JPS6112631A - 免疫グロブリンｇ分子のプロテインａへの結合方法 - Google Patents

免疫グロブリンｇ分子のプロテインａへの結合方法

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JPS6112631A
JPS6112631A JP60135808A JP13580885A JPS6112631A JP S6112631 A JPS6112631 A JP S6112631A JP 60135808 A JP60135808 A JP 60135808A JP 13580885 A JP13580885 A JP 13580885A JP S6112631 A JPS6112631 A JP S6112631A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫グロフ］リンの固定化方法に関し、特ζこ
プロティンＡに結合させることによる免疫グロブリン〔
ン（以下１ｇＧと略称することがある）の固定化方法に
関する。このような結合は分析的及び調製的（ｐｒｅｐ
ａｒａ　ｔｏｒｙ）免疫学技術において、ある範囲の有
用性を有し、腹水液から抗体、特にモノクロナール抗体
を精製する際に特に重要である。
〔（メ（来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕
プロテインＡがｔｇＧ分子のＦｃ部分に結合する能力は
、アフィニティ　クロマトグラフィーによる他の蛋白后
からのＩｇＧの分離の基礎原理として広く用いられてい
る。この種の分離においては、プ１コテ・イン△は通席
、アガロースの如き固体相支持体に架橋することにより
固定され、供試試料が、混合物中の他の蛋白質の結合を
嫌う緩衝剤中に溶液として供給され、次いで免疫グロブ
リンが異なる組成の緩衝剤を用・いる溶Ｉｉｌ！操作に
より固体相から回収される。しかしながら、上述の方法
によって達成される分離は完全とは言い難いものである
。
ある種の抗体をプロティンＡに結合させるという初期の
開示は、クロンパル等（Ｋｒｏｎｖａｌｌ　ｅｔ　ａｌ
）、ジャーナル　オブ　イミュノロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ釦匹匹旦■）第１０５巻第５号１１１６頁り１
９７０年）に見られる。この分離を改良する試みはマノ
ケンジー等（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ　ｅｔ　ａｌ）によっ
てなされ、ジャーナル　オブ　イミュノロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆ　Ｔｍｍｕｎｏｌｏ　　）第１２０巻第５
号１４９３頁（１９７８年）には低ｐＨにおいて連続的
に上昇するＮａ５ＣＮ勾配が溶離用緩衝剤として、プロ
ティンへ−セファロース４Ｂカラムに関して用いられる
ことが開示されている。しかし、この結合はＩｇＧ１及
びＩｇ　Ｇ２に関して低く、再現性がないことがち明し
ている。
一定の低い塩濃度においてｐＨを段階的に減少させるこ
とを更に含有する、溶離操作がアイ等（Ｅｙ　ｅｔａｌ
）　、イミ１ノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１５
巻４２９頁（１９７８年）に開示されているが、この方
法ではＩｇＧＨの実質的な量が次のフラクション中に流
出することが判明しており、この方法も再現性がない。
ツヤロン等（Ｃｈａｌｏｎ　ｅｔ　ａｔ）は、スカンジ
ナビアン　ツヤ−ナル　オブ　イミュノロジー（Ｓｃａ
ｎｄ、。
、）−製卯銀−ｏ−ｆ　−彫則ｏｊ、！Ｏｇｚχ第９巻
３５９頁（１９７９年）において、ホスフェート−緩衝
化塩溶液中に１１１１７．３において混合物を溶解し、
次いでｉ’Ｊ　／＆ヲ同−１ｄ’ｔ！ｉ剤でｆ　ｆ？ｊ
化したプロティンＡ−セファロース４Ｂ含有カラム中に
導入することにより種々のＩＢＧをＩｇＡ及びＩｇＭか
ら分離するごとに部分的に成功している。この方法にお
いて緩衝剤を変化さセずに２つのピークが現れ、第２の
ピークが殆どのＩｇＧ１　を含有する溶離物に対するも
のであり、収率は３１％〜７３％である。
また種々のＴＲＧのプロティンＡ−セファロース４′Ｂ
を用いる精製のた。めの１６種の溶離液がパイゲッター
等（Ｂｙｗｔｅｒ　ｅｔ　ａ、Ｉ）によ；て研究され、
