固定する能力について正
の結果を与える能力、アルカリ性媒体（pH８．５〜１
０．５）でF VIII／vWF 複合体を放出するそれらの適応
度について試験し、上記第一試験で固定し、第二試験に
続いて溶離した抗Ａ型血友病活性およびフォン・ビレブ
ランド活性を既知の方法でインビトロで試験する。
【００１７】上述した如く選択したハイブリドーマによ
って産生された単クローン抗体を、次いで適切なタンパ
ク質媒体の存在下、セファロース４Ｂ（デキストラン重
合体）とカップリングさせる。次いで１Ｌのカラムを抗
体とカップリングしたゲルで充填する。
って産生された単クローン抗体を、次いで適切なタンパ
ク質媒体の存在下、セファロース４Ｂ（デキストラン重
合体）とカップリングさせる。次いで１Ｌのカラムを抗
体とカップリングしたゲルで充填する。
【００１８】０．１M 塩化ナトリウムで平衡化したカラ
ムに、流速０．５Ｌ/hr で血漿１０Ｌを投入する。次い
でカラムを２Ｌの０．１M 塩化ナトリウムで洗い、次い
で２Ｌの１００mMトリエタノールアミン（pH９．９）で
溶離する。活性成分全体を１Ｌの溶離剤中に集める。そ
してそれは約５０００I.U.のフォン・ビレブランド因子
および因子VIIIを含有する、すなわち５０％の収率およ
び５I.U./ml の濃度を有する。この生成物は冷却沈殿よ
りも１００倍も少ない汚染物を含有し、濃縮物より１０
倍少ない汚染物を含有する。
ムに、流速０．５Ｌ/hr で血漿１０Ｌを投入する。次い
でカラムを２Ｌの０．１M 塩化ナトリウムで洗い、次い
で２Ｌの１００mMトリエタノールアミン（pH９．９）で
溶離する。活性成分全体を１Ｌの溶離剤中に集める。そ
してそれは約５０００I.U.のフォン・ビレブランド因子
および因子VIIIを含有する、すなわち５０％の収率およ
び５I.U./ml の濃度を有する。この生成物は冷却沈殿よ
りも１００倍も少ない汚染物を含有し、濃縮物より１０
倍少ない汚染物を含有する。
【００１９】その比活性は、因子VIII凝血促進活性およ
びフォン・ビレブランド活性の両方で２０I.U./mg に達
する。タンパク質含有量は非常に少ない（低温沈殿にお
けるよりも１００倍も少ない）ので、生成物は超濾過ま
たはアミノヘキシルセファロースクロマトグラフィによ
って２５倍まで（１２５I.U./ml ）濃縮できる。溶離緩
衝剤としてのトリエタノールアミンの使用は、溶離生成
物の直接凍結乾燥を可能にする。この容易性はまた他の
揮発性塩基（NH4OH 、エタノールアミン、ジエタノール
アミン、または同様化合物）を使用するときにも存在す
る。
びフォン・ビレブランド活性の両方で２０I.U./mg に達
する。タンパク質含有量は非常に少ない（低温沈殿にお
けるよりも１００倍も少ない）ので、生成物は超濾過ま
たはアミノヘキシルセファロースクロマトグラフィによ
って２５倍まで（１２５I.U./ml ）濃縮できる。溶離緩
衝剤としてのトリエタノールアミンの使用は、溶離生成
物の直接凍結乾燥を可能にする。この容易性はまた他の
揮発性塩基（NH4OH 、エタノールアミン、ジエタノール
アミン、または同様化合物）を使用するときにも存在す
る。
【００２０】０．１M 塩化ナトリウムで再平衡させたカ
ラムは上述した如く再び使用でき、同じ結果が得られ
た。
ラムは上述した如く再び使用でき、同じ結果が得られ
た。
【００２１】セファロースの代わりに上述した操作にお
いてセファクリル（デキストランおよびアクリルアミド
重合体）を使用したとき、１６I.U./ml の濃度が得られ
た。同様にトリスアクリル（トリスおよびアクリルアミ
ド重合体）の如き他の同様ゲルを使用できる。
いてセファクリル（デキストランおよびアクリルアミド
重合体）を使用したとき、１６I.U./ml の濃度が得られ
た。同様にトリスアクリル（トリスおよびアクリルアミ
ド重合体）の如き他の同様ゲルを使用できる。
【００２２】この方法で得られた生成物は、少量（４ml
中、５００I.U.）の静脈内注射によりＡ型血友病および
フォン・ビレブランド病患者において欠乏している活性
を回復するのに特に好適である。
中、５００I.U.）の静脈内注射によりＡ型血友病および
フォン・ビレブランド病患者において欠乏している活性
を回復するのに特に好適である。
【００２３】本発明は、純粋に説明のためにのみ示した
ので全く限定するためのものでなく、本発明の範囲を逸
脱することなく均等置換によって有用な改変をなしうる
ことはわかるであろう。
ので全く限定するためのものでなく、本発明の範囲を逸
脱することなく均等置換によって有用な改変をなしうる
ことはわかるであろう。
【００２４】
【発明の効果】本発明の免疫吸着材は、低温沈殿からの
またはF VIII／vWF 複合体を含有する他の媒体からのF
VIII／vWF 複合体の精製に特に適用できる。
またはF VIII／vWF 複合体を含有する他の媒体からのF
VIII／vWF 複合体の精製に特に適用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デレズ，マリレーヌ フランス，13010−マルセーユ，ブールバ ール ポール−クラウド 248 ’ル オ ービーブ’−バーデ (72)発明者 ヘルト，ベンサン フランス，26110−ニオンズ，ラ マダド ルリイ （番地なし)
Claims (3)
- 【請求項１】 抗VIIIＲ：Ａｇ単クローン抗体を担持す
る固体キャリアからなる免疫吸着材であって、該単クロ
ーン抗体が、 −マウスｘ６３骨髄腫細胞と、F VIII／vWF 複合体で免
疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞との融合後、選択さ
れたハイブリドーマから産生され、 −VIIIＲ：Ａｇに対するアフィニティが生理学的媒体中
で強く、pH８．５〜１０．５の間で弱い、 ことを特徴とするF VIII/vWF複合体吸着用免疫吸着材。 - 【請求項２】 固体キャリアが、ゲルである請求項１記
載の免疫吸着材。 - 【請求項３】 単クローン抗体が、好適なタンパク質媒
体の存在下で、固体キャリアに担持された請求項１記載
の免疫吸着材。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8414480 | 1984-09-18 | ||
| FR8414480A FR2570276B1 (fr) | 1984-09-18 | 1984-09-18 | Procede d'obtention du complexe fviii/vwf a usage therapeutique et produits en resultant |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60504092A Division JPH0649720B2 (ja) | 1984-09-18 | 1985-09-17 | Ａ型血友病およびフォン・ビレブランド病治療用ＦＶ▲ＩＩＩ▼／ｖＷＦ複合体ならびにその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06107700A true JPH06107700A (ja) | 1994-04-19 |
