JPH0455440B2 - - Google Patents
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- JPH0455440B2 JPH0455440B2 JP60135808A JP13580885A JPH0455440B2 JP H0455440 B2 JPH0455440 B2 JP H0455440B2 JP 60135808 A JP60135808 A JP 60135808A JP 13580885 A JP13580885 A JP 13580885A JP H0455440 B2 JPH0455440 B2 JP H0455440B2
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、免疫グロブリンＧ分子（以下、IgG
と略称することがある）のプロテインＡへの結合
方法に関する。このような結合は分析的及び調製
的（preparatory）免疫学技術において、ある範
囲の有用性を有し、腹水液から抗体、特にモノク
ロナール抗体を精製する際に特に重要である。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点〕 プロテインＡがIgG分子のFc部分に結合する能
力は、アフイニテイ、クロマトグラフイーによる
他の蛋白質からのIgGの分離の基礎原理として広
く用いられている。この種の分離においては、プ
ロテインＡは通常、アガロースの如き固体相支持
体に架橋することにより固定され、供試試料が、
混合物中の他の蛋白質の結合を嫌う緩衝剤中に溶
液として供給され、次いで免疫グロブリンが異な
る組成の緩衝剤を用いる溶離操作により固体相か
ら回収される。しかしながら、上述の方法によつ
て達成される分離は完全とは言い難いものであ
る。 ある種の抗体をプロテインＡに結合させるとい
う初期の開示は、クロンバル等（Kronvall et
al）、ジヤーナル オブ イミユノロジー
（Journal of Immunology）第105巻第５号1116
頁（1970年）に見られる。この分離を改良する試
みはマツケンジー等（Mackenzie et al）によつ
てなされ、ジヤーナル オブ イミユノロジー
（Journal of Immunology）第120巻第５号1493
頁（1978年）には低PHにおいて連続的に上昇する
NaSCN勾配が溶離用緩衝剤として、プロテイン
Ａ−セフアロース4Bカラムに関して用いられる
ことが開示されている。しかし、この結合は
IgG1及びIgG2に関して低く、再現性がないこと
が判明している。 一定の低い塩濃度においてPHを段階的に減少させ
ることを特徴とする溶離操作がアイ等（Ey et
al）、イミユノロジー（Immunology）第15巻429
頁（1978年）に開示されているが、この方法では
IgG1の実質的な量が次のフラクシヨン中に流出
することが判明しており、この方法も再現性がな
い。 シヤロン等（Chalon et al）は、スカンジナビ
アン ジヤーナル オブ イミユノロジー
（Scand.Journal of Immunology）第９巻359頁
（1979年）において、ホスフエート−緩衝化塩溶
液中にPH7.3において混合物を溶解し、次いで溶
液を同一緩衝剤で平衡化したプロテインＡ−セフ
アロース4B含有カラム中に導入することにより
種々のIgGをIgA及びIgMから分離することに部
分的に成功している。この方法において緩衝剤を
変化させずに２つのピークが現れ、第２のピーク
が殆どのIgG1を含有する溶離物に対するもので
あり、収率は31％〜73％である。 また種々のIgGのプロテインＡ−セフアロース
4Bを用いる精製のための16種の溶離液がバイワ
ツター等（Bywter et al）によつて研究され、
ジヤーナル オブ イミユノロジカル メソツヅ
（Journal of Immu−nogical Methods）第64巻
１頁（1983年）に報告されているが、前述の方法
をしのぐ分離率及び収率の向上が、供試試料のい
ずれにおいても観察されていない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、叙上の観点に鑑みなされたもので、
マウスIgG1，IgG2a及びIgG2bからなる群から選択
される免疫グロブリンＧ分子を、アガロースに架
橋させたプロテインＡに結合させる方法であつ
て、前記の免疫グロブリンＧ分子を、1.0M〜
4.0Mの塩濃度と8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナト
リウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択