ジャーナル　オブ　イミュノロジカル　メソソヅ（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ−ｎｏ　１ｃａｌ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ）第６４巻１頁（１９８３年）に報告されてい
るが、前述の方法をしのく分離率及び収率の向上か、供
試試料のいずれにおいても観察されていない。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者等は、一般的にＩｇＧに対するプロティンへの
結合親和性が、塩濃度が０．５モル／β以上であると実
質的に増加することを見い出した。このような効果はプ
ロティンＡを上述の選択された濃度の塩溶液で平衡化さ
せることにより及び／又は免疫グロブリン混合物を上述
の塩溶液に溶解させることにより達成される。
生じる非常に強固な結合は、これらの免疫グロブリン類
を、例えｂｉ腹水液に通常存在するような他の蛋白質か
ら分離するのに特に有用である。
〔好ましい態様の記述〕 本発明は入手源に関係な（一般にＩｇＧに適用さメ７．
イｌか　本発明”の目的のために好ましい＋ｇｃはマウ
スＩ８＋；ｌ　、　Ｉ８に２１及び１ｇＧ２１＋Ｔ：％
る。目的種（Ｌｈｃ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　１ｎｔｅ
ｒｅｓｔ）が分離される蛋白質は他の免疫グＩＪプリン
例えばＩＢＭ及びＩｇＥ、及び他の蛋白質イ列えばアル
ブミンである。これらの蛋白質のプロテインＡに対する
結合親和性はＩｇＧのそれよりもはるかに小さいことが
知られている。
水性媒体中で可溶性の無機塩ならばいずれも使用できる
が、その例としてアルカリ金属−及びアルカリ土類金属
−ハライド及び−スルフェートが挙げられる。アンモニ
ウムのような正に荷電したイオンを」二連の金属のイオ
ンの代わりに置き換えても良い。この塩は、免疫グロブ
リン、プロティンＡ又ＧオプロテインＡが結合される支
持体との反応性を有しないものでなければならない。塩
の濃度は約０．５モルから溶解度限度まで変動し得るが
、好ましくは約１．０モル−約４．０モルである。溶液
の蔽密なｐ）Ｉは臨界的ではなく、はぼ中性から弱アル
カリ性までの範囲内で広く変動させることができる。従
って、ｐｌｌは約７．０又はそれ以上、好ましくは約８
．５〜約９．５である。
上記の塩を緩衝剤溶液の一部として用いるのが好ましく
、緩衝効果は塩それ自体によって又は混合物中の他成分
よって生み出される。慣用されている緩衝剤も用いられ
、これらは所望のｐＨを達成するために適切に選択され
る。
固定化目的のために、プロティンＡは、アフィニティ　
りロマトグラフィー　カラムの充填剤の如き固体支持体
に架橋させることにより結合される。プロティンＡが結
合する固体支持体の例としてはポリアクリルアミド、セ
ルロース及びアガロース等が挙げられ、アガロースが一
般に好ましい。
本発明の方法をアフィニティ　りロマトグラフィーにお
ける分離を高めるために用いる場合には、カラム充填物
を高い塩濃度の緩衝剤溶液で繰り返し洗浄することによ
り平衡化し、また供試試料混合物をカラムに導入する前
に同一の緩衝剤溶液で希釈するのが好ましい。希釈化度
は広範囲に変動させることができるが、約１／１〜約１
／２０の範囲の希釈化度が好ましい。緩衝剤溶液がカラ
ムを通過すると、非結合蛋白質が緩衝剤溶液とともに運
ばれ、これにより非結合蛋白質と結合免疫グロブリンが
分離される。免疫グロブリンの回収は、好ましくは約２
．０〜約５．０、より好ましくは約２゜５〜約４．０　
（７）ＩＩｌｌを有する６！！緩衝剤で溶離させること
により行われる。
カラムの性質は臨界的ではなく、開放カラムから加圧カ
ラムに至るまで広範囲に変化させることができる。本発
明において固有の強固な結合は開放カラムを用いても効
果的な分離が行われることを可能にする。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本
発明を限定するものではない。
実施例１ 標準ホ〕４フェートー緩衝化塩溶液（０，０１０モル　
リン酸ナトリウム、０．１５モル　塩化ナトリウム、ｐ
Ｈ８，２）を含む一連の結合用緩衝剤溶液を並行試験の
ために調製した。分離カラムは、直径約１ｃｍ、高さ約
２ｃｍ５容積１ｍｌの使い捨てタイプの開放カラムであ
り、この中にはアフィーゲル（Ａｆｆ　ｉ〜Ｇｅ１）プ
