JPH0543719B2 - - Google Patents
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- JPH0543719B2 JPH0543719B2 JP3109760A JP10976091A JPH0543719B2 JP H0543719 B2 JPH0543719 B2 JP H0543719B2 JP 3109760 A JP3109760 A JP 3109760A JP 10976091 A JP10976091 A JP 10976091A JP H0543719 B2 JPH0543719 B2 JP H0543719B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】 本発明は免疫グロブリン
G分子の単離方法に関し、詳しくは、免疫グロブ
リンG分子を、アガロース支持体に架橋されたプ
ロテインAに選択的に結合させた後に溶離する、
免疫グロブリンG(以下IgGを略称することがあ
る)分子の単離方法に関する。このような単離は
分析的及び調製的(preparatory)免疫学技術に
おいて、有用性を有する。 【0002】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテインAがIgG分子のFc部分に結合する能
力は、アフイニテイ クロマトグラフイーによる
他の蛋白質からのIgG分子の単離の基礎原理とし
て広く用いられている。この種の単離において
は、プロテインAは通常、アガロースの如き固体
相支持体に架橋することにより固定され、供試試
料が、混合物中の他の蛋白質の結合を嫌う緩衝剤
中に溶液として供給され、次いで免疫グロブリン
が異なる組成の緩衝剤を用いる溶離操作により固
体相から回収される。しかしながら、上述の方法
によつて達成される単離は完全とは言い難いもの
である。 【0003】 ある種の抗体をプロテインAに結合さ
せるという初期の開示は、クロンバル等
(Kronvall et al)、ジヤーナル オブ イミユノ
ロジー((Journal ofImmunology)第105巻第5
号1116頁(1970年)に見られる。この分離を改良
する試みはマツケンジー等(Mackenzie et al)
によつてなされ、ジヤーナル オブ イミユノロ
ジー((Journal of Immunology)第120巻第5
号1493頁(1978年)には低PHにおいて連続的に上
昇するNaSCN勾配が、溶離用緩衝剤としてプロ
テインA−セフアロース4Bカラムに関して用い
られることが開示されている。しかし、この結合
はIgG1及びIgG2に関して低く、再現性がないこ
とが判明している。 【0004】 一定の低い塩濃度においてPHを段階的
に減少させることを特徴とする溶離操作がアイ等
(Ey et al)、イミユノロジー(Immunology)第
15巻429頁(1978年)に開示されているが、この
方法ではIgG1の実質的な量が次のフラクシヨン
中に流出することが判明しており、この方法も再
現性がない。 【0005】 シヤロン等(Chalon et al)は、スカ
ンジナビアン ジヤーナル オブ イミユノロジ
ー(Scand.Jouranal of Immunology)第9巻
359頁(1979年)において、ホスフエート−緩衝
化塩溶液中にPH7.3において混合物を溶解し、次
いで溶液を同一緩衝剤で平衡化したプロテインA
−セフアロース4B含有カラム中に導入すること
により種々のIgGをIgA及びIgMから分離するこ
とに部分的に成功している。この方法において緩
衝剤を変化させずに2つのピークが現れ、第2の
ピークが殆どのIgG1を含有する溶離物に対する
ものであり、収率は31%〜73%である。 【0006】 また種々のIgGのプロテインA−セフ
アロース4Bを用いる精製のための16種の溶離液
がバイワツター等(Bywter et al)によつて研
究され、ジヤーナル オブ イミユノロジカル
メソツヅ(Jouranal of Immu−nogical
Methods)第64巻1頁(1983年)に報告されてい