される塩の緩衝剤水溶液の存在下にプロテインＡ
と接触させる工程を含むことを特徴とする免疫グ
ロブリンＧ分子のプロテインＡへの結合方法を提
供するものである。 本発明によれば、上記免疫グロブリンＧ分子と
上記プロテインＡとは強固に結合する。そして、
生じる非常に強固な結合は、これらの免疫グロブ
リン類を、例えば腹水液に通常存在するような他
の蛋白質から分離するのに特に有用である。 〔好ましい態様の記述〕 本発明において固定化されるIgGはマウス
IgG1，IgG2a及びIgG2bである。目的種（the
species of interest）が分離される蛋白質は他の
免疫グロブリン例えばIgM及びIgE、及び他の蛋
白質例えばアルブミンである。これらの蛋白質の
プロテインＡに対する結合親和性はIgGのそれよ
りもはるかに小さいことが知られている。 本発明に用いられる緩衝剤水溶液は、1.0M〜
4.0Mの塩濃度と8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナト
リウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択
される塩の緩衝剤水溶液である。この塩は、免疫
グロブリン、プロテインＡ、及びアガロースに架
橋されたプロテインＡの何れに対しても反応性を
有しないものである。 固定化目的のために、プロテインＡは、アフイ
ニテイ クロマトグラフイー カラムの充填剤の
如き固体支持体に架橋させることにより結合され
る。プロテインＡが結合する固体支持体としては
アガロース支持体が用いられる。 本発明の方法をアフイニテイ クロマトグラフ
イーにおける分離を高めるために用いる場合に
は、カラム充填物を高い塩濃度の緩衝剤溶液で繰
り返し洗浄することにより平衡化し、また供試試
料混合物をカラムに導入する前に同一の緩衝剤溶
液で希釈するのが好ましい。希釈化度は広範囲に
変動させることができるが、約1/1〜約1/20の範
囲の希釈化度が好ましい。緩衝剤溶液がカラムを
通過すると、非結合蛋白質が緩衝剤溶液とともに
運ばれ、これにより非結合蛋白質と結合免疫グロ
ブリンが分離される。免疫グロブリンの回収は、
好ましくは約2.0〜約5.0、より好ましくは約2.5〜
約4.0のPHを有する酸緩衝剤で溶離させることに
より行われる。 カラムの性質は臨界的ではなく、開放カラムか
ら加圧カラムに至るまで広範囲に変化させること
ができる。本発明において固有の強固な結合は開
放カラムを用いても効果的な分離が行われること
を可能にする。 以下の実施例は本発明を説明するためのもので
あり、本発明を限定するものではない。 実施例 １ 標準ホスフエート−緩衝化塩溶液（0.010M
リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、PH
8.2）を含む一連の結合用緩衝剤溶液を並行試験
のために調製した。分離カラムは、直径約１cm、
高さ約２cm、容積１mlの使い捨てタイプの開放カ
ラムであり、この中にはアフイーゲル（Affi−
Gel）プロテインＡ〔米国カリフオルニア州リツ
チモンドのバイオ−ラツド ラボラトリーズ イ
ンコーポレイテツドの製品であり、アミド結合に
よりアガロース ビーズに架橋結合されている精
製プロテインＡである〕が充填されている。 それぞれの試験のために充填カラムに、このカ
ラムの床体積の５倍量の結合用緩衝剤を0.5ml／
分の流速で流すことにより、充填カラムを平衡化
させた。Ｍ及び血液群決定子（デターミナント）
を保有するヒト赤血球膜であるグリコフオリンＡ
に対して指向されるIgG1モノクロナール抗体
（9A3）を含有するマウス腹水液の試料は、
SP2／０骨髄腫細胞と、同形（ホモ）接合の血液
群Ｍ及びＮからのヒト赤血球の混合物で免疫化さ
れた脾臓細胞とから誘導されるハイブリドーマか
ら得られた、この試料を結合用緩衝剤で1/10に希
釈し、アフイーゲル プロテインＡ １ml当たり
総蛋白質が10mgになるような体積でカラムに適用
した。次いで、カラムを、カラムの床体積の10倍
の量の結合用緩衝剤で洗浄した。 免疫グロブリンを、PH３において、カラムの床
体積の３倍の量の1.0M クエン酸ナトリウムに
よつてカラムから溶離し、溶離物を280nmにおけ
る紫外吸収度により分析した。回収率（アガロー
ス−プロテインＡ上の結合率に相当する）が、免
疫グロブリンmg／ml当たり1.4吸収単位の吸光係
数値（免疫グロブリンを結合させるために過剰の
カラムパツキングを用いる標準試験によつて決定
された値である）を基礎にして決定され、100％
の結合率が初期溶離物のゲル濾過分析により確認
された。 結果を表に示すが、この表から、試験された
各結合用緩衝剤は、ホスフエート−緩衝化塩溶液