| JPH06102680B2 JPH06102680B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=9307917
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60504092A Expired - Lifetime JPH0649720B2 (ja) | 1984-09-18 | 1985-09-17 | Ａ型血友病およびフォン・ビレブランド病治療用ＦＶ▲ＩＩＩ▼／ｖＷＦ複合体ならびにその製造方法 |
| JP5072978A Expired - Lifetime JPH06102680B2 (ja) | 1984-09-18 | 1993-03-08 | Ｆ ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体吸着のための免疫吸着材 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60504092A Expired - Lifetime JPH0649720B2 (ja) | 1984-09-18 | 1985-09-17 | Ａ型血友病およびフォン・ビレブランド病治療用ＦＶ▲ＩＩＩ▼／ｖＷＦ複合体ならびにその製造方法 |
Country Status (9)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0179006B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0649720B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3584817D1 (ja) |
| ES (1) | ES8700568A1 (ja) |
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| US8597910B1 (en) | 1985-04-11 | 2013-12-03 | Children's Medical Center Corporation | DNA encoding Von Willebrand Factor (VWF) and methods and cells for producing VFW, and VFW produced by the DNA, methods and cells |
| DE3707213A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung von faktor viii:c-mangelplasma und ein so erhaltenes mangelplasma |
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| US5110907A (en) * | 1989-08-01 | 1992-05-05 | Alpha Therapeutic Corporation | Factor viii complex purification using heparin affinity chromatography |
| JPH0427865A (ja) * | 1989-12-21 | 1992-01-30 | Kurita Water Ind Ltd | 血液凝固因子用分離剤およびその製造方法 |
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| AT403992B (de) * | 1991-02-22 | 1998-07-27 | Head Sport Ag | Ski |
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| AT403765B (de) | 1996-04-12 | 1998-05-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer präparation enthaltend einen hochgereinigten komplex |
| AT406867B (de) | 1997-02-27 | 2000-10-25 | Immuno Ag | Verfahren zur gewinnung von hochreinem vwf oder faktor viii/vwf-komplex |
| US20060068454A1 (en) * | 2004-09-27 | 2006-03-30 | Sysmex Corporation | Method of inactivating blood coagulation factor and blood coagulation factor-inactivated sample |
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|---|---|---|---|---|
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-
1984
- 1984-09-18 FR FR8414480A patent/FR2570276B1/fr not_active Expired
-
1985
- 1985-09-17 CA CA000490954A patent/CA1257211A/fr not_active Expired
- 1985-09-17 AT AT85430031T patent/ATE69955T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-09-17 DE DE8585430031T patent/DE3584817D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-17 JP JP60504092A patent/JPH0649720B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-17 ES ES547051A patent/ES8700568A1/es not_active Expired
- 1985-09-17 WO PCT/FR1985/000250 patent/WO1986001718A1/fr unknown
- 1985-09-17 EP EP85430031A patent/EP0179006B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-18 US US06/777,335 patent/US4670543A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-03-08 JP JP5072978A patent/JPH06102680B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| ES8700568A1 (es) | 1986-10-16 |
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