るが、前述の方法をしのぐ単離率及び収率の向上
が、供試試料のいずれにおいても観察されていな
い。 【0007】 従つて、本発明の目的は、実用上充分
な単離率及び収率で免疫グロブリンG分子を単離
する方法を提供することにある。 【0008】 【課題を解決するための手段】 本発明者等は、
上記目的を達成すべく、鋭意研究した結果、IgG
分子とプロテインAとの結合親和性が、アガロー
ス支持体に架橋されたプロテインAを含む固体層
に対してIgG分子を特定の塩濃度と特定のPHを有
する、特定の塩の緩衝剤水溶液中で接触させるこ
とにより実質的に増加し、かつ上記プロテインA
に結合したIgG分子が特定のPHの酸緩衝剤水溶液
中に効率的に溶離することを知見した。 【0009】 本発明は上記知見に基づいてなされた
もので、腹水液から免疫グロブリンG分子を単離
する方法において、 (a) アガロース支持体に架橋されたプロテインA
を含む固体相を有するアフイニテイ クロマトグ
ラフイー カラムを、1.0モル〜4.0Mの塩濃度と
8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナトリウム及び硫酸
アンモニウムからなる群から選択される塩の緩衝
剤水溶液で平衡化し、 (b) 前記の腹水液を更に別の量の前記の緩衝剤水
溶液と混合して1/1〜1/20に希釈された溶液
を形成し、 (c) この希釈された溶液を前記の固体相に接触さ
せて前記の免疫グロブリンG分子を前記のプロテ
インAに選択的に結合させ、前記の腹水液の残余
のものを通過させ、 (d) 2.5〜4.0のPHの酸緩衝剤水溶液を前記のカラ
ム中に通液することにより前記の免疫グロブリン
G分子を前記のプロテインAから溶離させ、 (e) 前記の免疫グロブリンG分子を回収する 諸工程を含むことを特徴とする免疫グロブリンG
分子の単離方法を提供するものである。 【0010】 本発明は入手源に関係なく一般にIgG
に適用されるが、本発明の目的のために好ましい
IgGはマウスIgG1、Ig2a及びIgG2bである。本発明
の免疫グロブリンG分子の単離方法は、目的種
(the species of interest)を、他の免疫グロブ
リン例えばIgM及びIgE、及びアルブミン等の他
の蛋白質が含まれる腹水液から、良好な単離率及
び収率で単離できるものである。これらの蛋白質
のプロテインAに対する結合親和性はIgG分子の
それよりもはるかに小さいことが知られており、
免疫グロブリンGとアガロース支持体に架橋され
たプロテインAとの結合は高い選択性がある。 【0011】 本発明で用いられる塩類は、免疫グロ
ブリンG、プロテインA、及びプロテインAが結
合されるアガロース支持体の何れに対しても反応
性を有しないものである。 また、本発明で用いられる酸緩衝剤水溶液として
は、上記塩類と同様に、免疫グロブリンG、プロ
テインA、及びプロテインAが結合されるアガロ
ース支持体の何れに対しても反応性を有しないも
のであれば特に限定はないが、クエン酸ナトリウ
ム水溶液が好ましい。 【0012】 本発明の方法は、アフイニテイ クロ
マトグラフイーにおける分離を高めるために用い
られ、カラム充填物である、アガロース支持体に
架橋されやプロテインAを前記塩濃度及び前記PH
の塩化ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる
群から選択される塩の緩衝剤水溶液で繰り返し洗
浄することにより平衡化し、また供試試料混合物
をカラムに導入する前に同一の緩衝剤水溶液で希
釈する。希釈化度は1/1〜1/20の範囲であ
る。上記の供試試料を希釈した緩衝剤水溶液がカ
ラムを通過すると免疫グロブリンG分子は上記ア
ガロース支持体に架橋されたプロテインAと選択
的に結合して固定化され、一方、免疫グロブリン
G以外の他の蛋白質はほとんど結合しないため緩
衝剤水溶液とともに流れ去り、これにより他の蛋
白質から免疫グロブリンG分子が分離される。免
疫グロブリンG分子の回収は、2.5〜4.0のPHを有
する酸緩衝剤水溶液でアガロース支持体に架橋さ
れたプロテインA上に固定された免疫グロブリン