（PBS）をしのぐ効果を示すことが明らかであ
る。
と略称することがある）のプロテインＡへの結合
方法に関する。このような結合は分析的及び調製
的（preparatory）免疫学技術において、ある範
囲の有用性を有し、腹水液から抗体、特にモノク
ロナール抗体を精製する際に特に重要である。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点〕 プロテインＡがIgG分子のFc部分に結合する能
力は、アフイニテイ、クロマトグラフイーによる
他の蛋白質からのIgGの分離の基礎原理として広
く用いられている。この種の分離においては、プ
ロテインＡは通常、アガロースの如き固体相支持
体に架橋することにより固定され、供試試料が、
混合物中の他の蛋白質の結合を嫌う緩衝剤中に溶
液として供給され、次いで免疫グロブリンが異な
る組成の緩衝剤を用いる溶離操作により固体相か
ら回収される。しかしながら、上述の方法によつ
て達成される分離は完全とは言い難いものであ
る。 ある種の抗体をプロテインＡに結合させるとい
う初期の開示は、クロンバル等（Kronvall et
al）、ジヤーナル オブ イミユノロジー
（Journal of Immunology）第105巻第５号1116
頁（1970年）に見られる。この分離を改良する試
みはマツケンジー等（Mackenzie et al）によつ
てなされ、ジヤーナル オブ イミユノロジー
（Journal of Immunology）第120巻第５号1493
頁（1978年）には低PHにおいて連続的に上昇する
NaSCN勾配が溶離用緩衝剤として、プロテイン
Ａ−セフアロース4Bカラムに関して用いられる
ことが開示されている。しかし、この結合は
IgG1及びIgG2に関して低く、再現性がないこと
が判明している。 一定の低い塩濃度においてPHを段階的に減少させ
ることを特徴とする溶離操作がアイ等（Ey et
al）、イミユノロジー（Immunology）第15巻429
頁（1978年）に開示されているが、この方法では
IgG1の実質的な量が次のフラクシヨン中に流出
することが判明しており、この方法も再現性がな
い。 シヤロン等（Chalon et al）は、スカンジナビ
アン ジヤーナル オブ イミユノロジー
（Scand.Journal of Immunology）第９巻359頁
（1979年）において、ホスフエート−緩衝化塩溶
液中にPH7.3において混合物を溶解し、次いで溶
液を同一緩衝剤で平衡化したプロテインＡ−セフ
アロース4B含有カラム中に導入することにより
種々のIgGをIgA及びIgMから分離することに部
分的に成功している。この方法において緩衝剤を
変化させずに２つのピークが現れ、第２のピーク
が殆どのIgG1を含有する溶離物に対するもので
あり、収率は31％〜73％である。 また種々のIgGのプロテインＡ−セフアロース
4Bを用いる精製のための16種の溶離液がバイワ
ツター等（Bywter et al）によつて研究され、
ジヤーナル オブ イミユノロジカル メソツヅ
（Journal of Immu−nogical Methods）第64巻
１頁（1983年）に報告されているが、前述の方法
をしのぐ分離率及び収率の向上が、供試試料のい
ずれにおいても観察されていない。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、叙上の観点に鑑みなされたもので、
マウスIgG1，IgG2a及びIgG2bからなる群から選択
される免疫グロブリンＧ分子を、アガロースに架
橋させたプロテインＡに結合させる方法であつ
て、前記の免疫グロブリンＧ分子を、1.0M〜
4.0Mの塩濃度と8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナト
リウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択
される塩の緩衝剤水溶液の存在下にプロテインＡ
と接触させる工程を含むことを特徴とする免疫グ
ロブリンＧ分子のプロテインＡへの結合方法を提
供するものである。 本発明によれば、上記免疫グロブリンＧ分子と
上記プロテインＡとは強固に結合する。そして、
生じる非常に強固な結合は、これらの免疫グロブ
リン類を、例えば腹水液に通常存在するような他
の蛋白質から分離するのに特に有用である。 〔好ましい態様の記述〕 本発明において固定化されるIgGはマウス
IgG1，IgG2a及びIgG2bである。目的種（the
species of interest）が分離される蛋白質は他の
免疫グロブリン例えばIgM及びIgE、及び他の蛋
白質例えばアルブミンである。これらの蛋白質の
プロテインＡに対する結合親和性はIgGのそれよ