ロティンＡ〔米国カリフォルニア州すソチモンドのバイ
オ−ラット　ラボラトリーズ　インコーポレイテノドの
製品であり、アミド結合によりアガロース　ビーズに架
橋結合されている精製プロティンＡである〕が完膚され
ている。
それぞれの試験のために充填カラムに、このカラムの床
体積の５倍量の結合用緩衝剤を０．５ｍｌ／分の流速で
流すことにより、゛充填カラムを平衡化させた。Ｍ及び
Ｎ血液群決定子（デターミナント）を保有するヒト赤血
球膜であるグリコフォリンＡに対して指向されるＩｇＧ
１　モノクロナール抗体（９Ａ　３）を含有するマウス
腹水液の試料は、５Ｐ２１０骨髄腫細胞と、同形（ホモ
）接合の血液群Ｍ及びＮからのヒト赤血球の混合物で免
疫化された牌臓細胞とから誘導されるハイブリトーマか
ら得られた。この試料を結合用緩衝剤で１７１０に希釈
し、アフィーゲル　プロティンＡ　　１ｍｌ当たり総蛋
白質が１０ｍｇになるような体積でカラムに適用した。
次いで、カラムを、カラムの床体積の１０倍の量の結合
用緩衝剤で洗浄した。
免疫グリコホリンを、ｐＨ３において２、カラムの床体
積の；３倍の星の１．０モル　クエン酸ナトリウムによ
ってカラムから熔離し、ｆ４離物を２８０ｎｍにおける
紫外吸収度により゛分析した。回収率（アガロース−プ
ロティンＡ上の結合率に相当する）が、免疫グしＩソリ
ンｍｇ／ｍ１当たり１．４吸収単位の吸光係数値（免疫
グロブリンを結合させるために過剰のカラムバッキング
を用いる標準試験によって決定された値である）を基礎
にして決定され、１（１０％の結合率が初期溶離物のゲ
ル濾過分析により＊認された。・ 結果を表１に示すが、この表から、試験された各結合用
緩衝剤は、ホスフェート−緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）
をしのぐ妨果を示すことが明らかである。
表！・ 各種の結合用緩衝剤を用いる、９Ａ３　（ＩｇＧ１　）
のアフィーゲル　プロティンＡに対する結合力猪金里緩
血剋　　　　　　　輩査聚」笈しＬＭ（ＮＨ４）　２　
ＳＯ４ｐＨ９，０１（１０１阿（ＮＨａ）　２　ＳＯ４
ｐＨ８，５８４１Ｍ（ＮＨａ）　２　ＳＯ４ｐＨ８，０
７６１Ｍ（ＮＨａ）　２　ＳＯ４ｐＨ７，０７１０，５
Ｍ（ＮＨ４）　２５Ｏ４ｐＨ９，０３４ＰＢＳ　　　　
　　　　ｐＨ８，２１６実施例２ 一連の異なるＩｇＧ型のモノクロナール抗体に対して単
一の結合用緩衝剤を用いた以外は実施例１の試験方法を
繰り返した。結合用緩衝剤は１モル（ＮＨ４’）　２　
ＳＯ４（ｐＨ９，０）であった。抗体は全て５Ｐ２１０
ｆｌｌｉ腫細胞からのものであり、実施例１の９Ａ３；
グリコホリンＡに対するＩｇＧ１抗体てオ）るＩ（ｌＦ
’７；未知特異性のｒｇｃｌ　であるＤＣＭＢ；未知特
異性のｒｇｃ２ａ″？：あるＨＯＰＣ−Ｉ；及び未知特
異性のＩｇＧ２ｂであるＴ４〜１からなる。それぞれの
場合の結合率がｐｌ＋８．２のボスフヱートー緩１（Ｉ
化塩溶液（ＰＢＳ）の使用によって　゛達成されど）結
合率と比較された。結果は表Ｈに示！書が１、二のλ″
から、そＩｑ、それのＪＪ合において８Ａ１１？’な改
良が認められた。
表　　■ ！１のｌ　ｇ　Ｇ　ｍ　体のアフィーゲル　プロティン
Ａに対ずろ結合力 ＩａＧｌ　　（９Ａ３）　　　　　　　　　　　Ｉ　　
６　　　　　　　　　　　　１　０　０ＩＩ！に１　（
ＩＯＦ７）　　　　　１５　　　　　１（１０ＩｇＣ；
１　（ＤＣＭＢ）　　　　　　０　　　　　１（１０Ｉ
ＲＱ２１０１０ＰＣ−１）　　　　９２　　　　　　’
１（１０ＩｇＧ２１）（Ｔ４−１）　　　　　５０　　
　　　１（１０上の記述は本発明を説明するためのもの
であり、上記の物質及び方法工程についての数多くの改
良及び改変も本発明の範囲に含まれることは当業者には
明らかである。
〔発明の効果〕
本発明の免疫グロブリンＧのプロティンＡへの結合方法
は、免疫グロブリンＧ分子をプロテインＡと強固に結合
させることができ、そのため、例えば腹水液から免疫グ
ロブリンＧ分子を分離するのに特に有用なものである。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）免疫グロブリンＧ分子を、少なくとも約０．５モ
    ルの濃度の不活性無機塩の水溶液の存在下にプロテイン
    Ａと接触させる工程を含むことを特徴とする免疫グロブ
    リンＧ分子のプロテインＡへの結合方法。
  2. （２）前記の水溶液が少なくとも約７．０のｐＨにおい