G分子を溶離させることにより行われる。 【0013】 カラムの性質は臨界的ではなく、開放
カラムから加圧カラムに至るまで広範囲に変化さ
せることができる。本発明において固有の強固な
結合は開放カラムを用いても効果的な単離を可能
にする。 【0014】 以下の実施例は本発明を説明するため
のものであり、本発明を限定するものではない。 【0015】 【実施例】 実施例 1 標準ホスフエート−緩衝化塩溶液(0.010M リ
ン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、PH
8.2)を含む一連の結合用緩衝剤水溶液を並行試
験のために調製した。分離カラムは、直径約1
cm、高さ約2cm、容積1mlの使い捨てタイプの開
放カラムであり、この中にはアフイーゲル(Affi
−Gel)プロテインA〔米国カリフオルニア州リ
ツチモンドのバイオーラツド ラボラトリーズ
インコーポレイテツドの製品であり、アミド結合
によりアガロース ビーズに架橋結合されている
精製プロテインAである〕を充填した。 【0016】 それぞれの試験のために充填カラム
に、このカラムの床体積の5倍量の結合用緩衝剤
水溶液を0.5ml/分の流速で流すことにより、充
填カラムを平衡化させた。M及びN血液群決定子
(デターミナント)を保有するヒト赤血球膜であ
るグリコフオリンAに対して指向されるIgG1モ
ノクロナール抗体(9A3)を含有するマウス腹水
液の試料は、SP2/0骨髄腫細胞と、同形(ホ
モ)接合の血液群M及びNからのヒト赤血球の混
合物で免疫化された脾臓細胞とから誘導されるハ
イブリドーマから得られた。この試料を結合用緩
衝剤水溶液で1/10に希釈し、アフイーゲル プ
ロテインA 1ml当たり総蛋白質が10mgになるよ
うな体積でカラムに接触させた。次いで、カラム
を、カラムの床体積の10倍の量の結合用緩衝剤水
溶液で洗浄した。 【0017】 上記免疫グロブリンを、PH3におい
て、カラムの床体積の3倍の量の1.0Mクエン酸
ナトリウム水溶液によつてカラムから溶離し、溶
離物を280nmにおける紫外吸光度により分析し
た。回収率(アガロース−プロテインAへの結合
率に相当する)は、免疫グロブリンmg/ml当たり
14吸収単位の吸光係数値(免疫グロブリンG分子
を結合させるために過剰のカラムパツキングを用
いる標準試験によつて決定された値である)に基
づいて決定された。100%の結合率は初期溶離物
のゲル濾過分析により確認された。 【0018】 結果を表1に示すが、この表から、試
験された各結合用緩衝剤水溶液は、ホスフエート
−緩衝化塩溶液(PBS)をしのぐ効果を示すこ
とが明らかである。又、結合用緩衝剤水溶液が低
い場合やPHが低い場合と比較しても、本発明の効
果は高いものであつた。 【0019】 ■■■ 亀の甲 [0071] ■■■ 【0020】 実施例 2 一連の異なるIgG型のモノクロナール抗体に対し
て単一の結合用緩衝剤水溶液を用いた以外は実施
例1の試験方法を繰り返した。結合用緩衝剤水溶
液は1M(NH4)2SO4(PH9.0)であつた。抗体は全
てSP2/0骨髄腫細胞からのものであり、実施例
1の9A3;グリコフオリンAに対するIgG1抗体で
ある10F7;未知特異性のIgG1であるDCMB;未
知特異性のIgG2aであるHOPC−1;及び未知特
異性のIgG2bであるT4−1からなる。それぞれの
場合の結合率がPH8.2のホスフエート−緩衝化塩
溶液(PBS)の使用によつて達成される結合率
と比較された。結果は表2に示すが、この表か
ら、それぞれの場合において明瞭な改良が認めら
れた。 【0021】 ■■■ 亀の甲 [0072] ■■■ 【0022】 上の記述は本発明を説明するためのも
のであり、上記の物質及び方法工程についての数
多くの改良及び改変も本発明の範囲に含まれるこ
とは当業者には明らかである。 【発明の効果】 本発明の免疫グロブリンG分子
の単離方法によれば、実用上充分な単離率及び収
率で免疫グロブリンG分子を単離できる。
G分子の単離方法に関し、詳しくは、免疫グロブ
リンG分子を、アガロース支持体に架橋されたプ