りもはるかに小さいことが知られている。 本発明に用いられる緩衝剤水溶液は、1.0M〜
4.0Mの塩濃度と8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナト
リウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択
される塩の緩衝剤水溶液である。この塩は、免疫
グロブリン、プロテインＡ、及びアガロースに架
橋されたプロテインＡの何れに対しても反応性を
有しないものである。 固定化目的のために、プロテインＡは、アフイ
ニテイ クロマトグラフイー カラムの充填剤の
如き固体支持体に架橋させることにより結合され
る。プロテインＡが結合する固体支持体としては
アガロース支持体が用いられる。 本発明の方法をアフイニテイ クロマトグラフ
イーにおける分離を高めるために用いる場合に
は、カラム充填物を高い塩濃度の緩衝剤溶液で繰
り返し洗浄することにより平衡化し、また供試試
料混合物をカラムに導入する前に同一の緩衝剤溶
液で希釈するのが好ましい。希釈化度は広範囲に
変動させることができるが、約1/1〜約1/20の範
囲の希釈化度が好ましい。緩衝剤溶液がカラムを
通過すると、非結合蛋白質が緩衝剤溶液とともに
運ばれ、これにより非結合蛋白質と結合免疫グロ
ブリンが分離される。免疫グロブリンの回収は、
好ましくは約2.0〜約5.0、より好ましくは約2.5〜
約4.0のPHを有する酸緩衝剤で溶離させることに
より行われる。 カラムの性質は臨界的ではなく、開放カラムか
ら加圧カラムに至るまで広範囲に変化させること
ができる。本発明において固有の強固な結合は開
放カラムを用いても効果的な分離が行われること
を可能にする。 以下の実施例は本発明を説明するためのもので
あり、本発明を限定するものではない。 実施例 １ 標準ホスフエート−緩衝化塩溶液（0.010M
リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム、PH
8.2）を含む一連の結合用緩衝剤溶液を並行試験
のために調製した。分離カラムは、直径約１cm、
高さ約２cm、容積１mlの使い捨てタイプの開放カ
ラムであり、この中にはアフイーゲル（Affi−
Gel）プロテインＡ〔米国カリフオルニア州リツ
チモンドのバイオ−ラツド ラボラトリーズ イ
ンコーポレイテツドの製品であり、アミド結合に
よりアガロース ビーズに架橋結合されている精
製プロテインＡである〕が充填されている。 それぞれの試験のために充填カラムに、このカ
ラムの床体積の５倍量の結合用緩衝剤を0.5ml／
分の流速で流すことにより、充填カラムを平衡化
させた。Ｍ及び血液群決定子（デターミナント）
を保有するヒト赤血球膜であるグリコフオリンＡ
に対して指向されるIgG1モノクロナール抗体
（9A3）を含有するマウス腹水液の試料は、
SP2／０骨髄腫細胞と、同形（ホモ）接合の血液
群Ｍ及びＮからのヒト赤血球の混合物で免疫化さ
れた脾臓細胞とから誘導されるハイブリドーマか
ら得られた、この試料を結合用緩衝剤で1/10に希
釈し、アフイーゲル プロテインＡ １ml当たり
総蛋白質が10mgになるような体積でカラムに適用
した。次いで、カラムを、カラムの床体積の10倍
の量の結合用緩衝剤で洗浄した。 免疫グロブリンを、PH３において、カラムの床
体積の３倍の量の1.0M クエン酸ナトリウムに
よつてカラムから溶離し、溶離物を280nmにおけ
る紫外吸収度により分析した。回収率（アガロー
ス−プロテインＡ上の結合率に相当する）が、免
疫グロブリンmg／ml当たり1.4吸収単位の吸光係
数値（免疫グロブリンを結合させるために過剰の
カラムパツキングを用いる標準試験によつて決定
された値である）を基礎にして決定され、100％
の結合率が初期溶離物のゲル濾過分析により確認
された。 結果を表に示すが、この表から、試験された
各結合用緩衝剤は、ホスフエート−緩衝化塩溶液
（PBS）をしのぐ効果を示すことが明らかであ
る。
【表】
実施例 ２
一連の異なるIgG型のモノクロナール抗体に対
して単一の結合用緩衝剤を用いた以外は実施例１
の試験方法を繰り返した。結合用緩衝剤は1M
（NH4）2SO4（PH9.0）であつた。抗体は全てSP2／
０骨髄腫細胞からのものであり、実施例１の
9A3；グリコホリンＡに対するIgG1抗体である
10F7；未知特異性のIgG1であるDCMB；未知特
異性のIgG2aであるHOPC−１；及び未知特異性
のIgG2bであるT4−１からなる。それぞれの場合
の結合率がPH8.2のホスフエート−緩衝化塩溶液
（PBS）の使用によつて達成される結合率と比較
された。結果は表に示すが、この表から、それ
ぞれの場合において明瞭な改良が認められた。
して単一の結合用緩衝剤を用いた以外は実施例１