    て緩衝剤を更に含有する、特許請求の範囲第（１）項記
    載の方法。
  3. （３）前記の水溶液が約８．５〜約９．５のｐＨにおい
    て緩衝剤を更に含有する、特許請求の範囲第（１）項記
    載の方法。
  4. （４）前記の塩がアンモニウム−　アルカリ金属−、及
    びアルカリ土類金属−ハライド並びにアンモニウム−、
    アルカリ金属−、及びアルカリ土類金属−スルフェート
    からなる群から選択される、特許請求の範囲第（１）項
    記載の方法。
  5. （５）前記のプロテインＡがアガロースと架橋されてい
    る、特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
  6. （６）マウスＩｇＧ＿１、ＩｇＧ＿２＿ａ及びＩｇＧ＿
    ２＿ｂからなる群から選択される免疫グロブリン分子を
    、プロテインＡとアガロースとの錯体に結合させる方法
    において、前記の免疫グロブリン分子を、約１．０モル
    〜約４．０モルの濃度と約８．５〜約９．５のｐＨにお
    いて塩化ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる群か
    ら選択される塩の緩衝剤水溶液の存在下にプロテインＡ
    と接触させる工程を含むことを特徴とする前記の方法。
  7. （７）免疫グロブリンＧ分子を他の蛋白質を含む混合物
    から単離する方法において、 （ａ）少なくとも約０．５モルの濃度を有する不活性無
    機塩の水溶液の存在下に、前記の混合物を、固体支持体
    上に固定されたプロテインＡを含む固体相を有するアフ
    ィニティクロマトグラフィーカラム中に通液させて前記
    の免疫グロブリンＧ分子を前記のプロテインＡに選択的
    に結合させ、次いで （ｂ）酸緩衝剤溶液を前記のカラム中に通液させること
    により前記のプロテインＡから免疫グロブリンＧ分子を
    解離させる 諸工程を含むことを特徴とする前記の方法。
  8. （８）工程（ａ）の前に前記の固体相を前記の水溶液で
    平衡化させることを更に含む特許請求の範囲第（７）項
    記載の方法。
  9. （９）前記の水溶液が少なくとも約７．０のｐＨにおい
    て緩衝剤を更に含有する、特許請求の範囲第（７）項記
    載の方法。
  10. （１０）前記の水溶液が約８．５〜約９．５のｐＨにお
    いて緩衝剤を更に含有する、特許請求の範囲第（７）項
    記載の方法。
  11. （１１）前記の塩がアンモニウム−、アルカリ金属−、
    及びアルカリ土類金属−ハライド並びにアンモニウム−
    、アルカリ金属−、及びアルカリ土類金属−スルフェー
    トからなる群から選択される、特許請求の範囲第（７）
    項記載の方法。
  12. （１２）前記の酸緩衝剤溶液のｐＨが約２．０〜約５．
    ０である、特許請求の範囲第（７）項記載の方法。
  13. （１３）前記の酸緩衝剤溶液のｐＨが約２．５〜約４．
    ０である、特許請求の範囲第（７）項記載の方法。
  14. （１４）前記の固体支持体がアガロースである、特許請
    求の範囲第（７）項記載の方法。
  15. （１５）腹水液から免疫グロブリンＧ分子を単離する方
    法において、該方法が、 （ａ）アガロース支持体に架橋されたプロテインＡを含
    む固体相を有するアフィニティクロマトグラフィーカラ
    ムを、約１．０モル〜約４．０モルの濃度と約８．５〜
    約９．５のｐＨにおいて塩化ナトリウム及び硫酸アンモ
    ニウムからなる群から選択される塩の緩衝剤水溶液で平
    衡化し、 （ｂ）前記の腹水液を更に別の量の前記の緩衝剤水溶液
    と混合して約１／１〜約１／２０に希釈された溶液を形
    成し、 （ｃ）この希釈された溶液を前記の固体相に適用して前
    記の免疫グロブリンＧ分子を前記のプロテインＡに選択
    的に結合させ、前記の腹水液の残余のものを通過させ、 （ｄ）約２．５〜約４．０のｐＨにおいて酸緩衝剤溶液
    を前記のカラム中に通液することにより前記の免疫グロ
    ブリンＧ分子を前記のプロテインＡから解離させ、 （ｅ）前記の免疫グロブリンＧ分子を回収する諸工程を
    含むことを特徴とする前記の方法。
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