ロテインAに選択的に結合させた後に溶離する、
免疫グロブリンG(以下IgGを略称することがあ
る)分子の単離方法に関する。このような単離は
分析的及び調製的(preparatory)免疫学技術に
おいて、有用性を有する。 【0002】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテインAがIgG分子のFc部分に結合する能
力は、アフイニテイ クロマトグラフイーによる
他の蛋白質からのIgG分子の単離の基礎原理とし
て広く用いられている。この種の単離において
は、プロテインAは通常、アガロースの如き固体
相支持体に架橋することにより固定され、供試試
料が、混合物中の他の蛋白質の結合を嫌う緩衝剤
中に溶液として供給され、次いで免疫グロブリン
が異なる組成の緩衝剤を用いる溶離操作により固
体相から回収される。しかしながら、上述の方法
によつて達成される単離は完全とは言い難いもの
である。 【0003】 ある種の抗体をプロテインAに結合さ
せるという初期の開示は、クロンバル等
(Kronvall et al)、ジヤーナル オブ イミユノ
ロジー((Journal ofImmunology)第105巻第5
号1116頁(1970年)に見られる。この分離を改良
する試みはマツケンジー等(Mackenzie et al)
によつてなされ、ジヤーナル オブ イミユノロ
ジー((Journal of Immunology)第120巻第5
号1493頁(1978年)には低PHにおいて連続的に上
昇するNaSCN勾配が、溶離用緩衝剤としてプロ
テインA−セフアロース4Bカラムに関して用い
られることが開示されている。しかし、この結合
はIgG1及びIgG2に関して低く、再現性がないこ
とが判明している。 【0004】 一定の低い塩濃度においてPHを段階的
に減少させることを特徴とする溶離操作がアイ等
(Ey et al)、イミユノロジー(Immunology)第
15巻429頁(1978年)に開示されているが、この
方法ではIgG1の実質的な量が次のフラクシヨン
中に流出することが判明しており、この方法も再
現性がない。 【0005】 シヤロン等(Chalon et al)は、スカ
ンジナビアン ジヤーナル オブ イミユノロジ
ー(Scand.Jouranal of Immunology)第9巻
359頁(1979年)において、ホスフエート−緩衝
化塩溶液中にPH7.3において混合物を溶解し、次
いで溶液を同一緩衝剤で平衡化したプロテインA
−セフアロース4B含有カラム中に導入すること
により種々のIgGをIgA及びIgMから分離するこ
とに部分的に成功している。この方法において緩
衝剤を変化させずに2つのピークが現れ、第2の
ピークが殆どのIgG1を含有する溶離物に対する
ものであり、収率は31%〜73%である。 【0006】 また種々のIgGのプロテインA−セフ
アロース4Bを用いる精製のための16種の溶離液
がバイワツター等(Bywter et al)によつて研
究され、ジヤーナル オブ イミユノロジカル
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るが、前述の方法をしのぐ単離率及び収率の向上
が、供試試料のいずれにおいても観察されていな
い。 【0007】 従つて、本発明の目的は、実用上充分
な単離率及び収率で免疫グロブリンG分子を単離
する方法を提供することにある。 【0008】 【課題を解決するための手段】 本発明者等は、
上記目的を達成すべく、鋭意研究した結果、IgG
分子とプロテインAとの結合親和性が、アガロー
ス支持体に架橋されたプロテインAを含む固体層
に対してIgG分子を特定の塩濃度と特定のPHを有
する、特定の塩の緩衝剤水溶液中で接触させるこ
とにより実質的に増加し、かつ上記プロテインA
に結合したIgG分子が特定のPHの酸緩衝剤水溶液
中に効率的に溶離することを知見した。 【0009】 本発明は上記知見に基づいてなされた
もので、腹水液から免疫グロブリンG分子を単離
する方法において、 (a) アガロース支持体に架橋されたプロテインA