の試験方法を繰り返した。結合用緩衝剤は1M
（NH4）2SO4（PH9.0）であつた。抗体は全てSP2／
０骨髄腫細胞からのものであり、実施例１の
9A3；グリコホリンＡに対するIgG1抗体である
10F7；未知特異性のIgG1であるDCMB；未知特
異性のIgG2aであるHOPC−１；及び未知特異性
のIgG2bであるT4−１からなる。それぞれの場合
の結合率がPH8.2のホスフエート−緩衝化塩溶液
（PBS）の使用によつて達成される結合率と比較
された。結果は表に示すが、この表から、それ
ぞれの場合において明瞭な改良が認められた。
本発明の免疫グロブリンＧ分子のプロテインＡ
への結合方法は、免疫グロブリンＧ分子をアガロ
ースに架橋されたプロテインＡと強固に結合させ
ることができ、そのため、例えば腹水液から免疫
グロブリンＧ分子を分離するのに特に有用なもの
である。
への結合方法は、免疫グロブリンＧ分子をアガロ
ースに架橋されたプロテインＡと強固に結合させ
ることができ、そのため、例えば腹水液から免疫
グロブリンＧ分子を分離するのに特に有用なもの
である。
Claims (1)
- １ マウスIgG1，IgG2a及びIgG2bからなる群から
選択される免疫グロブリンＧ分子を、アガロース
に架橋させたプロテインＡに結合させる方法であ
つて、前記の免疫グロブリンＧ分子を、1.0M〜
4.0Mの塩濃度と8.5〜9.5のPHを有する、塩化ナト
リウム及び硫酸アンモニウムからなる群から選択
される塩の緩衝剤水溶液の存在下にプロテインＡ
と接触させる工程を含むことを特徴とする免疫グ
ロブリンＧ分子のプロテインＡへの結合方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US623797 | 1984-06-22 | ||
| US06/623,797 US4704366A (en) | 1984-06-22 | 1984-06-22 | Process for binding IgG to protein A |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3109760A Division JPH04234899A (ja) | 1984-06-22 | 1991-04-15 | 免疫グロブリンｇ分子の単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6112631A JPS6112631A (ja) | 1986-01-21 |
| JPH0455440B2 true JPH0455440B2 (ja) | 1992-09-03 |
Family
ID=24499435
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60135808A Granted JPS6112631A (ja) | 1984-06-22 | 1985-06-21 | 免疫グロブリンｇ分子のプロテインａへの結合方法 |
| JP3109760A Granted JPH04234899A (ja) | 1984-06-22 | 1991-04-15 | 免疫グロブリンｇ分子の単離方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3109760A Granted JPH04234899A (ja) | 1984-06-22 | 1991-04-15 | 免疫グロブリンｇ分子の単離方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4704366A (ja) |
| JP (2) | JPS6112631A (ja) |
| DE (1) | DE3521679A1 (ja) |
| GB (1) | GB2160530B (ja) |
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| KR20070009637A (ko) * | 2004-03-24 | 2007-01-18 | 피디엘 바이오파르마 인코포레이티드 | 암 세포 증식을 억제하는 항α5β1 항체의 용도 |
| BRPI0813630A2 (pt) * | 2007-07-27 | 2019-09-24 | Facet Biotech Corp | combinações farmacêuticas compreendendo inibidor da tirosina quinase e anticorpo contra a integrina alfa 1 beta 5 (cd49e) |
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