を含む固体相を有するアフイニテイ クロマトグ
ラフイー カラムを、1.0モル〜4.0Mの塩濃度と
8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナトリウム及び硫酸
アンモニウムからなる群から選択される塩の緩衝
剤水溶液で平衡化し、 (b) 前記の腹水液を更に別の量の前記の緩衝剤水
溶液と混合して1/1〜1/20に希釈された溶液
を形成し、 (c) この希釈された溶液を前記の固体相に接触さ
せて前記の免疫グロブリンG分子を前記のプロテ
インAに選択的に結合させ、前記の腹水液の残余
のものを通過させ、 (d) 2.5〜4.0のPHの酸緩衝剤水溶液を前記のカラ
ム中に通液することにより前記の免疫グロブリン
G分子を前記のプロテインAから溶離させ、 (e) 前記の免疫グロブリンG分子を回収する 諸工程を含むことを特徴とする免疫グロブリンG
分子の単離方法を提供するものである。 【0010】 本発明は入手源に関係なく一般にIgG
に適用されるが、本発明の目的のために好ましい
IgGはマウスIgG1、Ig2a及びIgG2bである。本発明
の免疫グロブリンG分子の単離方法は、目的種
(the species of interest)を、他の免疫グロブ
リン例えばIgM及びIgE、及びアルブミン等の他
の蛋白質が含まれる腹水液から、良好な単離率及
び収率で単離できるものである。これらの蛋白質
のプロテインAに対する結合親和性はIgG分子の
それよりもはるかに小さいことが知られており、
免疫グロブリンGとアガロース支持体に架橋され
たプロテインAとの結合は高い選択性がある。 【0011】 本発明で用いられる塩類は、免疫グロ
ブリンG、プロテインA、及びプロテインAが結
合されるアガロース支持体の何れに対しても反応
性を有しないものである。 また、本発明で用いられる酸緩衝剤水溶液として
は、上記塩類と同様に、免疫グロブリンG、プロ
テインA、及びプロテインAが結合されるアガロ
ース支持体の何れに対しても反応性を有しないも
のであれば特に限定はないが、クエン酸ナトリウ
ム水溶液が好ましい。 【0012】 本発明の方法は、アフイニテイ クロ
マトグラフイーにおける分離を高めるために用い
られ、カラム充填物である、アガロース支持体に
架橋されやプロテインAを前記塩濃度及び前記PH
の塩化ナトリウム及び硫酸アンモニウムからなる
群から選択される塩の緩衝剤水溶液で繰り返し洗
浄することにより平衡化し、また供試試料混合物
をカラムに導入する前に同一の緩衝剤水溶液で希
釈する。希釈化度は1/1〜1/20の範囲であ
る。上記の供試試料を希釈した緩衝剤水溶液がカ
ラムを通過すると免疫グロブリンG分子は上記ア
ガロース支持体に架橋されたプロテインAと選択
的に結合して固定化され、一方、免疫グロブリン
G以外の他の蛋白質はほとんど結合しないため緩
衝剤水溶液とともに流れ去り、これにより他の蛋
白質から免疫グロブリンG分子が分離される。免
疫グロブリンG分子の回収は、2.5〜4.0のPHを有
する酸緩衝剤水溶液でアガロース支持体に架橋さ
れたプロテインA上に固定された免疫グロブリン
G分子を溶離させることにより行われる。 【0013】 カラムの性質は臨界的ではなく、開放
カラムから加圧カラムに至るまで広範囲に変化さ
せることができる。本発明において固有の強固な
結合は開放カラムを用いても効果的な単離を可能
にする。 【0014】 以下の実施例は本発明を説明するため
のものであり、本発明を限定するものではない。 【0015】 【実施例】 実施例 1 標準ホスフエート−緩衝化塩溶液(0.010M リ
ン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、PH
8.2)を含む一連の結合用緩衝剤水溶液を並行試
験のために調製した。分離カラムは、直径約1
cm、高さ約2cm、容積1mlの使い捨てタイプの開
放カラムであり、この中にはアフイーゲル(Affi
−Gel)プロテインA〔米国カリフオルニア州リ
ツチモンドのバイオーラツド ラボラトリーズ
インコーポレイテツドの製品であり、アミド結合
によりアガロース ビーズに架橋結合されている
精製プロテインAである〕を充填した。 【0016】 それぞれの試験のために充填カラム
に、このカラムの床体積の5倍量の結合用緩衝剤
水溶液を0.5ml/分の流速で流すことにより、充
填カラムを平衡化させた。M及びN血液群決定子
(デターミナント)を保有するヒト赤血球膜であ
るグリコフオリンAに対して指向されるIgG1モ
ノクロナール抗体(9A3)を含有するマウス腹水
液の試料は、SP2/0骨髄腫細胞と、同形(ホ
モ)接合の血液群M及びNからのヒト赤血球の混
合物で免疫化された脾臓細胞とから誘導されるハ
イブリドーマから得られた。この試料を結合用緩
衝剤水溶液で1/10に希釈し、アフイーゲル プ
ロテインA 1ml当たり総蛋白質が10mgになるよ
うな体積でカラムに接触させた。次いで、カラム
を、カラムの床体積の10倍の量の結合用緩衝剤水
溶液で洗浄した。 【0017】 上記免疫グロブリンを、PH3におい
て、カラムの床体積の3倍の量の1.0Mクエン酸
ナトリウム水溶液によつてカラムから溶離し、溶
離物を280nmにおける紫外吸光度により分析し
た。回収率(アガロース−プロテインAへの結合
率に相当する)は、免疫グロブリンmg/ml当たり
14吸収単位の吸光係数値(免疫グロブリンG分子
を結合させるために過剰のカラムパツキングを用
いる標準試験によつて決定された値である)に基
づいて決定された。100%の結合率は初期溶離物
のゲル濾過分析により確認された。 【0018】 結果を表1に示すが、この表から、試
験された各結合用緩衝剤水溶液は、ホスフエート
−緩衝化塩溶液(PBS)をしのぐ効果を示すこ
とが明らかである。又、結合用緩衝剤水溶液が低
い場合やPHが低い場合と比較しても、本発明の効
果は高いものであつた。 【0019】 ■■■ 亀の甲 [0071] ■■■ 【0020】 実施例 2 一連の異なるIgG型のモノクロナール抗体に対し
て単一の結合用緩衝剤水溶液を用いた以外は実施
例1の試験方法を繰り返した。結合用緩衝剤水溶
液は1M(NH4)2SO4(PH9.0)であつた。抗体は全
てSP2/0骨髄腫細胞からのものであり、実施例
1の9A3;グリコフオリンAに対するIgG1抗体で
ある10F7;未知特異性のIgG1であるDCMB;未
知特異性のIgG2aであるHOPC−1;及び未知特
異性のIgG2bであるT4−1からなる。それぞれの
場合の結合率がPH8.2のホスフエート−緩衝化塩
溶液(PBS)の使用によつて達成される結合率
と比較された。結果は表2に示すが、この表か
ら、それぞれの場合において明瞭な改良が認めら
れた。 【0021】 ■■■ 亀の甲 [0072] ■■■ 【0022】 上の記述は本発明を説明するためのも
のであり、上記の物質及び方法工程についての数
多くの改良及び改変も本発明の範囲に含まれるこ
とは当業者には明らかである。 【発明の効果】 本発明の免疫グロブリンG分子
の単離方法によれば、実用上充分な単離率及び収
率で免疫グロブリンG分子を単離できる。
Claims (1)
- 【請求項1】 腹水液から免疫グロブリンG分子
を単離する方法において、 (a) アガロース支持体に架橋されたプロテインA
を含む固体相を有するアフイニテイクロマトグラ
フイーカラムを、1.0モル〜4.0Mの塩濃度と8.5〜
9.5のPHを有する、塩化ナトリウム及び硫酸アン
モニウムからなる群から選択される塩の緩衝剤水
溶液で平衡化し、 (b) 前記の腹水液を更に別の量の前記の緩衝剤水
溶液と混合して1/1〜1/20に希釈された溶液
を形成し、 (c) この希釈された溶液を前記の固体相に接触さ
せて前記の免疫グロブリンG分子を前記のプロテ
インAに選択的に結合させ、前記の腹水液の残余
のものを通過させ、 (d) 2.5〜4.0のPHの酸緩衝剤水溶液を前記のカラ
ム中に通液することにより前記の免疫グロブリン
G分子を前記のプロテインAから溶離させ、 (e) 前記の免疫グロブリンG分子を回収する 諸工程を含むことを特徴とする免疫グロブリンG
分子の単離方法。
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